Khóa luận Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất, khảo sát khả năng ức chế sản sinh aflatoxin của các chủng phân lập được

hí nghiệm được tiến hành với chủng Bacillus subtilis NK-330 và NK-C-3 trên ngô hạt và lạc hạt đã nhiễm aflatoxin từ Aspergillus flavus hay Aspergillus parasiticus. Kết quả cho thấy có sự ức chế rõ rệt khả năng tổng hợp aflatoxin của chủng nấm mốc này (chỉ còn 34 ppb với chủng Bacillus subtilis NK-C-3 trên ngô nhiễm Aspergillus flavus NRRL 3357 sau 5 ngày, so với đối chứng 720 ppb) (R.Mann và cộng sự, 1997; N.kimura, 1988; trích dẫn bởi Bùi Xuân Đồng, 2004). 18 Chƣơng 3 NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 3.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM 3.1.1. Thời gian Thời gian thực hiện đề tài từ tháng 3/2007 đến tháng 8/2007 3.1.2. Địa điểm Phòng thực hành vi sinh, khoa Chăn Nuôi –Thú Y trường Đại Học Nông Lâm Tp.HCM. 3.2. ĐỐI TƢỢNG KHẢO SÁT - Chủng vi khuẩn Bacillus subtilis được phân lập từ đất. - Chủng nấm mốc Aspergillus flavus sinh aflatoxin do phòng thực hành vi sinh cấp. - Vịt nuôi. 3.3. THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ THÍ NGHIỆM - Thiết bị: kính hiển vi, tủ sấy, nồi hấp tiệt trùng (autoclave), cân điện tử, máy lắc (vortex), lò vi sóng, đèn cực tím,..... - Dụng cụ: ống nghiệm, đĩa petri, que cấy, đèn cồn, bình tam giác, bacher, micropipette, đũa khuấy thủy tinh, ống đong, nhiệt kế, que trang, buồng đếm Neubauer, giá để ống nghiệm,...Tất cả các dụng cụ thủy tinh dùng trong thí nghiệm phải dược sấy tiệt trùng ở 180oC/45 phút. Dụng cụ nhựa được hấp tiệt trùng bằng autoclave ở 121oC/15 phút. 19 3.4. MÔI TRƢỜNG NUÔI CẤY 3.4.1. Môi trƣờng tự nhiên - Môi trường thạch nước cốt dừa: dùng kiểm tra khả năng sinh aflatoxin của Aspergillus flavus. Nước cốt dừa đóng hộp được pha loãng với nước theo tỷ lệ 1:1. Sau đó thêm agar theo tỷ lệ thích hợp. Hấp tiệt trùng ở 121oC/20 phút. - Môi trường bắp: bắp hạt trước khi dùng phải được nghiền nhỏ như hạt tấm. Sau đó sấy tiệt trùng, xác định hàm lượng aflatoxin và đo hàm lượng ẩm. Điều chỉnh hàm lượng ẩm đến 30% bằng nước, cho vào chai nâu, mỗi chai 150 g bắp. Hấp tiệt trùng ở 121oC/20 phút trước khi tiến hành nuôi cấy. (Thành phần các môi trường được trình bày ở phần phụ lục) 3.4.2. Môi trƣờng tổng hợp - Môi trường phân lập, giữ giống và đếm số lượng vi khuuẩn: môi trường TSA (Trypticase Soya Agar). - Môi trường tăng sinh khối vi khuẩn: môi trường TSB (Trypticase Soya Broth). - Môi trường giữ giống nấm: môi trường thạch khoai tây. 3.5. NỘI DUNG - Phân lập chủng Bacillus sutilis từ đất. - Khảo sát khả năng ức chế aflatoxin của các chủng Bacillus subtilis phân lập được. - Khảo sát tỷ lệ nuôi cấy thích hợp giữa bào tử nấm mốc sinh aflatoxin và bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis để vi khuẩn có thể ức chế sản sinh aflatoxin tốt nhất. - Thử độ an toàn của nguyên liệu bắp nhiễm aflatoxin sau khi xử lý với vi khuẩn Bacillus subtilis thu được trên vịt nuôi. 3.6. PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH NGHIÊN CỨU 3.6.1. Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất 3.6.1.1. Cách lấy mẫu đất để phân lập vi khuẩn Dùng muỗng gạt bỏ lớp đất mặt khoảng 2 - 3 cm, lấy lớp dất ở dưới. 20 Cân 10 g mẫu đất cho vào bình tam giác có chứa 90 ml nước muối sinh lý vô trùng và lắc đều, được nồng độ pha loãng 10-1. 3.6.1.2. Phƣơng pháp phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis Chuẩn bị 4 ống nghiệm, mỗi ống chứa 9 ml nước muối sinh lý vô trùng, đánh số thứ tự từ 1 - 4. Dùng micropipette hút 1 ml dịch mẫu từ bình tam giác chứa mẫu đất phân lập có nồng pha loãng 10-1 cho vào ống nghiệm thứ 1 và lắc đều bằng máy vortex, được nồng độ pha loãng 10-2, cứ như vậy tiếp tục làm cho đến ống cuối cùng. Tiếp theo chọn các ống nghiệm có nồng độ pha loãng 10-3,10-4,10-5 đem đun cách thủy ở 700C/30 phút. Sau khi đun thì dùng micropipette hút 0,1 ml từ mỗi nồng độ pha loãng cho lên đĩa môi trường TSA và trang đều bằng que trang vô trùng, để đĩa TSA ở 370C/24 giờ trong tủ ấm. Sau đó quan sát các khuẩn lạc hình thành trên đĩa TSA, chọn ra những khuẩn lạc nghi ngờ là của Bacillus subtilis, dùng que cấy vòng bắt và cấy giữ giống lại trên môi trường ống thạch TSA nghiêng. 3.6.2. Khảo sát đặc điểm sinh học của vi khuẩn phân lập đƣợc 3.6.2.1. Quan sát hình thái vi khuẩn dƣới kính hiển vi Lấy một ít sinh khối vi khuẩn từ ống TSA làm tiêu bản nhuộm Gram để quan sát dưới kính hiển vi, độ phóng đại 1000 lần. Các chỉ tiêu quan sát: sự bắt màu, hình dạng, cách sắp xếp của tế bào vi khuẩn, có hay không có bào tử. Sau khi quan sát dưới kính hiển vi nếu thấy tiêu bản vi khuẩn nào phù hợp với những đặc điểm của vi khuẩn Bacillus subtilis thì tiếp tục thử phản ứng sinh hóa để khẳng định. 21 3.6.2.2. Khảo sát các phản ứng sinh hóa của vi khuẩn phân lập đƣợc Chủng vi khuẩn thuần đã kiểm tra dưới kính hiển vi Hoạt tính catalase (+) Lecithinase (-) Nitrate (+) MR-VP (+) Citrate (+) Maltose (+) Vi khuẩn Bacillus subtilis Sơ đồ 3.1:Các phản ứng sinh hóa của vi khuẩn Bacillus subtilis 3.6.3. Thí nghiệm 1: Kiểm tra khả năng sinh aflatoxin của chủng nấm mốc Aspergillus flavus và đánh giá sơ bộ khả năng ức chế sản sinh aflatoxin của các chủng Bacillus subtilis phân lập đƣợc 3.6.3.1. Kiểm tra khả năng sinh aflatoxin của chủng nấm mốc Aspergillus flavus Trƣớc khi tiến hành thí nghiệm phải tiến hành kiểm tra định tính khả năng sinh độc tố aflatoxin của chủng nấm mốc Aspergillus flavus trên môi trƣờng thạch nƣớc cốt dừa. Cho vào đĩa petri khoảng 15 ml môi trường thạch nước cốt dừa và chờ đến khi thạch đông. Dùng que cấy móc lấy 1 ít sợi nấm mốc trong ống giống (môi trường thạch khoai tây), cấy 1 chấm vào giữa đĩa và giữ đĩa ở nhiệt độ phòng. Sau 5 ngày, theo dõi màu huỳnh quang của khuẩn lạc bằng cách đem đĩa đã cấy soi dưới ánh đèn tia cực tím (UV) có bước sóng 365 nm. Màu huỳnh quang xung quanh khuẩn lạc càng sáng thì khả năng sinh độc tố aflatoxin của nấm mốc Aspergillus flavus càng mạnh. 22 3.6.3.2. Thí nghiệm đánh giá sơ bộ khả năng ức chế sản sinh aflatoxin của các chủng Bacillus subtilis phân lập đƣợc Dùng que cấy vòng lấy 1 ít vi khuẩn Bacillus subtilis phân lập được được giữ trong ống môi trường TSA nghiêng vào đĩa môi trường thạch nước cốt dừa và ủ trong tủ ấm ở 370C trong 3 ngày. Mỗi đĩa từ 3 đến bốn chủng vi khuẩn Bacillus subtilis phân lập được. Sau 3 ngày, dùng que cấy móc lấy 1 ít sợi nấm mốc Aspergillus flavus trong ống giống (đã kiểm tra khả năng sinh độc tố aflatoxin trên môi trường thạch nước cốt dừa) cấy vào giữa đĩa môi trường thạch nước cốt dừa nước cốt dừa đã cấy vi khuẩn xung quanh và xem kết quả sau 7 ngày. Sau khoảng 7 ngày theo dõi màu huỳnh quang xung quanh khuẩn lạc Aspergillus flavus ở các phía có cấy vi khuẩn Bacillus subtilis và không có cấy vi khuẩn bằng cách đem đĩa soi dưới ánh đèn tia cựa tím (UV) có bước sóng 365 nm. Nếu màu huỳnh quang càng sáng ít ở phía ở phía cấy chủng vi khuẩn nào thì chủng Bacillus subtilis đó cho khả năng ức chế sản sinh aflatoxin càng mạnh. Sau thí nghiệm sơ bộ này, chọn những chủng vi khuẩn Bacillus subtilis cho khả năng ức chế sản sinh aflatoxin mạnh nhất để tiến hành thí nghiệm tiếp theo. Ghi chú: - Môi trường thạch nước cốt dừa dùng trong thí nghiệm trên không chứa kháng sinh. - Chỉ tiêu theo dõi: định tính khả năng ức chế sản sinh aflatoxin của các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis phân lập được. 3.6.4.Thí nghiệm 2: Khảo sát khả năng làm giảm aflatoxin sản sinh trên môi trƣờng bắp của các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis phân lập đƣợc 3.6.4.1. Phƣơng pháp thu hoạch và xác định số lƣợng bào tử nấm mốc Aspergillus flavus 3.6.4.1.1. Phƣơng pháp thu hoạch bào tử nấm mốc Aspergillus flavus Cấy chủng nấm mốc đã được kiểm tra khả năng sinh độc tố lên ống môi trường thạch nghiêng khoai tây, để ở nhiệt độ phòng 4 ngày. Sau đó cho khoảng 9 ml nước muối sinh lý vô trùng vào ống môi trường thạch nghiêng khoai tây đã cấy nấm mốc, 23 dùng que cấy móc khuấy nhẹ và hút lấy huyễn dịch bào tử bằng micropipette rồi cho vào một ống nghiệm vô trùng khác. Sau đó tiến hành đếm số lượng bào tử nấm mốc trong huyễn dịch thu được bằng phương pháp dùng buồng đếm Neubauer dưới kính hiển vi có độ phóng đại x 400 lần. 3.6.4.1.2. Phƣơng pháp xác định số lƣợng bào tử nấm mốc Aspergillus flavus Cố định buồng đếm Neubauer dưới kính hiển vi độ phóng đại x 400 lần, đặt lamell lên. Dùng micropipette hút 1 ít (khoảng 0,4 ml) huyễn dịch bào tử nấm mốc thu được nhỏ vào rãnh của buồng đếm. Để yên 1 - 2 phút để dịch đếm tự dàn đều khắp buồng đếm. Cộng số bào tử có được ở các ô vừa đếm và áp dụng công thức để xác định số lượng bào tử nấm mốc/ml (xem phụ lục). 3.6.4.2. Phƣơng pháp thu hoạch và xác định số lƣợng bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis 3.6.4.2.1. Phƣơng pháp thu hoạch huyễn dịch bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis Dùng que cấy vòng lấy một ít sinh khối của vi khuẩn Bacillus subtilis từ ống giống cấy chuyền sang môi trường ống thạch nghiên TSA, để ống TSA ở 370C trong 24 h. Tiếp theo cũng dùng que cấy vòng lấy một ít sinh khối vi khuẩn từ ống TSA cấy sang môi trường ống TSB lỏng, để ống TSB ở 370C trong 24 h. Sau đó dùng micropipette hút 0,1ml canh khuẩn từ môi trường TSB cho lên môi trường đĩa TSA và trang đều bằng que trang vô trùng, để đĩa TSA ở 370C trong khoảng 7 ngày. Sau đó nhuộm Gram theo dõi số lượng bào tử được hình thành. Tiến hành thu hoạch bào tử vi khuẩn khi có hơn 50% tế bào Bacillus subtilis ở dạng bào tử. Cuối cùng thu huyễn dịch bào tử bằng cách cho khoảng 9 ml nước muối sinh lý vô trùng vào đĩa TSA, dùng que trang vô trùng chà nhẹ lên mặt thạch, hút lấy huyễn dịch vi khuẩn bằng micropipette và cho vào ống nghiệm vô trùng. 24 Ống giống Cấy chuyển Cấy sang TSB Vi khuẩn Ống TSA Ống TSB Bacillus subtilis 37 0C/24 giờ 37oC/24 giờ Hút 0,1ml trang lên đĩa Đĩa TSA (để ở 37oC/7ngày) Cho nuớc muối sinh lý vô trùng vào đĩa TSA Thu hoạch huyễn dịch bào tử Ống huyễn dịch bào tử Bacillus subtilis Sơ đồ 3.2: Phƣơng pháp thu hoạch huyễn dịch bào tử Bacillus subtilis 3.6.4.2.2. Phƣơng pháp xác định số lƣợng bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis Pha loãng huyễn dịch bào tử vi khuẩn thu được theo bậc 10 liên tiếp bằng cách dùng các ống nghiệm chứa 9 ml nước muối vô trùng, đánh số thứ tự trên các ống nước muối. Dùng micropipette hút 1ml huyễn dịch vi khuẩn cho vào 2 ống nghiệm 1, bơm lên bơm xuống nhiều lần và lắc trên máy vortex để trộn đều, ta được nồng độ pha loãng 10 -1, hút 1ml từ ống 1 cho vào ống 2, trộn đều được nồng độ pha loãng 10-2 và tiếp tục cho tới ống cuối cùng. Sau đó chọn 3 nồng độ pha loãng liên tiếp thích hợp và đun cách thủy các ống nghiệm đó ở 700C trong 30 phút để làm chết các tế bào sinh dưỡng còn sót lại và hoạt hóa bào tử vi khuẩn. Đun xong, để nguội,dùng micropipette hút 0,1 huyễn dịch bào tử vi khuẩn cho lên môi trường đĩa TSA (mỗi nồng độ 2 đĩa), trang đều bằng que trang vô trùng, để đĩa TSA ở 370C trong 24 h. Sau đó đếm số lượng khuẩn lạc vi khuẩn hình thành trên đĩa. 25 Huyễn dịch Pha loãng bào tử Nồng độ Chọn 3 nồng độ vi khuẩn 10-1 đến 10-n pha loãng liên tiếp thích hợp Đun cách thủy ở 70oC/30 phút Hút 0,1ml trang lên đĩa TSA (mỗi nồng độ 2 đĩa) Để đĩa TSA ở 37oC/24 giờ Đếm số khuẩn lạc hình thành trên đĩa Sơ đồ 3.3: Phƣơng pháp xác định số lƣợng bào tử Bacillus subtilis 3.6.4.3. Bố trí thí nghiệm 3.6.4.3.1. Xử lý nguyên liệu bắp ban đầu trƣớc khi tiến hành thí nghiệm Nguyên liệu bắp được xay nhuyễn tương đối kích khoảng 2 – 3 µm. Sau đó được sấy khô bằng tủ sấy ở 110oC trong 30 phút nhằm ngăn chặn sự phát triển của nấm mốc, để bảo quản nguyên liệu bắp dùng trong các thí nghiệm. Tiếp theo tiến hành gửi mẫu bắp đã sấy đi phân tích hàm lượng aflatoxin bằng phương pháp sắc ký bản mỏng (TLC) nhằm xác định hàm lượng aflatoxin có trong nguyên liệu bắp ban đầu. 3.6.4.3.2. Nuôi cấy chung bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis và bào tử nấm Aspergillus flavus trên môi trƣờng nguyên liệu bắp Sau khi xác định được số lượng thì tiến hành nuôi cấy chung bào tử nấm mốc và bào tử vi khuẩn trên môi trường bắp theo tỷ lệ và số lượng phù hợp.Tỷ lệ bào tử nấm mốc và bào tử vi khuẩn là 1/102. 26 Bảng 3.1: Bố trí thí nghiệm 2 Tỷ lệ bào tử nấm/bào tử vi khuẩn Số lượng bào tử 1/10 2 Thí nghiệm Đối chứng Nấm mốc (1 chủng) 104 104 Vi khuẩn (8 chủng) 106 - Ghi chú: - Mẫu đối chứng không bổ sung bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis - Sau khi cấy bào tử nấm mốc và bào tử vi khuẩn theo tỷ lệ nghiên cứu thì đặt các chai ở nhiệt độ phòng (25-300C), hàng ngày lắc đều chai để tránh hiện tượng vón cục và tạo độ thoáng giữa các hạt . - Sau 7 ngày gửi mẫu phân tích hàm lượng aflatoxin bằng phương pháp sắc ký bản mỏng (TLC) - Chỉ tiêu theo dõi: hàm lượng của aflatoxin của mẫu đối chứng và mẫu thí nghiệm 3.6.5. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hƣởng của tỷ lệ bào tử nấm mốc /bào tử vi khuẩn đối với sự sản sinh aflatoxin Thí nghiệm 2 cho thấy một số chủng vi khuẩn Bacillus subtilis phân lập được có khả năng làm giảm aflatoxin trên bắp nhưng kết quả chưa tốt lắm. Vì vậy chúng tôi tiến hành thí nghiệm 3với mục đích tìm ra tỷ lệ bào tử nấm mốc/bào tử vi khuẩn để vi khuẩn có thể ức chế aflatoxin tốt nhất. Dựa vào kết quả phân tích hàm luợng aflatoxin của thí nghiệm 2, chọn chủng vi khuẩn Bacillus subtilis có khả năng làm giảm aflatoxin mạnh nhất để thực hiện thí nghiệm 3. 27 Hình 3.1: Nuôi cấy bào tử vi khuẩn và bào tử nấm mốc trên môi trƣờng bắp 3.6.5.1. Phƣơng pháp thu hoạch và xác định số lƣợng bào tử nấm mốc Aspergillus flavus Tiến hành giống như mục 3.6.4.1 ở trang 22 3.6.5.2. Phƣơng pháp thu hoạch và xác định số lƣợng bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis Tiến hành giống như mục 3.6.4.2 ở trang 23 3.6.5.3. Bố trí thí nghiệm Trong thí nghiệm này, số lượng bào tử nấm Aspergillus flavus vẫn giữ nguyên như như ở thí nghiệm 2 là 104 , còn số lượng bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis thay đổi tăng 10 lần so với số lượng bào tử vi khuẩn sử dụng ở thí nghiệm 2. Bảng 3.2: Bố trí thí nghiệm 3 Tỷ lệ bào tử nấm mốc/bào tử vi khuẩn Số lượng bào tử Mẫu đối chứng 1/10 3 1/10 4 1/10 5 Nấm mốc 104 104 104 104 Vi khuẩn: chủng 8 - 107 108 109 Ghi chú: - Mẫu đối chứng không được bổ sung bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis . 28 - Sau khi cấy bào tử nấm mốc và bào tử vi khuẩn theo tỷ lệ nghiên cứu thì đặt các chai ở nhiệt độ phòng (25-300C), hàng ngày lắc đều chai để tránh hiện tượng vón cục và tạo độ thoáng giữa các hạt . - Sau thời gian 7 ngày gửi mẫu đi phân tích hàm lượng aflatoxin. - Chỉ tiêu theo dõi: hàm lượng aflatoxin mẫu thí nghiệm và mẫu đối chứng. 3.6.6. Thí nghiệm 4:Thử mức độ an toàn của ngƣyên liệu bắp đã nhiễm aflatoxin sau khi xử lý bằng vi khuẩn Bacillus subtilis (có khả năng ức chế aflatoxin) trên vịt nuôi. Tiến hành xác định liều độc tố aflatoxin quy định có trong thức ăn hỗn hợp dành cho vịt con là 0 bbp. Trong thí nghiệm tăng liều độc tố trong nguyên liệu lên 100 lần là 100 bbp cho vịt ăn ( Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn Việt Nam, 2002; trích dẫn bởi Lê Anh Phụng ). Sau đó, tiến hành nuôi cấy bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis (chủng 8) với nguyên liệu bắp đã nhiễm aflatoxin với hàm lượng độc tố 100bbp trơng 7 ngày và sấy khô ở 1100C/15phút. Phân lô thí nghiệm: chia làm 4 lô thí nghiệm, mỗi lô 10 con vịt. - Lô 1: cho vịt ăn nguyên liệu bắp ban đầu (đã xác định hàm lượng aflatoxin là 0bbp), được sấy khô. - Lô 2: cho vịt ăn nguyên liệu bắp nhiễm aflatoxin với hàm lượng 100 bbp, được sấy khô. - Lô 3: cho vịt ăn nguyên liệu bắp đã nhiễm aflatoxin như lô 2 nhưng được nuôi cấy với bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis sau 7 ngày và được sấy khô. - Lô 4: cho vịt ăn nguyên liệu bắp nhiễm aflatoxin như ở lô 2 nhưng có bổ sung thêm bào tử Bacillus subtilis (với số lượng 109 CFU/ml) vào thời điểm cho vịt ăn với số lượng bào tử vi khuẩn là 109 CFU/ml cho 100g bắp. Sau đó, theo dõi kết quả trong 7 ngày. Ghi nhận số vịt chết, sống và lấy mẫu gan đi phân tích. Ghi chú: - Vịt làm thí nghiệm ở 3 ngày tuổi - Chủng vi khuẩn Bacillus subtilis được sử dụng trong thí nghiệm là chủng 8 29 - Số lượng bào tử vi khuẩn bổ sung trong thí nghiệm 4 là 109 CFU/ml - Chỉ tiêu theo dõi: khả năng sống, chết của vịt. Xác định bệnh tích đại thể và vi thể của gan vịt ở các lô thí nghiệm. 3.7. PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH MẪU Phân tích hàm lượng aflatoxin bằng phương pháp sắc ký bản mỏng (TLC). 3.8. PHƢƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU Các số liệu được xử lý bằng trắc nghiệm F kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên 1 yếu tố và so sánh các số trung bình bằng trắc nghiệm Tukey (bằng phần mềm Minitab 12.0). 30 Chƣơng 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA BACILLUS SUBTILIS 4.1.1. Quan sát đặc điểm khuẩn lạc nghi ngờ là Bacillus subtilis Sau 24 giờ cấy trang mẫu đất trên môi trường đĩa TSA, quan sát và bắt giữ những khuẩn lạc có đặc điểm như hình 4.1: mọc lan trên mặt thạch, khuẩn lạc có bề mặt thô, màu xám trắng, tâm đậm màu, viền răng cưa. Tiếp theo là làm tiêu bản nhuộm Gram từng chủng vi khuẩn phân lặp được và quan sát dưới kính hiển vi (độ phóng đại 1000 lần) để khảo sát đặc điểm hình thái. Khuẩn lạc nghi ngờ Hình 4.1: Khuẩn lạc nghi ngờ Bacillus subtilis trên môi trƣờng TSA 31 4.1.2. Đặc điểm hình thái của vi khuẩn nghi ngờ là Bacillus subtilis sau nhuộm Gram Nhuộm Gram tiêu bản vi khuẩn và quan sát dưới kính hiển vi ở độ phóng đại 1000 lần, chúng tôi nhận thấy các chủng vi khuẩn được nghi ngờ có hình thái giống với Bacillus subtilis, là những trực khuẩn bắt màu Gram dương, ngắn và nhỏ, kích thước 0,5 – 0,8 m x 1,5 - 3 m, hai đầu tròn, thường đứng riêng lẻ, đôi khi xếp thành chuỗi ngắn từ 3 - 5 tế bào, có bào tử hai đầu bắt màu và bào tử nhỏ, ngắn hơn tế bào sinh dưỡng. Bào tử tế bào sinh dưỡng Hình 4.2: Hình dạng tế bào và bào tử của Bacillus subtilis sau khi nhuộm Gram 4.1.3. Khảo sát các đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn nghi ngờ là Bacillus subtilis Các chủng phân lập có đặc điểm hình thái phù hợp với vi khuẩn Bacillus subtilis được chọn làm một số phản ứng sinh hóa để khẳng định. Kết quả được trình bày ở bảng 4.1 32 Bảng 4.1: Kết quả thử phản ứng sinh hóa của các chủng phân lập đƣợc Chủng phân lập Các phản ứng sinh hóa Catalase Lecithinase Nitrate MR-VP Citrate Maltose 1 + - + + + + 2 + - + + + + 3 + - + + + + 4 + - + + + + 5 + - + + + + 6 + - + + + + 7 + - + + + + 8 + - + + + + Ghi chú: (+) là phản ứng dương tính (-) là phản ứng âm tính Sau khi tiến hành thử phản ứng sinh hóa của 98 chủng nghi ngờ, chúng tôi xác định được có 8 chủng là Bacillus subtilis. Tiếp theo chúng tôi tiến hành thí nghiệm đánh giá sơ bộ khả năng ức chế sản sinh aflatoxin trên môi trường thạch nước cốt dừa của các chủng Bacillus subtilis phân lập được. Lecithinase (+) Lecithinase (-) 33 MR(-) VP (-) MR(+) VP(+) Citrate (+) Citrate (-) Hình 4.3: Kết quả các phản ứng sinh hóa xác định Bacillus subtilis 4.2.THÍ NGHIỆM 1: KIỂM TRA KHẢ NĂNG SINH AFLATOXIN CỦA CHỦNG NẤM MỐC ASPERGILLUS FLAVUS VÀ ĐÁNH GIÁ SƠ BỘ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ SẢN SINH AFLATOXIN CỦA CÁC CHỦNG BACILLUS SUBTILIS PHÂN LẬP ĐƢỢC. 4.2.1. Kiểm tra khả năng sinh aflatoxin của chủng nấm mốc Aspergillus flavus. Sau 5 ngày nuôi cấy trên môi trường thạch nước cốt dừa đem xem dưới đèn UV (365nm) được kết quả như hình 4.3. 34 Vòng sáng aflatoxin Hình 4.4: Khuẩn lạc Aspergillus flavus dƣới ánh đèn UV sau 5 ngày nuôi cấy trên môi trƣờng thạch nƣớc cốt dừa Vòng sáng phát ra xung quanh khuẩn lạc nấm mốc là vòng aflatoxin được Aspergillus flavus sản sinh. Vòng phát ra càng rộng, càng sáng thì nồng độ độc tố sản sinh càng cao, càng mạnh. Dùng chủng nấm mốc sau khi kiểm tra có sinh độc tố aflatoxin để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo. 4.2.2. Thí nghiệm đánh giá sơ bộ khả năng ức chế sản sinh aflatoxin của các chủng Bacillus subtilis phân lập đƣợc. Quan sát từ ngày đầu cấy nấm mốc đến ngày thứ 5 vẫn chưa cho kết quả theo mong đợi. Khuẩn lạc nấm mốc Aspergillus flavus chưa lấn sâu vào các khuẩn lạc vi khuẩn Bacillus subtilis, lúc này quan sát bên ngoài vẫn thấy khuẩn lạc nấm mốc chưa bị khuyết ở các nơi sắp tiếp xúc với khuẩn lạc vi khuẩn và khi xem dưới ánh đèn tia cực tím (UV) ở bước sóng 365 nm thì vẫn phát hiện vòng sáng đều xung quanh khuẩn lạc nấm mốc của độc tố aflatoxin phát ra. 35 Vi khuẩn nấm mốc vi khuẩn Hình 4.5: Khuẩn lạc Aspergillus flavus tiếp xúc và chƣa tiếp xúc với khuẩn lạc Bacillus subtilis trên môi trƣờng thạch nƣớc cốt dừa Đến ngày nuôi cấy thứ 6, bước đầu quan sát thấy kết quả nhưng chưa rõ ràng. Sang ngày thứ 7, quan sát bên ngoài thấy khuẩn lạc nấm mốc bị khuyết ở những phía đã tiếp xúc với các khuẩn lạc vi khuẩn, còn những phía không tiếp xúc với vi khuẩn thì khuẩn lạc nấm mốc phát triển lấn ra tận bên ngoài như hình 4.5. Vi khuẩn nấm mốc Hình 4.6: Sự ức chế phát triển của khuẩn lạc vi khuẩn đối với nấm mốc Dưới ánh đèn tia cực tím (UV) có bước sóng 365nm chúng tôi nhận thấy vòng sáng độc tố xung quanh khuẩn lạc nấm mốc không đều, những nơi đã tiếp xúc với các khuẩn lạc Bacillus subtilis vòng sáng bị mờ đi rất nhiều so với những nơi vòng sáng không tiếp xúc với khuẩn lạc vi khuẩn như hình 4.6. 36 C8 C6 C1 C2 C7 C4 C8 C3 C5 Hình 4.7:Vòng sáng aflatoxin không đều ở các phía của khuẩn lạc Aspergillus flavus Những nơi khuẩn lạc Aspergillus flavus tiếp xúc với các khuẩn lạc của Bacillus subtilis bị khuyết vào không phát triển cho thấy vi khuẩn Bacillus subtilis có khả năng ức chế sự phát triển của nấm mốc Aspergillus flavus. Kết quả quan sát dưới ánh đèn tia cực tím được thấy rõ qua hình 4.6 cho thấy vi khuẩn Bacillus subtilis có khả năng ức chế sản sinh độc tố aflatoxin của nấm mốc Aspergillus flavus. So sánh khả năng ức chế sản sinh aflatoxin của 8 chủng vi Bacillus subtilis phân lập được thể hiện qua độ sáng của vòng aflatoxin (nơi đã tiếp xúc với khuẩn lạc của vi khuẩn) dưới ánh đèn cực tím (UV) cho kết quả được trình bày ở bảng 4.2 Bảng 4.2: So sánh khả năng ức chế sản sinh aflatoxin của 8 chủng Bacillus subtilis Ký hiệu chủng Bacillus subtilis Cấp độ sáng của vòng aflatoxin Chủng 1 ++ Chủng 2 ++++ Chủng 3 +++ Chủng 4 ++++ Chủng 5 ++ Chủng 6 +++ Chủng 7 +++++ Chủng 8 + 37 Ghi chú: (+) là cấp độ sáng của vòng độc tố aflatoxin tại những nơi vòng sáng tiếp xúc với khuẩn lạc vi khuẩn. Chủng 8 cho thấy độ sáng của vòng độc tố mờ nhất. Chủng 1, chủng 3, chủng 5, chủng 6 cho thấy độ sáng của vòng độc tố cũng mờ đi so với độ sáng của vòng aflatoxin tại nơi không tiếp xúc với vi khuẩn. Riêng chủng 2, chủng 4 và chủng 7 cho độ sáng của vòng độc tố sáng nhất trong 8 chủng. Như vậy, bước đầu chúng tôi có thể định hướng được khả năng ức chế sự phát triển và sản sinh độc tố của Aspergillus flavus của các chủng Bacillus subtilis đã khảo sát. Trong thí nghiệm của chúng tôi chủng 8 cho khả năng ức chế rõ nhất. Để tìm hiểu rõ thêm chúng tôi tiến hành thí nghiệm tiếp theo. 4.3. THÍ NGHIỆM 2 : KHẢO SÁT KHẢ NĂNG LÀM GIẢM AFLATOXIN SẢN SINH TRÊN MÔI TRƢỜNG BẮP CỦA CÁC CHỦNG BACILLUS SUBTILIS PHÂN LẬP ĐƢỢC. Các bƣớc tiến hành thí nghiệm: - Bào tử nấm mốc Aspergillus flavus được thu hoạch và xác định số lượng bằng phương pháp dùng buồng đếm Neubauer, kết quả thu được là 9,6.106 bào tử/ml huyễn dịch thu được. - Bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis được thu hoạch và xác định số lượng bằng phương pháp trang đĩa, kết quả cho thấy số lượng bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis của các chủng dao động từ 7,02.108 CFU/ml đến 89,30.108 CFU/ml. - Sau khi đã xác định được số lượng bào tử nấm mốc và bào tử vi khuẩn thì tiến hành nuôi cấy trên môi trường bắp theo tỷ lệ bào tử nấm mốc/bào tử vi khuẩn là 1/102. Trước khi nuôi cấy, bắp phải được xác định là không nhiễm aflatoxin và môi trường được hấp triệt trùng ở 1210C/15 phút. Đặt các chai môi trường bắp đã được trộn bào tử Aspergillus flavus và bào tử Bacillus subtilis ở nhiệt độ phòng, hàng ngày lắc đều các chai để tránh hiện tượng vón cục và tạo độ thông thoáng giữa các hạt nhằm tạo điều kiện phát triển tốt. Sau 7 ngày 38 nuôi cấy, các mẫu bắp được gửi phân tích hàm lượng aflatoxin bằng phương pháp sắc ký bản mỏng (TLC), kết quả được trình bày ở bảng 4.3. Bảng 4.3: Kết quả phân tích hàm lƣợng aflatoxin của thí nghiệm 2 Ký hiệu mẫu Hàm lượng aflatoxin trung bình (ppb) Bắp (nguyên liệu) 0 Đối chứng: Aspergillus flavus 6.300 Chủng 1 + Aspergillus flavus 4.250 Chủng 2 + Aspergillus flavus 15.800 Chủng 3 + Aspergillus flavus 5.250 Chủng 4 + Aspergillus flavus 15.000 Chủng 5 + Aspergillus flavus 4.660 Chủng 6 + Aspergillus flavus 5.410 Chủng7 + Aspergillus flavus 18.200 Chủng 8 + Aspergillus flavus 2.750 Kết quả trình bày ở bảng 4.3 cho thấy một số chủng vi khuẩn Bacillus subtilis có khả năng làm giảm aflatoxin so với mẫu đối chứng và kết quả thay đổi tùy theo chủng. Trong 8 chủng phân lập được làm thí nghiệm có 5 chủng làm giảm hàm lượng aflatoxin so với mẫu đối chứng và sự giảm này có ý nghĩa về mặt thống kê (P<0,05) . Chủng vi khuẩn làm giảm độc tố mạnh nhất so với mẫu đối chứng là chủng 8, giảm gần 2,5 lần (2.750 ppb so với 6.300 ppb) và sự khác biệt này có ý nghĩa về mặt thống kê (P<0,05) . Tuy nhiên, cũng có một số chủng làm tăng hàm lượng aflatoxin so với mẫu đối chứng như chủng 2, chủng 4 và chủng 7 (15.800 ppb, 15.000 ppb và 18.200 ppb so với 6.300 ppb). Đối với các chủng làm tăng hàm lượng độc tố aflatoxin cũng cần được tìm hiểu sâu hơn để có thể ứng dụng trong sản xuất độc tố tinh nhằm phục vụ cho công tác nghiên cứu khoa học. Như vậy, dựa vào kết quả thí nghiệm 2 chúng tôi khẳng định kết quả thí nghiệm đánh giá sơ bộ khả năng ức chế sản sinh aflatoxin của các chủng Bacillus subtilis phân lập được là hoàn toàn hợp lý. Chủng 8 làm độ sáng của vòng aflatoxin mờ nhất (phía tiếp xúc với khuẩn lạc vi khuẩn) thì ở thí nghiệm 2 cho khả năng ức chết sản sinh 39 aflatoxin nhiều nhất (2.700 ppb so với 6.300 ppb). Các chủng 1, chủng 3, chủng 5, chủng 6 cũng làm độ sáng vòng aflatoxin mờ đi (phía tiếp xúc với khuẩn lạc vi khuẩn) so với độ sáng vòng aflatoxin phía không tiếp xúc với khuẩn lạc vi khuẩn thì ở thí nghiệm 2 cũng cho khả năng giảm hàm lượng aflatoxin (so với mẫu đối chứng). Sau khi tiến hành thí nghiệm trên cho thấy các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis phân lập được từ đất có khả năng làm giảm aflatoxin trên bắp. Nhưng muốn tìm hiểu xem khi tăng số lượng bào tử Bacillus subtilis lên thì kết quả như thế nào nên chúng tôi tiến hành thí nghiệm 3. 4.4. THÍ NGHIỆM 3: KHẢO SÁT ẢNH HƢỞNG CỦA TỶ LỆ BÀO TỬ NẤM MỐC/BÀO TỬ VI KHUẨN ĐỐI VỚI SỰ SẢN SINH AFLATOXIN Kết quả ở thí nghiệm 2 cho thấy chủng 8 làm giảm hàm lượng aflatoxin nhiều nhất so với mẫu đối chứng (2.750 ppb so với 6.300 ppb) nên chúng tôi chọn chủng 8 để tiến hành tiếp thí nghiệm 2. Theo quy luật tự nhiên khi số lượng bào tử nấm mốc vẫn giữ nguyên như thí nghiệm 1 nhưng số lượng bào tử vi khuẩn càng tăng thì sẽ cho khả năng ức chế nấm mốc càng cao. Trong thí nghiệm 1 với tỷ lệ bào tử nấm mốc/bào tử vi khuẩn là 1/102 cho thấy hàm lượng aflatoxin ở các mẫu thí nghiệm của vi khuẩn chủng 8 giảm gần 2,5 lần so với mẫu đối chứng (2.750 ppb so với 6.300 ppb). Với mục đích tìm kiếm khả năng làm giảm hơn nữa lượng aflatoxin nên chúng tôi chọn tỷ lệ bào tử nấm mốc/bào tử vi khuẩn lần lượt là 1/103, 1/104, 1/105 trong thí nghiệm 3. Các bước tiến hành thí nghiệm 3 vẫn giống như thí nghiệm 2: - Thu hoạch và xác định số lượng bào tử nấm mốc bằng phương pháp buồng đếm Neubauer, kết quả có được là 11,8. 108 bào tử/ml huyễn dịch. - Thu hoạch và xác định số lượng bào tử vi khuẩn bằng phương pháp trang đĩa. - Tiếp theo tiến hành nuôi cấy bào tử nấm mốc và bào tử vi khuẩn lên môi trường bắp theo tỷ lệ bào tử nấm mốc/bào tử vi khuẩn lần lượt là 1/103, 1/104, 1/105, thí nghiệm được lặp lại 1 lần. Sau 7 ngày nuôi cấy, mẫu được gửi đi phân tích hàm lượng aflatoxin bằng phương pháp sắc ký bản mỏng (TLC), kết quả được trình bày ở bảng 4.4. 40 Bảng 4.4: Kết quả thí nghiệm 3 Tên mẫu (tỷ lệ bào tử nấm mốc/bào tử vi khuẩn) Hàm lượng aflatoxin (ppb) Mẫu đối chứng: Aspergillus flavus 6.300 Aspergillus flavus + chủng 8 (1/103) 2.155 Aspergillus flavus + chủng 8 (1/104) 1.960 Aspergillus flavus + chủng 8 (1/105) 715 Kết quả trình bày ở bảng cho thấy: hàm lượng aflatoxin ở các mẫu thí nghiệm giảm so với mẫu đối chứng và sự giảm này có ý nghĩa về phương diện thống kê học (P<0,05). Hàm lượng aflatoxin giảm dần khi số lượng bào tử vi khuẩn tăng dần. Trong đó, hàm lượng aflatoxin ở tỷ lệ 1/103 không có sự khác biệt về mặt thống kê so với tỷ lệ 1/10 4 (P>0,05) nhưng có sự khác biệt so với tỷ lệ 1/105 (P<0,05). Sự biến thiên hàm lượng aflatoxin theo tỷ lệ nuôi cấy như trên là hợp lý. Theo quy luật tự nhiên, khi số lượng bào tử nấm mốc không thay đổi và số lượng bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis được nuôi cấy càng nhiều thì khả năng ức chế sự phát triển của nấm mốc càng cao và làm giảm aflatoxin càng mạnh. Khi quan sát môi trường bắp sau 7 ngày nuôi cấy sẽ thấy có sự khác biệt về sự sinh trưởng và phát triển của nấm mốc giữa các mẫu thí nghiệm và mẫu đối chứng, sự khác biệt này được trình bày ở hình 4.7. Mẫu đối chứng Mẫu thí nghiệm Hình 4.8: So sánh các mẫu bắp 41 Mẫu đối chứng: môi trường bắp chỉ bổ sung bào tử Aspergillus flavus Mẫu thí nghiệm: môi trường bắp bổ sung bào tử nấm mốc và bào tử vi khuẩn. Hình 4.7 cho thấy ở mẫu đối chứng do không bổ sung bào tử vi khuẩn nên nấm mốc phát triển rất mạnh, làm cho môi trường bắp có màu vàng xanh, còn ở mẫu thí nghiệm thì nấm mốc phát triển ít nên ít xanh hơn và vẫn giữ được màu vàng tự nhiên của bắp. Qua đó có thể rút ra giả thuyết ban đầu như sau:do vi khuẩn Bacillus subtilis ức chế quá trình sinh trưởng và sinh tổng hợp aflatoxin của nấm mốc Aspergilus flavus nên hàm lượng aflatoxin của mẫu thí nghiệm giảm so với mẫu đối chứng. Do aflatoxin là sản phẩm thứ cấp của nấm mốc nên chỉ được tạo khi nấm đã phát triển.Vì vậy, nếu có yếu tố nào ngăn cản sự sinh trưởng và phát triển của nấm mốc thì sẽ ảnh hưởng đến quá trình sản sinh aflatoxin. Các yếu tố gây bất lợi cho sự sinh trưởng và phát triển của nấm mốc có thể là các nhóm polypeptide như surfactin, agrastatin và iturin do vi khuẩn tiết ra. Tuy nhiên do thời gian thí nghiệm có hạn nên chúng tôi không thể xác định được chủng 8 có tiết ra các hợp chất trên hay không. Vì thế cần tiếp tục nghiên cứu để rút ra kết luận cụ thể hơn. 42 4.5. THÍ NGHIỆM 4: THỬ MỨC ĐỘ AN TOÀN CỦA NGHUYÊN LIỆU BẮP ĐÃ NHIỄM AFLATOXIN SAU KHI XỬ LÝ BẰNG VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS (CÓ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ AFLATOXIN) TRÊN VỊT NUÔI. Theo dõi thí nghiệm trong 7 ngày được kết quả trình bày như bảng: Bảng 4.5: Kết quả thí nghiệm 4 Ngày thí nghiệm từ ngày thứ 1-3 Lô thí nghiệm Dấu hiệu nhận thấy Tỷ lệ vịt có dấu hiệu nhận thấy % vịt chết Lô 1 Khỏe mạnh 10/10 0% Lô 2 Khờ, chậm chạp Khỏe mạnh 4/10 6/10 0% Lô 3 Khỏe mạnh 10/10 0% Lô 4 Khỏe mạnh 10/10 0% Ngày thí nghiệm thứ 4-5 Lô 1 Khỏe mạnh 10/10 0% Lô 2 Chết Liệt, co giật Khờ, chậm chạp 5/10 2/10 3/10 50% Lô 3 Chết Khờ, chậm chạp Liệt, co giật Khỏe mạnh 2/10 3/10 1/10 4/10 20% Lô 4 Khờ, chậm chạp Khỏe mạnh 3/10 8/10 0% Ngày thí nghiệm thứ 6-7 Lô 1 Khỏe mạnh 10/10 0% Lô 2 Chết 10/10 100% Lô 3 Chết Khờ, chậm chạp Khỏe mạnh 5/10 3/10 2/10 50% Lô 4 Chết Khờ, chậm chạp Khỏe mạnh 3/10 3/10 4/10 30% Ghi chú: - Khỏe mạnh: vịt có dấu hiệu bình thường so với trước khi tiến hành thí nghiệm - Khờ, chậm chạp: gồm các biểu hiện như chậm chạp, rút cổ, không ăn,… Những mẫu vịt chết ở các lô được mổ quan sát bệnh tích đại thể trên gan và gửi đi phân tích vi thể. 43 Kết quả trình bày ở bảng 4.5 cho kết quả vịt chết do nhiễm độc tố aflatoxin khác nhau và sự khác nhau này có ý nghĩa về phương diện thống kê học (P<0,01). Ở những ngày đầu thí nghiệm, do lượng độc tố nhiễm vào vịt ít chưa đủ khả năng gây chết vịt. Ở lô 2, toàn bộ vịt thí nghiệm đều chết nhưng ở lô 3 và lô 4 số vịt chết giảm đi so với lô 2 chứng tỏ rằng dưới tác động của vi khuẩn Bacillus subtilis hàm lượng độc tố aflatoxin trong mẫu thí nghiệm dùng trong lô 3 từ 100 bbp ban đầu có thể giảm đi nhiều so với mẫu bắp thí nghiệm ở lô 2. Ở lô 4, vịt được cho ăn cùng loại thức ăn với lô 2 nhưng có bổ sung thêm bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis vào thời điểm cho ăn, có thể do chính Bacillus subtilis sống khi vào cơ thể vịt tiếp tục sản sinh các chất ức chế tác động của aflatoxin trên vịt vì thế làm giảm tỷ lệ chết của vịt. Khờ Liệt, co giật Chết Hìnkh 4.9: Kết quả thí nghiệm lô 2 sau 4 ngày Kết quả quan sát bệnh tích đại thể các mẫu gan được trình bày ở bảng 4.6 44 Bảng 4.6: So sánh sự khác nhau về bệnh tích đại thể các mẫu gan vịt ở các lô thí nghiệm Chỉ tiêu quan sát Lô 1(đối chứng) Lô 2 Lô 3 Lô 4 Màu Vàng hồng Đỏ sậm-đỏ đen Vàng sậm-đỏ sậm Vàng sậm-đỏ sậm Xuất huyết Không Xuất huyết cục bộ Xuất huyết cục bộ Xuất huyết cục bộ Sưng gan Không Sưng ( bề mặt căng phồng ) Sưng Sưng Gan đối chứng Gan nhiễm aflatoxin Hình 4.10: Sự khác nhau giữa 2 mẫu gan vịt Ngoài ra, có sự khác nhau về mức độ của bệnh tích đại thể về các chỉ tiêu ở bảng của các mẫu gan vịt bị nhiễm độc tố aflatoxin khi quan sát trên gan vịt chết, vịt liệt và co giật, vịt nhiễm nhưng chưa chết. Quan sát bệnh tích vi thể gan vịt ở các lô cho kết quả được trình bày ở bảng 4.7 45 Bảng 4.7: Kết quả bệnh tích vi thể gan của vịt ở các lô thí nghiệm Chỉ tiêu quan sát Lô 1 ( lô đối chứng) Lô 2 Lô 3 Lô 4 Xung huyết Không Rất nặng Rất nhẹ Nhẹ Tế bào bị thoái hóa mỡ Có Có Rất nhẹ Nhẹ Mô gan có dấu hiệu hồi phục Không Có dấu hiệu hồi phục nhiều Có Kết quả trình bày ở bảng 4.7 cho sự khác nhau về bệnh tích vi thể giữa các mẫu gan ở các lô thí nghiệm. Ở các lô thí nghiệm mẫu gan đều bị thoái hóa mỡ ở các mức độ khác nhau giữa các lô do vịt sử dụng thức ăn là bắp trong quá trình tiến hành thí nghiệm. Ở lô 2 vịt ăn bắp chứa aflatoxin không xử lý với Bacillus subtilis, mẫu gan bị tổn thương nặng nề nhất như hình 4.11. Ở lô 3, lô 4 vịt ăn mẫu bắp nhiễm aflatoxin có xử lý Bacillus subtilis, mẫu gan ít bị tổn thương hơn và có dấu hiệu mô gan được hồi phục (tế bào gan bắt màu nhuộm đậm hơn) so với lô 2. 46 Thoái hóa mỡ Xuất huyết nặng Thoái hóa mỡ nặng Lô 1 Lô 2 Xuất huyết nhẹ Tế bào gan hồi phục Thoái hóa mỡ nhẹ Lô 3 Lô 4 Hình 4.11: Bệnh tích vi thể các mẫu gan vịt ở các lô thí nghiệm 47 Chƣơng 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. KẾT LUẬN Sau thời gian thực hiện đề tài chúng tôi có những kết luận sau: - Có thể phân lập được vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất. - Vi khuẩn Bacillus subtilis được phân lập từ đất có khả năng làm giảm aflatoxin trên bắp. - Tỷ lệ nuôi cấy thích hợp giữa bào tử nấm mốc/bào tử vi khuẩn để vi khuẩn có khả năng làm giảm aflatoxin là thay đổi tùy chủng. - Có thể ứng dụng trong xử lý nguyên liệu nhiễm aflatoxin bằng Bacillus subtilis trong chăn nuôi gia cầm như vịt. 5.2. ĐỀ NGHỊ - Chủng vi khuẩn Bacillus subtilis mà chúng tôi phân lặp được từ đất có khả năng làm giảm aflatoxin nhưng lượng giảm chưa nhiều nên cần tiếp tục tìm kiếm các chủng khác từ nước, không khí, cỏ khô,… - Cần tiếp tục khảo sát tỷ lệ nuôi cấy thích hợp giữa bào tử vi khuẩn nấm mốc/bào tử vi khuẩn để tìm được tỷ lệ phù hợp cho từng chủng. - Cần tìm hiểu về phương thức tác động làm giảm aflatoxin của vi khuẩn Bacillus subtilis. - Khảo sát khả năng làm giảm aflatoxin của các sinh vật khác như Bacillus pulimus, Bacillus megaterium, Saccharomyces cerevisiae,…. - Khảo sát thêm ảnh hưởng của Bacillus subtilis đối với một số độc tố nguy hiểm khác như fumonisin, ochratoxin,…- Thử nghiệm với thức ăn công nghiệp gây nhiễm độc tố trong chăn nuôi gia cầm. 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO Phần Tiếng Việt 1. Bùi Xuân Đồng, 2004. Nguyên lý phòng chống nấm mốc và mycotoxin. NXB khoa học và kỹ thuật. 2. Đậu Ngọc Hào, Lê Thị Ngọc Diệp, 2003. Nấm mốc và độc tố aflatoxin trong thức ăn chăn nuôi. NXB nông nghiệp. 3. Kiều Hữu Cảnh, 1999. Giáo trình vi sinh vật học công nghiệp. NXB khoa học và kỹ thuật. 4. Tô Minh Châu, 2000. Giáo trình vi sinh vật ứng dụng trong chăn nuôi. Tủ sách Đại học Nông Lâm Tp.Hồ Chí Minh . 5. Dương Thanh Liêm, Bùi Huy Như Phúc, Dương Duy Đồng, 2002. Thức ăn và dinh dưỡng động vật. NXB nông nghiệp. 6. Nguyễn Huỳnh Nam, 2006. Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis trong phân heo và thử đối kháng với Escherichia coli gây bệnh tiêu chảy trên heo. Luận văn tốt nghiệp. Khoa công nghệ sinh học. Đại học Nông Lâm TP.Hồ Chí Minh. 7. Lý Kim Hữu, 2005. Khảo sát đặc điểm của vi khuẩn Bacillus subtilis và tìm hiểu điều kiện nuôi cấy thích hợp sản xuất thử nghiệm chế phẩm propiotic. Luận văn tốt nghiệp. Khoa Chăn Nuôi-Thú Y. Trường Đại học Nông Lâm Tp.Hồ Chí Minh . 8. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty, 2001. Vi sinh vật học. NXB giáo dục . 9. Dương Thanh Liêm, 2002. Giáo trình độc chất học.Tủ sách Đại học Nông Lâm TP.Hồ Chí Minh. 10. Trần Linh Phước, 2005. Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mỹ phẩm. NXB giáo dục. 11. Lê Anh Phụng, 2001. Bệnh nhiễm độc aflatoxin và các phương pháp phát hiện aflatoxin. Chuyên đề cấp tiến sĩ Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. 49 12. Nguyễn Duy Khánh, 2000. Khảo sát điều kiện nuôi cấy và sinh bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis. Luân văn kỹ sư chuyên ngành công nghệ sinh học. 13. Nguyễn Khắc Tuấn, 1996. Vi sinh vật học. NXB nông nghiệp. 14. Trần Bắc Vi, 2005. Phân lặp Aspergillus flavus trên bánh dầu phộng bị mốc và khảo sát khả năng sinh aflatoxin của các chủng phân lặp được. Luận văn tốt nghiệp. Khoa Chăn Nuôi Thú Y. Đại học Nông Lâm TP.Hồ Chí Minh. 15. Lê Anh Phụng, 2001. Nấm mốc sinh độc tố và ảnh hưởng của độc tố nấm mốc đối với động vật. Hướng khắc phục độc tố của nấm mốc. Chuyên đề cấp tiến sĩ Đại học Nông Lâm TP.Hồ Chí Minh. Tài liệu tham khảo tiếng Anh 16. A..CIEGLER, E. B LILLEHOJ, R. E. PETERSON, AND H. H. HALL . Microbial detoxification of aflatoxin. May 1966. 17. J. W. BENNETT and KLICH . Mycotoxins. CLINICAL MICROBIOLOGY REVIEWS, Junly 2003. 18. A. M. Fakhoury and C. P. Woloshuk. Inhibition of Growth of Aspergillus flavus and Fungal a-Amylases by a Lectun-Like Protein from Lablab purpureus. January 2001. Tài liệu tham khảo trên internet 19. 20. 21. PHỤ LỤC I. CÁC PHẢN ỨNG SINH HÓA 1.1. Phản ứng catalase Chuẩn bị Dung dịch H2O2 30 % Lame Giống vi khuẩn Bacillus subtilis Tiến hành: dùng que cấy vòng, bằng thao tác vô trùng lấy một ít sinh khối vi khuẩn Bacillus subtilis phết lên lam kính sạch và khô. Sau đó nhỏ giọt H202 30% lên vết phết vi khuẩn. Đọc kết quả sau khoảng 15 giây. Kết quả Phản ứng catalase dương tính: có hiện tượng sủi bọt. Phản ứng catalase âm tính: không có hiện tượng sủi bọt. 1.2. Phản ứng lecithinase Chuẩn bị Môi trường lòng đỏ trứng. Giống vi khuẩn Bacillus subtilis. Tiến hành: dùng que cấy vòng, bằng thao tác vô trùng lấy và cấy một ít sinh khối vi khuẩn lên đĩa môi trường lòng đỏ trứng, ủ đĩa ở 37 oC/24 giờ. Kết quả Phản ứng catalase dương tính: có vòng trong xung quanh khuẩn lạc. Phản ứng catalase âm tính: không có vòng trong xung quanh khuẩn lạc. 1.3. Phản ứng nitrate Chuẩn bị Môi trường nitrate. Dung dịch thuốc thử giess A, giess B. Giống vi khuẩn Bacillus subtilis. Tiến hành: dùng que cấy thẳng, bằng thao tác vô trùng lấy và cấy một ít sinh khối vi khuẩn vào ống nghiệm môi trường nitrate, ủ ở 37 oC/24 giờ. Sau 24 giờ nhỏ vào môi trường 2-3 giọt giess A, sau đó nhỏ tiếp 2-3 giọt giess B. Kết quả Phản ứng dương tính: môi trường có màu đỏ cam. Phản ứng âm tính: môi trường có màu vàng. 1.4. Phản ứng Metyl-Red (MR) Chuẩn bị Môi trường clark lubs. Thuốc thử: metyl red. Giống vi khuẩn Bacillus subtilis. Tiến hành: dùng que cấy vòng, bằng thao tác vô trùng, lấy và cấy một ít sinh khối vi khuẩn vào ống môi trường clark lubs, ủ ở 37 oC/24 giờ. Sau đó nhỏ 2-3 giọt thuốc thử metyl red, đọc kết quả. Kết quả Phản ứng dương tính: môi trường có màu có màu đỏ cam. Phản ứng âm tính: môi trường có màu vàng. 1.5. Phản ứng Voges-Proskauer (VP) Chuẩn bị Môi trường clurk lubs. Thuốc thử: NaOH 40 %; -naphtol 10 %. Giống vi khuẩn Bacillus subtilis. Tiến hành: dùng que cấy vòng, bằng thao tác vô trùng, lấy và cấy một ít sinh khối vi khuẩn vào ống môi trường clurk lubs, ủ ở 37 oC/24 giờ. Sau đó nhỏ 3-5 giọt NaOH 40 % và 3-5 -naphtol 10 %, đọc kết quả sau 15 phút. Kết quả Phản ứng dương tính: môi trường có màu đỏ. Phản ứng âm tính: môi trường có màu vàng. 1.6. Phản ứng citrate Chuẩn bị Môi trường Simmon citrate Giống vi khuẩn Bacillus subtilis Tiến hành: dùng que cấy vòng, lấy và cấy một ít sinh khối vi khuẩn vào ống môi trường citrate, ủ ở 37 oC/24 giờ. Kết quả Phản ứng dương tính: môi trường chuyển sang màu xanh dương. Phản ứng âm tính: môi trường có màu xanh lá mạ non. 1.7. Phản ứng lên men đƣờng maltose Chuẩn bị Môi trường maltose. Giống vi khuẩn Bacillus subtilis. Tiến hành: dùng que cấy vòng, lấy và cấy mọt ít sinh khối vi khuẩn vào môi trường đường maltose, ủ ở 37 oC/24 giờ. Kết quả Phản ứng dương tính: môi trường có màu vàng. Phản ứng âm tính: môi trường có màu đỏ. II. PHƢƠNG PHÁP NHUỘM GRAM Các bƣớc tiến hành: - Chuẩn bị vết bôi: cho lên lame kính một giọt nước cất vô trùng, dùng que cấy vòng vô trùng lấy một ít vi khuẩn mọc mọc trên bề mặt môi trường hòa vào giọt nước cất và dàn đều. - Cố định vết bôi: hơ lame kính bằng cách đưa qua lại 3-4 trên ngọn lửa đèn cồn. - Nhuộm tiêu bản: đặt giấy lọc lên vết bôi, nhỏ thuốc nhuộm crystal violet lên miếng giấy lọc sao cho đủ thấm xuống vết bôi, để 1-2 phút rồi rửa nước. Nhỏ dung dịch lugol lên vết bôi vừa mới được nhuộm, để 1 phút rồi rửa nước. Tẩy màu nhanh bằng cồn 96o, khoảng 15-30 giây, rửa nước. Đặt mảnh giấy lọc khác lên vết bôi và nhỏ thuốc nhuộm fuchsin kiềm loãng lên miếng giấy lọc sao cho đủ thấm xuống vết bôi, để khoảng 1 phút và rửa nước. Thấm khô tiêu bản và xem dưới kính hiển vi. III. CÔNG THỨC ĐẾM KHUẨN LẠC TRÊN MÔI TRƢỜNG THẠCH ĐĨA - Số khuẩn lạc trung bình trong 1ml dịch mẫu ở 3 độ pha loãng liên tiếp x1+x2+x3 Công thức: Y= 3 Trong đó: Y: là số khuẩn lạc trung bình ở các độ pha loãng. x1,x2,x3: là số khuẩn lạc trung bình có trong 1g mẫu hay 1ml dịch mẫu ở các nồng độ pha loãng. - Số khuẩn lạc trong 1ml dịch mẫu ở độ pha loãng 1 1 Công thức: X= A x x h V Trong đó: X: số khuẩn lạc có trong 1ml dịch mẫu. A: là số khuẩn lạc trung bình có trong đĩa (trong tổng số 2 đĩa ở cùng nồng độ pha loãng). h: là độ pha loãng (10-5, 10-6, 10-7,….) V: thể tích dịch mẫu cấy 1 đĩa. IV. CÔNG THỨC ĐẾM VI KHUẨN BẰNG BUỒNG ĐẾM Công thức: Avsv/ml = a x 4000 x 1000 x H Trong đó: ai a: là số vsv trung bình có trong 1 ô nhỏ = n ai: là số vsv đếm được trong từng ô nhỏ . n: là số ô nhỏ được đếm . 1 H: là hệ số pha loãng = Độ pha loãng 1000: hệ số chuyển thành ml (1 ml = 1000 mm3) 1 1 4000: là hệ số chuyển thành 1 mm3 = = Thể tích 1 ô nhỏ 4000 mm3 V. THÀNH PHẦN CÁC MÔI TRƢỜNG 5.1. Môi trƣờng Trypticase Soya Agar (TSA) Soy pepton 15 g Tryptone peptone 5 g NaCl 5 g Agar 18 g Nước cất 1000 ml PH = 7,3 0,2 5.2. Môi trƣờng Trypticase Soya Broth (TSB) Soy pepton 15 g Tryptone peptone 5 g NaCl 5 g Nước cất 1000ml PH = 7,3 0,2 5.3. Môi trƣờng Clark Lubs Peptone bột 7 g Glucose 5 g KH2PO4 5 g Nước cất 1000 ml PH = 6,7 - 7,1 5.4. Môi trƣờng lên men đƣờng maltose Cao thịt 5 g Peptone bột 10 g Đường maltose 10 g Phenol red 0,01 g Nước cất 1000 ml PH = 6,7 - 7,1 5.5. Môi trƣờng Simmon Citrate Agar Sodium citrate 2 g K2HPO4 1 g MgSO4 0,2 g Brothymol blue 0,008 g NaCl 5 g NH4H2PO4 1 g Agar 18 g Nước cất 1000ml PH = 6,9 0,2 5.6. Môi trƣờng khử nitrate Cao thịt 3 g Peptone bột 5 g NaNO3 1 g Agar 7 g Nước cất 1000ml PH = 7,0 0,2 5.7. Môi trƣờng lòng đỏ trứng Cao thịt 1 g Peptone bột 10 g Mannitol 10 g NaCl 10 g Phenol red 0,0025 g Agar 15 g Nước cất 1000 ml PH = 7,2 0,2 Phân 225 ml môi trường vào bình tam giác. Khử trùng ở 121 oC / 15-20 phút. Khi môi trường nguội đến 50 oC thêm 12,5 ml dung dịch lòng đỏ trứng gà. Trộn đều rồi phân vào đĩa petri vô trùng. Cách pha lòng đỏ trứng: rửa sạch trứng, sát trùng bên ngoài trứng bằng cồn. Dùng kẹt đập trứng, bỏ phần lòng trắng, chuyển phần lòng đỏ vào becher có chứa 25-30 ml nước mối sinh lý vô trùng. Bảo quản dung dịch này ở 4 oC để dùng. 5.8. Môi trƣờng thạch nƣớc cốt dừa Nước cốt dừa 500 ml Nước cất 500 ml Cloramphenicol 0,1 g Agar 15 g Thành phần nƣớc cốt dừa (Nước cốt dừa đóng hộp được sản xuất tại công ty CNCB thực phẩm quốc tế số 9, đường 5, phường Tân Tiến, Biên Hòa, Đồng Nai). Béo 15 g Carbohyrat 3 g Protein 2 g Sodium 33 g 5.9. Môi trƣờng thạch khoai tây Khoai tây 200 g Saccharose 20 g Cloramphenicol 1-2 g/l Agar 18 g Nước cất 1000 ml PH = 6,5 VI. HÓA CHẤT 6.1. Nƣớc mối sinh lý 0,9 % NaCl 9 g Nước cất 1000 ml 6.2. NaOH 40 % NaOH 40 g Nước cất 1000 ml Cân 40 g NaOH tinh thể hòa tan vào 50 ml nước cất, lắc đều, để yên 24 giờ, gạn lấy nước trong ở trên rồi bổ xung thêm nước cất cho đủ 1000 ml. 6.3. Dung dịch Iod 0,02 N Cân 2 g KI hòa tan vaò 3 ml nước cất, lắc đều cho tan, thêm nước cất vào cho đủ 100 ml. VII. THUỐC THỬ VÀ CHẤT CHỈ THỊ MÀU 7.1. Thuốc thử Methyl-red Methyl-red 0,1 g Ethanol 96 o 300 ml Nước cất vừa đủ 500 ml 7.2. Thuốc thử a-naphtol 10% -naphtol 10 g Cồn 96o vừa đủ 100 ml 7.3. Thuốc thử xác định khả năng khử nitrate giess A: Axit sunfanilis 0,5 g Axit acetic 30 g Nước cất 100 ml giess B: -naphthylamin 0,8 g Axit acetic 30 g Nước cất 100 ml Hòa tan 0,8 g -naphthylamin trong 100 ml nước đun sôi để nguội rồi bổ sung thêm 30 ml axit acetic, đem lọc. Đựng trong chai màu, bảo quản trong tủ lạnh để sử dụng. VIII. THUỐC NHUỘM 8.1. Crystal violet (C25H30N3Cl.9H2O = 570,11) a) Crystal violet 0,4 g Cồn 96o 10 ml b) Phenol 1 g Nước cất 100 ml Trộn hai dung dịch a và b với nhau, khuấy cho hòa tan đều rồi đem lọc. Bảo quản dung dịch này trong chai màu, tránh ánh sáng. 8.2. Lugol KI 2 g Iod tinh thể 1 g Nước cất 300 ml Hòa 2 g KI vào 5 ml nước cất, sau đó thêm 1 g iod, chờ cho iod tan hết mới thêm nước vừa đủ 300 ml. 8.3. Fuchsine kiềm loãng (C9H18N3Cl = 323,82) a) Fuchsine kiềm 0,3 g Cồn 96o 10 ml b) Phenol l 5 g Nước cất 35 ml Trộn dung dịch a và b với nhau rồi khuấy cho tan đều, đem lọc, bảo quản trong chai màu. IX. SỐ LƢỢNG VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS ĐẾM BẰNG PHƢƠNG PHÁP TRANG ĐĨA TRONG THÍ NGHIỆM 2 Chủng phân lập Số lƣợng bào tử (CFU/ml) 1 22,94.10 8 2 71,32.10 8 3 14,38.10 8 4 52,64.10 8 5 50,79.10 8 6 7,02.10 8 7 89,30.10 8 8 31,80.10 8 X. KẾT QUẢ XỬ LÝ THỐNG KÊ 10.1. Kết quả xử lý thống kê thí nghiệm 2 ————— 21/08/2007 15:08:22 ———————————————————— Welcome to Minitab, press F1 for help. One-way ANOVA: KQTN2 versus MTN2 Analysis of Variance for KQTN2 Source DF SS MS F P MTN2 8 560623644 70077956 522,80 0,000 Error 9 1206400 134044 Total 17 561830044 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev ------+---------+---------+---------+ 1 2 4250 778 (-*) 2 2 15800 0 (-*) 3 2 5250 495 (-*) 4 2 15000 0 (*) 5 2 4660 85 (*) 6 2 5410 552 (*) 7 2 18200 0 (*-) 8 2 2750 212 (-*) Asp 2 6300 0 (-*) ------+---------+---------+---------+ Pooled StDev = 366 5000 10000 15000 20000 Tukey's pairwise comparisons Family error rate = 0,0500 Individual error rate = 0,00331 Critical value = 5,60 Intervals for (column level mean) - (row level mean) 1 2 3 4 5 6 2 -13000 -10100 3 -2450 9100 450 12000 4 -12200 -650 -11200 -9300 2250 -8300 5 -1860 9690 -860 8890 1040 12590 2040 11790 6 -2610 8940 -1610 8140 -2200 290 11840 1290 11040 700 7 -15400 -3850 -14400 -4650 -14990 -14240 -12500 -950 -11500 -1750 -12090 -11340 8 50 11600 1050 10800 460 1210 2950 14500 3950 13700 3360 4110 Asp -3500 8050 -2500 7250 -3090 -2340 -600 10950 400 10150 -190 560 7 8 8 14000 16900 Asp 10450 -5000 13350 -2100 10.2. Kết quả xử lý thống kê thí nghiệm 3 ————— 16/08/2007 13:42:06 ———————————————————— Welcome to Minitab, press F1 for help. One-way ANOVA: KQTN3 versus MTN3 Analysis of Variance for KQTN3 Source DF SS MS F P MTN3 3 35435250 11811750 3009,36 0,000 Error 4 15700 3925 Total 7 35450950 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev -------+---------+---------+--------- C8(10^7) 2 2155,0 77,8 *) C8(10^8) 2 1960,0 84,9 (*) C8(10^9) 2 715,0 49,5 *) DC(Asp) 2 6300,0 0,0 *) -------+---------+---------+--------- Pooled StDev = 62,6 1600 3200 4800 Tukey's pairwise comparisons Family error rate = 0,0500 Individual error rate = 0,0152 Critical value = 5,76 Intervals for (column level mean) - (row level mean) C8(10^7) C8(10^8) C8(10^9) C8(10^8) -60,2 450,2 C8(10^9) 1184,8 989,8 1695,2 1500,2 DC(Asp) -4400,2 -4595,2 -5840,2 -3889,8 -4084,8 -5329,8 10.3. Kết quả xử lý thống kê thí nghiệm 4 ————— 01/09/2007 20:42:38 ———————————————————— Welcome to Minitab, press F1 for help. Chi-Square Test: SONG; CHET Expected counts are printed below observed counts SONG CHET Total 1 10 0 10 5,50 4,50 2 0 10 10 5,50 4,50 3 5 5 10 5,50 4,50 4 7 3 10 5,50 4,50 Total 22 18 40 Chi-Sq = 3,682 + 4,500 + 5,500 + 6,722 + 0,045 + 0,056 + 0,409 + 0,500 = 21,414 DF = 3, P-Value = 0,000 4 cells with expected counts less than 5,0