Khóa luận Phân lập vi khuẩn bacillus subtilis từ đất và khảo sát tính đối kháng với vi khuẩn E. Coli gây bệnh tiêu chảy trên heo

đoạn chuỗi xoắn kép ADN. Thực tế khi nuôi cấy nấm bệnh có sự hiện diện của Bacillus subtilis với một số lƣợng lớn sẽ xảy ra cạnh tranh dinh dƣỡng, cạnh tranh không gian sinh sống giữa vi khuẩn và nấm. Do vi khuẩn phát triển nhanh hơn (trong 24 giờ) sẽ sử dụng phần lớn chất dinh dƣỡng trong môi trƣờng, đồng thời tạo ra một số loại kháng sinh nên sự sinh trƣởng của nấm bị ức chế (Nguyễn Lân Dũng và Hoàng Đức Nhuận, 1976, trích dẫn bởi Lý Kim Hữu). Với đồng loại 17 Trong môi trƣờng dinh dƣỡng bị cạn kiệt, Bacillus subtilis đã tạo ra chất kháng sinh giết chết những tế bào vi khuẩn bên cạnh chƣa bắt đầu quá trình này nhằm tiêu thụ chất dinh dƣỡng giải phóng từ các tế bào này với mục đích kéo dài thời kỳ trƣớc khi tạo bào tử (Richard Losik, Jone Gonzales và cộng sự, 1993). 2.2.2.8. Độc tính của Bacillus subtilis Đối với con ngƣời Một số chủng Bacillus subtilis cũng nhƣ những họ hàng gần của nó là B. licheniformis, B. pumulis, B. megaterium có khả năng sản xuất lecithinase, một enzyme có khả năng phá vỡ màng tế bào động vật hữu nhũ. Tuy nhiên , vẫn chƣa có bằng chứng nào cho thấy lecithinase gây bệnh trên ngƣời. Một số nghiên cứu cho thấy Bacillus subtilis cũng liên quan đến vài trƣờng hợp ngộ độc thực phẩm. Bacillus subtilis sản xuất độc tố ngoại bào là subtilisin, mặc dù subtilisin có độc tính thấp nhƣng trong thành phần protein của nó có khả năng gây dị ứng đối với những ngƣời tiếp xúc trong thời gian dài gây những bệnh nhƣ viêm da, viêm đƣờng hô hấp,… Bacillus subtilis có tính độc rất thấp đối với ngƣời vì nó sản xuất enzyme ngoại bào và các tác nhân gây độc không đủ để có thể gây hại cho ngƣời. Ngoài trừ những trƣờng hợp có đột biến trong tế bào vi khuẩn hay hệ thống miễn dịch của ngƣời đang quá suy yếu. Trong một số trƣờng hợp, ngƣời ta vẫn phát hiện Bacillus subtilis ở những bệnh nhân bị ung thƣ phổi, hoại thƣ bạch cầu, áp xe khi lắp bộ phận giả,…Tuy nhiên, tỉ lệ các trƣờng hợp này là rất hiếm, chỉ có 2 trong 24 trƣờng hợp nhiễm Bacillus (trong 1034 ca nhiễm khuẩn) là do Bacillus subtilis (Edberg, 1991). Đối với động vật Bacillus subtilis đƣợc phát hiện trong một số trƣờng hợp bò và cừu sẩy thai. Tuy nhiên, Bacillus subtilis vẫn không đƣợc cho là nguyên nhân gây bệnh. Bacillus subtilis nhiễm vào và gây tử vong cho muỗi Anophelis aulicifacies gây sốt rét ở Ấn Độ (Gupta và Vyas, 1989) và đƣợc sử dụng nhƣ 1 tác nhân kiểm 18 soát sinh học trong nghiên cứu về bệnh này. Đối với thực vật Bacillus subtilis gây phân hủy pectin và polysaccharides của mô thực vật dẫn đến thối củ ở khoai tây Gây những vết viêm loét trên một số cây rừng 2.2.2.9. Một số phƣơng pháp nghiên cứu tính đối kháng của Bacillus subtilis và vi sinh vật gây bệnh Các phƣơng pháp này dựa trên sự khuếch tán của chất kháng sinh trong môi trƣờng thạch. Chỗ nào có chất kháng sinh khuếch tán đến thì nơi đó vi sinh vật kiểm định không mọc đƣợc và sẽ tạo thành vòng vô khuẩn. Một số lƣu ý + Kích thƣớc đĩa petri và bề dày thạch trong đĩa bằng nhau. + Lƣợng kháng sinh không đƣợc quá cao + Thời gian tiếp xúc giữa chất kháng sinh và môi trƣờng phải ổn định + Chú ý pH môi trƣờng (pH cao ức chế vi sinh vật cần kiểm định) + Lƣợng vi khuẩn kiểm định dùng để thử phải ổn định cho các mẫu thí nghiệm. Gồm các phƣơng pháp sau Phương pháp cấy theo đường thẳng góc Trên môi trƣờng dinh dƣỡng thạch đĩa, cấy 1 đƣờng vi sinh vật đối kháng dọc theo đƣờng kính của dĩa.. Đặt vào tủ ấm ủ ở nhiệt độ thích hợp khoảng 1 ngày đối vói vi khuẩn, 4- 5 ngày đối với nấm mốc. Sau khi các vi sinh vật đối kháng đã mọc và sinh chất kháng sinh, dùng que cấy cấy vi sinh vật kiểm định thành những đƣờng thẳng góc và sát với đƣờng vi sinh vật đối kháng. Sau 24h ủ trong tủ ấm, quan sát vùng ức chế vi khuẩn Hoạt tính kháng sinh đƣợc sơ bộ xác định bằng cách đo khoảng cách từ vết cấy vi sinh vật đối kháng đến nơi vi sinh vật kiểm định ban đầu mọc Phương pháp thỏi thạch Sử dụng trong xác định hoạt tính kháng sinh trong trƣờng hợp vi sinh vật kiểm định 19 và vi sinh vật sinh chất kháng sinh không mọc đƣợc trên cùng một môi trƣờng.  Nuôi vi sinh vật đối kháng trên đĩa petri cho mọc tốt.  Dùng đột nút cao su (đƣờng kính10- 20 mm) ấn nhẹ lên bề mặt thạch để lấy ra những thỏi thạch hình trụ.  Dùng cặp vô trùng gắp những thỏi thạch này đặt lên môi trƣờng đã cấy sẵn vi sinh vật kiểm định. Sau 18- 20h nuôi cấy trong tủ ấm và quan sát vòng vô khuẩn xung quanh thỏi thạch. Có thể dùng phƣơng pháp này để xem thời gian nào vi sinh vật sinh chất kháng sinh nhiều nhất. Phương pháp phủ lớp thạch vi sinh vật kiểm định lên khuẩn lạc vi sinh vật đối kháng. Phƣơng pháp này dùng để lựa chọn trong số các chủng nghiên cứu những chủng có hoạt tính cao nhất. Trên môi trƣờng dinh dƣỡng thạch đĩa petri, cấy vi sinh vật đối kháng sao cho các khuẩn lạc mọc cách nhau một khoảng khá xa. Sau khi các khuẩn lạc đã mọc và sinh chất kháng sinh ngƣời ta đổ lên trên các khuẩn lạc 1 lớp mỏng môi trƣờng đã trộn vi sinh vật kiểm định. Nồng độ vi khuẩn trong môi trƣờng thạch thƣờng là 100 triệu/ml, lắc đều, cẩn thận đổ lên trên khuẩn lạc thành 1 lớp mỏng rồi đặt đĩa vào tủ ấm. Quan sát vòng vô khuẩn. Phương pháp đục lỗ thạch Dùng đột nút cao su (đƣờng kính 10- 20 mm) ấn nhẹ lên bề mặt thạch để lấy ra những thỏi thạch hình trụ bỏ đi. Ta tạo đƣợc những lỗ hình trụ trên môi trƣờng thạch đĩa.  Phết vi khuẩn kiểm định lên bề mặt thạch bằng cách dùng que tăm bông vô trùng nhúng vào môi trƣờng tăng sinh lỏng.  Dùng pipette hút dịch chiết ly tâm từ vi sinh vật đối kháng bơm vào các lỗ trên (lƣợng dịch này khoảng 50µl/lỗ)  Ủ các đĩa này trong tủ ấm và quan sát vòng vô khuẩn sau 1 thời gian thích hợp đối với từng loài vi sinh vật. 20 Phƣơng pháp này đƣợc sử dụng phổ biến trong nghiên cứu các kháng sinh của Bacillus subtilis vì nó loại trừ đƣợc trƣờng hợp vòng vô khuẩn tạo ra do cạnh tranh dinh dƣỡng giữa 2 loại vi sinh vật. B.Vaeeharan và P. Ramasamy đã sử dụng dịch ly tâm của 3 chủng B. subtilis BT21, BT22 và BT23 thử đối kháng với chủng Vibrio spp. đƣợc phân lập từ tôm Penaeus monodon và kết quả cho thấy chủng B. subtilis BT23 cho kết quả tốt nhất (3- 6 mm). Chủng này cũng cho kết quả đối kháng cao đối với 112 chủng Vibrio spp.,V. haveyi, V. anguillarium, V. damsela,… 2.2.2.10. Một số nghiên cứu ứng dụng của Bacillus subtilis Các đặc tính có ích của Bacillus subtilis - Sản sinh enzyme amylase, pectinase, protease, lipase, trypsin, urease, mannase,.. - Sản sinh các acid hữu cơ: acid lactic, acid acetic làm giảm pH đƣờng ruột. - Sản sinh vitamin nhóm B - Cạnh tranh vị trí bám dính với vi sinh vật gây bệnh. - Sản xuất các kháng sinh ức chế các vi sinh vật gây bệnh - Bacillus subtilis còn đƣợc xem là tác nhân kích thích miễn dịch trong điều trị một số bệnh. Trong công nghiệp Bacillus subtilis đƣợc ứng dụng rộng rãi trong việc sản xuất ra enzyme và một số chất hóa học cho công nghiệp nhƣ amylase, protease, inosine, ribosides, aminoacid,…Trong đó, protease đƣợc ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp chất tẩy rửa. Trong y học Việc trao đổi gen giữa những chủng thuộc Bacillus subtilis khi chúng cùng phát triển trong đất đã đƣợc biết đến khá lâu. Klier và cộng sự đã chứng minh khả năng trao đổi plasmid giữa Bacillus subtilis và Bacillus thuringensis. Một số nghiên cứu chỉ ra rằng Bacillus subtilis chuyển gen có khả năng kích ứng hay làm ức chế khả năng biểu hiện độc tố hay 1 số thành phần độc tố trong các vi khuẩn trong các bệnh 21 ho gà, bạch hầu, viêm phổi,…điều này có ý nghĩa rất lớn đối với y học.Tuy nhiên, cũng còn tồn tại 1 vấn đề là Bacillus subtilis hoàn toàn có thể nhận các gen quy định tính độc từ các vi khuẩn độc có quan hệ tƣơng đối gần về mặt di truyền và gây hại. Trong nông nghiệp Bacillus subtilis ứng dụng phòng trừ vi sinh vật gây bệnh nhƣ nấm Rhizoctonia solani, Fusarium sp., Pylicularia oryzae,… ngoài ra còn ứng dụng nhiều trong công tác bảo vệ nông sản sau thu hoạch. Bacillus subtilis đƣợc ứng dụng vào sản xuất các chế phẩm nhằm làm giảm tái phát bệnh tiêu chảy gây ra trên heo so với đều trị bằng kháng sinh. 2.2.3. Tình hình nghiên cứu về tác dụng đối kháng với bệnh tiêu chảy do E.coli của Bacillus subtilis Theo tài liệu tổng hợp của Nguyễn Duy Khánh, 2006: Trong nƣớc Trong kháng chiến chống Pháp Bacillus subtilis đƣợc các giáo sƣ Đặng Đức Trạch, Hoàng Thuỷ Nguyên (là các bác sĩ quân y) đã nghiên cứu sản xuất chế phẩm Bacillus subtilis để đƣa ra chiến trƣờng nhằm giải quyết dịch tiêu chảy 1958 - 1960 bác sĩ Phạm Ngọc Thạch đã sản xuất đồng loạt chế phẩm Bacillus subtilis dùng trị bệnh đƣờng ruột. Khoa vệ sinh y học bệnh viện Bạch Mai Hà Nội đã nghiên cứu và sản xuất chế phẩm Bacillus subtilis dùng điều trị bệnh tiêu chảy ở ngƣời. Viện bào chế Pharimex Tp.HCM, Viện Pasteur Nha Trang đã nghiên cứu sản xuất chế phẩm Bacillus subtilis. 1982 Vũ Văn Ngữ và các cộng sự đã sản xuất thử nghiệm chế phẩm coli_subtyl (Escherichia coli và Bacillus subtilis) làm giảm tái phát do bệnh tiêu chảy gây ra ở lợn so với phƣơng pháp điều trị bằng kháng sinh, kết quả heo tăng trọng tốt. Ngoài nƣớc Năm 1949, tại Pháp đã lƣu hành thuốc uống dạng ống chứa vi khuẩn Bacillus 22 subtilis chủng IB 5832, đến năm 1955 có thêm thuốc dạng bột đóng ống và viên nang. Năm 1962, Guy Albot phát hiện Bacillus subtilis có tác dụng trong điều trị tiêu chảy do lạm dụng kháng sinh và viêm đại tràng mãn, trộn thêm với các vi khuẩn lên men lactic khác chữa loạn khuẩn đƣờng ruột rất hiệu quả. 23 Chƣơng 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 3.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM Thời gian Từ tháng 03/2007 đến 07/2007 Địa điểm Phòng vi sinh, khoa CN Thú Y trƣờng ĐH Nông Lâm Tp.HCM. 3.2. VẬT LIỆU THÍ NGHIỆM 3.2.1. Đối tƣợng khảo sát  Chủng vi khuẩn B. subtilis đƣợc phân lập từ đất (9 chủng)  Chủng vi khuẩn E. coli do phòng vi sinh cung cấp (1 chủng K88 và 1 chủng O157:H7 EDL 933) 3.2.2. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm Thiết bị: tủ sấy, máy hấp tiệt trùng (autoclave), tủ lạnh, cân điện tử, máy lắc (vortex), lò vi sóng, kính hiển vi, đèn cực tím,… Dụng cụ: đĩa petri, ống nghiệm, giá để ống nghiệm, que cấy, đèn cồn, giấy đo pH, bình tam giác, bacher, micropipette, đũa khuấy thủy tinh, ống đong, que trang,… Tất cả các dụng cụ thủy tinh dùng để nuôi cấy vi sinh vật đều đƣợc xử lý sạch, bao gói và hấp tiệt trùng ở 1210C/15ph 3.2.3. Môi trƣờng nuôi cấy Sử dụng các môi trƣờng nuôi cấy tổng hợp sau: 24 - Môi trƣờng giữ giống và đếm số lƣợng tế bào: TSA (Trypticase Soya Agar) - Môi trƣờng khảo sát các đặc điểm sinh hóa: TSB (Trypticase Soya Broth), Clark Clubs, Simon Citrate agar, môi trƣờng lòng đỏ trứng, môi trƣờng Nitrate, môi trƣờng lên men đƣờng Maltose,… 3.2.4. Hóa chất Hóa chất cơ bản: cồn, NaOH 1N, HCl 1%, NaCl, acid acetic,… Hóa chất dùng trong khảo sát các đặc điểm sinh họá: NaOH 40%, α -naphtol 10%, acid sulfanilic,… Thuốc thử Kowac’s, Methyl-Red,… Thuốc dùng cho phƣơng pháp nhuộm Gram. 3.3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU  Phân lập chủng B. subtilis từ đất  Thử đối kháng với E. coli trên môi trƣờng TSA (Trypton Soya Agar) nhằm xác định một số chủng đối kháng mạnh với E. coli  Khảo sát tỉ lệ nuôi cấy thích hợp giữa B. subtilis và E. coli trong môi trƣờng TSB để B. subtilis có khả năng ức chế E. coli mạnh nhất.  Thử khả năng đối kháng của Bacillus subtilis với chủng E. coli O157:H7 (chủng EDL 933) trên chuột bạch. 3.4. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.4.1. Phân lập vi khuẩn B. subtilis từ đất 3.4.1.1. Cách lấy mẫu Gạt bỏ lớp đất mặt khoảng 2- 3cm, lấy lớp đất mặt ở dƣới. Cân 10g mẫu đất cho vào bình tam giác có chứa 90ml nƣớc muối sinh lý vô trùng và lắc đều, đƣợc nồng độ pha loãng 10-1. 25 3.4.1.2. Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis Bắt lấy chủng nghi ngờ là B. subtilis Hình 3.1. Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis 1ml 10 -2 10 -3 10 -4 10 -5 10 -1 10g mẫu đất+ 90ml nƣớc muối sinh lý vô trùng 10 -3 10 -4 10 -5 Ủ 370C 24h 26 3.4.1.2.1 Lựa chọn khuẩn lạc - Quan sát hình dạng vi khuẩn dƣới kính hiển vi bằng phƣơng pháp nhuộm Gram Các chỉ tiêu quan sát: sự bắt màu, hình dạng, cách sắp xếp của tế bào vi khuẩn. Sau khi quan sát nếu thấy tiêu bản vi khuẩn phù hợp với những đặc điểm của vi khuẩn B. subtilis thì tiếp tục thử các phản ứng sinh hóa để khẳng định. 3.4.1.2.2 Kiểm tra đặc điểm sinh hóa Lecithinase (-) Nitrate (+) Voges- Proskauer (+) Methyl Red (+) Citrate (+) Maltose (-) Catalase(+) 3.4.2. Đánh giá khả năng đối kháng của Bacillus subtilis và E. coli 3.4.2.1. Thí nghiệm 1: Thử đối kháng với E. coli trên môi trƣờng thạch TSA Dịch khuẩn E. coli đƣợc trang trên đĩa môi trƣờng TSA Cấy B. subtilis lên đĩa TSA có E. coli ủ 370C 24h Ghi nhận các chủng cho vòng kháng khuẩn lớn. 27 3.4.2.2. Thí nghiệm 2:Khảo sát tính đối kháng từ dịch ly tâm của Bacillus subtilis và dịch khuẩn E. coli Cấy B. subtilis trên môi trƣờng TSB trong các khoảng thời gian 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ  li tâm 5000 vòng/phút thu lấy dịch trong Dùng tăm bông vô trùng phết dịch canh khuẩn E. coli lên môi trƣờng TSA đĩa Thử khả năng đối kháng bằng phƣơng pháp đục lỗ trên môi trƣờng thạch TSA 3.4.2.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát tính đối kháng của B. subtilis với nhiều nồng độ E. coli khác nhau trên môi trƣờng TSB Bảng 3.1. Thí nghiệm khảo sát tính đối kháng của B. subtilis và E. coli với nhiều nồng độ pha loãng canh khuẩn E. coli khác nhau E. coli B. subtilis 10 6 (tế bào/ml) 10 7 (tế bào/ml) 10 8 (tế bào/ml) 10 6 (tế bào/ml) 10 7 (tế bào/ml) Đếm số lƣợng B. subtilis và E. coli ở 6 tỉ lệ nuôi cấy khác nhau nhƣ trên bằng phƣơng pháp trang đĩa trên môi trƣờng TSA. 3.4.2.4. Thí nghiệm 4: Thử nghiệm khả năng đối kháng của 1 chủng B. subtilis và E. coli O157:H7 (chủng EDL 933) trên chuột bạch. Bố trí thí nghiệm gồm 2 lô, mỗi lô 10 con chuột khỏe mạnh. Chuẩn bị môi trƣờng TSB nuôi vi khuẩn B. subtilis ủ 370C/24h và lắc sục khí. Chuẩn bị môi trƣờng TSB nuôi E. coli ủ 370C/24h. 28 Bảng 3.2 Thử nghiệm tác dụng đối kháng B. subtilis đối với E. coli O157:H7 (chủng EDL 933) trên chuột bạch Ngày Lô thí nghiệm Lô đối chứng 1 - 3 Cho ăn cám trộn với dịch vi khuẩn B. subtilis 3 lần/ngày với khẩu phần mỗi lần ăn là 25g cám +25ml dịch khuẩn B. subtilis Cho ăn cám không có B. subtilis 3 lần/ngày khẩu phần 25g cám/1lần ăn 4 - 5 Cho ăn cám trộn B. subtilis và cho uống dịch canh khuẩn E. coli (1ml/con/ngày) Cho ăn cám không trộn B. subtilis và cho uống dịch canh khuẩn E. coli (1ml/con/ngày) 6 - 10 Cho ăn cám trộn B. subtilis Cho ăn cám không trộn B. subtilis Theo dõi tình trạng sức khỏe của chuột và tỷ lệ chuột chết trong thời gian thí nghiệm và đánh giá khả năng đối kháng của B. subtilis với chủng E. coli O157:H7 (chủng EDL 933). 3.4.3. CHỈ TIÊU THEO DÕI VÀ PHƢƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ  Đặc điểm sinh hóa khẳng định khuẩn lạc là B. subtilis - Hình dạng B. subtilis dƣới kính hiển vi - Hình dạng B. subtilis trên môi trƣờng TSA - Các phản ứng sinh hóa đặc trƣng đƣợc theo dõi: 29 Lecithinase (-) Nitrate (+) Voges- Proskauer (+) Methyl Red (+) Citrate (+) Maltose (-) Catalase(+)  Kích thƣớc vòng kháng khuẩn của khuẩn lạc B. subtilis Kích thƣớc vòng đối kháng = Đƣờng kính vòng kháng khuẩn – đƣờng kính khuẩn lạc  Kích thƣớc vòng đối kháng của dịch chiết kháng sinh từ vi khuẩn B. subtilis Kích thƣớc vòng đối kháng = Đƣờng kính vòng kháng khuẩn - đƣờng kính lỗ chứa kháng sinh  Số lƣợng vi khuẩn B. subtilis và E. coli ở từng tỷ lệ nuôi cấy chung trong môi trƣờng TSB Đếm số lƣợng vi khuẩn B. subtilis và E. coli ở 6 nồng độ dịch khuẩn với tỉ lệ nuôi cấy chung sau: (B. subtilis : E. coli) là (106:107); (106:108); (107:107); (107:108), (10 8 :10 7 ), (10 8 :10 8 ). . Công thức tính số lƣợng khuẩn lạc đƣợc thể hiện ở phần mục lục  Tỷ lệ % chuột chết/lô = x100% 3.4.4. Phƣơng pháp xử lý số liệu Sử dụng phần mềm thống kê Minitab 13.1 trắc nghiệm F Số lƣợng chuột chết/lô Tổng số chuột/lô 30 Chƣơng 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả phân lập B. subtilis trong đất Sau 24 giờ cấy trang mẫu đất trên môi trƣờng TSA, kết quả đƣợc thể hiện ở Hình 4.1, quan sát và bắt giữ giống những khuẩn lạc có đặc điểm sau: khuẩn lạc có bề mặt khô, mọc lan trên mặt thạch, màu xám trắng, tâm đậm màu, viền răng cƣa. Hình 4.1 Kết quả phân lập trên môi trƣờng TSA Các khuẩn lạc đặc trƣng đƣợc nhuộm gram để quan sát dƣới kính hiển vi (độ phóng đại x1000 lần) để khảo sát các đặc điểm hình thái. Chúng tôi nhận thấy các chủng vi khuẩn nghi ngờ có hình thái giống với Bacillus subtilis, là những trực khuẩn bắt màu gram (+), ngắn và nhỏ, kích thƣớc 0,5- 0,8µm, hai đầu tròn, thƣờng đứng riêng lẻ, đôi khi xếp thành chuỗi ngắn từ 3- 5 tế bào, có bào tử. 31 Hình 4.2. Hình thái vi khuẩn B. subtilis ở độ phóng đại x1000 Hình 4.3. Hình thái bào tử vi khuẩn B. subtilis ở độ phóng đại x1000 Các chủng phân lập có đặc điểm hình thái phù hợp với B. subtiilis đƣợc chọn làm một số phản ứng sinh hóa để khẳng định. Kết quả thu đƣợc 9 chủng vi khuẩn Bacillus subtilis có kết quả thử sinh hóa là: Lecithinase (-) Voges- Proskauer (+) Nitrate (+) Catalase(+) Methyl Red (+) Citrate (+) Maltose (+) 32 Hình 4.4. Kết quả thử một số phản ứng sinh hóa khẳng định B. subtilis 4.2. Kết quả đối kháng trực tiếp giữa B. subtilis và E. coli trên môi trƣờng TSA Chúng tôi thực hiện thử đối kháng giữa 9 chủng B. subtilis với những nồng độ pha loãng canh khuẩn E. coli khác nhau: không pha loãng (100), 10-1, 10-2, 10-3 và quan sát khả năng đối kháng sau 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ ủ trong tủ ấm 370C. Kết quả đƣợc thể hiện ở Bảng 4.1 Lecithinase (-) Lecithinase (+) Citrate (+) VP (+) và MR (+) 33 Bảng 4.1. Kết quả đối kháng trực tiếp giữa 9 chủng B. subtilis và E. coli trên môi trƣờng TSA Chủng B. subtilis Nồng độ pha loãng canh khuẩn E. coli Kích thước vòng kháng khuẩn (mm) 24 giờ 36 giờ 48 giờ L219 10 0 5 3,67 2 10 -1 1,33 1,33 0,67 10 -2 2,67 1,67 0 10 -3 3,33 4,33 3,67 L29 10 0 3 0 0 10 -1 4 0 0 10 -2 1,33 1,33 1 10 -3 3 2,67 2 L51 10 0 0 0 0 10 -1 3,67 1 1 10 -2 3,33 0,67 0 10 -3 5 7 5,67 L216 10 0 4,33 2 1,67 10 -1 1 1 1 10 -2 2,33 2,67 2,33 10 -3 3 2,33 1 L25 10 0 4,33 4,33 3 10 -1 7 5,33 6 10 -2 8,33 5,33 5,33 10 -3 7,33 7,33 7 L220 10 0 7 3,67 1,67 10 -1 3,67 5,67 5,33 10 -2 5,67 3,67 3,67 10 -3 4,33 1 1 L211 10 0 4 3 1,33 10 -1 6 1 1 10 -2 7,33 6,33 1 10 -3 8 6,33 1,33 L16 10 0 4,67 1 1 10 -1 1,67 1,67 2 10 -2 3,33 1 1,67 10 -3 4,33 1,67 3,33 L26 10 0 4 1 1,67 10 -1 1,67 2,33 5 10 -2 8 1,33 5,33 10 -3 2,67 3,67 5,67 Trung bình 4,15 2,73 2,37 34 Kết quả phân tích số liệu bằng phần mềm thống kê Minitab 13.1 sử dụng trắc nghiệm F cho thấy:  Có sự khác biệt có ý nghĩa về phƣơng diện thống kê học (P<0,05) giữa các kích thƣớc trung bình của vòng kháng khuẩn sau 3 khoảng thời gian 24 giờ (4,15mm), 36 giờ (2,73 mm) và 48 giờ (2,37 mm).  Sự khác biệt giữa các kích thƣớc vòng kháng khuẩn đo đƣợc ở các nồng độ pha loãng canh khuẩn E. coli 100 (2,494 mm), 10-1 (2,642 mm), 10-2 (3,21 mm), 10-3 (4 mm) là không có ý nghĩa về phƣơng diện thống kê học (P>=0,05) Nhận xét:  Khả năng đối kháng của B. subtilis đối với E. coli sau 24 giờ là cao nhất và khả năng này giảm dần theo thời gian.  Khả năng đối kháng của B. subtilis đối với E. coli ở nồng độ 10-3 là cao nhất. Giải thích: Khi cấy B. subtilis và phết E. coli trên môi trƣờng TSA, khuẩn lạc B. subtilis phát triển và tiết các chất kháng khuẩn ra môi trƣờng ức chế sự phát triển của E. coli ngay từ giai đoạn rất sớm và khả năng này giảm dần qua thời gian khi mà số lƣợng E. coli tăng lên ức chế ngƣợc lại sự phát triển của B. subtilis. Khi mật độ E. coli cao (không pha loãng, pha loãng ở nồng độ 10-1, 10-2) khả năng cạnh tranh dinh dƣỡng mạnh, tiết chất kháng khuẩn làm ức chế sự phát triển của khuẩn lạc B. subtilis, hơn nữa các chất kháng khuẩn của B. subtilis tiết ra không đủ để ức chế một số lƣợng lớn E. coli dẫn đến các khuẩn lạc B. subtilis tạo đƣợc vòng kháng khuẩn nhỏ hoặc không rõ ràng so với khuẩn lạc ở nồng độ pha loãng E. coli là 10-3. 35 Hình 4.5. Vòng kháng khuẩn của B. subtilis đối với E. coli trên môi trƣờng TSA với nồng độ pha loãng canh khuẩn E. coli là 10-3 4.3. Kết quả đối kháng giữa dịch ly tâm canh khuẩn B. subtilis nuôi cấy trong 24 giờ/370C với E. coli trên môi trƣờng TSA Chúng tôi thực hiện thử đối kháng giữa kháng sinh của 9 chủng B. subtilis với những nồng độ pha loãng canh khuẩn E. coli khác nhau: không pha loãng 100, 10-1, 10 -2 và quan sát khả năng đối kháng sau 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ ủ trong tủ ấm 370C. Kết quả đƣợc thể hiện ở Bảng 4.2 36 Bảng 4.2. Kết quả đối kháng của dịch ly tâm canh khuẩn từ 9 chủng B. subtilis phân lập đƣợc với E. coli trên môi trƣờng TSA Chủng B. subtilis Nồng độ pha loãng canh khuẩn E. coli Kích thước vòng kháng khuẩn (mm) 24 giờ 36 giờ 48 giờ L219 10 0 2 3,33 0 10 -1 2,67 6,67 5,33 10 -2 1,67 7 7 L29 10 0 2 3 0 10 -1 3,67 2 2,67 10 -2 5,67 0,67 1,33 L51 10 0 0 3,67 2,33 10 -1 2 6,33 3,67 10 -2 4,67 6 3,67 L216 10 0 14 3 7 10 -1 15,33 4,67 6,67 10 -2 11,33 5 4,67 L25 10 0 7,33 7,33 1,67 10 -1 20,33 6 2 10 -2 11,33 7,67 3,67 L220 10 0 1,33 2,33 2,67 10 -1 1 5,67 4,33 10 -2 0 3,67 4 L211 10 0 21,67 2 3 10 -1 23,33 3,33 6 10 -2 20,33 3,33 6,33 L16 10 0 0 2,33 0,67 10 -1 3,33 2,33 1,67 10 -2 4 1,67 1,67 L26 10 0 0 0 0,67 10 -1 4,67 2,33 2,67 10 -2 3,33 4,67 3,33 Trung bình 6,92 3.92 3.27 Kết quả phân tích số liệu bằng phần mềm thống kê Minitab 13.1 sử dụng trắc nghiệm F cho thấy:  Có sự khác biệt có ý nghĩa về phƣơng diện thống kê học (P<<0,05) giữa các kích thƣớc trung bình của vòng kháng khuẩn sau 3 khoảng thời gian 24 giờ (6,92 mm), 36 giờ (3,92 mm) và 48 giờ (3,27 mm).  Sự khác biệt giữa các kích thƣớc vòng kháng khuẩn ở các nồng độ pha loãng canh 37 khuẩn E. coli 100 (3,45 mm), 10-1 (5,57 mm), 10-2 (5,11 mm) không có ý nghĩa về phƣơng diện thống kê học (P>0,05). Nhận xét:  Khả năng kháng khuẩn của dịch ly tâm canh khuẩn B. subtilis đối với E. coli sau 24 giờ là cao nhất và khả năng này giảm dần theo thời gian.  Khả năng kháng khuẩn của dịch ly tâm từ canh khuẩn B. subtilis đối với E. coli ở nồng độ 10-1 là cao nhất. Khả năng đối kháng của B. subtilis đối với E. coli sau 24 giờ là cao nhất và khả năng này giảm dần theo thời gian có thể đƣợc giải thích dựa vào 2 giả thiết sau: Trong môi trƣờng tăng sinh TSB, vi khuẩn B. subtilis phát triển và phân tiết các chất kháng khuẩn ra môi trƣờng từ giai đoạn sớm. Càng về sau, khi môi trƣờng dinh dƣỡng ngày càng cạn kiệt, vi khuẩn phát triển kém, các chất kháng khuẩn càng ít đƣợc tiết ra môi trƣờng hơn, các chất này không tồn tại lâu trong môi trƣờng nuôi cấy sẽ bị phân hủy dần nên hàm lƣợng chất kháng khuẩn trong dịch ly tâm canh khuẩn B. subtilis ở giai đoạn càng về sau càng giảm, hiệu quả kháng khuẩn đối với E. coli cũng giảm theo. Tại những thời điểm khác nhau của quá trình phát triển, B. subtilis tiết ra những chất kháng khuẩn khác nhau, vai trò, thời gian tồn tại và tác dụng diệt khuẩn mạnh hay yếu của các chất này cũng khác nhau vì vậy kích thƣớc vòng kháng khuẩn với E. coli đo đƣợc cũng khác nhau khi thu dịch ly tâm từ B. subtilis ở những thời điểm khác nhau. Cụ thể là sau 24 giờ nuôi cấy trong môi trƣờng TSB, dịch ly tâm từ canh khuẩn B. subtilis đã cho thấy khả năng kháng khuẩn mạnh nhất và khả năng này giảm dần sau 36 và 48 giờ nuôi cấy. Tác dụng diệt khuẩn của dịch ly tâm từ B. subtilis dƣờng nhƣ không phụ thuộc vào nồng độ pha loãng của canh khuẩn E. coli. Tuy nhiên, cụ thể ở thí nghiệm này thì dịch ly tâm từ B. subtilis cho kết quả kháng khuẩn tốt nhất với E. coli ở nồng độ pha loãng E. coli là 10-1. 38 Hình 4.6. Vòng kháng khuẩn của dịch ly tâm canh khuẩn B. subtilis (chủng L211) đối với E. coli trên môi trƣờng TSA ở nồng độ pha loãng canh khuẩn E. coli là 10-1 4.4. Kết quả đối kháng giữa B. subtilis và E. coli trong môi trƣờng TSB Khi cho B. subtilis và E. coli với những tỉ lệ mật độ khác nhau trong môi trƣờng TSB và đánh giá sự thay đổi về số lƣợng của 2 vi khuẩn này bằng phƣơng pháp trang đĩa, ta có kết quả đƣợc thể hiện ở dạng logarit trong Bảng 4.3 (số lƣợng thực của các vi khuẩn đƣợc thể hiện ở phần phụ lục) 39 Bảng 4.3 Bảng số lƣợng vi khuẩn Bacillus subtilis và E. coli qua các thời điểm 24 giờ, 36 giờ CHỦNG THỜI GIAN CHỦNGVI KHUẨN LOG SỐ LƢỢNG 2 VI KHUẨN Ở CÁC TỶ LỆ NUÔI CẤY CHỦNG TRUNG BÌNH E6B7 E7B7 E8B7 E6B8 E7B8 E8B8 L220 24 giờ B. subtilis 8,59 12,58 8,72 7,69 5,75 5,46 8,13 E.coli 9,68 9,16 11.59 9,17 11,47 9,62 8,18 36 giờ B. subtilis 6,9 5,67 3,05 7,59 8,37 3,38 5,83 E.coli 8,66 9,06 8,94 9,05 9,06 10,63 9,23 L211 24 giờ B. subtilis 10,29 15,7 10,22 9,77 11,93 9,92 11,31 E.coli 9.29 14,13 9,89 10,56 13,15 10,25 9,66 36 giờ B. subtilis 8,35 5,5 7,09 5,8 8,08 8,5 7,22 E.coli 8,53 8,56 8,66 8,55 8,39 8,97 8,61 L25 24 giờ B. subtilis 10,05 12,69 11,01 10,47 12,54 10,45 11,20 E.coli 10,06 2,5 10,04 9,85 2,67 8,07 7,20 36 giờ B. subtilis 7,99 7,93 7,58 7,67 7,82 9,26 8,04 E.coli 9,42 8,49 9,07 8,25 7,99 8,76 8,66 Chú thích: E6B7: Tỷ lệ số lƣợng E. coli / B. subtilis là 106/107(tế bào/ml) và tƣơng tự đối với E6B8, E7B7, E7B8, E8B7, E8B8 40 Biểu đồ 4.1. Số lƣợng vi khuẩn B. subtilis và E. coli qua các thời điểm 24 giờ, 36 giờ L220-24 H 0 2 4 6 8 10 12 14 E6B7 E7B7 E8B7 E6B8 E7B8 E8B8 Ty le nuoi cay chung Lo g S Lg K L B. sub E. coli L220-36 H 0 2 4 6 8 10 12 E6B7 E7B7 E8B7 E6B8 E7B8 E8B8 Ty le nuoi cay chung Lo g S Lg K L B. SUB E. COLI L211-24 h 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 E6B7 E7B7 E8B7 E6B8 E7B8 E8B8 Ty le nuoi cay chung Lo g S Lg K L B. sub E. coli L211-36 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 6 E7B7 E8B7 E6B8 E7B8 E8B8 Ty le nuoi cay chung Lo g S Lg K L B. SUB E. COLI L25-24 h 0 2 4 6 8 10 12 14 E6B7 E7B7 E8B7 E6B8 E7B8 E8B8 Ty le nuoi cay chung Lo g S Lg K L B. sub E. coli L25-36 h 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 E6B7 E7B7 E8B7 E6B8 E7B8 E8B8 Ty le nuoi cay chung Lo g S lg K L B. sub E. coli 41 Biểu đồ cho thấy:  Cả 3 chủng B. subtilis đều có số lƣợng cao hơn E. coli ở 24 giờ và số lƣợng B. subtilis giảm dần đến mức thấp hơn E. coli ở 36 giờ B. subtilis có khả năng đối kháng với E. coli cao ở tỷ lệ nuôi tăng sinh chung ban đầu giữa B. subtilis:và E. coli trong môi trƣờng TSB là 107: 107.  Chủng L25 cho kết quả đối kháng cao nhất và số lƣợng vi khuẩn sau 36 giờ vẫn còn khá cao mặc dù vẫn thấp hơn số lƣợng vi khuẩn E. coli Giải thích Có sự khác biệt về số lƣợng của B. subtilis và E. coli sau 24 giờ và 36 giờ là do B. subtilis là vi khuẩn hiếu khí, trong khi E. coli là dạng vi khuẩn hiếu khí tùy nghi, vì vậy mà sau 36 giờ nuôi cấy chung trong những ống nghiệm môi trƣờng TSB, số lƣợng B. subtilis giảm đi nhanh chóng trong khi E. coli vẫn tiếp tục tăng trƣởng về số lƣợng. Trong khoảng thời gian 24 giờ sự cạnh tranh chủ yếu là do chất kháng khuẩn của B. subtilis ức chế E. coli vì lúc này môi trƣờng dinh dƣỡng còn nhiều, đồng thời số lƣợng 2 vi khuẩn chƣa cao nên ít xảy ra các tƣơng tác khác trong môi trƣờng. Sự ức chế của B. subtilis đối với E. coli sẽ yếu dần sau 36 giờ khi mà các yếu tố cần thiết cho sự sinh trƣởng cho vi khuẩn giảm nhƣ các chất dinh dƣỡng, hàm lƣợng oxi,… Nồng độ dịch khuẩn có tỷ lệ 107: 107 (B. subtilis: E. coli) có thể là nồng độ có số lƣợng E. coli phù hợp để kích thích sự phát triển cũng nhƣ sự tổng hợp và phân tiết các chất kháng khuẩn của B. subtilis. 4.5. Kết quả đối kháng của chủng B. subtilis L211 đối với E. coli O157:H7 (chủng EDL 933) trên chuột bạch Vài nét chính về chủng E. coli O157: H7 chủng EDL 933: EDL 933 là chủng thuộc type huyết thanh O157: H7 (nhóm EHEC). Là nguyên nhân chủ yếu dẫn đến các hiện tƣợng viêm ruột, tiêu máu, tiểu ra máu trên thú và kể cả con ngƣời. EDL 933 bám vào các tế bào biểu mô ruột và tiết các độc tố Stx1 và Stx2 . Hai 42 độc tố này làm ức chế tổng hợp protein và làm tế bào chết, phá hủy cấu trúc mô gây tiêu chảy nhiều máu, phân nhày nhớt và có nhiều tế bào bạch cầu đa nhân ( các đấu hiệu này đƣợc ghi nhận phổ biến trên ngƣờ). Kết quả thí nghiệm: Sau 2 ngày kể từ khi uống canh khuẩn E. coli, chuột có biểu hiện trạng thái mệt mỏi, chán ăn, thở bụng dồn dập và kể từ ngày thứ 3 thì bắt đầu xuất hiện những con chuột chết đầu tiên ở lô đối chứng và lô thí nghiệm. Bảng 4.4. Số lƣợng và tỷ lệ chuột chết ở các lô trong thí nghiệm đối kháng giữa B. subtilis và E. coli O157: H7 (chủng EDL 933) Lô Số chuột chết (con) Tổng số chuột (con) Tỷ lệ chết (%) Lô đối chứng (cho chuột uống canh khuẩn E. coli và ăn cám không trộn B. subtilis) 8 10 80 Lô thí nghiệm (cho chuột uống canh khuẩn E. coli và ăn cám trộn B. subtilis) 2 10 20 Hình 4.7. Chuột chết do nhiễm E. coli O157:H7 (chủng EDL 933) 43 Kết quả thống kê với phần mềm Minitab sử dụng trắc nghiệm X2 cho thấy sự khác biệt về tỷ lệ chuột chết ở 2 lô thí nghiệm là có ý nghĩa về phƣơng diện thống kê sinh học (P< 0,05). Tỷ lệ chuột chết ở lô thí nghiệm giảm đến 60 % so với lô đối chứng. Từ đó chúng tôi kết luận chủng B. subtilis L211 phân lập từ đất thật sự có khả năng đối kháng mạnh với E. coli O157:H7 (chủng EDL 933). 44 Chƣơng 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận Sau thời gian thực hiện đề tài chúng tôi có những kết luận sau:  Có thể phân lập đƣợc vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất  Bacillus subtilis có thể tiết kháng sinh ức chế sự phát triển của E. coli  Khả năng đối kháng của các chủng B. subtilis đối với E. coli thay đổi tùy theo chủng (trong 9 chủng Bacillus subtilis phân lập đƣợc từ đất, có 3 chủng cho thấy có khả năng đối kháng mạnh với E. coli K88 trên môi trƣờng TSA so với 6 chủng còn lại).  Bacillus subtilis thể hiện khả năng đối kháng với E. coli mạnh hay yếu khác nhau tùy theo nồng độ tƣơng tác giữa B. subtilis với E. coli trong môi trƣờng tăng sinh. (Cụ thể trong thí nghiệm của chúng tôi thì tỷ lệ tƣơng tác thích hợp giữa Bacillus subtilis và E. coli khi nuôi cấy chung trong môi trƣờng TSB cho kết quả đối kháng mạnh nhất là 107:107 tế bào/ml).  Các chất kháng khuẩn của Bacillus subtilis đƣợc tiết từ giai đoạn rất sớm trong quá trình phát triển của vi khuẩn (khoảng 24 giờ nuôi cấy)  B. subtilis có khả năng bảo vệ chuột chống lại bệnh tiêu chảy xuất huyết do E. coli O157:H7 (chủng EDL 933 ) 5.2. Đề nghị  Tiếp tục nghiên cứu khả năng đối kháng với vi khuẩn E. coli của các chủng Bacillus subtilis khác từ nƣớc, không khí, gỗ mục, cỏ khô,…  Nghiên điều kiện môi trƣờng tối ƣu để B. subtilis tiết các chất ức chế sự phát triển của E. coli 45  Đo lƣờng hàm lƣợng kháng sinh tiết ra môi trƣờng nuôi cấy qua từng thời điểm  Tìm hiểu các điều kiện nuôi cấy thích hợp để ứng dụng trong sản xuất probiotic từ bào tử B. subtilis phòng trừ bệnh tiêu chảy trên heo  Nghiên cứu khả năng đối kháng của B. subtilis với nhiều vi sinh vật gây bệnh khác  Tìm hiểu sâu hơn về cơ chế diệt khuẩn của B. subtilis 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt 1. Lý Kim Hữu, 2005. Khảo sát đặc điểm của vikhuẩn Bacillus subtilis và tìm hiểu điều kiện nuôi cấy thích hợp sản xuất thử nghiệm chế phẩm Probiotic. LVTN, Khoa Chăn Nuôi Thú Y. Trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp.HCM. 2. Nguyễn Ngọc Thanh Xuân, 2006. Phân lập vi khuẩn Bacillus sbtilis từ đất và khảo sát khả năng sử dụng các chủng phân lập được trong xử lý nhiễm aflatoxin trên nguyên liệu bắp. LVTN. Khoa Chăn Nuôi Thú Y. Đại Học Nông Lâm Tp.HCM. 3. Nguyễn Quỳnh Nam, 2006. Phân lập vi khuẩn Bacilus subtilis trong phân heo và thử đối kháng với Escherichia coli gây bệnh tiêu chảy trên heo. LVTN. Khoa Công Nghệ Sinh Học. Đại Học Nông Lâm Tp.HCM. 4. Nguyễn Vĩnh Phƣớc, 1976. Vi sinh vật thú y tập 1,2,3. NXB Nông Nghiệp Hà Nội. 5. Lê Minh Cẩm Ngọc, 2005. Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ chế phẩm probiotic. Tìm hiểu môi trường nuôi cấy thích hợp và sản xuất thử nghiệm. LVTN. Khoa Chăn Nuôi Thú Y. Trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp.HCM. 6. Lƣơng Đức Phẩm, 1998. Công nghệ vi sinh vật. NXB Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội. 7. Nguyễn Thụy Hải, 2001. Phân lập và giám định vi khuẩn E. coli gây bệnh tiêu chảy trên heo con theo mẹ. LVTN. Khoa Chăn Nuôi Thú Y. Trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp.HCM. 8. Nguyễn Văn Tranh, 2001. Tìm hiểu sự phân bố của các chủng E. coli gây bệnh phù trên heo sau cai sữa. LVTN. Khoa Chăn Nuôi Thú Y. Trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp.HCM. 9. Tô Minh Châu, Vƣơng Thị Việt Hoa, Vũ Thị Lâm An, Lâm Thanh Hiền, Nguyễn Thị Ngọc Diệp, Nguyễn Thúy Hƣơng. 2000. Vi sinh vật học đại cương. Tủ sách trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp.HCM. 10. Vƣơng Thị Việt Hoa, 2005. Thực tập vi sinh đại cương. Tủ sách trƣờng Đại 47 Học Nông Lâm Tp.HCM. 11. Nguyễn Đức Lƣợng, Nguyễn Hữu Phúc, 2003. Công nghệ vi sinh vật tập 2. Tủ sách trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp.HCM Tài liệu tham khảo internet 12. http//www.ebi.ac.uk/z can/genomes/bacteria.html 13. David H. Green, Phil R. Wakerley, Anthony Page, Andrew Barnes, Loredana Bacigalupi, Ezio Ricca, and Simon M. Cutting, 1999. Characterization of two Bacillus Probiotic 14. 15. Bacillus_subtilis_Gram.jpg 16. tain_images/E_coli_2000_P7201172.jpg 17. PHỤ LỤC 1. Thành phần môi trƣờng 1.1. Môi trƣờng Trypticase Soya Agar (TSA) Soya peptone 15g Tryptone peptone 5g NaCl 5g Agar 18g Nƣớc cất 1000ml pH 7,3 ± 0,2 Cân 30g môi trƣờng TSB + 18g agar, hoà tan vào 1000ml nƣớc cất, đun sôi cho hoà tan. Đem hấp tiệt trùng ở 121oC trong 20 phút. 1.2. Môi trƣờng Trypticase Soya Broth (TSB) Soya pepton 15g Tryptone pepton 5g NaCl 5g Nƣớc cất 1000ml pH 7,3 ± 0,2 Cân 30g bột môi trƣờng TSB hoà tan vào 1000ml nƣớc cất, đun sôi cho hoà tan.Đem hấp khử trùng ở 121oC trong 20 phút. 1.3. Môi trƣờng lên men đƣờng maltose Cao thịt 5g Pepton bột 10g Đƣờng maltose 10g Phenol red 0,01g Nƣớc cất 1000ml pH = 6,7 – 7,1 Hấp khử trùng 121oC trong 10 phút. 1.4. Môi trƣờng Simmons Citrate Agar Sodium citrate 2g K2PO4 1g MgSO4 0,2g Brothynol blue 0,008g NaCl 5g NH4H2PO4 1g Agar 18g Nƣớc cất 1000ml pH 6,9 ± 0,2 1.5. Môi trƣờng khử nitrate Cao thịt 3g Pepton bột 5g NaNO3 1g Agar 7g Nƣớc cất 1000ml pH = 7,0 ± 0,2 1.6 Môi trƣờng lòng đỏ trứng Cao thịt 1g Pepton bột 10g Manitol 10g NaCl 10g Phenol Red 0,0025g Agar 15g Nƣớc cất 1000ml pH = 7,2 ± 0,2 Phân 225ml môi trƣờng vào bình tam giác. Khử trùng ở 1210C/15 – 20 phút. Khi môi trƣờng nguội đến 500C thêm 12,5 ml dung dịch lòng đỏ trứng gà. Trộn đều rồi phân vào đĩa petri vô trùng Cách pha dung dịch lòng đỏ trứng: rửa sạch trứng, sát trùng bên ngoài trứng bằng cồn. Dùng kẹp đập trứng, bỏ phần lòng trắng, chuyển phần lòng đỏ vào bacher có chứa 25 – 30ml nƣớc muối sinh lý vô trùng. Bảo quản dung dịch này ở 40C để dùng. 1.7 Môi trƣờng Clark Lubs Pepton bột 7g Glucose 5g KH2PO4 5g Nƣớc cất 1000ml pH = 6,7 – 7,1 2.Hoá chất 2.1.Nƣớc muối sinh lý 9 ‰ NaCl 9g Nƣớc cất 1000ml 2.2.HCl 1% HCl đđ 10ml Nƣớc cất 1000ml 2.3. NaOH 1% NaOH đđ 10ml Nƣớc cất 1000ml 2.4. NaOH 40% NaOH 40g Nƣớc cất 1000ml Cân 40g NaOH tinh thể hòa vào 50ml nƣớc cất, lắc đều, để yên sau 24 giờ, gan lấy nƣớc trong ở trên rooig bổ sung thêm nƣớc cất cho đủ 1000ml. 3.Thuốc thử và chất chỉ thị màu 3.1.Thuốc thử catalase Dung dịch 3% H2O2 (Hydogen peroxide) 3.2.Thuốc thử methyl red Methyl Red 0,1g Ethanol 95% 300ml Nƣớc cất (vừa đủ) 500ml Hòa tan đỏ methyl vào 300ml ethanol. Thêm nƣớc cất vào cho đủ 500ml 3.3 Thuốc thử α-naphton 10% α-naphton 10g Cồn 960 vừa đủ 100ml 3.4 Thuốc thử xác định khả năng khử nitrate Giess A: Axit sunfanilis 0,5g Axit acetic 30ml Nƣớc cất 100ml Giess B: α-naphhthylamin 0,8g Axit acetic 30g Nƣớc cất 100ml Hòa tan 0,8g α-naphhthylamin trong 10ml nƣớc đun sôi để nguội rồi bổ sung thêm 30ml axit acetic, đem lọc. Đựng trong chai màu, bảo quản trong tủ lạnh để sử dụng. 4.Thuốc nhuộm 4.1.Crystal violet a. Crystal violet 0,4g Cồn 96 10ml b. Phenol 1g Nƣớc cất 100ml Trộn hai dung dịch a và b lại với nhau, khuấy cho tan đều rồi đem lọc. Dung dịch thuốc nhuộm luôn đƣợc bảo quản trong chai màu để tránh ánh sáng. 4.2. Lugol KI 2g Iod tinh thể 1g Nƣớc cất 300ml Hoà 2g KI vào 5ml nƣớc , sau đó thêm 1g Iod,chờ cho Iod tan hết rồi mới thêm nƣớc cất vừa đủ 300ml 4.3. Fuschine kiềm loãng a. Fuschine kiềm 0,3g Cồn 96o 10ml b Phenol 5g Nƣớc cất 35ml Trộn dung dịch a với dung dịch b cho hoà tan. Đem bảo quản trong chai màu. 5.Thử các phản ứng sinh hoá 5.1. Kiểm tra khả năng lên men đƣờng maltose Chuẩn bị Môi trƣờng đƣờng:maltose Giống vi khuẩn Bacilius subtili Ống nghiệm, ống durham. Tiến hành Cho vào mỗi ống nghiệm một ống durham, đem hấp khử trùng ở 121oC trong 10 phút. Sau đó cấy vi khuẩn vào môi trƣờng môi trƣờng, đem ủ ở 37oC/24 giờ. Quan sát sự đổi màu, sinh hơi. Nếu vi khuẩn có khả năng lên men đƣờng thì đƣờng sẽ bị lên men rƣợu, rƣợu hoá acid làm pH môi trƣờng giảm làm chuyển màu môi trƣờng. Kết quả Phản ứng (-): môi trƣờng có màu hồng đỏ. Phản ứng (+): môi trƣờng có màu vàng. 5.2.Thử phản ứng catalase Chuẩn bị Dung dịch H2O2 30%. Lame. Giống vi khuẩn Bacillus subtilis. Tiến hành Dùng pipete lấy một ít vi khuẩn phết lên giữa lame kính sạch và khô. Sau đó nhỏ giọt H2O2 30% lên vết vi khuẩn. Đọc kết quả sau khoảng 15 giây. Kết quả Phản ứng (-): không có hiện tƣợng sủi bọt. Phản ứng (+): Có hiện tƣợng sủi bọt. 5.3 Phản ứng lecithinase Chuẩn bị Môi trƣờng lòng đỏ trứng Giống vi khuẩn Bacillus subtilis Tiến hành: Dùng que cấy vòng, bằng thao tác vô trùng lấy và cấy một ít sinh khối vi khuẩn cấy lên đĩa môi trƣờng lòng đỏ trứng, ủ đĩa ở 370C/24 giờ. Kết quả Phản ứng catalase dƣơng tính: có vòng trong xung quanh khuẩn lạc Phản ứng catalase âm tính: không có vòng trong xung quanh khuẩn lạc. 5.4. Phản ứng VP (Voges Proskauer) Chuẩn bị Giống vi khuẩn Bacillus subtilis. Môi trƣờng Clark Lubs. Alpha-naphtol 10%, NaOH 40%. Tiến hành Dùng que cấy vòng lấy vi khuủân vào môi trƣờng Clark Lubs, nuôi ở nhiệt độ 37 oC trong 24 giờ. Sau đó nhỏ 3-5 giọt NaOH 40% và 3-5 giọt alpha-naphtol 10%. Sau 15 phút đọc kết quả. Kết quả Phản ứng VP (-): Môi trƣờng có màu vàng. Phản ứng VP (+): Môi trƣờng có màu đỏ. 5.5. Phản ứng Methyl-Red Chuẩn bị Môi trƣờng Clark Lubs Thuốc thử Methyl-Red Giống vi khuẩn Bacillus subtilis Tiến hành Dùng que cấy vòng lấy vi khuẩn vào môi trƣờng Clark Lubs, nuôi ở 37oC trong 24 giờ. Sau đó nhỏ 2-3 giọt thuốc thử Methyl-Red vào canh khuẩn va đọc kết quả. Kết quả Phản ứng (-): Môi trƣờng có màu vàng. Phản ứng (+): Môi trƣờng có mau đỏ. 5.6.Phản ứng khử nitrate (NO3) Chuẩn bị Môi trƣờng nitrate. Dung dịch thuốc thử giess A, giess B. Giống vi khuẩn Bacillus subtilis. Tiến hành Dùng que cấy lấy vi khuẩn vào môi trƣờng thạch Nitrate bán lỏng, nuôi ở 37 oC. Sauu 24 giờ, nhỏ vào môi trƣờng 2-3 giọt Giess A, sau đó nhỏ tiếp 2-3 giọt Giess B. Kết quả Phản ứng (-): Môi trƣờng có màu vàng. Phản ứng (+): Môi trƣờng có màu đỏ. 5.7.Khả năng sử dụng Citrate. Chuẩn bị Giống vi khuẩn Bacillus subtilis. Môi trƣờng Simmon citrate. Tiến hành Cấy vi khuẩn vào môi trƣờng citrate, nuôi ở 37oC trong 24 giờ. Kết quả Phản ứng (-): Môi trƣờng có màu xanh lá mạ non. Phản ứng (+): Môi trƣờng có nàu xanh dƣơng. 6.Phƣơng pháp nhuộm Gram Cố định tiêu bản. Đặt giấy lọc lên vết bôi. Nhuộm crystal violet trong 1 – 2 phút. Rửa nƣớc. Cố định Lugol trong 1 phút. Rửa nƣớc. Tẩy cồn 90o trong 15 giây. Rửa nƣớc. Nhuộm fuschine kiềm loãng trong 1 phút. Rửa nƣớc. Châm khô, soi kính hiển vi. 8. Phƣơng pháp đếm khuẩn lạc Chuẩn bị các đĩa môi trƣờng TSA đã hấp tiệt trùng và để khô mặt thạch. Lấy 1 ml dịch vi khuẩn cần đếm pha loãng ở nhiều nồng độ liên tiếp nhau (theo phƣơng pháp pha loãng thập phân) bằng dung dịch nƣớc muối sinh lí. Cấy trang 0,1 ml dịch pha loãng lên môi trƣờng TSA (mỗi nồng độ trang 2 đĩa), ủ ở 37oC trong 24 giờ. Đem đếm số lƣợng vi khuẩn. Đếm số lƣợng bào tử bằng phƣơng pháp đếm khuẩn lạc: Lấy dịch nuôi cấy vi khuẩn pha loãng xử lí tế bào sinh dƣỡng bằng cách đun ở 100oC trong 1 giờ, sau đó thực hiện các bƣớc tiếp theo nhƣ trên. Tính kết quả *Số khuẩn lạc trong 1g mẫu hay 1 ml dịch mẫu ở mỗi độ pha loãng. Công thức: X = Vh A 11 Trong đó: X: Số lƣợng vi khuẩn trong 1g mẫu hay 1 ml dịch mẫu. A: Số khuẩn lạc trung bình có trong đĩa (trong tổng số 2 đĩa có cùng nồng độ pha loãng). h: Độ pha loãng tứ (10-7, 10-8, 10-9, …). V: Thể tích dịch mẫu cấy lên một đĩa. *Số khuẩn lạc trung bình trong 1g mẫu hay 1 ml dịch mẫu ở 3 độ pha loãng liên tiếp nhau: Công thức: Y = 3 321 XXX Trong đó: Y: Số khuẩn lạc trung bình ở các độ pha loãng. X1, X2, X3: Số khuẩn lạc trung bình có trong 1g mẫu hay 1 ml dịch mẫu ở mỗi nồng độ pha loãng. 9. Kết quả xử lý thống kê 9.1 Thí nghiệm 1: Đối kháng giữa khuẩn lạc B. subtilis và E. coli trên môi trƣờng TSA Bảng ANOVA 9.1 : 24 H, 36 H, 48 H Analysis of Variance Source DF SS MS F P Factor 2 194.30 97.15 19.36 0.000 Error 321 1610.45 5.02 Total 323 1804.75 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev ------+---------+---------+---------+ 24 H 108 4.157 2.357 (----*----) 36 H 108 2.731 2.228 (----*----) 48 H 108 2.361 2.129 (-----*----) ------+---------+---------+---------+ Pooled StDev = 2.240 2.40 3.20 4.00 4.80 Bảng ANOVA 9.2 : Chủng B. subtilis versus nồng độ Analysis of Variance for C2 Source DF SS MS F P C1 3 37.76 12.59 2.69 0.050 Error 104 486.10 4.67 Total 107 523.86 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev ----+---------+---------+---------+-- 10^0 27 2.494 1.873 (-------*-------) 10^-1 27 2.642 2.132 (-------*--------) 10^-2 27 3.210 2.443 (-------*-------) 10^-3 27 4.000 2.162 (-------*-------) ----+---------+---------+---------+-- Pooled StDev = 2.162 2.0 3.0 4.0 5.0 Bảng ANOVA 9.3 : 24 H versus CHủng, Nồng độ Analysis of Variance for 24 H Source DF SS MS F P CHUNG 8 232.57 29.07 8.44 0.000 NONGDO 3 31.06 10.35 3.01 0.034 Error 96 330.69 3.44 Total 107 594.32 Individual 95% CI CHUNG Mean ----------+---------+---------+---------+- L16 3.50 (------*------) L211 6.33 (------*------) L216 2.67 (------*------) L219 3.08 (-------*------) L220 5.17 (------*-------) L25 6.75 (------*------) L26 4.08 (------*------) L29 2.83 (------*------) L51 3.00 (------*------) ----------+---------+---------+---------+- 3.00 4.50 6.00 7.50 Individual 95% CI NONGDO Mean ---+---------+---------+---------+-------- 10^0 4.04 (---------*---------) 10^-1 3.33 (----------*---------) 10^-2 4.70 (---------*---------) 10^-3 4.56 (---------*---------) ---+---------+---------+---------+-------- 2.80 3.50 4.20 4.90 9.2 Thí nghiệm 2: Đối kháng giữa dịch ly tâm từ B. subtilis và E. coli trên môi trƣờng TSA Bảng ANOVA 9.4 : 24 H, 36 H, 48 H Analysis of Variance Source DF SS MS F P Factor 2 615.1 307.6 13.55 0.000 Error 240 5447.1 22.7 Total 242 6062.3 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev -------+---------+---------+--------- 24 H 81 6.926 7.443 (-----*------) 36 H 81 3.926 2.301 (------*-----) 48 H 81 3.272 2.720 (-----*------) -------+---------+---------+--------- Pooled StDev = 4.764 3.2 4.8 6.4 Bảng ANOVA 9.5 : Chủng B. subtilis versus Nồng độ Analysis of Variance for C2 Source DF SS MS F P C1 2 66.6 33.3 1.44 0.243 Error 78 1804.7 23.1 Total 80 1871.3 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev ----------+---------+---------+------ 10^0 27 3.457 4.771 (-----------*----------) 10^-1 27 5.568 5.461 (-----------*----------) 10^-2 27 5.111 4.102 (-----------*----------) ----------+---------+---------+------ Pooled StDev = 4.810 3.2 4.8 6.4 Bảng ANOVA 9.6 : 24 H versus CHUNG, NONGDO Analysis of Variance for 24 H Source DF SS MS F P CHUNG 8 3894.00 486.75 83.74 0.000 NONGDO 2 130.67 65.33 11.24 0.000 Error 70 406.89 5.81 Total 80 4431.56 Individual 95% CI CHUNG Mean --+---------+---------+---------+--------- L16 2.44 (--*--) L211 21.78 (-*--) L216 13.56 (--*-) L219 2.11 (--*-) L220 0.78 (-*--) L25 13.00 (--*-) L26 2.67 (-*--) L29 3.78 (-*--) L51 2.22 (--*-) --+---------+---------+---------+--------- 0.00 6.00 12.00 18.00 Individual 95% CI NONGDO Mean ---+---------+---------+---------+-------- 10^0 5.37 (-------*------) 10^-1 8.48 (-------*------) 10^-2 6.93 (-------*------) ---+---------+---------+---------+-------- 4.80 6.00 7.20 8.40 9.3 Thí nghiệm 3: Đối kháng giữa dịch chiết từ canh khuẩn B. subtilis và E. coli trên môi trƣờng TSB Chủng L25-24 giờ Bảng ANOVA 9.7 : Số lượng VK B. subtilis và E. coli versus Nồng độ Analysis of Variance for SLG VK B Source DF SS MS F P NONG DO 11 727.37 66.12 15.79 0.000 Error 60 251.22 4.19 Total 71 978.59 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev --------+---------+---------+-------- E6B7-B 6 10.049 1.633 (---*---) E6B7-E 6 10.063 0.397 (---*---) E6B8-B 6 10.471 0.876 (---*---) E6B8-E 6 9.849 0.605 (----*---) E7B7-B 6 12.690 0.966 (---*---) E7B7-E 6 2.500 3.674 (---*---) E7B8-B 6 12.535 0.872 (---*----) E7B8-E 6 2.667 4.082 (----*---) E8B7-B 6 11.013 0.806 (----*---) E8B7-E 6 10.038 0.931 (---*---) E8B8-B 6 10.453 0.863 (---*---) E8B8-E 6 8.065 3.488 (---*---) --------+---------+---------+-------- Pooled StDev = 2.046 4.0 8.0 12.0 Chủng L211-24 giờ Bảng ANOVA 9.8 : SLG VK B. subtilis va E. coli versus NONG DO Analysis of Variance for SLG VK B Source DF SS MS F P NONG DO 11 271.29 24.66 21.30 0.000 Error 60 69.46 1.16 Total 71 340.75 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev -------+---------+---------+--------- E6B7-B 6 10.293 0.643 (--*---) E6B7-E 6 9.294 0.954 (--*---) E6B8-B 6 9.773 0.585 (--*---) E6B8-E 6 10.563 1.048 (--*---) E7B7-B 6 15.700 0.639 (---*--) E7B7-E 6 14.130 2.675 (---*--) E7B8-B 6 11.927 0.455 (---*--) E7B8-E 6 13.145 0.534 (---*--) E8B7-B 6 10.221 0.928 (---*--) E8B7-E 6 9.897 0.763 (---*--) E8B8-B 6 9.917 1.082 (---*--) E8B8-E 6 10.249 0.677 (---*---) -------+---------+---------+--------- Pooled StDev = 1.076 10.0 12.5 15.0 Chủng L220- 24 giờ Bảng ANOVA 9.9 : Số lượng VK B. subtilis và E. coli versus NONG DO Analysis of Variance for SLG VK B Source DF SS MS F P NONG DO 11 308.65 28.06 3.37 0.001 Error 60 500.11 8.34 Total 71 808.76 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev --+---------+---------+---------+---- E6B7-B 6 8.588 1.153 (------*-----) E6B7-E 6 9.679 0.929 (------*-----) E6B8-B 6 7.693 0.694 (------*------) E6B8-E 6 9.175 0.576 (------*------) E7B7-B 6 12.583 0.618 (------*------) E7B7-E 6 9.157 6.428 (------*------) E7B8-B 6 5.746 5.209 (-----*------) E7B8-E 6 11.466 0.949 (------*-----) E8B7-B 6 8.724 3.845 (------*------) E8B7-E 6 11.599 0.533 (------*------) E8B8-B 6 5.463 3.473 (------*-----) E8B8-E 6 9.622 0.389 (-----*------) --+---------+---------+---------+---- Pooled StDev = 2.887 3.5 7.0 10.5 14.0 9.4 Thí nghiệm 4: Thử nghiệm khả năng đối kháng của 1 chủng B. subtilis và E. coli O157:H7 chủng EDL 933 trên chuột Chi-Square Test: Lô đối chứng, Lô thí nghiệm Expected counts are printed below observed counts LÔ Đ/c Lô TN Total Chết 2 8 10 5.00 5.00 Sống 8 2 10 5.00 5.00 Total 10 10 20 Chi-Sq = 1.800 + 1.800 + 1.800 + 1.800 = 7.200 DF = 1, P-Value = 0.007 10. Số lƣợng vi khuẩn B. subtilis và E. coli đếm bằng phƣơng pháp trang đĩa ở thí nghiệm 3 CHỦNG THỜI GIAN CHỦNG VI KHUẨN SỐ LƯỢNG VI KHUẨN Ở CÁC TỶ LỆ NUÔI CẤY CHUNG (CFU/ml) E6B7 E7B7 E8B7 E6B8 E7B8 E8B8 L220 24 H B. subtilis 3,9.10 9 7,23.10 12 3,82.10 10 9,9.10 7 2,33.10 10 5.10 7 E.coli 2,18.10 10 6.10 13 6,79.10 11 2,84.10 9 1,03.10 12 5,74.10 9 36 H B. subtilis 1,16.10 8 7,72.10 7 3,35.10 7 1,19.10 8 4,14.10 8 1,7.10 8 E.coli 5,31.10 8 2,14.10 9 1,08.10 9 1,45.10 9 2,81.10 9 1,5.10 11 L211 24 H B. subtilis 3,75.10 10 9,48.10 15 5,79.10 10 9,75.10 9 1,19.10 12 6,32.10 10 E.coli 1,03.10 10 1,63.10 15 1,8.10 10 1,26.10 11 2,19.10 13 4,42.10 10 36 H B. subtilis 2,32.10 8 4,30.10 7 3,44.10 8 1,17.10 8 1,32.10 8 4,64.10 8 E.coli 3,98.10 8 6,87.10 8 7,63.10 8 3,94.10 8 2,73.10 8 1,74.10 9 L25 24 H B. subtilis 1,22.10 11 2,09.10 13 3,32.10 11 1,05.10 11 1,23.10 13 9,32.10 10 E.coli 1,68.10 10 1,67.10 9 5,12.10 10 1,43.10 10 1,67.10 10 4,65.10 9 36 H B. subtilis 1,77.10 8 2,11.10 8 1,15.10 8 5,69.10 7 8,52.10 7 3,07.10 9 E.coli 5,31.10 8 2,14.10 9 1,08.10 9 1,45.10 9 2,81.10 9 1,5.10 11