Khóa luận Phát hiện loài Fusarium spp. gây bệnh thối xương rồng (cactaceae) bằng phương pháp polymerase chain reaction (PCR)

uôn đều cần sự hiện diện của những primer chuyên biệt. 19 Mạch khuôn thƣờng là một trình tự DNA của bộ gen (gọi là trình tự DNA mục tiêu) đặc trƣng cho từng loại vi sinh vật mục tiêu hoặc gen quy định việc tổng hợp một loại độc tố chuyên biệt của vi sinh vật. Primer là những đoạn oligonucleotide có khả năng bắt cặp bổ sung vào đầu 3’ của khuôn, DNA polymerase sẽ nối dài primer để hình thành mạch mới (Bùi Trang Việt, 2002). 2.6.2. Nguyên tắc Sự khuếch đại đƣợc thực hiện nhờ chu trình nhiệt lặp lại. Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lặp lại nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn: Giai đoạn 1: (giai đoạn biến tính: tách sợi đơn DNA, denaturation) Ở điều kiện nhiệt độ cao phân tử DNA từ mạch đôi tách ra thành dạng mạch đơn và nhiệt độ cần thiết để biến tính hoàn toàn DNA thƣờng là 94 – 950C trong 30 – 60 giây. Giai đoạn 2: (giai đoạn bắt cặp giữa primer và khuôn, anealation) Khi nhiệt độ hạ xuống thấp hơn nhiệt độ nóng chảy Tm của primer, primer sẽ bắt cặp với mạch khuôn tại vị trí có trình tự bổ sung với primer. Nhiệt độ cho giai đoạn này là 50 – 640C. Giai đoạn 3: (giai đoạn tổng hợp, kéo dài, elongation) Nhiệt độ tăng lên 720C, ở nhiệt độ này Taq DNA polymerase hoạt động tối ƣu. Trong khoảng 30 giây cho đến vài phút tùy theo kích thƣớc cần khuếch đại. Khi đó Taq DNA polymerase tổng hợp mạch DNA mới dựa trên trình tự của mạch khuôn, độ dài đoạn khuếch đại là khoảng cách giữa hai primer đơn đã bắt cặp với 2 DNA khuôn mạch đơn, các nucleotid lần lƣợt đƣợc gắn vào mỗi đầu DNA khuôn sợi đơn, gắn kế tiếp các nucleotid của primer và chiều bổ sung là 5’ ở trên cả 2 DNA sợi đơn. Trong phản ứng PCR một chu kỳ gồm 3 giai đoạn nhƣ trên sẽ đƣợc lặp đi lặp lại nhiều chu kỳ và làm gia tăng số lƣợng DNA theo cấp số nhân. Sự khuếch đại này đƣợc tính nhƣ sau: Tổng số DNA khuếch đại= m x 2n . 20 Trong đó: n là số chu kỳ thực hiện. m là số bản sao của chuỗi trình tự DNA cần nhân ra. Yếu tố quan trọng nhất trong phản ứng PCR là nhiệt độ nóng chảy của primer Tm. Trong số 3 giai đoạn trên, giai đoạn 2 quan trọng nhất bởi vì trong giai đoạn này sự lai DNA – DNA giữa primer và khuôn xảy ra. Nếu nhiệt độ chọn cho phản ứng quá thấp thì việc lai DNA sẽ bị nhiều lỗi. Nếu nhiệt độ chọn cho phản ứng quá cao thì không lai đƣợc DNA. Vì thế để thiết lập nhiệt độ cho phản ứng PCR ngƣời ta xác định nhiệt độ nóng chảy Tm với từng nhóm primer nhƣ sau: Tm= 4 x (G+X) + 2(A+T) 0 C. 2.6.3. Các yếu tố ảnh hƣởng đến kết quả phản ứng PCR  DNA khuôn DNA khuôn dùng trong phản ứng PCR phải thật tinh sạch nhƣng đôi khi kỹ thuật này cũng cho phép khuếch đại DNA thu đƣợc trực tiếp từ dịch trích tế bào mà vẫn cho kết quả tốt, thông thƣờng phƣơng pháp này đƣợc áp dụng trong chẩn đoán. Lƣợng DNA khuôn dùng trong phản ứng PCR phải thật nhỏ khoảng 1 g. Nếu lƣợng DNA khuôn quá cao có thể tạo ra những sản phẩm phụ không mong muốn hay còn gọi là dƣơng tính giả.  Enzyme DNA polymerase dùng trong phản ứng PCR phải là enzyme chịu nhiệt cao: Taq polymerase đƣợc tách chiết từ vi khuẩn Thermus aquaticus (vi khuẩn suối nƣớc nóng). Taq polymerase quá cao sẽ thấy hiện tƣợng tổng hợp DNA do phản ứng giả của primer trên dây đơn, đây là những kết quả không chuyên tính sẽ làm sai lệch kết quả, còn nếu nồng độ Taq polymerase quá thấp sẽ không có đủ số lƣợng enzyme để xúc tác tạo ra sản phẩm PCR theo ý muốn.  Primer và nhiệt độ lai Primer có vai trò rất quan trọng trong tiến trình khuếch đại của phản ứng PCR. Việc thiết kế và chọn primer phải đáp ứng đủ các yêu cầu sau: 21  Trình tự primer đƣợc chọn sao cho không có sự bắt cặp bổ sung giữa primer “xuôi” và primer “ngƣợc”, không có những cấu trúc “primer dimer” do sự bắt cặp bổ sung giữa các thành phần khác nhau của một primer.  Nhiệt độ nóng chảy Tm của primer xuôi và primer ngƣợc không đƣợc cách biệt quá xa. Thành phần nucleotide của các primer phải cân bằng tránh lặp đi lặp lại nhiều lần.  Các primer phải đặt trƣng cho trình tự DNA cần khuếch đại, không trùng với trình tự lặp lại trên gen.  Các thành phần khác trong phản ứng PCR Bốn loại nucleotide (dNTP) thƣờng đƣợc sử dụng ở nồng độ là 200 nM/mỗi loại nucleotide. Nếu nồng độ cao hơn dễ dẫn đến sản phẩm khuếch đại dƣơng tính giả hay tạp nhiễm. Sự mất cân bằng trong thành phần các nucleotide lại làm tăng các lỗi sao chép của polymerase. Nồng độ Mg2+ cao hay thấp đều tạo ra các ảnh hƣởng rất khác nhau trong phản ứng PCR.  Số lƣợng chu kỳ phản ứng Số chu kỳ trong phản ứng thông thƣờng không đƣợc vƣợt quá 40 chu kỳ. Do phản ứng PCR diễn tiến qua hai giai đoạn. Giai đoạn đầu số lƣợng bản sao tăng theo cấp số nhân tỉ lệ với lƣợng mẫu ban đầu, sau đó hiệu quả khuếch đại giảm hẳn vì những nguyên nhân sau: sự phân huỷ và cạn kiệt các thành phần của phản ứng, sự xuất hiện các sản phẩm phụ làm ức chế phản ứng khuếch đại, các bản sao vừa đƣợc tổng hợp không bắt cặp với mồi mà chúng tự bắt cặp với nhau. Số chu kỳ cho một phản ứng còn phụ thuộc vào số lƣợng mẫu ban đầu.  Thiết bị và dụng cụ phản ứng PCR Máy PCR cần đáp ứng đƣợc yêu cầu thay đổi nhiệt độ thật nhanh, thật chính xác, tránh tối đa sự bốc hơi nƣớc trong quá trình thực hiện phản ứng PCR. Eppendorf dùng cho phản ứng PCR phải là loại có vách mỏng và có khả năng truyền nhiệt tốt. 22 2.6.4. Ứng dụng của PCR Hiện nay thành tựu của PCR mở ra nhiều triển vọng cho sinh học phân tử với nhiều ứng dụng trong sinh học, y khoa, nông nghiệp, kiểm nghiệm vi sinh vật gây bệnh: thực phẩm, bệnh phẩm, mỹ phẩm, nƣớc, phát hiện pháp y, điều tra tội phạm. Ứng dụng PCR để sản xuất những mẫu dò dùng trong phƣơng pháp lai phân tử, xác định các trình tự acid nucleic, tạo các đột biến điểm định hƣớng. Hơn thế nữa PCR còn đƣợc ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhƣ:  Trong nghiên cứu genome học Nhân bản vô tính với PCR. Recombinant PCR. Kỹ thuật footprinting DnaseI. Multiplex PCR. HLA DNA (các kháng nguyên bạch cầu ngƣời) 2.7. Giới thiệu sơ lƣợc về kỹ thuật DNA sequencing Kỹ thuật DNA sequencing là công trình đƣợc công bố bởi Maxam và Gilbert (1977). Tuy nhiên hơn 20 năm qua kỹ thuật này đƣợc cải tiến rất nhiều. Đặc biệt với sự trợ giúp của computer, kỹ thuật huỳnh quang, tiến bộ của phƣơng pháp PCR và kỹ thuật điện di, kỹ thuật DNA sequencing trở thành công cụ rất có giá trị, làm nền tảng cho phân tích genome. Khái niệm: Kỹ thuật DNA sequencing là kỹ thuật xác định tất cả những hợp phần do nucleotid hình thành nên phân tử DNA (Alphey, 1997). 2.8. Một số nghiên cứu trong và ngoài nƣớc về bệnh do nấm Fusarium spp. 2.8.1. Trên thế giới Tuy hiện nay các kỹ thuật công nghệ sinh học rất phát triển nhƣng dƣờng nhƣ việc ứng dụng các kỹ thuật này để định danh hay chẩn đoán bệnh do nấm Fusarium spp. gây hại trên xƣơng rồng rất ít. Và theo chúng tôi tìm hiểu thì chƣa thấy có tài liệu nào nói về kỹ thuật sinh học phân tử trong việc chẩn đoán, phát hiện 23 nấm Fusarium spp. gây bệnh trên xƣơng rồng. Chỉ có chẩn đoán và phát hiện nấm Fusarium spp. bằng biện pháp sinh học phân tử trong một số lĩnh vực nhƣ là: Ralph A. Wang, Yi-Hong và cộng sự, (2002) đã sử dụng phƣơng pháp PCR để phát hiện genotype kháng Fusarium gây bệnh héo trên cây trồng. Nghiên cứu này nhằm mục đích phát hiện genotype của cây họ bầu bí kháng hay mẫn cảm với sự nhiễm Fusarium. Các nhà nghiên cứu này đã sử dụng phƣơng pháp PCR để khuếch đại DNA mẫu, sử dụng cặp mồi AM hoặc FM. Sản phẩm PCR từ các cặp mồi khác nhau về kích cở, phụ thuộc vào DNA mẫu thu đƣợc từ cây mẫn cảm hay kháng nấm Fusarium, nghiên cứu đã xác định nhanh và chính xác kiểu gen của cây trồng. Hirano, Yasushi và ctv (2006), đã sử dụng phƣơng pháp PCR để phân biệt Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici và radicis-lycopersici và loài F. oxysporum f. sp. lycopersici gây bệnh trên cây cà chua. Bằng cách so sánh một phần trình tự của gen mã hóa enzyme endopolygalacturonase (pg1) và enzyme exopolygalacturonase (pgx4) phân lập từ F. oxysporum f. sp. lycopersici (FOL) và radicis-lycopersici (FORL) ở Nhật Bản và thiết kế các primer chuyên biệt (uni, sp13, sp23, and sprl) trên các nucleotide khác nhau của các loài gây bệnh. PCR với primer uni khuếch đại đoạn gen dài 670 - 672 bp từ FOL và FORL. Với primer sp13, chỉ thu đƣợc từ loài FOL 1 và 3. Với primer sp23, đoạn gen 518 bp thu đƣợc từ loài FOL 2 và 3 đƣợc khuếch đại. Primer sprl cho sản phẩm khuếch đại dài 947 bp, từ loài FORL , nhƣng không cho sản phẩm ở loài FOL. Yli - Mattila T., Paavenen S. và ctv (1996), đã sử dụng phƣơng pháp Isozyme và RAPD-PCR trong phân tích sự đa hình các dòng Fusarium avenceum ở Phần Lan. Kỹ thuật izozyme và RAPD - PCR đƣợc so sánh trong nghiên cứu đa hình giữa 33 dòng Fusarium avenaceum sử dụng phƣơng pháp điện di trên gel polyacrylamide và điện di trên gel agarose. Kỹ thuật isozyme đã phát hiện đƣợc 5 sự đa hình và độ tƣơng đồng là 70%, còn phƣơng pháp RAPD - PCR cho phép phân tích tất cả các dòng của F. avenaceum. Kết quả phenotype từ phân tích 24 RAPD - PCR đƣợc chia thành 5 nhóm chính bằng phân tích trung bình cộng và độ tƣơng đồng là 55%. Chiocchetti Annalisa và ctv, (1999) đã sử dụng phƣơng pháp PCR để phát hiện Fusarium oxysporum f. sp. basilici trên cây húng. Bằng cách sử dụng 69 trình tự DNA đƣợc khuếch đại, tạo ra từ sự phân lập các dòng Fusarium oxysporum f. sp. basilici khác nhau, F. oxysporum f. sp. basilici đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp dot blot. Một trình tự dài 1038 bp đƣợc lai DNA từ tất cả các dòng F. oxysporum f. sp. basilici nhƣng không thu đƣợc đoạn DNA từ các dòng F. oxysporum phân lập từ các cây húng không mang bệnh hoặc các dạng đặc biệt khác điển hình của F. oxysporum, hoặc từ sự phân lập các loài F. redolens, F. tabacinum, Rhizoctonia solani, Sclerotinia sclerotiorum, S. minor, và Pythium ultimum thu đƣợc từ các cây húng bị bệnh. Trình tự này đƣợc tạo dòng và đọc trình tự, 3 cặp mồi chuyên biệt của F. oxysporum f. sp. basilici đƣợc thiết kế, lần lƣợt cho sản phẩm khuếch đại là 943, 382, và 330 bp. Kỹ thuật nested PCR cho phép phát hiện F. oxysporum f. sp. basilici từ hạt bị bệnh và hạt bị nhiễm bẩn do tự nhiên hoặc nhân tạo. R N Crowhurst và cộng sự (1991), đã phân biệt sự khác nhau giữa nấm Fusarium solani f. sp. cucurbitae loài 1 và 2 bằng kỹ thuật RAPD. Phƣơng pháp này sử dụng để đánh giá sự đa dạng về genome giữa 21 dòng F. solani f. sp. cucurbitae loài 1 và loài 2. 7 sản phẩm đa hình nhờ RAPD đã sử dụng probe trong lai Southern genomic DNA trong đó 6 của 7 probe trong lai phân tử đƣợc sao chép trong giải trình tự đơn và 5 của 7 probe biểu hiện một sự lai chuyên biệt. Một nhóm nghiên cứu ngƣời Pháp (2000), đã sử dụng probe rDNA oligonucleotide và phƣơng pháp PCR để phát hiện nấm Fusarium oxysporum. Kỹ thuật PCR và lai phân tử đƣợc phát triển để phát hiện Fusarium oxysporum. Các dữ liệu trên trình tự từ rRNA 28S, 2 primer (PFO2 và PFO3) và probe 20 – mer đƣợc thiết kế. Những oligonucleotide này đƣợc kiểm tra trên 16 dòng F. oxysporum và 80 dòng của 23 loài Fusarium khác hoặc của 8 loài từ giống nấm khác. Phƣơng pháp PCR để khuếch đại đoạn DNA chuyên biệt từ các dòng F. oxysporum sử dụng các primer PFO2 và PFO3. Khi ở dƣới điều kiện cho phép, không thu đƣợc sản phẩm 25 PCR từ các primer này trên 80 dòng nấm khác. Probe oligonucleotide HFO1 đƣợc đánh dấu bằng phƣơng pháp phóng xạ tự ghi và đánh giá sự khác biệt trong các thử nghiệm lai dot blot với rRNA khuếch đại bởi PCR. Dƣới điều kiện khách quan, lai probe với DNA từ các dòng F. oxysporum cho kết quả tốt. John Paul Jone và Pat Crill (1974), nghiên cứu tính kháng bệnh héo do Fusarium gây ra trên cây cà chua nhận thấy rằng giống M.A.160 và một số dòng khác mang gen I có khả năng kháng loài F. oxysporum f. sp. lycopersici. Một số dòng khác không mang gen này sẽ bị nhiễm bệnh. Nhóm nghiên cứu của Matias Pasquali, Alberto Acquadro và ctv (2004), đã nghiên cứu đề tài: Sự phát triển primer để tiến hành PCR phát hiện một loài Fusarium oxysporum mới gây bệnh trên cây cúc Pari. Cặp primer Mg5/Mg6 có thể xác định một cách chuyên biệt 9 dòng Fusarium oxysporum đƣợc kiểm tra từ A.frutescens, khi DNA genome của nấm đƣợc sử dụng nhƣ mẫu để kiểm tra. Ngoài ra, cặp primer Mg5/Mg6 cho phép phát hiện thành công các mô gốc và rễ mang bệnh từ cây không mang triệu chứng bệnh bên ngoài. Một nhóm nghiên cứu gồm Zhenggang Zhang và cộng sự (2005), đã sử dụng phƣơng pháp phân tử để phát hiện Fusarium oxysporum f. sp. niveum và Mycosphaerella melonis nhiễm trong mẫu thực vật và đất. Với việc phát triển 2 loại PCR chuyên biệt để phát hiện nhanh và chính xác nấm gây bệnh Fusarium oxysporum f. sp. niveum và Mycosphaerella melonis trên mẫu thực vật và mẫu đất. 2 cặp primer chuyên biệt, Fn-1/Fn-2 và Mn-1/Mn-2 đƣợc tổng hợp. Primer Fn-1/Fn- 2 single PCR khuếch đại chỉ cho band khoảng 320 bp từ F. oxysporum f. sp.niveum, và primer Mn-1/Mn-2 cho sản phẩm PCR khoảng 420 bp từ M. melonis. 2.8.2. Tại Việt Nam Theo chúng tôi tìm hiểu thì tại Việt Nam hiện nay chƣa thấy có tài liệu nào nói về việc ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong việc chẩn đoán, phát hiện nấm Fusarium spp. gây hại trên xƣơng rồng. 26 2.9. Danh mục một số loài Fusarium đƣợc tìm thấy ở Việt nam Bảng 2.1. Một số loài Fusarium đƣợc tìm thấy ở Việt Nam (Đỗ Tấn Dũng, 1996) STT Tên bệnh Phân loại 1 Héo vàng cây khoai lang Fusarium batatas 2 Mốc hồng ngô F.moniliform f.sp. maydis 3 Lở gốc đậu tƣơng F.oxysporum f.sp. glysines 4 Héo vàng cây dƣa chuột F.solani f.sp.cucumerium 5 Héo vàng cây gừng F.oxysporum f.sp.zinggeberi 6 Vết xám trên cỏ lồng vực Fusarium sp. 7 Héo vàng cây hoa loa kèn F.oxysporum f.sp.lini 8 Vết xám trên cành chanh F.semitectum Berk 9 Thối củ chuối F.oxysporum f.sp.cubense 10 Héo vàng cây đinh lăng F.oxysporum f.sp.medicagins 11 Thối nhũn cây xƣơng rồng Fusarium oxysporum 27 Chƣơng 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Vật liệu thí nghiệm 3.1.1. Thời gian – địa điểm nghiên cứu  Thời gian: Đề tài đƣợc tiến hành từ 20/03/2007 đến 30/07/2007  Địa điểm nghiên cứu Bộ Môn Bảo Vệ Thực Vật, khoa Nông học trƣờng Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. - Viện nghiên cứu công nghệ sinh học và công nghệ môi trƣờng trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. 3.1.2. Vật liệu  Chủng vi sinh vật Các dòng nấm Fusarium spp. gây hại xƣơng rồng.  Môi trƣờng Môi trƣờng WA Agar 15 g H2O 1.000 ml Môi trƣờng PGA Khoai tây 200 g Glucose 20 g Agar 15 g H2O 1.000 ml Môi trƣờng nhân sinh khối Glucose 20 g Yeast extract 5 g MgSO4.7H2O 0,5 g KH2PO4 0,5 g K2HPO4 0,5 g CaCl2 1ít H2O 1.000 ml 28  Các thiết bị, dụng cụ thƣờng sử dụng  Các thiết bị Máy điện di (Bio-Rad) Bộ chày cối để nghiền mẫu Máy Vortex Máy PCR Máy chụp gel (Gel Doc 2000) Tủ cấy vi sinh Máy phơi mẫu 37ºC Máy ủ mẫu Tủ giữ mẫu: tủ lạnh (– 70ºC, – 20ºC), tủ mát (– 4ºC). Lò Viba Máy li tâm (Sigma)  Dụng cụ Ống nghiệm Micropipette các loại Đầu típ các loại Eppendorf các loại  Các hóa chất sử dụng  Các hóa chất để li trích DNA sợi nấm TE 1X Nitơ lỏng (nghiền mẫu nấm) Phenol/ Chlorform/ Isoamyl alcohol (25: 24: 1) Lysis Buffer Chloroform/ Isoamyl alcohol (24: 1) Isopropanol lạnh Ethanol 70% 29  Hóa chất sử dụng trong điện di Gel agarose dùng để phân tích DNA qua điện di thƣờng dùng có nồng độ 1% agarose. Dung dịch đệm TAE 0,5X dùng để pha gel và chạy điện di với các thành phần sau: + Tris HCl 4,48 g + Na 2 EDTA 0,5M (pH 8,0) 2 ml + Glacial acetic acid 1,14 ml + Nƣớc cất vừa đủ 1l ít Dung dịch nhuộm trên gel: 1% ethidium bromide  Hóa chất để thực hiện phản ứng PCR – Buffer 5X – MgCl2 25mM – dNTP 25mM – Primer ef1 10pmol/ l và primer ef2 1mpmol/ l – Taq DNA Polymerase 5U/ l – H2O cất khử ion 3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 3.2.1. Điều tra tình hình bệnh chết trên cây xƣơng rồng tại Tp. Hồ Chí Minh Tiến hành điều tra tình hình bệnh hại trên cây xƣơng rồng tại một số hộ trồng xƣơng rồng trên địa bàn Tp. Hồ Chí Minh từ đó xác định đƣợc tỷ lệ nhiễm bệnh do vi khuẩn, virus, nấm gây ra. Hình thức điều tra: phỏng vấn, trao đổi trực tiếp với từng hộ sản xuất. 3.2.2. Phân lập mẫu nấm Mẫu bệnh đƣợc thu thập tại các vƣờn xƣơng rồng bệnh ở Tp.Hồ Chí Minh. Tiến hành phân lập mẫu trên môi trƣờng WA và PGA. 30  Có 2 cách phân lập nấm từ xƣơng rồng bệnh  Cách 1: Mẫu bệnh đƣợc phân lập từ vết bệnh điển hình. Rửa mẫu bệnh bằng nƣớc sạch vì xƣơng rồng đƣợc trồng dƣới đất nên lúc thu thập mẫu dính rất nhiều đất. Để khô mẫu, sau đó cắt bỏ phần gai bên ngoài lấy phần thịt bên trong gồm phần mô bệnh và phần mô khỏe, cắt lấy mảnh nhỏ có kích thƣớc 5 7 mm x 5 7 mm. Tiến hành rửa khử trùng mẫu bằng nƣớc cất vô trùng 1 2 lần rồi khử trùng mẫu bệnh bằng cồn 70º trong 30 giây, sau đó rửa lại bằng nƣớc cất vô trùng 2 3 lần, cắt nhỏ mẫu và để khô tự nhiên trong tủ cấy. Chú ý tất cả dụng cụ để cắt mẫu và khử trùng mẫu nhƣ cốc, dao, giấy thấm… đều phải vô trùng và không nên để mẫu quá khô. Sau đó đặt mẫu lên đĩa petri chứa sẵn môi trƣờng WA và đặt ở 5 7 điểm khác nhau trên đĩa, để ở nhiệt độ phòng. Khi nấm mọc cấy sang môi trƣờng WA một lần nữa bằng cách cắt lấy mẫu nấm mọc từ các mẫu bệnh ở các điểm khác nhau trên đĩa WA trƣớc cấy sang các điểm khác nhau trên đĩa. Lần này khi nấm mọc cấy chuyền sang đĩa có sẵn môi trƣờng PGA, sau đó nấm mọc lại cấy chuyền qua môi trƣờng PGA để tạo dòng thuần.  Cách 2: Mẫu bệnh sau khi đem về tiến hành rửa bằng nƣớc sạch, để khô. Tiến hành ủ mẫu: Chuẩn bị các hộp nhựa có kích thƣớc 20 x 8 cm đã đƣợc khử trùng bằng cồn 70º, lót giấy thấm vô trùng dƣới đáy hộp, xếp ống hút nhựa thành hình tam giác rồi đặt trên miếng giấy thấm trong hộp, cho một ít nƣớc cất vô trùng vô hộp sao cho chỉ vừa ƣớt giấy là đƣợc để tạo độ ẩm. Cho mẫu bệnh vào hộp và tiến hành ủ mẫu cho đến khi nấm mọc. Vì không biết nấm mọc là nấm mong muốn hay không nên phải xem chúng trên kính hiển vi. Xem nấm trên kính hiển vi: Dùng que cấy điểm khều lấy nấm trên mẫu bệnh sau khi ủ cho lên miếng lame đã có sẵn một giọt nƣớc xem kính, rồi cho miếng lamelle đậy lên giọt nƣớc trên lame. Sau đó đƣa lên kính hiển vi để xem. Nếu nấm thuộc Fusarium spp. thì tiến hành phân lập. 31 Cách phân lập: Chuẩn bị lame, que trang, ống hút thủy tinh đã đƣợc hấp khử trùng. Môi trƣờng WA sau khi hấp khử trùng, dùng ống hút thủy tinh đã chuẩn bị hút môi trƣờng WA cho lên lame sau đó trang đều bằng que trang. Chú ý môi trƣờng trên lame không quá dày và cũng không quá mỏng (vì nếu quá dày sẽ khó cắt bào tử và quá mỏng sẽ dễ bị khô môi trƣờng không cắt đƣợc bào tử). Chờ cho môi trƣờng trên lame khô tiến hành cho nấm lên lame bằng cách nhỏ một giọt nƣớc vô trùng trên lame có môi trƣờng, dùng que cấy khều nấm cho vào giọt nƣớc rồi dùng que trang vô trùng trải đều nấm trên lame. Chú ý miếng lame đƣợc đặt trong đĩa petri vô trùng có sẵn giấy thấm và ống hút xếp hình tam giác để tạo độ ẩm. Ủ ở nhiệt độ phòng khoảng 6 giờ, sau đó lấy miếng lame đƣa lên kính hiển vi để tiến hành cắt đơn bào tử (thƣờng cắt ở vật kính 4X). Dụng cụ để cắt đơn bào tử là dao cắt thạch trong phòng thí nghiệm. Bào tử sau khi đƣợc cắt xong đƣa qua môi truờng WA, mỗi đĩa chứa một đơn bào tử. Khi nấm mọc cấy sang môi trƣờng PGA vài lần để tạo dòng thuần.  Cách đặt tên mẫu: FC07 1 là mẫu nấm đƣợc phân lập từ mẫu bệnh trên cây xƣơng rồng tại Tp. Hồ Chí Minh năm 2007, mẫu 1 (F: Fusarium spp., C: Cactaceae). Sau đó chúng tôi tiến hành kiểm tra nấm thuộc các dòng Fusarium spp. bằng cách coi hình thái nấm mọc và màu sắc nấm trên môi trƣờng PGA. Nấm Fusarium spp. mọc không gợn sóng và có màu trắng trên môi trƣờng. 3.2.3. Tăng sinh khối nấm trên môi trƣờng nhân sinh khối Dùng que cấy tam giác cắt khoảng 3 miếng thạch mỗi miếng có kích thƣớc từ 2 3 mm có chứa nấm cho vào bình tam giác có sẵn 100 ml môi trƣờng nhân sinh khối đã hấp tiệt trùng. Nấm trong các bình tam giác đƣợc nuôi lắc trên máy lắc. Chú ý mỗi dòng nấm đƣợc nuôi trong một bình tam giác khác nhau. Sau 72 giờ tăng sinh, sinh khối nấm đƣợc thu hoạch bằng miếng vải đã đƣợc hấp khử trùng. Nấm 32 sau khi thu hoạch trên miếng vải chuyển qua miếng giấy bạc và đem tồn trữ mẫu ở tủ 70ºC cho đến khi tiến hành ly trích. 3.2.4. Ly trích DNA tổng số của nấm Quy trình này đƣợc thực hiện dựa trên quy trình của Lee và Taylor. Bƣớc 1: Nghiền mẫu nấm trong dung dịch nitơ lỏng. Mẫu nấm đƣợc nghiền mịn cho vào các ống nghiệm có thể tích 15 ml. Trong quá trình nghiền cho nitơ lỏng vào liên tục để mẫu nấm không bị tan. Bứơc 2: Thêm 4 ml lysis buffer vào trong ống nghiệm. Trộn đều, ủ ấm ở 65ºC trong vòng 1 giờ. Bƣớc 3: Thêm vào 3 ml phenol/chloroform/isoamylalcohol lần lƣợt theo tỷ lệ (25: 24: 1). Lắc đều, nhẹ. Ly tâm 10 phút với tốc độ 3000 vòng/phút ở nhiệt độ phòng. Bƣớc 4: Hút lấy phần dịch nổi ở trên (3 – 5 ml) cho vào ống nghiệm có dung tích 15 ml khác. Bƣớc 5: Thêm vào ống nghiệm mới 3 ml chloroform/isoamylalcohol (24: 1). Trộn đều, ly tâm với tốc độ 4000 vòng/phút trong 10 phút. Bƣớc 6: Hút lấy phần dịch nổi ở trên (3 – 5 ml) cho vào ống nghiệm có dung tích 15 ml khác. Bƣớc 7: Thêm vào isopropanol lƣợng chất : 0,6 tổng thể tích của ống nghiệm. Lắc nhẹ, để ở nhiệt độ phòng 5 – 10 phút, ly tâm. Bƣớc 8: Dùng que thu DNA tủa ở đáy ống. Bƣớc 9: Dùng ethanol 70% để rửa tủa DNA. Rửa lại nhiều lần thƣờng là 3 – 4 lần. Bƣớc 10: Phơi khô mẫu. Mẫu DNA khô, thêm vào 200 l TE 1X. 3.2.5. Điện di xem DNA tổng số Điện di ở bƣớc này nhằm mục đích xem sản phẩm li trích DNA có bị gãy hay không và sản phảm có tinh sạch không. Nếu sản phẩm không tinh sạch phải tiến hành tinh sạch lại một lần nữa. 33  Các bƣớc của quá trình điện di Bƣớc 1: Chuẩn bị gel cho quá trình điện di. Cách chuẩn bị gel nhƣ sau: cân 0,125 g agarose, thêm 12,5 ml TAE 0,5X, đun trong lò viba ở bƣớc sóng 650W cho đến khi agarose tan hoàn toàn (thông thƣờng đun trong 2 phút). Để nguội đến khoảng 600C (đến khi nào cầm đƣợc mà không quá nóng) đổ gel vào giá nằm ngang có sẵn lƣợc đã cân bằng. Chờ gel đông đặc (khoảng 30 phút), rút lƣợc ra khỏi gel và cho vào bồn điện di có chứa TAE 0,5X sẵn sàng cho việc đặt mẫu. Bƣớc 2: Tiến hành điện di. Trộn dung dịch gồm 4 l DNA sau ly trích và 2 l loading dye 6X. Cho dung dịch này vào giếng trên gel. Điện di 20 phút với cƣờng độ dòng điện là 400 mA và hiệu điện thế là 100V. Bƣớc 3: Nhuộm mẫu. Sau khi điện di xong, gel đƣợc lấy ra khỏi bồn điện di và ngâm vào dung dịch EtBr trong khoảng 15 20 phút. Bƣớc 4: Quan sát kết quả điện di. Kết quả điện di đƣợc quan sát dƣới tia UV nhờ vào máy chụp ảnh Gel Doc, đƣợc quan sát nhờ phần mềm Quantity one (Biorad) Sau khi quan sát kết quả điện di thấy sản phẩm ly trích chƣa sạch còn có nhiều tạp chất. Để sản phẩm sau khi thực hiện phản ứng PCR thật tinh sạch, có thể tiến hành tinh sạch lại sản phẩm ly trích DNA. 3.2.6. Thực hiện phản ứng PCR khuếch đại vùng tef các dòng nấm Fusarium spp. Phản ứng PCR với cặp primer ef1và ef2. (David M. Geiser, 2004).  Thành phần phản ứng  Primer: Bảng 3.1. Primer dùng trong phản ứng PCR Primer Trình tự Primer theo chiều 5`- 3` Ef1 ATTGGGTAAGGA(A/G)GACAAGAC Ef2 GGA(G/A)GTACCAGT(G/C)ATCATGTT 34 Thành phần phản ứng PCR và lƣợng cần dùng đủ cho một phản ứng: Bảng 3.2. Thành phần phản ứng PCR và lƣợng dùng đủ cho một phản ứng Thành phần Liều lƣợng ( l) Nồng độ cuối PCR buffer 10X 10 5X MgCl2 3 1,5 mM dNTP 0,4 0,2 mM Primer 1 1 10 pmol/ l Primer 2 1 10 pmol/ l Khuôn DNA 1 20 ng/ l Taq polymerase 0,2 5U/ l Nƣớc cất 33,4 Tổng cộng 50  Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR Phản ứng với cặp primer ef1 và ef2. Các giai đoạn trong phản ứng PCR đƣợc thực hiện theo David M. Geiser và cộng sự, (2004). Giai đoạn 1: 95ºC trong 3 phút Giai đoạn 2: Bƣớc 1: 95ºC trong 30 giây Bƣớc 2: 53ºC trong 45 giây 30 chu kỳ Bƣớc 3: 72ºC trong 45 giây Giai đoạn 3: 72ºC trong 7 phút Sản phẩm PCR đƣợc giữ ở 4ºC.  Các bƣớc đọc kết quả sản phẩm PCR  Sản phẩm PCR đƣợc điện di trên agarose gel 1 %, dịch đệm TAE 0,5X.  Chạy điện di: 100 V, 250 mA, 20 phút.  Nhuộm gel bằng dung dịch EtBr trong vòng 15 phút.  Kết quả đƣợc ghi lại nhờ đọc tia UV và chụp ảnh bằng phần mềm Quality One của máy Gel Doc 2000 (Biorad). 35 Bảng tóm tắt quy trình khuếch đại vùng tef của các dòng Fusarium spp. bằng cách sử dụng primer ef1 và ef2. 3.2.7. Đọc trình tự sản phẩm PCR Sản phẩm PCR đƣợc đọc trình tự. Nấm Fusarium spp. đƣợc phân lập từ xƣơng rồng bệnh Cấy chuyền sang môi trƣờng PGA Nhân sinh khối nấm trong môi trƣờng nhân sinh khối Phân lập trên môi trƣờng WA Hoá chất: PCR Buffer 10X MgCl2 Primer ef2 Primer ef2 dNTP Taq polymerase DNA khuôn Nƣớc cất Thu sợi nấm Ly trích DNA Thực hiện phản ứng PCR Chu kỳ nhiệt: 95ºC/3 phút 95ºC/30 giây 53ºC/45 giây 72ºC/45 giây 72ºC/7 phút Nghiền sợi nấm 36 Các mẫu đƣợc đọc trình tự: FC07 3, FC07 7, FC07 10. 3.2.8. Chủng nấm lên cây xƣơng rồng Xƣơng rồng sau khi mua từ nhà vƣờn về để một tháng theo dõi có bệnh xuất hiện hay không. Những cây không bệnh đƣợc cho là cây khỏe mạnh và dùng để chủng bệnh. Thí nghiệm tiến hành chủng bệnh nầm lên xƣơng rồng với 12 dòng nấm phân lập đƣợc: FC07 1, FC07 2, FC07 3, FC07 4, FC07 5, FC07 6, FC07 7, FC07 8, FC07 9, FC07 10, FC07 11, FC07 12. Các mẫu xƣơng rồng không chủng nấm bệnh dùng làm đối chứng. 3.2.8.1. Tiến hành chủng bệnh trên xƣơng rồng  Vật liệu Nấm đƣợc nuôi trên môi trƣờng nhân sinh khối. Cây xƣơng rồng khỏe mạnh. Hộp nhựa có kích thƣớc 20 x 8 cm. Kim tiêm + xi lanh 3 ml/cc.  Phƣơng pháp Nấm sau khi đƣợc nuôi trên môi trƣờng, dùng xilanh hút lấy phần dịch lỏng tiêm trực tiếp lên cây xƣơng rồng, mỗi cây tiêm khoảng 3 ml. Sau khi tiêm, dùng bao nilông vô trùng bao cây xƣơng rồng vừa chủng bệnh xong để tránh sự lây lan ra ngoài môi trƣờng. Xƣơng rồng sau khi chủng đƣợc để trong điều kiện nhiệt độ phòng. 3.2.8.2. Đánh giá kết quả Theo dõi xem sau khi chủng bệnh nấm bao nhiêu ngày thì xƣơng rồng bị bệnh và mô tả triệu chứng. Sau đó, lấy mẫu xƣơng rồng bị bệnh phân lập lại và xác định tác nhân gây bệnh. Cách phân lập giống nhƣ cách phân lập ban đầu từ các mẫu bị bệnh ở vƣờn xƣơng rồng mang về. Khi nấm mọc quan sát và mô tả. 37 Chƣơng 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Tình hình bệnh hại xƣơng rồng tại Tp. Hồ Chí Minh Xƣơng rồng cũng giống nhƣ các loại cây cảnh khác thƣờng xuyên bị sâu bệnh gây hại làm ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng bình thƣờng, năng suất, phẩm chất trong đó có màu sắc, độ tƣơi lâu bền làm giảm giá trị kinh tế, giá trị thẩm mỹ, giá trị hàng hóa và xuất khẩu trên thị trƣờng, thậm chí còn làm chết cây. Hiện nay, tình hình bệnh hại nhất là bệnh chết khô trên cây xƣơng rồng đã gây thiệt hại rất lớn cho những hộ trồng xƣơng rồng tại Tp. Hồ Chí Minh. Do đó, việc tiến hành điều tra tình hình bệnh hại và xác định tỷ lệ nhiễm bệnh do vi khuẩn, nấm, virus gây ra có ý nghĩa quan trọng trong công tác bảo vệ thực vật. 4.2. Các triệu chứng bệnh trên xƣơng rồng Qua điều tra cho thấy một số bệnh thƣờng xuất hiện trên xƣơng rồng với các triệu chứng nhƣ sau: Hình 4.1. Xƣơng rồng với triệu chứng thối gốc 38 Hình 4.2. Xƣơng rồng với triệu chứng thối vàng và đen ở gốc Hình 4.3. Xƣơng rồng với triệu chứng thối thân Hình 4.4. Xƣơng rồng cắt dọc với triệu chứng thối từ lõi ra ngoài Qua một số triệu chứng bệnh trên xƣơng rồng chúng tôi thấy bệnh phân bố trên tất cả trên các phần của cây kể cả cây ghép và cây không ghép. 39 4.2.1. Tỷ lệ nhiễm bệnh do vi khuẩn, nấm, virus gây ra qua các vƣờn điều tra (số liệu điều tra tháng 04 năm 2007) Bảng 4.1. Tỷ lệ nhiễm bệnh do vi khuẩn, nấm, virus gây ra qua các vƣờn điều tra Vƣờnđiều tra Tổng số chậu Số chậu bệnh do vi khuẩn Số chậu bệnh do nấm Số chậu bệnh do virus 1 5.000 450 1.500 0 2 15.000 1.500 2.500 0 3 12.500 700 2.500 100 4 11.200 900 2.500 0 5 9.300 800 700 0 6 7.900 550 1.200 0 7 11.500 500 2.000 0 8 17.500 1.500 4.000 50 9 3.000 0 10 0 Tổng cộng 92.900 6.900 16.910 150 Qua bảng 4.1 cho thấy chúng tôi tiến hành điều tra 9 hộ trồng xƣơng rồng trên địa bàn Tp. Hồ Chí Minh với tổng số là 92.900 chậu trong đó số bệnh do vi khuẩn là 6900 chậu, do nấm là 16.910 chậu và do virus là 150 chậu. Điều này còn đƣợc thể hiện qua tỷ lệ phần trăm (%) nhƣ sau: Qua đánh giá kết quả từ bảng 4.1, tỷ lệ nhiễm bệnh tại các vƣờn: bệnh do vi khuẩn: 7,43%, bệnh do nấm: 18,2%, bệnh do virus: 0,16%. 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 2 Tỷ lệ n hi ễm b ện h( % ) Vi khuẩn Nấm Virus Tác nhân gây bệnh Đồ thị 4.1. Tỷ lệ nhiễm bệnh do vi khuẩn, nấm, virus gây ra qua các vƣờn điều tra 40 Bệnh chết khô trên xƣơng rồng đang ảnh hƣởng rất nghiêm trọng và gây thiệt hại lớn cho ngƣời trồng xƣơng rồng. Chúng tôi tiến hành điều tra 9 vƣờn xƣơng rồng và phần lớn các vƣờn này tập trung ở các quận Thủ Đức, quận 12, quận Gò Vấp và huyện Hóc Môn. Qua điều tra cho thấy tỷ lệ nhiễm bệnh do nấm gây ra cao hơn hẳn so với tỷ lệ nhiễm bệnh do vi khuẩn và virus (bảng 4.1 và đồ thị 4.1), hầu nhƣ vƣờn nào cũng bị nhiễm bệnh và tỷ lệ nhiễm bệnh trong mỗi vƣờn khá cao, cụ thể là hộ ở quận 12 vƣờn chỉ có 5.000 chậu nhƣng có đến 30% bị bệnh. Điều này có thể do thời tiết thay đổi bất thƣờng, mƣa nhiều làm cho bệnh phát sinh và phát tán nhanh. Tuy nhiên cũng có nhiều nguyên nhân góp phần làm cho bệnh lây lan là các yếu tố tự nhiên và một phần do chính cách chăm sóc và kỹ thuật của ngƣời trồng xƣơng rồng. Họ chủ yếu dựa vào kinh nghiệm, chƣa có quy trình kỹ thuật hợp lý. Do đó, việc tìm cách phát hiện sớm bệnh trên xƣơng rồng để điều trị cũng nhƣ phòng chống là rất cần thiết. 4.3. Phân lập mẫu nấm Kết quả điều tra cho thấy, bệnh do nấm gây ra có tỷ lệ cao hơn vi khuẩn và virus. Trƣớc tình hình đó chúng tôi tiến hành thu thập các mẫu xƣơng rồng có triệu chứng bệnh do nấm gây ra và tiến hành phân lập trên 2 môi trƣờng là WA và PGA trong đó môi trƣờng WA dùng để loại tạp nhiễm vi khuẩn trong mẫu bệnh và là môi trƣờng nghèo dinh dƣỡng nên thích hợp cho việc cắt đơn bào tử. Kết quả phân lập đƣợc 12 dòng nấm với 2 hình thái đặc trƣng trên môi trƣờng PGA (hình 4.5). Hình thái nấm khác nhau có thể do chúng gây bệnh chuyên biệt cho từng loại xƣơng rồng. 41 Hình 4.5. Nấm phân lập từ xƣơng rồng bệnh trên môi trƣờng PGA A1. Khuẩn lạc nấm màu trắng, tròn, tơ mịn B1. Khuẩn lạc nấm màu tím, tròn, tơ mịn 4.4. Kết quả ly trích thu DNA tổng số từ các dòng nấm Fusarium spp. DNA là vật chất cơ bản trong nghiên cứu di truyền phân tử. Do đó chúng ta phải ly trích đƣợc DNA tách khỏi tế bào và các chất nhƣ RNA, protein,… Có nhiều phƣơng pháp ly trích DNA nhƣng mục đích cuối cùng là làm sao thu đƣợc lƣợng DNA đủ lớn và đủ tinh sạch để tiến hành các thí nghiệm kế tiếp. Mặc dù giai đoạn tách chiết DNA là một giai đoạn khá đơn giản nhƣng nó lại đóng vai trò vô cùng quan trọng. Chúng tôi đã tiến hành ly trích tất cả các dòng nấm phân lập đƣợc bao gồm: FC07 1, FC07 2, FC07 3, FC07 4, FC07 5, FC07 6, FC07 7, FC07 8, FC07 9, FC07 10, FC07 11, FC07 12. Sau khi ly trích xong, chúng tôi tiến hành điện di trên gel agarose 1% ở hiệu điện thế 100V/15 phút trong dung dịch TAE 0,5X, 4 l mẫu/giếng để kiểm tra DNA tổng số. Kết quả ly trích đƣợc thể hiện ở (hình 4.6). A1 B1 Hì nh 4.9 . Xƣ ơn g rồ ng với tri ệu ch ứ g th ối sa u kh i ch ủn g 42 Hình 4.6. Sản phẩm ly trích DNA tổng số của nấm Qua (hình 4.6) cho thấy 1. FC07 1, 2. FC07 2, 3. FC07 3,4. FC07 4, 5. FC07 5, 6. FC07 6, 7. FC07 7, 8. FC07 8, 9. FC07 9,10. FC07 10, 11. FC07 11, 12. FC07 12. Kết quả ly trích DNA tổng số không tinh sạch hoàn toàn. Ngoài DNA tổng số còn có thêm phần tạp nhiễm và những đoạn DNA bị đứt gãy mà quá trình ly trích không thể loại bỏ đƣợc.  Nguyên nhân tạo ra những đoạn DNA đứt gãy  Quá trình nghiền chƣa tốt hoặc do hoá chất nhƣ phenol, chloroform.  Thời gian cho phenol để phá huỷ lớp vỏ, lớp màng nhân, loại bỏ protein. Nếu nhƣ thời gian quá dài sẽ gây nên sự đứt gãy DNA một lƣợng rất đáng kể.  Ly tâm (tốc độ, thời gian, thao tác): - Ly tâm với thời gian ngắn, tốc độ thấp thì sự phân lớp chƣa tốt giữa phần dịch chứa DNA, lớp xác tế bào, lớp phenol. - Ly tâm với thời gian quá dài thì phenol phá huỷ nhiều DNA hơn gây ra nhiều đoạn đứt gãy. - Ly tâm với tốc độ quá cao và thời gian dài thì DNA sẽ bị gãy rất nhiều.  Nguyên nhân thu lƣợng DNA tổng số ít là do: - Mẫu nghiền chƣa mịn. - Thời gian và nhiệt độ ủ chƣa đủ để phá vỡ vách tế bào. phần tạp DNA tổng số 1 2 3 4 5 6 8 6 6 7 8 9 10 11 12 43 - Sự phân lớp chƣa tốt ở các bƣớc ly tâm.  Thực hiện càng nhiều bƣớc ly tâm thì lƣợng DNA đứt gãy càng nhiều cho nên bƣớc tủa DNA không cần phải ly tâm để tập trung lƣợng DNA mà để lắng khoảng 30 phút sẽ thu đƣợc DNA tinh hơn.  Nhƣ vậy mức độ DNA tinh sạch có hoặc không có bị đứt gãy, lƣợng DNA tổng số thu đƣợc nhiều hay ít là do quá trình nghiền nấm và ly trích.  Có 9 dòng Fusarium spp. đƣợc sử dụng để chạy PCR. 4.5. Kết quả phản ứng PCR khuếch đại vùng tef Hình 4.7. Sản phẩm PCR khi khuếch đại bằng cặp primer ef1 và ef2 Chúng tôi đã tiến hành khuếch đại 9 trong 12 dòng phân lập đƣợc gồm: FC07 1, FC07 2, FC07 3, FC07 4, FC07 7, FC07 9, FC07 10, FC07 11, FC07 12. Điện di trên gel agarose 1% ở hiệu điện thế 100V/20 phút trong dung dịch đệm TAE 0,5X, 4 l mẫu/giếng. Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose, dựa vào thang ladder, cho thấy các dòng nấm Fusarium spp. chạy với primer ef1 và ef2 có kích thƣớc khoảng 700 bp. 4.6. Kết quả giải trình tự vùng tef Các dòng nấm sau khi giải trình tự cho kết quả : FC07 3, FC07 7, FC07 10. Trình tự vùng tef của các dòng nấm đọc trình tự đƣợc đối chiếu với dữ liệu của chúng trên NCBI. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 700 pb 44 So sánh vùng trình tự tef của 3 dòng FC07 3, FC07 7, FC07 10 với nhau và giữa 3 dòng với các dòng trên genbank kết quả thể hiện nhƣ sau: So sánh trình tự nucleotide vùng tef của 3 dòng nấm FC07 3, FC07 7, FC07 10 sử dụng phần mềm CLUSTAL. 45 Bảng 4.2. So sánh phần trăm (%) độ tƣơng đồng giữa dòng FC07 – 3, FC07 – 7 và FC07-10 Xác định phần trăm độ tƣơng đồng sử dụng phần mềm ClustalX (1.83) 1: FC07-3 100 100 72 2: FC07-10 100 100 72 3: FC07-7 72 72 100 Qua bảng so sánh 3 dòng nấm trên chúng tôi thấy độ tƣơng đồng giữa FC07 – 3 và FC07 – 10 là 100%, FC07 – 3 và FC07 – 7 là 72%. Nhƣ vậy, dòng FC07 – 3 và dòng FC07 – 10 cùng 1 loài nấm và sự sai khác về nucleotide giữa 2 dòng trên với dòng FC07 – 7 là 28%. Nhƣ vậy, sự sai khác này là khá lớn, có thể dòng FC07 – 7 khác với 2 dòng FC07 – 3 và FC07 – 10. Để biết mức độ tƣơng đồng giữa 3 dòng nấm trên với các dòng trên genbank chúng tôi tiến hành so sánh trình tự vùng tef của 3dòng FC07 3, FC07 7, FC07 10 với các dòng trên genbank sử dụng phần mềm CLUSTAL. 46 47 48 Bảng 4.3. So sánh phần trăm (%) độ tƣơng đồng giữa 3 dòng FC07 – 3, FC07 – 7, FC07 – 10 với các dòng trên genbank Xác định phần trăm độ tƣơng đồng sử dụng phần mềm ClustalX (1.83) 1: FC07-3 100 100 99 77 77 75 79 77 68 2: FC07-10 100 100 99 77 77 75 79 77 68 3: DQ465954-F.solani.south-Africa 99 99 100 78 78 75 80 78 67 4: AJ543556-F.culmorum.Nauy 77 77 78 100 98 90 83 83 73 5: AJ543580-F.graminearum.Nauy 77 77 78 98 100 89 83 82 72 6: EF512027-F.langsethiae.Canada 75 75 75 90 89 100 80 81 71 7: DQ295139-F.lateritium.China 79 79 80 83 83 80 100 80 68 8: DQ837692-F.oxysporum.China 77 77 78 83 82 81 80 100 71 9: FC07-7 68 68 67 73 72 71 68 71 100 Qua bảng so sánh độ tƣơng đồng vùng trình tự tef giữa 3 dòng FC07 3, FC07 7, FC07 10 với các dòng trên genbank khi sử dụng phần mềm CLUSTAL. Chúng tôi thấy dòng FC07 3, FC07 10 có độ tƣơng đồng với loài Fusarium solani là cao nhất 99%. Nhƣ vậy, có thể khẳng định rằng dòng FC07 3, FC07 10 là Fusarium solani. Còn dòng FC07 – 7 có độ tƣơng đồng cao nhất so với các dòng trên genbank cũng chỉ 73%, quá thấp để khẳng định nó là loài nào. Chúng tôi nghi ngờ nên đã Blast trình tự của dòng FC07-7 sau khi xử lý lên genbank nhƣng vẫn thu đƣợc độ tƣơng đồng rất thấp.  Nguyên nhân không thể khẳng định dòng FC07-7 là do:  Qua so sánh độ tƣơng đồng giữa dòng FC07-7 với một số dòng trên genbank chúng tôi nhận thấy đã khuếch đại đúng vùng chức năng, nhƣng không thể khẳng định tên dòng của FC07-7 do tác động của điều kiện sinh thái, địa lý sống khác 49 nhau hoặc do đột biến trong quá trình phân chia tế bào nên có sự sai khác và đa dạng trong kiểu gen của dòng trong cùng 1 loài.  Có thể dòng FC07 – 7 chƣa đƣợc nghiên cứu vùng chức năng tef trên genbank nên chúng tôi không thể so sánh đƣợc. Vậy, nấm gây bệnh thối trên xƣơng rồng ngoài Fusarium solani còn có loài nấm khác còn đang đƣợc tiếp tục nghiên cứu. Qua đó chúng tôi thấy định danh bằng hình thái không chính xác vì môi trƣờng sống của các giống loài ở những điều kiện khác nhau thì hình thái cũng có sự thay đổi dần để thích nghi, tồn tại và phát triển. Cho nên, định danh phân tử hiệu quả hơn, chính xác hơn. Công cụ trong sinh học phân tử nhƣ: kỹ thuật khuếch đại các vùng bảo tồn giống loài và những vùng chức năng khác, các probe đánh dấu và giải trình tự khuếch đại cung cấp những thông tin chính xác hơn về giống loài. Kết quả giải trình tự vùng tef của 3 dòng FC07 3, FC07 7, FC07 10  Kết quả giải trình tự của dòng FC07-3 TCGACTCTGGCAAGTCGACCACCGTAAGTCAAACCCTCATCGCGATCTGCTTATCTCGGGTCGTGGAACCCCGCCTGGCA TCTCGGGCGGGGTATTCATCAGCACTTCATGCTGACAATCATCTACAGACCGGTCACTTGATCTACCAGTGCGGTGGTATC GACAAGCGAACCATCGAGAAGTTCGAGAAGGTTGGTGACATCTCCCCCGATCGCGCCTTGCTATTCCACAACGAATTCCC TCCCTCGCGATACGCTCTGCGCCCGCTTCTCCCGAGTCCCAAAATTTTTGCGGTCCGACCGTAATTTTTTTGGTGGGGCATT TACCCCGCCACTCGGGCGACGTTGGACAAAGCCCTGATCCCTGCACACAAAAACACCAAACCCTCTTGGCGCGCATCAT CACGTGGTTCACAACAGACGCTAACCGGTCCAACAATAGGAAGCCGCTGAGCTCGGTAAGGGTTCCTTCAAGTACGCCTG GGTCCTTGACAAGCTCAAGGCCGAGCGTGAGCGTGGTATCACCATCGACATTGCCCTCTGGAAGTTCGAGACTCCCCGCT ACTATGTCACCGTCATTGGTATGTTGCTGTCACCTCTGTCACACACGTCTCACCACTAACAATCAACAGACGCC  Kết quả giải trình tự của dòng FC07-7 TCGACTCCGGAAAGTCCACCACTGTAAGTTCTCACTCCATGACTGTTTACAATCAGTCTTACCCCGCCATTTTATCTGGTG GGAGTCCCTGCAACAGTATACTGACATTTACAACTAGACCGGTCACTTGATCTACCAGTGCGGTGGTATCGACAAGCGAA CCATCGAGAAGTTCGAGAAGGTAGGTCACTTTTCCCTCGATTCCTGAGCCTTTCCCTACGCGATCGATTCGCTTCACGTCC ATCACCCCGCCCAACATCGATGATATTTTTTTTGCGTGGCTTTTTTATATTGGTGGGGGGTTTTACCCCGCCGAATATGAG AAGCTGGCATTTCGCCCCACCACAAAAATTTTCATCCTTTCTCATGGCTCGTCACAAGCAATCAAGACATGATGCTGACA ACCCACCAATAGGAAGCCGCCGAGCTCGGTAAGGGTTCCTTCAAGTACGCCTGGGTTCTTGACAAGCTCAAGGCCGAGCG TGAGCGTGGTATCACCATCGATATCGCTCTCTGGAAGTTCGAGACTCCTCGCTACTATGTCACCGTCATTGGTAAGTTTTG ATTGACTCATGCATGTCATCATCTATCAGTCACTAACATACATGATAGACGCC  Kết quả giải trình tự của dòng FC07-10 TCGACTCTGGCAAGTCGACCACCGTAAGTCAAACCCTCATCGCGATCTGCTTATCTCGGGTCGTGGAACCCCGCCTGGCA TCTCGGGCGGGGTATTCATCAGTCACTTCATGCTGACAATCATCTACAGACCGGTCACTTGATCTACCAGTGCGGTGGTAT CGACAAGCGAACCATCGAGAAGTTCGAGAAGGTTGGTGACATCTCCCCCGATCGCGCCTTGCTATTCCACAACGAATTCC CTCCCTCGCGATACGCTCTGCGCCCGCTTCTCCCGAGTCCCAAAATTTTTGCGGTCCGACCGTAATTTTTTTGGTGGGGCA TTTACCCCGCCACTCGGGCGACGTTGGACAAAGCCCTGATCCCTGCACACAAAAACACCAAACCCTCTTGGCGCGCATCA 50 TCACGTGGTTCACAACAGACGCTAACCGGTCCAACAATAGGAAGCCGCTGAGCTCGGTAAGGGTTCCTTCAAGTACGCCT GGGTCCTTGACAAGCTCAAGGCCGAGCGTGAGCGTGGTATCACCATCGACATTGCCCTCTGGAAGTTCGAGACTCCCCGT ACTATGTCACCGTCATTGGTATGTTGCTGTCACCTCTGTCACACACGTCTCACCACTAACAATCAACAGACGCC 4.7. Chủng bệnh trên xƣơng rồng Chúng tôi tiến hành chủng lên cây xƣơng rồng khỏe. Hình 4.8. Xƣơng rồng khỏe mạnh trƣớc khi chủng bệnh Hì nh 4.9 . Xƣ ơn g 51 Sau 4 ngày chủng, quan sát thấy 7 dòng nấm có khả năng gây hại mạnh: FC07 1, FC07 3, FC07 4, FC07 6, FC07 7, FC07 – 8, FC07 10 với các triệu chứng nhƣ (hình 4.9). Các dòng còn lại có khả năng gây bệnh yếu. Điều này có thể do phân lập, cấy chuyền nhiều lần nên độc tính của nấm bị giảm hoặc do đặc tính giống xƣơng rồng có tính chống chịu với mầm bệnh. Sau đó chúng tôi tiến hành phân lập lại từ các cây xƣơng rồng chủng bệnh có biểu hiện bệnh. Kết quả thu đƣợc nấm có hình thái, màu sắc khuẩn lạc giống với ban đầu (hình 4.10) Hình 4.10. Nấm phân lập từ xƣơng rồng bị bệnh sau khi chủng nấm 4 ngày trên môi trƣờng PGA Nhƣ vậy, sau khi chủng các dòng FC07 1, FC07 2, FC07 3, FC07 4, FC07 5, FC07 6, FC07 7, FC07 8, FC07 9, FC07 10, FC07 11, FC07 12, chúng tôi đã phân lập lại đƣợc tất cả các dòng. Qua (hình 4.10) là các dòng FC07 –3 và FC07– 8 là 2 trong 12 dòng chúng tôi phân lập lại đƣợc sau khi chủng. 52 Chƣơng 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận Qua kết quả điều tra cho thấy tỷ lệ nhiễm bệnh do nấm gây ra cao hơn hẳn (18,2%) so với tỷ lệ nhiễm bệnh do vi khuẩn (7,43%) và virus (0,16%). Phân lập các dòng nấm thuộc Fusarium spp. trên xƣơng rồng bệnh qua 2 môi trƣờng WA và PGA. Kết quả phân lập đƣợc 12 dòng nấm với 2 hình thái đặc trƣng:  Khuẩn lạc nấm màu trắng, tròn, tơ mịn.  Khuẩn lạc nấm màu tím, tròn, tơ mịn. Tiến hành nhân và thu sinh khối các dòng nấm cần cho mục đích ly trích các dòng nấm để khuếch đại vùng gen tef với cặp primer ef1 và ef2 và thu đƣợc sản phẩm khuếch đại có kích thƣớc 700 bp (căn cứ trên thang ladder), phản ứng thực hiện trên 9 trong 12 dòng ly trích đƣợc. Tiến hành giải trình tự vùng tef trên 3 dòng nấm FC07 3, FC07 7, FC07 10. Kết quả giải trình tự định danh dòng FC07 3 và FC07 10 là Fusarium solani, còn dòng FC07 – 7 vẫn đang tiếp tục nghiên cứu. Sau khi chủng bệnh nấm lên xƣơng rồng khỏe mạnh thu đƣợc kết quả: 7 dòng nấm có khả năng gây bệnh nặng. Các dòng còn lại có khả năng gây bệnh yếu. Mẫu nấm sau khi phân lập lại có hình thái giống với lần phân lập trên xƣơng rồng bệnh từ các vƣờn. 53 5.2. Đề nghị Từ những khó khăn, trở ngại trong quá trình nghiên cứu, chúng tôi có thể đƣa ra một số đề nghị sau: Cần có những nghiên cứu cụ thể hơn về đặc điểm sinh trƣởng và phát triển, hình thái cụ thể của từng dòng nấm để góp phần cho kết quả định danh chính xác hơn. Tiếp tục nghiên cứu các loài nấm gây hại trên xƣơng rồng để từ đó có những biện pháp phòng trừ hữu hiệu. Tiếp tục nghiên cứu các vùng chức năng trên dòng FC07 – 7 và kết hợp định danh bằng hình thái để khẳng định chính xác tên của dòng FC07 – 7. 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng việt 1. Nguyễn Thị Thanh Hà, 2006. Phát hiện vi khuẩn Erwinia carotovora subsp. carotovora trên cây địa lan (Cymbidium) bằng phương pháp PCR. Luận văn tốt nghiệp Ngành Công Nghệ Sinh Học 2006. 2. Nguyễn Hồng Minh, 1993. Phản ứng các dạng cà chua tới toxin (Fumaric) và dịch nuôi cấy của nấm Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici ở in vivo và in vitro. Tạp chí Bảo vệ Thực vật số 1/ 1993. 3. Huỳnh Văn Phục, 2006. Khảo sát tính đối kháng của nấm Trichoderma ssp. đối với Rhizoctonia solani, Fusarium oxysporum gây bệnh trên cây lúa và bắp. Luận văn tốt nghiệp Ngành Công nghệ Sinh học 2006. 4. Trần Văn Mão – Nguyễn Thế Nhã. Phòng trừ sâu bệnh hại cây xương rồng cảnh. Nhà xuất bản nông nghiệp Hà Nội 2002. 5. Lại Hà Tố Hoa, 2006. Định danh nấm Trichoderma dựa vào trình tự vùng TEF. Luận văn tốt nghiệp Ngành Công Nghệ Sinh Học 2006. 6. Trƣơng Duy Lam, 2006. Như những đóa hồng. Tạp chí hoa cảnh số 10/ 2006. 7. Huỳnh Văn Thới, 2004. Cẩm nang trồng và lai tạo xương rồng. Nhà xuất bản Trẻ,2004. 8. Huỳnh Văn Thới, 1997. Cây cảnh nhiệt đới, kỹ thuật trồng xương rồng – sứ Thái. Đặc biệt cách trồng và chăm sóc cây trong nhà. Nhà xuất bản Trẻ 1997. 9. Minh sơn, 2004. Đánh cắp xương rồng sa mạc: lợi trước hại sau. (Theo Science). Báo điện tử Việt Nam Net 2004. 10. Đỗ Tấn Dũng, 1996. Kết quả nghiên cứu phạm vi ký chủ của nấm Fusarium sp hại trên một số giống cây trồng, cây cảnh và cỏ dại vùng Hà Nội năm 1996. Kết quả nghiên cứu khoa học Khoa Trồng trọt, đại học nông nghiệp I. Nhà xuất bản nông nghiệp Hà Nội.1996, trang 183-188. Nƣớc ngoài 11. Nassar Jafet M.; Hamrick J. L.; Fleming Theodore H. Genetic variation and population structure of the mixed-mating cactus, Melocactus curvispinus (Cactaceae). Heredity, 2001. 55 12. Horvath David P.; Chao Wun S. Molecular analysis of signals controlling dormancy and growth in underground adventitious buds of leafy spurge. Plant Physiology, 2002. 13. Batista Angela M.; Mustafa Arif F. Effects of variety on chemical composition, in situ nutrient disappearance and in vitro gas production of spineless cacti. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2003. 14. Chiocchetti, A., Bernardo, I., Daboussi, M.-J., Garibaldi, A., Gullino, M. L., Langin, T., and Migheli, Q. 1999. Detection of Fusarium oxysporum f. sp. dianthi in carnation tissue by PCR amplification of transposon insertions. Phytopathology 89:1169-1175. 15. Chiocchetti Annalisa; Sciaudone Lucia; Durando Fiorenza; Garibaldi Angelo; Migheli Quirico. PCR detection of Fusarium oxysporum f. sp. basilici on basil. Plant disease ISSN 0191-2917. 16. V. Edel, C. Steinber, N. Gautheron, C. Alabouvette, Inra-Cmse, 1999. Ribosomal DNA-targeted oligonucleotide probe and PCR assay specific for Fusarium oxysporum. Laboratoire de Recherches sur la Flore Pathogène dans le Sol, 17 rue Sully, 21034 Dijon Cedex, France. 17. X. Y. Zheng, D. W. Wolff, S. Baudracco-Arnas, M. Pitrat. Development and utility of cleaved amplified polymorphic sequences (CAPS) and restriction fragment length polymorphisms (RFLPs) linked to the Fom-2 Fusarium wilt resistance gene in melon (Cucumis melo L.). Department of Horticulture Science, Texas Agricultural Experiment Station, The Texas A&M University System, 2415 East Highway 83, Weslaco, TX 78596 18. Matias Pasquali, Alberto Acquadro, Virgilio Balmas, Quirico Migheli, Maria Lodovica Gullino và Angelo Garibald, 2004. Development of PCR Primers for a New Fusarium oxysporum Pathogenic on Paris Daisy (Argyranthemum frutescens L.). European Jounal of Plant pathology. 19. Diana Fernandez, Mohamed Ouinten, Abdelaziz Tantaoui, Jean-Paul Geiger, Marie-Josée Daboussi, và Thierry Langin, 1998. Fot 1 Insertions in the Fusarium oxysporum f. sp. albedinis Genome Provide Diagnostic PCR Targets for Detection of the Date Palm Pathogen. American Society for Microbiology. 56 20. Hirano, Yasushi; Arie, Tsutomu, 2006. PCR-based differentiation of Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici and radicis-lycopersici and races of F. oxysporum f. sp. lycopersici. Jounal of General Plant Pathology. Volume 72, Number 5, October 2006 , pp. 273-283. 21. Zhenggang Zhang, Jingyu Zhang, Yuchao Wang, Xiaobo Zheng, 2005. Molecular detection of Fusarium oxysporum f. sp. niveum and Mycosphaerella melonis in infected plant tissues and soil. FEMS Microbiology Letters. Volume 249 Issue 1 Page 39-47, August 2005. < et=1&journalCode=fml> 22. Barry Pryor, Assistant Professor, Department of Plant Pathology,University of Arizona, Tucson, 2005. Detection of Fusarium oxysporum f. sp. lactucae in lettuce seed and soil. Arizona Iceberg Lettuce Research Council 23. Biehn, W. L and Dimond, A. E., 1973. Chemically induced root injury correlated with a redution of Fusarium wilt of Tomato. Phytopathology, pp. 655- 656 24. Kuniyasu, K. , 1984. Fusarium wit diseases of vegetable crop. Vegetable and Ornamental crops reasearch station, Japan. 25. H. Cai, H.R. Chen, F. Li, B.H. Kong. First Report of a Phytoplasma Associated with Cactus Witches’-Broom in Yunnan (China). New Disease Reports. 26. IK Hwa Hyun, Sang Dok Lee, Young Hee Lee, Noh Youl Heo, 1998. Mycological Characteristics and Pathogenicity of Fusarium oxysporum Schlecht. Emend. Snyd. and Hans. Causing Stem Rot of Cactus. The Plant Pathology Jounal, pp. 463-466. < pMenu=&topMenu1=> 27. Young Ho Kim, Kwang-Hyung Kim. Abscission Layer Formation as a Resistance Response of Peruvian Apple Cactus Against Glomerella cingulata. Phytopathology 92:964-969 28. Jones, J. P và Crill.P, 1974. Susceptibility og resistant tomato cultivars to Fusarium wilt. Phytopathology, pp 1507-1510. 29. David M. Geiser, Mariaa del Mar Jimenez, Seogehan Kang, Izabela Makalowska, Narayanan Veeraraghavan, Ning Zhang và Gretchen, 2004. A. Kuldau, todd J. Ward and Kerry O` Donnell. FUSARIUM-ID v. 1.0: A DNA 57 sequence database for identifying Fusarium. European Journal of Plant Pathology 00: 1-7, 2004. 30. Gary J. Samuels, 9-2005. Trichoderma: Systematic, the Sexual State, and Ecology. United States Department of Agriculture Agricultural Research Service Systematic Botany and Mycology Laboratory 304, B-011A Beltsville, MD 20705. Acepted for publication. < alCode=phyto> 31. Bogale, Mesfin; Wingfield, Brenda D.; Wingfield, Michael J.; Steenkamp, Emma T. Species-specific primers for Fusarium redolens and a PCR-RFLP technique to distinguish among three clades of Fusarium oxysporum. FEMS Microbiology Letters, Volume 271, Number 1, June 2007 , pp. 27-32. < 05> 32. Abawi, G.R and Lorbeer, J.W, 1972. Several aspects of ecology and pathology of Fusarium oxysporum. Phytopathology, pp 870- 876. Trang WEB http:// en.wikipedia.org/wiki/Fusarium http:// en.wikipedia.org/wiki/cactaceae ions/Fusarium_drawing.jpg (Gary. J. Semuels). PHỤ LỤC Kết quả đọc trình tự vùng tef của 3 dòng FC07 – 3, FC07 – 7 , FC07 – 10.  Kết quả đọc trình tự vùng tef của dòng FC07-3. Ghi chú: M1 là tên đặt cho dòng FC07-3, M2 là tên đặc cho dòng FC07 – 7, M3 là tên đặt cho dòng FC07-10. Kết quả đọc trình tự vùng tef của dòng FC07 – 3. Kết quả đọc trình tự vùng tef của mẫu FC07 – 7 (M2) Kết quả đọc trình tự vùng tef của mẫu FC07 – 10 (M3)