Khóa luận Phát hiện và định lượng virus gây bệnh đốm trắng (WSSV) trên tôm sú (Penaeus monodon) bằng kỹ thuật Real - Time PCR

các nồng độ pha loãng lặp lại 3 lần của mẫu 1 được định lượng dựa trên đường chuẩn ở Hình 4.9. Hình 4.9 thể hiện rõ mối quan hệ tuyến tính giữa log số bản sao ban đầu và số chu kỳ ngưỡng qua hệ số tương quan rất cao: r2 bằng 1. Hiệu quả phản ứng Real - time PCR này đạt cao (99,6%) chứng tỏ phản ứng này hoạt động tốt. Đường chuẩn thể hiện rõ các giá trị tương ứng với các chu kỳ ngưỡng và log số bản sao ban đầu ở từng nồng độ pha loãng của mẫu gần như trùng nhau. Từ Hình 4.9 ta có được độ lệch chuẩn và số bản sao ban đầu trung bình ở các nồng độ pha loãng của mẫu 1 sau 3 lần lặp lại thể hiện ở Bảng 4.5 như sau: Bảng 4.5 thể hiện rõ số chu kỳ ngưỡng trung bình tăng và số bản sao trung bình giảm theo từng nồng độ pha loãng. Chu kỳ ngưỡng trung bình càng cao tương ứng với số bản sao trung bình càng thấp. Sai lệch giữa các chu kỳ ngưỡng trung bình tương đối đều nhau và nằm trong khoảng từ 3,2 đến 3,71. Sai lệch đều thể hiện tính tuyến tính về Hình 4.9 Đồ thị biểu diễn đƣờng chuẩn ở từng nồng độ pha loãng lặp lại 3 lần của mẫu 1 Bảng 4.5 Độ lệch chuẩn và số bản sao ban đầu trung bình ở các nồng độ pha loãng của mẫu 1 sau 3 lần lặp lại Nồng độ mẫu 1 Chu kỳ ngưỡng trung bình Số bản sao ban đầu trung bình Độ lệch chuẩn của số bản sao ban đầu 10 0 16,77 4,89.10 6 1,38.10 6 10 -1 19,97 5,25.10 5 0,63.10 5 10 -2 23,37 5,02.10 4 0,84.10 4 10 -3 27,08 3,87.10 3 0,53.10 3 55 khả năng định lượng cao của Real - time PCR. Sau 3 lần lặp lại, độ lệch chuẩn của số bản sao ban đầu tương đối thấp, cho thấy độ lặp lại về khả năng định lượng cao. Qua kết quả khảo sát tính tuyến tính và độ lặp lại về khả năng định lượng của Rea l - t ime PCR trên các nồng độ pha loãng của mẫu 1 sau 3 lần lặp lại cho thấy phương pháp Real - time cho kết quả định lượng chính xác số bản sao ban đầu của virus gây bệnh đốm trắng với độ lặp lại cao. Tính định lượng của phương pháp Real - time PCR còn được khảo sát qua mẫu 7, kết quả thu được qua Hình 4.10 và Hình 4.11. Ở các nồng độ pha loãng, đường biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ thể hiện tuyến tính (Hình 4.10). Khoảng cách độ lệch giữa các chu kỳ ngưỡng ở các nồng độ pha loãng của mẫu 7 đều nhau thể hiện tính tuyến tính cao. Ở nồng độ 100 từng đường biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ ở các lần lặp lại hơi tách biệt nhau với độ lệch 0,43 chu kỳ. Ở nồng độ 10-1, đường biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ ở một lần lặp lại tách biệt so với hai lần lặp lại còn lại với sai lệch 0,2 chu kỳ. Sai lệch nhỏ này có thể do sai Hình 4.10 Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ ở từng nồng độ pha loãng lặp lại 3 lần của mẫu 7 : 100 : 10-1 : 10-2 : 10-3 ▲: các chuẩn : các mẫu : đối chứng âm 56 số pipet và các tác động khác như thao tác người thực hiện,… Ở nồng độ 10-2, 10-3, đường biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ ở cả 3 lần lặp lại gần như trùng nhau. Điều này chứng tỏ độ lặp lại về khả năng định lượng của hệ thống cao. Log số bản sao ban đầu của WSSV ở các nồng độ pha loãng sau 3 lần lặp lại thu được qua Hình 4.11. Số bản sao ban đầu ở từng nồng độ pha loãng sau khi lặp lại 3 lần của mẫu 7 được định lượng dựa trên đường chuẩn ở Hình 4.11. Hình 4.11 cho thấy hiệu quả của phản ứng Real - time PCR đạt rất cao: 99,6%. Log số bản sao ban đầu và số chu kỳ ngưỡng có quan hệ rất tuyến tính qua hệ số tương quan r2 bằng 1. Đồ thị biểu diễn đường chuẩn thể hiện rõ các giá trị tương ứng với các chu kỳ ngưỡng và log số bản sao ban đầu ở từng nồng độ pha loãng của mẫu qua 3 lần lặp lại trùng nhau hoàn toàn và gần trùng nhau, cho thấy hệ thống có khả năng cho kết quả định lượng chính xác với độ lặp lại cao. Độ lệch chuẩn và số bản sao ban đầu trung bình ở các nồng độ pha loãng mẫu 7 sau 3 lần lặp lại thể hiện ở Bảng 4.6 như sau: Hình 4.11 Đồ thị biểu diễn đƣờng chuẩn ở từng nồng độ pha loãng lặp lại 3 lần của mẫu 7 57 Bảng 4.6 cho thấy số chu kỳ ngưỡng trung bình tăng dần và số bản sao trung bình giảm dần theo từng nồng độ pha loãng. Khoảng cách giữa các giá trị của các chu kỳ ngưỡng trung bình ở các nồng độ tương đối đều nhau và nằm trong khoảng từ 3,13 đến 3,75. Sau 3 lần lặp lại, độ lệch chuẩn của số bản sao ban đầu rất thấp thể hiện độ sai lệch nhỏ và độ lặp lại thí nghiệm cao. Như vậy, kết quả thử nghiệm tính định lượng của Real - time PCR trên hai mẫu 1 và 7 thể hiện rõ tính tuyến tính và độ lặp lại cao về khả năng định lượng của hệ thống, có thể sử dụng để kiểm tra định lượng WSSV trên tôm sú. 4.4. Kết quả khảo sát độ nhạy giữa phƣơng pháp Real - time PCR và Non Stop Nested PCR Kết quả Real – time PCR của các nồng độ pha loãng từ 10-1 đến 10-8 thể hiện qua Hình 4.12. Bảng 4.6 Độ lệch chuẩn và số bản sao ban đầu trung bình ở các nồng độ pha loãng của mẫu 7 sau 3 lần lặp lại Nồng độ mẫu 7 Chu kỳ ngưỡng trung bình Số bản sao ban đầu trung bình Độ lệch chuẩn của số bản sao ban đầu 10 0 18,78 1,23.10 6 0,36.10 6 10 -1 21,91 1,38.10 5 0,18.10 5 10 -2 25,66 1,02.10 4 0,061.10 4 10 -3 29,27 8,46.10 2 0,92.10 2 58 Sau hai lần chạy Real – time PCR ở các nồng độ pha loãng 10-1 đến 10-8 của mẫu, kết quả cho thấy ở các nồng độ pha loãng từ 10-1 đến 10-7 đều có đường biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ nằm trên đường baseline subtracted, cho kết quả dương tính với WSSV, riêng nồng độ pha loãng 10-8 có đường biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ nằm dưới đường baseline subtracted, cho kết quả âm tính. Điều này chứng tỏ phương pháp Real - time PCR có khả năng phát hiện tới nồng độ pha loãng 10-7. Các nồng độ pha loãng của mẫu trên có kết quả kiểm tra qua Non Stop Nested PCR như sau: Hình 4.12 Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ của mẫu nhiễm WSSV pha loãng từ 10-1 đến 10-8 : 10-5 : 10-6 : 10-7 : 10-8 : đối chứng âm : 10-1 : 10-2 : 10-3 : 10-4 59 Ở các nồng độ 10-1, 10-2, 10-3 đều xuất hiện hai băng đặc hiệu 633 bp và 221 bp, cho kết quả nhiễm WSSV nặng (số lượng bản sao ban đầu lớn). Ở các nồng độ càng loãng: 10-4, 10-5, 10-6 số lượng ADN đích càng giảm nên chỉ hiện diện băng 221 bp (dương tính nhẹ với WSSV). Theo chiều giảm dần nồng độ mẫu pha loãng, các băng xuất hiện càng mờ dần. Ở hai nồng độ 10-7, 10-8 không thấy xuất hiện băng đặc hiệu (âm tính với WSSV). Kết quả kiểm tra lần 2 bằng Non Stop Nested PCR trên các mẫu pha loãng này cũng cho kết quả tương tự. Từ các kết quả trên cho thấy Non Stop Nested PCR có khả năng phát hiện mẫu tôm nhiễm WSSV có nồng độ pha loãng từ 10 -1 đến 10-6, và không có khả năng phát hiện mẫu tôm nhiễm WSSV có nồng độ pha loãng 10-7 và 10-8. Kết quả so sánh độ nhạy giữa hai phương pháp được tóm tắt qua Bảng 4.7. Hình 4.13 Kết quả kiểm tra Non Stop Nested PCR ở các nồng độ pha loãng của mẫu nhiễm WSSV (+) (-) MK 10-8 10-1 10-7 10-6 10-5 10-4 10-3 10-2 633bp 221bp 60 Với kết quả thu nhận từ khảo sát trên (thể hiện ở Bảng 4.7), tôi nhận thấy phương pháp Real - time PCR nhạy hơn phương pháp Non Stop Nested PCR 10 lần. Nếu có điều kiện nên tiến hành pha loãng mẫu từ nồng độ pha loãng 10-6 (nồng độ pha loãng cuối cùng mà hai phương pháp có thể phát hiện mẫu dương tính với WSSV) để so sánh độ nhạy của hai phương pháp một cách chính xác hơn. 4.5. Kết quả ứng dụng phƣơng pháp Real - time PCR để kiểm tra mầm bệnh WSSV trên 30 mẫu tôm thu từ thực tế Qua các kết quả thu nhận từ các thí nghiệm trên, tôi nhận thấy phương pháp Real - time PCR là phương pháp đáng tin cậy trong phát hiện và định lượng WSSV, tiến hành kiểm tra 30 mẫu tôm thu từ thực tế bằng phương pháp Real - time PCR, kết quả thu được như sau: Bảng 4.7 Kết quả chạy Real - time PCR và Non Stop Nested PCR trên mẫu tôm nhiễm WSSV ở các nồng độ pha loãng từ 10-1 đến 10-8 Nồng độ Real - time PCR Non Stop Nested PCR 10 -1 + + 10 -2 + + 10 -3 + + 10 -4 + + 10 -5 + + 10 -6 + + 10 -7 + - 10 -8 - - 61 Hình 4.14 cho thấy đường biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ của các mẫu 1, 18, 22, 23, 26 vượt qua đường baseline subtracted , cho kết quả dương tính với virus gây bệnh đốm trắng. Trong 5 mẫu dương tính với WSSV này, có mẫu 22 nhiễm WSSV rất nặng thể hiện qua chu kỳ ngưỡng lên rất sớm: 19,66. Các mẫu 6, 10, 13, 14, 25 âm tính về bệnh đốm trắng thể hiện qua các đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang nằm dưới đường baseline subtracted. Kết quả chạy Real – time PCR lần 2 của các mẫu này cũng cho kết quả tương tự. Số bản sao ban đầu của các mẫu tôm được định lượng dựa trên đồ thị biểu diễn đường chuẩn. Hình 4.14 Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ của 10 mẫu tôm thu thực tế : 22 : 23 : 25 : 26 ▲: các chuẩn : đối chứng âm : 1 : 6 : 10 : 13 : 14 : 18 62 Hiệu quả của phản ứng Real - time PCR trung bình qua 2 lần lặp lại đạt khá cao 92,95%. Hệ số tương quan r2 bằng 1 thể hiện mối tương quan tuyến tính giữa log số bản sao ban đầu và chu kỳ ngưỡng rất chặt. Sau hai lần lặp lại, độ lệch chuẩn và số bản sao ban đầu trung bình của 10 mẫu tôm thu thực tế được tóm tắt qua Bảng 4.8. Bảng 4.8 thể hiện mẫu 22 nhiễm WSSV rất nặng với số bản sao trung bình cao: 3,66.10 5 bản sao. Các mẫu 1, 18, 23 nhiễm WSSV nhẹ và trung bình với số bản sao tương ứng là 24, 83 và 603. Mẫu 26 nhiễm WSSV rất nhẹ tương ứng số bản sao rất Hình 4.15 Đồ thị biểu diễn đƣờng chuẩn của 10 mẫu tôm thu thực tế Bảng 4.8 Độ lệch chuẩn và số bản sao ban đầu trung bình của 10 mẫu tôm thu thực tế Mẫu thực tế Chu kỳ ngưỡng trung bình Số bản sao trung bình Độ lệch chuẩn của số bản sao ban đầu 1 33,81 2,33.10 1 1,7.10 1 18 31,65 8,3.10 1 1,8.10 1 22 18,87 3,66.10 5 0,75.10 5 23 28,64 6,03.10 2 1,65.10 2 26 38,25 1,13 0,47 6 N/A N/A N/A 10 N/A N/A N/A 13 N/A N/A N/A 14 N/A N/A N/A 25 N/A N/A N/A 63 thấp (2 bản sao). Độ lệch chuẩn số bản sao ban đầu của các mẫu thấp cho thấy khả năng định lượng chính xác với độ lặp lại thí nghiệm cao. Kết quả kiểm tra 10 mẫu tôm thu từ thực tế khác qua Real - time PCR như sau: Hình 4.16 thể hiện các đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang của 10 mẫu tôm thu thực tế vượt qua đường baseline subtracted, cho thấy 10 mẫu này đều dương tính với WSSV. Tất cả 10 mẫu này đều nhiễm WSSV nhẹ, thể hiện qua số chu kỳ ngưỡng lên khá muộn từ chu kỳ 34 đến 42. Số lượng bản sao ban đầu của WSSV được định lượng dựa trên đường chuẩn ở Hình 4.17. Hình 4.16 Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ của 10 mẫu tôm thu thực tế tiếp theo : 9 : 11 : 12 : 15 ▲: các chuẩn : đối chứng âm : 2 : 3 : 4 : 5 : 7 : 8 64 Phản ứng Real - time PCR này hoạt động tốt thể hiện qua hiệu quả phản ứng Real - time PCR đạt khá cao: 90,5%. Log số bản sao ban đầu và chu kỳ ngưỡng tuyến tính với nhau qua hệ số tương quan r2 bằng 1. Số bản sao ban đầu của 10 mẫu tôm sú được thể hiện ở Bảng 4.9 sau: Bảng 4.9 cho thấy các mẫu tôm này đều nhiễm WSSV ở mức độ rất nhẹ từ 1 đến 13 bản sao. Chu kỳ ngưỡng của mẫu 3 lên sớm nhất: 34,82 tương ứng với số bản sao cao nhất gần 13 bản sao. Các mẫu 5, 12 nhiễm WSSV rất nhẹ có chu kỳ ngưỡng lên khá muộn (41, 42 chu kỳ) với số bản sao ban đầu chỉ 1 bản sao. Kết quả kiểm tra 10 mẫu tôm thu từ thực tế còn lại theo Hình 4.18. Hình 4.17 Đồ thị biểu diễn đƣờng chuẩn của 10 mẫu tôm thu thực tế tiếp theo Bảng 4.9 Số bản sao ban đầu của 10 mẫu tôm thu thực tế tiếp theo Mẫu thực tế Chu kỳ ngưỡng Số bản sao ban đầu 2 38,46 1,19 3 34,82 1,25.10 1 4 37,11 2,84 5 40,90 2,48.10 -1 7 38,38 1,25 8 35,69 7,10 9 36,21 5,08 11 36,94 3,18 12 41,47 1,71.10 -1 15 36,79 3,49 65 Hình 4.18 thể hiện các đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang của mẫu 16, 17, 24 nằm dưới baseline subtracted cho thấy 3 mẫu âm tính với virus gây bệnh đốm trắng, các đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang của các mẫu 19, 20, 21, 27, 28, 29, 30 vượt qua đường baseline subtracted cho thấy 7 mẫu tôm này đều nhiễm WSSV. Các mẫu dương tính này có chu kỳ ngưỡng lên khá muộn từ chu kỳ 35 đến 41. Số bản sao ban đầu của các mẫu tôm được định lượng qua đồ thị biểu diễn đường chuẩn ở Hình 4.19. Bảng 4.9. Số bản sao ban đầu của 10 mẫu tôm thu thực tế Mẫu thực tế Chu kỳ ngưỡng Số bản sao ban đầu 2 38,46 1,19 3 34,82 1,25.10 1 4 37,11 2,84 5 40,90 2,48.10 -1 7 38,38 1,25 8 35,69 7,10 9 36,21 5,08 11 36,94 3,18 12 41,47 1,71.10 -1 15 36,79 3,49 Hình 4.18 Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ của 10 mẫu tôm thu thực tế còn lại : 27 : 28 : 29 : 30 ▲: các chuẩn : đối chứng âm : 16 : 17 : 19 : 20 : 21 : 24 66 Hiệu quả của phản ứng Real - time PCR đạt 90,5% thể hiện ở Hình 4.19. Hệ số tương quan r2 bằng 1 chứng tỏ mối quan hệ giữa log số bản sao ban đầu và số chu kỳ ngưỡng rất tuyến tính với nhau theo phương trình Y = - 3,573 X + 38,745. Số chu kỳ ngưỡng và số bản sao ban đầu thể hiện ở Bảng 4.10. Bảng 4.10 thể hiện 7 mẫu 19, 20, 21, 27, 28, 29, 30 nhiễm WSSV từ rất nhẹ đến nhẹ, với số bản sao tương ứng là 3, 8, 2, 1, 1, 1, 12. Các mẫu còn lại 16, 17, 24 cho kết quả âm tính với WSSV. Từ kết quả kiểm tra qua Real - time PCR của 30 mẫu thực tế cho thấy có 22 trong số 30 mẫu tôm thu từ thực tế bị nhiễm WSSV, chiếm tỷ lệ 73,33%, từ kết quả này có thể cho thấy tỷ lệ nhiễm WSSV trên tôm nuôi thực tế là khá cao. Trong số 18 mẫu tôm giống thu từ hai tỉnh Bạc Liêu và Bến Tre, có 14/ 18 mẫu bị nhiễm WSSV, chiếm tỷ lệ 77,77%. Theo Nguyễn Văn Hảo (2004), kết quả phân tích tỷ lệ tôm giống nhiễm WSSV bằng Nested PCR ở các tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long trong giai đoạn từ 30 Hình 4.19 Đồ thị biểu diễn đƣờng chuẩn của 10 mẫu tôm thu thực tế còn lại Bảng 4.10 Số chu kỳ ngƣỡng và số bản sao ban đầu của 10 mẫu tôm thu thực tế còn lại Mẫu thực tế Chu kỳ ngưỡng Số bản sao 19 37,37 2,43 20 35,65 7,36 21 37,89 1,74 27 40,51 3,2.10 -1 28 40,97 2,38.10 -1 29 39,82 5,01.10 -1 30 35,02 1,11.10 1 16 N/A N/A 17 N/A N/A 24 N/A N/A 67 đến 60 ngày tuổi là 37,77%, so với kết quả kiểm tra qua Real - time PCR, thì tỷ lệ này thấp hơn một nửa. Điều này có thể là do phương pháp Real - time PCR nhạy hơn phương pháp Nested PCR đã sử dụng hoặc có thể là do số lượng mẫu thu còn quá ít, chưa đủ để đại diện cho tỷ lệ nhiễm WSSV của tôm sú giống trong khu vực thu mẫu. Đối với mẫu tôm nuôi thương phẩm, có 6/ 9 mẫu (chiếm 66,66%) dương tính với WSSV qua Real - time PCR, và mẫu tôm bố mẹ, có 2/ 3 mẫu thu bị nhiễm WSSV. So với kết quả thu được của Nguyễn Văn Hảo (2004), tỷ lệ nhiễm WSSV qua kiểm tra Nested PCR ở các tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long trên tôm nuôi lớn hơn 60 ngày tuổi và tôm bố mẹ là: 18,24% và 11,11%. Kết quả này có thể do khả năng phát hiện WSSV của Real – time PCR cao hơn các phương pháp khác và do số lượng mẫu thu quá ít. Cho nên cần tiến hành kiểm tra với số lượng mẫu lớn hơn để có được tỷ lệ nhiễm WSSV chính xác của các giai đoạn tôm sú nuôi. Tuy nhiên, tỷ lệ tôm bố mẹ, tôm giống và tôm thương phẩm bị nhiễm WSSV khá cao, cho nên cần có biện pháp kiểm tra chẩn đoán nhanh, chính xác trong quá trình sản xuất giống, kiểm tra giống trước khi thả nuôi và trong quá trình nuôi để giảm thiểu rủi ro cho người nuôi tôm và đạt được kết quả tốt nhất mà theo các kết quả thí nghiệm trên thì phương pháp Real – time PCR cho kết quả tốt và thích hợp nhất. 4.6. Kết quả theo dõi tình trạng thu hoạch của các ao nuôi tôm đã đƣợc thu mẫu kiểm tra Trong số 30 mẫu tôm thu từ thực tế, tình trạng thu hoạch các ao nuôi tôm của 23 mẫu được ghi nhận qua Bảng 4.11. 68 Bảng 4.11 cho thấy tất cả các mẫu tôm giống qua kiểm tra Real - time PCR về WSSV với kết quả dương tính đều phải tháo bỏ ao nuôi. Các mẫu tôm giống cho kết quả âm tính với Real – time PCR cho kết quả thu hoạch tốt. Do vậy, tôm giống thả nuôi sạch bệnh là một trong những yêu cầu cấp thiết để quyết định yếu tố thành công Mẫu Giai đoạn tôm nuôi Kết quả xét nghiệm qua Real – time PCR Tình trạng thu hoạch 1 Tôm giống 34 ngày + Tháo bỏ ao tôm 2 Tôm giống 31 ngày + Tháo bỏ ao tôm 3 Tôm giống 31 ngày + Tháo bỏ ao tôm 4 Tôm giống 31 ngày + Tháo bỏ ao tôm 5 Tôm giống 31 ngày + Tháo bỏ ao tôm 6 Tôm giống 31 ngày - Thu hoạch tốt 7 Tôm giống 31 ngày + Tháo bỏ ao tôm 8 Tôm nuôi thương phẩm (73 ngày) + Tháo bỏ ao tôm 9 Tôm nuôi thương phẩm (43 ngày) + Tháo bỏ ao tôm 10 Tôm giống 36 ngày - Thu hoạch tốt 11 Tôm giống 34 ngày + Tháo bỏ ao tôm 12 Tôm giống 31 ngày + Tháo bỏ ao tôm 13 Tôm giống 31 ngày - Thu hoạch tốt 14 Tôm giống 31 ngày - Thu hoạch tốt 15 Tôm nuôi thương phẩm (62 ngày) + Tháo bỏ ao tôm 16 Tôm nuôi thương phẩm (98 ngày) - Thu hoạch tốt 17 Tôm nuôi thương phẩm (132 ngày) - Thu hoạch sớm 18 Tôm giống 33 ngày ++ Tháo bỏ ao tôm 22 Tôm nuôi thương phẩm (135 ngày) ++++ Thu hoạch sớm 24 Tôm bố mẹ - Duy trì nuôi 26 Tôm bố mẹ + Loại bỏ 27 Tôm bố mẹ + Loại bỏ 30 Tôm nuôi thương phẩm (120 ngày) + Thu hoạch sớm Bảng 4.11 Bảng kết quả theo dõi tình trạng thu hoạch của các ao nuôi tôm đã đƣợc thu mẫu kiểm tra +: nhiễm WSSV rất nhẹ ++: nhiễm WSSV nhẹ ++++: nhiễm WSSV nặng -: không nhiễm WSSV 69 của các hộ nuôi tôm. Kết quả thu hoạch của các ao nuôi thương phẩm có thu mẫu để kiểm tra WSSV bằng Real – time PCR cũng cho kết quả tương tự, tất cả các ao nuôi bị nhiễm WSSV đều bị tháo bỏ hoặc thu hoạch sớm và các ao nuôi không bị nhiễm WSSV cho kết quả thu hoạch tốt hoặc bị thu hoạch sớm. Điều này có thể là do quá trình quản lý ao nuôi kém dẫn đến hiện tượng lây nhiễm WSSV từ bên ngoài vào trong ao và cũng có thể do các yếu tố khác. Do vậy, quy trình quản lý ao nuôi tốt cũng góp phần đáng kể vào sự thành công của vụ nuôi. Tôm bố mẹ bị nhiễm WSSV cũng không cho kết quả sản xuất giống tốt (bị loại bỏ), mặt khác, có thể lây nhiễm WSSV sang tôm giống. Vì vậy, tôm bố mẹ sạch bệnh là yếu tố cần thiết để tạo ra tôm giống sạch bệnh và quyết định yếu tố thành công trong sản xuất giống. Từ các kết quả trên cho thấy các ao thả nuôi tôm giống cho kết quả dương tính qua kiểm tra bằng Real – time đều bị tháo bỏ, các ao nuôi tôm thương phẩm bị nhiễm WSSV đều bị thu hoạch sớm, các ao nuôi tôm thương phẩm không bị nhiễm WSSV có thể cho kết quả thu hoạch tốt hoặc có thể bị thu hoạch sớm tùy thuộc vào quá trình quản lý ao nuôi, và tôm bố mẹ bị nhiễm WSSV thì cho kết quả sản xuất giống kém. 70 Phần 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận Sau khi thực hiện đề tài, qua 6 thí nghiệm đã tiến hành, tôi nhận thấy: Ly trích bằng SDS, NaOH, sốc nhiệt kết hợp với Instagene Matrix sẽ thu được ADN của WSSV tinh sạch thích hợp cho tiến hành Real – time PCR và Non Stop Nested PCR. Real - time PCR có thể ứng dụng để kiểm tra mầm bệnh WSSV trên tôm sú với khả năng phát hiện (1 bản sao) cao hơn các phương pháp khác. Hơn nữa, Real - time PCR còn cho phép định lượng số bản sao của virus gây bệnh đốm trắng mà các phương pháp khác không có khả năng thực hiện. Phương pháp Real - time PCR có khả năng định lượng chính xác số lượng bản sao của WSSV với độ lặp lại cao. Độ nhạy của phương pháp Real - time PCR cao hơn 10 lần so với Non Stop Nested PCR. Tỷ lệ nhiễm WSSV trên tôm sú ở các giai đoạn nuôi qua kiểm tra bằng Real – time PCR có thể cao hơn rất nhiều so với tỷ lệ nhiễm được công bố qua xác định bằng các phương pháp khác. Các ao thả nuôi tôm giống cho kết quả dương tính qua kiểm tra bằng Real – time đều bị tháo bỏ, các ao nuôi tôm thương phẩm bị nhiễm WSSV đều bị thu hoạch sớm, các ao nuôi tôm thương phẩm không bị nhiễm WSSV có thể cho kết quả thu hoạch tốt hoặc có thể bị thu hoạch sớm tùy thuộc vào quá trình quản lý ao nuôi, và tôm bố mẹ bị nhiễm WSSV thì cho kết quả sản xuất giống kém. 5.2. Đề nghị Nên sử dụng phương pháp Real – time PCR để kiểm tra phát hiện virus gây bệnh đốm trắng (WSSV) trên tôm sú thay cho các phương pháp khác. Không thả nuôi tôm giống bị nhiễm WSSV. Không sử dụng tôm bố mẹ bị nhiễm WSSV để sản xuất tôm giống. Kiểm tra tôm nuôi thương phẩm định kỳ trong quá trình nuôi để có biện pháp xử lý thích hợp. 71 Do thời gian thực hiện đề tài hạn hẹp, nếu có điều kiện, tôi đề nghị thực hiện tiếp một số nghiên cứu như sau: Kiểm tra đánh giá tỷ lệ nhiễm WSSV bằng phương pháp Real – time PCR ở các giai đoạn tôm nuôi. Phát triển kỹ thuật Real - time PCR để phát hiện và định lượng các loại virus khác gây bệnh trên tôm sú. Tiến hành nghiên cứu nhằm sản xuất ra tôm giống sạch bệnh để giảm rủi ro cho người nuôi tôm. 72 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT 1. Trần Minh Anh, 1989. Đặc điểm sinh học và kỹ thuật nuôi tôm he. Nhà xuất bản Thành Phố Hồ Chí Minh. 394 trang. 2. Trần Thị Minh Tâm và Đái Duy Ban, 1999. Bệnh thường gặp ở tôm – Phương pháp chẩn đoán và phòng trị. Nhà Xuất Bản Nông nghiệp Hà Nội. 144 trang. 3. Nguyễn Văn Chung, 2000. Cơ sở sinh học và kỹ thuật sản xuất giống nhân tạo tôm sú. Nhà xuất bản Nông nghiệp. 71 trang. 4. Trần Thị Hoàng Dung, 2000. Ứng dụng phương pháp Nested PCR điều tra bệnh WSSV trên tôm sú ở một số tỉnh phía Nam. Khóa luận tốt nghiệp Kỹ sư Thủy sản, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 56 trang. 5. Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2002. Sinh học phân tử. Nhà xuất bản Giáo dục. 301 trang. 6. Nguyễn Văn Hảo, 2000. Một số vấn đề về kỹ thuật nuôi tôm sú công nghiệp. Nhà xuất bản Nông nghiệp. 210 trang. 7. Nguyễn Văn Hảo, 2004. Một số bệnh thường gặp trên tôm sú (Penaeus monodon) – Các phương pháp chẩn đoán và biện pháp phòng trị. Nhà xuất bản Nông nghiệp. 223 trang. 8. Trần Thị Việt Ngân, 2002. Hỏi và đáp về kỹ thuật nuôi tôm sú. Nhà xuất bản Nông nghiệp Tp. Hồ Chí Minh. 192 trang. 9. Báo cáo tại hội thảo bệnh tôm sú tại Hải Phòng, ngày 28 – 29/2/2004. Tổng quan bệnh virus đốm trắng ở tôm he (Penaeus). Tạp chí thông tin KHCN và Kinh Tế Thủy Sản, số 4 – 2004. 42 trang. 10. Hội thảo về bệnh tôm nuôi ở các tỉnh phía Nam, 2004. Bệnh đốm trắng của tôm sú và biện pháp phòng trị. Tạp chí Thủy sản, số 3 – 2004. 44 trang. 11. Bộ Thủy Sản, 1996. Nguồn lợi thủy sản Việt Nam. Nhà xuất bản Nông nghiệp Hà Nội. 616 trang. 12. Bộ Thủy Sản, 2003. Tuyển tập báo cáo khoa học về nuôi trồng thủy sản tại hội nghị khoa học toàn quốc lần thứ 2 (24 – 25/11/2003). Nhà xuất bản Nông nghiệp Hà Nội. 683 trang. 73 13. Trần Thị Minh Tâm, 1999. Bệnh thường gặp ở tôm phương pháp chẩn đoán và phòng trị. Nhà xuất bản Nông nghiệp. 126 trang. 14. Bùi Quang Tề, 2003. Bệnh của tôm nuôi và biện pháp phòng trị. Nhà xuất bản Nông nghiệp Hà Nội. 113 trang. 15. Nguyễn Thái Thủy, 2003. PCR và Real - time PCR. Công ty Bio – Rad. 101 trang. 16. Phạm Văn Tình, 2001. Kỹ thuật nuôi tôm sú. Nhà xuất bản Nông nghiệp Tp. Hồ Chí Minh. 55 trang. 17. Vũ Thế Trụ, 1993. Cải tiến kỹ thuật nuôi tôm tại Việt Nam. Nhà xuất bản Nông nghiệp. 87 trang. 18. Phạm Hùng Vân, 2002. Cẩm nang các kỹ thuật PCR và RT-PCR phát hiện các tác nhân virus thường gây bệnh trên tôm sú Penaeus monodon. Công ty Thương Mại và Dịch Vụ Nam Khoa. 29 trang. TIẾNG NƢỚC NGOÀI 19. Applied Biosystems, 2004. Real - time PCR Vs. traditional PCR. 15 pages. 20. Bio - Rad, 2004. iCycler iQTM Multi - Color Real - time PCR detection system. operating instructions. Bio - Rad company. 118 pages. 21. FAO and Multimedia Asia Co., Ltd., 1999. Diagnosis of shrimp diseases with emphasis on the black tiger shrimp (Penaeus monodon). www.multimedia- asia.com. 22. Lightner D. V, 1996. A handbook of shrimp pathology and diagnostic procedures for disease of culture penaeid shrimp. World aquaculture society. Baton rouge, luoisana. USA. 180 pages. 23. Newton C. R. and Graham A., 1997. PCR. Second edition. United States of America. 192 pages. 24. McPherson M. J. and Moller S. G., 2001. PCR. The United States of America. 276 pages. 25. Qiagen, 2004. Critical factors for successful Real - time PCR. Epoch Biosciences. 48 pages. 74 26. Thuy Thi Ngoc Phan, 2001. Prevalence and Co – prevalence of White Spot Syndrome Virus (WSSV) and Yellow Head Complex Viruses (YHV – Complex) in Cultured Giant Tiger Prawn (Penaeus monodon) in Vietnam. MSc. Thesis, University of Queensland, Australia. 39 pages. 27. Too H. P., 2001. Demystifying the new genetics. Molecular aspects of biomedical sciences. Biochemistry Department. Faculty of medicine. National University of Singapore. 244 pages. 28. Wang Y. C et al, 1996. Experimental infection of WSSV in some cultivated and will decapods in Taiwan. 35 pages. 29. Weighardt F., 2004. The analysis of food samples for the presence of genetically modified organisms. Session 10 “Quantitative PCR for the detection of GMOs”. European Commission Joint Research Centre. 19 pages. INTERNET benhdomtrang.htm 75 PHỤ LỤC Phụ lục A TRỌNG LƢỢNG MẪU LY TRÍCH STT Mã số mẫu cũ Mã số chạy mẫu m Ghi chú 1 1 PTN (+) 1 0,089 PTN: mẫu đã xác định +, - từ các chi cục và Viện NTTS 2 3 PTN(+) 2 0,082 TT: mẫu thu từ thực tế 3 4 PTN(+) 3 0,073 m: trọng lượng mẫu ly trích 4 5 PTN(+) 4 0,102 5 6 PTN(+) 5 0,049 6 7 PTN(+) 6 0,057 7 8 PTN(+) 7 0,056 8 9 PTN(+) 8 0,046 9 10 PTN(-) 9 0,045 10 12 PTN(-) 10 0,065 11 13 PTN(-) 11 0,036 12 14 PTN(-) 12 0,029 13 15 PTN 1 0,037 14 16 TT 2 0,057 15 17 TT 3 0,061 16 18 TT 4 0,062 17 19 TT 5 0,053 18 20 TT 6 0,065 19 21 TT 7 0,075 20 22 TT 8 0,049 21 23 TT 9 0,088 22 24 TT 10 0,075 23 25 TT 11 0,085 24 26 TT 12 0,069 25 27 TT 13 0,093 26 28 TT 14 0,039 27 29 TT 15 0,060 28 30 TT 16 0,067 29 31 TT 17 0,076 30 32 TT 18 0,062 31 33 TT 19 0,026 32 34 TT 20 0,030 33 35 TT 21 0,031 34 36 TT 22 0,085 35 37 TT 23 0,048 36 38 TT 24 0,085 37 39 TT 25 0,098 38 40 TT 26 0,060 39 41 TT 27 0,093 40 42 TT 28 0,051 41 43 TT 29 0,068 42 44 TT 30 0,028 43 45 PTN (-) 13 0,098 44 46 PTN (-) 14 0,059 45 47 PTN (-) 15 0,052 76 PHỤ LỤC B HÌNH ẢNH VÀ SỐ LIỆU THÔ KẾT QUẢ CHẠY REAL - TIME PCR VÀ NON STOP NESTED PCR Hình B.2 Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ của mẫu ly trích theo quy trình 2 : mẫu ly trích theo quy trình 1 : mẫu ly trích theo quy trình 2 : đối chứng âm , : 10-1 , : 10-2 , : 10-3 , : 10-4 , : 10-5 , : 10-6 Hình B.1 Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ của mẫu ly trích theo quy trình 1 77 Bảng B.2 Kết quả thử nghiệm Real - time PCR trên 12 mẫu tôm sú lần 1 Type Identifier Rep Ct Log SQ SQ SQ Ct Ct SQ Mean SD Mean SD E01 Unknown 11 14 36,62 0,646 4,43E+00 4,43E+00 N/A 36,62 N/A E02 Unknown 12 15 36,06 0,812 6,48E+00 6,48E+00 N/A 36,06 N/A F02 Unknown 5 16 20,37 5,482 3,04E+05 3,04E+05 N/A 20,37 N/A F04 Unknown 6 17 19,72 5,677 4,76E+05 4,76E+05 N/A 19,72 N/A F06 Unknown 7 18 18,90 5,921 8,34E+05 8,34E+05 N/A 18,90 N/A F08 Unknown 8 19 18,96 5,902 7,97E+05 7,97E+05 N/A 18,96 N/A F10 Unknown 9 20 38,15 0,191 1,55E+00 1,55E+00 N/A 38,15 N/A F12 Unknown 10 21 38,46 0,099 1,26E+00 1,26E+00 N/A 38,46 N/A G05 Unknown 1 24 17,03 6,478 3,00E+06 3,00E+06 N/A 17,03 N/A G07 Unknown 2 25 33,88 1,460 2,88E+01 2,88E+01 N/A 33,88 N/A G09 Unknown 3 26 33,05 1,709 5,12E+01 5,12E+01 N/A 33,05 N/A G11 Unknown 4 27 37,98 0,240 1,74E+00 1,74E+00 N/A 37,98 N/A H02 Standard std 6 21,92 5,000 1,00E+05 1,00E+05 N/A 21,92 N/A H04 Standard std 7 25,41 4,000 1,00E+04 1,00E+04 N/A 25,41 N/A H06 Standard std 8 28,84 3,000 1,00E+03 1,00E+03 N/A 28,84 N/A H08 Standard std 9 31,91 2,000 1,00E+02 1,00E+02 N/A 31,91 N/A H10 Standard std 10 35,47 1,000 1,00E+01 1,00E+01 N/A 35,47 N/A I: quy trình ly trích 2 S: quy trình ly trích 1 Well Identifier Ct A2 10 -1 I 16,9 A4 10 -2 I 20,6 A6 10 -3 I 23,7 A8 10 -4 I 27,1 A10 10 -5 I 30,6 A12 10 -6 I 34,8 C2 10 -1 S 20,6 C4 10 -2 S 23,8 C6 10 -3 S 27,5 C8 10 -4 S 31,6 C10 10 -5 S 34,9 C12 10 -6 S 37,8 E6 (-) N/A Bảng B.1 Số liệu của mẫu ly trích theo hai quy trình ly trích sử dụng SDS, NaOH, sốc nhiệt và ly trích sử dụng SDS, NaOH, sốc nhiệt kết hợp với Instagene Matrix 78 Hình B.4 Đồ thị biểu diễn đƣờng chuẩn của 12 mẫu tôm sú thử nghiệm Real - time PCR lần 2 : 8 : 9 : 10 : 11 : 12 : đối chứng âm ▲: các chuẩn : 1 : 2 : 3 : 4 : 5 : 6 : 7 Hình B.3 Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ của 12 mẫu tôm sú thử nghiệm Real - time PCR lần 2 79 Bảng B.3 Kết quả thử nghiệm Real - time PCR trên 12 mẫu tôm sú lần 2 Type Identifier Rep Ct Log SQ SQ SQ Ct Ct SQ Mean SD Mean SD A02 Standard std 1 21,34 5,000 1,00E+05 1,00E+05 N/A 21,34 N/A A04 Standard std 2 24,65 4,000 1,00E+04 1,00E+04 N/A 24,65 N/A A06 Standard std 3 28,05 3,000 1,00E+03 1,00E+03 N/A 28,05 N/A A08 Standard std 4 31,18 2,000 1,00E+02 1,00E+02 N/A 31,18 N/A A10 Standard std 5 35,01 1,000 1,00E+01 1,00E+01 N/A 35,01 N/A C02 Unknown 12 1 39,51 (0,385) 4,12E-01 4,12E-01 N/A 39,51 N/A C06 Unknown 1 3 16,30 6,470 2,95E+06 2,95E+06 N/A 16,30 N/A C08 Unknown 2 4 33,76 1,312 2,05E+01 2,05E+01 N/A 33,76 N/A C10 Unknown 3 5 32,63 1,646 4,42E+01 4,42E+01 N/A 32,63 N/A C12 Unknown 4 6 37,40 0,238 1,73E+00 1,73E+00 N/A 37,40 N/A D01 Unknown 5 7 20,19 5,322 2,10E+05 2,10E+05 N/A 20,19 N/A D03 Unknown 6 8 19,34 5,572 3,73E+05 3,73E+05 N/A 19,34 N/A D05 Unknown 7 9 18,75 5,745 5,56E+05 5,56E+05 N/A 18,75 N/A D07 Unknown 8 10 18,65 5,775 5,96E+05 5,96E+05 N/A 18,65 N/A D09 Unknown 9 11 35,20 0,887 7,72E+00 7,72E+00 N/A 35,20 N/A D11 Unknown 10 12 37,94 0,077 1,19E+00 1,19E+00 N/A 37,94 N/A D12 Unknown 11 13 35,35 0,842 6,94E+00 6,94E+00 N/A 35,35 N/A Bảng B.4 Kết quả xử lý qua phần mềm excel của 12 mẫu tôm lặp lại 2 lần Mẫu Ct lần 1 Ct lần 2 Ct trung bình Độ lệch chuẩn của Ct SQ trung bình SQ lần 1 SQ lần 2 Độ lệch chuẩn của số bản sao ban đầu 1 17,03 16,3 16,67 0,52 2,98E+06 3,00E+06 2,95E+06 0,035.10 6 2 33,88 33,76 33,82 0,08 2,47E+01 2,88E+01 2,05E+01 0,059.10 1 3 33,05 32,63 32,84 0,30 4,77E+01 5,12E+01 4,42E+01 0,49.10 1 4 37,98 37,4 37,69 0,41 1,74E+00 1,74E+00 1,73E+00 0,01 5 20,37 20,19 20,28 0,13 2,57E+05 3,04E+05 2,10E+05 0,665.10 5 6 19,72 19,34 19,53 0,27 4,25E+05 4,76E+05 3,73E+05 0,73.10 5 7 18,9 18,75 18,83 0,11 6,95E+05 8,34E+05 5,56E+05 1,97.10 5 8 18,96 18,65 18,81 0,22 6,97E+05 7,97E+05 5,96E+05 1,42.10 5 9 38,15 35,2 36,68 2,09 4,64E+00 1,55E+00 7,72E+00 4,36 10 38,46 37,94 38,20 0,37 1,23E+00 1,26E+00 1,19E+00 0,05 11 36,62 35,35 35,99 0,90 5,69E+00 4,43E+00 6,94E+00 1,77 12 36,06 39,51 37,79 2,44 3,45E+00 6,48E+00 4,12E-01 4,29 80 Type Identifier Rep Ct Log SQ SQ SQ Ct Ct SQ Mean SD Mean SD A01 Standard std 1 22,57 5,000 1,00E+05 1,00E+05 N/A 22,57 N/A A03 Standard std 2 25,47 4,000 1,00E+04 1,00E+04 N/A 25,47 N/A A05 Standard std 3 28,97 3,000 1,00E+03 1,00E+03 N/A 28,97 N/A A07 Standard std 4 32,33 2,000 1,00E+02 1,00E+02 N/A 32,33 N/A A09 Standard std 5 35,79 1,000 1,00E+01 1,00E+01 N/A 35,79 N/A B04 Unknown 14 8 41,73 (0,813) 1,54E-01 1,54E-01 N/A 41,73 N/A B06 Unknown 15 9 40,64 (0,485) 3,27E-01 3,27E-01 N/A 40,64 N/A B02 Unknown 13 7 N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A Bảng B.5 Kết quả thử nghiệm Real - time PCR trên 3 mẫu tôm sú Bảng B.6 Kết quả thử nghiệm tính định lƣợng của phƣơng pháp Real - time PCR ở từng nồng độ pha loãng lặp lại 3 lần của mẫu 1 Type Identifier Rep Ct Log SQ SQ SQ Ct Ct SQ Mean SD Mean SD A01 Standard std 1 22,57 5,000 1,00E+05 1,00E+05 N/A 22,57 N/A A03 Standard std 2 25,46 4,000 1,00E+04 1,00E+04 N/A 25,46 N/A A05 Standard std 3 28,97 3,000 1,00E+03 1,00E+03 N/A 28,97 N/A A07 Standard std 4 32,33 2,000 1,00E+02 1,00E+02 N/A 32,33 N/A A09 Standard std 5 35,79 1,000 1,00E+01 1,00E+01 N/A 35,79 N/A C01 Unknown 10 0 10 17,11 6,575 3,76E+06 3,76E+06 N/A 17,11 N/A C03 Unknown 10 0 11 16,86 6,652 4,48E+06 4,48E+06 N/A 16,86 N/A C05 Unknown 10 0 12 16,34 6,807 6,42E+06 6,42E+06 N/A 16,34 N/A C07 Unknown 10 -1 13 20,02 5,704 5,06E+05 5,06E+05 N/A 20,02 N/A C09 Unknown 10 -1 14 20,11 5,675 4,74E+05 4,74E+05 N/A 20,11 N/A C11 Unknown 10 -1 15 19,78 5,775 5,95E+05 5,95E+05 N/A 19,78 N/A D02 Unknown 10 -2 16 23,59 4,632 4,29E+04 4,29E+04 N/A 23,59 N/A D04 Unknown 10 -2 17 23,41 4,685 4,84E+04 4,84E+04 N/A 23,41 N/A D06 Unknown 10 -2 18 23,11 4,774 5,94E+04 5,94E+04 N/A 23,11 N/A D08 Unknown 10 -3 19 27,10 3,576 3,77E+03 3,77E+03 N/A 27,10 N/A D10 Unknown 10 -3 20 26,87 3,647 4,44E+03 4,44E+03 N/A 26,87 N/A D12 Unknown 10 -3 21 27,26 3,530 3,39E+03 3,39E+03 N/A 27,26 N/A 81 Bảng B.8 Kết quả thử nghiệm tính định lƣợng của phƣơng pháp Real - time PCR ở từng nồng độ pha loãng lặp lại 3 lần của mẫu 7 Type Identifier Rep Ct Log SQ SQ SQ Ct Ct SQ Mean SD Mean SD A01 Standard std 1 22,57 5,000 1,00E+05 1,00E+05 N/A 22,57 N/A A03 Standard std 2 25,47 4,000 1,00E+04 1,00E+04 N/A 25,47 N/A A05 Standard std 3 28,97 3,000 1,00E+03 1,00E+03 N/A 28,97 N/A A07 Standard std 4 32,33 2,000 1,00E+02 1,00E+02 N/A 32,33 N/A A09 Standard std 5 35,79 1,000 1,00E+01 1,00E+01 N/A 35,79 N/A E01 Unknown 10 0 22 19,19 5,952 8,95E+05 8,95E+05 N/A 19,19 N/A E03 Unknown 10 0 23 18,81 6,068 1,17E+06 1,17E+06 N/A 18,81 N/A E05 Unknown 10 0 24 18,34 6,207 1,61E+06 1,61E+06 N/A 18,34 N/A E07 Unknown 10 -1 25 21,75 5,183 1,52E+05 1,52E+05 N/A 21,75 N/A E09 Unknown 10 -1 26 21,84 5,158 1,44E+05 1,44E+05 N/A 21,84 N/A E11 Unknown 10 -1 27 22,14 5,067 1,17E+05 1,17E+05 N/A 22,14 N/A F02 Unknown 10 -2 28 25,76 3,982 9,59E+03 9,59E+03 N/A 25,76 N/A F04 Unknown 10 -2 29 25,65 4,013 1,03E+04 1,03E+04 N/A 25,65 N/A F06 Unknown 10 -2 30 25,58 4,035 1,08E+04 1,08E+04 N/A 25,58 N/A F08 Unknown 10 -3 31 29,21 2,944 8,79E+02 8,79E+02 N/A 29,21 N/A F10 Unknown 10 -3 32 29,46 2,870 7,41E+02 7,41E+02 N/A 29,46 N/A F12 Unknown 10 -3 33 29,15 2,963 9,17E+02 9,17E+02 N/A 29,15 N/A Bảng B.7 Kết quả xử lý qua phần mềm excel của mẫu 1 ở từng nồng độ pha loãng lặp lại 3 lần Nồng độ Ct lần 1 Ct lần 2 Ct lần 3 Ct SD Ct Mean 10 0 17,11 16,86 16,34 0,39 16,77 10 -1 20,02 20,11 19,78 0,17 19,97 10 -2 23,59 23,41 23,11 0,24 23,37 10 -3 27,1 26,87 27,26 0,20 27,08 Nồng độ SQ lần 1 SQ lần 2 SQ lần 3 SQ SD SQ Mean 10 0 3,76E+06 4,48E+06 6,42E+06 1,38.10 6 4,89E+06 10 -1 5,06E+05 4,74E+05 5,95E+05 0,63.10 5 5,25E+05 10 -2 4,29E+04 4,84E+04 5,94E+04 0,84.10 4 5,02E+04 10 -3 3,77E+03 4,44E+03 3,39E+03 0,53.10 3 3,87E+03 82 Hình B.5 Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ của mẫu nhiễm WSSV pha loãng từ 10-1 đến 10-8 lặp lại lần 2 : 10-1 : 10-2 : 10-3 : 10-4 : 10-5 : 10-6 : 10-7 : 10-8 : đối chứng âm Bảng B.9 Kết quả xử lý qua phần mềm excel của mẫu 7 ở từng nồng độ pha loãng lặp lại 3 lần Nồng độ Ct lần 1 Ct lần 2 Ct lần 3 Ct SD Ct Mean 10 0 19,19 18,81 18,34 0,43 18,78 10 -1 21,75 21,84 22,14 0,20 21,91 10 -2 25,76 25,65 25,58 0,09 25,66 10 -3 29,21 29,46 29,15 0,16 29,27 Nồng độ SQ lần 1 SQ lần 2 SQ lần 3 SQ SD SQ Mean 10 0 8,95E+05 1,17E+06 1,61E+06 0,36.10 6 1,23E+06 10 -1 1,52E+05 1,44E+05 1,17E+05 0,18.10 5 1,38E+05 10 -2 9,59E+03 1,03E+04 1,08E+04 0,061.10 4 1,02E+04 10 -3 8,79E+02 7,41E+02 9,17E+02 0,92.10 2 8,46E+02 83 Hình B.6 Non Stop Nested PCR trên mẫu tôm nhiễm WSSV ở nồng độ pha loãng từ 10-1 đến 10-8 lặp lại lần 2 (-) MK 633bp 10-8 10-7 (+) 10-6 10 -5 10-4 10-3 10-2 10-1 221bp Bảng B.10 Kết quả tính chu kỳ ngƣỡng ở các nồng độ từ 10-1 đến 10-8 của mẫu nhiễm WSSV sau hai lần thử nghiệm Real - time PCR qua phần mềm excel Nồng độ Real - time PCR Chu kỳ ngưỡng lần 1 Chu kỳ ngưỡng lần 2 Chu kỳ ngưỡng trung bình 10 -1 20,53 21,06 20,80 10 -2 23,86 24,38 24,12 10 -3 27,40 27,78 27,59 10 -4 30,37 30,91 30,64 10 -5 33,93 34,8 34,37 10 -6 37,32 36,96 37,14 10 -7 41,76 41,08 41,42 10 -8 N/A N/A N/A 84 Hình B.7 Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ của 10 mẫu tôm thu thực tế lặp lại lần 2 : 1 : 6 : 10 : 13 : 14 : 18 : 22 : 23 : 25 : 26 ▲: các chuẩn : đối chứng âm Bảng B.11 Kết quả Real - time PCR trên 10 mẫu tôm thu thực tế ở lần lặp lại thứ 1 Type Identifier Rep Ct Log SQ SQ SQ Ct Ct SQ Mean SD Mean SD F02 Standard std 1 21,43 5,000 1,00E+05 1,00E+05 N/A 21,43 N/A F04 Standard std 2 24,69 4,000 1,00E+04 1,00E+04 N/A 24,69 N/A F06 Standard std 3 28,31 3,000 1,00E+03 1,00E+03 N/A 28,31 N/A F08 Standard std 4 31,40 2,000 1,00E+02 1,00E+02 N/A 31,40 N/A F10 Standard std 5 35,19 1,000 1,00E+01 1,00E+01 N/A 35,19 N/A G01 Unknown 1 13 34,96 1,027 1,06E+01 1,06E+01 N/A 34,96 N/A H02 Unknown 18 19 32,16 1,846 7,01E+01 7,01E+01 N/A 32,16 N/A H04 Unknown 22 20 19,66 5,495 3,13E+05 3,13E+05 N/A 19,66 N/A H06 Unknown 23 21 29,28 2,687 4,86E+02 4,86E+02 N/A 29,28 N/A H10 Unknown 26 23 37,91 0,165 1,46E+00 1,46E+00 N/A 37,91 N/A G05 Unknown 6 15 N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A G07 Unknown 10 16 N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A G09 Unknown 13 17 N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A G11 Unknown 14 18 N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A H08 Unknown 25 22 N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A 85 Bảng B.12 Kết quả Real - time PCR trên 10 mẫu tôm thu thực tế ở lần lặp lại thứ 2 Type Identifier Rep Ct Log SQ SQ SQ Ct Ct SQ Mean SD Mean SD A02 Standard std 1 20,24 5,000 1,00E+05 1,00E+05 N/A 20,24 N/A A04 Standard std 2 23,88 4,000 1,00E+04 1,00E+04 N/A 23,88 N/A A06 Standard std 3 27,72 3,000 1,00E+03 1,00E+03 N/A 27,72 N/A A08 Standard std 4 30,92 2,000 1,00E+02 1,00E+02 N/A 30,92 N/A A10 Standard std 5 34,65 1,000 1,00E+01 1,00E+01 N/A 34,65 N/A B01 Unknown 1 1 32,66 1,555 3,59E+01 3,59E+01 N/A 32,66 N/A D11 Unknown 18 18 31,13 1,982 9,58E+01 9,58E+01 N/A 31,13 N/A E08 Unknown 22 22 18,08 5,622 4,19E+05 4,19E+05 N/A 18,08 N/A E10 Unknown 23 23 27,99 2,857 7,20E+02 7,20E+02 N/A 27,99 N/A F03 Unknown 26 26 38,58 (0,096) 8,02E-01 8,02E-01 N/A 38,58 N/A B11 Unknown 6 6 N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A C08 Unknown 10 10 N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A D01 Unknown 13 13 N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A D03 Unknown 14 14 N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A D07 Unknown 25 25 N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A Hình B.8 Đồ thị biểu diễn đƣờng chuẩn của 10 mẫu tôm thu thực tế lặp lại lần 2 Bảng B.13 Kết quả xử lý qua phần mềm excel của 10 mẫu tôm thu thực tế lặp lại 2 lần Mẫu Ct lần 1 Ct lần 2 Ct SD Ct Mean SQ lần 1 SQ lần 2 SQ SD SQ Mean 1 34,96 32,66 1,63 33,81 1,06E+01 3,59E+01 1,79.10 1 2,33E+01 18 32,16 31,13 0,73 31,65 7,01E+01 9,58E+01 1,82.10 1 8,30E+01 22 19,66 18,08 1,12 18,87 3,13E+05 4,19E+05 0,75.10 5 3,66E+05 23 29,28 27,99 0,91 28,64 4,86E+02 7,20E+02 1,65.10 2 6,03E+02 26 37,91 38,58 0,47 38,25 1,46E+00 8,02E-01 0,47 1,13E+00 6 N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A 10 N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A 13 N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A 14 N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A 25 N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A 86 Bảng B.14 Kết quả Real - time PCR trên 10 mẫu tôm thu thực tế tiếp theo Type Identifier Rep Ct Log SQ SQ SQ Ct Ct SQ Mean SD Mean SD A02 Standard std 1 20,79 5,000 1,00E+05 1,00E+05 N/A 20,79 N/A A04 Standard std 2 24,45 4,000 1,00E+04 1,00E+04 N/A 24,45 N/A A06 Standard std 3 28,25 3,000 1,00E+03 1,00E+03 N/A 28,25 N/A A08 Standard std 4 31,43 2,000 1,00E+02 1,00E+02 N/A 31,43 N/A A10 Standard std 5 35,16 1,000 1,00E+01 1,00E+01 N/A 35,16 N/A B03 Unknown 2 2 38,46 0,076 1,19E+00 1,19E+00 N/A 38,46 N/A B05 Unknown 3 3 34,82 1,096 1,25E+01 1,25E+01 N/A 34,82 N/A B07 Unknown 4 4 37,11 0,453 2,84E+00 2,84E+00 N/A 37,11 N/A B09 Unknown 5 5 40,90 (0,606) 2,48E-01 2,48E-01 N/A 40,90 N/A C02 Unknown 7 7 38,38 0,098 1,25E+00 1,25E+00 N/A 38,38 N/A C04 Unknown 8 8 35,69 0,851 7,10E+00 7,10E+00 N/A 35,69 N/A C06 Unknown 9 9 36,21 0,706 5,08E+00 5,08E+00 N/A 36,21 N/A C10 Unknown 11 11 36,94 0,502 3,18E+00 3,18E+00 N/A 36,94 N/A C12 Unknown 12 12 41,47 (0,767) 1,71E-01 1,71E-01 N/A 41,47 N/A D05 Unknown 15 15 36,79 0,543 3,49E+00 3,49E+00 N/A 36,79 N/A Bảng B.15 Kết quả Real - time PCR trên 10 mẫu tôm thu thực tế còn lại Type Identifier Rep Ct Log SQ SQ SQ Ct Ct Set SQ Mean SD Mean SD Point A02 Standard std 1 20,80 5,000 1,00E+05 1,00E+05 N/A 20,80 N/A A04 Standard std 2 24,47 4,000 1,00E+04 1,00E+04 N/A 24,47 N/A A06 Standard std 3 28,26 3,000 1,00E+03 1,00E+03 N/A 28,26 N/A A08 Standard std 4 31,44 2,000 1,00E+02 1,00E+02 N/A 31,44 N/A A10 Standard std 5 35,18 1,000 1,00E+01 1,00E+01 N/A 35,18 N/A E02 Unknown 19 19 37,37 0,386 2,43E+00 2,43E+00 N/A 37,37 N/A E04 Unknown 20 20 35,65 0,867 7,36E+00 7,36E+00 N/A 35,65 N/A E06 Unknown 21 21 37,89 0,240 1,74E+00 1,74E+00 N/A 37,89 N/A F05 Unknown 27 27 40,51 (0,494) 3,20E-01 3,20E-01 N/A 40,51 N/A F07 Unknown 28 28 40,97 (0,623) 2,38E-01 2,38E-01 N/A 40,97 N/A F09 Unknown 29 29 39,82 (0,300) 5,01E-01 5,01E-01 N/A 39,82 N/A F11 Unknown 30 30 35,02 1,044 1,11E+01 1,11E+01 N/A 35,02 N/A D07 Unknown 16 16 N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A D09 Unknown 17 17 N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A E12 Unknown 24 24 N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A 87 Bảng B.16 Bảng kết quả kiểm tra 30 mẫu tôm thu từ thực tế Mã số mẫu Tên chủ hộ nuôi tôm Nguồn gốc Giai đoạn tôm Real - time PCR 1 Nguyễn Thành Nhân Bến Tre Tôm giống 34 ngày + 2 Nguyễn Văn Dương Bến Tre Tôm giống 31 ngày + 3 Huỳnh Văn Thả Bến Tre Tôm giống 31 ngày + 4 Nguyễn Văn Dứt Bến Tre Tôm giống 31 ngày + 5 Nguyễn Văn Khanh (ao 1) Bến Tre Tôm giống 31 ngày + 6 Nguyễn Văn Khanh (ao 2) Bến Tre Tôm giống 31 ngày - 7 Nguyễn Văn Đực Bến Tre Tôm giống 31 ngày + 8 Nguyễn Minh Quang Bến Tre Tôm thương phẩm 73 ngày + 9 Nguyễn Văn Lộ Bến Tre Tôm thương phẩm 43 ngày + 10 Nguyễn Thị Phượng Bến Tre Tôm giống 36 ngày - 11 Trần Văn Ngừng Bến Tre Tôm giống 34 ngày + 12 Lê Văn Mai Bến Tre Tôm giống 31 ngày + 13 Lê Thanh Liêm Bến Tre Tôm giống 31 ngày - 14 Lê Hoàng Phong Bến Tre Tôm giống 31 ngày - 15 Lê Thị Tím Bến Tre Tôm thương phẩm 62 ngày + 16 Nguyễn Văn Sấm Bến Tre Tôm thương phẩm 98 ngày - 17 Nguyễn Văn Thanh (ao nuôi lần 1) Bến Tre Tôm thương phẩm 132 ngày - 18 Nguyễn Văn Thanh (ao nuôi lần 2) Bến Tre Tôm giống 33 ngày + 19 Nguyễn Thị Đẹp Bạc Liêu Tôm giống 30 ngày + 20 Lê Minh Thành Bạc Liêu Tôm giống 33 ngày + 21 Trần Thị Kim Hoa Bạc Liêu Tôm giống 33 ngày + 22 Lê Thanh Sơn Bạc Liêu Tôm thương phẩm 135 ngày + 23 Cao Thị Mến Bạc Liêu Tôm thương phẩm 130 ngày + 24 Nguyễn Văn Cường Bạc Liêu Tôm bố mẹ - 25 Nguyễn Tấn Tài Bạc Liêu Tôm thương phẩm 125 ngày - 26 Nguyễn Văn Cường Bạc Liêu Tôm bố mẹ + 27 Nguyễn Văn Cường Bạc Liêu Tôm bố mẹ + 28 Trương Văn Quyến Bạc Liêu Tôm giống 35 ngày + 29 Nguyễn Ngọc Anh Bạc Liêu Tôm giống 32 ngày + 30 Lâm Minh Nhựt Bạc Liêu Tôm thương phẩm 120 ngày + 88 PHỤ LỤC C CÁC THUẬT TỪ THƢỜNG DÙNG TRONG REAL - TIME PCR Background Nền là tín hiệu huỳnh quang không đặc hiệu trong phản ứng, chẳng hạn do sự hấp thụ không hiệu quả tín hiệu huỳnh quang hay sự hiện diện với số lượng lớn ADN đích mạch đôi khi dùng SYBR Green I. Thành phần tín hiệu nền được loại bỏ nhờ phần mềm toán học của Real - time cycler. Baseline là mức độ nhiễu trong các chu kỳ từ 2 đến 15. Trong khoảng các chu kỳ này không có sự gia tăng tín hiệu huỳnh quang tương ứng với số sản phẩm khuếch đại. Số chu kỳ để tính baseline có thể thay đổi và giảm dần nếu số lượng mạch khuôn cao hay mức độ biểu hiện gen đích cao. Biến tính (denaturation): biến tính của ADN là sự chuyển từ dạng mạch kép sang dạng mạch đơn. Tác nhân gây nên sự biến tính thường là nhiệt. bp (base pair): cặp base, là liên kết A-T hoặc C-G trên một phân tử ADN mạch kép, và là đơn vị đo chiều dài của một phân tử ADN. Cấu trúc kẹp tóc (hairpin): một vùng xoắn kép hình thành từ sự bắt cặp bổ sung giữa hai trình tự bổ sung nằm kề nhau trên một phân tử ADN hay RNA mạch đơn. Chu kỳ ngưỡng (Ct) Là chu kỳ mà đường đồ thị khuếch đại vượt qua đường baseline subtracted. Tại điểm vượt qua đó, tín hiệu huỳnh quang tăng một cách thấy rõ. Chu kỳ ngưỡng được xem như một phương cách tính số khuôn mẫu ban đầu ở từng mẫu. Đường chuẩn: đường chuẩn được dựng nên từ mẫu đã biết số bản sao ban đầu. Log của số bản sao (trục X) được dựng nghịch với chu kỳ ngưỡng (trục Y) tạo dựng nên đồ thị (graph). Phương trình của đường thẳng và hệ số tương quan r2 được thể hiện trên biểu đồ biểu diễn đường chuẩn. Primer: một trình tự ADN hay ARN ngắn, bắt cặp với một mạch khuôn ADN và có mang một đầu 3’OH tự do giúp ADN polymerase bắt đầu tổng hợp mạch mới. Probe: một đoạn ADN hay ARN chuyên biệt được đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ hay bằng hóa chất, dùng để định vị một trình tự nucleic acid nhất định thông qua kỹ thuật lai phân tử. 89 Quencher (Q): chất hấp thụ: tín hiệu huỳnh quang phát ra từ chất chỉ thị huỳnh quang (reporter hay fluorophore) được quencher hấp thụ khi probe ở dạng không bắt cặp với trình tự chuyên biệt. Reporter (R): chất chỉ thị tín hiệu huỳnh quang Tín hiệu huỳnh quang tạo ra trong suốt Real - time PCR qua SYBR Green I hay probe có trình tự đặc hiệu được đánh dấu. Tm (nhiệt độ nóng chảy) (melting temperature): của một trình tự ADN là nhiệt độ ở đó có một nửa số phân tử của trình tự đó bị biến tính. Threshold Ngưỡng được điều chỉnh sao cho giá trị ngưỡng nằm trên tín hiệu nền và dưới đường bằng của đồ thị khuếch đại. Ngưỡng phải nằm trong vùng tuyến tính với đường cong khuếch đại, thể hiện phổ PCR phát hiện tuyến tính dưới dạng hàm log (the detectable log - linear range of the PCR). Giá trị ngưỡng được thiết lập qua đồ thị khuếch đại hàm log nhằm xác định pha log tuyến tính của PCR. Nếu nhiều trình tự đích trong thử nghiệm Real - time PCR, ngưỡng được thiết lập cho từng trình tự đích. 90 PHỤ LỤC D CÁC BƢỚC VẬN HÀNH MÁY iCycler iQ Máy iCycler iQ cho phép quan sát trực tiếp trên máy tính điều khiển diễn biến của phản ứng Real - time PCR theo các chu kỳ nhiệt. 1. Mở máy iCycler iQ theo thứ tự lần lượt: buồng nhiệt, đầu đọc iQ, máy vi tính điều khiển. Sau khi máy khởi động xong, vào start chọn all program, chọn iCycler, chọn instrument mode để kích hoạt điều khiển máy iCycler iQ. 2. Trên màn hình desktop, click vào hiển thị iCycler, màn hình vi tính hiển thị hình máy Bio – Rad và nhấn Yes để máy vi tính kích hoạt điều khiển Real - time PCR. Lúc này màn hình máy iCycler iQ hiển thị dòng chữ host control mode. Khi đó buồng PCR được nhận diện và được điều khiển qua máy vi tính. 3. Mở buồng máy cho ống chứa hỗn hợp phản ứng Real - time PCR vào máy (chú ý lau sạch ống bằng fisher lens paper cả phía đáy lẫn nắp ống. Đóng buồng PCR lại. 4. Thao tác trên máy vi tính điều khiển Bước 1: vào view protocol để chọn chương trình đã cài sẵn hay thiết lập chương trình mới trên máy tính điều khiển, chọn theo các hướng dẫn sau: - Create a new protocol: cài đặt một chương trình mới. Vào save protocol để lưu lại chương trình vừa cài vào máy điều khiển. - Edit this protocol: hiệu chỉnh một chương trình đã có. Edit protocol đặt tên chương trình, cài đặt các chu trình nhiệt của phản ứng Real - time PCR theo hướng dẫn trên màn hình vi tính. Sau đó vào save protocol để lưu. Bước 2: vào view plate setup để chọn các vị trí đặt ống phản ứng đã cài sẵn hay thực hiện cài đặt các vị trí mới trên máy tính điều khiển theo hướng dẫn như sau: - Edit plate setup Dùng mũi tên nhấn vào erase rồi di chuyển mũi tên đến ô vuông ở góc trên trái để xóa các vị trí có sẵn, chọn vị trí đặt ống PCR trên plate của máy iCyler iQ. Dùng mũi tên chọn tên của các vị trí như: unknown, standard, control (-), control (+) và click vào các vị trí muốn chọn. Muốn ghi tên của mẫu trên vị trí đã chọn vào Identifier. - Sau khi chọn vị trí xong, vào select and fluorophore để chọn màu và kính lọc: chọn FAM, SYBR,…Sau đó chọn màu hiển thị, dùng mũi tên nhấp vào góc trên trái của màn hình biểu diễn plate để chọn màu cho các giếng. Tiến hành lưu plate đã cài đặt. 91 Bước 3: vào run with selected plate setup hay run with selected protocol để chạy Real - time PCR. Không thay đổi các thông số và hiển thị cài đặt sẵn. Click begin run, màn hình máy tính sẽ hiển thị lệnh lưu tên, dữ liệu sẽ có vào user 1. Đặt tên cho tập tin dữ liệu sẽ có và chọn save. Máy bắt đầu chạy với hiển thị màn hình run time central với hoạt động performing bias optimizing rồi sẽ vào hiển thị nhiệt độ, đến lúc này ta sẽ biết máy hoạt động bình thường. Bước 4: sau khi máy chạy xong, ta có thể phân tích kết quả ngay hay vào view post run data để phân tích kết quả các dữ liệu của mẫu đã chạy Real - time PCR. Thực hiện theo đường dẫn: - Chọn view post run data\tên tập tin cần phân tích\analyze data. Lúc này màn hình hiển thị các thông tin về dữ liệu cần phân tích. - Chọn PCR quantification xem phân tích Ct. Chọn standard curve để xem đường chuẩn, hiệu quả phản ứng Real - time PCR, hệ số tương quan r2. - Chọn melt curve để phân tích nhiệt độ nóng chảy của sản phẩm Real - time PCR tạo thành để xác định mẫu dương hay âm tính đối với thí nghiệm dùng chất chỉ thị huỳnh quang là SYBR Green I. Bước 5: vào report để xuất kết quả: lựa chọn dữ liệu cần xuất. File xuất ra có thể lưu dưới một tập tin khác trong file word.