Khóa luận Quy trình chẩn đoán bệnh viêm gan siêu vi B bằng phương pháp Real-Time pcr

iều trị nhiễm HBV hay tình trạng mạng virus lâu dài trong máu cũng đang rất quan tâm. Nhưng để có thể có được những hiểu biết về các vấn đề kể trên thì cần phải xác định được một người đang mang HBsAg trong máu có thật sự đang nhiễm HBV hay không. Ngoài ra, để có được chỉ định điều trị đặc hiệu cũng như theo dõi được hiệu quả điều trị thì phải phát hiện cũng như định lượng được HBV trong máu. Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Võ Thị Hải Yến 2 Trước yêu cầu thực tế đó, khóa luận “Quy trình chẩn đoán bệnh viêm gan siêu vi B bằng phương pháp Real-time PCR” được thực hiện với mục đích đề xuất phương pháp định lượng HBV-DNA trong huyết thanh của người bệnh, nhằm giải quyết các vấn đề nói trên. III. Nhiệm vụ đề tài Giới thiệu sơ lược về virus gây bệnh viêm gan siêu vi B. Tìm hiểu các phương pháp chẩn đoán bệnh viêm gan siêu vi B. Tìm hiểu quy trình chẩn đoán bệnh viêm gan siêu vi B bằng phương pháp Real-time PCR. IV. Phương pháp nghiên cứu Nghiên cứu tài liệu, lý thuyết. Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Võ Thị Hải Yến 3 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Đại cương về bệnh viêm gan siêu vi B 1.1.1. Định nghĩa bệnh viêm gan siêu vi B [19] Viêm gan siêu vi B là bệnh viêm gan do virus viêm gan B (Hepatitis B Virus) gây ra, truyền nhiễm theo đường máu và sinh dục lây đến gần 1/3 dân số trên toàn thế giới, nhiều nhất tại các nước đang phát triển. 1.1.2. Lịch sử bệnh viêm gan siêu vi B [5] Bệnh được biết từ năm 1883 qua một vụ dịch viêm gan trên 191 người trong số 1289 công nhân đóng tàu ở Bremen (Anh) được chủng đậu mùa. Tất cả bệnh nhân là những người được chủng cùng một loại vaccine đậu mùa. Năm 1965, Blumberg phát hiện kháng nguyên gây bệnh viêm gan lây truyền qua huyết thanh, đặt tên là kháng nguyên Úc Châu (vì tìm thấy trên một người ở Châu Úc). HBV do Dane phát hiện năm 1970 trong huyết thanh của những bệnh nhân viêm gan bằng kỹ thuật miễn dịch hiển vi điện tử và được gọi là hạt Dane. Hình 1.1. Virus viêm gan siêu vi B trong máu của một bệnh nhân nhìn dưới kính hiển vi điện tử [23] Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Võ Thị Hải Yến 4 1.2. Đặc điểm sinh học của Hepatitis B Virus [8],[15],[18] Tác nhân gây viêm gan siêu vi B là một loại virus thuộc họ Hepadnaviridae, là tác nhân chủ yếu gây viêm gan và ung thư gan, được tìm thấy trong tế bào gan và trong huyết thanh của người bị nhiễm bệnh. 1.2.1. Kích thước và cấu trúc của virus hoàn chỉnh Hình 1.2. Cấu trúc viêm gan B [24] Virus hoàn chỉnh (virion) là một tiểu thể hình cầu có đường kính từ 42 - 47nm được gọi là hạt tử Dane, gồm: - Một vỏ protein có bề dày khoảng 7nm chứa kháng nguyên bề mặt HBsAg, glycoprotein và lipid. - Lõi có đường kính khoảng 28nm chứa một phân tử DNA, 2 loại kháng nguyên lõi là HBcAg, HBeAg và một số enzyme quan trọng như DNA polymerase, protein kinase. Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Võ Thị Hải Yến 5 1.2.2. Cấu trúc bộ gene của HBV Phân tử DNA của virus có dạng vòng, chứa khoảng 3,2Kb gồm hai mạch đơn có chiều dài khác nhau: một mạch dài hay mạch [-] là mạch hoàn chỉnh và một mạch ngắn là mạch [+] liên kết với phân tử DNA polymerase. Hình 1.3. Cấu tạo bộ gene HBV [18] Mạch [-] có 4 vùng mã hóa đã được xác định: gene S, gene C, gene P và gene X. v Gene S (surface) Mã hóa kháng nguyên bề mặt HBsAg, gồm ba vùng (pre S1, pre S2, S) mã hóa ba loại protein của HBsAg. - Vùng S mã hóa protein nhỏ (là protein chủ yếu vì nó chiếm đa số) chứa 226 acid amin, có vị trí gắn glucose. - Vùng S và pre S2 mã hóa loại protein trung bình chứa 281 acid amin, có vị trí gắn glucose. - Vùng S, pre S1, pre S2 mã hóa protein lớn chứa 389 - 400 acid amin, không có vị trí gắn glucose. Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Võ Thị Hải Yến 6 v Gene C (core) Mã hóa các polypeptide ở phần lõi của virus, gồm kháng nguyên lõi là HBcAg. Gene C có một trình tự ngắn là pre C (precore) mã hóa HBeAg. Nếu có một đột biến tại mã ngừng (stop codon) sẽ làm cho virus không sản xuất được HBeAg trong khi HBsAg vẫn được tổng hợp. Dòng đột biến này cũng có vai trò trong viêm gan siêu vi mãn và viêm gan siêu vi tối cấp. v Gene P (pol hay polymerase) Gene P chiếm 3/4 bộ gene của virus. Gene này gối lên phần cuối gene C, phần đầu gene X và toàn bộ gene S. Gene P mã hóa một polypeptide cơ bản, có hoạt tính DNA polymerase và ribonuclease H. v Gene X Đây là gene có kích thước nhỏ nhất, mã hóa một polypeptide gồm 154 acid amin, có chức năng điều hòa sự phiên mã của virus. 1.2.3. Sự tái bản DNA Trong sự tái bản DNA, mạch DNA [-] làm khuôn mẫu phiên mã ra mạch RNA [+] gọi là mRNA. Các bản sao mRNA này sẽ được đưa vào lõi của virus ở giai đoạn cuối của quá trình tái bản, mRNA sẽ làm khuôn mẫu cho giai đoạn phiên mã ngược để tổng hợp mạch cDNA [-] nhờ enzyme reverse transcriptase cũng là enzyme DNA polymerase. Sau đó, mRNA bị phân hủy bởi hoạt tính ribonuclease. Mạch cDNA [-] lại làm khuôn mẫu tổng hợp mạch [+] nhưng sự tổng hợp không được hoàn tất trước khi virus trưởng thành và được giải phóng. Vì thế, các virus hoàn chỉnh thường có sự khác nhau về chiều dài hai mạch DNA và mạch [+] luôn ngắn hơn mạch [-]. 1.2.4. Các thành phần kháng nguyên v Kháng nguyên bề mặt (HBsAg) HBsAg được tìm thấy trong huyết thanh người dưới dạng một thành phần của virus hoàn chỉnh hay dạng không hoàn chỉnh. Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Võ Thị Hải Yến 7 Năm 1968, Bayer và cộng sự đã quan sát được hai dạng HBsAg dưới kính hiển vi điện tử. - Dạng hình cầu có đường kính 17 - 25nm. - Dạng hình ống có đường kính khoảng 20nm, chiều dài thay đổi có thể lên đến vài trăm nm. Cấu tạo hóa học của cả hai dạng này gồm: protein, carbohydrate, lipid, không có nucleic acid nên được xem là dạng không hoàn chỉnh của HBV. HBsAg là chỉ điểm huyết thanh học thường được dùng để xác định nhiễm HBV. Đồng thời các mẫu huyết thanh có HBsAg sẽ là nguồn cung cấp kháng nguyên rất tốt, có thể làm vật liệu cho các phản ứng huyết thanh học áp dụng trong chẩn đoán. v Kháng nguyên lõi Gồm hai loại: HBcAg và HBeAg - HBcAg được tìm thấy trong nhân tế bào gan bị nhiễm HBV, trong huyết thanh người bị nhiễm. HBcAg hiện diện như là một thành phần của một virus hoàn chỉnh, chứ không có ở dạng tự do. - HBeAg là loại kháng nguyên hòa tan trong huyết thanh. Ở tế bào gan HBeAg hiện diện trong tế bào chất, sẽ được giải phóng khỏi phần lõi của virus khi xử lý với các chất mạnh. 1.2.5. Cách thức tồn tại và khả năng gây bệnh Các HBV gắn vào các receptor của nó trên màng tế bào gan. Sau đó, chúng bị tế bào nuốt vào trong theo kiểu ẩm bào. Vỏ capsid của nó (khi đã lọt vào tế bào) sẽ được một enzyme thích hợp của tế bào phân hủy và acid nucleic của HBV được giải phóng. Acid nucleic này đi vào nhân tế bào gan, tại đây sẽ tái tổng hợp tiến hành phiên mã, dịch mã và cuối cùng tạo sợi DNA mới. Các sợi này được lắp ráp qua lưới nội chất tạo ra các virion, và cuối cùng các virion được xuất bào ra ngoài. Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Võ Thị Hải Yến 8 Virus gắn vào bề mặt tế bào gan: HBV gắn vào bề mặt tế bào gan cảm thụ nhờ sự phù hợp giữa thụ thể của tế bào với protein trên màng của virus. Virus xâm nhập tế bào: Sau khi bám vào thụ thể của tế bào chủ, có sự hòa nhập vỏ virus với màng tế bào, sau đó capsid được phóng thích vào trong tế bào. Virus nhân lên trong tế bào: Đầu tiên, các thông tin di truyền của virus được mã hóa trong các phân tử DNA sẽ được phiên mã sang các RNA thông tin của virus. Quá trình này cần đến sự tham gia của các enzyme RNA polymerase. Các tRNA của virus sẽ đóng vai trò truyền tin để tạo ra các DNA của virus và các protein của vỏ capsid của virus, các virus mới sẽ được lắp ráp từ DNA và protein. Hình 1.4. Sự xâm nhiễm và sao chép HBV [27] Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Võ Thị Hải Yến 9 1.3. Tình hình bệnh viêm gan siêu vi B trên thế giới và Việt Nam [2],[4] 1.3.1. Tình hình bệnh viêm gan siêu vi B trên thế giới Theo tổ chức y tế thế giới (WHO), hiện nay trên thế giới có khoảng 2 tỉ người bị nhiễm HBV và 350 triệu người mang mầm bệnh mãn tính. Viêm gan siêu vi B thường là nguyên nhân dẫn đến viêm gan mãn tính, xơ gan và ung thư gan nguyên phát với tỷ lệ tử vong là 1 - 2 triệu người. Các genotype HBV khác nhau phân bố ở vùng địa lý đặc trưng khác nhau: - Genotype A phổ biến ở Bắc Mỹ, Châu Âu, Nam Phi và Ấn Độ. - Genotype B và C thì phổ biến ở Châu Á. - Genotype D phổ biến ở Châu Âu (vùng Địa Trung Hải), Trung Đông, Ấn Độ và Nam Phi. - Genotype E phổ biến ở Tây Phi. - Genotype F phổ biến ở Trung và Nam Mỹ, Alaska. - Genotype G phổ biến ở Châu Âu, Mexico, Mỹ. - Genotype H thường thấy ở Trung Mỹ, Mỹ, Nhật Bản. Tình hình HBV thay đổi theo từng khu vực địa lý. Tùy theo tỷ lệ người mang HBsAg [+] mà người ta chia làm 3 khu vực chính: 1.3.1.1. Khu vực lưu hành thấp Tỷ lệ HBsAg [+] khoảng 0,1 - 0,5% dân số như ở Bắc Mỹ, Tây Âu và Úc. Tỷ lệ người mang HBsAg cao nhất ở khoảng tuổi từ 20 - 40, trẻ em hiếm khi bị nhiễm HBV. 1.3.1.2. Khu vực lưu hành trung bình Tỷ lệ HBsAg [+] khoảng 2 - 7% ở một số quốc gia miền Nam Châu Âu và Đông Âu, Nga, Nam Mỹ. Kiểu lây truyền thường là phối hợp nhưng lây nhiễm qua đường tình dục thường là quan trọng hơn. Tuổi bị lây nhiễm cao nhất là từ 25 tuổi (khoảng 50% dân số). Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Võ Thị Hải Yến 10 1.3.1.3. Khu vực lưu hành cao Tỷ lệ HBsAg [+] vào khoảng 8 - 15%. Đặc điểm dịch tễ học quan trọng của vùng này là nhiễm HBV thường gặp ở trẻ em và lây nhiễm qua đường chu sinh (đường lây từ mẹ sang con). Trung Quốc, Phi Châu, Đông Nam Á được xếp vào khu vực này. Ngoài ra người ta cũng ghi nhận sự lây nhiễm còn xảy ra ở tuổi thiếu niên do các trẻ bị lây lẫn nhau trong gia đình, hoặc trong bạn bè, thường gặp ở trẻ em châu Phi. Vì vậy, hầu hết dân số bị nhiễm có huyết thanh chẩn đoán HBV dương tính rất sớm, thường là sau 10 tuổi. Tuy nhiên, bệnh lại thường được phát hiện ở tuổi trưởng thành, lúc mà các biến chứng mãn tính của nhiễm HBV có thể đã xuất hiện như viêm gan mãn, xơ gan và ung thư gan nguyên phát. Do nhiễm ở tuổi còn nhỏ nên nguy cơ mang siêu vi mãn tính rất cao, những phát hiện này chứng tỏ rằng người trẻ mang HBV là người có khả năng lây nhiễm nhất. Việt Nam cũng được xếp vào khu vực lưu hành cao, nghĩa là nhiễm HBV khá phổ biến, tuy chưa có những nghiên cứu dịch tễ học thống nhất. 1.3.2. Tình hình bệnh viêm gan siêu vi B trong nước Ở Việt Nam, cứ 5 - 7 người dân thì có một người nhiễm, chủ yếu là kiểu gene B và C. Virus B xâm nhập tế bào gan, biến chúng thành nơi sản xuất virus mới. Khi phát hiện ra sự bất thường này, hệ miễn dịch sẽ tấn công kẻ xâm lược. Nếu “cuộc chiến“ thắng lợi, tế bào gan tổn thương sẽ được thay thế bằng những tế bào khỏe mạnh và bệnh nhân sẽ được phục hồi. Nhưng ở một số người, hệ miễn dịch không loại trừ được virus và họ trở thành người mang virus viêm gan B mãn tính. Khoảng 10% số người nhiễm virus B rơi vào trường hợp này. Trong các trường hợp xấu nhất, các tế bào gan bị virus phá hoại bị thay thế bằng các mô sợi bất thường, dẫn đến xơ gan và ung thư gan. Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Võ Thị Hải Yến 11 Trên bản đồ dịch tễ của thế giới, tỷ lệ dân số Việt Nam mang kháng nguyên HBsAg (chứng tỏ nhiễm HBV) là trên 8%, xếp vào hàng các quốc gia có tỷ lệ nhiễm HBV cao nhất thế giới. Nhận định này cũng được một số công trình nghiên cứu về dịch tễ học trong và ngoài nước xác nhận. Không phải tất cả các trường hợp nhiễm HBV đều cần phải được đặt ra vấn đề phải điều trị vì đa số bệnh nhân đều có thể tự khỏi nhờ cơ thể có thể tạo ra đáp ứng miễn dịch bằng kháng thể bảo vệ là kháng thể kháng kháng nguyên bề mặt của virus. Tuy nhiên vẫn có một tỷ lệ người nhiễm HBV cần phải được điều trị đặc hiệu bằng thuốc kháng virus một khi có dấu hiệu viêm gan mãn tính và lượng virus tăng cao. Hình 1.5. Sự phân bố HBsAg trên thế giới [25] 1.4. Đường lây của HBV, triệu chứng lâm sàng, biện pháp phòng ngừa và điều trị HBV [4],[8],[19] 1.4.1. Đường lây của HBV Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Võ Thị Hải Yến 12 Phương thức lây nhiễm chủ yếu trong viêm gan siêu vi B là lây qua đường tiêu hóa. Sự lây nhiễm sẽ dễ dàng xảy ra khi trong máu hoặc trong dịch tiết của người bệnh đã nhiễm có nồng độ siêu vi B rất cao và khi người bệnh tiếp xúc thường xuyên với các yếu tố nguy cơ trong một thời gian dài. Mặt khác, đa số những người mang siêu vi B mãn tính thường không có triệu chứng và họ không hề hay biết để dự phòng nguy cơ lây nhiễm cho những người xung quanh. Về phương diện dịch tễ học, người ta ghi nhận có ba phương cách lây nhiễm chính: v Lây truyền qua đường ngoài tiêu hóa do tiếp xúc với máu, các vật phẩm của máu Cách lây nhiễm này thường gặp ở các nhân viên y tế, người được truyền máu nhiều lần, người mắc bệnh máu khó đông và được lọc máu ngoài thận,… Ngoài ra, bệnh còn có thể lây qua đường tiêm chích hoặc khi sử dụng các dụng cụ không đảm bảo vô khuẩn như phẫu thuật, nội soi đường tiêu hóa, châm cứu, xỏ lỗ tai, xăm mình, chữa răng và nhất là những người nghiện ma túy sử dụng chung ống tiêm. HBV có tính đề kháng tương đối và bền vững khi được bảo quản ở nhiệt độ -20oC trong nhiều năm, có thể tồn tại ở 60oC trong bốn giờ. v Lây truyền qua đường tình dục Máu và các chất dịch của cơ thể như nước bọt, tinh dịch hoặc dịch âm đạo đều chứa virus. v Lây truyền từ mẹ sang con HBV được lây truyền chủ yếu trong lúc sanh hơn là lúc lây qua nhau thai. Mức độ nặng và tiên lượng của tình trạng lây nhiễm này tùy thuộc vào hai yếu tố: mức độ nhân đôi của siêu vi và thời gian bị nhiễm HBV cấp tính ở mẹ. Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Võ Thị Hải Yến 13 1.4.2. Triệu chứng lâm sàng - Viêm gan cấp tính Thời gian ủ bệnh từ 1 - 6 tháng. Một số bệnh nhân có cảm giác như bị cảm nhẹ, đôi khi không biết mình bị HBV. Một số khác bị vàng da, mệt mỏi, đau nhức, buồn ói, chán ăn, sốt nhẹ, biến đổi cảm giác (hiện tượng đặc biệt là người ghiền thuốc lá tự nhiên không thích mùi thuốc lá), đau bụng (dưới sườn bên phải). Những trường hợp bị viêm nặng sẽ đưa đến gan to, ngầy ngật, khó ngủ, mê muội, lãng trí hoặc bất tỉnh. Biểu hiện lâm sàng: tăng nhiệt độ, vàng da (một tuần sau khi bị nhiễm và có thể kéo dài đến 1 - 3 tháng), gan to, lách to. Hiếm khi thấy bàn tay ửng đỏ hoặc “spider nevi” (mạch máu li ti kết tỏa thành hình nhện như hoa thị trên da). - Viêm gan mãn tính Phần lớn khi bị viêm mãn tính bệnh nhân hoàn toàn bình thường. Một số bị viêm mãn tính nặng thì tiếp tục bị các triệu chứng viêm cấp như mệt mỏi, chán ăn, đau bụng và suy gan. Biểu hiện lâm sàng: gan to, bàn tay ửng đỏ. Khi bị biến chứng sơ gan có thể bị ứ nước trong bụng, vàng da, loãng máu, chảy máu trong dạ dày, tĩnh mạch tỏa lớn từ rốn (do tăng áp làm giãn tĩnh mạch cửa gan), nam vú lớn như vú nữ, tinh hoàn teo nhỏ (vì gan yếu làm thay đổi cân bằng của các hormone giới tính). 1.4.3. Biện pháp phòng ngừa và điều trị HBV v Phòng bệnh Tiêm chủng vaccine: Sau khi tiêm vaccine, để đánh giá được hiệu quả bảo vệ của chúng cần làm xét nghiệm anti-HBsAg để phát hiện kháng thể chống virus đã được hình thành. Khi người bệnh xét nghiệm HBsAg [+] thì không được tiêm vaccine nữa. Hiện Việt Nam đã có vaccine viêm gan thế hệ III mới nhất Sci-B-Vac có độ an toàn và tính hiệu quả cao hơn trước rất nhiều. Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Võ Thị Hải Yến 14 Tuyệt đối không dùng chung các dụng cụ có thể gây xây xát da, niêm mạc (dao cạo, bàn chải răng, dụng cụ y tế … hoặc truyền máu) để tránh lây lan từ người bệnh. Quan hệ tình dục có bảo vệ, có thể ngăn chặn sự lây nhiễm HBV. v Điều trị Khi mắc bệnh viêm gan B, thường sẽ xét nghiệm một mẫu máu của bệnh nhân để tìm các dấu hiệu của bệnh gan. Hai yếu tố sẽ xem xét kĩ lưỡng là lượng siêu vi (lượng HBV-DNA) lưu thông trong máu, và các enzyme của gan có thể cho biết tình trạng tổn thương gan. Kiểm soát lượng siêu vi trong máu, duy trì lượng enzyme ở mức bình thường, và tăng cường hệ miễn dịch của bệnh nhân để ngừa bệnh hiệu quả. Hiện nay, có các loại thuốc giúp có tác dụng chữa bệnh viêm gan B, nhưng không thể chữa khỏi được. Các loại thuốc này được gọi là interferon và thuốc kháng siêu vi. - Interferon Interferon, một chất đạm tự nhiên trong cơ thể, có tác dụng tăng cường hệ miễn dịch để ngừa bệnh. Các nhà nghiên cứu đã bào chế các loại interferon tổng hợp có tác dụng giúp hệ miễn dịch chống viêm nhiễm trong gan và tăng lượng kháng thể chống loại siêu vi này. Interferon có thể giúp cải thiện tình trạng sức khỏe lá gan và giảm bớt lượng siêu vi trong gan. Việc điều trị bằng interferon thường diễn ra trong một thời gian nhất định, thường là vài tháng, và có thể giúp cải thiện vĩnh viễn tình trạng sức khỏe của gan mà không gây ra triệu chứng kháng siêu vi. Chính vì vậy, interferon là biện pháp điều trị tốt nhất được nhiều người lựa chọn đầu tiên, do nó có hoạt tính chống virus và kích thích hệ miễn dịch. - Thuốc kháng siêu vi Thuốc kháng siêu vi (dạng thuốc viên hoặc thuốc nước) can thiệp vào quá trình tái tạo HBV để ngăn chặn tình trạng tái tạo siêu vi HBV mới. Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Võ Thị Hải Yến 15 Có bốn loại thuốc kháng siêu vi đã được Cơ quan Quản lý Dược phẩm và Thực phẩm Hoa Kỳ (FDA) chấp nhận. Các loại thuốc kháng siêu vi khác nhau ở chỗ, chúng chú trọng tới một bộ phận khác nhau trên bộ gene của siêu vi. Tuy nhiên, dần dần HBV có thể phát sinh các đột biến giúp siêu vi này tiếp tục sinh sôi bất kể điều trị bằng thuốc viên kháng siêu vi. Hiện tượng này gọi là “kháng” siêu vi, vì siêu vi có thể “kháng lại” thuốc kháng siêu vi. Các loại thuốc kháng siêu vi có thể có tác dụng trong một thời gian để giảm bớt lượng siêu vi và mức enzyme, tuy nhiên khi hiện tượng kháng thuốc xảy ra thì các mức này lại bắt đầu tăng cao. Các nhà nghiên cứu vẫn chưa bào chế được loại thuốc kháng siêu vi hoặc biện pháp điều trị kết hợp hoàn hảo có tác dụng xóa bỏ hoàn toàn HBV. Các loại thuốc kháng siêu vi hiếm khi tạo ra các triệu chứng là phản ứng phụ. Hiện nay FDA chấp nhận 5 thuốc để điều trị viêm gan mãn virus B: interferon alpha-2b (1992), lamivudine (1998), adefovir dipivoxil (2002) và entecavir (2005) và peginterferon alpha-2a (tháng 5-2005). 1.5. Các phương pháp chẩn đoán bệnh viêm gan siêu vi B 1.5.1. Phương pháp huyết thanh học (phát hiện kháng thể) và hóa miễn dịch (phát hiện kháng nguyên) [5] HBV cũng tạo ra kháng nguyên “e” hay HBeAg, được phóng thích vào máu và phát hiện bằng thử nghiệm huyết thanh học. Sự hiện diện HBeAg và DNA virus lưu hành trong máu là một dấu hiệu chỉ điểm virus đang tăng sinh và có độ gây nhiễm rất cao. Khi tình trạng nhiễm trùng phục hồi, HBeAg và HBsAg không còn trong máu, và có dấu hiệu chuyển đổi huyết thanh: xuất hiện các kháng thể anti-HBe và anti-HBs. Vì vậy, dựa vào nguyên lý tính đặc hiệu kháng nguyên – kháng thể có thể chẩn đoán HBV bằng kỹ thuật ELISA. Các bước cơ bản: - Kháng nguyên - antigen (KN) chưa biết, được gắn trên một bề mặt. Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Võ Thị Hải Yến 16 - Kháng thể - antibody (KT) biết trước. Kháng thể này được gắn kết với enzyme. - Thêm vào một cơ chất (subtance), enzyme sẽ biến đổi cơ chất này và tạo tín hiệu có thể xác định được. - Đối với các ELISA phát quang, ánh sáng sẽ được phát ra từ mẫu chứa KN - KT. Sự hiện diện của phức hợp KN - KT sẽ quyết định cường độ sáng phát ra. Với nguyên lý trên, ELISA giúp xác định sự có mặt hay không có mặt cũng như lượng KN trong mẫu nghiên cứu. Nhưng phương pháp này rất hạn chế do KN không đặc hiệu sẽ ảnh hưởng đến kết quả xét nghiệm. 1.5.2. Phương pháp sinh học phân tử 1.5.2.1. Phương pháp khuếch đại tín hiệu bằng DNA nhánh (bDNA) [8] Là phương pháp phát hiện và định lượng DNA (hoặc RNA) bằng kỹ thuật lai và khuếch đại tín hiệu trên pha rắn là các giếng thử nghiệm. Phương pháp được thực hiện theo các bước sau: (1) HBV-DNA nếu có trong mẫu thử sẽ lai với các đoạn dò đích (target probes), có hai loại: một loại có đầu đặc hiệu với đoạn dò tóm bắt, một loại có đầu đặc hiệu với DNA nhánh (bDNA). (2) Trên bề mặt của các giếng thử nghiệm có gắn các đoạn dò tóm bắt (capture probes). Các đoạn dò này sẽ tóm bắt các đoạn dò đích, đã được lai với HBV-DNA, nhờ đó đã tóm bắt HBV-DNA lên giếng thử nghiệm. (3) Các đoạn dò đích, đã lai với HBV-DNA, có đầu đặc hiệu bDNA vẫn được tự do sẽ được lai với bDNA. (4) Các nhánh của bDNA sẽ được lai với các đoạn dò phát hiện đã đánh dấu enzyme Alkaline phosphatase, nhờ đó phát hiện được sự hiện diện của HBV-DNA đã bị tóm bắt trên giếng. Phương pháp này có thể phát hiện một lượng tối thiểu là 7.105 phân tử DNA trong một ml máu. Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Võ Thị Hải Yến 17 Hình 1.6. Nguyên lý phát hiện HBV bằng phương pháp bDNA [14] Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Võ Thị Hải Yến 18 1.5.2.2. Phương pháp PCR [1],[3],[22] v Nguyên tắc Đây là một kỹ thuật tạo dòng in vitro, không cần sự hiện diện của tế bào, cho phép khuếch đại một đoạn DNA nằm giữa hai vùng trình tự oligonucleotide đã biết trước. Hai trình tự oligonucleotide này được gọi là mồi xuôi - bắt cặp với mạch [+] DNA và mồi ngược bắt cặp với mạch [-] DNA. Một phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm ba giai đoạn: - Giai đoạn biến tính Nhiệt độ phản ứng là 94oC trong 30 giây đến 1 phút, làm cho phân tử DNA biến tính tách ra làm đôi hoàn toàn, tất cả hoạt động của các enzyme đều dừng lại, phân tử DNA duỗi thẳng ra hoàn toàn, từ đó dễ dàng cho việc bắt cặp và gắn các Nu vào mạch đơn đó theo nguyên tắc bổ sung. - Giai đoạn bắt cặp Các primer (đoạn mồi) là các đoạn Nu ngắn (khoảng 20 - 25 Nu) sẽ bắt cặp vào các chuỗi đơn DNA sau khi biến tính theo nguyên tắc bổ sung. Sự bắt cặp này sẽ có hai ý nghĩa đặc hiệu: đặc hiệu theo nguyên tắc bổ sung với đoạn gene mà ta cần khuếch đại và đặc hiệu theo chiều dài của đoạn gene khuếch đại. - Giai đoạn kéo dài Sau khi primer bắt cặp đặc hiệu với các mạch đơn DNA, nhờ tác dụng của enzyme Taq polymerase ở điều kiện thích hợp sẽ gắn các Nu vào các primer theo nguyên tắc bổ sung, từ đó làm cho đoạn mồi dài ra và hình thành nên một mạch đơn mới bổ sung với mạch đơn cũ. Và một bản sao DNA mới đã được hình thành. Như vậy, sau giai đoạn này ta có được hai phân tử DNA có cấu trúc giống hệt như phân tử DNA ban đầu. Chu kỳ này được lặp lại nhiều lần (30-40 lần), kết quả từ một số lượng DNA đích ban đầu (N), sau n chu kỳ sẽ tạo thành N x 2n bản sao. Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Võ Thị Hải Yến 19 Hình 1.7. Nguyên lý PCR [9] v Các thành phần trong phản ứng PCR Một phản ứng PCR thường gồm 6 thành phần cơ bản sau: - DNA mạch khuôn DNA mạch đôi hay mạch đơn đều có thể là nguồn vật chất ban đầu cho phản ứng PCR, chúng được tách chiết từ tế bào thực vật, động vật, vi khuẩn hoặc virus. Ngoài ra, RNA cũng là một nguồn vật liệu cho phản ứng khuếch đại nếu nó được phiên mã ngược thành cDNA. Nồng độ DNA ban đầu trong phản ứng không cần quá cao, có thể chỉ cần một phân tử DNA ban đầu cho Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Võ Thị Hải Yến 20 một phản ứng. Thông thường, nồng độ DNA ban đầu tốt nhất cho phản ứng PCR ở khoảng 105 bản sao/phản ứng. - Mồi Đây là một trong những yếu tố quan trọng nhất trong phản ứng PCR, có vai trò làm mồi cho hoạt động kéo dài mạch của DNA polymerase. Do đó, việc thiết kế mồi phải được tiến hành thật chính xác, tránh ảnh hưởng đến hiệu quả và độ chuyên biệt của phản ứng PCR. Nồng độ mồi trong mỗi phản ứng PCR phải được tính toán tối ưu bằng thực nghiệm. Nếu nồng độ mồi quá cao sẽ dẫn đến hiện tượng khuếch đại kí sinh, ngược lại sẽ làm hiệu quả khuếch đại của phản ứng không cao. Giới hạn nồng độ mồi thường là 0.1 - 1µl. Mồi thiết kế phải tuân thủ những nguyên tắc sau: · Tm của mồi “xuôi” và mồi “ngược” không khác nhau quá 5oC. · Tránh sự bắt cặp bổ sung giữa mồi “xuôi” và mồi “ngược”. · Tránh các cấu trúc “kẹp tóc” trong thành phần mỗi mồi. · Thành phần nucleotide của mồi phải cân bằng. · Tránh các cặp GC lặp đi lặp lại nhiều lần. · Thành phần GC khoảng 40 - 60%. · Trình tự mồi phải đặc trưng cho trình tự DNA cần nhân bản. - Enzyme chịu nhiệt Taq polymerase Enzyme này có thể chịu được nhiệt độ tới 95oC. Một phản ứng PCR từ 25 - 50µl thông thường có liều lượng Taq polymerase nằm trong giới hạn từ 0.5 - 2.5 đơn vị. - MgCl2 Có vai trò là một cofactor cho enzyme DNA polymerase hoạt động. Ngoài ra, mồi; DNA bản mẫu; dNTPs; EDTA cũng có thể liên kết với MgCl2 và do đó sẽ cạnh tranh với DNA polymerase. Nếu nồng độ MgCl2 cao sẽ dẫn Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Võ Thị Hải Yến 21 đến hiện tượng khuếch đại kí sinh. Vì vậy, phải thiết kế nồng độ MgCl2 tối ưu nhất cho từng phản ứng PCR cụ thể, thông thường là từ 1.5 - 4mM. - Dung dịch đệm PCR Dung dịch này có vai trò cung cấp những ion cần thiết cho phản ứng xảy ra. Tùy theo nguồn DNA polymerase mà nồng độ và pH của dung dịch đệm cũng như nồng độ KCl tối ưu sẽ thay đổi cho phù hợp. Thông thường, một phản ứng PCR sẽ có dung dịch đệm điển hình là: 50mM KCl, 10mM Tris - HCl, pH 8.3 ở nhiệt độ phòng. - dNTPs (deoxyribonucleotide triphosphate) Gồm bốn loại nucleotide được dùng trong phản ứng PCR là: dATP, dTTP, dGTP, dCTP. Nồng độ của mỗi loại nu trong mỗi phản ứng (với nồng độ MgCl2 1.5mM) là 200-250µl. 1.5.2.3. Phương pháp Real-time PCR [6] ü Nguyên lý của Real-time PCR Real-time PCR kiểm soát lượng huỳnh quang giải phóng ra trong phản ứng, từ đó có thể biết được lượng sản phẩm PCR trong từng thời điểm (chu kỳ) của quá trình khuếch đại, trái ngược với PCR truyền thống chỉ biết được lượng sản phẩm được khuếch đại ở thời điểm cuối cùng của phản ứng khuếch đại. - Real-time PCR là một phản ứng động, cho phép phát hiện “huỳnh quang phát ra nhờ sự khuếch đại của sản phẩm PCR” tại mỗi chu kỳ của phản ứng PCR. - Phân tích kết quả phản ứng mà không cần bước điện di trên gel. - Phân tích kết quả huỳnh quang phát ra theo thời gian tại mỗi chu kỳ phản ứng PCR bằng máy tính. Các đặc tính của Real-time PCR Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Võ Thị Hải Yến 22 - Thiết bị Real-time PCR khác thiết bị PCR chỉ đơn giản bằng cách bổ sung thêm thiết bị quang học vào máy PCR thông thường. - Bổ sung cơ chất huỳnh quang vào hỗn hợp phản ứng và tiến hành phản ứng PCR bằng máy Real-time PCR. - Phản ứng huỳnh quang tại mọi điểm xác định nhờ thiết bị quang học. ü Hiện nay có bốn kiểu phản ứng được sử dụng trong kỹ thuật Real-time PCR với độ nhạy tương đương. Cả bốn phương pháp đều sử dụng các chất nhuộm phát huỳnh quang (fluorescent dye), có sự kết hợp bước nhân bản và phát hiện sản phẩm PCR mục tiêu nhằm theo dõi hàm lượng sản phẩm PCR mục tiêu theo thời gian thật (real-time) của phản ứng. Phương pháp đơn giản nhất là sử dụng một chất hóa học phát huỳnh quang có khả năng gắn vào phân tử DNA mạch đôi. Ba phương pháp còn lại sử dụng các probe có đánh dấu bằng chất huỳnh quang để lai đặc hiệu với sản phẩm PCR mục tiêu. v Molecular beacon Loại mẫu dò này có cấu trúc dạng vòng và cuống. Phần cấu trúc dạng vòng sẽ bắt cặp bổ sung đặc hiệu với trình tự DNA mục tiêu, còn phần cấu trúc dạng cuống được tạo thành từ các base nằm ở hai đầu mút của mẫu dò bắt cặp bổ sung với nhau nhờ liên kết hydro. Một đầu mẫu dò sẽ được gắn một chất hóa học phát huỳnh quang, đầu kia được gắn một chất hóa học khác có nhiệm vụ “dập tắt” (quencher) bằng cách làm tiêu giảm năng lượng dưới dạng nhiệt mà nó nhận được từ chất phát huỳnh quang, ngăn cản ánh sáng huỳnh quang không phát ra. Ở trạng thái tự do trong không gian, phần cấu trúc dạng cuống làm cho hai đầu của mẫu dò gần nhau, lúc đó phần quencher sẽ phát huy tác dụng. Nhưng khi bắt cặp bổ sung đặc hiệu với một trình tự mục tiêu, dạng vòng cuống của mẫu dò sẽ mất đi và trở thành dạng thẳng, khoảng cách giữa chất phát huỳnh quang và mẫu dò gia tăng làm cho chất huỳnh quang có Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Võ Thị Hải Yến 23 khả năng phát sáng, lúc đó các thiết bị chuyên dụng sẽ tiếp nhận và phân tích tín hiệu. Molecular beacon có tính đặc hiệu rất cao do yêu cầu của chúng về khả năng bắt cặp bổ sung với trình tự DNA là tuyệt đối. Vì xét về mặt nhiệt động học, sự hình thành cấu trúc kẹp tóc ở beacon thuận lợi hơn sự hình thành các phân tử lai không hoàn chỉnh, nếu beacon không bắt cặp bổ sung hoàn toàn với trình tự mục tiêu, hiện tượng lai sẽ không xảy ra, và đương nhiên tín hiệu huỳnh quang sẽ không có. Việc thiết kế mẫu dò dạng beacon rất khó và quan trọng, trình tự nucleotide trong phần cấu trúc dạng cuống phải được thiết kế sao cho quencher và chất phát huỳnh quang phải tiếp xúc với nhau, nếu không sẽ làm một phần ánh sáng huỳnh quang phóng thích không đặc hiệu dẫn đến sai lệch trong kết quả định lượng. Mặt khác, các liên kết trong cấu trúc dạng cuống không được quá mạnh, như thế sẽ làm cản trở sự bắt cặp giữa beacon và trình tự DNA mục tiêu. Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Võ Thị Hải Yến 24 Hình 1.8. Tóm tắt cơ chế hoạt động của Beacon probe trong Real-time PCR [7] Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Võ Thị Hải Yến 25 v Chất nhuộm gắn với DNA mạch đôi Chất nhuộm này gắn với mọi phân tử DNA mạch đôi và chỉ phát tín hiệu huỳnh quang khi gắn vào chúng. Cường độ huỳnh quang phát ra của chất nhuộm này tỷ lệ thuận với hàm lượng DNA có trong phản ứng PCR. Hai chất nhuộm phát huỳnh quang thường được sử dụng là SYBR Green I và Ethidium bromide. Trong phản ứng PCR, các chất nhuộm sẽ gắn vào DNA mạch đôi mới được tổng hợp trong bước kéo dài và rời ra khi các phân tử DNA bị biến tính. Nhược điểm của phương pháp này phản ứng sẽ cho kết quả định lượng không chính xác nếu có sản phẩm ký sinh. v Mẫu dò đôi (Hybridization probe) Phương pháp này có độ đặc hiệu rất cao do việc sử dụng cùng lúc hai mẫu dò bắt cặp với trình tự DNA mục tiêu. Một mẫu dò sẽ gắn chất cho huỳnh quang (fluorescein donor) ở đầu 3’ phát ánh sáng xanh, một mẫu dò sẽ gắn chất nhận huỳnh quang (fluorescein accepter) ở đầu 5’ và luôn chặn ở đầu 3’ DNA sao cho Taq polymerase không thể kéo dài mạch từ đầu này. Trong dung dịch phản ứng, khi chất cho và chất nhận cách xa nhau thì tín hiệu nền là tín hiệu huỳnh quang do chất cho phát ra (màu xanh), nhưng khi có sự bắt cặp xảy ra, hai mẫu dò sẽ được sắp xếp sao cho phần đầu của mẫu dò này tiếp xúc với phần cuối của mẫu dò kia, lúc đó chất nhận huỳnh quang sẽ phát ra một ánh sáng huỳnh quang mới có bước sóng lớn hơn ánh sáng mà nó nhận được (màu đỏ) nhờ hiệu ứng FRET (sự chuyển năng lượng huỳnh quang kiểu cộng hưởng). Cường độ ánh sáng huỳnh quang phát ra tỷ lệ thuận với hàm lượng DNA trong mẫu. Ưu điểm của phương pháp này là việc thiết kế mẫu dò tương đối linh động, dễ dàng hơn so với việc thiết kế beacon. Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Võ Thị Hải Yến 26 Hình 1.9. Tóm tắt cơ chế hoạt động của probe đôi trong Real-time PCR [7] Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Võ Thị Hải Yến 27 v Mẫu dò thủy giải (Hydrolysis probe) Còn được gọi là Taqman probe. Mẫu dò này được gắn một chất phát huỳnh quang (reporter) ở đầu 5’ và một chất “dập tắt” huỳnh quang (quencher) ở đầu 3’ sao cho ánh sáng huỳnh quang phát ra bị hấp thu bởi quencher. Trong phản ứng PCR, mẫu dò này sẽ bắt cặp bổ sung đặc hiệu với trình tự DNA mục tiêu, khi Taq polymerase kéo dài mạch bổ sung từ đầu 3’ của mồi đến tiếp xúc với mẫu dò, nó sẽ thể hiện hoạt tính 5’ - 3’ exonuclease là loại bỏ các nucleotide ở đầu của mẫu dò và thay bằng nucleotide mới. Khi đó, chất phát huỳnh quang sẽ tách rời khỏi mẫu dò và phát tín hiệu, còn quencher bị mất tác dụng dập tắt. Ánh sáng huỳnh quang phát ra sẽ tương ứng với hàm lượng sản phẩm PCR có trong phản ứng. Taqman probe có tính đặc hiệu cao, chỉ bắt cặp và phát tín hiệu nếu trình tự bổ sung với mạch khuôn là hoàn toàn, vì vậy các sản phẩm ký sinh nếu có cũng không được phát hiện. Thông thường, Taqman probe có nhiệt độ nóng chảy (Tm) cao hơn cặp mồi từ 8 - 10oC nhằm tạo điều kiện cho việc bắt cặp và thủy giải mẫu dò bởi Taq polymerase. Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Võ Thị Hải Yến 28 Hình 1.10. Tóm tắt cơ chế hoạt động của Taqman probe trong Real- time PCR [7] Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Võ Thị Hải Yến 29 ü Một số điều lưu ý khi thực hiện phản ứng Real-time PCR - Kích thước sản phẩm PCR trong phản ứng Real-time PCR Chiều dài tối ưu của sản phẩm PCR trong phản ứng Real-time PCR thường nhỏ hơn 100bp. Đôi khi có thể tăng kích thước sản phẩm nhân bản đến 400bp trong một số trường hợp với Taqman probe. Sản phẩm PCR có kích thước ngắn, nhân bản hiệu quả hơn và chịu các điều kiện bất lợi của phản ứng tốt hơn so với các sản phẩm có kích thước dài có thể biến tính ở nhiệt độ 92oC và chỉ cần 15 giây để Taq polymerase tổng hợp hoàn toàn một mạch mới bổ sung. - Probe Người ta thường thiết kế probe trước khi thiết kế cặp primer. Cặp primer được thiết kế phải nằm gần với vị trí của probe nhưng không được trùng lắp. Thành phần GC trong trình tự nucleotide của probe phải nằm trong khoảng 20 - 80%. Cần tránh các nucleotide lặp lại trong trình tự của probe, đặc biệt là G. Nhiệt độ nóng chảy của probe phải lớn hơn nhiệt độ nóng chảy của cặp primer từ 8 - 10oC nhằm bảo đảm cho việc bắt cặp hoàn toàn với mạch DNA khuôn trong bước bắt cặp và kéo dài của chu kỳ PCR. Trình tự probe không nên có G ở đầu 5’ vì G sẽ có thể hấp thu ánh sáng huỳnh quang ngay cả khi mẫu đã bị thủy giải bởi Taq polymerase. Nếu phải chọn probe có nhiều GC thì nên chọn mạch bổ sung với probe có nhiều C hơn G để làm tăng cường độ phát huỳnh quang trên cường độ huỳnh quang của nền phản ứng. - Cặp primer Được thiết kế sao cho kích thước của sản phẩm PCR trong khoảng 50 - 150bp. Thành phần GC của cặp primer giống như thành phần GC của probe, khoảng 20 - 80%. Cần tránh các nucleotide lặp lại trong trình tự của primer, Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Võ Thị Hải Yến 30 đặc biệt là G, nếu có 4G hoặc hơn nữa lặp lại thì phải loại bỏ. Nhiệt độ nóng chảy của các cặp primer trong khoảng 58 - 60oC, thấp hơn nhiệt độ nóng chảy của probe từ 8 - 10oC. Thành phần 5 nucleotide cuối cùng của đầu 3’ không nên có hơn 2G hoặc C nhằm tránh hiện tượng nhân bản ký sinh trong phản ứng PCR. - Khái niệm chu kỳ ngưỡng (threshold cycle) Khái niệm chu kỳ ngưỡng (Ct) là khái niệm trung tâm của kỹ thuật Real- time PCR. Nguyên tắc của kỹ thuật này dựa vào đường cong chuẩn (standard curve) được xây dựng từ các giá trị chu kỳ ngưỡng của các mẫu dò đã có nồng độ nucleic acid biết trước. Chu kỳ ngưỡng của một mẫu được định nghĩa là chu kỳ mà tại đó tín hiệu huỳnh quang của mẫu vượt lên tín hiệu huỳnh quang nền của phản ứng PCR và được các thiết bị cảm biến thu nhận. Chu kỳ ngưỡng rơi vào pha lũy thừa của phản ứng PCR. Vì vậy, việc định lượng trong phản ứng là chính xác vì không chịu bất kỳ ảnh hưởng nào từ pha bão hòa (plateau phase) của phản ứng PCR. Các mẫu có nồng độ nucleic acid ban đầu lớn thì sẽ có Ct nhỏ và ngược lại. Tín hiệu huỳnh quang nền được tạo ra trong phản ứng Real-time PCR là do các chất phát huỳnh quang có nồng độ xác định có sẵn trong thành phần phản ứng PCR. Chất phát huỳnh quang này khác với chất phát huỳnh quang được sử dụng để định lượng. Trong phản ứng Real-time sử dụng Taqman probe thì chính quencher của Taqman probe sẽ đóng vai trò tạo tín hiệu nền cho phản ứng. - Thiết kế đường cong chuẩn (standard curve) cho phản ứng Real-time PCR Việc định lượng trong phản ứng Real-time PCR được thực hiện bằng cách so sánh hàm lượng sản phẩm PCR của mẫu xét nghiệm với hàm lượng sản phẩm PCR từ các mẫu chuẩn có nồng độ đã biết được nhân bản đồng thời. Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Võ Thị Hải Yến 31 Các thiết bị thực hiện phản ứng Real-time PCR sẽ tự động xây dựng đường cong chuẩn dựa trên chu kỳ ngưỡng (Ct) của các mẫu có nồng độ nucleic acid biết trước (các mẫu chuẩn - standard sample). Sau đó, nồng độ của các mẫu xét nghiệm sẽ được tính toán trên đường cong chuẩn này. - Tính lặp lại (reproducibility) của phản ứng Real-time PCR Kết quả phản ứng PCR thường biến động, thay đổi từ lần này sang lần khác, nhưng phản ứng Real-time PCR lại có tính lặp lại rất cao. Nguyên nhân của sự khác biệt này là thời điểm phân tích kết quả. Real-time PCR phân tích kết quả theo thời gian thật (real-time), chu kỳ ngưỡng của phản ứng lại luôn rơi vào pha lũy thừa - là pha mà phản ứng xảy ra thuận lợi nhất. Trong khi đó, kết quả của phản ứng PCR thông thường chỉ được phân tích khi phản ứng kết thúc, thường là vào pha bão hòa của phản ứng. Như vậy, bất kỳ một biến đổi nhỏ nào ở pha lũy thừa cũng sẽ dẫn đến những khác biệt rất lớn trong pha bão hòa của phản ứng PCR thông thường. ü Biểu đồ khuếch đại của Real-time PCR: [7] Biểu đồ khuếch đại của Real-time PCR có: trục tung (Y) là cường độ huỳnh quang phát ra từ ống phản ứng khi nhận ánh sáng kích thích, còn trục hoành (X) là các chu kỳ nhiệt. Qua biểu đồ bên dưới ta có thể thấy đối với từng ống phản ứng thì cường độ huỳnh quang mà máy ghi nhận được trong những chu kỳ đầu là rất thấp và hầu như không thay đổi, nó hiển thị trên một đường thẳng nằm ngang và có thể gọi là “giai đoạn ủ” (hoặc giai đoạn phục hồi), vì trong giai đoạn này DNA đã được nhân bản thành các bản sao nhưng số lượng bản sao chưa đủ để giúp cho chất phát huỳnh quang nhận được ánh sáng kích thích để phát ra ánh sáng huỳnh quang đủ cường độ để máy ghi nhận. Khi số lượng bản sao của DNA đạt đến lượng khuếch đại nhất định thì ánh sáng phát ra đủ cường độ để máy ghi nhận, đồng thời đường biểu diễn khuếch đại bắt đầu ngóc lên. Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Võ Thị Hải Yến 32 Cường độ huỳnh quang tỷ lệ thuận với số lượng bản sao của DNA, nên sẽ tăng gấp đôi theo cấp số nhân của lượng bản sao DNA sau mỗi chu kỳ, có thể gọi đây là “giai đoạn lũy thừa” về cường độ huỳnh quang. Cường độ huỳnh quang trong ống phản ứng chỉ tăng đến một mức độ nào đó thì sẽ tăng trưởng chậm lại và đạt “giai đoạn bình nguyên”. Do phản ứng PCR đến giai đoạn kết thúc và đã cạn dần dNTP, và enzyme polymerase không hoạt động nữa. Sau khi hoàn thành quá trình PCR, ta phân tích sẽ thấy một thông số quan trọng luôn đi kèm đó là chu kỳ ngưỡng Ct (threshold cycle). Ở tại chu kỳ ngưỡng (hay chu kỳ nhiệt) này là thời điểm thiết bị Real-time PCR ghi nhận được tín hiệu huỳnh quang phát ra từ ống phản ứng bắt đầu vượt qua cường độ huỳnh quang nền. Chu kỳ ngưỡng được xác định bằng số chu kỳ mà ở đó đường nền (base line) cắt được đường biểu diễn khuếch đại. Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Võ Thị Hải Yến 33 Hình 1.11. Biểu đồ biểu diễn khuếch đại ghi nhận cường độ huỳnh quang phát ra từ ống phản ứng khi nhận được ánh sáng kích thích vào mỗi chu kỳ nhiệt [7] Cường độ huỳnh quang Giai đoạn ủ Pha lũy thừa Giai đoạn bình nguyên Đường biểu diễn khuyếch đại Cường độ huỳnh quang nền Đường nền(base line) Chu kỳ nền Chu kỳ ngưỡng (ct) Chu kỳ nhiệt Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Võ Thị Hải Yến 34 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. Vật liệu thiết bị 2.1.1. Vật liệu sinh học Mẫu thử nghiệm: mẫu huyết thanh. 2.1.2. Thiết bị, dụng cụ Máy Real-time PCR và hệ thống máy tính, phần mềm hỗ trợ. Hình 2.1. Máy ly tâm thu huyết thanh Hình 2.2. Máy Stratagene Mx3000P Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Võ Thị Hải Yến 35 Hình 2.3. Máy ly tâm Hình 2.4. Máy vortex Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Võ Thị Hải Yến 36 Miropipette 0.5-10µl, 20-100µl, 100-1000µl. Tủ cấy vô trùng. Vật liệu tiêu hao: găng tay, khẩu trang, đầu tip có phin lọc, eppendorf. Hình 2.5. Máy ủ nhiệt khô Hình 2.6. Máy ly tâm eppendorf 0.2ml Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Võ Thị Hải Yến 37 2.1.3. Hóa chất v Hóa chất cho tách chiết DNA: - Dung dịch (1): Trizol gồm phenol 38%, guanidine thiocyanat 0.8M, glycerol 5%, pH 8.0. - Dung dịch (2): Chloroform. - Dung dịch (3): Isopropanol tuyệt đối có chứa chất trợ tủa. - Dung dịch (4): Ethanol 70%. - Dung dịch (5): dung dịch TE 1X (Tris 0.1M - EDTA 0.001M). v Hóa chất trong Real-time PCR: - Real-time PCR mix. Thành phần của một phản ứng Real-time PCR 25µl gồm: dung dịch đệm (buffer) 1X, dNTP 200µM, Taq DNA polymerase 0.625 unit, MgCl2 1.5mM, nước cất vô trùng, mồi và mẫu dò. - Mẫu chứng âm (nước cất), chứng dương (chứa virus HBV). - Standard HBV (dùng xây dựng đường chuẩn) + Tube PCR mix chứa standard 102 copies + Tube PCR mix chứa standard 104 copies + Tube PCR mix chứa standard 106 copies Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Võ Thị Hải Yến 38 2.2. Phương pháp tiến hành Hình 2.7. Quy trình phát hiện HBV bằng phương pháp Real-time PCR 2.2.1. Phương pháp thu nhận và xử lý mẫu - Lấy máu tĩnh mạch, lấy lúc đói và buổi sáng là tốt nhất. - Máu chỉ giữ ở 4 - 8oC trong tối đa 4 giờ, sau đó phải tách huyết thanh. Thu mẫu Tách chiết DNA Thu nhận DNA Thực hiện Real-time PCR Phân tích kết quả Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Võ Thị Hải Yến 39 - Lấy 3ml máu bệnh nhân cho vào ống nghiệm thu máu chuyên dụng. - Ly tâm ống nghiệm chứa máu 3000 vòng/phút trong 15 phút. - Thu khoảng 0.5ml huyết thanh chuyển vào tube 1.5ml vô trùng. - Giữ tube huyết thanh ở -20oC cho đến khi tiến hành xét nghiệm. 2.2.2. Phương pháp tách chiết v Nguyên tắc Việc tách chiết DNA bao gồm các bước cơ bản sau: (1) phá màng tế bào, (2) loại protein, (3) tủa DNA. Để thu nhận DNA tinh sạch, người ta cần loại bỏ những thành phần tạp nhiễm, mà quan trọng nhất là protein. Sự tách chiết dựa trên nguyên tắc hòa tan khác nhau của các phân tử khác nhau (nucleic acid/protein) trong hai pha không hòa tan (phenol, chloroform/nước). Các hóa chất dùng trong quy trình tách chiết: phenol; guanidine thiocyanat có trong thành phần dung dịch Trizol, là những chất biến tính protein mạnh, khi xử lý với hai hóa chất này, tế bào sẽ bị phá vỡ và giải phóng các thành phần nội bào: DNA; RNA; protein… Chloroform – thường đi kèm với phenol, có tác dụng bổ sung và loại bỏ hoàn toàn dấu vết phenol, chloroform cũng làm biến tính protein nhưng yếu hơn phenol. Sau khi ly tâm, mẫu xử lý với Trizol sẽ phân tách thành hai lớp: lớp dưới là phenol, lớp trên là nước chứa DNA, phần protein bị biến tính sẽ nằm ở bề mặt phân cách hai lớp này và bị loại bỏ. DNA trong phần dịch nổi ở trên sẽ được thu nhận bằng cách tủa với Isopropanol có bổ sung chất trợ tủa. Chất trợ tủa là một loại polymer có cấu trúc mạng lưới nên dễ dàng bắt được các phân tử DNA, nhưng không ức chế phản ứng PCR. Sau khi tủa, tủa sẽ được rửa lại một lần nữa với Ethanol 70% và cuối cùng sẽ được bảo quản trong TE 1X. v Quy trình thực hiện Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Võ Thị Hải Yến 40 - Cho 200µl mẫu (huyết thanh) vào một eppendorf có sẵn 900µl dung dịch (1), vortex 30s, để yên 10 phút. Thêm vào 200µl dung dịch (2), trộn đều. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút. Mục đích của bước này là phá màng tế bào. - Thu 600µl dịch nổi có chứa DNA vào một eppendorf sạch khác có sẵn 600µl dung dịch (3). Trộn đều, để yên 10 phút. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút. Đây là bước loại protein. - Loại bỏ dịch nổi (protein), thu cặn màu hồng (DNA). Cho từ từ 900µl dung dịch (4) vào. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút. Với mục đích tủa DNA. - Loại bỏ hết dịch nổi, thu cặn. Để khô ở 60oC, 10 phút. Cho vào 50µl dung dịch (5). Cuối cùng là bước tinh sạch, bảo quản. 2.2.3. Phản ứng Real-time PCR Thực hiện phản ứng: - Cho 5µl chứng +, chứng - hoặc dịch DNA tách chiết vào tube Real-time PCR mix. - Trước và sau khi đặt phản ứng PCR phải ly tâm tube để tất cả dung dịch nằm dưới đáy tube. - Đặt vào máy Real-time PCR cùng với một bộ standard . - Cài đặt chương trình định dạng vị trí các mẫu trong block nhiệt của máy, cài đặt chương trình Real-time PCR: 1 chu kỳ: 95oC - 5; 40 chu kỳ: 95oC - 15”, 60oC - 1’ (chọn đọc kết quả tại bước này). Chọn chức năng chờ cho đến khi “Heat lid” đạt 105o thì chương trình luân nhiệt bắt đầu. Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Võ Thị Hải Yến 41 Hình 2.8. Chu trình nhiệt của Real-time PCR Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Võ Thị Hải Yến 42 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN v Phân tích kết quả định lượng HBV dựa vào đường chuẩn bằng phương pháp Real-time PCR Để Real-time PCR xác định được chính xác số lượng bản đích ban đầu có trong mẫu thử nghiệm thì phải thực hiện Real-time PCR các mẫu thử nghiệm chứa các số lượng bản DNA đích ban đầu cần xác định số lượng cùng lúc với các mẫu chuẩn chứa số lượng DNA đích ban đầu đã biết rõ số lượng. Và thường thì các mẫu chuẩn là các mẫu pha loãng theo hệ số pha loãng 10 chứa số lượng DNA đích ban đầu. Sau khi hoàn tất các chu kỳ nhiệt của Real- time PCR, trên biểu đồ khuếch đại, các mẫu chuẩn và các mẫu thử nghiệm sẽ có các đường biểu diễn khuếch đại của nó và tương ứng với các đường biểu diễn khuếch đại này, các mẫu chuẩn và mẫu thử nghiệm đều có một chu kỳ ngưỡng (Ct). Đường biểu diễn vẽ lên mối quan hệ giữa chu kỳ ngưỡng với số lượng bản DNA đích ban đầu có trong các mẫu chuẩn, được gọi là đường biểu diễn chuẩn (standard curve). Đây là một đường thẳng tuyến tính đi qua các điểm tọa độ xác định bởi số lượng bản DNA đích ban đầu của từng mẫu chuẩn (trên trục tung) và chu kỳ ngưỡng của ống phản ứng chứa số lượng bản DNA đích này. Trên biểu đồ chuẩn này, trục tung (Y) là Ct còn trục hoành (X) là số lượng bản DNA đích ban đầu có trong các mẫu chuẩn. Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Võ Thị Hải Yến 43 Định tính Hình 3.1. Đường biểu diễn khuếch đại mẫu thử nghiệm - Mẫu chuẩn dương: dương tính, cho thấy mồi và mẫu dò hoạt động bình thường. - Chứng nội: dương tính, chứng tỏ phản ứng diễn ra bình thường. - Mẫu chứng âm: âm tính, chứng tỏ quy trình được thực hiện tốt, không có hiện tượng nhiễm chéo xảy ra. - Mẫu thử nghiệm: có kết quả dương tính với HBV. Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Võ Thị Hải Yến 44 Định lượng Hình 3.2. Biểu đồ đường chuẩn Qua biểu đồ đường chuẩn ta thấy E=101.7% (nằm trong khoảng 90- 105%), R2=0.999 (≥ 0.99) và độ dốc (slope lý tưởng -3.32) của đường biểu diễn là -3.281. Có thể kết luận đây là biểu đồ chuẩn lý tưởng. - Tính toán số lượng bản sao ban đầu Các mẫu chuẩn và mẫu thử nghiệm đều có một chu kỳ ngưỡng (Ct). Do đã biết số lượng bản sao ban đầu của các mẫu chuẩn, ta có thể xây dựng được phương trình đường chuẩn thể hiện mối tương quan giữa chu kỳ ngưỡng và số lượng bản sao chu kỳ ngưỡng =a*log(số lượng bản sao ban đầu) +b (1) Từ Ct của mẫu xét nghiệm và phương trình (1) ta có thể xác định được số lượng bản sao ban đầu của mẫu xét nghiệm. Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Võ Thị Hải Yến 45 KẾT LUẬN Trước yêu cầu cấp thiết của các nhà nghiên cứu y học, cần phải có một thử nghiệm phát hiện và có thể định lượng được HBV-DNA trong máu của người bệnh nghi nhiễm HBV. Nhờ đó, các nhà nghiên cứu y học mới có thể biết được tình trạng nhiễm HBV thật sự trên người bệnh, cho được chỉ định điều trị đặc hiệu, và theo dõi hiệu quả điều trị. Khóa luận được thực hiện nhằm tìm hiểu quy trình chẩn đoán bệnh viêm gan siêu vi B bằng phương pháp Real-time PCR. Kết quả thu được cho thấy việc sử dụng kỹ thuật Real-time PCR trong chẩn đoán HBV cho độ nhạy cao, kết quả chính xác, ổn định và đặc biệt là có thể áp dụng một cách dễ dàng. Với kết luận trên, hy vọng rằng phương pháp Real-time PCR trong chẩn đoán bệnh viêm gan siêu vi B được sử dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm và trong cả việc theo dõi điều trị bệnh. Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Võ Thị Hải Yến 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt [1] Hồ Huỳnh Thùy Dương. (2002). Sinh học phân tử (khái niệm-phương pháp-ứng dụng). NXB giáo dục. [2] Nguyễn Hữu Chí. Chủng ngừa viêm gan siêu vi B. NXB TPHCM. [3] Lê Thị Hòa. (2010). Xây dựng quy trình phát hiện đồng thời Chlamydia Trachomatis và Nisseria gonorhoeae bằng kỹ thuật Real-time PCR. Đồ án tốt nghiệp đại học. [4] Tạ Hùng Vương, Nguyễn Trần Khánh. (2010). Xác định tỷ lệ HBV Genotyping ở bệnh nhân nhiễm HBV mạn tính tại Việt Nam. Báo cáo thực tập tốt nghiệp. [5] Lưu Phương Nam. (2011). Quy trình định lượng HBV bằng phương pháp Real-time PCR. Báo cáo thực tập tốt nghiệp. [6] Phan Quốc Việt, Hồ Thị Thanh Thủy. (2008). Ứng dụng sinh học phân tử trong chẩn đoán bệnh nhiễm ở người. Tài liệu tập huấn của Công ty Cổ phần Thương mại Sản xuất và Dịch vụ Việt Á. [7] Phạm Hùng Vân. (2009). PCR và Real-time PCR Các vấn đề cơ bản và áp dụng thường gặp. NXB Y học chi nhánh TP.HCM. [8] Lê Thúy Quyên. (1999). PCR-phát hiện và định lượng HBV-DNA. Luận án thạc sĩ khoa học. [9] Bruce Alberts, Alexander Johnson, Julian Lewis, Martin Raff, Keith Roberts, and Peter Walter. (2008). Molecular Biology of the cell. NXB: Taylor & Francis. Tài liệu tiếng Anh Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Võ Thị Hải Yến 47 [10] Welzel TM, Miley WJ, Parks TL, Goedert JJ, Whitby D, Ortiz- Conde BA. (2006 Sep). Real-time PCR assay for detection and quantification of hepatitis B virus genotypes A to G. [11] Monjardino J, Velosa J, Thomas HC, de Moura MC. (1991 Jul). Serum HBV DNA detected by PCR in dot blot negative HBV chronic carriers with active liver disease. [12] Dr. Yamina Lazizi*, Jacques Pillot. (March 1993). Delayed clearance of HBV-DNA detected by PCR in the absence of viral replication. [13] Chien-Hung Chen a, Jin-Town Wang a,b,*, Cha-Ze Lee a, Jin-Chuan Sheu a, Teh-Hong Wang a, Ding-Shinn Chen a,c. (January 1995). Quantitative detection of hepatitis B virus DNA in human sera by branched- DNA signal amplification. [14] Gregory J. Tsongalis, PhD. (2006). Branched DNA Technology in Molecular Diagnostics. Tài liệu Internet [15] |newsid:840 [16] [17] [18] [19] quat-ve-viem-gan-sieu-vi-b [20] [21] [22] [23] [24] [25] Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Võ Thị Hải Yến 48 [26] [27] https://www.qiagen.com/geneglobe/pathwayview.aspx?pathwayID=217