Khóa luận Quy trình chẩn đoán viêm gan C bằng kỹ thuật pcr elisa và Real-Time pcr

đoạn mãn tính: Sau giai đoạn nhiễm cấp tính khoảng 15-25% bệnh nhân sẽ tự loại bỏ tất cả các virus HCV và cơ thể trở lại bình thường như khi chưa nhiễm virus. Tuy nhiên, khoảng hơn 75% các bệnh nhân nhiễm HCV sẽ chuyển sang giai đoan mãn tính. 9 Hình 1.4. Các giai đoạn phát triển bệnh Trong giai đoạn nhiễm mãn tính bệnh nhân thường không có bất kỳ một biểu hiện bệnh lý nào. Giai đoạn này có thể kéo dài từ 20-30 năm hoặc có thể kéo dài hơn trước khi bệnh nhân chuyển thành ung thư gan. Vì thế người bệnh thường không được chẩn đoán và điều trị kịp thời. Nhiều trường hợp bệnh chỉ được phát hiện khi đã có biến chứng nghiêm trọng như : xơ gan với biểu hiện báng bụng (ổ bụng có nước), giãn mạch máu đường tiêu hóa, có thể vỡ gây chảy máu ồ ạt và tử vong. Một biến chứng nữa là ung thư tế bào gan. Khi đã xơ, gan khó hồi phục lại, cho dù tình trạng viêm có thuyên giảm. Vì vậy, các thầy thuốc khuyên nên điều trị sớm nhằm ngăn ngừa hoặc làm chậm tiến triển sang giai đoạn xơ gan. 1.4. Chẩn đoán Chẩn đoán viêm gan do siêu vi C, ngoài các xét nghiệm đánh giá chức năng gan, siêu âm gan ( nhằm nghiên cứu cấu trúc của gan và các bộ phận xung quanh, tìm dấu hiệu xơ gan hoặc biểu hiện bất thường), sinh thiết gan ( Xét nghiệm này cho phép các chuyên gia quan sát tế bào gan dưới kính hiển vi, xác định mức độ viêm nhiễm, chẩn đoán giai đoạn bệnh, đánh giá hiệu quả điều trị.)....thì các xét nghiệm tìm HCV giữ một vai trò rất quan trọng . Anti-HCV: có thể tìm thấy ở 70% trường hợp khi bắt đầu có triệu chứng và khoảng 90% trong vòng 3 tháng sau. Tuy nhiên, nhiều người bị viêm gan C 10 nhưng không có triệu chứng. Anti-HCV không xác định được là đang nhiễm cấp tính, đã lành bệnh (đào thải hết virus) hay chuyển sang giai đoạn mãn tính. HCV RNA : phát hiện trực tiếp siêu vi trong máu, một bằng chứng của nhiễm HCV và virus đang tăng sinh, đồng thời định danh dưới nhóm để lựa chọn phác đồ hợp lý. Có thể phát hiện HCV-RNA trong vòng 1 đến 2 tuần sau khi nhiễm virus. Xét nghiệm này còn được sử dụng để tiên lượng đáp ứng tốt với điều trị. 1.5. Dịch tễ học: Từ khi Choo Q.L phát hiện siêu vi gan viêm gan C năm 1989 đến nay, nhiều nghiên cứu dịch tễ học nhiễm siêu vi C đã được tiến hành để đánh giá tình trạng nhiễm siêu vi C trong cộng đồng, các đường lây nhiễm và diễn tiến các trường hợp bị lây nhiễm. 1.5.1 . Tình trạng nhiễm bệnh viêm gan siêu vi C: [1], [22] Tình hình trên thế giới: Số người bị nhiễm viêm gan siêu vi C trên thế giới là khoảng 170 triệu người, trong đó khu vực Đông Nam Á chiếm tỷ lệ cao với khoảng 32,3 triệu (xem hình 1.5). Con số này cũng đã gia tăng trong những năm gần đây. Virus viêm gan siêu vi C được xem như là kẻ giết người thầm lặng vì bệnh nhân khi mắc phải virus này có thể không có các triệu chứng gì trong khoảng hơn 10 năm trước khi phát triển thành viêm gan mãn tính và ung thư gan. Khoảng 40-50% các trường hợp ghép gan ở Hoa kỳ là do nhiễm virus viêm gan C. Có 6 chủng virus viêm gan C được xác định (HCV1-6) và tùy thuộc vào chủng virus nhiễm mà các đáp ứng trị liệu cũng khác nhau. 11 Hình 1.5. Tình hình nhiễm bệnh viêm gan siêu vi C trên thế giới năm 2002 (đơn vị tính: triệu người) Hình 1.6. Bản đồ phân bố tỷ lệ nhiễm HCV Tình hình trong nước: Hiện nay, ở Việt Nam tỷ lệ nhiễm HCV chiếm từ 1-5% dân số. 1.5.2. Con đường lây bệnh và các biện pháp đề phòng và điều trị bệnh viên gan siêu vi C [1], [21] 1.5.2.1 Con đường lây bệnh HCV lây lan bằng sự tiếp xúc trực tiếp qua máu. Đường truyền bệnh bao gồm việc dùng chung các vật dụng ma túy như kim chích, kim dùng để xâm mình, xỏ da và châm cứu cũng có thể truyền HCV. Dùng chung các vật dụng cá 12 nhân như dao cạo, bàn cải đánh răng, đồ cắt móng tay, tuy ít nguy cơ nhưng vẫn có thể làm lây nhiễm bệnh. Một số ít có thể bị lây nhiễm HCV do sự quan hệ tình dục không an toàn. Các nhân viên y tế cũng có nguy cơ nhiễm bệnh vì những tai nạn việc làm như bị kim đâm hoặc trong những trường hợp không thể tránh được có thể tiếp xúc trực tiếp với máu của người mang bệnh. Những người mẹ bị HCV có thể truyền bệnh cho con vào lúc trước hoặc sau khi sinh. Sự lây truyền này tùy thuộc vào mức độ HCV có trong máu của người mẹ. 1.5.2.2. Các biện pháp phòng ngừa : Cho đến nay vẫn chưa có thuốc chủng ngừa siêu vi viêm gan C. Ngay cả những hy vọng về một loại thuốc chủng ngừa cho căn bệnh này trong tương lai cũng chưa thấy hé mở. Vì 3 lý do sau: + Thứ nhất: siêu vi C có khả năng biến hóa,nhưng đã nói ở phần 1.2.1 cấu tạo HCV, chúng có khả năng thay đổi các đặc tính di truyền bằng cách thay thế những cấu trúc trên nhiễm sắc thể của mình. Điều này chẳng những gây khó khăn cho hệ thống miễn nhiễm trong việc phát hiện và đối phó với chúng, mà còn là nguyên nhân khiến cho việc tìm ra thuốc chủng ngừa bệnh này trở nên cực kỳ khó khăn. + Thứ hai : do siêu vi C không “hoạt động” với bất cứ loài động vật nào khác ngoài con người và một loài tinh tinh (chimpanzee). Vì thế, việc nghiên cứu thử nghiệm rất khó khăn. + Cuối cùng: Khả năng sao chép của siêu vi C trong điều kiện phòng thí nghiệm rất yếu ớt. Vì thế, việc phòng ngừa bệnh viêm gan siêu vi C hiện nay chủ yếu là tập trung vào các biện pháp ngăn chặn từ đầu. Như đã biết, siêu vi viêm gan C lây lan chủ yếu qua sự tiếp xúc trực tiếp với máu của người có bệnh, nên các biện pháp tiệt trùng và chăm sóc thích hợp 13 đối với các vết thương ngoài da như băng bó mọi vết cắt, vết thương sẽ giảm thiểu đáng kể nguy cơ nhiễm bệnh. Tuyệt đối không dùng chung kim chích, các dụng cụ chích ma túy, vật dụng cá nhân hoặc bất cứ thứ gì có thể dính máu. Phải sát trùng đúng cách những dụng cụ dùng để xâm mình, xỏ da và châm cứu. 1.5.1.3 Điều trị: Loại dược phẩm thường dùng để chống lại viêm gan C là interferon, một thuốc ức chế sự nhân lên của virus. Các thuốc interferon dùng để điều trị viêm gan gồm: interferon alfa-2b (Intron A), interferon alfa-2a (Roferon-A) và interferon alfacon-1 (Infegen). Nhưng interferon chỉ có tác dụng ở khoảng 20% số trường hợp. Hiện nay, tiêm interferon thường được phối hợp với uống ribavirin-một thuốc kháng sinh virus phổ rộng. Điều trị thường mất sáu tháng đến một năm và thành công ở khoảng 40% số người bị HCV. Gần đây, một thuốc khác, interferon pegyl hóa (PEG) có hiệu quả gấp hai lần interferon thông thường. Vào tháng 1-2001 Cơ quan quản lý thuốc và dược phẩm Mỹ (FDA) đã cho phép dùng PEG interferon-peginterferon alfa-2b (PEG- Intron) để điều trị viêm gan. Tùy theo loại genotype mà điều trị, tức là kiểu loại di truyền của siêu vi. Xét nghiệm này giúp cho bác sĩ điều trị xác định được là mình đang “đối mặt với ai” để có thể quyết định các phương thức điều trị. Thời gian điều trị bệnh viêm gan C sẽ tùy thuộc vào kết quả của cuộc thử máu này. Nếu genotype được xác định là loại số 1, bệnh nhân cần điều trị khoảng một năm. Nếu là loại số 2 hoặc 3, thời gian sẽ là khoảng 6 tháng. Những loại khác có thể phải điều trị từ 6 đến 12 tháng, tùy theo từng trường hợp. 14 Tên Thuốc Công ty Cơ chế tác động Có trên thị trường PEG-Interferon-alpha (Pegasys®) PEG-Interferron-alpha 2b (Peg-Intron®) Ribavirin Interferon alpha-2a (Roferon-A ) Interferon alpha-2b (Intron® A ) Interferon Đang nghiên cứu Pha III Viramidine(Taribavirin) Interferon –Beta Zadaxin Pha II VX-950 Valoppicitabine (NM283) SCH503034 Albuferon Suvus (Methylene blue) Omega interferon Multiferon Actilon (CPG 10101) Roche Schering-Plough Copegas®(Roche),Rebetol® ( Schering Plough), Ribaphere®, Vilona®,Virazole® Roche Schering-Plough Các hãng thuốc và dạng thuốc generic khác Valeant Pharma Serono SciClone Certex Indenix/Novartis Schering-Plough Human Genome Sciences/Novartis Bioenvision Intarcia Therapeutics Viragen/Valentis Coley Interferron tác động kéo dài Interferon tác động kéo dài Nucleosid ức chế polymerase Hiệp lực với interferon Interferron điều trị viêm gan siêu vi B và một số dạng C Nucleosid ức chế polymerase Tiến dược của ribavirin Interveron-Beta 1a,tác nhân miễn dịch Ức chế NS3 serine protease Nucleosid ức chế polymerase Ức chế NS3 serine protease Interferon-alpha gắn kết với albumin) Xanh methylen Tác nhân miễn dịch Interferon tác động kéo dài,đã sử dụng ở một số quốc gia,ngoại trừ Hoà Kỳ và chau âu Chủ vận TLR9 ( Tác nhận miễn dịch) Bàng 1.1: Các thuốc trên thị trường dùng điều trị viêm gan C và các thuốc có triển vọng [22] 15 1.6. Định lượng RNA-HCV trong huyết thanh 1.6.1.Phương pháp PCR ELISA [8], [15], 17] 1.6.1.1 Định nghĩa: ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay - Xét nghiệm hấp thu miễn dịch liên kết với enzyme) là một kỹ thuật sinh hóa để phát hiện sự hiện diện của kháng nguyên hoặc kháng thể trong mẫu xét nghiệm. Phương pháp này dựa vào nguyên lý tính bắt cặp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể. Do trong thành phần phản ứng có enzyme, khi thêm cơ chất tương ứng, enzyme sẽ biến đổi cơ chất và tạo tín hiệu có thể xác định được. Khi virus viêm gan C vào trong cơ thể thì hệ thống miễn dịch của cơ thể sẽ tạo ra những chất để chống lại việc xâm nhập này, những chất này gọi là kháng thể. Nếu cơ thể có kháng thể (Anti-HCV) có nghĩa là đã có sự hiện diện của virus viêm gan C. Sự hiện diện của phức hợp kháng nguyên kháng thể sẽ quyết định cường độ màu ánh sáng phát ra. 1.6.1.2 Phương pháp xét nghiệm virus HCV bằng ELISA Có 2 cách : + Phương pháp gián tiếp là phương pháp miễn dịch, nghĩa là qua phản ứng kháng nguyên kháng thể ta sẽ xác định được kiểu của kháng thể, từ đó biết được type huyết thanh của siêu vi C (HCV serotype) + Phương pháp trực tiếp dựa trên sự phân tích trực tiếp trên gen của siêu vi C để xác định kiểu gen của siêu vi C (HCV genotype). Ưu điểm của kỹ thuật này là đơn giản, không sợ nguy cơ ngoại nhiễm và có thể thực hiện hoàn toàn trên máy tự động. Tuy nhiên, phương pháp này vẫn còn ít nhiều nhược điểm như không định được chi kiểu (subtype), không biết được tình trạng bệnh nhân có hay không có HCV-RNA (tình trạng siêu vi đang tăng sinh để điều trị đặc hiệu), ở bệnh nhân bị ức chế hay suy giảm miễn dịch sẽ không có anti HCV từ đó không xác định được loại HCV, không phân biệt được 16 giữa anti HCV nhiễm trước đây còn tồn tại và loại HCV đang nhiễm. Và một điều cực kỳ quan trọng là sự phù hợp giữa type huyết thanh và kiểu gen vẫn còn nhiều khác nhau. Dễ bị dương tính giả, chi phí cao. Hiện nay, người ta kết hợp phương PCR với phương pháp ELISA để phát hiện virus HCV, người ta hay gọi là phương pháp PCR-ELISA. Để nhân bản cDNA được tách chiết từ RNA HCV trong huyết thanh người bệnh, sau đó ta cho vào trong vi giếng tiến hành xét nghiệm. Hình 1.7. Các vi giếng của microtiter plate chứa kháng nguyên *Phương pháp PCR-ELISA: Dưới sự xúc tác của enzyme kết hợp với kháng thể kháng digoxigenin. Đầu tiên, người ta tách chiết HCV RNA từ huyết thanh và chuyển thành cDNA nhờ enzyme phiên mã ngược, cDNA này được dùng làm bản mẫu (template) cho phản ứng PCR. Trong thành phần của phản ứng PCR, một trong hai primer sẽ được đánh dấu ở đầu 5’ với biotin, như vậy, sản phẩm PCR tạo ra sẽ có một mạch được đánh dấu biotin ở đầu 5’. Sau bước nhân bản, sản phẩm PCR được biến tính thành dạng mạch đơn và được cho vào các vi giếng. Mặt trong mỗi vi giếng được phủ streptavidin là một protein có ái lực đặc biệt cao đối với biotin sẽ giữ các mạch mang bitotin ở đầu 5’. Tiếp theo, người ta cho probe đặc hiệu cho HCV vào vi giếng và tiến hành phản ứng lai. Probe này được đánh dấu ở đầu 3’ với digoxigenin sẽ bắt cặp bổ sung với mạch mang biotin ở đầu 5’. Phức hợp kháng thể kháng digoxigenin-alkaline phosphatase được cho vào và ủ trong một thời gian thích hợp, phần dư thừa sẽ được loại bỏ. Phản ứng màu sẽ xuất hiện khi 17 cơ chất hiện màu của alkaline phosphatase được cho vào. Cường độ màu tương ứng với hàm lượng sản phẩm PCR có trong mẫu. Việc định lượng HCV RNA có trong mẫu được thực hiện bằng cách quy giá trị cường độ màu ở mỗi vi giếng vào một đường chuẩn xây dựng từ những mẫu có nồng độ HCV RNA biết trước. Phương pháp này có khả năng phát hiện HCV với nồng độ là 600 IU/ml. Độ tuyến tính của phương pháp nằm trong khoảng 600 IU/ml đến 850.000 IU/ml. Với nguyên lý trên, ELISA giúp xác định sự có mặt hay không có mặt cũng như lượng KN trong mẫu nghiên cứu. Nhưng phương pháp này rất hạn chế do KN không đặc hiệu sẽ ảnh hưởng đến kết quả xét nghiệm. 1.6.2. Phương pháp khuếch đại tín hiệu [12], [14] Phương pháp khuếch đại tín hiệu: là phương pháp phát hiện và định lượng RNA bằng kỹ thuật lai và khuếch đại tín hiệu. Bộ gen virus lúc đầu được lai vào một giá, thì các bộ dò oligonucleotide liên kết/bắt cặp đặc hiệu, sau đó tín hiệu phát ra bởi các phân tử lai được khuếch đại và đo lường. Có hai kỹ thuật hay sử dụng: +Kỹ thuật DNA nhánh (Branched DNA technology) +Phương pháp bắt giữ lai (hybrid capture) 1.6.2.1. Kỹ thuật DNA nhánh-bDNA (Branched DNA technology) Trong xét nghiệm này, mẫu dò lai với acid nucleic đích không khuếch đại trước. Có sự gia tăng tín hiệu lai đáng kể, thường được thêm vào bộ khuếch đại bDNA (bDNA Amlifier). RNA được lai với các probe đặc hiệu. Sau đó, phức hợp RNA HCV – probe được cố định trên một vi giếng (microwell) và tiếp tục được lai với các probe khuếch đại tín hiệu, mỗi probe này liên kết với nhiều phân tử alkline phosphatase (Hình 1.8). Cuối cùng, cơ chất của enzyme được cho vào vi giếng và tín hiệu hóa quang (chemiluminescent) sẽ được thu nhận bởi máy đọc tín hiệu ánh sáng. 18 Hình 1.8. Kỹ thuật bDNA nhánh Trong phương pháp định lượng bằng bDNA thì việc thiết kế các probe mục tiêu là vô cùng quan trọng. Cả hai lọai probe (probe cố định RNA HCV vào vi giếng và probe khuếch đại tín hiệu RNA HCV) phải được thiết kế sao cho có thể định lượng mọi genotype HCV với hiệu quả như nhau. Phương pháp này có thể phát hiện tối thiểu 7.105 phân tử HBV-DNA/ml máu. So với Real-time PCR, kĩ thuật bDNA ít nhạy hơn và không thể đo lượng virus < 200.000 bản sao/ml. 1.6.2.2. Phương pháp bắt giữ lai (hybrid capture) Kỹ thuật này dự trên nguyên tắc lai phân tử giữa một mạch của phân tử DNA mạch đôi và phân tử RNA tạo thành một thể lai DNA:RNA. Các mẫu được xử lý bằng dung dịch ly giải để giải phóng các nucleic acid có trong tế bào. Sau đó các probe DNA hoặc RNA được cho vào và phản ứng lai xảy ra. Phức hợp lai 19 được cho vào trong các ống nghiệm hoặc trong các vi giếng của microtiter plate có phủ một kháng thể đa dòng (polyclonal antibody). Kháng thể đa dòng này bắt giữ (capture) toàn bộ các phân tử lai DNA:RNA hiện diện trong phản ứng. Các phân tử nucleic acid khác như phân tử DNA mạch đơn, RNA, thể lai DNA:RNA, RNA:RNA không phản ứng với kháng thể này và bị rửa trôi. Sau đó, các phân tử lai DNA:RNA đã được bắt giữ sẽ liên kết đặc hiệu với một kháng thể thứ hai cộng hợp với alkaline phosphatase. Một phân tử lai có thể liên kết với nhiều phức hợp kháng thể - alkaline phosphatase nên sẽ làm gia tăng độ nhạy của kỹ thuật. Hàm lượng trình tự mục tiêu được định lượng bằng giá trị RLU (Relative Light Unit) có cường độ tương ứng với hàm lượng trình tự đích có trong mẫu ban đầu. 1.6.3. Phương pháp PCR [3], [5] Kỹ thuật PCR (PCR - polymerase chain reation: phản ứng tổng hợp chuỗi nhờ DNA polymerase) được mô tả năm 1985 bởi K.Mullis và các cộng sự cho phép khuyếch đại, nghĩa là làm tăng một cách rất lớn, lượng DNA sử dụng ban đầu, mức độ khuếch đại là vô cùng lớn, mà về lý thuyết người ta có thể có được một lượng nguyên liệu (nhiều microgram) từ một phân tử DNA. Bằng phương pháp tạo dòng in vivo người ta có thể khuyến đại AND nhờ vi khuẩn. Trong kỹ thuật PCR, sự khuếch đại được thực hiện in vitro, nhờ enzyme (đó là DNA - polymerase), không cần đến sự hiện diện của tế bào. 1.6.3.1. Nguyên tắc của phương pháp PCR: Tất cả các DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn đều cần sự hiện diện của những mồi chuyên biệt. Mồi là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn và DNA polymerase sẽ nối dài mồi để hình thành mạch mới. Phương pháp PCR đã được hình thành dựa vào những đặc tính đó của các DNA polymerase. Thật vậy nếu ta cung cấp hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu của một trình tự 20 DNA, ta chỉ tổng hợp đoạn DNA nằm giữa hai mồi. Điều đó có nghĩa là để khuếch đại một trình tự DNA xác định, ta phải có thông tin tối thiểu về trình tự đó để tạo các mồi bổ sung chuyên biệt, các mồi này gồm một mồi xuôi (sens primer) và một mồi ngược (antisens primer). Từ “xuôi” và “ngược” phải hiểu là xuôi và ngược so với chiều phiên mã của gen. 1.6.3.2 Các giai đoạn của một chu kỳ phản ứng PCR Một phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kì nối tiếp nhau, mỗi chu kì gồm ba bước: (Hình 1.9) Hình 1.9. Nguyên tắc hoạt động của PCR [10] 21 Bước 1: Giai đoạn biến tính (denaturation) Phân tử bị biến tính cao hơn Tm của phân tử. Nhiệt độ phản ứng là 94oC - 95oC trong 30 giây đến 1 phút, hai mạch DNA khuôn bị biến tính, duỗi xoắn và tách ra. Bước 2: Giai đoạn lai (hybridization) Nhiệt độ được hạ thấp xuống nhiệt độ Ta (nhiệt độ bắt cặp) của mồi, khoảng 40 - 70oC trong 30 giây đến 1 phút, cho phép các mồi bắt cặp vào khuôn. Bước 3: kéo dài (nhiệt độ 72oC) Nhiệt độ được tăng lên 72oC, là nhiệt độ thích hợp nhất cho enzyme DNA polymerase để hoạt động tổng hợp mạch mới từ đoạn mồi. Thời gian này tùy thuộc độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại (từ 30 giây đến vài phút). Thông thường một phản ứng PCR không được vượt quá 40 chu kỳ. 1.6.3.3. Các chỉ tiêu ảnh hưởng đến phản ứng PCR Một phản ứng PCR thường gồm 6 thành phần cơ bản sau: - Khuôn acid nudcleic DNA mẫu phải thật tinh sạch, nhưng nếu DNA thu nhận trực tiếp từ dịch chiết tế bào thì việc chẩn đoán bằng PCR vẫn cho ra kết quả tốt. Giảm lượng mẫu ban đầu còn lại sẽ hạn chế được việc khuếch đại “ký sinh”, tạo ra những sản phẩm phụ không mong muốn. DNA mạch đôi hay mạch đơn đều có thể là nguồn vật chất ban đầu cho phản ứng PCR, chúng được tách chiết từ tế bào thực vật, động vật, vi khuẩn hoặc virus. Ưu điểm lớn khác của phương pháp PCR là cho phép khuếch đại những mẫu DNA không được bảo quản tốt, đã bị phân hủy thành từng phần nhưng trong các vết máu để lâu ngày, tinh dịch đã khô, hóa thạch, tóc, móng tay của người đã chết,… Thông thường, nồng độ DNA ban đầu tốt nhất cho phản ứng PCR ở khoảng 105 bản sao/phản ứng. -Enzyme chịu nhiệt Taq polymerase Enzyme này có thể chịu được nhiệt độ tới 95oC, không bị phá hủy ở nhiệt độ biến tính và xúc tác sự tổng hợp từ đầu đến cuối quá trình phản ứng. Một 22 phản ứng PCR từ 25 - 50µl thông thường có liều lượng Taq polymerase nằm trong giới hạn từ 0.5 - 2.5 đơn vị. Enzyme này có hoạt tính polymerase 5’- 3’ và hoạt tính exonuclease 5’- 3’ nhưng không có hoạt tính exonuclease 5’- 3’ nhưng không có hoạt tính exonuclease 3’- 5’ (đọc sửa), chỉ dùng Tag DNA polymerase để phiên mã ngược cDNA từ mARN để phát hiện ra virus HCV nói riêng và xét nghiệm có hay không có một gen cụ thể trong DNA đích nói chung, chứ không dùng enzyme này để nghiên cứu chức năng của gen vì enzyme này có tỷ lệ sai xót 1/10000, nghĩa là sau 25 lần tái bản thì khoảng 10% sản phẩm có chứa đột biến. -Mồi ( Primer ) Đây là một trong những yếu tố quan trọng nhất trong phản ứng PCR, để đạt được một sự khuếch đại đặc trưng và có hiệu quả cao, có vai trò làm mồi cho hoạt động kéo dài mạch của DNA polymerase. Do đó, việc thiết kế mồi phải được tiến hành thật chính xác, và là giai đoạn quyết định của phương pháp PCR. Nồng độ mồi trong mỗi phản ứng PCR phải được tính toán tối ưu bằng thực nghiệm. Nếu nồng độ mồi quá cao sẽ dẫn đến hiện tượng khuếch đại kí sinh, ngược lại sẽ làm hiệu quả khuếch đại của phản ứng không cao. Giới hạn nồng độ mồi thường là 0.1-1µl. Mồi thiết kế phải tuân thủ những nguyên tắc sau: +Tm của mồi “xuôi” và mồi “ngược” không khác nhau quá 5oC. +Tránh sự bắt cặp bổ sung giữa mồi “xuôi” và mồi “ngược”. +Tránh các cấu trúc “kẹp tóc” trong thành phần mỗi mồi. +Thành phần nucleotide của mồi phải cân bằng. +Tránh các cặp GC lặp đi lặp lại nhiều lần. +Thành phần GC khoảng 40-60%. +Trình tự mồi phải đặc trưng cho trình tự DNA cần nhân bản. -dNTPs (deoxynucleotide triphosphates) 23 Gồm bốn loại nucleotide được dùng trong phản ứng PCR là: dATP, dTTP, dGTP, dCTP. Nồng độ của mỗi loại nu trong mỗi phản ứng (với nồng độ MgCl2 1.5mM) là 200-250µl, chúng ta phải giữ nồng độ của tất cả các deoxynucleotide bằng nhau, để tránh sự gắn kết nhầm lẫn. Nếu nồng độ dNTPs cao hơn 4µl sẽ dẫn đến sự khuếch đại “kí sinh”, và sự mất cân bằng nồng độ giữa các loại nu sẽ làm tăng lỗi sao chép của DNA polymerase -MgCl2 Có vai trò là một cofactor cho enzyme Tag polymerase hoạt động. Ngoài ra, mồi; DNA bản mẫu; dNTPs; EDTA cũng có thể liên kết với MgCl2 và do đó sẽ cạnh tranh với DNA polymerase. Nếu nồng độ MgCl2 cao sẽ dẫn đến hiện tượng khuếch đại kí sinh. Ngược lại nếu nồng độ quá thấp (<0.5µM) sẽ làm xấu đi quá trình kéo dài chuỗi. Vì vậy, phải thiết kế nồng độ MgCl2 tối ưu nhất nhằm đảm bảo kết quả số lượng sản phẩm và sự chuyên tính của sản phẩm PCR, thông thường là từ 1.5 - 4µM. Ph sẽ giảm khi nhiệt độ tăng. -Dung dịch đệm PCR Dung dịch này có vai trò cung cấp những ion cần thiết cho phản ứng xảy ra. Tùy theo nguồn DNA polymerase mà nồng độ và pH của dung dịch đệm cũng như nồng độ KCl tối ưu sẽ thay đổi cho phù hợp. Thông thường, một phản ứng PCR sẽ có dung dịch đệm điển hình là: 50mM KCl, 10mM Tris – HCl, pH 8.3 ở nhiệt 200C. pH sẽ giảm khi nhiệt độ tăng. 1.6.3.4. Phương pháp Real-time PCR [4, tr. 152-153], [9], [11] Trong sinh hoc phân tử Real - time PCR (PCR đúng thời điểm) là kỹ thuật phòng thí nghiệm dựa trên phản ứng PCR dùng để nhân bội và định lượng đồng thời phân tử DNA đích. Nó có khả năng vừa phát hiện vừa định lượng trình tự đặc hiệu trong mẫu DNA. ) Nguyên tắc real-time PCR cũng dựa trên PCR thường, đặc điểm cơ bản của Reat - time PCR là DNA nhân bội được định lượng đúng thời điểm sau mỗi chu kỳ phản ứng, nhưng phương pháp này có thể định lượng được hàm 24 lượng DNA/RNA có trong mẫu nhờ các chất nhuộm phát huỳnh quang (fluorescent dye) vào DNA mạch kép hoặc dùng mẫu dò DNA oligonucleotide được biến đổi để phát huỳnh quang khi lai với DNA bổ trợ, phản ứng PCR đúng thời điểm được kết hợp với RT - PCR (revserse transcription-polymerase chain reaction) để định lượng mRNA có hàm lượng nhỏ, giúp nhà nghiên cứu định lượng mức độ biểu hiện gen một cách tương đối tại một thời điểm cụ thể hoặc ở những tế bào hoặc mô cụ thể. Sau khi nhân bản, các sản phẩm PCR mục tiêu sẽ được theo dõi hàm lượng theo một thời gian thật (real time) của phản ứng. ) Thiết bị Thực chất, thiết bị dùng để tiến hành phản ứng PCR chỉ cần đáp ứng được yêu cầu thay đổi nhiệt độ thật nhanh và chính xác và cũng không cần phải qua bước điện di hoặc lai phân tử như kỹ thuật PCR truyền thống, vì vậy nguy cơ ngoại nhiễm do sản phẩm của lần nhân bản trước được loại bỏ và việc phân tích kết quả sau phản ứng được tiến hành hoàn toàn tự động nên đặc biệt thích hợp thao tác trên số lượng mẫu lớn. Thiết bị nhân bản nucleic acid có sử dụng huỳnh quang thông dụng trên thị trường hiện này gồm có máy Mx 400 hay Mx 300 (Stratagene). Máy real-time PCR và hệ thống máy tính, phần mềm hỗ trợ. Hình 1.10. Máy Stratagene Mx3000P 25 Các chất phát huỳnh quang trong mỗi phản ứng được kích thích bằng một nguồn sáng laser (ABI Prism 7700) hoặc đèn tungsten halogen (iCycler). Ánh sáng huỳnh quang phát ra được thu nhận qua một Charged Coupled Device camera (CCD camera) và được chuyển thành một tính hiệu mà máy vi tính có thể phân tích được. ) Phản ứng phát huỳnh quang (khi dùng mẫu dò Taqmam) Việc định lượng số bản sao khuếch đại sẽ dựa vào mẫu dò (probe). Mẫu dò là một đoạn oligonucleotide ngắn xác định, được đánh dấu bằng nhiều phương pháp khác nhau dùng để nhận diện các đoạn acid nucleic khác có trình tự bổ sung với nó. Về cơ bản, mẫu dò cũng tương tự như mồi, chỉ khác ở chỗ mẫu dò được gắn thêm một cơ chất có thể phát tín hiệu (thường là đồng vị phóng xạ P32/P33, hoặc chất phát huỳnh quang). Trong real-time PCR có nhiều loại mẫu dò nhưng trong chẩn đoán HCV chỉ sử dụng mẫu dò thủy giải (hydrolysis probe) : Mẫu dò thủy giải (Hydrolysis probe): còn được gọi là Taqman probe, người ta dựa vào đăc tính exonuclease 5’- 3’ của Tag polymerase để hình thành phương pháp, loại mẫu dò dựa trên sự truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang khi lai ( Hình 1.11). Mẫu dò này là oligonucleotide có chứa thuốc nhuộm “phát huỳnh quang” (reporter) thường gắn vào base ở đầu 5’ và một chất “dập tắt” huỳnh quang (quencher) ở đầu 3’. Mẫu dò được thiết kế để lai với vùng giữa của sản phẩm PCR. Khi phát xạ, thuốc nhuộm phát huỳnh quang bị kích thích, truyền năng lượng cho phân tử thuốc nhuộm dập tắt bên cạnh chứ không phát sáng, tạo nên cơ chất không phát huỳnh quang. Trong quá trình PCR, khi enzyme DNA polymerase tái bản khuôn có mẫu dò gắn vào, hoạt tính 5’- 3’ của enzyme cắt bỏ mẫu dò. Động thái đó tách thuốc nhuộm phát huỳnh quang khỏi thuốc nhuộm dập tắt và sự truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang không xảy ra nữa. Ánh sáng huỳnh quang phát ra sẽ tương ứng với hàm lượng sản phẩm PCR có trong 26 Hình 1.11. Real-time,sử dụng Taqman probe để định lượng Mồi 1 và mồi 2 để tái bản DNA.Mẩu dò gắn vào một mạch và nằm giữa 2 mạch Mẫu dò chứa 2 base bị biến đổi,một phát huỳnh quang (R) nằm ở đầu 5’,và base kia bị biến đổi ức chế phát quang (Q) nằm ở đầu 3’. Khi quá trình tái bản diễn ra,sản phẩm từ mồi 1 thay thế đầu 5’ của mẫu dò và hoạt tính exonuclease của polymerase cắt chất phát quang từ vật dò.Sự kiện tách chất phát quang khỏi chất ức chế cho phép nó phát huỳnh quang.Lượng phát huỳnh quang tỷ lệ thuận với lượng sản phẩm PCR được tạo ra và được đo ở mỗi chu kỳ. phản ứng, tỷ lệ với tốc độ mẫu dò bị cắt bỏ và có thể đo lường được. Taqman probe có tính đặc hiệu cao, chỉ bắt cặp và phát tín hiệu nếu trình tự bổ sung với mạch khuôn là hoàn toàn, vì vậy các sản phẩm ký sinh nếu có cũng không được phát hiện. Thông thường, Taqman probe có nhiệt độ nóng chảy (Tm) cao hơn cặp mồi từ 8-10oC nhằm tạo điều kiện cho việc bắt cặp và thủy giải mẫu dò bởi Taq polymerase. 27 ) Một số điều lưu ý khi thực hiện phản ứng real-time PCR -Kích thước sản phẩm PCR trong phản ứng Reat-time PCR Chiều dài tối ưu của sản phẩm PCR trong phản ứng Real-time PCR thường nhỏ hơn 100bp. Sản phẩm có kích thước ngắn nhân bản hiệu quả hơn và chịu các điều kiện bất lợi của phản ứng tốt hơn so với các sản phẩm có kích thước lớn. Sản phẩm kích thước nhỏ có thể biến tính ở nhiệt độ 92oC và chỉ cần 15 giây để Taq polymerase tổng hợp hoàn toàn một mạch mới bổ sung. -Cặp primer Cần phải cẩn thận trong việc chọn lọc mồi, probe quyết định sự thành công trong việc khuếch đại của PCR. Mồi phải đạt được sự cân bằng giữa sự chuyên tính và sự hiệu quả của PCR. Thành phần GC của cặp primer gần giống như thành phần GC của probe khoảng 20% - 80%, cần tránh các nucleotide lặp lại, đặc biệt là G, nếu giá trị Tm càng lớn, cơ hội cho priming nhầm càng cao. Nhiệt độ nóng chảy của cặp primer trong khoảng 58-60oC, thấp hơn nhiệt độ nóng chảy của probe từ 8-100C. -Chu kỳ ngưỡng (threshold cycle – Ct): Đây là khái niệm trung tâm của kỹ thuật real-time PCR. Nguyên tắc định lượng của kỹ thuật này dựa vào một đường cong chuẩn (standard curve) được xây dựng từ các giá trị chu kỳ ngưỡng của các mẫu đã biết trước nồng độ nucleic acid. Chu kỳ ngưỡng của một mẫu là chu kỳ mà tại đó tín hiệu huỳnh quang của mẫu vượt trên tín hiệu huỳnh quang nền của phản ứng PCR và được các thiết bị cảm biến ghi nhận. Tín hiệu huỳnh quang nền được tạo ra trong phản ứng real- time PCR là do các chất phát huỳnh quang có nồng độ xác định có sẵn trong thành phần phản ứng PCR. Chất phát huỳnh quang này khác với chất phát huỳnh quang được sử dụng để định lượng. Trong phản ứng real-time PCR sử dụng Taqman probe thì chính quencher của Taqman probe sẽ đóng vai trò tạo tín hiệu nền cho phản ứng. 28 -Đường cong chuẩn (standard curve): Việc định lượng trong phản ứng real-time PCR được thực hiện bằng cách so sánh hàm lượng sản phẩm PCR của mẫu thử nghiệm với hàm lượng sản phẩm PCR từ các mẫu chuẩn có nồng độ đã biết được nhân bản đồng thời. Các thiết bị thực hiện phản úng real-time PCR sẽ tự động xây dựng một đường cong chuẩn dựa trên chu kỳ ngưỡng (Ct) của các mẫu có nồng độ nucleic acid biết trước (các mẫu chuẩn - standard samples). Sau đó, nồng độ nucleic acid của các mẫu thử nghiệm sẽ được tính toán dựa trên đường cong chuẩn này. 29 CHƯƠNG 2.VẬT LIỆU-PHƯƠNG PHÁP 2.1. Vật liệu [3],[6] 2.1.1. Vật liệu sinh học Mẫu thử nghiệm: mẫu huyết thanh. 2.1.2 Hóa chất Z Hóa chất cho tách chiết RNA: - Dung dịch (1) (Trizol) gồm: phenol 38%, guanidine thyocianat 0.8M, glycerol 5%, pH 4.0 - Dung dịch (2): Chloroform - Dung dịch (3): Isopropanol tuyệt đối có chứa chất trợ tủa. - Dung dịch (4): Ethanol 70%. - Dung dịch (5): nước cất đã qua xử lý bằng DEPC. Z Hóa chất trong phản ứng ELISA: - Digoxigenin, ABTS - 2, 2' - Azino-bis (3-Ethylbenzthiazoline-6-Sulfonic Acid) - Streptavidin microtiter plate - Tris-HCl, Nacl, NaOH, bovine serum Albumin, Sodium Dodecyl Sulfate Z Hóa chất trong phản ứng RT: - Thành phần của 1 phản ứng RT 20µl: Dung dịch đệm (buffer) 1X, dNTP 0.5mM, Reverse Transcriptase, mồi ngược, RNA bản mẫu, nước cất vô trùng. Z Hóa chất trong real-time PCR: - Thành phần của 1 phản ứng real-time PCR 25µl: dung dịch đệm (buffer) 1X, dNTP 200µM, Taq DNA polymerase 0.625 unit, MgCl2 1.5mM, cDNA bản mẫu, nước cất vô trùng, mồi và mẫu dò. - Chuẩn bị các eppendorf gồm : *Các mẫu thử ( unknown ) *Mẫu chứng dương (positive control) chứa cDNA của virus HCV 30 *Mẫu chứng âm (negative control ) *Standard HCV : dùng xây dựng đường chuẩn Tube PCR mix chứa standard 102 copies Tube PCR mix chứa standard 104 copies Tube PCR mix chứa standard 106 copies 2.1.3. Thiết bị, dụng cụ -Dàn máy ELISA Hình 2.1. Máy ủ lắc Hình 2.2. Máy khay rửa vi thẻ Hình 2.3. Máy đọc vi thẻ 31 -Máy luân nhiệt (MJ Research ) -Máy luân nhiệt real-time iCycler (Bio-Rad) Hình 2.4. Máy luân nhiệt Real-time iCyCler -Ly tâm eppendorf lạnh (Hermle) Hình 2.5. Máy ly tâm eppendorf 0.2ml 32 -Máy ủ nhiệt khô (Fisher Scientific ) -Máy vortek (Ika Labortechnik) Hình 2.7. Máy vortex Hình 2.6. Máy ủ nhiệt khô 33 -Máy chụp hình kỹ thuật số (Olympus) và bộ lọc tia UV (Kodak) -Máy ly tâm thu huyết thanh và máy ly tâm -Miropipette 0.5-10µl, 20-100µl, 100-1000µl. -Tủ cấy vô trùng. -Vật liệu tiêu hao: găng tay, khẩu trang, đầu tip có phin lọc, eppendorf. 2.2. Phương pháp [2], [3], [5], [7] Hình 2.10 Quy trình phát hiện HCV Hình 2.8. Máy ly tâm thu huyết thanh Hình 2.9. Máy ly tâm 34 2.2.1. Ly trích RNA 2.2.1.1. Nguyên tắc: Việc tách chiết RNA bao gồm các bước cơ bản sau: (1) phá màng tế bào (2) loại protein (3) tủa RNA. Để thu nhận RNA tinh sạch, người ta cần loại bỏ những thành phần tạp nhiễm, mà quan trọng nhất là protein. * Mục đích của việc tách chiết là RNA tinh sạch là: +Chiết được RNA tinh sạch + Thu được RNA tối đa + Loại được protein Sự tách chiết dựa trên nguyên tắc hòa tan khác nhau của các phân tử khác nhau (acid nucleic/protein) trong hai pha không hòa tan (phenol, chloroform / nước) . Các chất trong tách chiết: -Dung dịch (1): thành phần có phenol, guianidine thyocianat 0,8M, glycerol. Dung dịch này có tính nhớt, được sử dụng để ổn định các thành phần, đồng thời chúng là những chất làm biến tính protein mạnh. Vì vậy, khi xử lý với hóa chất này, tế bào sẽ bị phá vỡ và giải phóng các thành phần nội bào: DNA, RNA, protein… -Dung dịch (2) chloroform: thường đi kèm với phenol vì phenol không hòa tan nucleic acid (làm biến tính protein nhưng yếu hơn phenol), có tác dụng bổ sung và loại bỏ hoàn toàn dấu vết phenol. Sau khi ly tâm, mẫu xử lý với Trizol sẽ tách thành hai lớp: lớp dưới là phenol, lớp trên chứa RNA (khi Trizol có pH 4.0), phần protein bị biến tính sẽ nằm ở mặt phân cách hai lớp này và bị loại bỏ => thu lớp RNA + H2O nổi phía trên -Dung dịch (3) Isopropanol: có vai trò tạo tủa và kết tủa acid, RNA trong phần dịch nổi được thu nhận bằng cách tủa với Isopropanol có bổ sung chất trợ 35 tủa. Chất trợ tủa này là một polymer có cấu trúc mạng lưới nên dễ dàng bắt được các phân tử RNA, nhưng không gây ức chế phản ứng PCR. - Sau khi tủa, tủa sẽ được rửa lại 1 lần nữa với dung dịch (4) (ethanol 70%) và cuối cùng sẽ được bảo quản trong nước cất đã qua xử lý bằng DEPC (Dung dịch (5)), bảo quản ở -20oC đến khi sử dụng. 2.2.1.2. Phương pháp tiến hành a) Phương pháp thu nhận và chuẩn bị mẫu -Lấy máu tĩnh mạch, lấy lúc đói và buổi sáng là tốt nhất -Máu chỉ giữ ở 4o-8oC trong tối đa 4 giờ, sau đó phải tách huyết thanh. -Lấy 3ml máu bệnh nhân cho vào ống nghiệm thu máu chuyên dụng. -Ly tâm ống nghiệm chứa máu 3000 vòng/phút trong 15 phút. Thu khoảng 0.5ml huyết thanh chuyển vào eppendorf 1.5ml vô trùng. Giữ tube huyết thanh ở -200C cho đến khi tiến hành xét nghiệm. b) Phương pháp tách chiết RNA HCV Bước 1: Trước hết phá màng tế bào -Cho 200µl mẫu (huyết thanh) vào 1 eppendorf có sẵn 900µl dung dịch 1, vortex 30s, để yên 10 phút. Bước 2: loại protein - Thêm vào 200µl dung dịch 2, trộn đều. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút. - Thu được 600µl dịch nổi (chú ý chỉ thu dịch nổi) có chứa RNA. Bước 3: Tủa RNA - Lấy 600µl có chứa RNA hút vào 1 eppendorf sạch đã có sẵn 600µl dung dịch 3. Trộn đều, để yên 10 phút. Thêm 200µl dung dịch 2. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút. -Loại bỏ dịch nổi, thu cặn màu xanh. Cho từ từ 900µl dung dịch 4 vào. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút. -Loại bỏ dịch nổi (dùng pipet 200 µl hút sạch phần dịch nổi), thu cặn tránh loại bỏ phần cặn. Để khô ở 60oC, 10 phút. Cho vào 50µl dung dịch 5. 36 - Nếu chưa đặt phản ứng PCR ngay thì phải bảo quản ở -20oC. 2.2.2. Thực hiện phản ứng phiên mã ngược - Thực hiện bước này với các tube RT-Mix (gồm: dung dịch đệm thích hợp, các đoạn mồi, dNTP...) được giữ trong khay lạnh hoặc đá đang tan. - Trước và sau khi đặt phản ứng RT phải ly tâm tube để tất cả dung dịch nằm dưới đáy tube. - Đánh dấu các tube bằng k ý hiệu mẫu. Cho 15µl chứng (+), chứng (-) hoặc dịch RNA tách chiết vào tube. Phải kiểm tra chắc chắn dịch trong tip phải được cho hết vào tube. Thực hiện mẫu nào, chỉ mở nắp tube tương ứng. Thực hiện xong đóng thật kỹ nắp tube ngay để tránh nguy cơ ngoại nhiễm. Sau đó, ly tâm và chuyển ngay các tube vào máy PCR. - Lập chương trình cho máy PCR hoạt động: 25oC - 5’, 42oC - 30’, 85oC - 5’, giữ ở 4oC. Chọn chức năng chờ đến khi “Heat lid” đạt 1050 thì chương trình luân nhiệt mới bắt đầu. Giai đoạn này là giai đoạn phiên mã ngược. Z Trong hỗn hợp RT-PCR premix có chứa: dung dịch đệm thích hợp, các đoạn mồi, dNTP… cần thiết cho quá trình chạy PCR . Z Trong quá trình chạy RT-PCR, giai đoạn phiên mã ngược là hết sức quan trọng. + 250C trong 5 phút, nhằm ổn định RNA để chuẩn bị cho quá trình phiên mã ngược. Enzyme reverse transriptase được sử dụng để tổng hợp cDNA từ mạch khuôn là RNA. + RT-Enzyme mix hoạt động thích hợp ở nhiệt độ 420C. Tại nhiệt độ này, RNA bắt cặp mồi là đoạn oligonucleotide có sẵn trong RT-PCR premix, từ đó nhờ enzyme RT kéo dài, phiên mã ngược RNA thành cDNA. Trong khoảng thời gian 30 phút ở 42oC, lượng RNA được phiên mã ngược hoàn toàn thành cDNA. + Sau đó nhiệt độ được tăng lên 85oC trong vòng 5 phút để phân hủy hết lượng reverse transcriptase này nếu còn dư và đồng thời phá vỡ liên kết hydro giữa RNA-cDNA mới được tổng hợp. 37 - Bảo quản ở 4oC nhằm giữ mẫu được lâu hơn . - Sản phẩm cDNA được dùng để thực hiện phản ứng PCR ELISA/real- time PCR. -Nếu chưa thực hiện phản ứng PCR ELISA/real-time PCR ngay phải bảo quản cDNA ở -20oC. 2.2.3. Phương pháp PCR ELISA Trộn 20µl dung dịch digoxigenin với 20 µl dung dịch DNA biến tính, vortex nhẹ, để digoxigenin gắn vào DNA mạch đơn. Để ở nhiệt độ phòng trong 10 phút để ổn định thành phần hỗn hợp trên trước khi tiến hành phản ứng lai . Thêm 200µl dung dịch lai có chứa probe đặc hiệu cho HCV (probe này xác định được digoxigenin nào có gắn oligonucleotide đặc trưng cho virus HCV). Vortex nhẹ trong 10 giây. Lúc này, probe được đánh dấu ở đầu 3’ với digoxigenin sẽ bắt cặp bổ sung với mạch mang biotin ở đầu 5’. Cho tất cả 240µl vào trong giếng của đĩa chạy ELISA. Mặt trong mỗi vi giếng đã có phủ sẵn streptavidin là một chất giữ có khả năng mang các protein của kháng nguyên HCV, đặc biệt là đối với biotin chúng sẽ giữ các mạch mang biotin ở đầu 5’. -Đặt của đĩa chạy ELISA vào máy lắc ổn nhiệt.Lắc trong 1 giờ 55oC để thúc đẩy quá trình bắt cặp bổ sung giữa digoxigenin và bitotin được hoàn toàn. -Sau đó, hút bỏ dung dịch trong các giếng, để loại bỏ kháng nguyên không chứa virus HCV. -Rửa các giếng với dung dịch rửa, để có thể loại bỏ hoàn toàn kháng nguyên không chứa virus HCV. Thực hiện 5 lần rửa, trong đó còn lại kháng nguyên có chứa virus HCV đã được cố định trong Streptavidin. -Cho vào giếng 200µl cộng hợp kháng thể digoxigenin-peroxidase -Đặt vào máy lắc ổn nhiệt, lắc trong 30 phút ở 37oC, trong thời gian này kháng thể đặc hiệu trong huyết thanh sẽ gắn với kháng nguyên virus HCV. 38 -Rửa các giếng với dung dịch rửa để loại bỏ huyết thành và chuẩn bị cho bước tiếp theo. Thực hiện 5 lần rửa. -Cho vào giếng 200µl dung dịch ABTS, là một dạng cơ chất đặc hiệu của enzyme, có chứa một chất hóa học là chất hiện màu, chất hiện màu này lai ở trạng thái bất hoạt thì ở dạng không màu, nhưng khi chuyển sang dạng hoạt hóa thì chúng là dạng hòa tan có màu, khi thêm cơ chất này vào giếng, nếu giếng có kháng thể gắn cộng hợp với kháng nguyên thì enzyme peroxidase sẽ hoạt hóa cơ chất và khi đó chất hiện màu chuyển sang dạng hoạt hóa thì giếng sẽ hiện màu còn nếu giếng không có kháng thể gắn cộng hợp với kháng nguyên thì chất hiện màu trong cơ chất ABTS sẽ ở trạng thái bất hoạt không màu. Cuối cùng ta đặt giếng vào máy đọc ELISA, ghi nhận kết quả trong 20 phút ủ có lắc trong máy đọc ELISA. 2.2.4. Phương pháp Real time - PCR - Thực hiện bước này với các tube PCR mix được giữ trong khay lạnh hoặc đá đang tan. - Trước và sau khi đặt phản ứng PCR phải ly tâm tube để tất cả dung dịch nằm dưới đáy tube. - Cho 2.5µl dịch cDNA từ phản ứng RT ở trên vào tube HCV qPCR mix. Phải kiểm tra chắc chắn dịch trong tip phải được cho hết vào tube. Thực hiện mẫu nào, chỉ mở nắp tube tương ứng. Thực hiện xong đóng thật kỹ nắp tube ngay để tránh nguy cơ ngoại nhiễm. Sau đó, ly tâm và chuyển ngay các tube vào máy real-time PCR cùng với 1 bộ standard . - Bật máy real-time PCR, nhất là đèn của đầu đọc real-time ít nhất 15 phút trước khi chạy chương trình. Bật máy tính và chờ cho máy tính khởi động xong, gọi chương trình real-time PCR lên. Phải kiểm tra chắc chắn máy real-time PCR và máy vi tính đã kết nối với nhau. Chọn chức năng chờ cho đến khi “Heat lid” đạt 1050 thì chương trình luân nhiệt bắt đầu. 39 - Cài đặt vị trí mẫu “Plate setup” trên phần mềm đúng với vị trí mẫu đã đặt trên máy real-time PCR. - Với standard: chọn loại mẫu là “Standard” và khai báo nồng độ tương ứng với từng standard. - Với mẫu: chọn loại mẫu là “Unknown”, đặt tên hoặc số tương ứng với ký hiệu của mẫu. - Màu “Fam”: phát hiện trình tự mục tiêu HCV, màu “Hex”: phát hiện trình tự chứng nội. - Cài đặt chương trình cho máy real-time PCR hoạt động: 1 chu kỳ: 95oC-5’, 40 chu kỳ: 95oC-15’’, 60o-1’ (chọn đọc kết quả ở bước này). Chọn chức năng chờ cho đến khi “Heat lid” đạt 105o thì chương trình luân nhiệt bắt đầu. 1 chu kỳ: 95oC trong 5 phút: hoạt hóa enzyme Taq polymerase và tách mạch hoàn toàn của bộ gen cDNA. 40 chu kỳ: Z 95oC-15’’ biến tính cDNA mạch đôi thành hai mạch đơn. Z 60o-1’ hạ nhiệt độ xuống để lai, bắt cặp bổ sung để tổng hợp đọan mạch mới, đồng thời phản ứng phát quang xảy ra. Trong lúc này máy tính ghi nhận lượng huỳnh quang giải phóng ra trong phản ứng, mỗi chu kỳ máy tính ghi nhận một lần. - Số lượng chu kỳ cho một phân tử PCR không vượt quá 40 chu kỳ vì sẽ làm giảm hiệu quả khuếch đại, thoái hóa gene. - Sau khi kết thúc chương trình luân nhiệt, chuyển qua chế độ PCR Quantitation, chọn nút Report, chọn chế độ hiển thị toàn phần và in ra giấy kết quả của đợt thí nghiệm hoặc lưu file dữ liệu vào máy tính. 40 Hình 2.11. Biểu đồ: chu trình nhiệt của Real-time PCR 41 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ-THẢO LUẬN 3.1. Kết quả [7],[9],[24] 3.1.1. Biểu đồ khuếch đại của real-time PCR Trong real-time PCR, thì người làm thí nghiệm dùng biểu đồ khuếch đại (amplification graph) để quan sát được quá trình nhân bản DNA của các ống phản ứng. Biểu đồ này có trục tung (Y) là cường độ huỳnh quang phát ra từ các ống phản ứng khi nhận ánh sách kích thích, còn trục hoành (X) là các chu kỳ nhiệt. Hình 3.1. Biểu đồ một đường biểu diễn khuếch đại ghi nhận cường độ huỳnh quang phát ra từ ống phản ứng khi nhận được ánh sáng kích thích vào mỗi chu kỳ nhiệt 42 Trên biểu đồ khuếch đại (hình 3.1), người làm thí nghiệm sẽ thấy đối với từng ống phản ứng thì cường độ huỳnh quang mà máy thu nhận được sẽ rất thấp và hầu như là không thay đổi, hiến thị bằng một đường thẳng nằm ngang, đây gọi là giai đoạn ủ.Vì trong giai đoạn này, dù DNA đích đã nhân bản được thành các bản sao nhưng do số lượng chưa đủ để giúp cho chất phát huỳnh quang nhận được ánh sáng. Nhưng một khi số lượng bản sao của DNA đích đạt đến một ngưỡng nhất định thì ánh sáng huỳnh quang phát ra sẽ đủ cường độ để được máy ghi nhận và lúc này chúng ta sẽ thấy đường biểu hiện khuếch đại bắt đầu ngóc lên. Cường độ huỳnh quang trong ống phản ứng từ lúc này trở đi sẽ tăng gấp đôi sau mỗi chu kỳ nhiệt, do số lượng bản sao của DNA đích tăng gấp đôi sau mỗi chu kỳ, đây là giai đoạn lũy thừa về cường độ huỳnh quang. Cường độ huỳnh quang trong ống phản ứng sẽ tăng trưởng đến một mức nào đó thì độ tăng trưởng sẽ chậm dần và đạt đến bình nguyên, do phản ứng đã cạn dần dNTP và enzyme Taq polymertase không hoạt động hiệu quả nữa, giai đoạn này là “giai đoạn bình nguyên”. Chu kỳ ngưỡng (Ct - Threshold cyle) là chu kỳ nhiệt mà tại thời điểm đó thiết bị real-time ghi nhận được tín hiệu huỳnh quang phát ra từ ống phản ứng và bắt đầu vượt qua cường độ huỳnh quang nền. Chu kỳ ngưỡng thường là một số lẻ (ví dụ: Ct = 28.35), ít khi là một số chẵn là do chu kỳ ngưỡng là một trị số được xác định bằng số chu kỳ ở đó mà đường nền cắt đường biểu diễn khuếch đại. Để xác định được cường độ huỳnh quang nền, thiết bị real-time thường ghi nhận cường độ tín hiệu huỳnh quang xuất hiện trong ống phản ứng ở một số chu kỳ đầu, chúng ta gọi là chu kỳ nền (basal cycle), và lấy trung bình cộng của các cường độ huỳnh quang này làm cường độ huỳnh quang nền, đường cắt ngang qua đi qua cường độ huỳnh quang nền này được gọi là đường nền. Tùy theo số lượng bản DNA đích ban đầu (starting quantity) trong ống phản ứng là nhiều hay ít, nếu DNA đích nhiều thì Ct xuất hiện sớm hơn còn nếu 43 DNA đích mà ít thì Ct sẽ xuất hiện chậm hơn. Cho nên, nếu Ct cao thì ta cần giảm chu kỳ nhiệt lại, còn nếu thấp thì ta sẽ tạo ra thêm chu kỳ nhiệt. 3.1.2. Biểu đồ đường chuẩn của real-time PCR Hình 3.2 Biểu đồ đường chuẩn của phản ứng reat-time PCR Đường biễu diễn nêu lên mối quan hệ giữa chu kỳ ngưỡng với số lượng bản DNA đích ban đầu có trong mẫu chuẩn được gọi là đường biểu diễn chuẩn (standard curve). Đây là một đường thẳng tuyến tính đi qua các điểm tọa độ xác định bởi số lượng bản DNA đích ban đầu (trên trục tung) và chu kỳ ngưỡng của ống phản ứng chứa số lượng DNA đích này (Hình 3.2). Trên biểu đồ chuẩn này, trục tung (Y) là Ct, còn trục hoành (X) là số lượng bản DNA đích ban đầu có trong các mẫu chuẩn. Để xác định một biểu đồ đường chuẩn (standard curve) lý tưởng hay không, thì ta dựa vào hai thông số: * Hệ số tương quang (R2): hệ số này phải đạt là trên hay bằng 0.99, nếu người làm thử nghiệm không lấy được các thể tích chính xác thì chắc chắn các thể tích mẫu chuẩn cho vào real-time PCR mix sẽ không thể nào chính xác được, nên R2 này phải đạt là trên hay bằng 0.99. 44 * Hiệu quả PCR: E nằm trong khoảng 90% Æ 105% . 3.2. Thảo luận Để real-time PCR xác định được chính xác số lượng bản đích ban đầu có trong mẫu thử, người làm thí nghiệm phải thực hiện real-time PCR các mẫu thử chứa các số lượng bản DNA đích ban đầu, cần xác đích cùng lúc với các mẫu chuẩn chứa số lượng DNA đích ban đầu đã biết rõ số lượng và thường thì các mẫu chuẩn là các mẫu pha loãng theo hệ số pha loãng 10 chứa số lượng DNA đích ban đầu. Hình 3.3. Biễu đồ khuếch đại vẽ lên các đường biễu diễn khuếch đại của các mẫu thử và các mẫu chuẩn Sau khi hoàn tất các chu kỳ nhiệt của real-time PCR, trên biểu đồ khuếch đại (Hình 3.3), các mẫu chuẩn và các mẫu thử sẽ có đường biễu diễn khuếch đại của nó và tương ứng với các đường biểu diễn khuếch đại này, các mẫu chuẩn và mẫu thử đều có một chu kỳ ngưỡng ( Ct ) Đường biểu diễn khuyếch đại là yếu tố không thể thiếu trong phương pháp real-time PCR và nhờ vào đó ta có thể nhận biết được mẫu nào dương, mẫu nào âm dựa vào chu kỳ ngưỡng và cường dộ khuếch đại huỳnh quang. 45 Hình 3.4 Biểu đồ khuếch đại biễu diễn sự khuếch đại của các mẫu dương và mẫu âm Nhìn vào biểu đồ (hình 3.4) ta biết được mẫu nào có đi qua chu kỳ ngưỡng và có sự khuyếch đại cường độ huỳnh quang thì mẫu đó là mẫu dương, còn mẫu nào nằm dưới chu kỳ ngưỡng thì là mẫu âm. Qua biểu đồ này thì ta biết được mẫu nào có hay không có virus HCV. Các mẫu chuẩn và mẫu thử nghiệm đều có một chu kỳ ngưỡng (Ct). Do đã biết số lượng bản sao ban đầu của các mẫu chuẩn, ta có thể xây dựng được phương trình đường chuẩn thể hiện mối tương quan giữa chu kỳ ngưỡng và số lượng bản sao. Chu kỳ ngưỡng = a*log(số lượng bản sao ban đầu) +b (1) Từ Ct của mẫu xét nghiệm và phương trình (1) ta có thể xác định được số lượng bản sao ban đầu của mẫu xét nghiệm. 46 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN - ĐỀ NGHỊ 4.1. Kết luận Phương pháp Real Time PCR chứa nhiều tiềm năng trong tương lai, tuy là một lĩnh vực mới nhưng phương này có nhiều áp dụng trong nghiên cứu khoa học, trong chọn giống, trong y học, trong khoa học hình sự, trong tư vấn di truyền y học v.v… Viêm gan do virus C vẫn còn khó khăn trong chẩn đoán, điều trị đắt tiền mà hiệu quả vẫn còn hạn chế, chưa có thuốc chủng ngừa. Tần suất mang HCV RNA của bệnh nhân anti HCV[+] là 70%. Như vậy, các trường hợp anti HCV[+] mà không có HCV RNA chiếm 30% trường hợp. Hàng năm trên thế giới có 500.000 người bị ảnh hưởng của bệnh ung thư gan. Một nửa trong số những người ở trên là ở Trung Quốc, ngoài ra vùng hạ Sahara ở Châu Phi cũng có tỉ lệ ung thư cao. Ngày nay, nguyên nhân gây ra tỉ lệ lớn người bị mắc bệnh ung thư gan đã được xác định rõ ràng. Khoảng 50% các ca bệnh ung thư gan là liên quan đến sự nhiễm của Hepatitis B virus (HBV) và 25% là liên quan đến sự nhiễm của Hepatitis C virus (HCV). 50 là do HBV. Măc dù chỉ chiếm khoảng 25% các ca mắc bệnh ung thư gan Tuy nhiên, theo một số các nghiên cứu thì sự gây nhiễm của HBV thường có biểu hiện rất rõ ở năm năm đầu kể từ khi nhiễm, trong khi HCV thì thường ảnh hưởng ở giai đoạn sau. Chính vì vậy mà khoảng 75% số người mắc bệnh ung thư gan ở độ tuổi dưới, nhưng HCV được xem là virus nguy hiểm hơn HBV. Cho tới thời điểm hiện nay, chúng ta đã có vaccin để phòng HBV nhưng đối với HCV thì vẫn đang trong giai đoạn nghiên cứu. Hơn thế nữa, việc điều trị virus viêm gan C lại vô cùng tốn kém và phức tạp hơn so với điều trị những bệnh nhân nhiễm HBV. Nhiễm virus HCV là một vấn đề quan trọng trong y tế cộng đồng và việc chẩn đoán chính xác tác nhân HCV, là mục tiêu quan tâm hàng đầu của các bác sĩ, từ đó tiến hành điều trị, theo dõi diễn tiến và biến chứng của bệnh, phòng 47 ngừa sự lây lan của HCV. Hiện nay, trên thế giới có nhiều phương pháp chẩn đoán HCV như: sinh thiết gan, siêu âm gan, phương pháp khuếch đại tín hiệu, PCR ELISA, real-time PCR, … Trong các phương pháp kể trên, thì phương pháp real-time PCR được sử dụng rộng rãi nhất trong việc xét nghiêm virus HCV vì phương pháp này cho ta kết quả nhanh chóng, cho biết chính xác cơ thể hiện có đang bị nhiễm virus HCV hay không và theo dõi được HCV genotype nào để ta có thể điều trị đúng cách. Ngoài phương pháp real-time PCR còn có phương pháp PCR ELISA cũng đang được sử dụng rộng rãi trong truyền máu và giúp xác định bệnh nhân có mang virus viêm gan C trong máu hay không, bằng xét nghiệm định tính HCV- RNA vì xét nghiệm anti-HCV chỉ là xét nghiệm sàng lọc trong cho và truyền máu chứ không phải là xét nghiệm trong chẩn đoán lâm sàng, hơn nữa một người có kết quả anti-HCV[+] vẫn có thể không mang virút viêm gan C mà chỉ là kết quả của tình trạng nhiễm mầm bệnh trước đó và nay đã khỏi. 4.2. Kiến nghị Cần một giải phát toàn diện về chẩn đoán sinh học phân tử bệnh viêm gan C mạn tính. Nên nhanh chóng đẩy mạnh phát triển vá ứng dụng kỹ thuật Real-time PCR và cũng như các kỹ thuật sinh học phân tử khác vào chẩn đoán và hổ trợ cho việc theo dõi và điều trị bệnh nhân tại Việt Nam.