Khóa luận Quy trình nhân giống dâu tây in vitro

Năm 1902, nhà thông thái Haberlandt lần đầu tiên đưa ra ý tưởng nuôi cấy mô của sinh vật ngoài cơ thể nhưng ông đã dùng tế bào quá chuyên biệt nên không thành công. Năm 1934, White đã thành công trong việc phát hiện ra sự sống của việc nuôi cấy tế bào cà chua. Năm 1964, Ball là người đầu tiên tìm ra mầm rễ từ việc nuôi cấy ngọn. Ông đã thành công trong việc chuyển cây sen cạn từ môi trường nuôi cấy tối thiểu. Tuy nhiên việc nhân giống vẫn chưa hoàn chỉnh. Sau đó có rất nhiều nhà khoa học đã khám phá ra những thành phần dinh dưỡng quan trọng cần thiết cho sự phát triển của tế bào được nuôi cấy. Năm 1951, Skoog và Miler đã phát hiện ra hợp chất để điều khiển sự nhân chồi. Năm 1962, Murashige và Skoog đã cải tiến môi trường nuôi cấy đánh dấu một bước tiến trong kỹ thuật nuôi cấy mô. Môi trường của họ đã được dùng làm cơ sở cho việc nuôi cấy nhiều loại cây và vẫn còn được sử dụng rộng rãi cho đến nay. Năm 1960- 1964, Morel cho rằng có thể nhân giống vô tính lan bằng nuôi cấy điỉnh sinh trưởng. Từ kết quả đó, lan được xem là cây nuôi cấy mô đầu tiên thương mại hóa.Từ đó dến nay, công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật đã được phát triển với tốc độ nhanh trên nhiều và được ứng dụng thương mại hóa. Hình 1.1. Cây lan mô trong phòng thí nghiệm 1.1.3. Tầm quan trọng của kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào Phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật có ý nghĩa vô cùng to lớn với việc nghiên cứu lý luận sinh học cơ bản, đồng thời đóng góp trực tiếp thực tiễn sản xuất và đời sống. 1.1.3.1. Về mặt lý luận sinh học cơ bản. Nuôi cấy mô đã mở ra khả năng to lớn cho việc tìm hiểu sâu sắc bản chất của sự sống. Thông qua nuôi cấy mô và tế bào, ta có thể so sánh đặc tính cơ thể với các hợp phần của chúng khi tách rời khỏi cơ thể, từ đó rút ra những tương quan giữa các bộ phận trong cây. Thực tế đã cho pháp tách và nuôi cấy trước hết là mô phân sinh chồi từ đó cho ra nhóm tế bào không chuyên hóa là mô sẹo, từu mô sẹo có thể kích thích để tái sinh cây hoàn chỉnh. Đây là ưu thế mà các nhà khoa học sinh lý, hóa sinh và di truyền học dễ dàng sử dụng trong công việc của mình. Trong một cơ thể rất khó phân biệt được từng giai đoạn một cách cụ thể và chính xác theo chu kỳ phát triển của cá thể. Phương pháp nuôi cấy mô có thể khắc phục được khó khăn trên và dễ dàng tạo ra các bước phát sinh hình thái được phân biệt một cách rõ rệt. Điều này tạo thuận lợi cho công tác nghiên cứu về các qui luật sinh trưởng, phát triển cùng mối quan hệ giữa chúng với bên ngoài. Từ đó có thể tìm ra các mấu chốt thúc đẩy sự phát triển của cây trồng theo hướng mong muốn. Bằng phương pháp nuôi cấy mô và tế bào, có thể nghiên cứu mối quan hệ giữa ký sinh và ký chủ. Như vậy rõ ràng nhiều vấn đề về bệnh lý sẽ được giải quyết một cách cơ bản. Từ đó tìm ra những cơ chế miễn dịch của thực vật giúp cho việc phòng bệnh cây tốt hơn và đỡ tốn kém hơn. 1.1.3.2. Về mặt thực tiễn sản xuất Phương pháp nuôi cấy mô được sử dụng để đảm bảo và nhân nhanh các cây quí, có kinh tế giá trị cao. Hiện nay, phương pháp này ngày càng phổ biến trong công tac cây giống cây trồng. Bằng phương pháp nuôi cây mô, trong thời gian ngắn có thể tạo được một sinh khối lớn có họat chất: sinh khối tạo ra vẫn giữ nguyên thuộc tính, nghĩa là vẫn giữ được khả năng tổ hợp các chất thứ cấp như alkaloid. Glycosid dùng trong y học, chất dinh dưỡng trong công nghiệp thực phẩm, những chất kìm hãm sinh truởng của các vi sinh vật trong nông nghiệp. Hình 1.2. Qui trình nhân giống cây chuối trong ống nghiệm 1.2. Các thiết bị cơ bản trong phòng nuôi cấy in vitro 1.2.1. Phòng rửa và cất nước - Máy cất nước một lần. - Máy cất nước 2 lần. 1.2.2. Phòng hấp sấy - Nồi hấp Autoclave. - Tủ sấy: 60oC-200oC. 1.2.3. Phòng chuẩn bị môi trường - Cân phân tích (chính xác đến 0.0001). - Cân kỹ thuật (chính xác 0.001). - Máy đo pH. - Tủ lạnh. - Lò vi sóng. 1.2.4. Phòng thí nghiệm và nuôi cấy - Tủ cấy vô trùng. - Quạt thông gió. - Đèn tử ngọai treo trên tường. Hình 1.3. Phòng nuôi cấy mô (Phòng này để phân tích sinh hoá, phân tử và di truyền). Kính hiển vi hai mắt (độ phóng đại 1000 lần). Kính lúp hai mắt (độ phóng đại 75 lần). Hệ thống đèn chiếu. Máy phổ kế… 1.2.5. Phòng chứa mẫu Kệ chất mẫu. Bóng đèn, ổn áp… Hình 1.4. Phòng chất cây 1.3. Nuôi cấy mô tạo cây hoàn chỉnh 1.3.1. Nuôi cấy nốt đơn thân 1.3.1.1. Phương pháp Sử dụng chồi ngọn hoặc chồi mang một đoạn thân ngắn. Chồi này sẽ được kích thích tăng trưởng thành cây nguyên vẹn. Chồi được thu từ chồi ngọn hoặc ở các nách lá, sau đó cấy lên môi trường dinh dưỡng với các điều kiện thích hợp để tăng trưởng. Chồi mới tăng trưởng mang nhiều lá và tiếp tụ nhân nhanh để đạt đến số lượng cần thiết. Chồi sẽ được cảm ứng cho ra rễ để thành cây hoàn chỉnh và được chuyển ra đất trồng. 1.3.1.2 . Những điểm chú ý trong phương pháp nuôi cấy nốt đơn thân - Phương pháp này không thể áp dụng với những cây có lá xếp như hoa hồng (như cúc đồng tiền) và khi mẫu cấy có khả năng nhiễm cao. Đối với những cây này phải sử dụng phương pháp nhân chồi đỉnh. - Để giảm khả năng nhiễm, nên chọn những ngọn còn khép kín. Nền cây bị nhiễm từ bên trong thì tốt nhất là sử dụng phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng. - Tốc độ nhân giống phụ thuộc vào sồ lượng chồi có sẵn. Chồi tăng trưởng tạo ra càng nhiều lá thì số lượng chồi bên càng nhiều dẫn đến sự tăng tốc độ nhân giống. - Các chồi được trẻ hóa, đặc biệt là các chồi thân gỗ, tăng trưởng nhiều hơn so với chồi trưởng thành. - Sự tạo rễ trên các chồi trưởng thành khó thực hiện vì vậy cần trẻ hóa chồi để cảm ứng sự ra rễ. Phương pháp này đã thực hiện thành công trên một số đối tượng: cây măng tây, khoai tây,lê, cà chua,dưa chuột... 1.3.2. Nuôi cấy chồi bên Về nguyên tắc phương pháp tương tự nuôi cấy nốt đơn thân. Điểm khác nhau là trong phương pháp nuôi cấy nốt đơn thân có sự kéo dài chồi thông thường là cytokinin là yếu tố phát triển. Trong phương pháp nhân nhanh chồi bên, chồi được cô lập trong môi trường dinh dưỡng và các chồi bên của lá nách phát triển dưới ảnh hưởng của cytokynin với nồng độ cao. Vai trò của cytokinin lúc này là hạn chế ưu tính ngọn đề cho các chồi bên phát triển. Các chồi bên này tiếp tục chuyển sang môi trường mới chứa cytokinin thì các chồi bên mới lại tiếp tục tạo ra... Sau đó các chồi được đưa ra môi trường ra rễ và được đưa ra ngoài vườn ươm khi rễ đã dược hoàn chỉnh. Thực tế, cả hai phương pháp này thường được áp dụng chung: Đầu tiên chồi tăng trưởng bình thường, sau đó bổ sung cytokinin vào môi trường nuôi cấy kích thích chồi bên. Phương pháp nhân giống chồi bên được tiến hành đầu tiên trên cẩm chướng, dâu tây, cúc đồng tiền... Hiện nay, phương pháp này được áp dụng nhiều loài thực vật phổ biến là cây ăn trái. 1.3.3. Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Nhiễm virus là một trong những nguyên nhân gây ảnh hưởng lớn đến sự sinh trưởng và phát triển của thực vật. Đặc biệt, virus chuyển sang cac thế hệ kế tiếp trong quá trình thực vật sinh sản hữu tính và ngay cả vô tính in vitro. Trong đỉnh sinh trưởng của mô thực vật có dự cạnh tranh giữa sự sinh sản của virus và sự phân chia tế bào của mô phân sinh để tạo tế bào con. Ở vùng mô phân sinh trong suốt quá trình phân chia tế bào, khả năng sinh tổng hợp nucletic acid được tận dụng để phân chia tế bào sẽ gây bất lợi cho quá trình tăng sinh của virus. Để có được nhiều đỉnh sinh trưởng sạch virus làm nguồn mẫu cho nuôi cấy in vitro, trước tiên phải tiến hành tạo chồi bất định, sau đó thu đỉnh sinh trưởng từ các chồi bất định này. Nếu đỉnh sinh trưởng cô lập đang ở trạng thái hoạt động thì cơ hội loại trừ virus sẽ lớn hơn. Nếu như đỉnh sinh trưởng được cô lập có kích thước lớn thì cơ hội thu được cây sạch bệnh thấp. Phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng được áp dụng những cây trồng cây trồng quan trọng như: khoai tây, thuốc lá, lily... Một số cây thân gỗ như anh đào, mâm xôi, nho... cũng được nuôi cấy đỉnh sinh trưởng để nuôi cấy sạch bệnh. 1.3.4. Nuôi cấy bao phấn và hạt phấn Kỹ thuật nuôi cấy bao phấn và hạt phấn là kỹ thuật tạo cây đơn bội kép (DH, double haploid). Phương pháp tạo cây đơn bội kép và chọn lọc là phương pháp chọn tạo giống có hiệu quả chọn lọc rất cao đặc biệt là nếu được kết hợp với các biện pháp tạo biến dị di truyền khác như lai hữu tính gây đột biến nhân tạo. Đây là kỹ thuật không phức tạp nhưng có hiệu quả trong chọn lọc cây trồng, nhất là với cây trồng có hạt như lúa. Kỹ thuật nuôi cấy bao phấn và hạt phấn đã được phát triển thành phương pháp chọn tạo giống đơn bội. Sử dụng phương pháp này các nhà chọn tạo giống lúa đã rút ngắn thời gian và cũng giảm bớt chi phí về lao động, không cần thiết tạo ra các dòng thuần. 1.4. Một số hệ thống nuôi cấy mới 1.4.1. Nuôi cấy lỏng sục khí- Bioreactor Hiện nay, hầu hết các hệ thống vi nhân giống được thực hiện trên những hệ thống bình nuôi cấy khác nhau nhưng đều có điểm chung mẫu cấy phát triển trên môi trường đặc. Nuôi cấy trên môi trường đặc chủ yếu trên những thiết bị nuôi cấy có kích thước nhỏ nên môi trường không đủ đáp ứng cho sự phát triển lâu dài của mẫu cấy. Hơn nữa nuôi cấy trên môi trường đông đặc, môi trường bị lãng phí do cây không hấp thu hết các chất dinh dưỡng ở đáy bình nuôi cấy. Các hệ thống nuôi cấy trong môi trường lỏng trên máy lắc ban đầu dựa trên mô hình cấy vi sinh và tế bào động vật nhằm phục vụ cho nghiên cứu nuôi cấy và thu nhận các hợp chất thứ cấp. Mẫu cấy trong môi trường lỏng có khả năng tăng trưởng nhanh hơn môi trường đông đặc. Có thể do mẫu cấy tiếp xúc hoàn toàn trong môi trường. Ngày nay, hệ thống bioreactor với cấu trúc của các bình lên men và các cánh khuấy bằng kim loại được thay bằng silicon sục khí, có thể điều khiển được tốc độ dòng khí để hạn chế những tương tác bất lợi của mẫu cấy, hạn chế sự tổn thương của mẫu. Vì thế, hệ thống bioreactor được sử dụng rộng rãi với nhiều mục đích khác nhau như: nuôi cấy chồi và phôi thực vật, chồi hoa thu hải đường, nhân củ khoai tây in vitro, hoa lily, một số cây thân gỗ và đặc cấy thu nhận các hợp chất có hoạt tính sinh học như nuôi cấy rễ nhân sâm. 1.4.2. Nuôi cấy quang tự dưỡng Nuôi cấy quang tự dưỡng Đã được giáo sư Kozai và các cộng sự đẩy mạnh nghiên cứu trong thập niên 90. Từ đó đến nay có rất nhiều nghiên cứu thành công trong ứng dụng phương pháp vi nhân giống quang tự dưỡng vào sản xuất cây trồng. Phương pháp vi nhân quang tự dưỡng có nhiều ưu điểm hơn so với phương pháp truyền thống. Nó thúc đẩy sự tăng trưởng cây in vitro, rút ngắn thời gian nuôi cấy và đồng thời làm hạ giá thành cây in vitro. Phương pháp này chú trọng đến các tác nhân vật lý của môi trường nuôi cấy (ion, sự khuyếch tán khí hòa tan) và các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của cây con trong bình cấy (cường độ ánh sáng, thời gian chiếu sáng, thành phần không khí, độ ẩm, nhiệt độ và tốc độ luân chuyển của không khí trong bình nuôi cấy,...) thay vì chỉ nghiên cứu thành phần hóa học của môi trường cấy như độ đường, muối khoáng, vitamin hay các chất điều hòa sinh trưởng thực vật mà các nhà nuôi cấy quan tâm. Trong vi nhân giống quang tự dưỡng, đường không sử dụng trong môi trường nuôi cấy. Nói đúng hơn sử dụng chất hữu cơ bao gồm cả chất điều hòa sinh trưởng thực vật, vitamin, amino acid, ngoại trừ các chất khoáng được cho vào môi trường. Điều này dựa trên cơ sở tự nhiên tất cả các cây xanh chứa diệp lục tố đều có khả năng quang hợp để tồn tại và phát triển. Tất cả các cơ quan dùng trong môi trường nuôi cấy mô có diệp lục tố đều có khả năng quang hợp. Chúng đều có thể nhận CO2 không khí làm nguồn trong carbon trong quá trình quang hợp mà không cần đường và vitamin trong quá trình nuôi cấy. Phương pháp nuôi cấy mô quang tự dưỡng tạo điều kiện tối đa cho cây trong bình nuôi cấy sử dụng khí CO2 có sẵn trong không khí làm nguồn carbon cho chính quá trình tăng trưởng và phát triển của cây. Sự loại bỏ đường trong môi trường nuôi cấy dẫn đến tỷ lệ nhiễm nấm, khuẩn trong quá trình nuôi cấy giảm. Điều này đem lại ý nghĩa rất lớn trong sản xuất vì chi phí công lao động sẽ giảm đáng kể song song với việc giảm nguyên vật liệu. Theo khái niệm về nuôi cấy mô quang tự dưỡng thì hộp chứa cây cấy được xem như là nhà kính thu nhỏ. Với phương pháp này sự tăng trưởng phát triển của cây in vitro phần lớn chịu ảnh hưởng của các tác nhân vật lý trong môi trường nuôi cấy như ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm, nồng độ CO2 sự trao đổi khí. Nồng độ CO2 và ánh sáng là hai nhân tố chính quan trọng nhất trong nuôi cấy quang tự dưỡng cùng với cơ quan có diệp lục tố, sự gia tăng khác biệt giữa nồng độ CO2 bên trong và bên ngoài hộp cấy và sự gia tăng của ánh sáng làm cho hiệu quả quang hợp tăng lên. 1.5. Ưu điểm của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật Hệ số nhân giống cao: Từ một mẫu vật sạch bệnh ban đầu, bằng con đường nuôi cấy mô có thể nhân nhanh và cung cấp một lượng giống lớn trong thời gian ngắn trên một quy mô mặt bằng hạn chế. Đối với khoai tây chẳng hạn, từ một cây sạch bệnh trong ống nghiệm (in vitro) trong vòng một năm có thể nhân lên hàng ngàn cây trong phòng thí nghiệm. Chất lượng giống tốt: Mẫu cây ban đầu (có thể sạch hoặc không sạch bệnh) được nhập in vitro và nhân nhanh. Khi đạt một số lượng nhất định cần thiết, mẫu được kiểm tra bệnh virus bằng các phương pháp huyết thanh (ELISA, ngưng kết antigene – antibody), hoặc cây chỉ thị. Mẫu không nhiễm tiếp tục được nhân nhanh cho mục đích sử dụng (sản xuất giống hoặc phục vụ các nghiên cứu lai tạo giống). Mẫu đồng nhất về mặt di truyền, dòng cây mong muốn, có khả năng ra hoa và tạo quả sớm. Khả năng chủ động trong nhân giống: Trong điều kiện phòng thí nghiệm có kiểm soát, kỹ thuật nuôi cấy mô cho phép nhân giống quanh năm. Vì vậy, hoàn toàn có thể chủ động trong việc lập kế hoạch sản xuất, cung cấp giống 1.6. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trinh nuôi cấy mô tế bào thực vật Các nhân tố trong nuôi cấy mô tế bào thực vật có 3 nhân tố chính: Đảm bảo điều kiện vô trùng Chọn đúng môi trường và chuẩn bị đúng cách Chọn mô cấy và xử lí mô cấy thích hợp với trước và sau khi cấy. 1.6.1. Yếu tố vô trùng 1.6.1.1. Ý nghĩa của việc nuôi cấy vô trùng tế bào nuôi cấy mô tế bào thực vật - Môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật chứa đường, các chất khoáng, vitamin… là điều kiện thuận lợi để các vi sinh vật phát triển mạnh mẽ. - Do tế bào nấm và vi khuẩn hơn nhiều so với tế bào thực vật nên chỉ cần nhiễm một vài bào tử nấm hoặc vi khuẩn, thì chúng nhanh chóng phủ đầy trên toàn bề mặt môi trường, bề mặt mô tế bào thực vật. Các vi sinh vật lấn áp tế bào nuôi cấy mô thực vật sẽ làm cho mô thực vật phát triển chậm lại và chết dần. 1.6.1.2. Nguồn tạp nhiễm Có 3 nguồn tạp nhiễm chính: Dụng cụ, nút đậy, môi trườn nuôi cấy không được vô trùng tuyệt đối. Trên bề mặt mô có chứa các sợi nấm, bào tử nấm và bào tử vi khuẩn. Trong quá trình thao tác làm nhiễm các bào tử nấm hoạc vi khuẩn vào môi trường nuôi cấy. 1.6.2. Kỹ thuật vô trùng 1.6.2.1. Vô trùng thuỷ tinh, nút đậy, môi trường Dụng cụ thuỷ tinh: thông thường dụng cụ thuỷ tinh dùng trong các phòng thí nghiệm bằng dung dịch sulfocromate một lần trước khi đưa vào sử dụng, về sau chỉ cần rửa sạch để ráo trước khi sử dụng . Trong trường hợp các dụng cụ thủy tinh dùng trong thí nghiệm nuôi cấy mô và tế bào thực vật đòi hỏi phải vô trùng, có thể khử trùng bằng cách đưa vào tủ sấy sấy trong nhiều giờ dụng cụ phải được gói trong giấy nhôm hoặc cất trong hộp kim loại để tránh bị nhiễm trơ lại sau khi khử trùng. Bảng 1.1 Thời gian khử trùng dụng cụ thủy tinh bằng nhiệt độ và nhiệt độ khử trùng. Nhiệt độ khử trùng (oC) Thời gian khử trùng (Phút) 160 45 170 20 180 10 190 7,5 Nút đậy: thường là nút đậy không thấm nước. Nút đậy phải chặt để bụi đi qua được đồng thời nước ở môi trường cũng không bốc hơi dễ dàng trong quá trình nuôi cấy. Bông thấm nước là một loại chất đơn giản nhất nhưng có những nhược điểm sau: - Nếu khi nút bông bị ướt hoạc dính môi trường thì sẽ bị nấm nhất là đối với những thí nghiệm lâu dài. - Thao tác nút bông chậm không thể sản xuất trên qui mô lớn. - Chỉ dùng vài lần rồi bỏ. Môi trường : Môi trường nuôi vấy thường được hấp khử trùng trong nồi autoclave, khử trùng bằng áp suất hơi bão hòa. Thời gian thường 15 -30 phút ở áp suất 1atm nhiệt độ 121oC. Bảng 1.2: bảng thể tích và thời gian hấp khử trùng( Autoclave) Thể tích môi trường (ml) Thời gian hấp khử trùng (phút) <50 15 75 20 250 - 500 25 1000 30 Việc hấp khử trùng này không hợp với các chất nhạy cảm với nhiều như: acid amin, các vitamin, hormone tăng trưởng, các chất kháng sinh. Các chất này thường được khử bằng cách lọc qua màng lọc polyethylen hoặc sợi cellulose. Các lỗ màng này có thể giữ lại các vi sinh vật. 1.6.2.2. Khử trùng nơi thao tác cấy và dụng cụ cấy Nguồn nhiễm tạp quan trọng và thường xuyên nhất là bụi rơi vào dụng cụ thuỷ tinh chứa môi trường trong khi mở nắp hoặc nút bông để thao tác cấy. Người ta áp dụng nhiều biện pháp khác nhau để chống lại nguồn nhiễm tạp này. Phòng cấy thường là buồng có diện tích hẹp, rộng từ 10-15m2, có hai lớp cửa để tránh không khí chuyển động từ bên ngoài trực tiếp đưa bụi vào. Sàn và tường lát gạch men để có thể lau chùi thường xuyên. Vô trùng phòng cấy: Trước khi đưa vào sử dụng hoặc cứ sau 2-3 tháng, phòng cấy phải được xử lý hơi formalin bằng cách rót formol 40% ra một số đĩa petri để rải rác vài nơi trong phòng cho bốc hơi tự do, đóng kín cửa phòng cấy trong 24h, sau đó bỏ formalin đi và khử hơi formalin thừa bằng dung dịch amoniac 25% cũng để rải rác trong phòng 24h. Để đảm bảo mức độ vô trùng cao, trong phòng cấy ngoài đèn tử ngoại trong box cần có 4 đèn tử ngoại 40W trên trần. Chỉ cho các đèn tử ngoại làm việc khi không có người làm việc trong box cấy. Nên bật đèn tử ngoại 30 phút và tắt trước 30 phút trước khi làm việc hoặc bật sau khi đã ngưng làm việc. Cần hạn chế chuyển động không khí trong phòng cấy đến mức tối thiểu. Các dụng cụ làm việc phải chuẩn bị đầy đủ, bố trí hợp lý, thuận tiện để làm việc và hạn chế đi lại khi cấy, ra vào buồng cấy, đóng cửa cẩn thận. Phòng nuôi cũng phải được khử trùng trước là bằng xà bông bột, sau đó lau bằng dung dịch calcium hypochlorite loãng hoặc cồn 70%. Tất cả trần, sàn đều phải được lau như vậy mỗi tuần. Không được khuấy động những nơi bị nhiễm để tránh phát tán bào tử. Khử trùng các dụng cụ kim loại và môi trường khoáng: Các dụng cụ kim loại được khử trùng bằng không khí nóng (130o – 170oC). Các dụng cụ này phải được gói kín trước khi khử trùng, nên gói trong giấy nhôm là tốt nhất. Không nên hấp khử trùng dụng cụ kim loại vì điều kiện nóng ẩm sẽ làm kim loại bị rỉ sét và bị ăn mòn. Autoclave là phương pháp khử trùng bằng hơi nước dưới một áp suất nhất định nút gòn, khăn vải, các vật dụng phòng thí nghiệm bằng thủy tinh, các bình nuôi cấy bằng plastic, nút cao su, các bộ lọc, nước, môi trường khoáng đều có thể khử trùng bằng nồi hấp. Gần như tất cả vi sinh vật đều bị tiêu diệt bởi hơi nước trong nồi hấp thời gian từ 10 - 30 phút ở nhiệt độ 121o, 1,5 atm. Môi trường sau khi pha chế có thể chuyển vào bình cấy với lượng cần thiết trước khi hấp tiệt trùng, cũng có thể hấp trước với khối lượng lớn và rót chuyển vào bình cấy trong box cấy. Thời gian hấp tiệt trùng phụ thuộc dung tích môi trường trong dụng cụ đựng khi hấp ở nhiệt độ 121o, 1,5atm. Thời gian tối thiểu này gồm cả thời gian cần thiết để nhiệt độ nồi hấp đạt đến 121oC và 15 phút tiệt trùng. Đối với môi trường khoáng, áp suất không nên cao quá 1atm vì áp suất cao sẽ làm phân hủy carbohydrate và các phức hợp nhạy cảm với nhiệt độ. Sau khi tiệt trùng, môi trường được chuyển ngay sang phòng cấy để làm nguội và sử dụng theo yêu cầu. Nếu là môi trường thạch hấp với khối lượng lớn trước khi chia vào bình cấy, thì chuyển ngay vào box cấy đã được vô trùng để tránh nhiễm. Trên bàn thường xuyên có một đèn cồn để sử dụng khi cấy và cốc đựng cồn 90% để nhúng các dụng cụ làm việc. Các dụng cụ khác để cấy như bình môi trường, ống nghiệm, bình đựng mẫu cấy chuyền… Đều được xử lý khử trùng bề mặt bằng cách lau bằng cồn 70 % trước khi đưa vào trong box cấy. 1.6.3. Yếu tố môi trường Một trong nghững yếu tố quan trọng nhất đối với sự tăng trưởng và phát sinh hình thái của tế bào và mô thực vật trong nuôi cấy là thành phần môi trường. Thành phẩn này thay đổi tùy theo loài và bộ phận nuôi cấy. Đối với cùng một mẫu cấy nhưng tùy theo mục đích thí nghiệm mà thành phần môi trường cũng thay đổi. Tuy nhiên tất cả các môi trường nuôi cấy thành phần dinh dưỡng bao gồm 5 phần: khoáng đa lượng, khoáng vi lượng, vitamin, đường (nguồn carbon) và các chất điều hòa sinh trưởng thực vật. Có một số công thức môi trường thường được sử dụng chủ yếu trong nuôi cấy mô tế bào thực vậtnhư môi trường MS (Murashige và skoog), B5 (Ganborg và cộng sự), SH (Schenk và Hilderbrandt) có hàm lượng cao và một số môi trường khác mô tả bởi White, Gautheret, Nitach Loyd và Mc Cown có hàm lượng khoáng đa lượng thấp. 1.6.3.1.Khoáng đa lượng Nhu cầu khoáng của mô, tế bào tách rời không khác nhiều so với cây trồng trong tự nhiên. Các nguyên tố đa lượng cần phải cung cấp N, P, K, Ca, Mg và Fe. 1.6.3.2. Khoáng vi lượng Nhu cầu khoáng vi lượng trong nuôi cấy mô thực vật in vitro là lĩnh vực còn ít được nghiên cứu. Trước đây, khi kỹ thuật nuôi cấy mô mới ra đời, người ta không nghĩ đến việc bổ sung khoáng vi lượng vào môi trường nuôi cấy. Các thí nghiệm thành công do argar và hóa chất dùng để pha môi trường không tinh khiết mà có lẫn một số nguyên tố vi lượng cung cấp phần nào cho môi trường nuôi cấy cung cấp phần nào cho môi trường nuôi cấy. Các nguyên tố vi lượng cần cung cấp cho tế bào là: Zn, Cu, B, Mn, Co, Mo... 1.6.3.3.Carbon và nguồn năng lượng Trong nuôi cấy in vitro, nguồn carbon giúp mô và tế bào thực vật tổng hợp nên các chất hữu cơ để tế bào phân chia, tăng sinh khối không phải từ quá trình quang hợp mà chính là nguồn carbon bổ sung vào môi trường dưới dạng đường. Hai dạng đường thường hay gặp nhất là glucose và surcose. Các nguồn carbonhydrate khác cũng được tiến hành thử nghiệm như: Lactose, galactose, rafinose, maltose và tinh bột nhưng nguồn carbohydrate này có hiệu quả kém hơn so với glucose và sucrose. Sucruse là nguồn carbon quan trọng đối với mô tế bào nuôi cấy. Nồng độ sucrose ban đầu có thể ảnh hưởng đến một số tham số nuôi cấy như tốc độ tăng trưởng và sản lượng hợp chất thứ cấp trong nuôi cấy tế bào thực vật. 1.6.3.4.Vitamin Thông thường thực vật tổng hợp các vitamin cần thiết cho sự tăng trưởng và phát triển của chúng. Chúng cần vitamin để xúc tác nhiều quá trình biến dưỡng khác nhau. Khi tế bào và mô được nuôi cấy in vitro thì một vài vitamin trở thành yếu tố giới hạn cho sự phát triển của chúng.các vitamin thường được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô là thiamin (B1), acid nicotinic, piridorxite (B6) và mio- inositol. 1.6.3.5. Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật Trong nuôi cấy mô thực vật có 5 nhóm chất điều hòa quan trọng trong nuôi cấy mô thực vật: auxin, gibberellin, cytokinin, abscisic acid và ethylen. Miller là người đầu tiên nhận thấy tỉ lệ auxin và cytokinin bổ sung vào môi trường để kích thích sự phát sinh hình thái và tỷ lệ phytohormone sử dụng để kích thích sự tạo chồi hay sự tạo rễ không giống nhau. Auxin: Tự nhiên là hợp chất tương đối dơn giản: indol-3- acetic acid (IAA). Các chất có cấu trúc gần giống như IAA và có cùng vai trò với IAA trong cơ quan đều được gọ là auxin (như: IBA, NAA. 2,4-D, 2,4,5- t và phenoxyacetic acid) auxin phối hợp với cytokinin giúp sự tăng trưởng chồi non và khôi phục tạo mới mô phân sinh chồi từ nhu mô. Tuy nhiên, ở nồng độ cao auxin cản trở sự phát triển của các phát thể chồi vừa được thành lập hay các chồi nách (các chồi ở trạng thái tiềm sinh), auxin ở nồng độ cao kích thích sự tạo sơ khỏi rễ (phát thể non của rễ) nhưng cũng cản trở sự tăng trưởng của các sơ khởi này. Trong sự tạo rễ auxin cần phối hợp với các vitamine (như thiamine mà rễ không tạo được), amino acid (như arginin), và nhất là các hợp chất othordiphenollic (như cafeic acid, chlorogenic acid) Cytokinin: là một loại chất sinh trưởng thực vật thực vật kích thích tế bào phân chia. Các hợp chất này xuất phát từ purine adenin, một trong cac base của DNA và hợp chất cytokinin đầu tiên được khám phá ra là kinetine, tiếp theo là zeatin một chất có trong phần lớn thực vật và một vài vi khuẩn cấu trúc gần giống kinetine nhưng hoạt tính cao hơn gấp 10 lần. Sau zeatin hơn 30 cytokinin khác nhau được cô lập. Ngày nay, cytokinin để chỉ một hợp chất tự nhiên hay nhân tạo, có đặc tính sinh lí giống kinetin. Nhiều hợp chất có hoạt tính cytokinin, chúng đều là apminopurin được thay thế ở vị trí thứ 6, ví dụ như BA. Cytokinin kích thích sự phân chia tế bào với điều kiện có auxin và cytokinin tác động trên cả 2 bước của sự phân chia tế bào: phân nhân và phân bào. Trong nuôi cấy mô nghèo cytokinin (mô lõi thuốc lá, vỏ rễ đậu) auxin kích thích sự phân đôi nhiễm sắc thể, thậm chí là tạo tế bào hai nhân, nhưng không có sự phân vách: sự phân vách chỉ xảy ra khi cytokinin ngoại sinh. Cytokinin giúp đỡ sự gia tăng kích thước tế bào và sinh tổng hợp protein. Trong thân và rễ, cytokinin cản trở sự kéo dài nhưng kích thích sự tăng rộng lá tế bào lá trưởng thành. Trong các nghiên cứu nuôi cấy mô thực vật, tỷ lệ auxin/cytokinin (A/C) là một yếu tố rất quan trọng: A/C cao sự tao rễ, A/C thấp sự tạo chồi, vậy cytokinin hỗ trợ auxin trong tăng trưởng nhưng đồng thời nhưng đồng thời cũng có sự đối kháng giữa auxin( giúp tạo rễ) và cytokinin giúp tạo chồi. Sự cân bằng giữa 2 phytohormone này là một trong những yếu tố kiểm soát phát triển. (2,4- diclorophenoxy) acetic acid Napthalene acetic acid Kinetin 6- Benzyl adenin Hình 3.1. Công thức một số chất điều hòa sinh trưởng thực vật Ngoài 5 thành phẩn cơ bản trên người ta còn bổ sung một số chất hữu cơ có thành phần xác định (amino acid, ETDA...) và một số chất có thành phần không xác định như nước dừa. Dịch chiết nấm men... vào môi trường nuôi cấy. 1.6.3.6. Các chất hữu cơ không xác định Bổ xung nhiều chất trích hữu cơ khác nhau vào môi trường nuôi cấy mang lại kết quả thuận lợi cho sự tăng trưởng mô. Chất bổ sung là: protein hydrolysate, nước dừa, dịch chiết nấm men, dịch chiết lúa mạch, chuối, nước cam, cà chua. Tuy nhiên chỉ có nước dừa và protein hydrolysate là được được sử dụng rộng rãi. 1.6.3.7. Amino acid và các nguồn cung cấp nitrogen khác Mặc dù tế bào cáo khả năng tổng hợp các amino acid cần thiết nhưng sự bổ sung amino acid vào môi trường nuôi cấy là kích thích sự tăng trưởng của tế bào. Amino acid cung cấp cho nguồn tế bào thực vật nguồn amino acid sẵn sàng cho nhu cầu của tế bào và nguồn nitơ này được tế bào hấp thu nhanh hơn so với nitơ vô cơ. Các nguồn nitơ thường được sử dụng là nguồn amino acid như casein hydrolysate, L- glutamine, L- asparine và adenine. 1.6.3.8. Than hoạt tính Việc bổ sung than hoạt tính vào môi trường nuôi cấy có tác dụng khử độc. Ảnh hưởng của than hoạt tính: hút các hợp các chất cản, hút các chất cản, hút các chất điều hòa sinh trưởng và làm đen môi trường. Tác dụng càng tăng trưởng của mô trong môi trường có than hoạt tính là do nó hút các chất điều hòa sinh trưởng trong môi trường như: NAA, kinetin, BAP, IAA và 2ip. Khả năng kích thích tăng trưởng là do than hoạt tính kết hợp với chất phenol độc do mô tiết ra trong suốt quá trình nuôi cấy. 1.6.3.9. Yếu tố làm đặc môi trường Argar là chất thường được sử dụng để tạo môi trường đặc hay môi trường bán rắn trong nuôi cấy mô thực vật. Khi argar được trộn chung với nước thì tạo ra ở dạng gel và tan ở nhiệt độ từ 600 – 1000C, đặc lại khi nhiệt độ xuống còn 450 vì vậy argar ổn định trong tất cả các điều kiện nhiệt độ môi trường và không bị phân hủy bởi enzyme thực vật. Hơn nữa argar không bị phản ứng với các chất trong môi trường. Độ ứng của argar quyết định bởi số argar sử dụng và pH môi trường. 1.6.4. Khử trùng mô thực vật Các mô thực vật hầu như là các bộ phận của cây. Các mẫu trước khi nhập mẫu đòi hỏi phải tiến hành khử trùng bề mặt mẫu tránh tạp nhiễm. Các bước để xử lý khử trùng gây bề mặt mẫu vật: - Chọn lựa mẫu cấy tốt nhất, rửa kỹ mẫu bằng nước máy (trong dòng chảy) cho sạch bụi bẩn. - Ngâm rửa mẫu bằng nước xà phòng loãng trong ba phút (lắc nhẹ liên tục trong quá trình ngâm) - Rửa sạch xà phòng bằng nước máy (trong dòng chảy). Chuyển vào box đã được xử lý, vô trùng từ trước, mọi thao tác từ đây đều phải áp dụng các biện pháp vô trùng. - Dùng panh vô trùng gắp chuyển mẫu sang dung dịch khử trùng (panh này không dùng lại nữa nếu không khử trùng lại), ngâm (lắc nhẹ) mẫu trong dung dịch khử trùng trong thời gian ấn định. – Chú ý: Hiệu quả xử lí các chất phụ thuộc vào thời gian, nồng độ, và khả năng xâm nhập vào các khe của tế bào, và khả năng đẩy hết bọt khí trên bề mặt các mô cấy. Để tăng tính linh động và khả năng hoạt động của các chất khử trùng trước tiên nguời ta thường ngâm tế bào mô thực vật trong cồn 70o sau đó mới xử lí dung dịch diệt khuẩn. Đồngthời người ta có thể cho thêm vào các chất giảm sức căng bề mặt như tween 80, Fotoflo, teepol vào dung dịch diệt khuẩn. Bảng 1.3. Thời gian và nồng độ các chất khử trùng( Street (1974) Tác nhân vô trùng       Nồng độ %      Thời gian xử lý        Hiệu quả (phút) Calci hypochlorit            9 – 10                  5 – 30                   Rất tốt Natri hypochlorit              2                       5 – 30                  Rất tốt Hydro peroxid               10 – 12                5 – 15                   Tốt Nước Brom                   1 - 2                       2 – 10                 Rất tốt HgCl2 0.1 – 1                   2 – 10                  Trung bình Chất kháng sinh       4 – 50 mg/l                   30 – 60              Khá tốt - Rửa sạch mẫu bằng nước cất vô trùng 3-4 lần. Nếu rửa không sạch, chất khử trùng có thể làm chết mẫu. - Nhập mẫu sau khi khử trùng chuyển mẫu ra giấy thấm (dưới lớp giấy thấm có một lớp giấy không thấm hoặc đĩa petri vô trùng). Tiến hành cắt tách mẫu, tỉa bỏ các phần dập nát, hư hỏng và cấy chuyển ngay mẫu thu được vào môi trường nhập mẫu đã chuẩn bị trước. Sau trên dưới một tháng (tùy từng loại mẫu) cấy chuyễn những mẫu sạch sang môi trường nhân nhanh. 1.7.Giới thiệu và phân loại dâu tây 1.7.1 .Nguồn gốc và phân loại dâu tây Dâu tây có tên khoa học là Fragaria hay còn gọi là dâu đất là một loài thuộc họ hoa hồng. Xuất sứ từ châu Mỹ và được các nhà làm vườn châu Âu lai tạo thế kỷ 18 và tạo ra giống dâu ngày nay. Hình thái quả dâu tây là một loại quả giả, nghĩa là phần thịt không bắt nguồn từ bầu nhụy (Là các hạt mà người thông thường nhìn thấy, trên thực tế chúng là một dạng quả bế) mà từ cái móc ở đáy hypanthium để giữ các bầu nhụy. Từ quan điểm thực vật học, các hạt là quả thực sự của thực vật, và phần cùi mọng nước của dâu tây là mô đế hoa bị biến đổi. Hình 1.6. Quả dâu tây Dâu tây là cây được nhiều nguời ưa thích vì hình dạng, màu sắc và mùi vị. Phân loại khoa học: Giới : Plantea (thực vật) Ngành : Angiospermae (hạt kín) Lớp : Rosids (hoa hồng) Bộ : Rosales (hoa hồng) Họ : Rosaceae (hoa hồng) Hình 1.7. Cây dâu tây Chi : Fragaria Loài : Fragaria. sp (có hơn 20 loài trên thế giới) 1.7.2. Phương pháp nhân giống dâu tây 1.7.2.1. Phương pháp truyền thống Cắt cành từ cây mẹ. Phương pháp này hệ số nhân giống thấp cây dễ bị hoái hóa, đồng thời rễ cây yếu. Phương pháp này không đảm bảo sạch bệnh cây bị tryền bệnh từ đời này sang đời khác. Phương pháp nhân giống in vitro: Sử dụng chồi cây tiến hành nhân giống trong phòng thí nghiệm, lúc này cây sẽ được nuôi cấy một cách hoàn chỉnh nhanh chóng, ta được giống sạch bệnh và trẻ hóa được giống cây. 1.7.2.2. Các bước nhân giống dâu tây in vitro Trước khi đi sâu vào qui trình nhân giống cây dâu tây, ta sẽ đi tổng quát các bước nhân giống in vitro Chọn lựa và khử trùng mẫu cấy: Mẫu cấy là mảnh mô thực vật được đặt vào trong môi trường nuôi cấy. Để tiến hành nuôi cấy in vitro thành công, khi lựa chọn mô cấy cần lưu ý đến tuổi sinh lý của cơ quan được dùng làm mẫu cấy, vụ mùa lấy mẫu cấy, vụ mùa lấy mẫu, chất lượng của cây lấy mẫu kích thước và vị trí lấy mẫu đó... Mẫu cấy sau khi chọn lựa được rửa sạch bằng xà phòng và khử trùng bề mặt bằng các chất khử trùng hóa học như calcium hypochloride, sodium dihloroisocyanurate, chlorua thủy ngân,... Tạo thể nhân giống in vitro: Mẫu cấy trên môi trường để tạo thể nhân giống in vitro. Có hai thể nhân giống in vitro là thể chồi và thể cắt đốt. Tạo thể nhân giống in vitro phụ thuộc vào đặc điểm nhân giống ngoài tự nhiên của cây trồng. Đối với những loài không có khả năng nhân giống, người ta thường thường bổ sung cytokinin, GA3 và các chất hữu cơ khác. Nhân giống in vitro: Đây là giai đoạn quan trọng trong nhân giống bằng cách tạo cụm từ chồi mô sẹo. Trong môi trường nhân giống giai đoạn quan trọng trong nhân giống cây trồng bằng phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật nhằm mục đích tăng sinh khối thể nhân giống . Vật liệu nuôi cấy là những thể chồi, môi trường nuôi cấy thuờng là môi trường tạo thể chồi, đôi khi nồng độ chất sinh trưởng giảm thấp cho phù hợp với quá trình nhân giống kéo dài. Điều kiện nuôi cấy thích hợp giúp cho quá trình tăng sinh diễn ra nhanh. Cây nhân giống in vitro ở trạng thái trẻ hóa và được duy trì trong thời gian dài. Tái sinh cây in vitro hoàn chỉnh: Đây là giai đoạn tạo cây con hoàn chỉnh có đầy đủ thân, lá rễ để chuẩn bị chuyển ra vườn ươm. Cây con phải khỏe mạnh để nâng cao sức sống khi ra môi trường bình thường. Các cơ chất có tác dụng tạo chồi được loại bỏ, thay vào đó là các chất kích thích quá trình ra rễ. Điều kiện nuôi cấy gần như với điều kiện bên ngoài , một bước làm thích nghi trước khi tách khỏi điều kiện nuôi cấy in vitro. Sự tạo rễ phụ thuộc vò các yếu tố: hàm lượng auxin nội sinh, ánh sáng, sự trẻ hóa của mẫu, kiểu di truyền. Người ta thường bổ sung auxin kích thích quá trình ra rễ in vitro Chuyển cây con in- vitro ra vườn ươm: Cây con đã ra rễ được lấy khỏi ống nghiệm, rửa sạch argar và được đặt trong chậu nơi có bóng râm, độ ẩm cao, cường độ chiếu sáng thấp,... sau khoảng 2 tuần, cây đã bắt đầu thích nghi với điều kiện bên ngoài lúc này ta có thể tăng cường độ chiếu sáng và hạ độ ẩm. Đây là giai đoạn rất quan trọng trong qui trình nhân giống vô tính vì cây con thường bị chết do sự khác biệt giữa diều kiện sống in vitro và ex vitro. Cây con in vitro được nuôi cấy trong điều kiện ổn định về môi trường dinh dưỡng, ánh sáng, nhiệt độ, nên khi chuyển ra đất, với điều kiện tự nhiên hoàn toàn khác hẳn như dinh dưỡng thấp, ánh sánh cường độ mạnh, nhiệt độ cao, độ ẩm thấp cây con dễ bị stress dễ bị mất nước dẫn đến hiện tượng chất. Để tránh tình trạng này, vườn ươm cấy mô phải mát, cường độ ánh sáng thấp, độ ẩm cao. Cây con thường được cấy trong luống cây có cơ chất dễ thoát nước, tơi xốp và giữ độ ẩm, trong những ngày đầu tiên phải phủ nylon để giảm sự thoát hơi nước ở lá (thường 7-10 ngày kể từ ngày cấy). Rễ được tạo ra trong quá trình nuôi cấy mô dần dần lui đi và rễ mới xuất hiện, cây con thường được xử lí ra rễ bằng cách ngâm rễ hay phun lên lá các hợp chất kích thích ra rễ, nồng độ thấp đẻ rút ngắn quá trình ra rễ CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. Thời gian và địa điểm Tiến hành tại tổ nuôi cấy, phòng sản xuất (Trung Tâm Nghiên Cứu Khoai tây, Rau và Hoa Đà Lạt). 2.2. Vật liệu phương pháp 2.2.1. Đối tượng nghiên cứu Sử dụng cây dâu tây nhân giống in vitro tại tổ nuôi cấy phòng sản xuất (Trung Tâm Nghiên Cứu Khoai tây, Rau và Hoa Đà Lạt). 2.2.2.Trang thiết bị và dụng cụ 2.2.2.1. Phòng chuẩn bị và giữ môi trường dinh dưỡng Dùng để chuẩn bị môi trường. Khử trùng môi trường và dụng cụ nuôi cấy Trang thiết bị: + Tủ cấy vô trùng. + Tủ lạnh. + Nhiệt kế, ẩm kế. + Máy đo pH. + Bếp từ. + Cân điện tử. + Nồi hấp. + Kệ đặt bịch môi trường. 2.2.2.2. Phòng thao tác cấy. Phòng này thực hiện thao tác nuôi cấy Trang thiết bị: + Tủ cấy + Đèn UV + Giá thể môi trường + Dụng cụ hấp vô trùng 3.1.2.3. Phòng nuôi cây Phòng này phải có những điều kiện thích hợp để cây in vitro phát triển. + Cường độ chiếu sáng: 2000 lux + Nhiệt độ phòng: 23 – 27oC + Ẩm độ: 60- 80 % + Thời gian chiếu sáng: 16 giờ 2.2. Phương Pháp nghiên cứu 2.2.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất khử trùng và thời gian lên khả năng sống xót của mẫu Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên. Sử dụng bộ phận của cây dâu tây để nhân giống: chồi tia. Mẫu cấy: chồi tia dâu tây khỏe mạnh Rửa: - Đặt mẫu xuống vòi nước chảy mạnh trong vòng 1 phút. - Cho vào dung dịch xà phòng lắc đều 2 - 3 phút. - Đặt dưới vòi nước chảy cho sạch xà phòng - Vô trùng sơ bộ bằng cồn 70%, lắc đều 1-2 phút - Xử lý trong dung dịch khử trùng Calcium hypochlrorite. Trong khi khử trùng tiến hành lắc nhẹ để chất khử trùng tác dụng đều lên mẫu. Trước khi tiến hành tách đỉnh sinh trưởng, mẫu xử lý phải được rửa sạch Calcium hypochlrorite nước cất vô trùng 3-4 lần hoặc hơn. Vào mẫu: Đưa mẫu vào Box cấy vô trùng vào mẫu vào môi trường. Hình 2.1.Ngọn dâu tây sau khi xử lí mẫu. Hình 2.2.Đỉnh sinh trưởng sau khi cắt Thí nghiệm bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 9 nghiệm thức. Bảng 2.1. Bố trí thí nghiệm khử trùng Nồng độ CKT Thời gian(phút) 7% 12% 20% 10 1,1 2,1 3,1 15 1,2 2,2 3,2 30 1,3 2,3 3,3 Cấy trên nền môi trường ½ MS bổ sung thêm 0,4 mg/1 BA và 25g/1 đường 2.2.2. Thí nghiệm 2: Theo dõi ảnh hưởng của BA kết hợp với môi trường MS đến khả năng sinh trưởng và tạo chồi của cây dâu tây Sau 30 ngày chồi phát triển thành cụm gồm nhiều chồi non, thu chồi dâu tây sẽ được cắt và nhân sang môi trường cụm. Ta dùng dao cấy gạt nhẹ lớp thạch và cắt cụm ra thành nhiều phần, tiếp đó ta cấy vào trong bịch. Đối với những bịch mới nhập mẫu ta chú ý chỉ cấy 2-3 cụm trong một bịch.Sau đó chất lên giàn chứ giống, tiếp tục như vậy cứ khoảng 25-30 ngày ta tiến hành nhân cụm và một bịch khoảng 4-5 cụm. Hình 2.3. Cụm dâu tây sau khi cắt chồi để nhân Nhân nhanh trên nền môi trường Chất lên dàn khảo sắt thời gian ra chồi và số lượng chồi tạo ra trong môi trường nuôi cấy. Hình 2.4. Cụm dâu tây cắt rồi được cắm vào trong bịch Hình 2.5. Dâu tây được cắm khoảng 4-5 cụm trong bịch Thí nghiệm 1 yếu tố bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên lặp lại 3 lần. Thí nghiệm được bố trí dựa trên khảo sát BA ở nhiều nồng độ khác nhau. Nhằm tìm ra hàm lượng BA thích hợp nhất kết hợp với môi trường ½ MS tạo chồi hiệu quả nhất. Bảng 2.2. Khảo sát quá trình phát triển chồi trên nồng độ BA khác nhau Nồng độ BA Lặp lại 0mg/l 0,25mg/l 0,5mg/l 1 ½ MS ½ MS ½ MS 2 ½ MS ½ MS ½ MS 3 ½ MS ½ MS ½ MS 2.2.3. Thí nghiệm 3: Theo dõi ảnh hưởng của NAA đến khả năng tạo rễ của cây dâu tây Quá trình nhân ra rễ là quá trình nhằm mục đích tạo cây có rễ hoàn chỉnh để ra vườn ươm. Vật liệu được lấy từ môi trường cụm nhân nhanh sau 25-30 ngày, sử dụng panh cấy và dao tách nhưng cây đơn, to khỏe mạnh vào môi trường cấy tạo rễ. Không phải lấy toàn bộ trong quá trình nhân nhanh những cây nhỏ yếu tiếp tục nhân nhanh để nhân chồi mới. Hình 2.6. Cụm dâu tây sau khi nhân cụm 26 ngày Sau khi thu nhận bịch nhân chồi sau 26 ngày ta tiến hành cắt sử sụng ngọn có từ 3 - 4 lá, chiều cao khoảng 2,5 – 3,5 cm lấy ra cấy trong môi trường ra rễ, phần còn lại tiếp tục quá trình nhân nhân nhanh chồi. Thí nghiệm 1 yếu tố bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên lặp lại 3 lần. Thí nghiệm được bố trí dựa trên khảo sát NAA ở nhiều nồng độ khác nhau. Nhằm tìm ra hàm lượng NAA thích hợp nhất kết hợp với môi trường ½ MS tạo chồi hiệu quả nhất. Bảng 2.3. Bố trí thí nghiệm khảo sát nồng độ NAA khác nhau Nồng độ NAA Lặp lại 0,15mg/l 0,25mg/l 0,5mg/l 1 ½ MS ½ MS ½ MS 2 ½ MS ½ MS ½ MS 3 ½ MS ½ MS ½ MS 2.2.4. Thí nghiệm 4: Theo dõi thời gian phát triển của cây dâu tây ngoài vườn ươm Cây dâu sau những qui trình trồng trong phòng thí nghiệm, có sẵn mặt dinh dưỡng, ánh sáng yếu, ví vậy đây là giai đoan quan trọng cho quá trình phát triển sau này của cây. Điều quan trọng nhất củ quá trình này là ta phải tập nắng cho cây. Trung bình một bịch cấy ra rễ có khoảng 35 - 40 cây dâu. Giai đoạn tạo rễ khoảng 5-7 ngày, sau đó đưa bịch cây ra tập nắng để chuẩn bị cho giai đoạn ra vườn ươm. Cho cây tập nắng 2- 3 ngày cho cây quen với ánh sáng tự nhiên. Cây đã đủ điều kiện khỏe mạnh, có rễ, chiều cao khoảng 2,5- 3,5 cm thì ta tiến hành rửa sạch argar môi trừơng bám vào cây, sau đó cắm vào vỉ xốp đã có sẵn thành phần môi trường. Sau đó tiến hành chăm sóc. Hình 2.7 Bịch dâu tây sau khi tập nắng rửa sạch lớp thạch Hình 2.8. Chọn những cây khỏe và có rễ đầy đủ Hình 2.9. Công nhân đang cắm dâu vào vỉ xốp Sử dụng đất trộn với sơ bừa cới tỷ lệ 1 sơ dừa 2 đất mùn,nhồi vào vỉ tưới nước vào vỉ cho đủ độ ẩm yêu cầu. Khi cắm cây chú ý đất phải ẩm, cắm lấp hết rễ cây, không lấp ngọn của cây dâu, sau khi cắm xong thì phải tiến hành ghi lại ngày, giống trên vỉ xốp. Hình 2.10. Cây dâu sau khi ra vỉ xốp CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát các bước trong giai đoạn nhập mẫu Một trong những thành phần đóng vai trò quan trọng trong thí nghiệm 1 là thành phần môi trường, nó ảnh hưởng đến quá trình hình thành và phát triển chồi thành cây. Bên cạnh những chất dinh dưỡng cần thiết cho quá trình nuôi cấy mô bảo vệ thực vật, thì thành phần các chất dinh dưỡng cũng góp phần không nhỏ trong quá trình kích thích sự sinh trưởng, phát triển và phân hóa cơ quan, hình thành của chồi dâu tây. Đồng thời tăng sức sống cho dâu tây. Yếu tố ảnh hưởng là quá trình làm sạch mẫu, do thời gian và các nồng độ chất khử trùng. Đặc biệt là sự có mặt của thành phần Calcium hypochlrorite. Quan trọng nhất là thời gian tránh cho mẫu tổn thương nhưng vẫn có thể phát triển. 3.1.1. Ảnh hưởng của chất khử trùng và thời gian khử trùng lên sự sống xót của cây Bảng 3.2. Bảng kết quả ảnh hưởng nồng độ chất khử trùng lên sự sống xót của cây Nồng độ CKT Thời gian(phút) 7% 12% 20% 10 7 10 2 15 6 12 1 30 10 6 0 Số cây sống TB 7,67 9,33 1  3.1.2. Thảo luận kết quả thí nghiệm 1 Kết quả cho ta thấy khử trùng ở nồng độ 12 % và thời gian 15 phút là tối ưu nhất. Tại thời điểm thời gian 15 phút chồi nhất và sống xót là 12. Tại Thời gian 30 phút và nồng độ 20% cây bi chết hầu hết do nồng độ chất khử trùng cao và thời gian quá lâu làm tổn thương tế bào thực vật.Tại nồng độ này tinhsats trùng cao nên gây tổn thương mô tế bào nên tỉ lệ sống thấp Ở mức nồng độ 7% thì thời gian thấp dễn đến cây không sát trùng hết toàn bộ bề mặt mô tế bào. Nhưng nếu thời gian tăng thì đuur để sát trùng bề mặt tế bào thực vật, thì tỉ lệ nhiễm giảm. 3.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ BA đến sự sinh trưởng cây dâu tây Giai đoạn nhân nhanh chồi là giai đoạn nhân nhanh của mẫu cấy sau khi đã hình thành chồi sẵn. Chú ý giai đoạn này cần đòi hỏi có nhiều cây để tăng nhanh số lượng cần thiết nhằm mục đích phục vụ cho nhân giống. Giai đoạn này chú ý cây chỉ hàm lượng có thể nhỏ hơn so với quá trình nhập mẫu. Khi cây nhập mẫu nhiễm thấy rõ ta loại bỏ nhận mẫu không nhiễm. Chất kích thích sử dụng ở đây là chất BA có hoạt tính mạnh hơn nhiều so với kinetine và giá cả cũng rẻ hơn và không bị phân hủy nếu hấp môi trường nuôi cấy ở nhiệt độ cao. Quá trình nhân nhanh cây dâu tây cần có số lượng lớn, nguồn mẫu sử dụng để nhân tạo chồi có thể là lá hoặc chồi cây. Vì vậy, thí nghiệm tiến hành ảnh hưởng môi trường ½ MS bổ sung BA trân bộ phận nuôi cấy là chồi tia của cây dâu tây. 3.2.1. Ảnh hưởng của nồng độ BA lên sồ chồi Bảng 3.2. Kết quả số chồi cây dâu tây ở các nồng độ của BA Nồng độ BA(mg/l) Lặp lại 0 0,25 0,5 Số chồi (cây) 1 2 7 1 2 2 9 1 3 3 7 1 Số chồi TB 2,3 7,7 1 Bảng 3.1. Biểu đồ ảnh hưởng nồng độ BA lên số chồi Kết luận: Qua kết quả cho thấy tại nồng độ BA kác nhau khả năng mọc chồi khác nhau. - Cây khi không sử dụng BA thì vẫn mọc chồi. Tuy nhiên thấp không hiệu quả cho việc nhân giống. - Cây ở tỉ lệ BA 0,5 không những không kích thích tăng trưởng mà ức chế sự phát triển của chồi. - Nồng độ BA số chồi phát triên nhanh hơn so với các nồng độ kác cây phát triển tối ưu. 3.2.2. Ảnh hưởng nồng độ BA lên chiều cao của cây dâu tây Bảng 3.4. Kết quả ảnh hưởng nồng độ BA lên chiều cao chồi cây dâu tây Nồng độ BA(mg/l) Lặp lại 0 0,25 0,5 Chiều cao (cm) 1 1,9 3,7 1,2 2 2 3,9 2,0 3 2,2 3,3 1,3 Chiều cao TB 1,8 3,63 1,5 Hình 3.2. Biểu đồ biểu hiện ảnh hưởng của BA lên chiều cao cây Kết luận - Nồng độ BA mức 0 chiều cao cây phát triển chậm. - Nồng độ BA 0,25 phát triển chiều cao tối ưu so với cây kác nhiều.Cấy phát triển mức 3,63 là nồng độ thích hợp nhất để cây phát triển. - Nồng độ 0,5 Cây chậm phát triển môi trường không tối ưu cây bị ức chế. 3.3. Thí nghiệm 3: Theo dõi ảnh hưởng của NAA đến sự rễ tạo cây hoàn chỉnh Giai đoạn này cây sau nhiều lần nhân chồi cụ đạt đến mức số lượng cần thiết. Mẫu bắt đầu tiến hành thành cây hoàn chỉnh chú ý giai đoạn này là những bịch chồi ra cây là chiều cao đạt 2,5 – 3,8 ta có thể đưa vào bịch nhân giống. NAA là chất kích thích ra rễ cho cây giai đoạn này, Vì khi có bộ rễ kích thích cây hoạt động khi ra vườn ươm môt trường thay đổi hoàn toàn so với môi trường in vitrro. Than hoạt tính bổ xung nhằm tạo môi trường tối cho cây ra rễ, đồng thời tương tác phenol độc do mô tế bào tiết tránh gây ngộ độc môi trường của cây. Giai đoạn này thời gian trong phòng thí nghiệm chỉ khoảng 2 -3 ngày còn lại ra ngoài môi trường vườn ươm để cây thích ứng trươc khi cho vào vỉ xốp. Chỉ chọn những cây có rễ tiến hành cho môi trường ra rễ. 3.3.1. Ảnh hưởng của môi trường lên số cây ra rễ Bảng 3.5 Ảnh hưởng nồng độ NAA lên số cây Nồng độ NAA Lặp lại 0.15mg/l 0.25mg/l 0.5mg/l Độ dài rễ (m m) 1 0,2 2 5 2 0,5 1,8 4 3 0,7 2 3 Chiều dài rễ TB 0,47 1,9 4 3.3.2. Kết luận Rễ ở nồng độ 0,15 thì nồng độ phát triển thấp nhất, 0,5 phát triển tối ưu nhất, tuy nhiên rễ phát triển quá dài không cần thiết vì thế nên chọn nồng độ 0,25 phù hợp cho cây phát triển nhằm tiết kiệm chi phí. 3.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát quá trình đưa cây ra vườn ươm Quá trình đua cây ra vườn ươm thấy thời gian tập năng thích hợp nhất là 2-3 ngày. Thời gian vừa để cây thích ứng với điều kiện ánh sáng, nhiệt độ môi trường ngoài in vitro. Nhằm hạn chế số lượng cây chết do thay đổi đột ngột môi trương của cây. Quá trình này tỉ lệ sống cấy khoảng 80 – 90% cây. Sau khoảng từ 20 ngày trở đi ta có thể tiến hành đưa giông trực tiếp ra vườn, đem sản xuất. 3.5. Một số hình ảnh kết quả quá trình nhân giống dâu tây Hình 3.3. Chồi sau 10 ngày nhập mẫu Hình 3.4. Đỉnh sinh trưởng dâu tây sau 20 nngày nhập mẫu Hình 3.5. Cây dâu tây trong giai đoạn ra rễ Hình 3.6. Cây dâu sau 15-20 ngày ra khay Hình 3.7. Cây sau khi trồng và chăm sóc 2 tháng Khử trùng mẫu cấy (Calci hypochorit 15% trong 15 phút) Lựa chọn nguồn mẫu (chồi tia cây dâu tây) 3.5. Qui trình nhân giống dâu tây in vitro Vô mẫu ban đầu Chuyển cây con ra vườn ươm theo dõi sự sinh trưởng và phát triển của cây con ex vitro Nhân chồi (BA nồng độ25mg/l) (Sau 30 ngày) Nhân ra rễ (NAA :0.25mg/l) Kéo dài chồi (BA nồng độ 0,25mg/l) (5-7 ngày) (sau 15-25 ngày) (15-20 ngày) CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1. Kết Luận Môi trường nuôi cấy thích hợp nhất của quá trình nhân giống, tùy vào mỗi giai đoạn mà có hàm luợng chất sinh trưởng thực vật khác nhau. Cây dâu tây nuôi cấy trong môi trường in vitro có năng suất nhân giống nhanh. Số lượng cây thu lại không nhỏ trong quá trình, thời gian nhân giống ngắn Giai đoạn tạo chồi: môi trường MS bổ sung 0,25 mg/l BA và 25g /l đường là thích hợp nhất. Trong vòng khoảng 20 -25 ngày chồi có thể phát triển cao từ 2,6 – 3,5 cm. Giai đoạn tạo rễ: môi trường MS bổ sung 0,25 mg/l NAA, 7,5g/l than hoạt tính và 25 g/l đuờng. Sau từ 5 -7 ngày ta có thể thu cây có thể thu rễ hoàn chỉnh. Hệ số nhân giống cao và chất lượng tốt: Từ một số mẫu nhỏ nhất định cây được số lượng chồi khá nhỏ trong một môi trường nhất định. Khi đó ta có thể thấy thu nhận số lượng chồi thích hợp để nhân giống cây. Bằng phương pháp in vitro nhanh hơn các phương pháp thủ công, truyền thống mà giống chưa làm được về cả thời gian nhân giống. Trước khi đưa vào môi trường nuôi cấy mẫu cây được khử trùng vi khuẩn nấm bệnh. Sử dụng phương pháp ELISA để kiểm tra loại trừ virus thu được giống có tỉ lệ sạch bệnh cao. 4.2. Đề nghị Nghiên cứu ảnh hưởng của TDZ, 2ip, 2,4,5_D nhằm tăng hệ số nhân giống cây dâu tây. Nghiên cứu bổ sung một số dịch chiết tự nhiên vào môi trường nuôi cấy nhằm nâng cao chất lượng cây giống. Nghiên cứu Tạo phôi để tăng sức sống cho cây con. Nghiên cứu chuyển gene nhằm tăng khả năng kháng bệnh cây dâu tây TÀI LIỆU THAM KHẢO Nguồn trong nước: [1] Bùi Văn Thế Vinh. Năm 2010. Giáo trình Công nghệ thực vật. Trường đại hoạc kỹ thuật công nghệ. [2] Dương Tấn Nhựt, 2007. Công nghệ sinh học thực vật và nhân giông trong công nghệ chọn tạo giống hoa. Nhà xuất bản Nông Nghiệp. [3] Vũ văn Vụ, 1999.Sinh lý thực vật ứng dụng. NXB Giáo dục. [4] Nguyễn Đức Thành, 2000.Nuôi cấy mô tế bòa thực vật và nghiên cứu ứng dụng. NXB Nông nhgiệp. Nguồn nước ngoài [5] Darrow George, the Strawbery: History, Breeding and Physiology. New York. Holt, Rinehart and Winston, 1966. [6] Shinji Tokuyama, 2010. Prevention for Strawberry. Đại học Shizuoka [7] T Ulmasov, J Murfett, G Hagen,The Plant Cell 1997 - Am Soc Plant Biol Nguồn internet [7] mt.lhu.edu.vn [8] chonongnghiep.com [9] Cuctrongtrot.gov.vn [10] Webtailieu.vn [11] Dalat.gov.vn [12] Khoahocchonhanong.com.vn [13] www.vietlinh.vn [14] wikipedia.org [15] vn.strawberrynet.com [16] sinhhocqbu.net 53-58p PHỤ LỤC Môi trường cấy cơ bản được dùng là môi trường ½ MS (Murashige và Skoog,1962) Thành phần Dạng sử dụng Nồng độ môi trường Khoáng đa lượng KNO3 950 mg/l MgSO4.7H 2O 185 mg/l NH4H2PO4 185 mg/l CaCl2.2H2O 220 mg/l NaH2PO4H2O 220 mg/l (NH4)2 SO4 220 mg/l NH4NO3 850 mg/l KH2PO4 85 mg/l Khoáng vi lượng MnSO4.H2O 85 mg/l H3BO3 3,1 mg/l ZnSO4.7H2O  4,3 mg/l KI 0,425 mg/l CuSO4.5H2O 0,0125 mg/l Na2MoO4.2H2O 0,125 mg/l CoCl2.6H2O 0,0125 mg/l MnSO4.4H2O 11,25 mg/l Sắt ETDA Na2EDTA 18,65 mg/l FeSO4.7H2O 13,9 mg/l Vitamine Myo – Inositol 50 mg/l Thiamin –HCl (B1) 0,05 mg/l Nicotinic acid (P.P) 0,025 mg/l Pirydoxine (B6) 0,025 mg/l Glysine 1mg/l Các thành phần khác argar 8.5mg/l Đường 25g/l