Khóa luận Quy trình phát hiện Listeria Monocytogenes trong thủy hải sản đông lạnh

, Murraya, nhưng ngày nay ñược xếp thành một loài duy nhất Listeria grayi. Gần ñây, Listeria ivanovii ñược chia thành hai loài phụ là: subsp.ivanovii, và subsp.londonniensis. Trong số các loài không thuộc “monocytogenes” chỉ duy nhất Listeria ivanovii ñược xác ñịnh là tác nhân gây bệnh trên người. 2.2.4. ðặc ñiểm hình thái và kháng nguyên. - Các loài Listeria là trực khuẩn Gram dương có kích thước ngắn (0.4- 0.5×0.5-2.0 µm). Chúng mọc trên các môi trường nuôi cấy không acid, không sinh nha bào. Ở 200C, chúng chỉ di ñộng bằng lông mọc xung quanh than, nhưng sự di ñộng không quan sát ñược ở 370C. Chúng là vi khuẩn kỵ khí không bắt buộc và có thể mọc trên khoảng nhiệt ñộ dao ñộng từ 0-450C ( tối ưu là 30-360C), mặc dù tốc ñộ mọc ở nhiệt ñộ thấp là chậm. Chúng cũng mọc trên một khoảng pH dao ñộng rộng, một số chủng có thể mọc ở pH 9.6, nhưng ñạt ñiều kiện tối ưu ở môi trường trung tính hoặc hơi kiềm. 13 - Kháng nguyên chính của các loài Listeria là kháng nguyên thân (O) và kháng nguyên lông (H).Quy trình ñịnh type huyết thanh hiện nay dựa trên các kháng nguyên này, ñã phân loại ñược 6 nhóm huyết thanh (1/2, 3, 4, 5, 6 và 7) và phân loại sâu hơn thành các serovar cho tất cả các loài trừ Listeria grayu và Listeria invanoii. Trong khi Listeria invanoii và Listeria welshimeri có thể ñược phân biệt với Listeria monocytogenes khẳng ñịnh type huyết thanh thì các loài khác có thể có chung một hoặc nhiều kháng nguyên trùng với Listeria monocytogenes. Ví dụ, một số chủng Listeria seeligeri có thể không phân biệt ñược về mặt kháng nguyên so với chủng thuộc Listeria monocytogenes ở nhó, huyết thanh ½. Cũng cần lưu ý rằng, mặc dù có 13 serovar của Listeria monocytogenes mới ñược xác ñịnh hiện nay, trong khi hơn 90% các chủng phân lập trên lâm sang chỉ thuộc về 3 serovar: 1/2a; 1/2b va 4b, ñiều này làm hạn chế giá trị của kỹ thuật này trong các nghiên cứu dịch tễ học. Các ñặc tính quan trọng ñược liệt kê ở Bảng 2.1 Dùng ñể phân biệt các loài Listeria. Loại test L. m o n o cy to ge n es L. in n o cu a L. se el ig er i L. iv a n o vi i L. w el sh im er i Su bs p. gr a yi Su bs p. m u rr a yi Tan máu beta (β) CAMP test với S.aureus R.equi Khử Nitrate + + W - - - + W - + - - - - - - - - - - - 14 Acid từ D-Manitol L-Rhamnose D-Xylose α-Methyl-D- glucoside α-Methyl-D- mannoside - - + - + + - - V - + + - - - + + - + - - - + - - + - - V V - + - - V V + + V - V V Với (+) ≥ 90% các chủng dương tính. (-) ≤ 10% các chủng dương tính. (V) 11-89% các chủng dương tính. (W) các chủng dương tính yếu. 2.2.5. Cấu trúc. 2.2.5.1. Cấu trúc di truyền. - Genome của Listeria monocytogenes và Listeria innocua ñược giải trình tự có ñộ dài là 2.94 Mbp với 2583 khung ñọc mở và mol % G+C là 39. Listeria innocua có genome dài 3.01 Mbp với 2973 khung ñọc mở và thành phần mol 5% G+C là 37. Một ñiều ñáng chú ý là nhiều protein ñược mã hóa bởi vi khuẩn này mang ñộ tương ñồng rất cao so với Bacillus subtilis. Listeria monocytogenes có mức ñộ ña dạng thường ở nhiều quần thể, do vậy,chúng có tới 331 gen mã hóa cho các protein vận chuyển khác 15 nhau (11,6% trong số tất cả các gen dự kiến) và 209 các vị trí ñiều hòa quá trình dịch mã ñược tìm thấy trên loại vi khuẩn này. - Khoảng 0-79% các chủng Listeria monocytogenes có chứa plasmid này ở dạng ẩn, sự ñề kháng với cadmium là hiện tượng phụ thuộc plasmid và các plasmid ñặc hiệu cho hiện tượng ñề kháng với một hoặc nhiều loại kháng sinh ñã ñược ghi nhận. Plasmid thường thấy trong các chủng Listeria monocytogenes thuộc nhóm huyết thanh 1. 2.2.5.2. Cấu trúc tế bào. - Nhân: là vùng nhân nguyên thủy, chưa có màng nhân nên không có hình dạng cố ñịnh vì vậy còn gọi là vùng nhân. - Ribosome: nằm tự do trong tế bào chất và chiếm tới 70% trọng lượng của tế bào chất. Ribosome gồm hai tiểu phần ( 50S và 30S), hai tiểu phần này kết hợp với nhau tạo thành ribosome 70S. - Lông ( khuẩn mao ): là những sợi lông rất mảnh, chúng có tác dụng giúp vi khuẩn bám vào giá thể. - Màng tế bào: Màng cấu tạo bởi 2 lớp phospholipid (PL) chiếm 30 – 40% khối lượng của màng, các protein chiếm 60 -70% khối lượng các màng. ðầu phosphate của PL tích ñiện phân cực, ưa nước. ðầu hydrocacbon không tích ñiện, không phân cực, và có tính kỵ nước. 16 Hình 2.3. Màng tế bào của vi khuẩn Listeria monocytogenes. - Chức năng chủ yếu của màng. - Khống chế sự qua lại của các chất dinh dưỡng, các sản phẩm trao ñổi chất. - Duy trì áp suất thẩm thấu bình thường của tế bào. - Là nơi sinh tổng hợp của thành phần tế bào và các polymer của bao nhầy. - Là nơi sinh tổng hợp của nhiều enzyme, các protein của chuỗi hô hấp. - Cung cấp năng lượng cho sự hoạt ñộng của tiên mao. - Tiên mao: chúng quyết ñịnh khả năng và phu7o7nmg pháp di ñộng của vi khuẩn, tiên mao là nhũng sợi lông dài, dưới kính hiển vi quang học chỉ có 17 thể quan sát cấu trúc khi nhuộm theo phương pháp riêng. Dưới kính hiển vi ñiện tử có thể thấy rõ cấu trúc của từng sợi tiên mao. - Thành tế bào: - Peptidoglycan chiếm 30 – 95%, là loại xốp, khá bền vững, cấu tạo bởi ba thành phần: - N-Acetylglucolsamin (NAG) - Acid N0- acetylmuramic (NAM) - Tetrapepid chứa cả D- và L- axit amin. - Thành tế bào rất dày, hấp thu và giữ lại màu tím khi nhuộm với thuốc nhuộm tím tinh thể. - Thành tế bào làm những nhiệm vụ sau : - Tham gia quá trình trao ñổi chất. - Là nơi chứa ñựng nhiều chất có chứa hoạt tính sinh học. - Bao nhầy : - Bào vệ vi khuẩn trong ñiều kiện khô hạn. - Bảo vệ vi khuẩn tránh khỏi bị thực bào. - Cung cấp chất dinh dưỡng cho vi khuẩn khi thiếu thức ăn. - Giúp vi khuẩn bám vào giá thể. Hình 2.4. Lông roi của vi khuẩn Listeria monocytogenes. 18 2.2.6. Yếu tố ñộc lực. 2.2.6.1. Tổ hợp gen của Listeria monocytogenes. _ Gen prfA (prfA): hoạt hoá quá trình lây lan cho tế bào chủ của vi khuẩn. _ Gen plcA (PI-PLC) (phosphatidy linocitol-specific phospholipase C) là protein ñược mã hoá bởi gen plcA,33kDa), có tác dụng dung giải màng không bào của thể thực bào. _ Gen plcB(PC-PLC) (phosphatidulcholine-spefic phospholipase C, là protein ñược mã hoá bởi gen pclB, 29kDa):, có tác dụng dung giải màng không bào của thể thực bào. _ Gen hly (LLO là protein ñược mã hoá bởi gen hly, 58.5kDa), có tác dụng giải phóng vi khuẩn ra khỏi lkhông bào của tế bào chủ. _ Gen mpl (Mpl metallprotease ñược mã hoá bởi gen mpl,60kDa) là gen chứa 510 amino axit, có vai trò tham gia vào quá trình hoạt ñộng của gen plcB. _ Gen actA ( AtcA là protein ñược mã hoá bởi gen ACTa,97kDa) có chức năng giúp vi khuẩn lây lan từ tế bào này sang tế bào khác. _ Gen inlA (InlA là protein ñược mã hoá bởi gen inlA, 80kDa). Protein InlA ảnh hưởng mạnh tới internalin khác, xoá bỏ inlA thì sẽ dẫn tới biểu hiện inlB cao hơn, có chức năng nội bộ hoá tế bào chủ. _ Gen inlB (InlB là protein ñược mã hoá bởi gen inlB, 67kDa), có chức năng nội bộ hoá tế bào chủ. _ Trong ñó gen prfA có vai trò như yếu tố ñiều hoà chính nhằm ổn ñịnh hoạt ñộng của các gen plcA, plcB, hly, mpl, actA, inlA, inlB. Ngoài ra, còn có gen hly mã hoá protein tạo ra sản phẩm Listeriolysin O (LLO) là tác nhân gây bệnh Listeriosis ở người và ñộng vật, plcA mã hoá tạo PI-PLC và gen 19 plcB mã hoá tạo PC-PLC, gen inlA ,mã hoá cho internalin A, gen inlB mã hoá cho internalin B, gen inlC mã hoá cho internalin C. tất cả các gen này ñều phụ thuộpc vào gen prfA. 2.2.6.2. ðộc tố listeriolysin A (LLO). _ Listeriosin A (LLO) là một ñộc tố protêin ñược tiết bởi L.monocytogenes thóat khỏi không bào và thực bào chủ có trọng lựơng 58.6 kDa, hình thành 1 chuỗi polypeptide gồm 529 amino acid. Trình tự ñầu N có ñặc ñiểm là phần ñầu có tính ái nước, mang ñiện tích dương và ñượ theo sau bởi 20 ñầu kỵ nước. trình tự này mã hoá trực tiếp cho protein và ñược phân cắt sau vị trí lysine 25. kết quả là LLO ñược bắt ñầu từ amino axit thứ 26 và có trọng lượng phân tử là 55.8kDa, dài 504 axit amin. _ LLO thuộc nhóm ñộc tố gắn lên cholesterol ñược hoạt hoá bởi nhóm thiol ñược tạo ra ở hầu hết các vi khuẩn Gram (+). _ Hoạt tính dung huyết của LLO có liên quan ñến pH của môi trường. Nó hoạt ñộng cao nhất ở pH 5.5 và gần như bị bất hoạt ở pH 7.0. Sự phát hiện này có thể giải thích vai trò của LLO trong quá trình xâm nhiễm của Listeria monocytogenes. Sau quá trình thực bào, môi trường acid của không bào chứa tế bào vi khuẩn sẽ hoạt hoá LLO. Chính ñộc tố này xúc tiến quá trình ly giải không bào và vi khuẩn xâm nhập vào tế bào chất, trong khi ñó pH cao hơn sẽ làm giảm hoạt tính của LLO. 2.2.6.3. Vai trò của yếu tố ñộc lực. _ Listeria monocytogenes tồn tại trong môi trường ña dạng như: môi trường sống bao gồm ñất, nước, thức phẩm, ñộng vật. Gen prfA quy ñịnh sự biểu hiện của các gen có tính ñộc ñó. Bên ngoài tế bào chủ, gen prfA tồn tại ở 20 trạng thái hoạt ñộng thấp. Khi ở bên trong tế bào chủ, gen prfAkích hoạt (prfA*) và biểu hiện các gen cần thiết cho cuộc xâm nhập vào tế bào chủ. _ Listeria monocytogenes xâm nhập vào tế bào của cơ thể vật chủ thông qua cơ chế thực bào. Nếu Listeria monocytogenes vẫn còn sống sau giai ñoạn ñầu xâm nhiễm này, nó ñược cơ thể vật chủ tiếp nhận nhờ protein bề mặt ñượ gọi là internalin A (inlA) và internalin B (inlB). InlA tương tác với e- Carherin tạo ñiều kiện cho Listeria monocytogenes ñi vào tế bào biểu mô, InlB nhận diện Clq-R ( hoặc Met) cho phép Listeria monocytogenes xâm nhập vào trong nhiều loại tế bào của vật chủ. Sauk hi xâm nhiễm ñược vào tế bào vật chủ, Listeria monocytogenes phân giải không bào tạo ra các lỗ trên màng tế bào và hoạt giải ñộc tính lưu huỳnh PI-PLC kết hợp với PC- PLC, giúp LLO phân giảikhông bào. 21 Hình 2.5. Cơ chế xâm nhập vào tế bào của vi khuẩn Listeria monocytogenes. 22 _ Sau khi phân giải không bào, Listeria monocytogenes ñược phóng thích vào cytosol, tại ñây chúng phát triển và nhân lên, trong giai ñoạn này ñòi hỏi phải có protein bề mặt khác như ActA ñể nó di chuyển từ tế bào này sang tế bào khác, và tổng hợp actin. ðuôi actin cho phép vi khuẩn xâm nhập vào tế bào chủ khác, nó phụ thuộc vào hoạt ñộng của PC-PLC và Mpl. 2.2.7. Bệnh và triệu chứng của bệnh do vi khuẩn “Listeria monocytogenes” gây ra. 2.2.7.1. Bệnh do vi khuẩn “Listeria monocytogenes” gây ra. - Nhiễm Listeria ở phụ nữ mang thai:
Hội chứng này xuất hiện trong khoảng một phần ba các trường hợp nhiễm Listeria mặc dù tỷ lệ này có thể cao hơn nhiều trong các ñợt dịch. Hầu hết các trường hợp nhiễm khuẩn ñều xãy ra vào 3 tháng cuối của thai kỳ. ða số phụ nữ mang thai bị nhiễm Listeria monocytogenes có dấu hiệu: sốt , mệt mỏi và ñau lưng, có khi thấy bị tiêu chảy, ñau bụng, buồn nôn hoặc nôn trong suốt thời kỳ nhiễm khuẩn. Vi khuẩn có thể lây truyền qua rau thai dẫn ñến nhiễm khuẩn tử cung, viêm màng ñệm và màng ối, sinh non, hoặc bệnh khởi phát ở giai ñoạn sớm ở những trẻ mới sinh. Phụ nữ nhiễm bệnh dễ bị sãy thai tự nhiên. Trẻ sơ sinh tuần lễ ñầu tiên khởi phát bệnh với những dấu hiệu nhiễm khuẩn, khó thở, những tổn thương ở da, hội chứng u hạt nhiễm khuẩn ñặc trưng bởi những ổ áp-xe rải rác ở gan, lách, tuyến thượng thận, phổi và những cơ quan khác. Nếu nhiễm khuẩn bào thai ở giai ñoạn sớm thường ñi kèm với những biến chứng sản khoa như : sinh non và viêm màng ñệm và màng ối. − Nhiễm Listeria ở trẻ sơ sinh: 23
Gần giống như các trường hợp nhiễm khuẩn liên cầu nhóm B ở trẻ sơ sinh, nhiễm Listeria ở trẻ sơ sinh có thể ñược chia thành hai nhóm khởi phát sớm và muộn. Khởi phát sớm là biểu hiện nhiễm khuẩn trong vòng 5 ngày, nhất là khoảng 48 giờ sau sinh. Bệnh khởi phát muộn thì phát bệnh sau 5 ngày từ khi sinh, trung bình là 14 ngày. Tỷ lệ tử vong cao tới 60% cho nhóm khởi phát sớm và 25% cho nhóm khởi phát muộn.
ða số các trường hợp bệnh khởi phát sớm bị truyền nhiễm Listeria monocytogenes từ trong tử cung qua nguồn vi khuẩn trong máu mẹ. Nhiễm khuẩn từ âm ñạo là cực kỳ hiếm gặp. Biểu hiện kinh ñiển của bệnh khởi phát sớm là bệnh u hạt nhiễm khuẩn ở trẻ sơ sinh vời ñặc tính là có u hạt rải rác ở một số cơ quan nội tạng. Mặc dù biểu hiện ñiển hình hơn của dạng bệnh này là nhiễm khuẩn huyết kèm theo viêm phổi và viêm màng não. Có thể có ban sần và ban dạng gờ nhú. Trên thực tế thường khó phân biệt giữa bệnh Listeriosis khởi phát sớm và các thể khác của nhiễm khuẩn trẻ sơ sinh trên các bệnh cảnh lâm sàng ñơn ñộc.
Trái ngược với thể khởi phát sớm của bệnh này, trẻ sơ sinh có khởi phát muộn thường biểu hiện khỏe mạnh lúc trẻ mới sinh. Người ta cho rằng trẻ sơ sinh bị vi khuẩn ngay từ lúc mới sinh, nhưng do các yếu tố chưa biết nào ñó, việc khởi phát bệnh bị chậm lại. Cũng giống như vậy, nhưng các trường hợp nhiễm khuẩn do nhiễm trùng bệnh viện xãy ra sau khi trẻ ñược sinh ra dã ñược ghi nhận trong nhiều báo cáo về các nhóm nhiễm Listeria khởi phát muộn. Bệnh khởi phát muộn hay có viêm màng não hoặc viêm não màng não (ở 90% các trường hợp). Khởi phát muôn thường âm thầm hơn so với thể bệnh khởi phát sớm với những triệu chứng thường gặp như trẻ bú kém hoặc bỏ bú, khó chịu và sốt. 24 - Nhiễm Listeria ở người trưởng thành.
Nhiễm Listeria ở người trưởng thành thường gặp trên các bệnh cảnh suy giảm miễn dịch, ñặc biệt khi hệ miễn dịch của tế bào bị suy giảm như trong u hệ lympho, các hệ thống ñiều trị chống thải ghép trong các ca ghép cơ quan nội tạng hoặc ghép tủy xương tự thân hoặc cùng loài, khi ñó bệnh xãy ra ñiển hình dưới dạng một biến chứng muộn. Ngay trong thời kỳ ñầu của ñại dịch AIDS, Listeria monocytogenes không ñược coi là tác nhân gây bệnh quan trọng với bệnh nhân nhiễm HIV, và có một số ý kiến giải thích khá thuyết phục cho hiện tượng này như hoạt tính kháng Listeria của cotrimoxazole ñược dùng trong ñiều trị dự phòng nhiễm Pneumocystis jiroveci trước ñó. Những nghiên cứu gần ñây lại cho thấy, nhiễm Listeria xãy ra ở bệnh nhân dương tính với HIV cao hơn 150-300 lần so với nhóm ñối chứng. Những bệnh mạn tính khác như nghiện rượu và tiểu ñường cũng là ñiều kiện thuận lợi cho việc lây nhiễm Listeria monocytogenes.
Nhiễm Listeria tiến triển ở người trưởng thành có thể ñược xếp thành ba nhóm tùy theo các biểu hiện lâm sàng: bệnh liên quan ñến hệ thống thần kinh trung ương (CNS) chiếm khoảng 75% các trường hợp, nhiễm khuẩn huyết nguyên phát và nhóm các loại khác bao gồm phổ rộng các loại nhiễm trùng tại chỗ. - Nhiễm khuẩn hệ thần kinh:
Viêm màng não có hoặc không có dấu hiệu thần kinh cục bộ là biểu hiện hay gặp nhất của nhiễm Listeria hệ thần kinh trung ương. Giống như các trường hợp viêm màng não mủ khác, viêm màng não do Listeria thường khởi phát cấp tính với sốt cao, cứng gáy và sợ ánh sáng, nhưng có thêm 25 các rối loạn vận ñộng như run rẩy hoặc mất khả năng ñiều hòa. Co giật cũng thường hay xuất hiện hơn so với các thể khác của viêm màng não.
Biểu hiện của viêm màng não hay gặp nhất của nhiễm Listeria hệ thần kinh trung ương là viêm màng não, thường hay ảnh hưởng nhất ñến vùng não sau. Thể này có tiến triển theo kiểu hai thì ñiển hình: tiền triệu chứng không ñặc hiệu như ñau ñầu, buồn nôn, nôn và sốt, tiếp ñó là liệt dây thần kinh không ñối xứng tiến triển, các dấu hiệu tiểu não hoặc liệt nhẹ nửa người và suy giảm ý thức. Tiên lượng bệnh xấu, tỷ lệ di chứng thần kinh cao ở các trường hợp sống sót. Nguồn gốc nhiễm khuẩn thần kinh là từ nhiễm khuẩn huyết, không có bằng chứng cho thấy là lây bệnh từ những vị trí nhiễm bệnh khác. - Nhiễm khuẩn huyết:
Nhiễm khuẩn huyết nguyên phát là biểu hiện hay gặp thứ hai trong nhiễm Listeria tiến triển ở người lớn tuổi không mang thai, khoảng 25-50% các trường hợp. Không có ñặc ñiểm lâm sàng phân biệt cho thể hiện nhiễm Listeria này. Bệnh nhân có thể bị tụt huyết áp nặng với bệnh cảnh lâm sang tương tự như trong shock nôi ñộc tố vi khuẩn Gram âm, là trường hợp có thể kèm theo hội chứng suy giảm hô hấp ở người lớn. - Viêm màng trong tim xãy ra trên các van tim ñã có tổn thương từ trước, hay gây tình trạng nghẽn mạch hệ thống. - Viêm dạ dày ruột cấp tính gây tiêu chảy ở những người bị suy giảm miễn dịch. - Nhiễm khuẩn ở ñộng vật:
Trong số các ñộng vật, bệnh do Listeria monocytogenes tác ñộng chuyên biệt trên gia súc, cứu và dê với thời gian ủ bệnh từ 2-6 tuần. ðộng vật bị 26 nhiễm Listeria monocytogenes chủ yếu là qua thức ăn bị nhiễm Listeria monocytogenes, qua ñường hô hấphoặc do tiếp xúc trực tiếp. Sự phát bệnh xãy ra kèm theo sự suy giảm miễn dịch ñối với tác nhân gây bệnh do các yếu tố gây stress (mang thai, sự ñông ñúc, sự vận chuyển, ñiều kiện môi trường kém). ðộng vật bị nhiễm bệnh do Listeria monocytogenes thường sốt, biếng ăn, suy nhược và bị mất phương hướng. 2.2.7.2. Các triệu chứng của bệnh do vi khuẩn “Listeria monocytogenes” gây ra. - Các triệu chứng của Listeriosis thường bắt ñầu xuất hiện vài ngày sau khi ăn uống phải các loại thực phẩm bị nhiễm khuẩn. Tuy nhiên, có một số trường hợp thời gian kéo dài ñến 2 tháng mới xuất hiện các dấu hiệu ñầu tiên của bệnh. Các dấu hiệu và triệu chứng của bệnh thường gặp là: tiêu chảy, sốt 380C ( 100,40F) hoặc cao hơn, ñau các cơ, có các cơn ớn lạnh hoặc rung mình buồn nôn. - Nếu xuất hiện tình trạng nhiễm Listeria vào hệ thần kinh, một số các dấu hiệu bệnh và triệu chứng cũng gần tương tự với nhiễm Listeria khu trú. Bao gồm: sốt, ñau các cơ và các cơn rung mình, ớn lạnh nhưng chúng thường diễn biến nặng hơn các triệu chứng và bệnh lý thường có ở tình trạng lan tỏa. Có những thay ñổi về tâm thần. Có xáo trộn về mặt nhận thức và tinh thần, có cơn co giật, nhứt ñầu, mất thăng bằng, ñau ở cổ ( cổ có thể bị cứng, khó chuyển ñộng), có cơn ñộng kinh, mất kiểm soát vận ñộng các chi. 2.2.8. Cơ chế gây bệnh. 27 Hình 2.6. Cơ chế gây bệnh của vi khuẩn Listeria monocytogenes. - Từ lâu, các nhà khoa học ñã phát hiện ra rằng vi khuẩn Listeria lây lan từ tế bào này sang tế bào khác trong cơ thể con người. - Sau khi xâm nhập vào cơ thể qua ñường tiêu hóa, Listeria monocytogenes tiếp tục di chuyển qua dạ dày rồi ñi vào các mô ở ruột non của vật chủ, bao gồm các tế bào biểu mô và các ñại thực bào của mảng Peyer. Trong suốt quá trình di chuyển chúng sẽ không gây ra những thương tổn mô học 28 nếu liều lượng không ñủ lớn. Trong dịch lympho hoặc máu thì Listeria monocytogenes di chuyển rất nhanh ñến hạch bạch huyết, lá lách và gan rồi nhanh chóng ñi sâu vào không bào, hầu hết vi khuẩn xâm nhập và phá hủy không bào nhờ kết hợp với pH thấp, các enzyme thủy phân và oxy hóa trong không bào. - Từ không bào chúng sẽ dy chuyển vào tế bào chất và nhân lên trong vòng 30 phút sau khi xâm nhiễm, từ 40-60 phút ở trong tế bào gan và ñại thực bào. Quá trình xâm nhiễm vào cơ quan hoàn thành sau 5-7 ngày. Tuy nhiên, nếu không ñạt ñược ñáp ứng ñược miễn dịch ở tế bào bạch huyết CD8+ và gamma, interferon gián tiếp hoạt hóa ñại thực bào. Nếu tế bào của vật chủ không tạo ra ñủ ñáp ứng miễn dịch thì Listeria monocytogenes sẽ di chuyển ñến các vị trí khác trong cơ thể như não và nhau thai. Gây ra hiện tượng sẩy thai ở phụ nữ, các dị tật bẩm sinh ở trẻ em, viêm màng não, gây tử vong cho thai nhi. - Vi khuẩn lớn lên trong một tế bào và di chuyển nhanh chóngtạo thành một cấu trúc theo hình ngón tay nhô ra từ tế bào và ñẩy sang tế bào liền kề. Khi ñó, vi khuẩn sẽ tiếp tục gây bệnh cho tế bào liền kề ñó. - Giáo sư Ireton và nhóm của ông ñã phát hiện ra một quá trình thứ hai hổ trợ việc lây lan của vi khuẩn sang những tế bào khỏe mạnh mà trước ñây chưa ñược biết ñến. Qúa trình này dần dần ñã làm suy yếu khả năng tự vệ khỏi việc nhiễm bệnh của tế bào thứ hai. Vi khuẩn Listeria di chuyển qua tế bào chất của tế bào trong cơ thể người sử dụng một phần khung của tế bàogọi là sợi actin. Vi khuẩn Listeria có màu xanh và sới actin có màu ñỏ. Sợi actin hình thành một cấu trúc dạng ñuôi phía sau vi khuẩn. Những sợi 29 actin này, có tác dụng ñẩy vi khuẩn Listeria qua tế bào chất của té bào trong cơ thể người. - Màng tế bào hay lớp ngoài cùng của tế bào khỏe mạnh thông thường căng ra. Tình trạng căng ñó kỳ vọng là có tác dụng ngăn chặn vi khuẩn Listeria không lây lan sang những tế bào chưa nhiễm bệnh liền kề. - Tuy nhiên phòng thí nghiệm của giáo sư Ireton phát hiện ra rằng một loại protein trong vi khuẩn Listeria gọi là InIC xuất hiện làm giảm ñi ñộ căng của màng tế bào ở những tế bào nhiễm bệnh, ñiều này sẽ làm cho việc di chuyển của vi khuẩn ñể xuyên thủng màng tế bào và sau ñó lây lan sang các tế bào khỏe mạnh liền kề dễ dàng hơn. Phòng thí nghiệm của giáo sư Ireton cũng ñưa ra bản báo cáo cho thấy cách mà InIC làm giảm ñộ căng là ngăn chặn chức năng protein Tuba trong cơ thể người. Thông thường, chức năng của Tuba trong tế bào người không nhiễm bệnh là tạo ra ñộ căng của màng tế bào. Protein InIC trong vi khuẩn Listeria ñã khống chế sự hoạt ñộng của Tuba, làm giảm ñộ căng và giúp vi khuẩn lây lan sang các tế bào liền kề. Vi khuẩn mang mầm bệnh có thể lây lan bằng cách kiểm soát ñộ căng của màng tế bào trong tế bào người. 2.2.9. Tình hình nhiễm listeria monocytogenes ở Việt Nam và trên thế giới. - ðến những năm 1980, thực phẩm ñược coi là tác nhân chính gây truyền nhiễm Listeriosis. - Vào những năm 1981, tại Canada , một trận ñại dịch từ thực phẩm ñã làm ảnh hưởng ñến 41 bệnh nhân là do ăn phải cải bắp lây nhiễm từ các phân tử cừu bị nhiễm bệnh. - Vào năm 1983, ở Boston có 49 người bị nhiễm bệnh Listeriosis do tiêu thụ phải sữa không ñược tuyệt trùng kỹ lưỡng. 30 - Năm 1985, các trận dịch bệnh lớn xãy ra ở Bắc Mỹ tại California bắt nguồn từ phomat mềm có 142 người bị nhiễm, những phomat khác gây ra 122 trườnghợp bị nhiễm Listeriosis ở Switzerland. Trong khi ở Anh, có 300 trường hợp bị nhiễm trùng Listeriosis. - Những năm 1990, ở Pháp dịch bện xãy ra do ăn phải lưỡi lợn, thịt lợn, phomat mềm bị nhiễm khuẩn. - Trong thời gian vừa qua, trước tình hình số lượng các mẫu cá tra ñông lạnh bị phát hiện nhiễm Listeria monocytogenes ngày càng gia tăng, thực hiện chỉ ñạo của lãnh ñạo bộ, cục quản lý chất lượng nông lâm thủy hải sản (NAFIQAD) ñã có quyết ñịnh thành lập nhóm công tác chủ trì thực hiện ñề tài khoa học cấp cơ sở “Xác ñịnh nguyên nhân lây nhiễm và ñề xuất giải pháp kiểm xoát mối nguy hiểm Listeria monocytogenes trong sản phẩm cá tra ñông lạnh”. Ngày 6/11/2009, cục ñã tổ chức hội nghị nghiệm thu ñánh giá kết quả thực hiện ñề tài. - Theo số liệu các kết quả phân tích của ñề tài cho thấy 162/485 mẫu (bao gồm 29/120 mẫu nguyên liệu ñược lấy tại các nhà máy chế biến, 79/186 mẫu vệ sinh công nghiệp sau khi vệ sinh, 8/28 mẫu tay công nhân, 24/36 mẫu bán thành phẩm) bị phát hiện nhiễm Listeria monocytogenes. - Vào ngày 19/3/2007, cơ quan quản lý thực phẩm Anh quốc có lệnh thu hồi các loại bánh mì kẹp thịt, do công ty thực phẩm Anchor cung cấp cho hệ thống bệnh viện và trường học tại Luân ðôn, do sản phẩm này bị nhiễm vi khuẩn Listeria monocytogenes. - ðây không phải là lần ñầu, mà từ nhiều năm qua vi khuẩn này ñã gây ra các vụ ngộ ñộc thực phẩm lớn tại một số quốc gia trên thế giới (Mỹ, Úc, Canada, Pháp, Bỉ…..). Chúng ta có thể ñiểm qua vài vụ ngộ ñộc ñiển hình 31 như sau: Vào tháng 12 năm 1999, tại Pháp có vụ ngộ ñộc do ăn phải hamburger có nhiễm vi khuẩn Listeria gây cho 27 người mắc bệnh. Trong ñó, có 7 người chết. Theo thống kê của Mỹ, hàng năm số bệnh lây nhiễm Listeria khoảng 2500 người, với gần 500 người chết. Thống kê tại Anh từ năm 2001-2005 có 1933 người mắc bệnh do vi khuẩn Listeria gây ra… - Trong những năm qua, những con cá hun khói, và bơ có liên quan ñến dịh Listeriosis do vi khuẩn Listeria gây ra tại Thụy ðiển và Finland. - Cơ quan hữu quan các nước trên từng cảnh báo về loại vi khuẩn này. ðồng thời cũng ñề ra các biện pháp kiểm tra nghiêm ngặt nguồn nguyên liệu thực phẩm. Nguy cơ của loại vi khuẩn này không chỉ gây ra ngộ ñộc thực phẩm mà quan trọng hơn là chúng gây ra các bệnh lý nguy hiểm như xảy thai, viêm màng não, nhiễm trùng huyết. Thường giai ñoạn ủ bệnh từ vài ngày ñến 2 tháng. Chính vì vậy, người ta thường không nhận biết ñược ngay sự lây nhiễm của loại vi khuẩn này. Dấu hiệu khởi phát của bệnh là có sốt, khó chịu, ñau lưng. Nếu ñộc tố ñủ mạnh chúng sẽ gây ra ngộ ñộc thực phẩm cấp tính trong khoảng 12 giờ, với các triệu chứng nôn mủa, tiêu chảy, ñau quặn bụng, nhức ñầu…. 2.2.10. Nguyên tắc ñiều trị. - Mặc dù trên invitro cho thấy còn nhạy cảm với nhiều thuốc (trừ Cephalosporin và Fosfomycin), kết quả ñiều trị bằng liệu phápkháng sinh trong bệnh nhiễm Listeria tiến triển thường không tốt, một phần do sự chậm chễ trong việc bắt ñầu ñiều trị bằng kháng sinh thích hợp khi chưa ñưa ra ñược chẩn ñoán sớm trong quá trình bệnh và một phần do nhiều bệnh nhân có tình trạng suy giảm miễn dịch. Hơn nữa, Listeria monocytogenes là một loại vi khuẩn ký sinh nội tế bào không bắt buộc, và 32 nhiều thuốc kháng sinh có khả năng thâm nhập bên trong tế bào kém. Thậm chí nếu có thể thâm nhập ñược, các thuốc này có thể không ổn ñịnh hoặc giảm hoạt tính trong ñiều kiện môi trường này. - Khả năng thâm nhập nội bào kém và nhiều ý kiến cho rằng các β-lactam chỉ có khả năng kìm khuẩn ñối với Listeria monocytogenes, nhưng các aminopenicillins, amoxicillin và ampicillin ñược cho là các thuốc thích hợp trong các trường hợp Listeria xâm nhiễm làm gây bệnh Listeriosis. Mặc dù phải dùng ở liều cao hơn so với bình thường (8-12g/ngày, chia 2 lần). Nhiều tác giả khuyến cáo nên sử dụng thêm một aminoglycoside, như gentamicin 5-7mg/kg/ngày. Các mô hình ñộng vật thực nghiệm sử dụng ampicillin gắn liposomal hoặc phân tử nano cũng cho kết quả khả quan mặc dù hiện tượng này vẫn ñược ñánh giá lại trên lâm sàng. - Thời gian tối ưu của liệu pháp kháng sinh cho bệnh Listeriosis vẫn chưa ñược xác ñịnh, ñiều này phụ thuộc vào nhiều biểu hiện lâm sàng khác nhau và các ñiều kiện thuận lợi ñể gây bệnh, nhưng nói chung ñược khuyến cáo tối thiểu là 2 tuần trong nhiễm khuẩn nguyên phát và nhiễm Listeria ở phụ nữ mang thai ít nhất 3 tuần với viêm màng não và bệnh ở trẻ sơ sinh. Liệu trình ngắn hơn có thể làm bệnh tái phát. Viêm màng trong tim có thể cần ñược ñiều trị tối 6 tuần. - Với những bệnh nhân không dung nạp với ampicillin +/- aminoglycoside, cotrimoxazole ñược coi là liệu pháp thay thế chấp nhận ñược. - Việc lựa chọn kháng sinh cho bệnh nhân trong trường hợp không dung nạp với cả ampicillin và cotrimoxazole là một vấn ñề khó khăn. ðiều trị bằng Vancomycin cũng cho kết quả kém, và mặc dù các thuốc khác như carbapenem, fluoroquinolone thế hệ mới hơn, linezelid và 33 quinupristin/dalfopristin có hoạt tính tốt trên invitro chống lại Listeria monocytogenes, nhưng kinh nghiệm với những thuốc này trên lâm sàng vẫn còn rất hạn chế. - Kháng kháng sinh mắc phải ở các chủng phân lập trên lâm sàng tương ñối hiếm gặp, mặc dù kháng tetracycline ở các chủng mang gen tetM ñã ñược ghi nhận với khả năng kháng thuốc qua plasmid. Với nhiều loại kháng sinh khác cơ chế ñể kháng qua trung gian plasmid cũng ñã ñược ghi nhận. 2.2.11. Cách phòng ngừa. - Giữ thức ăn ngoài giới hạn của vùng nhiệt ñộ nguy hiểm từ 40C ñến 600C. - Thức ăn nào cần giữ lạnh thì phải giữ ở nhiệt ñộ 40C hoặc thấp hơn, còn những thức ăn nóng thì phải giữ ở nhiệt ñộ trên 600C trở lên. - Nấu chín toàn bộ thức ăn tươi có nguồn gốc từ ñộng vật. - Giữ vệ sinh tối ña lúc nấu nướng hay chuẩn bị bữa ăn. Chùi rữa dụng cụ, dao, thớt bằng dung dịch Javel pha loãng trong nước. - Cẩn thận với các loại cá và ñồ biển hun khói. - Rửa tay bằng savon. - Thường xuyên chùi rữa, tẩy trùng tủ lạnh. - Không nên dung thực phẩm có mùi lạ. - Không dung thực phẩm quá thời hạn sử dụng. - Không ñể thực phẩm tươi sống chung với thức ăn ñã nấu chin. - Thức ăn nấu chín dung ngay không ñể lâu ngày trong tủ lạnh. - Rữa kỹ thức ăn trước khi sử dụng. - Giữ thức ăn ñã ñược nấu chín tách biệt khỏi rau, thực phẩm chưa chế biến. 34 CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP XÁC ðỊNH VI KHUẨN L.MNOCYTOGENES. 3.1. Phương pháp xác ñịnh truyền thống. 3.1.1. Nguyên lý và phương pháp. − Sử dụng phương pháp cấy ñếm Listeria monocytogenes trên môi trường nuôi cấy chuyên biệt sau khi ủ ấm ở nhiệt ñộ 300C trong 48h. chọn các khuẩn lạc nghi ngờ khẳng ñịnh Listeria monocytogenes bằng các thử nghiệm sinh hóa. 3.1.2. Phạm vi phát hiện vi khuẩn. − Phát hiện sự hiện diện của vi khuẩn Listeria monocytogenes trong thủy sản. 3.1.3. Dụng cụ sử dụng. − Mẫu thực phẩm cần kiểm tra. − Bình tam giác 500ml, ống lên men (Durham). − Tủ ấm 30-500C. − Que cấy vòng. − Que cấy thẳng. − Kính hiển vi. − ðĩa petri. − Pipettes 25,10 và 1ml. − ống nghiệm có nắp ñậy. 3.1.4.Môi trường ñể nuôi cấy. - Canh tăng sinh sơ cấp Listeria Enrichment Broth I(LB I). - Canh tăng sinh thứ cấp Listeria Enrichment Broth II (LB II) 35 - Môi trường Enrichment Broth (EB) cải tiến từ môi trường LB, ñược sử dụng trong môi trường tăng sinh từng giai ñọan. - Môi trường Oxford Agar, nôi trường Palcam Agar. - Thạch máu. - Môi trường thạch mềm BHI. - Rhamnose Phenol Red Broth (RPR), Xylose Phenol Red Broth (XPR). - Thuốc thử catalase, oxidase. 3.1.5.Quy trình phân tích vi khuẩn Listeria Monocytogenes. 3.1.5.1. Quy trình kiểm nghiệm vi khuẩn Listeria monocytogenes. 36 Thạch mềm, ủ ở 250C, 25-48h Thạch máu, ở 370C,2 4-48h Soi canh khuẩn BHI ñã ủ ở 250C Canh RPR, ủ ở 370C, 48 giờ Thử nghiệm Catalas e. CAMP với S.aureus và R.equi Tan máu yếu Di ñộng hình dù trong thạch mềm Âm tính Dương tính Dương tính Chuyển ñộng xoay tròn Kết luận: Listeria monocytogenes (+)/(-) trong 25 mẫu thử nghiệm Canh XPR, ủ ở 370C, 48 giờ Thử nghiệm Oxydase S.aureus (+), r.equi (-) Âm tính Sơ ñồ 3.1. Quy trình kiểm nghiệm vi khuẩn Listeria monocytogenes. ðồng nhất 25g mẫu trong 225ml LB I, ủ ở 300C, 24h. Cấy 0.1ml canh khuẩn sang 10ml môi trường LB II ủ ở 300C,24h Ria lên ñĩa Oxford Agar hoặc ñĩa Palcam Agar, ủ ở 300C, 48h Chọn các khuẩn lạc ñặc trưng của Listeria Ria lên ñĩa thạch TSA, ủ qua ñêm 37 3.1.5.2. Thuyết minh quy trình. a/ Tăng sinh. − ðồng nhất 25g mẫu trong 225ml môi trường tăng sinh LB I trong 30 giây. Ủ 300C trong 24h. Chuyển 0.1 ml LB I sang ống 10 ml LB II, tiếp tục ủ ở 300C trong 24 giờ. − Quy trình tăng sinh một giai ñoạn ñược thực hiện như sau : Cân 25g mẫu, thêm vào 225ml canh EB ( ñã ñược làm ấm ở 450C nếu mẫu thử là các sản phẩm sữa và ở 300C ñối với các sản phẩm khác ) và tiến hành ñồng nhất mẫu trong 30 giây. Ủ ở 300C trong 48 giờ. − Quy trình tăng sinh một giai ñoạn ñược thực hiện như sau: Cân 25g mẫu, thêm vào 225ml canh EB (ñã ñược làm ấm ở 450C nếu mẫu thử là các sản phẩm khác ) và tiến hành ñồng nhất mẫu trong 30 giây, ủ ở 300C trong 48h. b/ Phân lập. − Phân lập Listeria monocytogenes trên môi trường OXFORD.
Dùng tăm bông vô trùng thấm dịch mẫu từ ống tăng sinh, trải sang ½ ñĩa môi trường Oxford Agar. Từ những vệt cấy này dùng que cấy vòng ria sang ½ ñĩa còn lại. Ủ ở 370C trong 24-48h. Trên môi trường này khuẩn lạc Listeria monocytogenes có màu xám hay màu nâu ñược bao quanh bởi vòng ñen, khuẩn lạc lõm, nhỏ, ñường kính khoảng 1mm. − Phân lập Listeria monocytogenes trên môi trường PALCAM.
Dùng pipet hút 0.1 ml mẫu cho vào môi trường thạch Palcam, sau ñó tiến hành cấy trang ( trang ñến khi thấy môi trường lan ñều mặt thạch là ñược). Sau ñó, ñem ủ ở 370C trong vòng 48 giờ. Sau 48 giờ lấy ra quan sát, ta thấy khuẩn lạc Listeria monocytogenes có màu xám ñến 38 xanh lá cây, có tâm màu ñen. Môi trường xung quanh chuyển sang màu xanh ñen. c/ Khẳng ñịnh Listeria monocytogenes bằng các thử nghiệm sinh hóa. − Thử khả năng tan huyết.
Chọn khuẩn lạc ñiển hình trên môi trường thạch Oxford, dùng que cấy vòng,cấy truyền sang môi trường thạch máu, ủ ở 370C, 24-48 giờ. Trên môi trường thạch máu, khuẩn lạc Listeria monocytogenes ñược bao quanh bởi vòng tán huyết hẹp do hiện tượng dung huyết dạng β vòng tan huyết trong và rõ. Trước khi tiền hành thử nghiệm khẳng ñịnh, cấy chuyền khuẩn lạc nghi ngờ là vi khuẩn Listeria monocytogenes sang môi trường lỏng không chọn lọc, ủ ở 250C, trong 20 giờ. - Thử nghiệm Catalase.
Nguyên tắc: Các vi sinh vật kỵ khí và hiếu khí tùy nghi chứa chuỗi ñiện tử có cytochrome ñều có enzyme catalase (trừ các Streptococcus.spp). Enzyme catalase có vai trò bảo vệ tế bào khỏi các tổn thương bởi các dẫn xuất ñộc tính cao của oxy phân tử trong tế bào vi sinh vật. Các vi sinh vật có khả năng biến dưỡng năng lượng theo phương thức với oxy là chất nhận ñiện tử cuối cùng trong chuỗi truyền ñiện tử tạo H2O2. Catalase thủy phân hydrogen peroxide (H2O2) thành H20 và O2, ngăn cản sự tích tụ của phân tử có ñộc tính cao này trong tế bào. Sự thủy phân hydrogen peroxide sẽ giài phóng O2 ñược ghi nhận qua sự sủi bọt khí.
Chủng làm ñối chứng của thử nghiệm này là Staphylococcus epidermidis, Enterococcus faecalis. 39 Hình 3.1. thử nghiệm Catalase.
Phương pháp tiến hành: Hóa chất dùng ñể tiến hành thử nghiệm là: Hydrogen Peroxide 30%, dung dịch ñệm Photphate pH 7.0. − Thử trên lame.
Dùng que cấy thẳng cấy lấy một ít sinh khối từ khuẩn lạc thuần ñặt trêm lame, nhỏ 1 giọt H2O2 30% lên sinh khối vi sinh vật trêm lame, nhỏ 1 giọt H2O2 0.5% rồi ñậy lại bằng lamelle. Nếu dương tính sẽ xuất hiện bọt khí bị giữ lại giữa lame và lamelle. − Thử nghiệm trên ñĩa Petri.
Nhỏ trực tiếp 1ml H202 30% lên sinh khối chủng thuần trên bề mặt thạch. Nếu dương tính sẽ xuất hiện sủi bọt quanh sinh khối. − Thử nghiệm Oxidase.
Nguyên tắc:  Xác ñịnh sự hiện diện của hệ enzyme oxidase ở vi sinh vật. Enzyme quan trọng nhất là cytochrome oxidase trong chuỗi truyền ñiện tử của hô hấp hiếu khí với O2 là chất nhận ñiện tử cuối cùng , chỉ hiện diện ở 40 các lòai hiếu khí hay kỵ khí tùy nghi. Họat tính cytochrome oxidase ñược phát hiện nhờ thuốc thử p- phenylenediamine. Trong ñiều kiện có sự hiện diện của cytochrome C khử trong tế bào, thuốc thử này bị oxy hóa thành một hợp chất indophenol có màu xanh dương. Chủng dùng làm ñối chứng là (+) Pseudomonas aerugnosa, (-) Acinetobacter lwoffi.
Phuơng pháp tiến hành.  Cách 1: cấy sinh khối chủng thuần lên ống thạch nghiêng Nutrien Agar, ủ ở nhiệt ñộ thích hợp trong 24-48 giờ. Nhúng một mành giấy lọc vào dung dịch 1% teramethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride hoặc oxalate. Dùng que cấy vòng thu lấy sinh khối, dàn ñều lên vị trí có thuốc thử trên giấy lọc. Nếu không xuất hiện màu xanh thì phản ứng âm tính.  Cách 2: Cấy sinh khối chủng thuần lên ống thạch nghiêng Nutrien Agar, ủ ở nhiệt ñộ thích hợp trong 24-48 giờ. Nhỏ lên sinh khối vào giọt mỗi lọai thuốc thử mới pha là 1% p-aminodimethyaniline oxalate và 1% α-napthol trong ethanol. Nếu không xuất hiện màu xanh thì phản ứng âm tính. − Thử nghiệm tính di ñộng.
Nguyên tắc.  Vi sinh vật họat ñộng di chuyển ñược là nhờ tiêm mao. Khả năng di ñộng có thể dùng ñể phân biệt các vi sinh vật, khả năng này ñược quan sát nhờ sự tăng trưởng và di ñộng của vi sinh vật vào bên trong thạch mềm.  Chủng dùng ñể làm ñối chứng là: Serratia marcescens, Acinetobacter lwoffi. 41
Phuơng pháp tiến hành.  Sử dụng môi trường thạch mềm chứa 0.5% agar. Môi trường ñược ñun tan chảy, phân phối thành dung tích 5ml vào ống nghiệm vô trùng, hấp khử trùng ở 1200C trong 15 phút. Các ống môi trường này ñược làm nguội ở trạng thái ñứng và bảo quản 4-100C. Dùng que cấy thẳng thu lấy sinh khối từ khuẩn lạc của chủng thuần sau khi ủ ở nhiệt ñộ thích hợp. Chủng ñược cấy bằng cách ñâm sâu ñầu que cấy xuyên vào giữa môi trường trong ống nghiệm ñến ñộ sâu khoảng 2cm . Các ống môi trường ñược ủ ở 370C trong 24/48 giờ. Thực hiện song song với việc ủ ở ñiều kiện tương tự một ống môi trường không ñược cấy vi sinh vật dùng làm ống ñối chứng.  Ống ñối chứng không có vi sinh vật tăng trưởng, môi trường trong. Nếu sử dụng môi trường thạch mềm mà trong ống nghiệm có Listeria monocytogenes thì Listeria monocytogenes sẽ mọc lan khỏi ñường cấy theo hình dù và làm vẫn ñục môi trường xung quanh. − Khả năng biến dưỡng ñường.
Nguyên tắc.  Xác ñịnh khả năng sử dụng một nguồn carbon nhất ñịnh của vi sinh vật ñể tăng trưởng.
Phương pháp tiến hành.  Ủ các ống canh trùng thử khả năng lên men ñường ở 370C trong 7 ngày. Kết quả (+) (màu vàng) thường quan sát ñược trong vòng 24-48 giờ. Listeria monocytogenes lên men rhamnose nhưng không có khả năng lên men xylose.  Thử nghiệm CAMP. 42
Nguyên tắc.  Phản ứng CAMP là phả ứng phối hợp giữa nhân tố protein tiết bởi các loài Streptococcus nhóm B với nhân tố β-hemolysin tiết ra bởi chủng Streptococcus aureus gây ra hiện tượng làm tan hồng cầu của cừu hoặc bò trên môi trường thạch màu. Nhân tố CAMP có vai trò tăng cường hoạt tính photpholipase C xúc tác thuỷ phân thành phần chủ yếu của màng hồng cầu cừu hoặc bò là β-hemolysin. Photpholipase C thuỷ phân lecithin ở màng ngoài tạo thành các diglyceride, photphatidyl choline và ceramide. Ceramide và diglyceride kết tụ với nhau thanh những giọt ñặc. Nhân tố CAMP tác dụng lên các khối tụ này tạo ra khoảng trống trên màng ngoài giúp cho photpholipase C có ñiều kiện tiếp xúc và thuỷ phân sphigomelin ở màng trong làm hồng cầu dễ vỡ. Trong thử nghiệm CAMP người ta tiến hành cấy chủng kiểm nghiệm cùng với một chủng Staphylococcus tạo nhiều β-lysin lên môi trường thạch máu ñược bổ sung máu cừu hay bò. Nếu chủng kiểm nghiệm CAMP thì sẽ xuất hiện ñường tan huyết ở vùng lân cận chung của ñường cấy chủng kiểm nghiệm và Saccharomyces aureus.
Phương pháp tiến hành.  Trên ñĩa thạch dung ñể thử CAMP, cấy Saccharomyces aureus thành một ñường cấy mỏng, tương tự cấy Rhodocus equi ñể tạo thành 2 ñường cấy song song cách nhau 4cm.  Cấy chủng nghi ngờ Listeria monocytogenes ở giữa, gần nhưng không chạm vào 2 ñường cấy song song của Staphylococcus aureus và Rhodococus equi. Có thể cấy một hoặc nhiều dòng vi khuẩn nghi ngờ Listeria monocytogenes làm chủng kiểm nghiệm ñể kiểm tra trên cùng 43 một ñĩa. Cấy chủng ñối chứng Listeria monocytogenes và chủng Listeria innocua thành hình vuông góc nhưng không chạm vào nhau. Ủ ñĩa ở 370C trong 20-36 giờ. Phản ứng dương tính khi xuất hiện vùng cộng hưởng tan huyết ngay tại ranh giới của chủng kiểm nghiệm với Staphylococcus aureus hoặc giữa chủng thử nghiệm với Rhodococus equi. Phản ứng CAMP dương tính với Rhodococus equi sẽ tạo vùng tan huyết rộng (5-10mm) và có hình dạng ñầu mũi tên. Phản ứng dương tính với Staphylococcus aureus thường tạo vùng tan huyết hẹp ( khoảng 2 mm) có dạng hình tròn. Listeria monocytogenes cho phản ứng CAMP dương với S.aureus và âm với Rhodococus equi. Ngược lại, Listeria innocua có phản ứng CAMP âm với cả hai loài Staphylococcus aureus và Rhodococus equi. 3.2. Phương pháp hiện ñại. 3.2.1. Phương pháp ELISA. 3.2.1.1. Nguyên tắc. - Nguyên tắc của phương pháp miễn dịch là phản ứng giữa một tế bào(kháng nguyên) vớimột kháng thể ñặc hiệu. Tín hiệu của một phản ứng miễn dịh có thể nhận biết thông qua sự ngưng tủa hay kết dính của kháng nguyên kháng thể hoặc bằng cách sử dụng những kháng thể ñã ñược ñánh dấu bằng cách nhuộm hùynh quang, ñồng vị phóng xạ, hay enzyme. - Phương pháp ELISA là phương pháp hấp thụ miễn dịch liên kết enyme. Nguyên tắc kỹ thuật Elisa là sử dụng kháng thể ñơn dòng hay còn gọi là kháng thể sơ cấp phủ bên ngòai những giếng nhỏ nhằm mục ñích thu giữ ñược phép thu giữ bằng cách sử dụng kháng thể thứ 2 có gắn enzyme phát tín hiệu. Khi cho vào hỗn hợp phản ứng một cơ chất ñặc hiệu của enzyme, 44 phản ứng xãy ra và làm ñổi màu các sản phẩm làm ñổi màu phản ứng.Vì vậy chúng ta có thể phát hiện ñược sự hiện diện của kháng nguyên. 3.2.1.2. Quy trình thực hiện phân tích. Sơ ñồ 3.2. Quy trình phát hiện Listeria monocytogenes. Thuyết minh quy trình.
Chuẩn bị mẫu.
Tăng sinh lần ñầu : Thêm 25g mẫu vào 225ml dung dịch 3M Listeria Broth (LB), trộn ñều, ủ ở 36=5-370C/24h. Cho mẫu vào giếng ñể 30 phút, ở 35-370C Thêm phức hợp kháng thể và enzyme Chuẩn bị mẫu ( tăng sinh lần 1 ở 30- 350C/24h, tăng sinh lần 2 ở 300C/22-24h. Thêm cơ chất, dể khỏang 10 phút ở 20-250C ðọc kết quả 45
Tăng sinh lần 2: Chuyển 0.1ml dung dịch tăng sinh lần 1 vào 9.9ml canh FRASER ủ ở 300C/22-24h.
Cách tiến hành phân tích bằng phản ứng ELISA.
Chuẩn bị: Xử lý nhiệt.
Chuyển 1ml mẫu từ canh Fraser vào 50µl dung dịch phụ trợ mẫu vào ống ñã ñược dán nhãn, ngâm 15 phút trong nước sôi, ñể nguội. Mở hộpp Listeria VIA và ñể ở nhiệt ñộ phòng. Mở bao và tháo giếng ra rồi ñặt ở chân ñế.
Cách tiến hành:  Bước 1: ♦ Cấy mẫu và mẫu ñối chứng, ghi lại vị trí cấy mẫu và dung pipep hút 200µlmẫu và dịch ñối chứng vào giếng rồi rữa và ñổ bỏ nước mỗi giếng 3 lần.  Bước 2: ♦ Thêm 200µl chất kết hợp vào mỗi giếng, ñậy giếng, ủ ở 35-370C/30 phút. ♦ Rửa: ñổ hết dung dịch trong giếng rồi rữa và ñổ bỏ nước ở giếng rữa mỗi giếng 4 làn.  Bước 3: ♦ Thêm 200µl cơ chất vào mỗi giếng, ủ 20-250C/15 phút. Them 20µl dung dịch kết thúc giúp ổn ñịnh màu vào mỗi giếng ( nếu cần).  Bước 4: ðọc kết quả. ♦ ðọc bằng mắt thường nhờ bảng so màu hoặc sử dụng máy ñọc. ♦ Nếu mẫu có màu xanh lá cây ñến xanh dương ñậm thì mẫu dương tính. 3.2.2. Phương pháp lai phân tử. 46 3.2.2.1.Nguyên tắc. - Phương pháp sử dụng mẫu dò ñể phát hiện v sinh vật trong thực phẩm ñược dựa trên sự phát hiện một ñọan gene ñặc trưng của vi sinh vật. Cơ sở của vịec mẫu dò là quá trình lai phân tử. - Cơ sở của việc sử dụng mẫu dò là phương pháp lai phân tử. Qúa trình này bao gồm sự tách rời hai mạch ñôi của chuỗi xoắn kép DNA và sự tái bắt cặp các trình tự nucleotide bổ sung khi nhiệt ñộ trở lại bình thường. Sự lai phân tử xãy ra khi ñoạnmồi có trình tự nucleotide bổ sung với một vúng trình tự trên DNA mục tiêu gặp nhau do chuyển ñộng nhiệt và khi nhiệt ñộ môi trường thấp hơn Tm ít nhất vài ñộ. Qúa trình lai phân tử chịu ảnh hưởng bởi rất nhiều yếu tố: nồng ñộ DNA trong môi trường, nhiệt ñộ và thời gianphản ứng, kích thước các trình tự lai và lực ion của môi trường. 3.2.2.2. Cách làm. - Hệ thống này sử dụng que với mẫu dò ñể phát hiện Listeria. Mẫu dò là những ñọan Oligomer DNA ñánh dấu bằng hóa chất phát quang. Quy trình có thể ñược chia làm 6 bước:
Phát vỡ tế bào thu nhận rRNA.
Mẫu dò DNA có ñuôi oligodeoxyadenylic nucleotide (dA) và mẫu dò phát hiện chứa fluorescenin isothiocynate (F) ở ñầu 5’ và 3’của phân tử ñược ñặt vào phản ứng.
Que thử ñược bao bọc bởi polydeoxythydien (dT) ñể gắn kết ñược với oligo dA của mẫu dò
Que thử ñược ñặt vào ống ño chứa mẫu dò phát hiện ñược ñánh dấu bằng enzyme. 47
Sau khi rữa, lọai bỏ phần enzyme thừa , que thử ñược ñặt vào ống ño chứa cơ chất tạo màu.
Sau khi ủ ñể hiện màu, màu ñược phát hiện ở bước sóng 450nm. 3.2.3.Phương pháp PCR. 3.2.3.1. Nguyên tắc. - Phương pháp PCR là một phương pháp invitro ñể tổng hợp DNA dựa trên khuôn là môt trình tự DNA ban ñầu, khuyếch ñại, nhân số lượng bản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ họat ñộng của enzymepolymerase và môt cặp mồi ñặc hiệu cho ñọan DNA này. - Toàn bộ quá trình ñược lặp ñi lặp lại 25-30 chu kỳ ñể một bản sao của mẫu DNA có thể biến thành ha2ng tỷ bản sao trong vòng 3-4 giờ. 3.2.3.2. Cách làm.  Cách xác ñịnh Listeria monocytogenes bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi LM-F và LM-R. - Chủng vi sinh vật: Listeria monocytogenes. - Chuẩn bị thí nghiệm.
Trình tự gen hlyA ñã ñược công bố trên ngân hàng gen.
Phần mềm BLAST dung ñể xác ñịnh trình tự gen ñích hlyA của Listeria monocytogenes.
Cặp mồi LM-F và LM-R.
Hóa chất sử dụng ñể tách chiết DNA tổng số.
Phương pháp tiến hành thí nghiệm cho phản ứng PCR.
Dựa trên trình tự gen hlyA của các chủng Listeria monocytogennes ñược công bố trên ngân hàng gen, cặp mồi LM-F và LM-R ñược thiết kế bao gồm 20bp/mồi cho sản phẩm PCR 468bp. 48 - Xác ñịnh tính ñặc hiệu của mồi.
Tính ñặc hiệu của mồi ñược khảo sát bằng cách kiểm tra khả năng bắt cặp của mồi thiết kế với các khuôn DNA của vi khuẩn Listeria moocytogenes và không phải là vi khuẩn Listeria mococytogenes trong phản ứng PCR. - Phản ứng PCR.
DNA khuôn từ Listeria monocytogenes ñược thu nhận cho phản ứng PCR bằng cách tách à làm sạch DNA với chloroform hoặc sử lý nhiệt tế bào ở 1000C trong 10 phút. Tối ưu hóa ñiều kiện PCR về nồng ñộ MG2+ (1 .5-4.0 mM), nồng ñộ mồi (0.1-0.5pmol/mồi) và nồng ñộ dNTPs (100- 250Mm/mỗi loại). Phản ứng PCR ñược thực hiện với thể tích hổn hợp 25ml vói chu trình nhiệt gồm 940C/3 phút,( 940C/ 1 phút, 600C/1 phút , 720C/ 1 phút)×30 trình, 720C/ 5 phút và 40C/5 phút. ðánh giá kết quả trên gel agarose 1% với 3ml sản phẩm. - Xác ñịnh ñộ nhạy của phương pháp.
Môi trường nuôi cấy qua ñêm của vi khuẩn Listeria monocytogenes là tr6n môi trường LEB ñược ñịnh lượng, pha loãng với mật ñộ thích hợp. Ly tâm thu sinh khối 1ml canh trường hòa tan trong 100ml TE, xử lý nhiệt thu DNA cho phản ứng PCR 3ml dịch tế bào ñã qua sử lý nhiệt ñược sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR. ðánh giá kết quả nhờ ñiện di trên gel agarose 1% với 3ml sản phẩm. - Bộ gen DNA.
Bộ gen DNA của Listeria monocytogenes ñược tách và làm sạch dung là khuôn cho phản ứng PCR khuyết ñại ñoạn gen mục tiêu hlyA với cặp mồi LM-F và LM-R. Kết quả phản ứng PCR với khuôn DNA tinh sạch cho thấy một dãy DNA có kích thước nằm trong khoảng kích thước sản phẩm 49 PCR ñã ñược thiết kế sẵn. Với mục ñích thu nhận DNA bản mẫu cho phản ứng PCR một cách ñơn giản hơn, huyền phù Listeria monocytogenes ñược sử lý nhiệt ở 1000C trong 10 phút ñể phá vỡ tế bào, giải phóng DNA, ly tâm 10000 vòng / 1 phút × 10 phút, thu dịch ly tâm chứa DNA làm khuôn cho phản ứng PCR. - Xác ñịnh ñiều kiện tối ưu cho phản ứng PCR.
Nồng ñộ Mg2+: phản ứng PCR ñược thực hiện ở các nồng ñộ cuối cùng của Mg2+ từ 1.5mM-4.0Mm.
Nồng ñộ mồi: PCR ñược thực hiện tại các nồng ñộ mồi khác nhau từ 0.1- 05 pmol.
Dịch tế bào ñược xác ñịnh mật ñộ vi khuẩn bằng phương pháp ñếm khuẩn lạc. Pha loãng dịch vi khuẩn với các nồng ñộ khác nhau, xử lý nhiệt các dịch huyền phù vi khuẩn, 3 ml dịch sinh khối vi khuẩn sau khi sử lý nhiệt dung làm khuôn cho phản ứng PCR cho thấy phản ứng PCR cho kết quả dương tính với mẫu có mật ñộ tế bào 6 × 102/ phản ứng tương ứng với mật ñộ tế bào 2 × 104 CFU/ml. - Ưu ñiểm của phương pháp PCR.
Thời gian cho kết quả nhanh.
Có thể phát hiện những vi sinh vật khó nuôi cấy. Việc nuôi tăng sinh là ñơn giản hop7n và ñôi khi không cần thiết.
Hóa chất cần cho phản ứng PCR dễ tìm và dễ tồn trữ hơn so với trường hợp huyết thanh học. Không cần dụng cụ nuôi cấy và môi trường phân tích phức tạp, có thể thực hiện ngay tại hiện trường.
Ít tốn kém về nhân sự, có thể ñược tự ñộng hóa ñể làm giảm chi phí phân tích phát hiện các vi khuẩn gây bệnh trong thực phẩm. 50 - Nhược ñiểm của phương pháp PCR.
Sự ức chế hoạt tính ủa Tag DNA polymerase bởi thành phần của mẫu vật do mẫu thực phẩm thường có những thành phần phức tạp. Tuy nhiên, việc chiết tách và tính chế DNA từ thực phẩm hay môi trường trước khi thực hiện phương pháp PCR thường cho phép loại bỏ những hợp chất ức chế.
Mật ñộ vi sinh vật gây bệnh hiện diện trong mẫu thực phẩm thường thấp nên trong ña số trường hợp cần có bước nuối cấy làm giàu ñể có ñược mật ñộ ñể phát hiện bằng PCR.
Phương pháp này không phân biệt ñược tế bào sống với tế bào chết. Do vậy , có thể dẫn ñến trường hợp dương tính giả do DNA từ tế bào chết . ngược lại, phương pháp này cho phép phát hiện bào tử, dạng tiềm sinh hay tế bào ñã chết của các vi sinh gây bệnh, gây ngộ ñộc thực phẩm. 51 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận. - Tóm lại, vi khuẩn Listeria monocytogenes là 1 loài vi khuẩn gây ngô ñộc thực phẩm nguy hiểm cho người ăn phải những thực phẩm bị lây nhiễm. - ðặc biệt, nó gây nguy hiểm ñối với những phụ nữ mang thai, những người lớn tuổi, những có hệ thống miễn dịch suy giảm và trẻ sơ sinh khi mắc phải vi khuẩn Listeria monocytogenes có thể nguy hiểm ñến tính mạng. - Trên thế giới hiện nay, vấn ñề về vi khuẩn này hiện nay là vấn ñề vô cùng ñược quan tâm. Mặc dù, nó không xãy ra nhiều dịch bệnh tại Việt Nam. Nhưng tình hình lây nhiễm Listeria moncytogenes ñã từng xuất hiện tại Việt Nam và trên thế giới với một mức ñộ càng ngày càng tăng cao. - Trên thế giới hiện nay, ñã có nhiều công trình nghiên cứu về vi khuẩn Listeia monocytogenes và hiện nay ở các nước Châu âu vấn ñề về vi khuẩn Listeria gây nhiễm vào thực phẩm hiện ñang rất ñược quan tâm và kiểm soát kỹ bằng các phương pháp hiện ñại. - Nhưng tại Việt Nam vấn ñề nguy hiểm này chưa ñươc quan tâm ñúng mức và chưa ó phương pháp phòng chống 1 cách ñúng mức. 4.2. Kiến nghị. - Từ những nguy hiểm trên nên có cách phòng chống sự lây nhiễm của vi khuẩn Listeia monocytogenes. - Nên kiểm tra nghiêm ngặt những thực phẩm tiêu dùng về mức ñộ vi khuẩn trong thực phẩm, ñặc biệt là ñối với vi khuẩn Listeria monocytogenes. 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mỹ phẩm. – Trần Linh Thước. [2] Vi khuẩn y học – PGS- Ts Lê Văn Phùng [3] Giáo trình vi sinh vật học thực phẩm – Kiều Hữu Ảnh. [4] Sổ tay kiểm nghiệm vi sinh trong thủy sản – nhà xuất bản nông nghiệp. [5] Aerobic and Facultative Gram-Positive Bacilli