Khóa luận Sản xuất bào tử nấm Trichoderma spp. Làm thuốc trừ nấm bệnh cây trồng

choài, ngaén, nhoû, nhieàu boâng traùi, traùi bò chua, cuoái cuøng caøy cheát hoaøn toaøn. Khi caây chôùm beänh thì chæ vaøi nhaùnh reå bò thoái, coù soïc naâu treân reã chaïy töø choùp reã vaøo trong vaø ôû reã lôùn thì voû reã tuoät khôûi phaàn goã. Beänh naëng thì toaøn boä reã thoái. Chöõa trò : thoaùt nöôùc toát, bôø cao, dinh döôõng caây, kieåm tra vöôøn, phun thuoác, hoùa chaát kích thích ra traùi… naám Fusarium solani caây quyùt tieàu Beänh chaùy laù cheát ñoït Treân laù ban ñaàu chæ laø nhöõng ñoám nhoû suõng nöôùc, sau ñoù lan roäng daàn laøm laù phaùt trieån keùm, co laïi, khoâ vaø ruïng. Treân caây con beänh laøm laù ngoïn bò chaùy, khoâ daàn, beänh naëng laøm ñoït cheát. Treân caây tröôûng thaønh beänh laøm laù khoâ, ngoïn cheát, laù beänh thöôøng dính laïi do tô vaøng naâu, ñoâi khi coù haïch troøn naâu nhaït. Ñoä aåm cao thì veát beänh chuyeån sang ñen vaø thoái nhuõn ra. Beänh laù thí caû taùn caây truïi laù, giaûm quang hôïp vaø naêng suaát, chaát löôïng traùi. Chöõa trò : troàng thöa, töôùi ít, veä sinh, kieåm tra vöôøn, phun thuoác naám Rhizoctonia solani Caây saàu rieâng Phaán traéng Beänh gaây haïi treân quaû, ñoït non, laù non, chuøm boâng. Beänh naøy lieân quan chaët cheõ vôùi ñoä aåm khoâng khí, luùc caây ra hoa keát traùi. Treân chuøm hoa beänh coù phuû lôùp naám traéng xaùm, naëng thì chuyeån naâu, khoâ chaùy. Beänh laøm traùi phaùt trieån keùm, thaâm ñen, khoâ. Traùi lôùn khi maéc beänh thöôøng keùm phaùt trieån, khoâng côm hoaët ít, traùi coù maøu naâu ñen, vì theá ngöôøi daân coøn goïi beänh naøy laø beänh raâu keõm. Chöõa trò : troàng thöa, thoâng thoaùng, chaêm soùc, kieåm tra vöôøn kyõ vaø thöôøng xuyeân, phun thuoác naám Oidium sp Choâm choâm Thoái goác chaûy muû Loaøi naám naøy löu toàn trong ñaát vaø nöôùc. Beänh thöôøng phaùt sinh caø maïnh trong muøa möa. Beänh gaây thoái goác, chaûy muû, laøm cheát caây. Treân laù : veát beänh laù nhöõng veát nhoû suõng nöôùc, maát maøu, sau ñoù lan roäng laøm ruïng heát laù. Treân traùi : beänh laø nhöõng veát aåm öôùt maøu naâu ñen, aåm ñoä cao thì xuaát hieän tô naám, beänh lan roäng laøm thoái traùi. Treân goác thaân, caønh lôùn : choã bò beänh chaûy nhöïa ñoû, voû vaø vuøng goã phía döôùi chuyeån sang hoàng lôït vaân tím, vieàn gôïn soùng. Naëng laøm cheát caây. Chöõa trò : caét tæa caønh laù giaø, beänh, thoaùt nöôùc toát, giaûm phaân ñaïm taêng phaân laân, kali, höõu cô, töôùi ít, khieåm tra vaø chaêm soùc thöôøng xuyeân, kyõ caøng, phun thuoác naám Phytophthora palmivora saàu rieâng vaø treân 100 loaïi caây troàng khaùc Thaùn thö Quaû bò naám xaâm nhieãm töø khi coøn xanh, veát beänh nhoû, deït, hôi saùng, beänh ôùn daàn ( 12mm) thì beà maët loõm, coù voøng troøn ñoàng taâm, raùm naâu. Treân laù veát beänh thöôøng nhoû, troøn, maøu naâu, quaàng vaøng. Treân reã veát beänh naâu, reã giaø, coù chaám ñen nhoû, reã to troùc voû, reã phuï caèn coãi, thoái muïc. Naám beänh lan truyeàn nhôø gioù, nöôùc… Chöõa trò : troàng luaân canh, chaêm soùc, veä sinh kieåm tra thöôøng xuyeân, kyõ caøng ñeå haïn cheá beänh, phun thuoác nhö : Topsin M 70WP, Benlate 50WP… naám Colletotrichum coccodes Caø chua Heùo vaøng Beänh gaây haïi döa töø khi coøn nhoû ñeán luùc thu hoaïch traùi trôû ñi. Loaïi naám naøy öa ñieàu kieäng noùng aåm neân khi giaøn döa leo kín, gaëp thôøi tieát noùng aåm trong muøa möa, aåm ñoä taêng cao laøm naám beänh gaây haïi nhieàu. Naám beänh taïo veát thaâm treân döa roài lan roäng daàn laøm caây döa heùo nheï luùc tröa, naéng noùng, chieàu toái vaø saùng hoâm sau caây döa töôi trôø laïi. Beänh naëng laøm laù döa vaøng daàn, heùo ruõ khoâng theå töôi trôû laïi. Chöõa trò : thoaùt nöôùc toát, thoâng thoaùng, troàng thöa, caét tæa laù giaø, boùn phaân caân ñoái, phun thuoác naám Fusarium sp. , naám Pythium vaø vaøi loaïi naám khaùc Caây döa leo Heùo ruõ traéng goác Moâ beänh phaân huûy daàn. Laù vaøng daàn daàn töø goác ñeán ngoïn. Treân veát beänh ôû goác xuaát hieän lôùp hieän lôùp naám traéng, lan daán ra maët ñaát xung quanh goác caây. Naám beänh laøm cheát caây con vaø caây tröôûng thaønh, reã caây vaø quaû bò thoái, caây cheát khoâ, hoùa naâu. Sôïi naám maøu traéng, ña baøo, phaân nhaùnh nhieàu, phaùt trieån theo kieåu ñaâm tia. Naám xaâm nhaäp vaøo goác caây con, caây tröôûng thaønh, söû duïng chaát höõu cô laøm nguoàn dinh döôõng, saûn sinh acid oxalic vaø men laøm phaân huûy moâ caây chuû. Thôøi tieát noùng aåm phuø hôïp beänh phaùt trieån. Beänh thöôøng xuaát hieän vaøo thaùng 4,5,8,9,10. Chöõa trò : veä sinh vöôøn, boùn phaân caân ñoái, coù theå phun thuoác vaø troàng luaân canh naám Sclerotium rolfsii nhieàu loaïi caây nhö caø chua, ñaäu, ôùt, baàu bí, khoai taây, rau… Khoâ heùo Naám xaâm nhieãm vaøo veát thöông reã, laøm noù thoái khoâ, maøu naâu, laù maát maøu saùng meám daàn, khoâ heùo. Beänh phaùt sinh vaøo thaùng 4-6, naám beänh soáng hoaïi sinh trong ñaát. Laây lan nhôø gioù, beänh caùng naëng khi coù möa phuøn. Chöa trò :caét tæa caønh laù, nhoå caây, thay chaäu, boû haït trong muøa beänh, phun thuoác naám löôõi lieàm ( Fusarium dianthi ) Caây caåm chöôùng Ñoám than Beänh xuaát hieän ôû caùc vöôøn hoa caåm chöôùng, tyû leä beänh treân 50%. Beänh xaâm nhieãm vaøo ngoïn laù, luùc ñaàu laø caùc ñoám vaøng khoâ, daàn daàn lan roäng ra. Treân ñoám xuaát hieän caùc ñoám ñen, ñoù laø baøo töû naám. Chöõa trò : chaêm soùc kyõ, tieâu huûy caønh laù caây beänh, phun thuoác naám ñóa gai (Colletrichum sp. ) Caåm chöôùng ( Nguyeãn Danh Vaøn ) CHAÁT TRÖØ NAÁM SINH HOÏC (BIOFUNGICIDE ) Coù toång coäng 586 chuûng naám men töï nhieân thuoäc caùc chi khaùc nhau ñaõ ñöôïc thöû nghieäm khaû naêng ñoái khaùng cuûa chuùng vôù1 caùc chuûng naám beänh gaây haïi cho caây troàng. Khaû naêng ñoái khaùng cuûa caùc chuûng naám laø 1 ñaëc tính quan troïng vaø noù khoâng phuï tuoäc vaøo caùc loaïi hay chi. Troïng caùc ñoái khaùng, 2 chuûng Saccharomyces cerevisiae vaø Zygosaccharomyces cho thaáy 1 phoå roäng veà hoaït ñoäng ñoái khaùng vôùi caùc taùc nhaân gaây beänh caây troàng. Baûng 2.3 : Hieäu löïc cuûa Saccharomyces vaø Zygosaccharomyces öùc cheá caùc naám gaây beänh haïi caây troàng Ñoái khaùng naám men Öùc cheá naám beänh Cladospo rium variabile Rhizoctonia Fraga riae Phomo sis longicolla Colleotri chum acutatum A. ni ger Sclero tinia sderotiorum Penicillium digita tum Macrophomina phaseolina T. viri de Botytis squa mosa Saccharo myces ( S ) S.84 ++ + ++ - + + + + + + S.108 ++ + ++ - - + + + + + S.207 ++ + ++ - - + ++ ++ + + S.244 ++ + ++ - - + + + + + S.605 ++ + ++ - - - + + + + S.652 ++ + ++ + - + + + ++ + S.826 ++ + ++ - + ++ ++ ++ + + S.831 ++ + ++ - ++ + + + + + S.888 ++ + ++ - - - - + + + S.900 ++ + ++ - - + + + - + S.946 ++ + ++ - - + + + + + S.7138 ++ + ++ - - + + + + + Zygo Saccharo myces ( Z ) Z. F30 ++ + ++ + + ++ ++ ++ ++ + Z.F33 ++ + ++ - - + + ++ ++ + Z.F42 ++ + ++ - - ++ ++ + + + Z.F48 ++ + ++ - - + + - + + ++ : hieäu löïc ñoái khaùng cao. + : coù hieäu löïc ñoái khaùng. - : khoâng coù hieäu löïc ñoái khaùng 2.3. TOÅNG QUAN VEÀ TRICHODERMA SPP. LAØM CHAÁT TRÖØ NAÁM SINH HOÏC 2.3.1. PHAÂN LOAÏI Trichoderma spp. laø gioáng naám khaù phoå bieán trong töï nhieân, tuy nhieân heä thoáng phaân loaïi cuûa chuùng chöa roõ raøng vaø khaù phöùc taïp, do ñoù coù nhieàu yù kieán khaùc nhau ñöa ra khi phaân loaïi gioáng naám naøy. Hình 2.5 : naám Trichoderma harzianum Ngaønh : Ascomycota Lôùp : Deuteromycetes ( nhoùm naám baát toaøn) Boä : Moniliates Hoï : Moniliaceae Gioáng : Trichoderma spp. Phöông phaùp phaân loaïi truyeàn thoáng laø döïa treân söï khaùc nhau veà hình thaùi chuû yeáu laø ôû boä phaän hình thaønh baøo töû voâ tính. Gaàn ñaây nhieàu phöông phaùp phaân loaïi döïa treân caáu truùc phaân töû ñöôïc söû duïng. Hieän nay naám Trichoderma coù ít nhaát 33 loaøi. Theo 2 nhaø khoa hoïc Brazil laø Esposito vaø Manuela da Silva thì Trichoderma ñöôïc phaân thaønh 5 nhoùm : Trichoderma, Longibrachiatum, Satutnisporum, Pachibarium vaø Hypocrenum. 2.3.2 ÑAËC ÑIEÅM NAÁM TRICHODERMA SPP. 2.3.2.1 ñaëc ñieåm hình thaùi, sinh tröôûng vaø hình thaønh baøo töû cuûa Trichoderma - Ñaëc ñieåm hình thaùi: Trichoderma laø moät gioáng naám ñaát, phaùt trieån toát treân caùc loaïi ñaát giaøu dinh döôõng hoaëc treân taøn dö thöïc vaät. Ñaëc ñieåm hình thaùi cuûa naám naøy laø caønh baøo töû khoâng maøu, sôïi naám khoâng maøu, coù vaùch ngaên, coù khaû naêng phaân nhaùnh nhieàu vaø cho löôïng baøo töû raát lôùn. Baøo töû thöôøng coù maøu xanh, ñôn baøo hình tröùng, troøn, elip hoaëc hình oval tuøy theo töøng loaøi. Baøo töû ñính ôû ñænh cuûa caønh. - Söï sinh tröôûng cuûa Trichoderma: laø moät gioáng naám hoaïi sinh trong ñaát neân Trichoderma coù khaû naêng söû duïng nguoàn hoãn hôïp carbon vaø nitrogen. Nguoàn cacbon vaø naêng löôïng Trichoderma söû duïng ñöôïc laø Monosaceharides vaø Disaccharides, cuøng vôùi hoãn hôïp Polysaccgarides, puriness, pyrinidines, acideamin, tanmins vaø caechins coâ ñoïng; Aldehydes vaø acide höõu cô. Ñaëc bieät laø acide beùo (E.B.Nelson, G.E. Harman), methanol methylamine, formate vaø NH3 laø nguoàn ñaïm baét buoäc phaûi coù trong moâi tröôøng nuoâi troàng Trichoderma. Nhöõng nguoàn nitrogen naøo cuõng hoã trôï cho moâi tröôøng coù nhieàu dinh döôõng. Muoái, caùc nguoàn sulfur vaø caùc hoãn hôïp nhö vitamin cuõng coù aûnh höôûng lôùn ñeán khaû naêng sinh tröôûng cuûa Trichoderma. Nhöng muoái sodium chloride seõ laøm giaûm söï sinh tröôûng vaø phaùt trieån cuûa moät soá loaøi Trichoderma. Do ñoù trong moâi tröôøng nuoâi troàng khoâng ñöôïc coù maët cuûa muoái naøy. Noàng ñoä CO2 trong moâi tröôøng nuoâi troàng cuõng aûnh höôûng ñeán söï sinh tröôûng cuûa naám ñoái khaùng trong ñaát. Tuy nhieân aûnh höôûng cuûa CO2 ñeán khaû naêng sinh tröôûng vaø saûn xuaát cuûa Trichoderma phuï thuoäc vaøo noàng ñoä pH cuûa moâi tröôøng ñaát. CO2 noàng ñoä 10% khoâng aûnh höôûng ñeán toác ñoä sinh tröôûng cuûa Trichoderma. Toác ñoä moïc nhanh cuûa Trichoderma ôû noàng ñoä CO2 cao trong moâi tröôøng kieàm, coù theå giaûi thích taïi sao Trichoderma thöôøng soáng trong moâi tröôøng ñaát pheøn, aåm öôùt, ít hieän dieän treân ñaát kieàm. Vì theá CO2 coù aûnh höôûng ñeán sinh tröôûng cuûa Trichoderma taïi ñoä pH coù giaù trò cao. Hình 2.6 : baøo töû cuûa Trichoderma reesei - Söï hình thaønh baøo töû treân moâi tröôøng: Phaàn lôùn caùc loaøi Trichoderma coù caûm quang, deã naûy maàm ôû nhieàu ñieàu kieän moâi tröôøng töï nhieân vaø nhaân taïo döôùi ñieàu kieän toái saùng laãn loän, hay baøo töû coù theå xuaát hieän trong ñieàu kieän saùng. Moâi tröôøng agar trong khoaûng 20-30 giaây aùnh saùng 85 Lux laøm taêng hieäu quaû naûy maàm. Theå baøo töû phialoconidio caûm öùng vôùi aùnh saùng nhaát seõ xuaát hieän nhieàu döôùi aùnh saùng ban ngaøy chæ trong khoaûng 3 phuùt hoaëc gaàn tia cöïc tím (böôùc soùng 366nm) trong khoaûng 10 – 30 giaây. Caùc taùc giaû ñaõ coâng boá Trichoderma khoâng hình thaønh baøo töû ôû böôùc soùng döôùi 254nm hoaëc treân 1.100nm vaø hình thaønh baøo töû nhieàu nhaát ôû böôùc soùng 380nm ñeán 440nm. Caùc baøo töû caûm quang haïn cheá phaùt trieån döôùi aûnh höôûng cuûa caùc hoùa chaát. Caùc hoãn hôïp nhö azaguanine, 5-fluorouracil, actiomycin D, Cycloheximide, phenethyl alcohol vaø ethidium bromide ngaên caûn söï hình thaønh caùc haäu moâ baøo töû, ñaây laø 1 caáu truùc ñaëc bieät cuûa cô theå raát quan troïng trong hình thaùi hoïc, laøm taêng tieàm naêng trong phoøng tröø sinh hoïc. T. hamatum, T.hazianum, T.viride vaø T. virens ôû trong caû moâi tröôøng loûng vaø raén coù acide thích hôïp cho baøo töû naûy maàm hôn laø moâi tröôøng trung tính. 2.3.2.2 Sinh thaùi hoïc cuûa Trichoderma Sinh thaùi hoïc cho bieát söï phaân boá cuûa Trichoderma trong ñieàu kieän cô hoïc cuûa baøo töû naám Trichoderma trong ñaát. - Ñaát khaùng naám: Ñaát töï nhieân coù khaû naêng khaùng naám vaø khaû naêng naøy seõ maát daàn. Ñieàu naøy coù lieân quan ñeán söï xuaát hieän vaø maät ñoä phaân boá cô hoïc cuûa Trichoderma. Baøo töû phaân sinh cuûa Trichoderma coù khaû naêng khaùng naám cao vaø lieân quan ñeán hieän töôïng giaûm khaû naêng khaùng naám trong ñaát. Ñoä nhaïy cuûa ñaát khaùng naám ñöôïc coâng boá treân ñaát trung tính, ñaát kieàm chua vaø ñaát acide. Caùc baøo töû phaân sinh khaùng naám nhieàu hôn haäu moâ baøo töû, sôïi naám ít khaùng naám hôn baøo töû phaân sinh. Hình 2.7 : naám Trichoderma viridae - Thieát laäp quaàn theå vaø hieän töôïng naûy maàm trong ñaát: Vi sinh vaät trong ñaát khoâng vaø hoaït ñoäng phuï thuoäc vaøo nhieàu loaïi chaát neàn trong ñaát, coù nhieàu phöông phaùp xaùc ñònh khaùc nhau. Trong nhieàu tröôøng hôïp cho thaáy vaán ñeà naøy khoâng thích hôïp vôùi Trichoderma vaø taêng leân nhieàu trong nhieàu loaïi ñaát khaùc nhau. Khi caáy sôïi naám non (chöa coù baøo töû) vaøo ñaát ñeàu lieân quan maät thieát vôùi tình traïng thaønh phaàn moâi tröôøng ñaát. Baøo töû sinh soâi naûy nôû (maät ñoä 100) vaø thieát laäp quaàn theå caân baèng trong ñaát (maät ñoä duy trì caân baèng trong ñaát töø 9 – 36 tuaàn sau khi caáy naám vaøo ñaát). Ñieàu naøy phuï thuoäc vaøo tuoåi naám vaø nhö vaäy coù lieân quan ñeán thaønh phaàn thöùc aên, vaø vieäc hình thaønh quaàn theå sôïi naám Trichoderma töø thaønh phaàn nuoâi troàng khoâng lieân quan ñeán loaïi ñaát. Vieân Alginate chöùa baøo töû phaân sinh ñöôïc saûn xuaát baèng phöông phaùp leân men taïo quaàn theå baøo töû ít hôn so vôùi phöông phaùp nhaân sinh khoái baèng ñaát (chuû yeáu laø haäu moâ baøo töû). Theâm vaøo ñoù, vieäc leân men ñaát ñöôïc theâm vaøo ñaát chaát Pyrax khoâ giuùp laøm taêng quaàn theå töø 5.103 leân 6-7.106 baøo töû / gram ñaát. Hình 2.8 : naám Trichoderma reesei - Thieát laäp quaàn theå taïi vuøng reã caây: Trichoderma ñaõ ñöôïc phaân laäp töø reã caây vaø coù kha naêng duøng vaøo vieäc phoøng tröø sinh hoïc taïi vuøng reã caây bò beänh. Hieäu quaû cuûa Trichoderma khoâng chæ xöû lyù haït maø coøn tieáp tuïc thieát laäp quaàn theå döôùi vuøng reã caây sau khi xöû lyù haït. Trichoderma xöû lyù haït phaùt trieån nhanh xung quanh heä reã taïo caùc baøo töû ngaên caûn beänh xaâm nhieãm caây troàng. Neáu Trichoderma ñöôïc caáy vaøo ñaát vôùi taùc duïng choáng beänh cho caây baét buoäc phaûi caáy doïc theo beà maët reã nhöng caùch xa laù maàm. Trichoderma coù khaû naêng dieät tröø beänh thoái reã, haït vaø beänh cheát caây con. Nhöõng nghieân cöùu gaàn ñaây cho thaáy T.hazzianum khoâng thieát laäp quaàn theå xung quanh heä reã caây hoï ñaäu vaø caây ñaäu Hoøa Lan con. Quan saùt baøo töû treân vuøng reã caây goàm reã, voû, haït bò thoái vaø laù maàm, soá löôïng baøo töû treân moãi gram ñaát xung quanh heä reã luoân luoân ít. W.L.Chao, G.E. Harma vaø E.B.Nelson treân soá lieäu khoâng coâng boá, cho raèng baøo töû cuûa Trichoderma ít thieát laäp quaàn theå hay ít di chuyeån vaøo vuøng reã caây. Vôùi T. hazzianum vaøi baøo töû ñöôïc tìm thaáy caùch xung quanh heä reã caây 10 cm, treân caây ñöôïc xöû lyù haït. Ngöôïc laïi, soá löôïng baøo töû tìm thaáy nhieàu treân laø maàm ñaäu Høoøa Lan bò thoái vaø voû haït gioáng keå caû maãu beänh xung quanh reã.Coù nhieàu giaûi thích veà vieäc soá löôïng baøo töû Trichoderma taêng hoaëc giaûm trong ñaát vaø Trichoderma khoâng coù khaû naêng thieát laäp quaàn theå ôû vuøng reã caây, do coù nhieàu lyù do bao goàm: thieáu dinh döôõng, hieän dieän chaát ñoäc trong reã caây hay hieän dieän cuûa chaát khaùng hoaëc söï hieän dieän cuûa vi sinh vaät ñoái laäp vôùi Trichoderma (W.L. Chao, G.E. Hazman, E.B. Nelson treân soá lieäu khoâng coâng boá) taïi vuøng reã hay möùc ñoä reã cuûa caây. Ví duï: Pseudomonas ñoái laäp vôùi taùc nhaân phoøng tröø sinh hoïc nhöng khi coù hieän dieän cuûa chaát saét trong vuøng reã cuûa caây hay Pseudomonas saûn xuaát chaát ñoäc chuyeån ñoåi gaây aûnh höôûng ñeán baøo töû cuûa Trichoderma. 2.3.3 Cô cheá hoaït ñoäng cuûa naám Trichoderma spp. Hình 2.9 : söï öùc cheá cuûa Trichoderma ñoái vôùi naám beänh caây Pythium treân beà maët haït ñaäu. Caùc chuûng Trichoderma ñöôïc nhuoäm maøu vôùi thuoác nhuoäm huyønh quang maøu da cam trong khi Pythium ñöôïc nhuoäm maøu xanh laù caây Naám ñoái khaùng laø nhöõng thaønh vieân phoå bieán cuûa heä vi sinh vaät ñaát (Pomsch vaø coäng taùc vieân 1920). Chuùng thöôøng tieát ra caùc men, khaùng sinh gaây ñoäc cho naám gaây beänh hoaëc naám khaùng caïnh tranh ñieàu kieän soáng vôùi naám gaây beänh. Söï phaân bieät cuûa chuùng phuï thuoäc vaøo vuøng ñòa lyù, loaïi ñaát, ñieàu kieän khí haäu, vaø thaûm thöïc vaät ôû töøng khu vöïc. Naám ñoái khaùng coù theå kìm haõm söï sinh tröôûng, phaùt trieån cuûa naám gaây beänh, giuùp caây hoài phuïc, sinh tröôûng vaø phaùt trieån, moät soá loaøi naám ñoái khaùng ñaõ ñöôïc tìm thaáy: Penicillium axalicum. P. frequetans. P. Vermiculata, P. nigricans, P. chregsogetum laø ñoái khaùng cuûa naám pythium spp, phizoctotia solani, Sclerotium Cepivorum, Verticillium alboatrum (Martin vaø coäng taùc vieân 1995). Naám Aspergillus niger ñoái khaùng vôùi naám Fusaium sokeni, Rhizoctonia solani, Aeteraria alternata. Naám Aureobasidium, pollulans vaø Kikuchii laø ñoái khaùng cuûa naám Diaporthe phaseolorum var. sojage (Egurazdova et at, 1979). Ñoái vôùi naám Trichoderma, cuõng laø moät trong nhöõng gioáng naám coù khaû naêng öùc cheá moät soá naám gaây beänh khaùc nhö: Sclerotium rolfsii, phytopthora, Fusarium Pythium, Rhizoctonia gaây beänh treân nhieàu loaøi caây troàng: Caây hoï ñaäu, caây aên traùi, hoøa thaûo, caây coâng nghieäp vaø caây hoa kieång. 2.3.3.1 hieän töôïng giao thoa Hình 2.10 : naám ñoái khaùng trichoderma harzianum quaán quanh naám beänh Rhizoctonia solani Söï ñoái khaùng cuûa naám Trichoderma thoâng qua nhieàu cô cheá. Vaøo naêm 1932 Weinding ñaõ moâ taû hieän töôïng naám Trichoderma kyù sinh naám gaây beänh vaø ñaët teân cho hieän töôïng ñoù laø” Giao thoa sôïi naám” (Cnyder, 1976). Hieän töôïng giao thoa goàm ba giai ñoaïn nhö sau: (1) Sôïi naám Trichoderma vaây quanh sôïi naám gaây beänh. (2) Sau söï vaây quanh, sôïi naám Trichoderma thaét chaët laáy caùc sôïi naám gaây beänh caây. (3) Cuoái cuøng laø sôïi naám Trichoderma ñaâm xuyeân laøm thuûng lôùp teá baøo cuûa naám gaây beänh, laøm cho chaát nguyeân sinh trong naám gaây beänh bò phaân huûy vaø daãn ñeán naám beänh bò cheát. Hình 2.11 : hình aûnh cuûa Rhizoctonia solani döôùi kính hieån vi sau khi Trichoderma mycoparasitic ñöôïc gôõ boû. Enxyme do Trichoderma mycoparasitic tieát ra laøm thuûng teá baøo naám beänh caây Sau naøy quan saùt döôùi kính hieån vi, hieän töôïng kyù sinh cuûa naám Trichoderma ñöôïc moâ taû nhö sau: Taïi nhöõng ñieåm naám Trichoderma tieáp xuùc vôùi naám gaây beänh ñaõ laøm cho naám gaây beänh teo laïi vaø cheát (Dubey, 1995; Rousscu vaø coäng taùc vieân, 1996). Ngöôïc laïi ôû nhöõng ñieåm khoâng coù söï tieáp xuùc cuûa naám Trichoderma vôùi naám gaây beänh vaãn cheát thì caùc nhaø nghieân cöùu cho laø taùc ñoäng cuûa chaát khaùng sinh töø naám Trichoderma sinh ra gaây ñoäc cho naám gaây beänh (Agrowcal vaø coäng taùc vieân, 1979; Michrina vaø coäng taùc vieân 1996). 2.3.3.2 HOAÏT ÑOÄNG tieát enzyme 1. Heä enzyme thuûy phaân chitin Chitin laø 1 trong nhöõng polymer phong phuù nhaát trong sinh hoïc, enzyme phaân giaûi chitin ñöôïc tìm thaáy ôû taát caû moïi giôùi : nguyeân sinh, vi khuaån ,naám, thöïc vaät, ñoäng vaät coù xöông soáng vaø khoâng xöông soáng keå caû con ngöôøi. Söï thuûy phaân chitin baèng enzyme coù lieân quan ñeán raát nhieàu quaù trình sinh hoïc nhö : söï töï phaân giaûi, söï taïo hình, dinh döôõng. Theâm vaøo ñoù, söï vi kyù sinh ñoùng vai troø quan troïng trong moái quan heä giöõa naám vaø caùc sinh vaät khaùc. Chitinase xuùc taùc söï phaân caét giöõa noái C1 vaø C4 cuûa 2 ñôn vò N-acetyl-ß-D-glucosamin (GlcNAc) lieàn nhau. Chuùng ñöôïc chia ra laøm 3 nhoùm : 1,4-ß-N-acetylglucosaminidase, coù theå caét chitin ôû daïng exo thaønh nhöõng ñôn phaân GlcNAc, endochitinase, thöôøng caét ôû nhöõng vò trí beân trong doïc theo sôïi chitin vaø exochitinase hay citobiosidase ( Sahai vaø Manocha, 1993). Theo Harman vaø caùc coäng söï (1993) thì exochitinase hay chitobiosidase chæ cho ra caùc ñôn vò diacetylchitobiose theo con ñöôøng khoâng taïo caùc phaân töû saccharide ñôn hay ña. Ngöôøi ta ñaõ tinh cheá ñöôïc raát nhieàu enzyme chitinase, trong ñoù phoå bieán nhaát laø endochitinase coù kích thöôùc laø 42 kDa, sau ñoù laø N-acetyl-ß-D-glucosaminidase coù kích thöôùc 70-73 kDa. Ngoaøi ra coøn coù endochitinase37 kDa vaø 33 kDa (Cruz vaø coäng söï, 1992), chitobiosidase 40 kDa ( enzyme naøy coù theà hoaït ñoäng 1 mình hay keát hôïp vôùi enzyme endochitinase 42 kDa ) (Harman vaø caùc coäng söï 1993), enxochitinase 28 kDa ( Deane vaø coäng söï, 1998) vaø N-acetyl-ß-D-glucosaminidase 102 kDa coù vai tor2 duy nhaát trong vieäc gaây ra söï bieàu hieän cuûa caùc enzyme thuûy phaân chitin khaùc nhöng chöa tinh cheá ñöôïc (Haran vaø coäng söï, 1995). Hoaït ñoäng khaùng naám cuûa chitinase ñöôïc taêng cöôøng bôûi söï trôï löïc cuûa khaùng sinh. Enzyme chitinase cuûa Trichoderma ñöôïc xem laø enzyme coù hoaït tính khaùng khuaån maïnh nhaát. Hoaït ñoäng cuûa chitinase phoái hôïp maïnh meõ nôùi caùc enzyme chitinase vaø caùc hôïp chaát coù lieân quan ñeán vieäc kieåm soaùt sinh hoïc nhö khaùng sinh. Söï phoái hôïp vôùi caùc enzyme phaân giaûi chitin vaø glucan khaùc ñaõ daãn ñeán söï taêng cöôøng lyø laï cuûa hoaït ñoäng thuûy phaân vaø öùc cheá ngay caû trong caùc tröôøng hôïp caùc enzyme naøy coù hoaït tính thaáp hay khoâng coù hoaït tính khi chuùng ñöôïc söû duïng rieâng leû (de la Cruz et al., 1992; Lorito et al.,1993; 1994 a,b, 1996 c). tuy nhieân quan troïng hôn nöõa laø khaû naêng chitinase laøm taêng hieäu quaû khaùng naám cuûa caùc hôïp chaát khoâng coù baûn chaát enzyme hay caùc vi sinh vaät khaùc Lorito et al.,1993;1994 b).Chaúng haïn, Lorito vaø caùc coäng söï ñaõ cho thaáy söï phoái hôïp hoaït ñoäng giöõa caùc enzyme thuûy phaân chitin vôùi caùc hôïp chaát töï nhieân cuõng nhö toång hôïp coù aûnh höôûng leân maøng teá baøo. 2. Heä enzyme thuûy phaân cellulose Cellulose laø chaát truøng hôïp cuûa ß-1,4-glucan ñöôïc söû duïng nhö 1 nguoàn naêng löôïng bôûi raát nhieàu vi sinh vaät tieát ra cellulase. Heä enzyme thuûy phaân cellulose cuûa Trichoderma bao goàm 3 lôùp enzyme : enzyme thuûy giaûi 1,4 –ß-D-glucan, caét caùc sôïi cellulose thaønh caùc ñôn vò cellobiose; endo-1,4-D-glucanase,caét caùc noái glucoside vaø 1,4-ß-D-glucosidase phaân caét caùc cello-oligosaccharide ñeå taïo glucose. T.reesei RUT C30 ñöôïc bieát laø chuûng coù khaû naêng taïo cellulase maïnh nhaát vaø heä enzyme cellulase cuûa noù cuõng maïnh nhaát. Coù söï phoái hôïp cuûa ít nhaát laø 2 enzyme cellobiohydrolase, 2 enzyme endoglucanase vaø 1 enzyme ß-glucosidase trong quaù trình thuûy phaân cellulose ( Hui et at. 2001 ). T.harzianum T3 cuõng laù 1 chuûng raát hieäu quaû khi söû duïng ñeå kieåm soaùt ñoái vôùi Pithium sp., chuûng naøy ñöôïc bieát cuõng taïo ra raát nhieàu loaïi enzyme cellulase. Beân caïnh söï taùc ñoäng qua laïi trong quaàn theå giöõa naám ñoái khaùng vaø naám beänh, naám Trichoderma spp. coøn coù taùc ñoäng tröïc tieáp leän söï phaùt trieån cuûa caây troàng, do trong hoaït ñoäng soáng, naám naøy saûn sinh ra caùc men phaân huûy glucose, cellulose. Nhôø caùc men naøy maø caùc chaát höõu cô coù trong ñaát ñöôïc phaân huûy nhanh hôn, laøm taêng chaát dinh döôõng döôùi daïng deã haáp thuï cho caây troàng, taïo ñieàu kieän cho caây troàng sinh tröôûng vaø phaùt trieån toát. 3. Caùc hôïp chaát khaùng naám töø Trichoderma spp. Theo Dennis vaø Webster, T.viride vaø T.polysporum coù khaû naêng tieát ñoäc toá trichodermin, T.hamatum taïo ra caùc polypeptide coù baûn chaát khaùng sinh. Okuda cho raèng nhieàu loaøi Trichoderma tieát isonitrite coù baûn chaát khaùng sinh. Trichozianine laø khaùng sinh peptaibol coù hoaït tính khaùng naám ñöôïc phaùt hieän nhieàu ôû loaøi T. harzianum. Trichozianine B (TB) laø khaùng sinh coù baûn chaát acid, trichozianine A (TA) laø khaùng sinh trung hoøa. Rebuffat S vaø Hajji M ñaõ taùch chieát vaø xaùc ñònh ñöôïc trình töï acid amin cuûa 7 loaïi TB chính, Hennig P, Davoust D, Bodo B cuõng taùch chieát ñöôïc 9 loaïi TA. Trichozianine keát hôïp vôùi nhöõng enzyme thuûy phaân vaùch trong quaù trình öùc cheá söï naûy maàm vaø keùo daøi tô naám trong quaù trình kyù sinh naám. Trichothecene töø T.harzianum coù hoaït tính khaùng naám thaáp nhaát.Trichotoxin A laø khaùng sinh thuoäc nhoùm peptaibol ñöôïc taùch chieát töø T.viride Viridin laø 1 protein khaùng naám coù kích thöôùc 65 kDa ñöôïc taùch chieát töø T.viride Ergokonin A laø 1 chaát coù hoaït tính khaùng naám coù khaû naêng öùc cheá söï sinh toång hôïp glucan ñöôïc taùch chieát töø T. longibrachiatum 1 loaïi trichothecene môùi ñöôïc taùch chieát töø T.harzianum laø harzianum A coù khaû naêng khaùng naám ôû noàng ñoä 100µg/ml. Harzianin HA V saturnisporin SA IV laø 2 peptide thuoäc nhoùm peptaibol chöùa - aminoisobutyric coù khaû naêng bieán ñoåi tính chaát maøng ñöôïc tach chieát töø nhieàu loaøi Trichoderma.Tricholin laø protein baát hoaït ribosome do T.viride tieát ra chuùng laøm giaûm söï hình thaønh chuoãi polysome. ( thanh Tuyeàn ) 2.3.4 ÑIEÀU KIEÄN NUOÂI CAÁY NAÁM TRICHODERMA SPP. 2.3.4.1 Nhieät ñoä Trichoderma spp. phaùt trieån ôû vuøng nhieät ñoä khaù roäng 15-350C 15-200C : Trichoderma spp. phaùt trieån chaäm , hình thaùi ít baøo töû, thôøi gian hình thaønh baøo töû chaäm. 25-300C : Trichoderma spp. sinh tröôûng phaùt trieån nhanh hôn, löôïng baøo töû nhieàu, thôøi gian taïo baøo töû sôùm. 350C : phaùt trieån yeáu, khaû naêng sinh baøo töû yeáu. 2.3.4.2 Aùnh saùng Chieáu saùng lieân tuïc : phaùt trieån hanh, maät ñoä thöa, baøo töû ít. Toái lieân tuïc : sôïi naám phaùt trieån chaäm, maät ñoä thöa, sôïi naám chöa hình thaønh xong sau ñoù hình thaønh theo töøng ñôït raát roõ. Saùng toái xem keõ : sôïi naám hình thaønh nhieàu ( chæ sau 2 ngaøy ), maät ñoä daøy, xuaát hieän nhieàu baøo töû. ( Höõu Phöôùc ) 2.3.5 CAÙC DAÏNG THUOÁC CUÛA CHEÁ PHAÅM TRICHODERMA SPP. TRÖØ NAÁM BEÄNH vôùi söï ra ñôøi cuûa thuoác tröø saâu sinh hoïc, vieäc oâ nhieãm vaø thay ñoåi moâi tröôøng ñaõ ñöôïc caûi thieän. Caùc cheá phaåm sinh hoïc coù ñoä ñoäc cao ñoái vôùi caùc loaïi gaây haïi cho caây troàng vaø an toaøn ñoái vôi nhöõng loaøi khaùc keå caû con ngöôøi, hieäu quaû söû duïng cao neân ñöôïc öùng duïng raát nhieàu trong noâng nghieäp. Trong ñoù cheá phaåm sinh hoïc Trichoderma spp. ñöôïc chuù yù nhieàu nhaát vì hieäu quaû cao vaø nhieàu coâng duïng ñaõ trôû thaønh ñoái töôïng nhieân cöùu vaø saûn xuaát cuûa nhieàu nôi nhö tröôøng ñaïi hoïc, vieän nghieân cöùu, trung taâm khoa hoïc, coâng ty …. Ñeå ñaùp öùng yeâu caàu böùc thieát cuûa nhaø noâng vaø ngöôøi troàng. caùc nôi saûn xuaát cheá phaåm Trichoderma spp. ñöôïc trình baøy ôû baûng 2.4. Baûng 2.4 : caùc nôi saûn xuaát cheá phaåm Trichoderma spp. tröø naám beänh haïi caây troàng. Nôi saûn xuaát Teân saûn phaåm Daïng thuoác Thaønh phaàn Coâng duïng Coâng ty TNHH coâng ngheä Noâng Laâm Nolatri Daïng boät baøo töû Trichoderma spp. Taùc duïng chính : tieâu dieät vaø khoáng cheá caùc loaïi naám beänh haïi caây troàng. Taùc duïng phuï : taïo ñieàu kieän toát cho vi sinh vaät coá ñònh ñaïm phaùt trieån trong ñaát, kích thích söï taêng tröôûng vaø phuïc hoài boä reã, ñoàng thôøi coù khaû naêng phaân giaûi caùc chaát trong caùc pheá thaûi höõu cô thaønh caùc ñôn chaát dinh döôõng… Nolatri w daïng boät baøo töû Trichoderma spp. Taùc duïng chính : coù khaû naêng tieâu dieät vaø khoáng cheá caùc loaïi naám gaây beänh haïi caây troàng Taùc duïng phuï : taïo ñieàu kieän toát cho vi sinh vaät coá ñònh ñaïm phaùt trieån trong ñaát, kích thích söï taêng tröôûng vaø phuïc hoài boä reã, ñoàng thôøi coù khaû naêng phaân giaûi caùc chaát trong caùc pheá thaûi höõu cô thaønh caùc ñôn chaát dinh döôõng, taïo ñieàu kieän cho caây troàng haáp thu deã daøng, ñaát tôi xoáp hôn, taêng haøm löôïng chaát muøn vaø maät ñoä coân truøng coù ích, giöõ ñöôïc ñoä phì cuûa ñaát… Nolaba Daïng nöôùc vi khuaån phaân giaûi laân, coá ñònh nitô, phaân giaûi cellulose taïo ñieàu kieän toát cho vi sinh vaät coù ích phaùt trieån trong ñaát, kích thích söï taêng tröôûng vaø phuïc hoài boä reã, ñoàng thôøi coù khaê naêng phaân giaûi caùc chaát xô, chitin, hemicellulose, phosphor voâ cô, höõu cô trong ñaát, phaân höõu cô thaønh caùc ñôn chaát dinh döôõng taïo ñieàu kieän cho caây troàng haáp thu deã daøng…. Nolasub Daïng nöôùc vi khuaån Bacillus sp. Vi naám Trichoderma spp., xaï khuaån Streptomyces spp. uû phaân gia suùc, gia caàm, xaùc baõ thöïc vaät raùc thaûi höõu cô coù taùc duïng laøm maát muøi hoâi nhanh sau 10 ngaøy, laøm phaân gia suùc, gia caàm, xaùc baõ thöïc vaät mau hoai muïc sau 1 thaùng, Cheá phaåm taïo ñieàu kieän toát cho vi sinh vaät coù ích phaùt trieån trong ñaát, kích thích söï taêng tröôûng vaø phuïc hoài boä reã, ñoàng thôøi coù khaê naêng phaân giaû caùc chaát xô, chitin, hemicellulose, phosphor voâ cô, höõu cô trong ñaát, phaân höõu cô thaønh caùc ñôn chaát dinh döôõng taïo ñieàu kieän cho caây troàng haáp thu deã daøng. Trung Taâm Coâng Ngheä Sinh Hoïc TP.HCM ( 176, hai baø Tröng, Q.1, tp.HCM ) BIMA Daïng nöôùc Caùc chuûng naám Trichoderma spp. 5.106 baøo töû/g Höõu cô 50%, ñoä aåm 30% Taùc duïng chính : tieâu dieät, khoáng cheá vaø ngaên ngöøa caùc loaïi naám gaây beänh haïi caây troàâng Taùc duïng phuï :taïo ñieàu kieän toát cho vi sinh vaät coá ñònh ñaïm phaùt trieån soáng trong ñaát troàng. Kích thích taêng tröôûng vaø phuïc hoài boä reã caây troàng. Phaân giaûi chaát xô, chitin, lignin, pectin… trong pheá thaûi höõu cô thaønh caùc ñôn chaát dinh döôõng giuùp caây haáp thu deã daøng, ñaát xoáp hôn, nhieàu muøn, taêng coân truøng coù ích, giöõ ñoä phì cuûa ñaát. Vieän nghieân cöùu Coâng Ngheä Sinh Hoïc vaø Moâi Tröôøng-ÑH Noâng Laâm TP.HCM (tröôøng ÑH Noâng Laâm TP.HCM, KP6,P.Linh Trung, Q. Thuû Ñöùc, tp.HCM) TRI-CAB Daïng boät trichoderma spp., caùc enzyme thuûy phaân nhö cellulase, chitinase, xylanase, hemicellulase, Taùc duïng chính :tieâu dieät, khoáng cheá vaø ngaên ngöøa caùc loaïi naám beänh haïi caây troàâng Taùc duïng phuï : taïo ñieàu kieän toát cho vi sinh vaät coá ñònh ñaïm phaùt trieån soáng trong ñaát troàng. Kích thích taêng tröôûng vaø phuïc hoài boä reã caây troàng. Phaân giaûi chaát xô, chitin, lignin, pectin… trong pheá thaûi höõu cô thaønh caùc ñôn chaát dinh döôõng giuùp caây haáp thu deã daøng. Keát hôïp vôùi phaân höõu cô ñeå caûi taïo ñaát xoáp hôn, nhieàu muøn, taêng coân truøng coù ích, giöõ ñoä phì cuûa ñaát. Coâng ty TNHH Tam Noâng (D7 Khu DC Hoøa An, Bieân Hoøa, Ñoàng Nai ) Tam noâng Trichoderma Daïng boät Xaï khuaån MB, M31, Trichoderma konigii. Caùc chuûng naám Trichoderma spp. Taùc duïng chính :Ñoái khaùng naám khuaån soáng trong vuøng reã, gaây beänh haïi caây. Taùc duïng phuï : Phaân giaûi chaát höõu cô thaønh chaát muøn. Coâng ty TNHH ñieàn trang ( 41 ñöôøng soá 1-kp1-p.Caùt Laùi-Q.2-TP.HCM ) Cheá phaåm vi sinh Trichode rma Daïng boät Caùc chuûng naám Trichoderma spp. Taêng cöôøng heä vi sinh vaät coù ích cho ñaát.Phuïc hoài vaø baûo veä boä reã caây troàng. Phaân giaûi nhanh caùc chaát höõu cô, cung caáp dinh döôõng cho caây. Taêng söùc ñeà khaùng cho caây troàng choáng laïi caùc vi sinh vaät haïi. CHÖÔNG III THÖÏC NGHIEÄM 3.1. Muïc ñích Khaûo saùt hoaït tính ñoái khaùng cuûa trichoderma spp. gioáng goác Saûn xuaát baøo töû baèng phöông phaùp leân men theå raén Khaûo saùt hoaït tính ñoái khaùng cuûa baûo töû Trichoderma saûn xuaát baèng phöông phaùp leân men theå raén 3.2 vaät lieäu vaø phöông phaùp 3.2.1 vaät lieäu 3.2.1.1 Caùc chuûng vi sinh vaät duøng trong nghieân cöùu 3.2.1.1.1 Caùc chuûng naám moác Trichoderma @ Trichoderma harzianum @ Trichoderma reesei 3.2.1.1.2 Caùc chuûng naám beänh caây @ Fusarium spp. @ Phytophthora sp. Caùc chuûng naám do vieän sinh hoïc nhieät ñôùi cung caáp 3.2.1.2 Duïng cuï vaø thieát bò 3.2.1.2.1 Duïng cuï Caùc duïng cuï thuûy tinh thöôøng söû duïng trong phaân tích cuûa phoøng thí nghieäm 3.2.1.2.2 Thieát bò Noài haáp Tommy-SS-325-, Nhaät Baûn Tuû saáy Binder, Ñöùc Tuû caáy Telstar AV30/70 Tuû aám 3.2.1.3 Moâi tröôøng nuoâi caáy 3.2.1.3.1 Moâi tröôøng nuoâi caáy naám beänh, Trichoderma vaø khaûo saùt khaû naêng ñoái khaùng giöõa naám Trichoderma vôùi naám gaây beänh : moâi tröôøng PGA ( Potatoes Giucose Agar ) a. Thaønh phaàn moâi tröôøng Khoai taây 200g Glucose 20g Agar 20g Nöôùc caát 1000ml b. Caùch tieán haønh Khoai taây goït voû, caét nhoû, naáu chín. Chieát dòch khoai taây vaø loïc boû tinh boät. Sau ñoù cho glucose vaøo dòch khoai taây töø töø vaø khuaáy lieân tuïc treân beáp cho mau tan, sau ñoù cho agar vaøo vaø tieáp tuïc khuaáy. Khöû truøng ôû 1210C trong 15 phuùt. 3.2.1.3.2 Moâi tröôøng khaûo saùt khaû naêng ñoái khaùng giöõa cheá phaåm Trichoderma vaø naám beänh a. Thaønh phaàn moâi tröôøng Giaù ñoã 200g Saccharose 30g Pepton 2g MgSO4 0.5g KH2PO4 1g Nöôùc caát 1000ml Agar 20g pH 5-5.5 b. Caùch tieán haønh Giaù ñoã röûa saïch, naáu trong nöôùc caát 30 phuùt, loïc laát nöôùc. Cho saccharose vaø caùc thaønh phaàn khaùc vaøo vaø khuaáy ñeàu treân beáp cho tan heát. Tieáp tuïc cho agar vaøo khuaáy ñeàu. Ñem khöû truøng ôû 1210C trong 15 phuùt. 3.2.1.3.3 Khoaùng Crapek NaNO3 3.5g K2HPO4 1.5g MgSO4.7H20 0.5g FeSO4 0.01g Saccharose 30g KCI 0.5g Nöôùc caát 1000 ml 3.2.1.3.4 Moâi tröôøng leân men xoáp (thaønh phaàn cho 1 bình moâi tröôøng leân men xoáp ) caùm gaïo 10g traáu 5g caùm mì 5g khoaùng Crapek 10ml ñoä aåm 55% haáp khöû truøng ôû 1210C trong 15 phuùt 3.2.1.3.5 moâi tröôøng nhaân gioáng a.thaønh phaàn moâi tröôøng Thoùc 20g Khoaùng crapek 20ml Ñoä aåm 55% haáp khöû truøng ôû 1210C trong 15 phuùt b.caùch tieán haønh Cho thoùc vaøo bình tam giaùc 250 ml, theâm khoaùng crapek vaøo vaø ñem haáp khöû truøng ôû 1210C trong 15 phuùt. Sau ñoù caáy Trichoderma vaøo vaø nuoâi ôû nhieät ñoä 30-320C trong 5-7 ngaøy. 3.2.2 Phương pháp 3.2.2.1 khaûo saùt khaû naêng ñoái khaùng cuûa naám trichoderma spp. gioáng goác vôùi naám beänh a. Nguyeân taéc Taùc ñoäng ñoái khaùng cuûa Trichoderma spp. vôùi taùc nhaân gaây beänh nhôø cô cheá caïnh tranh dinh döôõng, cô cheá kyù sinh hay taïo chaát khaùng sinh do chuùng tieát ra trong quaù trình sinh tröôûng vaø phaùt trieån. b. Caùch tieán haønh chuaån bò moâi tröôøng PGA ñaõ haáp khöû truøng roài ñoà vaøo caùc ñóa petri voâ truøng coù kích thöôùc baèng nhau. Caáy ñieåm naám Trichoderma spp. leân thaïch ñóa petri, sau ñoù caùch khoaûng 3 cm caáy ñieåm naám beänh leân ñóa vöøa caáy Trichoderma spp. Uû ôû nhieät ñoä phoøng trong 8 ngaøy, quan saùt ghi nhaän söï phaùt trieån veà kích thöôùc ( ñöôøng kính khuaån laïc, thôøi gian tieáp xuùc, öùc cheá). Moãi thí nghieäm laëp laïi 3 laàn, vaø soá lieäu keát quaû cuoái cuøng laø trung bình coäng cuûa 3 laàn, theo coâng thöùc : KT = ( a+b+c)/3 Trong ñoù : KT kích thöôùc ñöôøng kính khuaån laïc trung bình. a,b,c : ñöôøng kính khuaån laïc cuûa 3 laàn thí nghieäm 3 cm sô ñoà 3.1 : thöïc hieän tieán haønh ñoái khaùng tröïc tieáp c. Boá trí thí nghieäm ÑOÁI CHÖÙNG ÑOÁI KHAÙNG Fusarium spp. T. harzianum – Fusarium spp. Phytophthora sp. T. harzianum – Phytophthora sp. T. ressei – Fusarium spp. T. ressei – Phytophthora sp. 3.2.2.2 phöông phaùp leân men xoáp a. sô ñoà quy trình coâng ngheä oáng gioáng â Moâi tröôøng nhaân gioáng ( trong bình tam giaùc ) â Moâi tröôøng leân men ( coù boå sung moâi tröôøng xoáp, nuoâi 5-8 ngaøy, nhieät ñoä 29-32 0C ) â Saáy khoâ ( ôû 50-600C ) â Xay mòn, raây â Cheá phaåm trichoderma spp. daïng boät Thuyeát minh : Caùc chuûng cuûa gioáng naám Trichoderma spp. töø oáng gioáng ñöôïc caáy vaøo caùc bình coù moâi tröôøng nhaân gioáng ñaõ voâ truøng, sau ñoù ñem ñi nuoâi ôû nhieät ñoä 30-32 0C cho ñeán khi naám leân traéng ñeàu. Sau ñoù chuyeån gioáng töø caùc bình nhaân gioáng vaøo caùc bình leân men coù saün moâi tröôøng voâ truøng roài ñem nuoâi töø 5-8 ngaøy, ôû nhieät ñoä 30-32 0C cho ñeán khi baøo töû leân traéng ñeàu khaép bình. Roài ñem ñi phôi hay saáy khoâ, xay nhuyeãn vaø raây ñeå thu cheá phaåm vaø baûo quaûn. Tieán haønh khaûo saùt khaû naêng ñoái khaùng cuûa cheá phaåm Trichoderma spp. vôùi caùc chuûng naám gaây beänh caây troàng. Hình 3.1 : phöông phaùp leân men xoáp 3.2.2.3 khaûo saùt khaû naêng ñoái khaùng cuûa cheá phaåm Trichoderma spp. ñoái vôùi naám beänh caây troàng 1. nguyeân taéc Leân men xoáp thu nhaän cheá phaåm daïng baøo töû ñính coù khaû naêng choáng laïi caùc loaïi naám beänh haïi caây troàng. Sau ñoù thöû nghieäm khaû naêng choáng caùc loaïi naám beänh treân moâi tröôøng toát nhaát. 2. caùch tieán haønh Chuaån bò moâi tröôøng ñoái khaùng ( thaïch giaù ), haáp khöû truøng 1210C trong 15 phuùt, ñeå nguoäi 50-600C roài ñoå 20 ml moâi tröôøng treân vaøo moåi ñóa petri voâ truøng coù kích thöôùc baèng nhau. Caùc ñóa ñoái chöùng ñöôïc caáy 1 ñieåm ôõ giöõa ñóa petri vôùi chuûng naám beänh. Caùc ñóa thí nghieäm : naám beänh ñöôïc caáy 1 chaám ôû giöõa ñóa petri. Sau 1 ngaøy, laáy cheá phaåm Trichoderma spp. raéc ñeàu xung quanh naám beänh, caùch naám beänh khoaûng 0.5 cm. Caùc ñóa ñoái chöùng vaø thí nghieäm ñöôïc nuoâi ôû 300C. caùch 2 ngaøy laáy ra quan saùt vaø ño döôøng kính khuaån laïc naám beänh. Sô ñoà 3.2 : khaûo saùt söï öùc cheá cuûa cheá phaåm ñoái vôùi naám beänh 3.3. KEÁT QUAÛ VAØ BIEÄN LUAÄN 3.3.1. KHAÛO SAÙT KHAÛ NAÊNG ÑOÁI KHAÙNG CUÛA NAÁM TRICHODERMA SPP. VÔÙI NAÁM BEÄNH CAÂY TROÀNG Trichoderma dieät naám beänh baèng cô cheá caïnh tranh dinh döôõng, cô cheá kyù sinh cuûa noù treân naám beänh vaø khaû naêng tieát ra 1 soá chaát khaùng sinh öùc cheá söï sinh tröôûng vaø phaùt trieån cuûa naám beänh. Loaïi Trichoderma ñöôïc söû duïng trong phoøng thí nghieäm ñoái khaùng laø T.harzianum vaø T.reesei vôùi 2 ñoái töôïng naám beänh laø Fusarium spp. Vaø Phytophthora sp. 3.3.1.1 Khaû naêng ñoái khaùng cuûa naám T.harzianum Thí nghiệm ñoái khaùng thöïc trieáp cuûa T. harzianum vôùi naám beänh Fusarium được trình bày trong hình 5.1, 5.2. Hình 3.2 : söï öùc cheá cuûa chuûng T.harzianum ñoái vôùi naám Fusarium Ngaøy Ñoái chöùng Thí nghieäm 2 4 6 8 Hình 3.3 : söï öùc cheá cuûa chuûng T.harzianum ñoái vôùi naám Phytophthora Ngaøy Ñoái chöùng Thí nghieäm 2 4 6 8 Trong thí nghieäm treân naám beänh vaø Tricho derma harzianum ñöôïc caáy chung trong 1 ñóa petri. Neáu Trichoderma coù hoaït tính ñoái khaùng vôùi naám beänh thì söï phaùt trieån cuûa naám beänh seõ bò haïn cheá , theå hieän qua ñöôøng kính khuaån laïc naám beänh. Ñöôøng kính khuaån laïc naám beänh phaùt trieån trong thôøi gian caáy chung vôùi Trichoderma spp. ñöôïc trình baøy trong baûng 5.1 keát quaû cho thaáy T.harzianum coù khaû naêng ñoái khaùng Fusarium toát hôn, theå hieän qua ñöôøng kính khuaån laïc naám beänh Fusarium ñaõ nhoû daàn, khoâng taêng theâm. 3.3.1.2 Khaû naêng ñoái khaùng cuûa T.reesei Hình 3.4, 3.5 vaø baûng 3.1 trình baøy keát quaû thí nghieäm ñoái khaùng cuûa T.reesei vaø 2 naám beänh Fusarium vaø Phytophthora Hình 3.4 : söï öùc cheá cuûa chuûng T.reesei ñoái vôùi naám Phytophthora Ngaøy Ñoái chöùng Thí nghieäm 2 4 6 8 Hình 3.5 : söï öùc cheá cuûa chuûng T.reesei ñoái vôùi naám Fusarium Ngaøy Ñoái chöùng Thí nghieäm 2 4 6 8 Baûng 3.1 : ñöôøng kính khuaån laïc naám beänh khi coù Trichoderma spp. Naám Trichoderma Ngaøy nuoâi ñöôøng kính khuaån laïc naám beänh ( mm ) Fusarium Phytophthora Ñoái chöùng Thí nghieäm Ñoái chöùng Thí nghieäm T. harzianum 2 4 6 8 23 50 85 Moïc kín ñóa 12 Tieáp xuùc 14 Bò vaây kín, Kyù sinh 13 Bò vaây kín, Kyù sinh 13 Bò vaây kín, Kyù sinh 40 Moïc 2/3 ñóa Moïc Kín ñóa Moïc kín ñóa 40 Tieáp xuùc 60 Bò vaây kín Kyù sinh 55 Bò vaây kín, Kyù sinh 55 Bò vaây kín, Kyù sinh T. reesei 2 4 6 8 23 50 85 Moïc Kín ñóa 9 Tieáp xuùc 10 Bò vaây kín, Kyù sinh Bò vaây kín, Kyù sinh Bò vaây kín, Kyù sinh 40 Moïc 2/3 ñóa Moïc Kín ñóa Moïc Kín ñóa 40 Chöa t. xuùc 1/2 ñóa thaïch Bò kyù sinh Bò kyù sinh. Thöa daàn Bò kyù sinh. Thöa daàn Keát quaû cho thaáy so vôùi ñoái chöùng ( khoâng caáy Trichoderma spp.) ñöôøng kính khuaån laïc naám beänh treân ñóa thí nghieäm khoâng taêng, chöùng toû khaû naêng ñoái khaùng cuûa Trichoderma ñoái vôùi naám beänh ñaït hieäu quaû cao, naám beänh bò öùc cheá do khaû naêng tieát enzyme ( peptaibol, chitinase..) phaù huûy teá baøo naám beänh. a. NAÁM BEÄNH PHYTOPHTHORA sp. Ngaøy ñaàu tieân naám beänh Phytophthora chöa tieáp xuùc vôùi naám Trichoderma, ñeán ngaøy thöù 2 thì naám beänh ñaõ tieáp xuùc vôùi Trichoderma, tuøy theo caùc chuûng naám ñoái khaùng khaùc nhau maø naám beänh tieáp xuùc nhieàu hay ít, nhö vôùi T. reesei thì naám beänh tieáp xuùc ít hôn vaø chaäm hôn so vôùi T. harzianum. Naám Phytophthora phaùt trieån khaù nhanh, moïc ôû phaàn thaïch maø Trichoderma khoâng moïc. Sang ngaøy thöù 4 thì Phytophthora bò Trichoderma vaây kín vaø kyù sinh laøm naám beänh thu nhoû laïi, thöa daàn, tô naám luïi daàn, laø tröôøng hôïp khaûo saùt vôùi T. harzianum. Coøn vôùi T. reesei thì naám beänh ít bò öùc cheá hôn nhöng cuõng bò thu nhoû laïi, kyù sinh vaø thöa daàn, nhaát laø ôû phía coù söï hieän dieän cuûa Trichoderma. Nhöõng ngaøy tieáp theo thì Phytophthora bò kyù sinh nhieàu hôn vaø thöa hôn, daàn daàn bò tieâu dieät. B. NAÁM BEÄNH FUSARIUM SPP. Ngaøy ñaàu tieân naám beänh chöa tieáp xuùc vôùi naám Trichoderma, ñeán ngaøy thöù 2 thì Trichoderma ñaõ tieáp xuùc vôùi 1/2 naám beänh. T. harzianum phaùt trieån nhanh hôn T. reesei. Ngaøy thöù 4 naám beänh bò bao quanh vaø bò Trichoderma kyù sinh, moïc daàn leân treân. nhöõng ngaøy tieáp theo naám Fusarium bò naám Trichoderma öùc cheá neân nhoû daàn, thöa hôn, tô naám luïi daàn vaø bò kyù sinh nhieàu hôn. So vôùi naám Phytophthora thì Fusarium phaùt trieån chaäm hôn , quaù trình ñoái khaùng dieãn ra theo trình töï sau : ñaàu tieân laø caïnh tranh, Trichoderma seõ caïnh tranh chaát dinh döôõng treân moâi tröôøng thaïch. Tieáp theo laø kyù sinh, Trichoderma seõ xaâm nhaäp vaøo naám beänh, phaùt trieån vaø kyù sinh treân naám beänh vaø cuoái cuøng naám beänh bò tieâu dieät. Trong 2 tröôøng hôïp thì ôû Fusarium, Trichoderma ít phaûi caïnh tranh hôn laø ôû Phytophthora. 3.3.2 KHAÛO SAÙT KHAÛ NAÊNG ÑOÁI KHAÙNG GIÖÕA CHEÁ PHAÅM TRICHODERMA VAØ NAÁM BEÄNH CAÂY. Baèng phöông phaùp leân men xoáp trong moâi tröôøng coù thaønh phaàn laø caùm vaø traáu, thu nhaän cheá phaåm vaø thöïc hieän thí nghieäm khaûo saùt khaû naêng ñoái khaùng cuûa cheá phaåm Trichoderma harzianum, Trichoderma reesei vaø 2 naám beänh Fusarium vaø Phytophthora 3.3.2.1 khaû naêng ñoái khaùng cuûa cheá phaåm T. harzianum Keát quaû thí nghieäm saùt khaû naêng ñoái khaùng cuûa T.harzianum vôùi Fusarium vaø Phytophthora ñöôïc trình baøy ôû hình 3.6, 3.7 vaø baûng 3.2 Hình 3.6: söï öùc cheá cuûa cheá phaåm T. harzianum ñoái vôùi Fusarium Ngaøy nuoâi Ñoái chöùng Thí nghieäm 2 4 6 8 Hình 3.7 : söï öùc cheá cuûa cheá phaåm T. harzianum ñoái vôùi Phytophthora Ngaøy nuoâi Ñoái chöùng Thí nghieäm 2 4 6 8 Trong thí nghieäm treân naám beänh vaø cheá phaåm Trichoderma harzianum ñöôïc caáy chung trong 1 ñóa petri. Neáu cheá phaåm Trichoderma coù hoaït tính ñoái khaùng vôùi naám beänh thì söï phaùt trieån cuûa naám beänh seõ bò haïn cheá , theå hieän qua ñöôøng kính khuaån laïc naám beänh. Ñöôøng kính khuaån laïc naám beänh phaùt trieån trong thôøi gian caáy chung vôùi Trichoderma spp. ñöôïc trình baøy trong baûng 3.2 keát quaû cho thaáy T.harzianum coù khaû naêng ñoái khaùng Fusarium toát hôn, theå hieän qua ñöôøng kính khuaån laïc naám beänh Fusarium khoâng taêng theâm. 3.3.2.2 khaû naêng ñoái khaùng cuûa cheá phaåm T. reesei Keát quaû thí nghieäm khaûo saùt khaû naêng ñoái khaùng cuûa T.reesei vôùi Fusarium vaø Phytophthora ñöôïc trình baøy ôû hình 3.8, 3.9 vaø baûng 3.2 Hình 3.8 : söï öùc cheá cuûa cheá phaåm T. reesei ñoái vôùi Fusarium Ngaøy nuoâi Ñoái chöùng Thí nghieäm 2 4 6 8 Hình 3.9 : söï öùc cheá cuûa cheá phaåm T. reesei ñoái vôùi Phytophthora Ngaøy nuoâi Ñoái chöùng Thí nghieäm 2 4 6 8 Baûng 3.2 : ñöôøng kính khuaån laïc naám Fusarium vaø Phytophthora sau khi raéc cheá phaåm Trichoderma harzianum vaø Trichoderma reesei Cheá phaåm Naám Trichoder ma Ngaøy nuoâi ñöôøng kính khuaån laïc naám beänh ( mm ) Fusarium spp. Phytophthora sp. Ñoái chöùng Thí nghieäm Ñoái chöùng Thí nghieäm Cheá phaåm T. harzianum 2 4 6 8 15 20 25 31 10 10 10 9 10 23 27 30 9 12 12 11 Cheá phaåm T. reesei 2 4 6 8 15 20 25 31 7 10 10 8 10 23 27 30 8 11 12 11 Keát quaû cho thaáy so vôùi ñoái chöùng ( khoâng raéc cheá phaåm Trichoderma spp.) ñöôøng kính khuaån laïc naám beänh treân ñóa thí nghieäm khoâng taêng, chöùng toû khaû naêng ñoái khaùng cuûa cheá phaåm Trichoderma ñoái vôùi naám beänh ñaït hieäu quaû cao, kìm haõm ñöôïc söï phaùt trieån cuûa naám beänh, daàn daàn tieâu dieät chuùng baèng chaát khaùng sinh vaø enzyme. A. NAÁM BEÄNH FUSARIUM SPP. Ôû ngaøy ñaàu tieân vaø ngaøy thöù 2, naám beänh Fusarium vaø cheá phaåm Trichoderma spp. phaùt trieån chaäm, baøo töû cheá phaåm moïc raûi raùc khaép ñóa thaïch. Sang ngaøy thöù 4, ñaõ thaáy daáu hieäu cuûa söï öùc cheá naám beänh Fusarium bôûi cheá phaåm Trichoderma spp. Naám beänh phaùt trieån chaäm laïi, tô naám co laïi, cheá phaåm thì moïc nhieåu hôn. Nhöõng ngaøy tieáp theo, Fusarium khoâng coøn phaùt trieån nöõa, tô naám luïi daàn, thöa daàn, chæ coøn laïi söï phaùt trieån cuûa cheá phaåm Trichoderma spp. B. NAÁM BEÄNH PHYTOPHTHORA SP. Ngaøy thöù 2, naám beänh moïc phaùt trieån toát nhöng chaäm, baøo töû cheá phaåm Trichoderma spp. cuõng ñaõ moïc tuy hôi chaäm. Ngaøy thöù 4, ñaõ thaáy cheá phaåm öùc cheá naám beänh, laøm naám beänh moïc chaäm laïi, tô naám co laïi, veå phaàn cheá phaåm thì ñaõ moïc raûi raùc khaép ñóa thaïch. Nhöõng ngaøy tieáp theo thì naám beänh Phytophthora sp. Khoâng coøn phaùt trieån nöõa, tô naám luïi daàn, thöa thôùt daàn, teá baøo naám beänh bò phaân huûy daàn, coøn cheá phaåm thì vaãn ñang phaùt trieån. 3. 3.3 PHÖÔNG PHAÙP LEÂN MEN XOÁP Qua quaù trình leân men naám Trichoderma spp. trong moâi tröôøng coù thaønh phaàn laø caùm vaø traáu, ta nhaän thaáy raèng chuûng T.reesei phaùt trieån chaäm hôn T.harzianum khaù nhieàu. Sau 2 ngaøy, naám Trichoderma ñaõ moïc vaø sang ngaøy thöù 5 thì moïc traéng bao phuû khaép nôi. Cheá phaåm Trichoderma daïng boät saûn xuaát baèng phöông phaùp leân men theå raén ñöôïc trình baøy ôû hình 4.0 vaø 4.1. Hình 4.0 : cheá phaåm naám T.reesei Hình 4.1 : cheá phaåm naám T.harzianum kết luận chuûng Trichoderma khaûo saùt ñeàu coù khaû naêng öùc cheá vaø tieâu dieät naám beänh trong thôøi gian ngaén khaû naêng tieâu dieät naám beänh tuøy vaøo caùc chuûng naám beänh : tieâu dieät naám Fusarium thì nhanh choùng vaø hieäu quaû, tieâu dieät Phytophthora chaäm. Chuûng T.harzianum phaùt trieån vaø phaân boá nhieàu hôn chuûng T. reesei ñieàu kieän ngoaïi caûnh ( nhieät ñoä, aùnh saùng… ) cuõng aûnh höôûng toác ñoä dieät naám beänh cuûa caùc chuûng naám Trichoderma spp. Cheá phaåm Trichoderma spp. dieät naám beänh ñaït hieäu quaû trong thôøi gian ngaén. 3.4 keát luaän vaø ñeà nghò 3.4.1 KEÁT LUAÄN Qua nhieàu thí nghieäm vaø caùc keát quaû thu ñöôïc, ta coù theå ruùt ra 1 soá keát luaän nhö sau : Kieåm soaùt sinh hoïc laø bieän phaùp söû duïng naám ñoái khaùng Trichoderma spp. ñeå kieåm soaùt caùc loaøi naám beänh haïi caây troàng. Trichoderma laø loaïi naám ñöôïc öùng duïng kieåm soaùt naám beänh caây troàng nhôø khaû naêng tieát caùc enzyme, chaát khaùng sinh tieâu dieät naám beänh haïi caây troàng Leân men theå raén thu baøo töû Trichoderma höùa heïn laø phöông phaùp saûn xuaát cheá phaåm tröø naám beänh quy moâ lôùn 3.4.2 ÑEÀ NGHÒ Nghieân cöùu vaø thöû nghieäm nhieàu chuûng naám Trichoderma vôùi nhieàu loaïi naám beänh khaùc. Khaûo saùt khaû naêng ñoái khaùng vaø caùc hoaït tính cuûa Trichoderma theo caùc ñieàu kieän ngoaïi caûnh khaùc ñeå Trichoderma coù phoå hoaït ñoäng vaø phaùt trieån roäng hôn. Aùp duïng söï öùc cheá vaø ñoái khaùng naøy treân nhieàu loaïi caây troàng khaùc nhau ñeå khaûo saùt hieäu quaû thöïc teá. Tieán haønh keát hôïp giöõa cheá phaåm Trichoderma vôùi caùc chaát dinh döôõng, phaân boùn ñeå taïo ra saûn phaåm ña chöùc naêng giuùp cho söï phaùt trieån vaø taêng tröôûng cuûa caây troàng. Trieån khai quy trình leân men theå raén saûn xuaát baøo töû Trichoderma TAØI LIEÄU THAM KHAÛO Nguyeãn Maïnh Chính, Mai Thaønh Phuïng, 2008. Coû daïi trong ruoäng luùa vaø bieän phaùp phoøng tröø. NXB Noâng nghieäp, Haø Noäi. GS.TS. Traàn Vaên Maõo, TS. Nguyeãn Theá Nhaõ, 2008. Phoøng tröø saâu beänh haøi caây caûnh. NXB Noâng nghieäp Haø Noäi. Nguyeãn Danh Ñaøn, 2008. Hoûi ñaùp veà phoøng tröø dòch haïi caây aên traùi, NXB toång hôïp, TP.HCM. Nguyeãn Danh Vaøn, 2008. Hoûi ñaùp veà phoøng tröø dòch haïi caây rau maøu, NXB toång hôïp, TP.HCM. TS. Nguyeãn Vaên Tuaát, PGS. TS. Leâ Vaên Thuyeát, 2001. Saûn xuaát, cheá bieán, söû duïng thuoác Baûo Veä Thöïc Vaät Thaûo moäc vaø Sinh hoïc, NXB Noâng nghieäp Haø Noäi. Döông Thò Höõu Phöôùc, 2008. nghieân cöùu öùng duïng 2 chuûng Trichoderma harzianum vaø Trichoderma viride duøng phoøng choáng naám beänh haïi caây troàng, khoùa luaän cöû nhaân khoa hoïc, ngaønh Sinh Hoïc, Ñaïi hoïc Môû TP.HCM Traàn Thò Thanh Tuyeàn, 2004. Khaûo saùt quaù trình ñoái khaùng naám gaây beänh caây cuûa cuûa naám moác Trichoderma harzianum, khoùa luaän cöû nhaân khoa hoïc, ngaønh sinh hoïc, Ñaïi hoïc Khoa Hoïc Töï Nhieân TP.HCM. TS.Nguyeãn Vaên Vieân, TS.Ñoã Taán Duõng, 2008. beänh haïi caø chua do naám, vi khuaån vaø bieän phaùp phoøng choáng, NXB Noâng nghieäp Haø Noäi. Nguyeãn Ngoïc Tuù, Nguyeãn Thò Cöûu Höông Giang, 1997. Baûo veä caây troàng baèng caùc cheá phaåm töø vi naám, NXB noâng nghieäp Haø Noäi. GS.TS. Tröông Thanh Giaûn, 1998. Coâng ngheä Sinh Hoïc trong Baûo veä Thöïc vaät, TP.HCM.