Khóa luận Sản xuất Chitin-Chitosan từ vỏ tôm

a oáng ñoái chöùng F : heä soá töông quan giöõa haøm löôïng tyrosin vaø ñoä haáp thu ôû böôùc soùng 660 nm treân ñöôøng chuaån. n : heä soá pha loaõng cuûa enzyme 1/100 : heä soá chuyeån ñoåi. V : theå tích cuûa dung dòch enzyme m : khoái löôïng cheá phaåm enzyme thoâ. 3.3.4 Xaùc ñònh hoaït tính rieâng cuûa dòch chieát enzyme Hoaït tính cuûa dòch chieát enzyme ñöôïc xaùc ñònh bôûi coâng thöùc: ∑ÑVHT HTR = (U/ml CPE) P Trong ñoù: HTR : hoaït tính rieâng ∑ ÑVHT : soá ñôn vò hoaït tính enzyme/ml CPE P: haøm löôïng protein (mg/ml CPE) 3.3.5 Phaân tích thaønh phaàn nguyeân lieäu voû toâm 3.3.5.1. Xaùc ñònh ñoä aåm cuûa voû toâm khoâ a) Thieát bò Caân phaân tích coù ñoä chính xaùc 10-4 Coác söù, Bình huùt aåm Tuû saáy baèng ñieän, coù khaû naêng kieåm tra nhieät ñoä 1050C b) Nguyeân taéc Caân maãu thöû chính xaùc ñeán 0.001g, cho vaøo bình (m1) Coác ñaõ ñöôïc saáy khoâ vaø caân ño tröôùc (m0) Ñeå coác coù chöùa maãu thöû vaøo tuû saáy ôû nhieät ñoä 1050C thôøi gian 3 giôø. Sau ñoù laøm nguoäi trong bình huùt aåm ñeán nhieät ñoä phoøng, ñem caân chính xaùc ñeán 0.001g (m2). Laäp laïi thao taùc treân nhöng moãi laàn chæ ñeå khoaûng 30 phuùt trong tuû saáy cho ñeán khi löôïng maát ñi cuûa hai laàn caân lieân tieáp khoâng cheânh leäch nhau quaù 2mg hoaëc 4mg tuyø theo khoái löôïng cuûa phaàn maãu thöû c) tính toaùn Ñoä aåm tính baèng % khoái löôïng ñöôïc tính theo coâng thöùc sau: [(m1 – m2) * 100]/ (m1 – mo) Trong ñoù: mo : khoái löôïng coác khoâng (g) m1 : khoái löôïng coác vaø maãu tröôùc khi saáy (g) m2 : khoái löôïng coác vaø maãu sau khi saáy (g) 3.3.5.2. Xaùc ñònh haøm löôïng tro trong voû toâm khoâ tuyeät ñoái a) Duïng cuï Caân phaân tích coù ñoä chính xaùc 10-4 Cheùn nung baèng söù chòu nhieät hoaëc baïch kim coù dung tích töø 30 -50 ml Beáp ñieän Bình huùt aåm Loø nung ñieàu chænh ñöôïc nhieät ñoä Loø saáy ñieàu chænh ñöôïc nhieät ñoä 1050C b) Nguyeân taéc Cho cheùn nung vaøo loø nung trong 3 giôø ôû nhieät ñoä 500 -5500C. sau khi laáy cheùn ra vaø laøm nguoäi trong bình huùt aåm vaø ñem caân ñeå xaùc ñònh khoái löôïng vôùi ñoä chính xaùc 0.001g. laëp laïi quaù trình treân cho ñeán luùc khoái löôïng cheùn khoâng ñoåi (m2). Caân m g maãu thöû ôû traïng thaùi khoâ khoâng khí vaø cho vaøo cheùn nung ñaõ bieát khoái löôïng vôùi ñoä chính xaùc 0.001g Daøn ñeàu maãu treân ñaùy cheùn vaø ñoát caån thaän treân beáp ñieän cho ñeán khi maãu boác heát khoi, sau ñoù ñaët cheùn maãu vaøo loø nung vaø nung ôû nhieät ñoä 500 - 550ºC trong khoaûng töø 1 -2 giôø. Sau ñoù laáy ra ngoaøi laøm nguoäi trong bình huùt aåm, ñem maãu ñi caân ta coù khoái löôïng m1, laøm laïi quaù trình nung maãu cho ñeán khi khoái löôïng khoâng ñoåi c) Tính toaùn Haøm löôïng tro tho cuûa maãu (X) ñöôïc tính baèng % theo coâng thöùc: X = [(m1 – m2) *100]/m Trong ñoù: X : haøm löôïng tro thoâ cuûa maãu (%) m1: khoái löôïng cheùn vaø maãu sau khi nung (g) m2 : khoái löôïng cheùn (g) m : khoái löôïng maãu thöû tröôùc khi nung (g) 3.3.5.3. Xaùc ñònh haøm löôïng Ca vaø P trong maãu toâm khoâ tuyeät ñoái Xaùc ñònh haøm löôïng Calcium a) Nguyeân taéc Duøng Trilon B xaùc ñònh calcium trong dung dòch maãu vôùi chæ thò murexid (C8H5O6N5) trong moâi tröôøng coù pH = 12. kyù hieäu chaát chæ thò murexid laø H3I- trong moâi tröôøng pH = 12, H3I- coù maøu tím vaø khi keát hôïp vôùi calcium taïo thaønh phöùc chaát coù maøu hoàng: H3I- + Ca2+ CaH3I+ Tím hoàng Chaát phöùc hôïp cuûa Ca vôùi muruxid khoâng beàn baèng chaát phöùc hôïp bôûi Ca vaø Trilon B ñaåy chæ thò murexid ra khoûi chaát phöùc hôïp döôùi daïng töï do coù maøu tím: CaH3I+ + H2Y2- CaY2- + H3I- + 2H+ Hoàng tím b) duïng cuï vaø hoaù chaát Duïng cuï: Bình tam giaùc 100ml Oáng chuaån ñoä 25ml Oáng huùt 2,5,10 ml Hoaù chaát: Dung dòch NaOH 10% Dung dòch KCN 3% Chæ thò murexid: caân 0.1g murexid + 50g NaCl tinh khieát. Nghieàn nhuyeãn baèng coái, cho vaøo chai thuyû tinh coù ñaäy nuùt kín. Dung dòch Trilon B 0.02 N c) Caùch tieán haønh Tuyø theo haøm löôïng Ca coù trong maãu, caân chính xaùc 2 – 5g maãu, nung thaønh tro traéng, hoaø vôùi 5ml HCl tinh khieát, ñun caùch thuyû tôùi khoâ treân noài caùch thuyû soâi – thöïc hieän töông töï theâm moät laàn nöõa. Tieáp ñoù cho theâm 5ml HCl 20%, hoaø tan, loïc treân giaáy loïc khoâng tro. Röûa cheùn nung nhieàu laàn baèng nöôùc caát noùng. Dòch loïc vaø nöôùc röûa cho caû vaøo bình ñònh möùc, cuoái cuøng cho theâm nöôùc caát ñuû 100ml, ta coù ñöôïc dòch thöû Huùt 20 ml dung dòch thöû cho vaøo bình tam giaùc 100ml theâm 2ml dung dòch NaOH 10%, 5 gioït KCN 3% vaø khoaûng nöõa haït gaïo chæ thò murexid. Chuaån ñoä baèng dung dòch Trilon B 0.02N cho ñeán khi maøu hoàng cuûa dung dòch chuyeån sang maøu tím, caàn thöïc hieän song song moät söï thöû khoâng (ñoái chöùng). d) Tính toaùn: V1 = (v1*100)/a (ml/100g maãu khoâ) Löôïng calcium (tính baèng mg) trong 100g maãu thoâ laø: m1 = (v1*C*20.04*100)/a trong ñoù: V1 : theå tích Trilon B caàn ñeå chuaån ñoä khi xaùc ñònh löôïng calcium trong dung dòch maãu töông ñöông vôùi 100g maãu khoâ. v1 : theå tích Trilon B 0.02N duøng ñeå chuaån ñoä a : troïng löôïng maãu khoâ töông ñöông vôùi theå tích dung dòch maãu laáy ñeå chuaån ñoä 20.04 : ñöông löôïng cuûa calcium C : ñoä nguyeân chuaån cuûa dung dòch Trilon B Ñònh löôïng phosphor a) Nguyeân taéc Phöông phaùp döïa vaøo khaû naêng cuûa ion Orthophosphate phaûn öng vôùi ammonium Molybdate taïo thaønh Phosphormolybdate, phöùc chaát coù maøu xanh lô 2(MoO24MoO3) + H3PO4 (MoO24MoO3).2H3PO4.4H20 Haøm löôïng phosphor phuï thuoäc vaøo cöôøng ñoä maøu cuûa maãu, ño ôû böôùc soùng haáp thuï cöïc ñaïi 650nm vôùi cuvet coù chieàu daøy 10mm, dung dòch dòch ñoái chöùng laø dung dòch khoâng b) Duïng cuï vaø hoaù chaát Duïng cuï Thôøi gian chuaån bò laø moät giôø, ñoä nhaïy cuûa phöông phaùp cao do ñoù caùc duïng cuï thuyû tinh ñoøi hoûi phaûi thaät saïch Maùy quang phoå coù böôùc soùng 650nm vaø cuvet baèng 10mm Bình ñònh möùc 50,100 ml Oáng nghieäm Hoaù chaát: taát caû caùc hoaù chaát söû duïng trong tieâu chuaån naøy phaûi coù tinh khieát phaân tích Nöôùc söû duïng phaûi laø nöôùc caát hay coù ñoä tinh saïch töông ñöông HCl ñaäm ñaëc HNO3 ñaäm ñaëc Amobi Molybdate Hydriquinone [ C6H4(OH)2] pha khi söû duïng Kali Dihydrophotphat (KH2PO4) Sodium sulfite (Na2SO3) c) Caùch tieán haønh Laáy maãu thöû vaø chuaån bò maãu theo TCVN 4325-86 Neáu maãu khoâ khoâng khí, ñaõ xöû lyù sô boä vaø baûo quaûn laïnh Neáu maãu töôi, xöû lyù sô boä coâ caïn, saáy ôû 60ºC , saáy 105ºC nghieàn laáy maãu trung bình Chuaån bò dòch thuoác thöû Dung dòch(1) = dung dòch chuaån goác (coù chöùa 100µg phosphor/ml). hoaø tan 0.394g KH2PO4 trong bình ñònh möùc 1000ml baèng nöôùc caát vaø ñònh möùc ñuùng 1000ml. chuaån bò dung dòch chuaån ñeå laäp thang chuaån (coù chöùa 25µg phosphor/ml). laáy 25ml dung dòch vaøo bình ñònh möùc baèng nöôùc caát ñuùng 100ml ta coù dung dòch 1A Dung dòch Acid Chlohydric 10% (pha loaõng tæ leä 1:3). 250ml HCl ñaäm ñaëc theâm 750 ml nöôùc caát Dung dòch (2) = dung dòch Sodium Sulfite (Na2SO3) 20% trong ít nöôùc vaø theâm cho ñuû 100ml, dung dòch chuaån bò khi söû duïng Dung dòch (3) = dung dòch Hydroquinone [C6H4(OH)2] 0.5%. hoaø tan 0.5g Hydroquinone trong moät ít nöôùc vaø 3 gioït H2SO3, theâm tieáp nöôùc cho ñuû 100ml. dung dòch chuaån bò khi söû duïng Dung dòch (4) = thuoác thöû Briggs = dung dòch Amoni Molybdate 5% hoaø tan 50g Amoni Molybdate trong 600ml nöôùc. Cho 150ml H2SO4 ñaäm ñaëc vaøo trong 400ml nöôùc, ñeå nguoäi theâm tieáp dung dòch Amoni Molybdate 5% ñaõ chuaån bò cho vaøo hoãn hôïp, ñeå nguoäi theâm nöôùc cho ñuû 1000ml Hoãn hôïp thuoác thöû chuaån bò khi söû duïng Troän laãn caùc dung dòch 2,3,4 theo tæ leä 1:1:1 Chuaån bò dung dòch tro phaân tích Caân chính xaùc 1 – 5g maãu (tuyø vaøo haøm löôïng phosphor nhieàu hay ít) Voâ cô hoaù ôû 5500C trong 4h, ñeå nguoäi ñeán nhieät ñoä phoøng thaám öôùt tro baèng vai gioït nöôùc caát vaø theâm 10ml dung dòch HCl 10% + 0.5ml HNO3 Ñun nheï trong 5 phuùt (ñeán bay hôi), ñeå nguoäi ñeán nhieät ñoä phoøng röûa saïch cheùn nung vaø ñònh möùc theå tích dung dòch tro 250ml Phaûn öùng leân maøu Laáy 10ml dung dòch tro cho vaøo bình noùn dung dòch 100ml, ñònh möùc ñuû 100ml ta coù dung dòch thöù 2 Laáy 1ml dung dòch thöù 2 cho vaøo oáng nghieäm Theâm 3ml hoãn hôïp thuoác thöû vaø nöôùc ñuû 10ml, hoãn hôïp laéc ñeàu ñeå 30 phuùt, ño ôû böôùc soùng 650 nm 3.3.5.4. Xaùc ñònh haøm löôïng Nitô toång soá baèng phöông phaùp Kjeldahl a) Nguyeân taéc Chaát ñaïm ñöôïc voâ cô hoaù baèng H2SO4 ñaäm ñaëc vaø chaát xuùc taùc thaønh muoái ammonium sulphate (NH4)2SO4. muoái naøy ñem cho taùc duïng vôùi kieàm maïnh nhö NaOH seõ giaûi phoùng NH3 H2SO4 ñaäm ñaëc Nguyeân lieäu (NH4)2SO4 Xuùc taùc, t0 (NH4)2SO4 + NaOH 2NH3 + 2H2O + Na2SO4 Sau ñoù löôïng NH3 ñöôïc loâi cuoán baèng hôi nöôùc sang moät bình tam giaùc coù chöùa moät löôïng thöøa H3BO3, maø ôû ñoù H3BO3 töï phaân ly: H3BO3 HBO2 + H2O Khi caát ñaïm, NH3 bay ra seõ phaûn öùng vôùi HBO2 NH4OH + HBO2 NH4+ + BO2- + H2O BO2- laø moät bazô maïnh, bôûi vaäy dung dòch cuûa bình phaûn öùng chuyeån töø maøu tím ñoû sang maøu xanh laù maï. Löôïng BO2- ñöôïc taïo thaønh töông ñöông vôùi löôïng NH3 bò ñaåy ra trong qua trình caát ñaïm. Xaùc ñònh löôïng BO2- baèng caùch chuaån ñoä ngöôïc vôùi HCl 0.25N. giai ñoaïn chuaån ñoä keát thuùc khi dung dòch chuyeån töø maøu xanh la maï sang maøu tím ñoû. b) Duïng cuï vaø hoaù chaát Maùy Kjeldahl NaOH 32% HCl 0.25N Chaát xuùc taùc laø hoãn hôïp cuûa 60g Se: 75g CuSO4: 865g K2SO4 Hoãn hôïp chaát chæ thò maøu: Hoaø tan 0.264g methyl ñoû trong 250ml coàn tuyeät ñoái Hoaø tan 1.28g bromocresol blue trong 50ml coàn tuyeät ñoái Troän ñeàu hai dung dòch treân, boå sung 96ml HCl 0.25N roài ñònh möùc ñeán 1000ml baèng coàn tuyeät ñoái Dung dòch acid boric 4% vôùi chæ thò maøu: hoaø tan 80g acid boric trong 1000ml nöôùc caát, ñun noùng moät chuùt. Ñeå nguoäi vaø boå sung 25ml hoãn hôïp chaát chæ thò maøu roài theâm nöôùc caát cho ñuû 2000ml c) Caùch tieán haønh Voâ cô hoaù maãu: Caân 0,1g maãu ñaõ nghieàn kyõ, theâm 5ml H2SO4 ñaäm ñaëc vaø 1g chaát xuùc taùc cho vaøo bình Kjeldahl. Sau khi theâm chaát xuùc taùc ñun nheï hoãn hôïp, traùnh soâi traøo vaø chæ ñun maïnh khi hoãn hôïp ñaõ hoaøn toaøn chuyeån sang dòch loûng. Trong quaù trình ñun thænh thoaûng laéc nheï, traùng kheùo leùo sao cho khoâng coøn moät veát ñen naøo cuûa maãu nguyeân lieäu chöa bò phaân huyû coøn soùt laïi treân thaønh bình. Ñun cho tôùi khi dung dòch trong bình hoaøn toaøn traéng. Khi thôøi gian phaù maãu keát thuùc, khoaûng 3 -4 giôø , ñeå nguoäi roài chuyeån toaøn boä vaøo bình chöng caát. Chöng caát Sau khi chuyeån maãu ñaõ ñöôïc voâ cô hoaù vaøo bình chöng caát, boå sung 30ml NaOH 32%. Dòch chöng caát chuyeån qua erlen coù chöùa saün 20ml dung dòch acid boric 4% coù chæ thò maøu Ngöøng chöng caát khi dòch chöng caát ra khoâng coøn NH3 (khoâng laøm ñoåi maøu giaáy quyø). Chuaån ñoä baèng HCl 0.25N ñeán khi xuaát hieän maøu ñoû phôùt Thoâng qua löôïng HCl 0.25N ñem ñi chuaån ñoä ta bieát ñöôïc löôïng acid boric keât hôïp vôùi NH3 vaø do vaäy bieát ñöôïc löôïng NH3 giaûi phoùng töø maãu. 1ml HCl 0.25N Töông öùng vôùi 0.0035g N höõu cô. d) keát quaû VHCl * 0.0035*100 N (%) = C Trong ñoù: VHCl : laø theå tích HCl 0.25N duøng ñeå chuaån ñoä (ml) C : laø khoái löôïng maãu ñem ñi voâ cô hoaù (g) Xaùc ñònh haøm löôïng protein trong voû toâm Thoâng thöôøng protein chöùa khoaûng 16%N. khí NH3 nhaän ñöôïc khi chöng caát nhaân vôùi heä soá chuyeån ñoåi 100/16 (~6.25) seõ thu ñöôïc giaù trò protein töông ñöông. Vì vaäy sau khi xaùc ñònh ñöôïc haøm löôïng Nitô toång soá theo phöông phaùp Kjeldahl ta suy ra haøm löôïng protein toaøn phaàn laø: HL protein = N(%) * 6.25 Phöông phaùp saûn xuaát chitin – chitosan 3.3.6.1 Ñieàu cheá enyzme protease baèng naám moác Aspergillus oryzae Caáy gioáng vaøo moâi tröôøng luùa coù boå dung khoaùng Czapek taêng sinh khoái khoaûng 2 ngaøy, sau ñoù cho vaøo moâi tröôøng baõ ñaäu naønh, caùm mì, caùm gaïo vôùi tyû leä 2:1:1 coù boå sung khoaùng Czapek vaø khoaùng Mandel ñeå thu enzyme sau ñoù ñem ly taâm 3000voøng/phuùt trong 15 phuùt ôû nhieät ñoä 150C. loaïi caën vaø thu dòch trong. Sau ñoù tuûa baèng coàn tieáp tuïc ly taâm 3000voøng/phuùt trong 15 phuùt ôû nhieät ñoä 150C thu caën boû dòch ta ñöôïc enzyme protease. Baûo quaûn ôû nhieät ñoä 50C 3.3.6.2 Keát quaû tuûa enzyme baèng coàn ñeå tìm ra tyû leä tuûa thích hôïp Thí nghieäm söû duïng caùc tyû leä tuûa sau: Baûng 3.3 tyû leä tuûa baèng coàn ñoái vôùi dòch enzyme Dòch enzyme thoâ (ml) 10 10 10 10 10 10 Coàn 960 laïnh (ml) 10 20 30 40 50 60 Tyû leä 1:1 1:2 1:3 1:4 1:5 1:6 a) Nguyeân taéc: caùc ñieàu kieän thí nghieäm ñöôïc tieán haønh trong moâi tröôøng laïnh nhaèm traùnh laøm maát hoaït tính cuûa enzyme vaø keát quaû ñöôïc toát hôn. Cho taùc nhaân tuûa ñaõ laøm laïnh vaøo dung dòch enzyme caàn tuûa vaø giöõ ôû nhieät ñoä laïnh trong becher. Laéc ñeàu hoãn hôïp, baûo quaûn laïnh moät thôøi gian , ñem ly taâm laïnh, laáy caën hoaø laïi trong dung dòch ñeäm, baûo quaûn laïnh. b) Caùch tieán haønh: cho dòch loïc enzyme thoâ ôû thí nghieäm treân tuûa baèng coàn 960 ñöôïc laøm laïnh tröôùc theo caùc tyû leä khaùc nhau. c) Caùc böôùc thöïc hieän Cho dòch enzyme vaøo becher. Cho töø töø löôïng coàn 960 laïnh vaøo becher chöùa dòch enzyme. Theå tích enzyme vaø coàn töông öùng vôùi moãi tyû leä ñöôïc söû duïng nhö baûng treân. Khuaáy ñeàu. Ñeå yeân 1 giôø ôû 50C trong tuû laïnh. Laáy dòch ñem ly taâm 8000 voøng/phuùt trong 10 phuùt ôû 50C. Boû dòch, thu tuûa. Cho enzyme vaøo trong loï nhoû, baûo quaûn ôû 50C. 3.3.6.3 Thuyû phaân voû toâm baèng enzyme protease keát tuûa ñeå thu chitin vaø chitosan Theo doõi quaù trình thuyû phaân voû toâm baèng enyzme protease keát tuûa vôùi caùc noàng ñoä 5%, 7%, 9% nhieät ñoä 40, 50, 600C thôøi gian töø 2 – 20 giôø Boá trí thí nghieäm nhö sau: Nguyeân lieäu ( voû toâm khoâ) Xay nhoû 2 – 4 mm Ngaâm trong dòch enzyme coù noàng ñoä khaùc nhau ( 5%, 7%, 9%) Vôùi caùc giaù trò nhieät ñoä 40, 50, 60, tyû leä W:V = 1:10 pH = 7, vaø trong khoaûng thôøi gian töø 0 -20 giôø ño haøm löôïng proteine hoaø tan choïn ñöôïc nhieät ñoä, noàng ñoä vaø thôøi gian thuyû phaân thích hôïp (taïi noàng ñoä maø haøm löôïng proteine hoaø tan thaáp nhaát) 3.3.6.4 Tieán haønh thuyû phaân voû toâm baèng enzyme ñeå thu nhaän chitosan Sau khi tieán haønh theo doõi caùc ñieàu kieän toái öu thuyû phaân, ta boá trí thí nghieäm nhö sau: Nguyeân lieäu (100g voû toâm khoâ, xay nhoû) Xöû lyù vôùi enzyme ôû noàng ñoä, nhieät ñoä vaø thôøi gian thích hôïp Röûa saïch Laøm khoâ Ngaâm HCl 10%, W:V = 1:10. nhieät ñoä phoøng, 5 giôø Röûa saïch Laøm khoâ ôû 600C Chitin Ngaâm NaOH 40%, W:V = 1:10. 100 – 1100C, trong 5 giôø Röûa saïch Phôi khoâ töï nhieân Chitosan 3.3.6.5 Kieåm tra saûn phaåm chitosan thu ñöôïc Ñònh tính chitosan Ñeå bieát chaát ñoù coù phaûi laø chitosan hay khoâng ngöôøi ta coù theå duøng phaûn öùng sau ñeå ñònh tính nhanh chitosan theo taøi lieäu cuûa Nguyeãn Höõu Ñöùc vaø Voõ Thò Töôøng Khanh (1997): Cho phaûn öùng vôùi KMnO4: laáy 0.1 ml KMnO4 cho vaøo 10 ml dung dòch chitosan 0.5% trong dung dòch acid acetic 1%, dung dòch töø maøu tím sang maøu vaøng nhaït Phöông phaùp xaùc ñònh ñoä hoaø tan nguyeân lyù: chitosan ñöôïc hoaø tan trong acid acetic loaõng 1%, coøn chitin vaø caùc taïp chaát khaùc khoâng hoaø tan tieán haønh Caân chính xaùc M g chitosan hoaø tan trong acid acetic 1%, khuaáy ñeàu trong 15 phuùt cho chitosan tan hoaøn toaøn (neáu coøn vôùt ra röûa saïch baèng nöôùc caát). Sau ñoù ñem saáy khoâ vaø caân laïi. Tính thaønh phaàn %: X (%) = [(M – m) x 100]/M Trong ñoù: M: laø khoái löôïng cuûa chitosan (g) m: laø khoái löôïng chitosan coøn dö sau phaûn öùng hoaø tan (g) 3.3.6.6 Xaùc ñònh ñoä deacety hoaù baèng phöông phaùp döïa vaøo haøm löôïng ñaïm toång soá Nguyeân lyù: khi chitin chuyeån hoaù thaønh chitosan thì goác acetyl cuõng chuyeån thaønh goác amino laøm aûnh höôûng ñoä ñaïm toång soá, döïa vaøo söï thay ñoåi ñoä ñaïm toång soá ta xaùc ñònh ñöôïc ñoä deacetyl. Trong phaân töû chitin (C8H13O5N)n laáy moät monome C8H13O5N, ta coù baûng sau: Baûng 3.4 Tính haøm löôïng % nitô toaøn phaàn trong maãu chitin tính theo lyù thuyeát (kyù hieäu laø a) Nguyeân toá Soá nguyeân töû trong moät maïch Tính ra ñôn vò oxi Tyû leä % trong maïch C 8 8 x 12 a = 6.89 % H 13 13 x 1 O 5 5 x 16 N 1 1 x14 Toång 203 Trong chitosan (C6H11O4N)n laáy moät monomer C6H11O4N, ta coù baûng sau: Baûng 3.5 Tính haøm löôïng % nitô toaøn phaàn trong maãu chitin tính theo lyù thuyeát (kyù hieäu laø b) Nguyeân toá Soá nguyeân töû trong moät maïch Tính ra ñôn vò oxi Tyû leä % trong maïnh C 6 6 x12 b = 8.69% H 11 11x 1 0 4 4 x16 N 1 1 x14 Toång 161 Ñoä acety hoaù ñöôïc tính theo coâng thöùc sau: c – a DA = x 100 b – a Trong ñoù: c : haøm löôïng % nitô toaøn phaàn trong maãu chitosan ñem kieåm nghieäm. a : haøm löôïng % nitô toaøn phaàn trong maãu chitin tính theo lyù thuyeát. b : haøm löôïng % nitô toaøn phaàn maãu chitosan tính theo lyù thuyeát Phöông phaùp xaùc ñònh ñoä nhôùt cuûa dung dòch chitosan a) nguyeân lyù: neáu cho chaát loûng chaûy qua caùc mao quaûn, chaát loûng caøng coù ñoä nhôùt cao thì chaûy caøng chaäm, vì vaäy ta coù theå döïa vaøo tính chaát ñoù ñeå xaùc ñònh ñoä nhôùt cuûa chaát loûng. b) phöông phaùp: ñoái vôùi doøng chaûy taàng oån ñònh cuûa chaát loûng Newton trong oáng mao daãn, phöông trình coå ñieån cuûa Hagen Poiseuille ñaõ ñöa ra nhöõng neàn taûng cho vieäc ño löôøng ñoä nhôùt. Q = (rP .3.14.R4) / (8.u.L) (1) Trong ñoù: Q : löïu löôïng theå tích, m3/s. rP : toån thaát aùp suaát doïc theo oáng mao daãn, Pa. R : ñöôøng kính oáng mao daãn, m. L : chieàu daøi oáng mao daãn, m. u : ñoä nhôùt cuûa chaát loûng, Pa.s. Ngoaøi ra, toån thaáp aùp suaát rP = ß.g.h (2) ß : khoái löôïng rieâng cuûa chaát loûng, kg/m3 h : chieàu cao coät thuyû tónh, m. h = L.cosα, vôùi α laø goùc taïo bôûi oáng mao daãn vôùi phöông thaúng ñöùng. g : gia toác troïng tröôøng, m/s2 Thay phöông trình (2) vaøo phöông trình (1) ta ñöôïc: u 3.14.R4.g.h v = = (3) ß 8.L.Q Trong ñoù: v laø ñoä nhôùt ñoäng hoïc cuûa chaát loûng, m/s2 Goïi V laø theå tích chaát loûng chaûy trong oáng mao daãn trong thôøi gian t, ta coù: V Q = t Phöông trình (3) ñöôïc vieát laïi nhö sau: 3.14.R4.g 3.14.R4.g.h v = ( cosα) . t = ( ).t (4) 8.V 8.L.V Khi cho chaát loûng chaûy töø ñieåm C ñeán E, theå tích V vaø chieàu cao coät aùp thuyû tónh h laø coá ñònh, do ñoù bieåu thöùc trong daáu ngoaëc trôû thaønh haèng soá, phöông trình (4) ñöôïc vieát ñôn giaûn nhö sau: v = b.t (5) 3.14.R4.g 3.14.R4.g.h Trong ñoù b = [ cosα] = [ ] laø haèng soá nhôùt keá 8.V 8.V.L Haèng soá nhôùt keá coù theå xaùc ñònh baèng caùch thay caùc giaù trò cuûa thoâng soá nhôùt keá hoaëc baèng caùch ño thôøi gian chaûy cuûa moät chaát loûng ñaõ bieát ñoä nhôùt, khi ñoù: b = Vknown/ tknown Khi ñaõ bieát haèng soá nhôùt keá, ta coù theå xaùc ñònh ñöôïc ñoä nhôùt ñoäng hoïc v cuûa chaát loûng caàn kieåm tra baèng caùch ño thôøi gian t vaø söû duïng phöông trình (5).töø ñoù xaùc ñònh ñöôïc ñoä nhôùt ñoäng löïc hoïc u. c) Caùch tieán haønh Caân 0.1 g chitosan hoaø trong 100ml acid acetic 1%, laáy 20 ml hoãn hôïp dung dòch treân cho vaøo nhôùt keá Ostwall. Duøng oáng boùp cao su huùt ôû ñaàu A sao cho möïc dung dòch chitosan chaïy khoûi vaïch C Cho möïc dung dòch chitosan chaïy xuoáng ngang vaïch C vaø baét ñaäu tính giôø khi möïc dung dòch chitosan chaïy töø vaïch C xuoáng vaïch E. Tröôùc khi tieán haønh ño phaûi veä sinh nhôùt keá saïch seõ, saáy khoâ nhôùt keá, traùng nhôùt keá baèng chính dung dòch caàn ño ít nhaát 1 laàn, roài môøi tieán haønh ño. 3.3.6.7 ÖÙng duïng chitosan thu ñöôïc laøm giaù theå coá ñònh enzyme Phöông phaùp coá ñònh enyzme protease vaøo trong chitosan baèng phöông phaùp nhoát a) nguyeân lyù: chitosan coù khaû naêng taïo gel hay maøng boïc, enzyme seõ ñöôïc giöõ trong gel hay maøng boïc ñoù sau quaù trình truøng hôïp vôùi söï coù maët cuûa moät hay nhieàu taùc nhaân khaâu maïch, taïo phöùc chelate. b) hoaù chaát boät chitosan Acid acetic 1% Tripolyphosphate 3% caùch tieán haønh Dung dòch chitosan ñöôïc chuaån bò baèng vieäc cho 3g chitosan vaøo 100 ml dung dòch acid acetic 1%, sau ñoù hoaø troän hoãn hôïp treân vôùi 2 ml dung dòch enzymeâ 5%. Duøng oáng tieâm cho chaûy nhoû gioït hoãn hôïp treân vaøo 500 ml dung dòch tripolyphosphate (TPP) 3%. Chuùng ñöôïc ñeå qua ñeâm cho raén laïi vaø sau ñoù ñöôïc röûa hai laàn treân maøng loïc vôùi nöôùc caát. Dung dòch TPP sau khi röûa ñöôïc thu thaäp ñeå xaùc ñònh hieäu suaát nhoát. Xaùc ñònh hieäu suaát coá ñònh enzyme CiVi - CfVf Hieäu suaát (%) = x 100 CiVi Trong ñoù: Ci : laø noàng ñoä ban ñaàu cuûa protein. Vi : laø theå tích ban ñaàu cuûa dung dòch protein. Cf : laø noàng ñoä protein trong toång phaàn nöôùc loïc ra. Vf : laø toång theå tích cuûa phaàn nöôùc loïc. 3.3.5 Xaùc ñònh haøm löôïng protein vaø hoaït tính protease trong cheá phaåm enzyme ban ñaàu Caân 0.05g cheá phaåm enzyme hoaø tan trong 5ml dung dòch nöôùc caát, sau ñoù tieán haønh thí nghieäm xaùc ñònh haøm löôïng protein vaø hoaït tính protease theo phöông phaùp Bradford vaø Amano 3.3.5.1 Xaùc ñònh hieäu suaát hoaït tính enyzme coá ñònh Hieäu suaát hoaït tính enzyme coá ñònh ñöôïc xaùc ñònh bôûi coâng thöùc: E0V0 - EfVf H = x 100 E0V0 Trong ñoù: H : hieäu suaát hoaït tính enzyme coá ñònh (%). E0 : hoaït tính enzyme protease coù trong theå tích duøng ñeå coá ñònh (U/ml). V0 : theå tích enzym duøng ñeå coá ñònh (ml). Ef : hoaït tính cuûa enzyme protease coù trong theå tích sau khi coá ñònh (U/ml). Vf : toång theå tích cuûa phaàn nöôùc loïc (ml). 3.3.5.2 Xaùc ñònh haøm löôïng protein coù trong 1g chaát mang gaén enzyme coá ñònh Haøm löôïng protein coù trong 1g chaát mang gaén enzyme coá ñònh ñöôïc xaùc ñònh bôûi coâng thöùc sau: (C0V0 - CfVf) P = x 1/1000 (mg/g) Wg Trong ñoù: P : haøm löôïng protein C0 : noàng ñoä protein cuûa dung dòch enzyme protease tröôùc khi coá ñònh (µg/ml). Cf : noàng ñoä protein cuûa dung dòch enzyme protease sau khi coá ñònh (µg/ml). V0 : theå tích enzyme tröôùc khi coá ñònh (ml). Vf : theå tích enzyme sau khi coá ñònh (ml). Wg: troïng löôïng cuûa chaát mang gaén enzyme coá ñònh (g) 3.3.5.3 Khaûo saùt aûnh höôûng cuûa pH leân hoaït tính cuûa enzyme tröôùc vaø sau coá ñònh Cheá phaåm enzyme protease ban ñaàu vaø enzyme protease coá ñònh ñöôïc khaûo saùt aûnh höôûng cuûa nhieät ñoä leân hoaït tính protease baèng phöông phaùp ñaõ Amano. tuy nhieân chuùng toâi giöõ nguyeân giaù trò pH vaø noàng ñoä cô chaát casein 1%, chæ thay ñoåi giaù trò nhieät ñoä töø 30 – 800C, moãi giaù trò caùch nhau 100C. töø ñoù veõ ñoà thò bieåu dieãn söï bieán thieân cuûa enzyme protease ban ñaàu vaø protease coá ñònh ñeå tìm ra nhieät ñoä toái öu cho hoaït ñoäng xuùc taùc thuyû phaân cuûa enzyme protease ban ñaàu vaø enzyme protease coá ñònh. 3.3.5.4 Khaûo saùt ñoä beàn nhieät ñoái vôùi hoaït tính cuûa enzyme tröôùc vaø sau coá ñònh Cheá phaåm enzyme protease ban ñaàu vaø enzyme protease coá ñònh ñöôïc khaûo saùt ñoä beàn nhieät leân hoaït tính protease baèng phöông phaùp Amano. tuy nhieân chuùng toâi tieán haønh uû enzyme ôû nhieät ñoä 600C trong caùc khoaûng thôøi gian 0 phuùt, 10 phuùt, 20 phuùt, .. .., 100 phuùt. Ôû moãi khoaûng thôøi gian chuùng toâi ñem ra laøm nguoäi vaø xaùc ñònh hoaït tính theo phöông phaùp Amano. Töø ñoù veõ ñoà thò bieåu dieãn söï bieán thieân cuûa enzyme protease ban ñaàu vaø enzyme protease coá ñònh ñeå xem aûnh höôûng cuûa thôøi gian uû leân hoaït ñoäng xuùc taùc thuyû phaân cuûa enzyme protease ban ñaàu vaø enzyme coá ñònh. 3.3.5.5 Khaûo saùt soá laàn taùi söû duïng cuûa enzyme coá ñònh baèng phöông phaùp nhoát Sau khi xaùc ñònh ñöôïc nhieät ñoä vaø pH toái öu cuûa protease coá ñònh, ta tieán haønh khaûo saùt soá laàn taùi söû duïng cuûa protease ñaõ ñöôïc coá ñònh, thoâng qua vieäc xaùc ñònh hoaït tính theo phöông phaùp Amano. khi keát thuùc thí nghieäm xaùc ñònh hoaït tính laàn 1, röûa laïi baèng nöôùc caát vaø tieáp tuïc khaûo saùt hoaït tính laàn 2, cöù tieáp tuïc nhö theá cho ñeán khi hoaït tính enzyme protease coá ñònh giaûm xuoáng 50% Töø ñoù veõ ñoà thò bieåu dieãn söï bieán thieân cuûa enzyme protease coá ñònh theo soá laàn taùi söû duïng, vaø cuõng xaùc ñònh ñöôïc khi naøo hoaït tính cuûa enzyme protease coá ñònh giaûm ñi moät nöõa so vôùi hoaït tính enzyme ban ñaàu. Chöông 4 KEÁT QUAÛ VAØ THAÛO LUAÄN 4.1 Keát quaû phaàn khaûo saùt enzyme Haøm löôïng proteine vaø hoaït tính protease cuûa dòch chieát enzyme: Baûng 4.1 keát quaû haøm löôïng proteine vaø hoaït tính protease cuûa dòch chieát enzyme Haøm löôïng proteine (mg/ml) Hoaït tính protease (U/ml) Hoaït tính rieâng (U/mg) 12.852 46.072 3.58 Haøm löôïng vaø hoaït tính cheá phaåm enzyme tuûa baèng coàn 960C: Baûng 4.2 keát quaû haøm löôïng proteine vaø hoaït tính protease cuûa cheá phaåm enzyme khi tuûa coàn Tyû leä tuûa (dòch chieát: coàn 960C 1:1 1:2 1:3 1:4 1:5 1:6 Haøm löôïng proteine (mg/g) 93.24 104.02 105.56 114.49 101.42 70.36 Hoaït tính protease (U/g) 236.27 291.77 437.43 496.63 430.32 240.13 Nhaän xeùt: Theo baûng 4.2 ta thaáy tyû leä tuûa coàn 1 : 4 laø cho keát quaû haøm löôïng vaø hoaït tính cuûa cheá phaåm enzyme laø cao nhaát, vì vaäy ta seõ choïn tyû leä 1 : 4 tuûa dòch chieát enzyme, taïo cheá phaåm enzyme ñeå laøm nguyeân lieäu cho caùc thí nghieäm sau. Khi tyû leä coàn cao thì khaû naêng tuûa proteine caøng cao, tuy nhieân neáu tyû leä coàn quaù cao coù theå laøm giaûm khaû naêng keát tuûa. Ban ñaàu khi löôïng dung moâi caøng taêng, enzyme ñöôïc keát tuûa do maát lôùp aùo nöôùc beân ngoaøi neân hoaït tính caøng taêng. Nhöng neáu tieáp tuïc taêng löôïng dung moâi, haèng soá ñieän moâi giaûm, phaân töû proteine coù theå töï thaùo gôõ vaø trôû thaønh daïng khoâng hoaït ñoäng, do ñoù hoaït tính giaûm (ôû tyû leä 1 : 5, 1 : 6). Coøn ôû tyû leä coàn quaù thaáp (tyû leä 1 : 1, 1 : 2, 1 : 3) do chöa ñuû löôïng dung moâi neân khoâng keát tuûa ñöôïc heát löôïng proteine, hoaït tính thaáp. Haøm löôïng vaø hoaït tính cuûa cheá phaåm enzyme: Baûng 4.3 keát quaû haøm löôïng proteine vaø hoaït tính protease cuûa cheá phaåm enzyme Haøm löôïng proteine (mg/g) Hoaït tính protease (U/g) Hoaït tính rieâng (U/mg) 37.53 134.60 3.58 4.2 Keát quaû phaàn khaûo saùt voû toâm Baûng 4.4 keát quaû kieåm tra nguyeân lieäu ban ñaàu Ñoä aåm (%) Haøm löôïng tro (%) Haøm löôïng Ca (%) Haøm löôïng P (%) Toång haøm löôïng proteine (%) 12.58 10.27 8.96 1.13 17.62 4.3 Ñoäng hoïc cuûa quaù trình thuyû phaân protein trong voû toâm baèng enyzme protease ôû caùc noàng ñoä 5%, 7%, 9% 4.3.1 Keát quaû ño haøm löôïng protein cuûa dòch loïc sau khi thuyû phaân (mg/g) 4.3.1.1 Ôû noàng ñoä enzyme 5% Baûng 4.5 keát quaû haøm löôïng proteine coøn laïi trong dòch loïc sau khi thuyû phaân ôû noàng ñoä enzyme 5% Thôøi gian (giôø) Nhieät ñoä (0C) 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 40 3.81 7.85 7.19 6.08 3.82 1.51 1.38 1.30 1.19 0.97 0.89 50 6.85 5.52 3.79 2.29 1.14 0.95 0.87 0.93 0.81 0.90 60 7.24 6.11 4.86 3.82 2.53 1.97 2.09 2.03 1.90 1.80 Hình 4.1 ñoä thò bieåu dieãn haøm löôïng proteine coøn laïi cuûa dòch loïc sau khi thuûy phaân ôû noàng ñoä enzyme 5% Nhaän xeùt: Döïa vaøo ñoà thò treân ta thaáy ôû nhieät ñoä 500C, haøm löôïng proteine hoaø tan coøn laïi trong dòch sau thuyû phaân enzyme thuyû phaân cho ra keát quaû toát nhaát, baèngchöùng laø haøm löôïng protein hoaø tan trung bình taïi 500C thaáp hôn 400C vaø 600C (2.54<3.27<3.47). Haøm löôïng proteine haøo tan coøn laïi trong dòch thuyû phaân ôû caùc thôøi gian khaùc nhau coù söï khaùc bieät veà phöông dieän thoáng keâ hoïc. Cuï theå laø haøm löôïng protein trung bình cao nhaát ôû maãu 2 giôø (7.31), thaáp nhaát ôû maãu 10 giôø (1.72) vaø caùc maãu sau 10 giôø khoâng coù söï khaùc bieät so vôùi maãu 10 giôø. Coù theå giaûi thích nhö sau: thôøi gian ñaàu (0 giôø), voû toâm chöa bò enzyme thuyû phaân neân haøm löôïng protein hoaø tan trong dòch loïc chæ laø haøm löôïng cuûa dòch chieát enzyme, haøm löôïng ño ñöôïc thaáp. Thôøi gian tieáp theo (2 giôø) haøm löôïng protein taêng vaø ñaït cöïc ñaïi, do voû toâm khoâ luùc naøy baét ñaàu bò röûa ra vaø hoaø vaøo dòch thuyû phaân, ñoàng thôøi ôû gian ñoaïn naøy coù theå enzyme chöa thuyû phaân hoaëc chæ thuyû phaân moät phaàn protein cuûa voû toâm, neân haøm löôïng protein ôû giai ñoaïn naøy cao nhaát (bao goàm protein cuûa dòch chieát enzyme vaø protein coøn laïi cuûa voû toâm). Töø 2 giôø trôû ñi thì haøm löôïng protein baét ñaàu giaûm maïnh. Ñieàu naøy laø do enzyme ñaõ thuyû phaân voû toâm taïo ra amino acid laøm cho haøm löôïng caùc chaát hoaø tan trong dòch loïc giaûm xuoáng vaø thôøi gian caøng daøi thì amino acid ñöôïc taïo ra caøng nhieàu, haøm löôïng protein hoaø tan caøng giaûm. Nhöng töø thôøi gian 10 giôø trôû ñi haøm löôïng protein hoaø tan khoâng giaûm nöõa, caùc giaù trò thôøi gian tieáp theo sau 10 giôø chæ coù haøm löôïng protein hoaø tan saáp xæ khoaûng 10 giôø vì luùc naøy protein trong voû toâm ñaõ heát, haøm löôïng protein ño ñöôïc luùc naøy chæ laø haøm löôïng protein coøn laïi cuûa enzyme sau khi thuyû phaân. Cuõng coù theå laø do tôùi thôøi gian 10 giôø thì hoaït tính cuûa enzyme baét ñaàu giaûm vaø maát haún neân khoâng thuyû phaân heát löôïng protein coøn laïi trong voû toâm. Nhö vaäy ôû noàng ñoä 5%, nhieät ñoä 500C, thôøi gian enzyme thuyû phaân toát nhaát laø 10 giôø. 4.3.1.2 Ôû noàng ñoä enzyme 7% Baûng 4.6 keát quaû haøm löôïng protein coøn laïi trong dòch loïc sau khi thuyû phaân ôû noàng ñoân enzyme 7% Thôøi gian (giôø) Nhieät ñoä (0C) 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 40 5.46 9.95 7.50 6.07 4.81 1.37 0.97 0.89 0.92 1.02 0.81 50 9.32 7.72 5.01 1.03 0.45 0.39 0.37 0.38 0.22 0.22 60 10.11 8.03 7.10 6.03 2.59 2.09 1.89 1.75 1.79 1.72 Hình 4.2 ñoà thò bieåu dieãn haøm löôïng protein coøn laïi cuûa dòch loïc sau khi thuyû phaân ôû noàng ñoä enzyme 7% Nhaän xeùt: döïa vaøo ñoà thò treân noàng ñoä 7% vaø 5% thì keát quaû thuyû phaân 500C laø toát nhaát vì haøm löôïng protein hoaø tan trung bình ôû 500C thaáp hôn 400C vaø 600C (2.78<3.62<4.42) Haøm löôïng protein hoaø tan trung bình ôû maãu 10 giôø cuõng thaáp nhaát (1.47) vaø caùc maãu sau 10 giôø khoâng coù söï khaùc bieät so vôùi maãu 10 giôø xeùt veà phöông dieän thoâng keâ hoïc. Nhö vaäy, noàng ñoä enzyme laø 7% thì nhieät ñoä vaø thôøi gian toái öu cho söï thuyû phaân cuõng laø 500C vaø 10 giôø. 4.3.1.3 Ở noàng ñoä enzyme 9% Baûng 4.7 keát quaû haøm löôïng protein coøn laïi trong dòch loïc sau khi thuyû phaân ôû noàng ñoä enzyme 9% Thôøi gian Nhieät ñoä (0C) 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 40 5.77 10.36 8.61 6.90 5.01 2.13 1.95 1.52 1.67 1.83 1.76 50 9.76 7.33 4.71 1.08 0.37 0.39 0.35 0.26 0.21 0.22 60 10.55 7.19 6.03 3.30 2.16 1.97 2.05 2.19 2.13 1.97 Hình 4.3 ñoà thò bieåu dieãn haøm löôïng protein coøn laïi cuûa dòch loïc sau khi thuyû phaân ôû noàng ñoä enzyme 9% Nhaän xeùt: döïa vaøo ñoà thò ta thaáy cuõng töông töï nhö ôû hai noàng ñoä 5% vaø 7% nhieät ñoä 500C vaø thôøi gian 10 giôø vaãn laø ñieàu kieän toái öu cho söï thuûy phaân enzyme. Nhaän xeùt chung: quaû 3 bieåu ñoà treân ta thaáy nhieät ñoä toái öu cho söï thuyû phaân laø 500C , thôøi gian thuyû phaân laø 10 giôø Haøm löôïng protein hoaø tan trung bình ô caùc noàng ñoä enzyme khaùc nhau 5%, 7%, 9% khoâng coù söï khaùc bieät xeùt veà phöông dieän thoáng keâ hoïc. Tuy nhieân neáu so saùnh veà nhieät ñoä vaø thôøi gian toái öu cho thuyû phaân thì ta thaáy haøm löôïng protein hoaø tan coøn laïi trong dòch sau thuyû phaân ôû noàng ñoä enzyme 7% thaáp hôn 5% vaø 9% neân ta coù theå choïn 7% laø noàng ñoä thích hôïp thaáp hôn 5% vaø 9% neân ta coù theå choïn 7% laø noàng ñoä thích hôïp cho thuyû phaân. Neáu ta taêng noàng ñoä enzyme vöôït quaù möùc toái thích thì toác ñoä phaûn öùng cuõng khoâng taêng, ñoâi khi coøn kieàm haõm toác ñoä phaûn öùng. Keát luaän: Töø nhöõng keát quaû treân ta thaáy. Ñeå quaù trình thuyû phaân ñaït cöïc ñaïi vaø ñeå tieát kieäm thôøi gian, enzyme ta seõ tieán haønh thuyû phaân ôû 500C, trong 10 giôø vôùi noàng ñoä enzyme laø 7%. 4.4 Keát quaû ño haøm löôïng protein toång soá cuûa maãu voû toâm sau caùc thôøi gian thuyû phaân (%) Ñaõ xaùc ñònh ñöôïc ñieàu kieän thích hôïp cho quaù trình thuyû phaân (nhieät ñoä 500C thôøi gian 10 giôø vaø noàng ñoä enzyme 7%) nhöng ñeå khaúng ñònh ñöôïc keát quaû treân ta tieán haønh xaùc ñònh haøm löôïng protein coøn laïi trong xaùc voû toâm sau khi thuyû phaân. 4.4.1 ÔÛ noàng ñoä enzyme 5% Baûng 4.8 keát quaû haøm löôïng protein toång soá cuûa maãu voû toâm sau khi thuyû phaân ôû noàng ñoä enzyme 5% Thôøi gian (giôø) Nhieät ñoä (0C) 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 40 17.07 15.60 13.13 10.84 6.17 2.84 2.61 2.55 2.47 2.37 2.38 50 14.23 11.16 7.71 4.87 1.52 1.45 1.38 1.41 1.36 1.30 60 16.38 14.12 11.44 9.37 8.07 5.58 5.26 5.23 5.13 5.02 Hình 4.4 ñoà thò bieåu dieãn haøm löôïng protein toång soá cuûa maãu voû toâm sau khi thuyû phaân ôû noàng ñoä enzyme 5% Nhaän xeùt: döïa treân ñoà thò ta thaáy haøm löôïng protein toång soá trung bình ôû giaù trò nhieät ñoä 500C thaáp hôn 400C vaø 600C (5.77<7.09<9.34). Haøm löôïng protein toång soá giaûm daàn theo thôøi gian ôû caû 3 nhieät ñoä 40,50,600C vaø thôøi ñieåm 10 giôø thì ngöng laïi khoâng giaûm nöõa. Vì luùc ñaàu (0 giôø) enzyme chöa kòp thuyû phaân neân haøm löôïng protein toång soá trong voû toâm coøn nhieàu. Khi ta keùo daøi thôøi gian thuyû phaân (töø 2 -10 giôø) thì löôïng protein toång soá trong voû toâm cuõng giaûm ñi. Vaø töø 10 giôø trôû ñi thì löôïng N toång soá khoâng giaûm nöõa do hoaït tính thuyû phaân cuûa enzyme ñaõ giaûm. Neáu ta vaãn tieáp tuïc keùo daøi thôøi gian thì haøm löôïng protein coøn laïi vaãn khoâng ñoåi. Nhö vaäy ôû nhieät ñoä 500C trong thôøi gian 10 giôø thì hoaït tính thuyû phaân cuûa enzyme ñaït giaù trò cao nhaát. 4.4.2 ÔÛ noàng ñoä 7% Baûng 4.9 keát quaû haøm löôïng protein toång soá cuûa maãu voû toâm sau khi thuyû phaân ôû noàng ñoä enzyme 7% Thôøi gian (giôø) Nhieät ñoä (0C) 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 40 16.96 14.47 12.60 9.82 5.16 1.97 1.71 1.83 1.72 1.79 1.91 50 13.55 10.23 5.95 1.88 1.76 1.63 1.71 1.81 1.44 1.55 60 15.16 13.98 11.8 9.58 5.28 4.99 5.02 4.73 4.86 4.48 Hình 4.5 đồ thị biểu diễn hàm lượng protein tổng số của mẫu vỏ toâm sau khi thủy phaân ở nồng độ 7% Nhaän xeùt: döïa vaøo ñoà thò cuõng töông töï ôû noàng ñoä 5% vaø 7% haøm löôïng protein coøn laïi ôû 500C thaáp hôn so vôùi 400C vaø 600C vaø giaûm daàn theo thôøi gian nhöng sau thôøi ñieåm 10 giôø thì haøm löôïng protein khoâng giaûm nöõa. Nhö vaäy, ôû noàng ñoä enzyme laø 7% thì ñieàu kieän thích hôïp cho thuyû phaân laø 500C vaø 10 giôø 4.4.3 ÔÛ noàng ñoä 9% Baûng 4.10 keát quaû haøm löôïng protein toång soá cuûa maãu voû toâm sau khi thuyû phaân ôû noàng ñoä enzyme laø 9% Thôøi gian (giôø) Nhieät ñoä (0C) 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 40 16.74 15.81 13.59 10.79 7.23 2.70 2.49 2.36 2.38 2.27 2.53 50 14.19 11.48 7.48 2.03 1.30 1.19 1.27 1.71 1.03 1.45 60 15.63 14.23 12.52 9.77 7.03 5.58 5.47 5.44 5.19 5.26 Hình 4.6 ñoà thò bieåu dieãn haøm löôïng protein toång soá cuûa maãu voû toâm sau khi thuyû phaân ôû noàng ñoä enzyme 9% Nhaän xeùt: döïa vaøo ñoà thò ta thaáy cuõng töông töï 2 noàng ñoä tröôùc, ôû noàng ñoä 9% ñieàu kieän thuyû phaân toát nhaát laø 500C, 10 giôø. Nhaän xeùt chung: haøm löôïng protein toång soá trung bình coøn laïi trong voû toâm sau khi thuyû phaân ôû noàng ñoä enzyme 7% thaáp hôn 5% vaø 9% Haøm löôïng protein toång soá trung bình coøn laïi trong voû toâm sau thuyû phaân ôû nhieät ñoä 500C thaáp hôn 40 0C vaø 600C Haøm löôïng protein trung bình coøn laïi trong voû toâm sau khi thuyû phaân ôû giaù trò thôøi gian laø 10 giôø laø thaáp nhaát vaø caùc giaù trò sau 10 giôø thì khoâng coù söï khaùc bieät veà phöông dieän thoáng keâ hoïc. Keát luaän Nhö vaäy keát quaû thí nghieäm ño haøm löôïng protein coøn laïi trong voû toâm sau thuyû phaân cho keát quaû hoaøn toaøn truøng khôùp vôùi keát quaû xaùc ñònh noàng ñoä protein hoaø tan protein coøn laïi trong dòch loïc sau thuyû phaân. Vì vaäy ta coù theå khaúng ñònh raèng ñieàu kieän toái öu cho söï thuyû phaân voû toâm baèng enzyme protease laø 500C thôøi gian laø 10 giôø vôi noàng ñoä enzyme laø 7% vaø seõ tieán haønh thuyû phaân voû toâm ñeå saûn xuaát chitosan vôùi caùc ñieàu kieän toái öu naøy. 4.5 Keát quaû cuûa saûn phaåm chitosan 4.5.1 Hieäu suaát thu hoài saûn phaåm Sau khi thuyû phaân 100g voû toâm, ta thu ñöôïc 20g chitosan Vaäy hieäu suaát (%) = 20% 4.5.2 Ñònh tính Caân 0.5g maãu hoaø trong 100ml dung dòch acid acetic 1%, sau ñoù laáy ra 10ml dung dòch vaø cho thuoác thöû KMnO4 vaøo, ta thaáy dung dòch chuyeån töø maøu tím sang maøu vaøng nhaït. Vaäy maãu thí nghieäm chính laø chitosan. 4.5.3 Caùc tính chaát lyù hoaù cuûa saûn phaåm chitosan Baûng 4.11 keát quaû kieåm tra saûn phaåm chitosan thu ñöôïc Maøu saéc Maøu traéng ngaø Ñoä aåm (%) 13.16 Ñoä hoaø tan (%) 80.46 Ñoä nhôùt (Pa.s) 0.57 Haøm löôïng tro (%) 1.63 Ñoä deacetyl hoaù (%) 80.56 Hình 4.7 chitosan ñöôïc thuyû phaân töø enzyme protease Nhaän xeùt: chaát löôïng cuûa chitin – chitosan ñöôïc ñaùnh giaù thoâng qua chaát löôïng chitosan cuûa coâng ty Protan – Biopolymer, laø moät trong nhöõng coâng ty lôùn treân theá giôùi (theo tpaï chí khoa hoïc vaø coâng ngheä thuyû saûn soá 2 – 1992) goàm caùc chæ tieâu sau: Ñoä aåm: 10% Ñoä tan: 100% Haøm löôïng tro: 15% Ñoä nhôùt: 0.2 Pa.s Hieäu suaát deacetyl: >80% Chitosan thu ñöôïc trong thí nghieäm treân coù keát quaû töông ñöông vôùi chaát löôïng chitosan cuûa coâng ty Protan – Biopolymer. Vì vaäy ta coù theå söû duïng chitosan naøy ñeå duøng trong vieäc khaûo saùt coá ñònh enzyme vaøo saûn phaåm. 4.6 Keát quaû cuûa quaù trình coá ñònh enzyme protease vaøo chaát mang chitosan baèng phöông phaùp nhoát 4.6.1 hieäu suaát coá ñònh Baûng 4.12 keát quaû kieåm tra haøm löôïng vaø hoaït tính cuûa cheá phaåm enzyme tröôùc vaø sau coá ñònh Haøm löôïng enzyme tröôùc coá ñònh (mg/g) Haøm löôïng enzyme sau coá ñònh (U/g) Hoaït tính enyzme tröôùc coá ñònh (mg/g) Hoaït tính enzyme sau coá ñònh (mg/g) Hoaït tính rieâng tröôùc coá ñònh (U/g) Hoaït tính rieâng sau coá ñònh (U/g) 37.53 24.79 134.60 81.45 3.58 3.03 Hieäu suaát coá ñònh haøm löôïng protein (%) 66 Hieäu suaát coá ñònh hoaït tính enzyme protease 60 Haøm löôïng protein coù trong 1g chaát mang (mg/g) 10.91 Hình 4.8 enzyme protease ñöôïc coá ñònh trong gel chitosan 4.6.2 Aûnh höôûng cuûa pH ñeán enzyme protease tröôùc vaø sau coá ñònh Baûng 4.13 keát quaû aûnh höôûng cuûa pH leân hoaït tính cuûa enzyme protease tröôùc vaø sau coá ñònh pH Hoaït tính enzyme tröôùc coá ñònh (U/g) Hoaït tính enzyme sau coá ñònh (U/g) 6 67.22 42.73 7 81.05 39.12 8 73.08 53.01 9 43.91 54.95 10 40.98 51.63 Hình 4.9 ñöôøng bieåu dieãn hoaït tính cuûa enzyme protease tröôùc vaø sau coá ñònh theo pH nhaän xeùt: hoaït tính cuûa enzyme tröôùc coá ñònh cao nhaát ôû pH 7 vaø giaûm daàn ôû pH trung tính (8,9,10). Coøn ñoái vôùi enzyme sau coá ñònh ta thaáy hoaït tính cuûa enzyme taêng daàn tôùi pH 9 môùi baét ñaàu giaûm xuoáng. pH toái thích cuûa enzyme sau coá ñònh coù xu höôùng chuyeån dòch veà phía pH kieàm (pH = 9). Vieäc naøy coù theå laø enzyme nhoát trong gel chitosan ñöôïc baûo veä bôûi lôùp maøng bao beân ngoaøi neân caáu truùc cuûa enzyme ít bò aûnh höôûng, vaû laïi baûn chaát cuûa enzyme ban ñaàu ñaõ hoaït ñoäng toát trong khoaûng pH kieàm neân enzyme sau coá ñònh coù xu höôùng chuyeån pH toái thích sang kieàm. 4.6.3 Aûnh höôûng cuûa nhieät ñoä ñeán enzyme protease tröôùc vaø sau coá ñònh Baûng 4.14 keát quaû aûnh höôûng cuûa nhieät ñoä leân hoaït tính cuûa enzyme tröôùc vaø sau coá ñònh Nhieät ñoä (0C) Hoaït tính enzyme tröôùc coá ñònh (U/g) Hoaït tính enzyme sau coá ñònh (U/g) 30 40.58 15.08 40 61.41 26.63 50 99.08 38.70 60 69.91 53.62 70 45.09 38.28 80 22.55 18.29 Hình 4.10 ñöôøng bieåu dieãn hoaït tính cuûa enzyme protease tröôùc vaø sau coá ñònh theo nhieät ñoä Nhaän xeùt: ñoái vôùi enzyme tröôùc coá ñònh ta coù theå thaáy hoaït tính cuûa enzyme chòu aûnh höôûng raát lôùn bôûi nhieät ñoä. Töø 30 – 500C thì hoaït tính cuûa enzyme taêng daàn vaø ñaït cöïc ñaïi ôû 500C, ñeàu naøy phuø hôïp vôùi quy luaät nhieät ñoä caøng taêng thì hoaït tính cuûa enzyme caøng taêng. Tuy nhieân töø 500C trôû ñi thì hoaït tính cuûa enzyme giaûm maïnh vaø giaûm raát nhanh. Ôû ñaây maëc duø nhieät ñoä taêng nhöng hoaït tính cuûa enzyme khoâng taêng nöõa maø laïi giaûm vì ôû nhieät ñoä > 500C vöôït quaù nhieät ñoä tôùi haïn cuûa enzyme neân toác ñoä phaûn öùng giaûm. Nhö vaäy chöùng toû enzyme protease ban ñaàu hoaït ñoäng raát keùm ôû nhieät ñoä cao. Ñoái vôùi enzyme coá ñònh thì hoaït tính cuûa enzyme cuõng taêng daàn töû 300C vaø ñaït giaù trò cöïc ñaïi ôû 600C. tuy nhieân töø 60 – 800C thì hoaït tính cuûa enzyme laïi giaûm maïnh. Ta coù theå deã daøng nhaän thaáy nhieät ñoä toái öu cuûa enzyme coá ñònh laø 600C cao hôn nhieät ñoä toái öu cuûa enyzme ban ñaàu laø 500C. ñieàu naøy coù theå giaûi thích laø do khi ta coá ñònh baèng phöông phaùp nhoát trong gel chitosan thì enzyme ñöôïc baûo veä bôûi heä gel cho neân enzyme coù khaû naêng beàn nhieät vaø chòu nhieät cao hôn. Tuy nhieân neáu tieáp tuïc taêng nhieät ñoä thì laøm cho lôùp gel chitosan bò bieán tính vaø laøm aûnh höôûng ñeán hoaït tính cuûa enzyme ñöôïc baûo veä beân trong neân hoaït tính luùc naøy cuûa enzyme giaûm maïnh. 4.6.4 Aûnh höôûng cuûa ñoä beàn nhieät ñeán enzyme tröôùc va sau coá ñònh Baûng 4.15 keát quaû aûnh höôûng cuûa ñoä beà nhieät leân hoaït tính cuûa enzyme tröôùc vaø sau coá ñònh Thôøi gian (phuùt) Hoaït tính enzyme tröôùc coá ñònh (U/g) Hoaït tính enzyme protease coøn laïi tröôùc coá ñònh (%) Hoaït tính enzyme sau coá ñònh (U/g) Hoaït tính enzyme protease coøn laïi sau coá ñònh (%) 0 105.85 100 89.90 100 10 88.47 83.58 76.55 85.15 20 80.11 75.68 74.94 83.35 30 60.89 59.98 60.48 67.27 40 42.57 40.22 49.21 54.74 50 30.77 29.07 45.65 50.78 60 24.01 22.68 44.29 49.27 70 13.37 12.64 41.76 46.45 80 9.97 9.42 37.16 41.33 Hình 4.11 ñöôøng bieåu dieãn hoaït tính cuûa enzyme protease tröôùc vaø sau coá ñònh theo ñoä beàn nhieät Nhaän xeùt: döïa vaøo ñoà thò ta coù theå thaáy hoaït tính cuûa enzyme protease giaûm daàn gaàn nhö tuyeán tính theo thôøi gian uû. Nhö vaäy thôøi gian caøng keùo daøi thì hoaït tính cuûa enzyme caøng giaûm. Ñoái vôùi enzyme coá ñònh, ôû 2 laàn uû ñaàu tieân (10 – 20 phuùt) hoaït tính cuûa enzyme vaãn coøn giöõ laïi raát cao. Tuy nhieân ôû caùc laàn uû tieáp theo thì hoaït tính cuûa enzyme coá ñònh laïi giaûm nhanh choùng. Hình 4.12 ñöôøng so saùnh phaàn traêm hoaït tính coøn laïi cuûa enzyme protease tröôùc vaø sau coá ñònh theo ñoä beàn nhieät Nhaän xeùt: theo ñoà thò vaø baûng keát quaû treân ta thaáy hoaït tính cuûa cheá phaåm enzyme protease tröôùc coá ñònh seõ giaûm daàn theo thôøi gian uû ôû 600C vaø giaûm hôn 50% so vôùi hoaït tính ban ñaàu ôû thôøi gian uû 40 phuùt. Neáu uû tieáp ôû thôøi gian 80 phuùt, hoaït tính seõ giaûm raát nhieàu vaø chæ giöõ laïi ñöôïc 9.42% so vôùi hoaït tính ban ñaàu. Nhö ôû phaàn khaûo saùt aûnh höôûng cuûa nhieät ñoä ñeán hoaït tính cuûa enzyme thì enzyme tröôùc coá ñònh hoaït ñoäng keùm ôû nhieät ñoä cao, vaø döïa vaøo keát quaû khaûo saùt ñoä beàn nhieät thì ta coù theå keát luaän raèng khaû naêng duy trì hoaït tính cuûa enzyme tröôùc coá ñònh ôû nhieät ñoä cao laø raát keùm. Coøn ñoái vôùi enzyme sau coá ñònh thì hoaït tính cuûa enzyme cuõng giaûm nhanh theo thôøi gian uû ôû 600C nhöng giaûm chaäm hôn so vôùi enzyme tröôùc coá ñònh. Ôû thôøi gian uû 60 phuùt thì hoaït tính cuûa enzyme coá ñònh ñaõ giaûm hôn moät nöõa (chæ coøn 49.27%) so vôùi hoaït tính ban ñaàu. Vaø thôøi gian uû tôùi 80 phuùt thì hoaït tính cuûa enzyme coá ñònh chæ coøn laïi 41.33%. nhö vaäy ôû gian ñoaïn ñaàu thì hoaït tính cuûa enzyme coá ñònh vaãn coøn cao, ñieàu naøy coù theå laø do lôùp chaát mang chitosan beân ngoaøi ñaõ baûo veä enzyme traùnh khoûi taùc ñoäng cuûa nhieät ñoä, nhöng thôøi gian uû keùo daøi laøm cho lôùp chitosan bò meàm ra neân khoâng coøn baûo veä ñöôïc enzyme laøm cho hoaït tính cuûa enzyme sau coá ñònh giaûm daàn theo thôøi gian uû. 4.7 keát quaû soá laàn taùi söû duïng cuûa enzyme coá ñònh Baûng 4.16 keát quaû khaûo saùt soá laàn taùi söû duïng cuûa enzyme coá ñònh Soá laàn taùi söû duïng Hoaït tính enzyme protease (U/g) Phaàn traêm coøn laïi (%) 1 55.16 100 2 54.23 98.3 3 38.65 91.09 4 34.51 81.34 5 27.83 65.6 6 18.16 42.8 7 15.56 36.68 Hình 4.13 ñöôøng bieåu dieãn hoaït tính enzyme protease theo soá laàn taùi söû duïng Hình 4.14 ñoà thò bieåu dieãn phaàn traêm hoaït tính enzyme protease coøn laïi theo soá laàn taùi söû duïng Nhaän xeùt: vieäc taùi söû duïng nhieàu laàn cuûa enzyme sau coá ñònh laø moät öu ñieåm raát coù giaù trò veà maët kinh teá cuûa enzyme coá ñònh. Tuy nhieân sau moãi laàn taùi söû duïng thì hoaït tính cuûa enzyme coá ñònh seõ giaûm vaø vieäc giaûm nhieàu hay ít laø vaán ñeà quan troïng haøng ñaàu. Döïa treân keát quaû khaûo saùt ta coù theå nhaän thaáy vieäc coá ñònh enzyme baèng gel chitosan cho hieäu suaát taùi söû duïng raát cao, tôùi laàn thöù 6 thì hoaït tính môùi giaûm hôn 50% ñieàu naøy chöùng toû laø lôùp gel chitosan raát vöõng chaéc, truøng khôùp vôùi keát quaû khaûo saùt ñoä beàn nhieät vaø keát quaû khaûo saùt aûnh höôûng cuûa nhieät ñoä ñeán hoaït tính enzyme sau coá ñònh cho thaáy vieäc baûo veä enzyme cuûa chitosan raát toát. Nhìn chung vieäc söû duïng chitosan laøm chaát gel ñeå nhoát enzyme cho keát quaû khaù toát neân coù theå aùp duïng trong thöïc teá coá ñònh enzyme hay teá baøo. Chöông 5 KEÁT LUAÄN VAØ ÑEÀ NGHÒ 5.1 keát luaän Vôùi keát quaû thu ñöôïc ta coù theå ñöa ra caùc keát luaän sau: Cheá phaåm enzyme thu ñöôïc coù hoaït tính vaø haøm löôïng cao nhaát khi tuûa baèng coàn 960 vôùi tyû leä theå tích dòch chieát enzyme : theå tích coàn = 1:4. Enzym protease cho keát quaû thuyû phaân trong ñieàu kieän: nhieät ñoä 500C, thôøi gian 10 giôø vôùi noàng ñoä enzyme 7%. Chitosan thu ñöôïc baèng phöông phaùp thuyû phaân protease töø naám moác Aspergillus oryzae coù chaát löôïng töông ñöông vôùi chitosan thöông maïi. Enzyme protease ñöôïc coá ñònh treân chaát mang baèng phöông phaùp nhoát: Hieäu suaát coá ñònh haøm löôïng protein (%): 66 Hieäu suaát coá ñònh hoaït tính protease (%): 60 Haøm löôïng protease coù trong 1g chaát mang (mg/g): 10.91 Hoaït tính rieâng (U/g): 3.03 5.2 Ñeà nghò Qua quaù trình thöïc hieän ñeà taøi chuùng toâi coù moät soá kieân nghò sau: Toái öu hoaù quaû trình thuyû phaân ñeå taêng hieäu suaát thu hoài saûn phaåm. Nghieân cöùu öùng duïng chitosan laøm giaù theå coá ñònh caùc loaïi enyzme khaùc. Töø ñoù ñeå hieåu roõ hôn veà khaû naêng coá ñònh enzyme cuûa chitosan. TAØI LIEÄU THAM KHAÛO Taøi lieäu tieáng vieät Döông Thò Höông Giang, Leâ Thanh Huøng, Voõ Vaên Song Toaøn, Sonia Beeckmans, Edibert Van Driesche vaø Traàn Phöôùc Ñöôøng. “Ñaùnh giaù caùc phöông phaùp ly trích enzyme bromelaine töø nöôùc khoùm khoâ”. Tuyeån taäp caùc coâng trình nghieân cöùu khoa hoïc, Tröôøng Ñaïi Hoïc Caàn Thô. Döông Thò Höông Giang. 2004. “Giaùo trình thöïc taäp coâng ngheä enzyme”. Tröôøng Ñaïi Hoïc Caàn Thô. Dieäp Quyønh Nhö, Nguyeãn Dieân Sanh. “Taøi lieäu thöïc taäp coâng ngheä enzyme vaø protein”. Vieän Sinh Hoïc Nhieät Ñôùi. Nguyeãn Ñöùc Löôïng. 2004. “Coâng ngheä enzyme”. Nhaø xuaát baûn Ñaïi Hoïc Quoác Gia Tp.HCM Nguyeãn Tieán Thaéng. 2003. “Moät soá kó thuaät phoøng thí nghieäm sinh hoïc”. Tuû saùch Vieän Sinh Hoïc Nhieät Ñôùi. Nguyeãn Tieán Thaéng. 2004. “Giaùo trình coâng ngheä enzyme”. Tuû saùch Tröôøng Ñaïi Hoïc Noâng Laâm Tp.HCM. Phaïm Thò Aùnh Hoàng. 2003. Kyõ thuaät sinh hoùa. Nhaø xuaát baûn Ñaïi Hoïc Quoác Gia Tp.HCM. Phaïm Leâ Duõng, Trònh Bình, Laïi Thu Hieàn vaø cuøng caùc coäng söï. 1997. “Vaät lieäu sinh hoïc töø chitin”. Vieän Hoaù Hoïc – Vieän Coâng Ngheä Sinh Hoïc, Trung taâm khoa hoïc vaø Coâng ngheä quoác gia Haø Noäi. Tröông Vónh. “Xaùc ñònh ñoä aåm vaø ñoä nhôùt”. Thöïc taäp moân hoïc: caùc quaù trình cô hoïc tuû saùch Tröôøng Ñaïi Hoïc Noâng Laâm Tp.HCM. Taøi lieäu tieáng Anh Tan et al.,”The chitosan yield .. .” Carbohydrate Polymers, 30:239-242,1996. Fortin et al.,“Elucidation of the Mechanism Involved... .” Biotechnology Letters, 12(12):913-918,1990 kubo et al., “Effects of the Cultivation .. .”Nippon Nogeikagaku kaishi, 66(11):1641-1643, 1992, English Abstract Only. McGahren et al., “ Chitosan by Fermentation,” Process Biochemistry, 19:88-90,1984 Rane et al., “Production of chitosan .. .” Food Biotechnology,7(1):11-33,1993 YoKoi et al.,”Chitosan Production from . ..”Journal of Fermentation and Bioengineering, 85(2):246-249,1998 Shapiro et al., “Biochemical and Biophysical Research Communications” 28(5):815-820 (1967) Yokoi, Haruhiko et al., “Chitosan Production from Shochu Distillery Wastewater by Funguses,” Journal of Fermention and Bioengineering, vol.85, No. 2, pp. 246-249, 1998 Zetelaki-Horvath, K. et al., “Kinetic Analysis of Protein Synthesis in Fungi, “ Acta Alimentaria, vol. 4, No.2, pp 181-188,1975 Yao Kangde, Yin Yuji, Cheng Guoxian, Zhou Jun. “Biomedical develoments in Chitosan – based polymers”. C.A, vol 130, No 13, pp 1052(172813, China),1999 Inui Hiroshi Appl. Biol. Sci., vol 2, No 2, pp 55-65, 1997