Khóa luận Sản xuất Chitin-Chitosan từ vỏ tôm và ứng dụng chitosan làm màng bao bảo quản cà chua

thời kỳ này và thông qua các phương pháp thúc chín thì quả chín không bình thường, quả không có hương vị, không có màu sắc đặc trưng của giống nên không thích hợp cho việc thu hái và bảo quản. - Thời kỳ chín xanh (Green): Chất keo bao quanh hạt được hình thành. Quả phát triển đầy đủ về kích thước, quả chưa có màu hồng hoặc màu vàng. Nếu đem thúc chín thì quả sẽ thể hiện màu sắc của giống. Do trong giai đoạn này khi trải qua quá trình chín quả sẽ chịu được nhiệt độ lạnh khác nhau nên không thích hợp cho bảo quản. - Thời kỳ chín vàng (Breaker): Đỉnh quả xuất hiện màu vàng hoặc màu hồng với diện tích bề mặt chiếm khoảng 10%. SVTH: BÙI THANH TRUNG TRANG 36 - Thời kỳ chuyển màu (Turning): Diện tích bề mặt từ 10-30% có màu vàng hoặc đỏ. - Thời kỳ chín hồng (Pink): 30-60% diện tích bề mặt quả có màu hồng nhạt hoặc màu vàng. Quả đạt độ chín cao nên đã trải qua các giai đoạn sinh lý quan trọng nên rất khó đánh giá hiệu quả của bảo quản thông qua các chỉ tiêu có liên quan tới các quá trình sinh lý như hô hấp, biến đổi màu sắc…Vì vậy dùng độ chín này để bảo quản trong thí nghiệm là không thích hợp. - Thời kỳ quả hồng hoặc đỏ (Light Red): 60-90% diện tích bề mặt quả có màu vàng hoặc đỏ. Quả chín quá nên không thể phân tích được hiệu quả bảo quản. - Thời kỳ quả chín đỏ (Red): Trên 90% diện tích bề mặt có màu đỏ. Trong thời kỳ này cũng không thể phân tích được hiệu quả bảo quản. Qua đánh giá cho thấy thích hợp nhất cho quá trình thu hái để bảo quản là khi quả đạt độ chín vàng (Breaker) và thời kì chuyển màu (Turning). Để chọn ra một độ chín thích hợp nhất cho bảo quản bằng chitosan, tôi đã tiến hành làm thí nghiệm khảo sát sơ bộ: thu hái hai độ chín dự kiến và tiến hành nhúng vào dung dịch chitosan đã chuẩn bị để bảo quản. Bảo quản ở cùng một điều kiện trong phòng thí nghiệm. Sau 14 ngày trên cơ sở đánh giá màu sắc, trạng thái sơ bộ rút ra được một số kết luận sau:  Hai độ chín khảo sát đều có màu biến đổi đồng đều.  Quả ở độ chín vàng có độ cứng cao hơn. Như vậy cả hai độ chín đều thích hợp cho việc đánh giá hiệu quả bảo quản, song độ chín vàng (Breaker) cho thời gian bảo quản lâu hơn do quả còn “xanh” hơn thời kỳ chuyển màu (Turning). Vì vậy độ chín thích hợp cho việc bảo quản cũng như đánh giá hiệu quả bảo quản bằng chitosan là thời kỳ chín vàng (Breaker). Tuy nhiên đây mới chỉ là những khảo sát sơ bộ do thời gian nghiên cứu chưa đáp ứng được, vì vậy một kiến nghị cho việc khảo sát chính xác độ chín của cà chua phù hợp nhất cho việc bảo quản bằng chitosan là cần thiết. SVTH: BÙI THANH TRUNG TRANG 37 3.3. Chitosan và các nồng độ tạo màng bao Chitosan phục vụ thí nghiệm được cung cấp từ trường Đại Học Thủy Sản Nha Trang- (Nguyễn Đình Chiểu, Nha Trang, Khánh hòa, Việt Nam) có những đặc tính sau Bảng 3.1: Đặc tính của chitosan Đặc tính Giá trị Độ ẩm 10% Hàm lượng ion Ca2+ 0.01% Độ nhớt 265cps Hàm lượng chất không tan 0.18% Hàm lượng Nitơ tổng số 8,42% Độ Deacetyl 87.8% Độ tan (trong dung dịch CH3COOH 1%) 99,82% Phản ứng Biure Âm tính Hàm lượng chitosan 89,82% Qua các tài liệu nghiên cứu đã chỉ ra rằng chitosan tan tốt trong dung dịch axit axetic 1%. Thí nghiệm đã tiến hành pha chitosan trong dung dịch axit axetic 1% để thu được dung dịch chitosan: 0.5%, 1.0%, 1.5%, 2.0%, 2.5% ở các nồng độ này chitosan đều tan hết sau 24h cho dung dịch trong có màu vàng ngà nhạt, dung dịch không có vẩn đục hay vón cục. Độ nhớt tăng lên theo nồng độ của chitosan. Riêng dung dịch chitosan ở nồng độ 3.0% chitosan không tan hết và có vón cục. Nên ở nồng độ 3.0% chitosan không tan hết trong dung dịch axit axetic 1%. Để xác định chitosan thích hợp làm màng bao theo thí nghiệm được cung cấp từ trường Đại Học Thủy Sản Nha Trang- (Nguyễn Đình Chiểu, Nha Trang, Khánh Hòa, Việt Nam) tiến hành thí nghiệm theo sơ đồ sau : SVTH: BÙI THANH TRUNG TRANG 38 Hình 3.1: Sơ đồ bố trí tiến hành thí nghiệm  Qua sơ đồ bố trí thí nghiệm trên các tác gái kết luận rằng nồng độ chitosan ở 1.5% và 2% thì cho kết quả tốt nhất với tỉ lệ hao hụt thấp, màu sắc sản phẩm đẹp, thời gian bảo quản được kéo dài . 3.4. Khảo sát sơ bộ số lần nhúng chitosan phù hợp cho bảo quản Dung dịch chitosan có độ nhớt nên có khả năng bám dính trên bề mặt quả cà chua và tạo màng khi để khô. Tuy nhiên do bề mặt quả nhẵn nên khó tạo điều kiện tốt cho việc tạo một lớp màng đều trên bề mặt quả, vì thế sẽ ảnh hưởng không nhỏ tới hiệu quả cũng như sự đánh giá khả năng ứng dụng chitosan trong bảo quản cà chua. Nhiệt độ lạnh 12-13 o C Nhiệt độ thường Xác định các chỉ tiêu: Hao hụt khối lượng, đường khử, axit, vi sinh vật tổng số, chất khô hoà tan, mằu sắc, độ cứng, cường độ hô hấp, cảm quan. Nhận xét-Kết luận Lựa chọn-Rửa sạch Để khô 0.5% 1.0% 1.5% 2.0% 2.5% Bảo quản Nhúng vào dung dịch chitosan 0% SVTH: BÙI THANH TRUNG TRANG 39 Do thời gian còn hạn chế nên việc đánh giá số lần nhúng chỉ dựa trên sự quan sát lớp màng tạo được trên bề mặt quả sau khi nhúng vào chitosan và để khô. Qua khảo sát nhận thấy rằng: với chỉ 1 lần nhúng thì ở tất cả các nồng độ màng chitosan tạo được đều không đều (soi nghiêng trên ánh sáng thấy những vệt loang không bao phủ toàn bộ bề mặt quả). Các nồng độ 0.5%; 1.0% do độ nhớt của các dung dịch này thấp nên phải nhúng đến lần thứ 3 thì màng chitosan mới bao phủ hết toàn bộ bề mặt quả, sau mỗi lần nhúng để khô trong 15 phút. Các nồng độ 1.5%; 2.0%; thì nhúng 2 lần, riêng ở nồng độ 2.5% do độ nhớt khá cao nên chỉ cần nhúng một lần là màng chitosan đã bao phủ toàn bộ bề mặt quả. 3.5. Điều kiện bảo quản 3.5.1. Bảo quản ở nhiệt độ thường Quả được bảo quản và theo dõi ở môi trường phòng thí nghiệm với nhiệt độ biến đổi trong khoảng từ 22-28 0C độ ẩm nằm trong khoảng 80-85% (Điều kiện khí hậu biến đổi từ tháng 2 tới tháng 5). 3.5.2. Bảo quản ở nhiệt độ lạnh Theo dõi ảnh hưởng của chitosan kết hợp với bảo quản lạnh bằng cách bảo quản trong ngăn dưới tủ lạnh với nhiệt độ trong khoảng 12-130C là khoảng nhiệt độ tối ưu để bảo quản cà chua. Trong điều kiện tủ lạnh để khống chế nhiệt độ này cần hạn chế việc mở tủ thường xuyên và luôn duy trì độ ẩm 90%. 3.6. Biến đổi độ cứng của quả trong quá trình bảo quản Trong quá trình bảo quản trong quả protopectin bị thủy phân thành pectin hòa tan làm cho quả mềm dần. Thí nghiệm được thực hiện với các nồng độ chitosan nhu bên dưới và chỉ dùng một lần nhúng. 3.6.1 Biến đổi độ cứng trong mẫu bảo quản thường Kết quả đo độ cứng mẫu bảo quản thường được biểu diễn thông qua biểu đồ sau: Bảng 3.2: Biến đổi độ cứng (mẫu bảo quản thƣờng- kg/cm2) SVTH: BÙI THANH TRUNG TRANG 40  Nhận xét: Với mẫu đối chứng (0%) độ cứng giảm rất nhanh sau 15 ngày đầu tiên bảo quản (từ 5.5-1.2 kg/cm2). Do trong giai đoạn này quả chín rất nhanh nên lượng protopectin có trong quả xanh bị biến đổi rất nhiều. Diễn biến này cũng trùng với thời kỳ quả hô hấp mạnh nhất (trình bày trong phần biến đổi cường độ hô hấp) nên các hợp chất bị biến đổi nhanh chóng. Sau 20 đến 25 ngày bảo quản quá trình giảm độ cứng diễn ra chậm dần do lượng protopectin có sẵn trong quả xanh ban đầu không còn nhiều và giai đoạn này hô hấp của quả cũng giảm dần, quả bắt đầu bị biến phân hủy sâu sắc và hư hỏng. Các mẫu 0.5%; 1.0% cũng biến đổi tương tự mẫu đối chứng nhưng độ cứng của quả ở cùng thời điểm luôn cao hơn. Chứng tỏ khi bảo quản bằng chitosan quả có cứng hơn khi không dùng. Với mẫu 1.5% và 2.0% thì ban đầu sau 15 ngày bảo quản thì độ cứng của mẫu 2.0% giảm nhanh hơn mẫu 1.5% nhưng sau đó thì mẫu 2.0% giảm ít hơn nhiều so với mẫu 1.5% điều này có thể được giải thích do cường độ hô hấp ban đầu của mẫu 2% diễn ra mạnh hơn mẫu 1.5% nhưng sau đó quá trình này bị hạn chế dẫn tới độ cứng của quả ít biến đổi hơn. Riêng mẫu 2.5% thì ban đầu độ cứng biến đổi ít nhất nhưng sau 25 ngày bảo quản thì độ cứng giảm thấp hơn mẫu 2.0%  Kết luận: Nồng độ Ngày 0% 0.50% 1.00% 1.50% 2.00% 2.50% 0 5.5 5.5 5.5 5.5 5.5 5.5 6 3.13 2.86 3 3.8 3.5 4 15 1.166 2.25 2.25 2.733 2.433 3.6 25 0.5 1.9 1.875 1.833 2.5 2.366 SVTH: BÙI THANH TRUNG TRANG 41  Nhìn vào biểu đồ ta có thể nhận thấy ở cùng một thời điểm thì biên độ thay đổi độ cứng của mẫu có dùng chitosan so với mẫu đối chứng là rất rõ rệt. Điều này chứng tỏ chitosan có thể làm giảm sự biến đổi độ cứng của quả.  Hiệu quả làm giảm sự biến đổi độ cứng quả cà chua khi bảo quản bằng màng chitosan có nồng độ 2% và 2.5% là tốt nhất. 3.6.2 Biến đổi độ cứng mẫu bảo quản lạnh Độ cứng của mẫu bảo quản lạnh cũng được đo bằng máy đo độ cứng ở thời điểm ban đầu, sau 6 ngày, 15 ngày, 30 ngày bảo quản. Khi bảo quản cà chua bằng chitosan kết hợp với bảo quản ở nhiệt độ lạnh thì độ cứng của quả biến đổi ít hơn so với bảo quản ở nhiệt độ thường. So sánh với sự biến đổi độ cứng của mẫu bảo quản thường ta thấy mẫu bảo quản lạnh biến đổi ít hơn ở cùng thời điểm với tất cả các nồng độ. Điều này là do tác dụng hạn chế hô hấp và biến đổi chất trong môi trường bảo quản lạnh, ở nhiệt độ lạnh tất cả các quá trình sống của quả diễn ra chậm hơn ở nhiệt độ cao và vấn đề này đã được rất nhiều nghiên cứu chứng minh. 3.7. Qúa trình biến đổi màu sắc quả Khi chín cà chua chuyển dần từ màu xanh sang màu vàng rồi màu đỏ. Điều này là do clorophil chuyển thành carotin…tạo nên màu sắc của quả chín. Tốc độ biến đổi các thành phần hóa học trong đó có biến đổi về màu sắc tỷ lệ thuận với cường độ hô hấp. Màu sắc của quả được khảo sát thông qua sự sai khác về màu (ΔE) trước và sau thời gian bảo quản, được xác định bằng máy đo màu. Đánh giá tại thời điểm ban đầu và sau 6 ngày, 15 ngày, 25 ngày bảo quản. Thời gian bảo quản càng lâu thì màu sắc biến đổi càng nhiều do quả càng chín. Do quá trình chín tỉ lệ thuận với cường độ hô hấp nên màu sắc quả biến đổi điều này có được là do cường độ hô hấp khi bảo quản bằng chitosan được hạn chế hơn. SVTH: BÙI THANH TRUNG TRANG 42 Nhưng ở đây chủ yếu là hô hấp yếm khí do màng chitosan quá dày đã hạn chế tối đa lượng khí oxi trao đổi với quả và tới ngưỡng làm quá trình hô hấp yếm khí xảy ra mạnh mẽ kết hợp với lượng nhiệt sinh ra không tỏa ra ngoài một cách hiệu quả nên quả biến đổi nhiều hơn các mẫu khác. Để so sánh ảnh hưởng của màng chitosan trong bảo quản thường kết hợp với bảo quản lạnh tới cường độ màu của cà chua chúng tôi đã tiến hành đo sự biến thiên cường độ màu tại cùng một thời điểm (15 ngày sau bảo quản) ở cả hai chế độ bảo quản lạnh và bảo quản thường và kết quả thu được như sau: Qúa trình bảo quản cà chua bằng chitosan ở nhiệt độ thường và nhiệt độ lạnh thì khả năng làm giảm sự biến đổi màu sắc khi kết hợp với bảo quản lạnh là rất rõ rệt. Ta thấy sự biến đổi màu của mẫu bảo quản lạnh đều thấp hơn mẫu bảo quản thường. Như vậy ở nhiệt độ thấp cường độ hô hấp giảm hẳn đã làm màu sắc quả biến đổi ít hơn, điều này một lần nữa minh chứng cho sự phụ thuộc của sự biến đổi màu sắc vào cường độ hô hấp. Như vậy khả năng làm giảm cường độ hô hấp của màng chitosan đã được chứng minh một phần thông qua màu sắc quả khi bảo quản.  Kết luận:  Màng chitosan có khả năng làm giảm sự biến đổi màu quả một cách rõ rệt.  Sự kết hợp màng chitosan với bảo quản lạnh làm giảm sự biến đổi màu sắc ở tất cả các nồng độ.  Ở nồng độ 2.0% màng chitosan cho hiệu quả làm giảm khả năng biến đổi màu tốt nhất của quả cà chua ở cả 2 chế độ bảo quản lạnh và bảo quản thường. 3.8.Ảnh hƣởng của màng chitosan tới cƣờng độ hô hấp của cà chua Khi bảo quản mọi rau quả khác cũng như cà chua luôn có các hoạt động sống, trao đổi chất. Trong đó điển hình nhất là quá trình hô hấp đó cơ bản là quá trình sử dụng các hợp chất đã được tổng hợp khi quả còn ở trên cây để duy trì sự sống của quả. SVTH: BÙI THANH TRUNG TRANG 43 Cà chua khi bảo quản phụ thuộc vào thành phần không khí bên ngoài mà sự hô hấp có thể là hiếu khí hoặc yếm khí. Cả hai quá trình này đều làm biến đổi các chất trong quả, nhưng hạn chế tối đa hô hấp yếm khí và giữ hô hấp hiếu khí ở mức tối thiểu đó chính là bài toán tối ưu của phương pháp bảo quản này. Chitosan là chất có khả năng tạo màng, tùy theo nồng độ mà khả năng thấm khí (O2) của chúng khác nhau, và khi làm màng bao thì khả năng điều chỉnh hô hấp của chúng theo đó cũng khác nhau. Để đánh giá khả năng điều chỉnh hô hấp của màng chitosan, thông qua các kết quả nghiên cứu về độ cứng, biến đổi màu và hao hụt khối lượng chúng tôi nhận thấy nồng độ chitosan cho kết quả tốt là 1,5% và 2,0%, kết hợp với điều kiện thiết bị không cho phép. Vì vậy trong phần nghiên cứu xác định cường độ hô hấp của quả chỉ xác định tại ba mẫu: mẫu đối chứng, mẫu 1.5 % và mẫu 2.0 % với cùng thời gian và điều kiện bảo quản (nhiệt độ thường).  Kết quả thu được như sau: Cƣờng độ hô hấp 0 10 20 30 40 50 60 0 2 4 6 8 10 12 14 16 ngày m g C O 2 /k g. h Mẫu DC Mẫu 1,5% Mẫu 2% Hình 3.2: Ảnh hƣởng của màng chitosan tới cƣờng độ hô hấp  Nhận xét: Nhìn vào biểu đồ ta thấy cà chua là loại quả có hô hấp đột biến (Climacteric). Cường độ hô hấp biến đổi lên xuống theo thời gian bảo quản. SVTH: BÙI THANH TRUNG TRANG 44 Tất cả các nồng độ biểu đồ đều giống nhau, chứng tỏ diễn biến hô hấp của chúng là như nhau nhưng chỉ khác nhau về cường độ. Ban đầu do quả còn ương nên cường độ hô hấp giảm dần trong 4 ngày đầu bảo quản giai đoạn này là thời kỳ ngủ tĩnh của quả, quả kết thúc giai đoạn tích lũy dinh dưỡng như khi còn trên cây mẹ và chuẩn bị quá trình chín nên các phản ứng tổng hợp diễn ra chậm hơn và lượng CO2 thoát ra giảm đi. Sau thời gian ngủ tĩnh hô hấp bắt đầu tăng lên và quả bắt đầu chín. Lúc này hàng loạt các phản ứng mà chủ yếu là các phản ứng phân hủy (chủ yếu là phân hủy đường) và biến đổi chất này thành chất khác (tinh bột biến thành đường) xảy ra mạnh mẽ và lượng CO2 thoát ra nhiều. Cường độ hô hấp đạt cực đại (điểm climacteric cực đại) sau 8 ngày bảo quản lúc này quả chín hoàn toàn. Trái cây sau khi chín hoàn toàn thì bắt đầu giai đoạn phân hủy và chết. Giai đoạn này chủ yếu là các phản ứng tự phân không không sinh ra nhiều CO2. Cường độ hô hấp giảm dần sau 9 ngày bảo quản. Dựa vào biểu đồ ta thấy mẫu 2.0 % có cường độ hô hấp thấp nhất, ở giai đoạn hô hấp cực đại mẫu 1.5 % có cường độ hô hấp mạnh hơn mẫu đối chứng nhưng ở giai đoạn sau thì thấp hơn. Điều này có thể giải thích như sau: Màng chitosan 1.5% có khả năng tích luỹ khí ethylen sinh ra do quá trình hô hấp nhiều hơn mẫu 2% nên khả năng kích thích của khí này tới các hệ enzyme hô hấp, đặc biệt là amylaza làm chuyển hoá tinh bột thành đường, lượng đường tăng lên làm cho hô hấp và quá trình chín tăng lên. Ở mẫu 2% khí ethylen cũng được tích luỹ song do màng chitosan dầy hơn nên lượng O2 cung cấp cho hô hấp ít hơn nên hô hấp vẫn thấp hơn. Do màng chitosan có khả năng thấm khí nên lượng không khí trao đổi giữa môi trường và quả bị thay đổi dẫn tới cường độ hô hấp thay đổi. Cường độ hô hấp càng thấp quả càng chín chậm hơn. Mẫu 2.0 % có khả năng làm giảm cường độ hô hấp tốt nhất, quá trình thấm khí O2 và thoát CO2 tránh yếm khí diễn ra rất có lợi cho bảo quản. Thời kỳ hô hấp cực đại của mẫu đối chứng diễn ra lâu hơn hai mẫu còn lại là do nhu cầu O2 luôn được đáp ứng từ môi trường, trong khi đó do có khả năng thấm SVTH: BÙI THANH TRUNG TRANG 45 khí từ từ nên lượng này cung cấp cho quả ở mẫu 1.5 % và mẫu 2.0 % bị hạn chế hơn. Cường độ hô hấp của mẫu 2.0 % thấp nhất chứng tỏ lượng O2 vẫn đủ duy trì hô hấp hiếu khí và không xảy ra hô hấp yếm khí.  Kết luận:  Màng chitosan có khả năng làm biến đổi thành phần không khí cung cấp cho quá trình hô hấp của quả.  Màng chitosan nồng độ 2.0 % có khả năng hạn chế hô hấp ở mức thấp nhất. Quả chín chậm nhất.  Màng chitosan 2.0 % không làm quả bị hô hấp yếm khí mạnh mẽ. 3.9. Biến đổi hàm lƣợng acid chung trong quá trình bảo quản Acid cũng tham gia một phần rất nhỏ vào quá trình hô hấp, nhưng chủ yếu là quá trình tổng hợp nên acid là hợp chất trung gian của các quá trình. Các giai đoạn phát triển khác nhau cho hàm lượng acid biến đổi khác nhau. Để đánh giá sự ảnh hưởng của màng bao chitosan tới hàm lượng acid chung khi bảo quản cà chua tác giả đã tiến hành đo ở tất cả các nồng độ sau mỗi 5 ngày bảo quản đối với mẫu bảo quản thường.  Nhận xét: Tất cả các mẫu đều có sự biến thiên hàm lượng acid chung giống nhau và chỉ khác nhau về cường độ. Những ngày đầu của quá trình bảo quản hàm lượng acid tăng lên nhanh chóng, sau 5 ngày bảo quản hàm lượng acid đạt cực đại. Do ban đầu khi quả còn xanh và bắt đầu chuyển sang giai đoạn chín, các hoạt động hóa sinh xảy ra mạnh mẽ, cường độ hô hấp chưa cao nên lượng acid được tổng hợp không bị mất đi. Chính vì vậy cùng với quá trình chín của quả thì hàm lượng acid tăng lên. Sau khi đạt cực đại thì hàm lượng acid bắt đầu giảm xuống (sau 5 ngày bảo quản) do lúc này cường độ hô hấp bắt đầu tăng mạnh mẽ, các chất hữu cơ dự trữ tham gia nhiều vào quá trình hô hấp. Sau giai đoạn này lượng acid lại tăng lên rất SVTH: BÙI THANH TRUNG TRANG 46 nhanh cho đến cuối giai đoạn bảo quản. Do trong quá trình hô hấp một số acid là các hợp chất hữu cơ trung gian được hình thành làm độ chua của quả tăng lên và quả càng chín thì độ chua càng tăng. Điều này cũng một phần là do hàm lượng đường khử đã được sử dụng phần lớn cho hô hấp. Và một số quá trình phân hủy khi quả hư hỏng cũng sinh ra acid (Protein tự phân hủy cũng tạo ra acid, sự thủy phân đường, chất béo có nhiều trong hạt cà chua thành những mảnh 2 cacbon trong chu trình Kreb cũng tạo ra những hợp chất trung gian là các acid hữu cơ) . Như vậy quả chín càng nhanh thì lượng acid càng tăng, cho tới khi quả bị hư hỏng. Ta thấy nồng độ chitosan trong mẫu bảo quản cà chua càng cao thì cường độ biến đổi acid chung lớn nhất điều này cho ta thấy do màng chitosan quá đặc nên sự khuếch tán khí oxi từ môi trường vào bị hạn chế làm quả hô hấp yếm khí, thực chất là các quá trình phân hủy không có mặt của oxi, kết quả của quá trình này tạo ra nhiều chất trung gian, trong đó phải kể đến là các nhóm rượu và acid hữu cơ. Ban đầu thì acid ở tất cả các mẫu còn lại đều tăng với tỉ lệ khác nhau không nhiều. Đây vẫn là thời kỳ tích lũy của quả xanh nên màng chitosan không ảnh hưởng nhiều tới kết quả đó. 3.10. Biến đổi hàm lƣợng đƣờng khử trong quá trình bảo quản Trong quá trình hô hấp cả hiếu khí và yếm khí cơ chất được sử dụng chủ yếu là các đường khử (chủ yếu là Glucoza), nhưng cùng với quá trình này là sự biến đổi các polysacaride khác mà quan trọng nhất là tinh bột chuyển hóa thành đường nhờ các enzyme thủy phân.  Kết quả biến đổi hàm lượng đường khử được mô tả thông qua biểu đồ sau: SVTH: BÙI THANH TRUNG TRANG 47 0 1 2 3 4 5 6 0 5 10 15 20 25 30 Ngày bảo quản % đ ƣờ ng k hử 0% 0.50% 1% 1.50% 2.00% 2.50% Hình 3.3: Biến đổi đƣờng khử theo thời gian bảo quản (mẫu bảo quản thƣờng)  Nhận xét: Hàm lượng đường khử biến thiên rất nhiều theo thời gian bảo quản. Sau 6 ngày đầu bảo quản lượng đường khử giảm xuống thấp nhất là do trong giai đoạn quả còn xanh lượng đường khử trong quả không nhiều, các enzyme thủy phân vẫn còn nằm ở dạng liên kết nên tinh bột chưa bị chuyển hóa thành đường, mặt khác trong giai đoạn này hô hấp bắt đầu tăng lên, quả không còn ở giai đoạn ngủ tĩnh nên lượng đường giảm đi nhanh chóng. Hàm lượng đường khử bắt đầu tăng lên khi hô hấp giảm đi và tới 14 ngày thì đạt cực đại, điều này trùng khớp với thời điểm hô hấp giảm mạnh. Mặt khác trong giai đoạn này các enzyme đã bị hoạt hóa và quá trình chuyển hóa tinh bột thành đường diễn ra mạnh mẽ. Sau khi đạt cực đại hàm lượng đường khử giảm xuống ở tất cả các mẫu tương ứng với thời kỳ phân hủy của quả. Lúc này quá trình phân hủy đường diễn ra chiếm ưu thế hơn hẳn quá trình tổng hợp. Quả bắt đầu đi vào giai đoạn hư hỏng. Ta thấy mẫu bảo quản cà chua bằng chitosan với nồng độ 2.0 % sau thời gian bảo quản có hàm lượng đường khử vẫn cao, điều này có được là do hô hấp của mẫu này bị hạn chế hơn so với các mẫu khác, hô hấp hiếu khí không xảy ra vì nếu xảy ra SVTH: BÙI THANH TRUNG TRANG 48 thì lượng đường sử dụng cho hô hấp tăng lên làm cho tổng lượng đường khử giảm đi. Ở mẫu đối chứng sau thời gian bảo quản hàm lượng đường khử giảm đi nhanh chóng do sau quá trình hô hấp quả chuyển sang giai đoạn phân huỷ (quá chín). Điều này một lần nữa chứng tỏ tác dụng của màng bao chitosan tới quá trình bảo quản. Sau 8 ngày bảo quản khi hô hấp của mẫu 2.0 % đạt cực đại thì lượng đường khử giảm, nhìn vào biểu đồ ta thấy mẫu đối chứng lượng đường khử giảm nhiều nhất, mẫu 2.0 % lại có xu hướng tăng là do hô hấp bị hạn chế hơn.  Kết luận:  Sau thời gian bảo quản hàm lượng đường khử mẫu 2.0 % là nhiều nhất.  Cũng tại điểm Climacteric lượng đường khử của mẫu đối chứng thấp nhất chứng tỏ hô hấp mạnh nhất. Như vậy tác dụng của màng chitosan tới cường độ hô hấp lại một lần nũa được khẳng định. 3.11. Hao hụt khối lƣợng trong quá trình bảo quản Trong quá trình bảo quản có những biến đổi và phản ứng xảy ra hết sức phức tạp, những biến đổi sinh hóa này không những làm thay đổi về chất mà còn dẫn tới biến đổi nhiều về lượng. Cà chua là một loại quả có chứa nhiều nước (84%-88%) nên luôn xảy ra hiện tượng bay hơi nước ra môi trường bên ngoài, bên cạnh đó có quá trình hô hấp của quả làm giảm hàm lượng chất khô. Cả hai yếu tố này đều làm hao hụt khối lượng của quả trong suốt quá trình bảo quản, trong đó 75-85% sự giảm khối lượng là do bay hơi nước còn lại là do hô hấp làm tiêu hao hàm lượng chất khô. 3.11.1 Hao hụt khối lượng mẫu bảo quản lạnh Để khảo sát sự hao hụt khối lượng khi bảo quản, tôi đã dùng phương pháp cân khối lượng quả trước và sau mỗi thời gian bảo quản, sự hao hụt được đánh giá theo phần trăm khối lượng.  Nhận xét: SVTH: BÙI THANH TRUNG TRANG 49 Thời gian bảo quản càng lâu thì khối lượng hao hụt càng nhiều, điều này xảy ra ở tất cả các mẫu. Nồng độ chitosan trong màng bao càng lớn thì khối lượng hao hụt càng ít, do màng bao càng dầy và kín nên sự bay hơi nước ra ngoài môi trường bị hạn chế. Ngoài ra còn kể tới cường độ hô hấp bị hạn chế một phần nên khối lượng quả cũng ít mất đi. Ở bất kỳ thời điểm bảo quản nào mẫu 2.0 % và mẫu 2.5 % cũng có hao hụt ít nhất, chứng tỏ màng bao kín và hạn chế tốt sự bay hơi nước của quả. Sau 21 ngày bảo quản thì mẫu 2.0 % và mẫu 2.5 % chỉ mất đi 3.34%. Điều này đã nói lên tính hiệu quả của màng chitosan tới việc ngăn chặn khả năng bay hơi nước của quả ra ngoài môi trường.  Kết luận:  Màng chitosan có khả năng làm giảm đáng kể sự hao hụt khối lượng quả khi bảo quản.  Nồng độ chitosan càng cao thì khả năng hạn chế hao hụt khối lượng càng nhiều. Mẫu 2.0 % và mẫu 2.5 % ít hao hụt khối lượng nhất. 3.11.2. Hao hụt khối lượng mẫu bảo quản thường  Nhận xét: Thời gian bảo quản càng dài thì khối lượng mất đi càng nhiều. Ở cùng một thời điểm mẫu bảo quản thường mất nhiều khối lượng hơn mẫu bảo quản lạnh ở tất cả các nồng độ. Điều này chứng tỏ hiệu quả của bảo quản lạnh tới độ hao hụt khối lượng. Do trong điều kiện bảo quản lạnh của thí nghiệm có độ ẩm không khí lạnh lớn hơn nên chênh lệch độ ẩm giữa quả và môi trường ngoài ít đi và động lực bay hơi nước giảm đi. Tại cùng một thời điểm bảo quản khối lượng bị mất đi tỉ lệ nghịch với nồng độ chitosan là do màng chitosan ngăn cản sự bay hơi và hạn chế một phần hô hấp.  Kết luận:  Màng chitosan có khả năng hạn chế sự bay hơi nước của quả. SVTH: BÙI THANH TRUNG TRANG 50  Nồng độ chitosan càng cao hao hụt khối lượng càng ít.  Cà chua được bảo quản lạnh hao hụt ít hơn bảo quản ở điều kiện thường.  Màng chitosan có nồng độ thích hợp khoảng 1.5%; 2.0 % và 2.5% có khả năng làm giảm sự mất khối lượng ít nhất. 3.12. Biến đổi chất khô hòa tan theo thời gian bảo quản Trong quá trình bảo quản chất khô hòa tan của quả biến đổi do hai quá trình ngược nhau xảy ra đồng thời: quá trình hô hấp và các phản ứng sinh hóa khác làm giảm chất khô hào tan cùng với nó là quá trình biến đổi những chất không tan thành chất tan. 3.12.1. Biến đổi chất khô hòa tan mẫu bảo quản thường Chất khô hòa tan biến đổi theo thời gian bảo quản. Cà chua sau 30 ngày bảo quản thì chất khô hòa tan chung giảm đi. Do tại thời điểm này quả đã hư hỏng nhiều nên các chất hòa tan bị phân hủy nhiều. Với nồng độ chitosan 2.0 % sự biến đổi chất khô hòa tan theo thời gian bảo quản là ít nhất. Sau 15 ngày chất tan gần như không thay đổi là do hô hấp của mẫu này bị hạn chế hơn các mẫu khác nên chất tan giảm đi ít hơn các mẫu khác. 3.12.2. Biến đổi chất khô hòa tan mẫu bảo quản lạnh  Nhận xét: Sau thời gian bảo quản lượng chất khô tan giảm do lúc nào quả đã bị hư hỏng nên các chất tan bị phân hủy nhiều, các mẫu còn lại chất tan đều tăng. Điều này có thể có được là do hô hấp bị hạn chế nên quá trình chuyển hóa các chất làm tăng chất khô hòa tan chiếm ưu thế hơn.  Kết luận: Sau thời gian bảo quản mẫu 1.5 % và mẫu 2.0 % chất khô hòa tan tăng nhiều nhất, quả đang ở giai đoạn chín đầy đủ, trong khi mẫu đối chứng đã chuyển sang giai đoạn hư hỏng, phân hủy. SVTH: BÙI THANH TRUNG TRANG 51 3.13. Xác định vi sinh vật tổng số Vi sinh vật tổng số là tổng tất cả các vi sinh vật sống trên môi trường dinh dưỡng chung khi nuôi cấy trong thời gian 48h. Để đánh giá khả năng kháng khuẩn của màng chitosan chúng tôi tiến hành xác định vi sinh vật tổng số trên bề mặt quả cà chua ở mẫu đối chứng và mẫu có bảo quản bằng chitosan 2% ở cả điều kiện bảo quản thường và bảo quản lạnh. 0 50000 100000 150000 200000 250000 300000 350000 400000 450000 500000cfu/g Ban đầu Sau 14 ngày ngày bảo quản Đối chứng Chitosan 2% Hình 3.4: Lƣợng vi sinh vật tổng số (mẫu bảo quản thƣờng) 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7 8 9 10000 cfu/g Ban đầu Sau 14 ngày ngày bảo quản Đối chứng Chitosan 2% Hình 3.5: Lƣợng vi sinh vật tổng số (mẫu bảo quản lạnh) SVTH: BÙI THANH TRUNG 52  Nhận xét: Thời gian bảo quản càng lâu thì lượng vi sinh vật tổng số càng nhiều do vi sinh vật phát triển và sinh sôi, ngoài ra còn có một lượng lớn thâm nhập từ môi trường bảo quản. Cà chua khi còn xanh có khả năng đề kháng mạnh hơn khi quả đã chín. Sau 14 ngày bảo quản lượng vi sinh vật tăng lên rất nhiều ở cả mẫu đối chứng và mẫu có bảo quản bằng chitosan. Tuy nhiên mẫu bảo quản bằng màng chitosan tỷ lệ tăng này ít hơn rất nhiều so với mẫu không bảo quản bằng chitosan. Điều này chứng tỏ khả năng kháng khuẩn rất tốt của màng chitosan. Các khuẩn lạc quan sát được hầu hết là các nấm mốc, chứng tỏ chitosan có khả năng ức chế sự phát triển của nấm mốc khá mạnh. Ở mẫu bảo quản lạnh lượng vi sinh vật tổng số phát triển ít hơn hẳn mẫu đối chứng điều này có được là do nhiệt độ lạnh đã có tác dụng hạn chế sự phát triển của vi sinh vật trên bề mặt quả. Vi sinh vật chủ yếu trên bề mặt là loại ưa ấm và kém chịu lạnh nên ở nhiệt độ thấp chúng bị ức chế nên hoạt động sống và sinh sản kém hơn nhiều so với điều kiện thường.  Kết luận:  Màng chitosan có khả năng kháng khuẩn cao. Có thể diệt được 96% vi sinh vật trên bề mặt quả.  Nhiệt độ thấp có khả năng ức chế vi sinh vật phát triển trên bề mặt cà chua.  Vi sinh vật trên bề mặt cà chua chủ yếu là nấm mốc. 3.14. Kết luận chung  Qua các chỉ số phân tích trên ta nhận thấy:  Tác dụng bảo quản của màng chitosan rất rõ rệt.  Mẫu bảo quản bằng màng chitosan 2% cho chất lượng tốt nhất ở cả chế độ bảo quản lạnh và bảo quản thường.  Chitosan kết hợp với bảo quản lạnh cho hiệu quả cao hơn bảo quản thường ở tất cả các chỉ tiêu 3.15. Đánh giá cảm quan mẫu 3.15.1 Đánh giá cảm quan mẫu bảo quản ở điều kiện thường SVTH: BÙI THANH TRUNG 53 Bảng 3.3: kết quả mẫu bảo quản thƣờng 0% chitosan sau 20 ngày bảo quản Bảng 3.4: Kết quả mẫu bảo quản thƣờng 2.0% chitosan sau 20 ngày bảo quản Chỉ tiêu Điểm từng thành viên TỔNG Trung bình chưa có trọng lượng Hệ số trọng lượng Trung bình có trọng lượng T1 T2 T3 T4 T5 Màu sắc 2 1 0 0 1 4 0.8 2 1.6 Trạng thái 0 1 0 0 0 1 0.2 2 0.4 Điểm chất lượng: 2.0 Chỉ tiêu Điểm từng thành viên TỔNG Trung bình chưa có trọng lượng Hệ số trọng lượng Trung bình có trọng lượng T1 T2 T3 T4 T5 Màu sắc 5 5 4 5 4 23 4.6 2 9.2 Trạng thái 5 4 4 5 4 22 4.4 2 8.8 Điểm chất lượng: 18.00 SVTH: BÙI THANH TRUNG 54 3.15.2 Đánh giá cảm quan mẫu bảo quản ở điều kiện lạnh Bảng 3.5: Kết quả mẫu bảo quản lạnh 2.0% chitosan sau 30 ngày bảo quản Bảng 3.6: Kết quả mẫu bảo quản lạnh 0% chitosan sau 30 ngày bảo quản  Kết luận: Sau 30 ngày bảo quản kết quả cảm quan đã chỉ ra rằng: nồng độ chitosan 2% cho chất lượng cảm quan tốt nhất ở cả 2 chế độ bảo lạnh và bảo quản thường 3.16. Chi phí nguyên liệu cho bảo quản Số liệu thực tế khi tiến hành làm thí nghiệm thu được như sau:  Trọng lượng trung bình của quả:83,33g Chỉ tiêu Điểm từng thành viên TỔNG Trung bình chưa có trọng lượng Hệ số trọng lượng Trung bình có trọng lượng T1 T2 T3 T4 T5 Màu sắc 5 5 5 5 5 25 5 2 10 Trạng thái 4 4 5 4 4 21 4.4 2 8.4 Điểm chất lượng: 18.4 Chỉ tiêu Điểm từng thành viên TỔNG Trung bình chưa có trọng lượng Hệ số trọng lượng Trung bình có trọng lượng T1 T2 T3 T4 T5 Màu sắc 1 2 0 1 2 6 1.2 2 2.4 Trạng thái 0 1 0 0 3 4 0.8 2 1.6 Điểm chất lượng: 4.0 SVTH: BÙI THANH TRUNG 55  Lượng dung dịch chitosan 2.0 % tiêu tốn cho 2kg quả là: 20ml  500ml dung dịch có thể bảo quản được 50kg cà chua. Bảng 3.7: Tính giá thành phụ thuộc vào chi phí nguyên liệu chính: Số lượng Đơn giá Giá thành Cà chua 50kg 3.000đ/kg 150.000 đ Chitosan 0.01kg 500.000 đ/kg 5.000 đ Axit axetic 0.005l 100.000 đ/l 500 đ - Tổng giá thành chi phí nguyên liệu cho bảo quản 50kg cà chua là: 155.500 đ. - Chi phí nguyên liệu để bảo quản 1kg cà chua là: 110 VND. - Hao hụt khối lượng sau thời gian bảo quản bằng chitosan là 7%. Tương ứng với cứ 1kg cà chua bảo quản bằng chitosan sẽ mất đi 210 VND. - Tổng chi phí cộng hao hụt khối lượng khi bảo quản bằng chitosan là: 320 VND.  Trong khi đó: - Độ hao hụt khối lượng quả khi bảo quản nếu không dùng chitosan là 11.72%. - Vậy cứ 1kg cà chua không được bảo quản bằng chitosan sẽ mất đi 0.1172 kg tương ứng với 351.6 VND.  Tóm lại - Nếu dùng chitosan để bảo quản mất 320VND, trong khi nếu không dùng chitosan sẽ mất 351.6 VND cho mỗi kg cà chua. - Mặt khác dùng chitosan còn kéo dài được thời gian bảo quản nên giá trị gia tăng thu được rất lớn từ sản phẩm trái vụ. SVTH: BÙI THANH TRUNG 56 3.17. Xây dựng quy trình bảo quản cà chua bằng chitosan 3.17.1. Sơ đồ quy trình bảo quản Thời gian từ 1- 2 phút Hình 3.6: Sơ đồ quy trình công nghệ bảo quản cà chua bằng chitosan 3.17.2. Thuyết minh quy trình bảo quản  Nguyên liệu: - Cà chua được lựa chọn theo giống được trồng và cung cấp ổn định tại vùng nguyên liệu. Bảo quản ở 12- 13 oC Dịch chitosan hồi lưu Pha dịch chitosan 2% Chitosa n Dung dịch axit axetic 1% Nguyên liệu Lựa chọn-Phân loại Rửa sạch Để khô Nhúng chitosan lần 1 Để khô trong 15 phút Nhúng chitosan lần 2 Để khô Xếp vào khay bảo quản SVTH: BÙI THANH TRUNG 57 - Chọn độ chín thu hái để bảo quản khi quả chín vàng (Breaker) - quả bắt đầu xuất hiện màu vàng hoặc hồng với diện tích chiếm 10% bề mặt.  Lựa chọn và phân loại: Cà chua được lựa chọn bằng máy dựa vào kích thước của quả với mục đích tạo sự đồng đều để hiệu quả bảo quản cao hơn và dễ cơ giới hóa.  Rủa sạch: cà chua được rửa sạch bằng máy, có thể kết hợp giữa quá trình rửa và phân loại quả. Sau khi rửa sạch quả được để khô để màng chitosan bám tốt trên bề mặt.  Chuẩn bị dịch chitosan 2%: dung dịch chitosan 2% được pha trong axit axetic 1% cho tới khi không còn vón cục và không có vẩn đục. Sau khi pha dung dịch được lọc qua vải lọc nhằm loại bỏ những cặn bẩn.  Nhúng quả vào dung dịch chitosan: quả sau khi để khô được nhúng vào dung dịch chitosan từ 1- 2 phút được nhúng theo hai lần, giữa mỗi lần cứ để se bề mặt trong 15 phút (tránh làm khô hoàn toàn bề mặt khi đó sẽ tạo hai lớp màng dầy). Dung dịch chitosan thừa chảy từ quả ra được thu hồi, lọc cặn bẩn và dùng lại cho lần nhúng tiếp theo.  Xếp khay: sau khi màng chitosan tạo được trên bề mặt quả khô hết thì tiến hành xếp quả vào khay. Mỗi khay có thể xếp 3-4 lớp quả, không xếp quá chặt để quá trình trao đổi khí diễn ra dễ dàng. Sử dụng khay có lỗ làm bằng tre hoặc nhựa dẻo. Các khay có thể được xếp trồng lên nhau trên các giá sai cho quả ở khay dưới không bị đè lên khay trên. Mỗi giá tối đa nên là 5 khay để quá trình tỏa nhiệt diễn ra tốt và tránh hô hấp yếm khí.  Bảo quản: Các giá được xếp vào kho bảo quản với khoảng cách hợp lý để đảm bảo điều kiện cho quả hoạt động sống bình thường, tránh tăng nhiệt cục bộ và CO2 thoát ra dễ dàng. Có thể bảo quản trong kho có thông khí cưỡng bức hoặc kho lạnh thì thời gian bảo quản lâu hơn nhưng tốn kém hơn. Cà chua có thể bảo quản được 24-26 ngày ở nhiệt độ thường và 35-38 ngày ở nhiệt độ lạnh 12- 13 oC tùy theo điều kiện bảo quản, mà vẫn cho chất lượng tốt có thể dùng cho ăn tươi hoặc chế biến. SVTH: BÙI THANH TRUNG 58 CHƢƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận Chitosan là một polysaccharide được sản xuất từ phụ phế phẩm thủy sản có nhiều tính chất vật lý, hóa học và sinh học đáng quý như khả năng kháng khuẩn, khả năng tạo màng bao có độ thoáng khí … Quy trình sản xuất chitosan đơn giản gồm các quy trình chính như thủy phân protein, khử khoáng và deacetyl hóa trong đó một số quy trình sản xuất chitosan bằng phương pháp hóa học đang được nghiên cứu thay thế bằng quy trình sinh học hay sử dụng enzyme thân thiện với môi trường. Những nghiên cứu nhằm sử dụng chitosan làm màng bảo quản trái cây, rau quả nói chung và cà chua nói riêng cho thấy chỉ cần nhúng trái cây, rau quả trong dung dịch chitosan với nồng độ 2% thì cà chua có thể bảo quản được 28 ngày ở nhiệt độ thường và 35 ngày ở điều kiện lạnh nhiệt độ khoảng 12 – 13 oC. 4.2. Kiến nghị  Hoàn thiện nghiên cứu sử dụng chitosan trong bảo quản cà chua như: o Xác định các chất dinh dưỡng khác trước và sau khi bảo quản. o Khảo sát giống cà chua để bảo quản cho hiệu quả cao hơn trong từng lĩnh vực sản xuất và xuất khẩu. o Nghiên cứu kết hợp các hóa chất bảo quản khác với chitosan để nâng cao hiệu quả bảo quản rau quả. o Nghiên cứu các quy trình áp dụng công nghệ sinh học vào sản xuất chitosan từ phụ phế phẩm của ngành thủy sản như đầu tôm, mai ghẹ …  Xây dựng mô hình, lựa chọn thiết bị, đánh giá hiệu quả kinh tế để đưa phương pháp bảo quản cà chua bằng chitosan vào thực tế.  Khảo sát tính chất và lựa chọn chitosan phù hợp nhất cho bảo quản rau quả.  Ứng dụng chitosan để bảo quản loại quả khác. SVTH: BÙI THANH TRUNG 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt: 1. Châu Văn Minh: “ sử dụng chitosan làm chất bảo quản quả tươi” Tạp chí khoa học, trang 34, số 4-1996 2. Lưu Văn Chính. Tổng hợp và nghiên cứu hoạt tính sinh học của một số dẫn xuất từ chitin. Luận án tiến sĩ 3. Nguyễn Thị Đông. Tách chitin từ phế thải thủy sản bằng phương pháp lên men axit lactic. Luận án tiến sĩ 4. Ðặng Văn Luyến, Ðặng Mai Hương. Phương pháp sản xuất chitosan, 1992. (Ðề cập công nghệ sản xuất biopolyme, cụ thể là đề cập đến phương pháp thu nhận chitin từ vỏ tôm rồi chuyển hóa tiếp thành chitosan). 5. Nguyễn Hoàng Hà, Hoàng Lê Sơn. Quy trình sản xuất chitosan từ vỏ tôm, 1993. (Ðề cập đến lĩnh vực công nghệ sản xuất biopolyme, cụ thể là đề cập đến quy trình sản xuất chitosan từ vỏ tôm). 6. PGS-TS Trần Thị Luyến; GVC Đỗ Minh Phụng; TS Nguyễn Anh Tuấn. Sản xuất các chế phẩm kỹ thuật và y dược từ phế liệu thủy sản, NXB Nông Nghiệp 7. Hà Văn Thuyết, Trần Quang Bình. Bảo quản rau quả tươi và bán chế phẩm-NXB Nông nghiệp, Hà Nội. 8. Quách Đĩnh, Nguyễn Vân Tiếp, Nguyễn Văn Thoa. Công nghệ sau thu hoạch và chế biến rau quả-NXB Khoa Học Kỹ Thuật Hà Nội. 9. Phan Hiếu Hiền. Phương pháp bố trí thí nghiệm và xử lý số liệu-NXB Nông Nghiệp Tp HCM 10. Hà Duyên Tư. Kỹ thuật phân tích cảm quan thực phẩm. _NXB KH&KT 11. Nguyễn Xuân Phương. Kỹ thuật lạnh thực phẩm, NXB Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội. 12. Hà Duyên Tư. Quản lý chất lượng trong công nghiệp thực phẩm- NXB Khoa học và kỹ thuật. 13. Phạm Thị Ánh Hồng. 2003. Kỹ thuật sinh hóa. Nhà xuất bản Đại Học Quốc Gia Tp.HCM. SVTH: BÙI THANH TRUNG 60 14. Phạm Lê Dũng, Trịnh Bình, Lại Thu Hiền và các cộng sự. 1997. “Vật liệu sinh học từ chitin”. Viện Hóa Học – Viện Công Nghệ Sinh Học, Trung tâm khoa học và Công nghệ quốc gia Hà Nội. SVTH: BÙI THANH TRUNG 61 Tài liệu tiếng Anh: 15. Production of chitosan oligosaccharide. (Sản xuất chitosan oligosaccharide và ứng dụng của nó trong thực phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm). 16. Joint FAO/WHO Food standards Progaramme Codex Alimentarius Commission (1994) 17. Alvarez, Review: Active food packating. Food Sci. Tech Page 97-108. 18. Argaiz A 2004 Mechanical, physical and barrier of edible chitosan film, Food Packating: Role of film, edible coating. 19. Caner, C. Vergano, PJ. And wiles. 1998 Chitosan film mechanical and permeatin propertes as affected by axid. Các website: 20. 21. 22. 23. www.compchem.hcmuns.edu.vn 24. www.fistenet.gov.vn 25. và một số website khác SVTH: BÙI THANH TRUNG 62 PHỤ LỤC A.Xác định độ ẩm của vỏ tôm khô A.1. Thiết bị  Cân phân tích có độ chính xác 10-4  Cốc sứ, Bình hút ẩm  Tủ sấy bằng điện, có khả năng kiểm tra nhiệt độ 105 0C A.2.Nguyên tắc  Cân mẫu thử chính xác đến 0.001g, cho vào bình (m1)  Cốc đã được sấy khô và cân đo trước (m0)  Để cốc có chứa mẫu thử vào tủ sấy ở nhiệt độ 105 0C thời gian 3 giờ. Sau đó làm nguội trong bình hút ẩm đến nhiệt độ phòng, đem cân chính xác đến 0.001g (m2). Lập lại thao tác trên nhưng mỗi lần chỉ khoảng 30 phút trong tủ sấy cho đến khi lượng mất đi của hai lần cân lien tiếp không chênh lệch nhau quá 2mg hoặc 4mg tùy theo khối lượng của phần mẫu thử A.3.Tính toán Độ ẩm tính bằng % khối lượng được tính theo công thức sau: [(m1 – m2) * 100]/ (m1 – mo)  Trong đó :  mo : khối lượng cốc không (g)  m1 : khối lượng cốc và mẫu trước khi sấy  m2 : khối lượng cốc và mẫu sau khi sấy (g) B. Xác định hàm lƣợng tro trong vỏ tôm khô tuyệt đối B.1.Dụng cụ  Cân phân tích có độ chính xác 10-4  Chén nung bằng sứ chiệu nhiệt hoặc bạch kim có dung tích từ 30 – 50 ml  Bếp điện  Bình hút ẩm  Lò nung điều chỉnh nhiệt độ SVTH: BÙI THANH TRUNG 63  Lò sấy điều chỉnh nhiệt độ 105 0C B.2. Nguyên tắc Chén cho vào lò nung trong 3 giờ ở nhiệt độ 500–550 0C. Sau khi lấy chén ra làm nguội trong bình hút ẩm và đem cân để xác định khối lượng với độ chính xác 0.001g. Dàn đều mẫu trên đáy chén và đốt cẩn thận trên bếp điện cho đến khi mẫu bốc hết khói, sau đó đặt chén mẫu vào lò nung ở nhiệt độ 500– 550 0C trong khoảng từ 1 – 2 giờ. Sau đó lấy ra ngoài làm nguội trong bình hút ẩm, đem mẫu đi cân ta có khối lượng m1, làm lại quá trình nung mẫu cho đến khi khối lượng không đổi. B.3.Tính toán  Hàm lượng tro thô của mẫu ( X ) được tính bằng % theo công thức : X = [(m1 – m2) *100]/m  Trong đó :  X: hàm lượng tro thô của mẫu (%)  m1: khối lượng chén và mẫu sau khi nung (g)  m2: khối lượng chén (g)  m: khối lượng mẫu thử trước khi nung (g) C. Xác định hàm lƣợng Ca và P trong mẫu tôm khô tuyệt đối C.1.Xác định hàm lƣợng calcium C.1.1.Nguyên tắc Dùng trilon B xác định calcium trong dung dich mẫu với chỉ thị murexid (C8H5O6N5) trong môi trường có pH = 12. Ký hiệu chất chỉ thị murexid là H3I - Trong môi trường có pH = 12, H3I - Có màu tím và khi kết hợp với calcium tạo thành phức chất có màu hồng: H3I - + Ca 2+ CaH3I + Tím hồng Chất phức hợp của Ca với muruxid không bền bằng chất phức hợp bởi Ca và trilon B đẩy chỉ thị murexid ra khỏi chất phức hợp bởi dạng tự do có màu tím: SVTH: BÙI THANH TRUNG 64 CaH3I + + H2Y 2- CaY 2- + H3I - + 2H + Hồng tím C.1.2.Dụng cụ và hóa chất  Dụng cụ :  Bình tam giác 100 ml  Ống chuẩn độ 25 ml  Ống hút 2, 5, 10 ml  Hóa chất  Dung dịch NaOH 10%  Dung dịch KCN 3 %  Chỉ thị murexid: cân 0.1g murexid + 50g tinh khiết. Nghiền nhuyễn bằng cối, cho vào chai thủy tinh có đậy nút kín.  Dung dịch trilon B 0.02 N C.1.3.Cách tiến hành Tùy theo hàm lượng Ca có trong mẫu,cân chính xác 2 – 5g mẫu, nung thành tro trắng, hòa với 5ml HCL tinh khiết, đun cách thủy tới khô trên nồi cách thủy sôi – thực hiện tương tự them một lần nữa. Tiếp đó cho thêm 5ml HCL 20% hòa tan, lọc trên giấy lọc không tro. Rửa chén nung nhiều lần bằng nước cất nóng. Dịch lọc và nước rửa cho cả vào bình định mức, cuối cùng cho thêm nước cất đủ 100ml, ta có được dịch thử. Hút 20ml dung dịch thử cho vào bình tam giác 100ml thêm 2ml dung dịch NaOH 10%, 5 giọt KCN 3% và khoảng nữa hạt gạo chỉ thị murexid. Chẩn độ bằng dung dịch Trilon B 0.02 N cho đến khi màu hồng của dung dịch chuyển sang màu tím, cần thực hiện song song một sự thử không (đối chứng) C.1.4.Tính toán: V1 = (v1*100)/a (ml/100g mẫu khô) Lượng calcium (tính bằng mg) trong 100g mẫu thô là: m1 = (v1*C*20.04*100)/a SVTH: BÙI THANH TRUNG 65  Trong đó:  V1: thể tích Trilon B cần để chuẩn độ khi xác định lượng calcium trong dung dịch mẫu tương đương với 100g mẫu khô.  v1: thể tích Trilon B 0.02 N dùng để chuẩn độ.  a: trọng lượng mẫu khô tương đương với thể tích dung dịch mẫu lấy để chuẩn độ.  20.04 : đương lượng của calcium  C : độ nguyên chuẩn của dung dịch Trilon B C.2.Định lƣợng phosphor C.2.1.Nguyên tắc Phương pháp dựa vào khả năng của ion Orthophosphate phản ứng với amomonium Molybdate tạo thành Phosphormolybdate, phức chất có màu xanh lơ 2(MoO24MoO3) + H3PO4 (MoO24MoO3).2H3PO4.4H20 Hàm lượng phosphor phụ thuộc vào cường độ màu của mẫu, đo ở bước sóng hấp thụ cực đại 650ml với cuvet có chiều dày 10mm, dung dịch đối chứng là dung dịch không. C.2.2.Dung dịch và hóa chất  Dụng cụ  Thời gian chuẩn bị là một giờ, độ nhạy của phương pháp cao do đó các dụng cụ thủy tinh đòi hỏi phải thật sạch.  Máy quang phổ có bước sóng 650nm và cuvet bằng 10mm.  Bình định mức 50,100 ml.  Ống nghiệm.  Hóa chất : Tất cả các hóa chất sử dụng trong tiêu chuẩn này phải có tinh khiết phân tích  Nước sử dụng phải là nước cất hay có độ tinh sạch tương đương  HCL đậm đặc  HNO3 đậm đặc SVTH: BÙI THANH TRUNG 66  Amobi Molybdate  Hydriquinone [ C6H4(OH)2] pha khi sử dụng  Kali Dihydrophotphat (KH2PO4)  Sodium sulfite (KH2PO4) C.2.3.Cách tiến hành  Lấy mẫu thử và chuẩn bị mẫu theo TCVN 4325 – 86  Nếu mẫu khô không khí, đã xử lý sơ bộ và bảo quản lạnh  Nếu mẫu tươi, xử lý sơ bộ cô cạn, sấy ở 60 0C, sấy 105 0C nghiền lấy mẫu trung bình.  Chuẩn bị dịch thuốc thử Dung dịch (1) = dung dịch chuẩn gốc (có chứa 100µg phosphor/ ml). Hòa tan 0.394g KH2PO4 trong bình định mức 1000ml bằng nước cất và định mức đúng 1000ml bằng nước cất và định mức đúng 1000ml. Chuẩn bị dung dịch chuẩn để lập thang chuẩn (có chứa 25µg phosphor/ml ). Lấy 25ml dung dịch vào bình định mức bằng nước cất đúng 100ml ta có dung dịch 1A. Dung dịch Acid Chlohydric 10% (pha loãng tỉ lệ 1: 3 ) 250ml HCL đậm đậc thêm 750 ml nước cất. Dung dịch (2) = dung dịch Sodium Sulfite (Na2SO3) 20% trong ít nước và thêm cho đủ 100ml, dung dịch chuẩn bị khi sử dụng. Dung dịch (3) = dung dịch Hydroquinone [C6H4(OH)2] 0.5%. Hòa tan 0.5g Hydroquinone trong một ít nước và 3 giọt H2SO3, thêm tiếp nước cho đủ 100ml. Dung dịch chuẩn bị khi sử dụng. Dung dịch (4) = thuốc thử Brigg = dung dịch Amoni Molybdate 5% hòa tan 50g Amoni Molybdate trong 600ml nước. Cho 150ml H2SO4 đậm đậc vào trong 400ml nước để nguội thêm tiếp dung dịch Amoni Molybdate 5% đã chuẩn bị cho vào hổn hợp, để nguội thêm nước cho đủ 1000ml. Hỗn hợp thuốc thử chuẩn bị khi sử dụng. Trộn lẫn các dung dịch 2, 3, 4 theo tỷ lệ 1: 1: 1 SVTH: BÙI THANH TRUNG 67  Chuẩn bị dung dịch tro phân tích Cân chính xác 1 – 5g mẫu ( tùy vào hàm lượng phosphor nhiều hay ít ), vô cơ hóa ở 550 0C trong 4h, để nguội đến nhiệt độ phòng thấm ướt tro bằng vài giọt nước cất và thêm 10ml dung dịch HCL 10% + 0.5ml HNO3 . Đun nhẹ trong 5 phút (đến bay hơi), để nguội đến nhiệt độ phòng rửa sạch chén nung và định mức thể tích dung dịch tro 250ml.  Phản ứng lên màu  Lấy 10ml dung dịch tro cho vào bình nón dung dịch 100ml, định mức đủ 100ml ta có dung dịch thứ 2.  Lấy 1ml dung dịch thứ 2 cho vào ống nghiệm.  Thêm 3ml hỗn hợp thuốc thử và nước đủ 10ml, hỗn hợp lắc đều để 30 phút, đo ở bước sóng 650 nm. D. Xác định hàm lƣợng Nito tổng số bằng phƣơng pháp Kjeldahl D.1.Nguyên tắc Chất đạm được vô cơ hóa bằng đậm đặc và chất xúc tác thành muối ammonium sulphate (NH4)2SO4. Muối này đem cho tác dụng với kiềm mạnh như NaOH sẽ giải phóng NH3 H2SO4 đậm đặc Nguyên liệu (NH4)2SO4 xúc tác , t 0 (NH4)2SO4 + NaOH 2NH3 + 2H2O + Na2SO4 Sau đó lượng được lôi cuốn bằng hơi nước sang một bình tam giác có chứa một lượng thừa H3BO3, mà ở đó H3BO3 tự phân ly: H3BO3 HBO2 + H2O Khi cất đạm, NH3 bay ra sẽ phản ứng với HBO2 NH4OH + HBO2 NH4 + + BO2 - + H2O BO2 - là một bazo mạnh, bởi vậy dung dịch của bình phản ứng chuyển từ màu tím đỏ sang màu xanh lá mạ. Lượng BO2 - được tạo thành tương đương với lượng NH3 bị đẩy ra trong quá trình cất đạm. Xác định lượng BO2 - bằng cách SVTH: BÙI THANH TRUNG 68 chuẩn độ ngược với HCL 0.25N. Giai đoạn chuẩn độ kết thúc khi dung dịch chuyển từ màu xanh lá mạ sang màu tím đỏ. D.2.Dụng cụ và hóa chất  Máy kjeldahl  NaOH 32%  HCl 0.25N  Chất xúc tác là hỗn hợp của 60g Se: 75g CuSO4: 865g K2SO4.  Hỗn hợp chất chỉ thị màu :  Hòa tan 0.264g methyl đỏ trong 250ml cồn tuyệt đối.  Hòa tan 1.28g bromocreseol blue trong 50ml cồn tuyệt đối.  Trộn đều hai dung dịch trên, bổ sung 96ml HCL 0.25N rồi định mức đến 1000ml bằng cồn tuyệt đối.  Dung dịch acid boric 4% với chỉ thị màu: hòa tan 80g acid boric trong 1000ml nước, đun nóng một chút. Để nguội và bổ sung 25ml hỗn hợp chất chỉ thị màu rồi thêm nước cất cho đủ 2000ml. D.3.Cách tiến hành  Vô cơ hóa mẫu Cân 0,1g mẫu đã nghiền kỹ và thêm 5ml đậm đặc và 1g chất xúc tác cho vào bình kjeldahl. Sau khi thêm chất xúc tác cho vào bình Kjeldahl và sau khi thêm chất xúc tác đun nhẹ hỗn hợp, tránh sôi trào và chỉ đun mạnh khi hỗn hợp đã hoàn toàn chuyển sang dung dịch lỏng. Trong quá trình đun thỉnh thoảng lắc nhẹ, tránh khéo léo sao cho không còn một vết đen nào của mẫu nguyên liệu chưa bị phân hủy còn sót lại trên thành bình. Đun cho tới khi dung dịch trong bình hoàn toàn trắng. Khi thời gian phá mẫu kết thúc, khoảng 3 – 4 giờ để nguội rồi chuyển toàn bộ vào bình chưng cất.  Chưng cất SVTH: BÙI THANH TRUNG 69 Sau khi chuyển mẫu đã được vô cơ hóa vào bình chưng cất, bổ sung 30ml NaOH 32%. Dịch chưng cất chuyển qua erlen có chứa sẵn 20ml dung dịch acid boric 4% có chỉ thị màu. Ngừng chưng cất khi dịch chưng cất ra không còn NH3 (không làm đổi màu giấy quỳ). Chuẩn độ bằng HCL 0.25N đến khi xuất hiện màu đỏ phớt. Thông qua lượng HCL 0.25N đem đi chuẩn độ ta biết được lượng acid boric kết hợp với NH3 và do vậy biết được lượng NH3 giải phóng từ mẫu 1ml HCL 0.25N. Tương ứng với 0.0035g N hữu cơ… D.4.Kết quả VHCl * 0.0035*100 N (%) = C  Trong đó :  VHCl : là thể tích HCL 0.25N dùng để chuẩn độ (ml)  C : là khối lượng mẫu đem đi vô cơ hóa ( g) Xác định hàm lượng protein trong vỏ tôm, thông thường protein chứa khoảng 16% N.Khí nhận được khi NH3 chưng cất nhân với hệ số chuyển đổi 100/16 ( ~ 6.25) sẽ thu được giá trị protein tương đương . Vì vậy khi xác định được hàm lượng Nito tổng số theo phương pháp Kjeldahl ta suy ra hàm lượng protein toàn phần là: HL protein = N (%) * 6.25 E.Thủy phân vỏ tôm bằng phƣơng pháp enzyme protease kết tủa để thu chitin và chitosan Theo dõi quá trình thủy phân vỏ tôm bằng enzyme protease kết tủa với các nồng độ 5%, 7%, 9% nhiệt độ 40, 50 , 60 0C thời gian từ 2 – 20 giờ SVTH: BÙI THANH TRUNG 70  Bố trí thí nghiệm như sau : Nguyên liệu vỏ tôm khô Xay nhỏ 2 – 4 mm Ngâm trong dung dịch enzyme có nồng độ khác nhau (5, 7, 9%) Với các giá trị nhiệt độ 40, 50, 60, tỷ lệ W: V = 1:10 pH = 7, và trong khoảng thời gian từ 0 – 20 giờ Đo hàm lượng protein hòa tan Chọn được nhiệt độ, nồng độ và thời gian thủy phân thích hợp (tại nồng độ mà hàm lượng protein hòa tan thấp nhất ) F. Kiểm tra sản phẩm chitosan thu đƣợc F.1. Định tính chitosan Để biết chất đó có phải là chitosan hay không người ta có thể dùng phản ứng sau để định tính nhanh chitosan theo tài liệu của Nguyễn Hữu Đức và Võ Thị Tường Khanh (1997): Cho phản ứng với KMnO4: lấy 0.1 ml KMnO4 Cho vào 10ml dung dịch chitosan 0.5% trong dung dịch acid acetic 1%, dung dịch từ màu tím sang màu vàng nhạt. F.2.Phƣơng pháp xác định độ hòa tan F.2.1.Nguyên lý Chitosan được hòa tan trong acid acetic loãng 1% còn chitin và các tạp chất khác không hòa tan. F.2.2.Tiến hành Cân chính xác M g chitosan hòa tan trong dung dịch acid acetic 1%, khuấy đều trong 15 phút cho chitosan tan hoàn toàn (nếu còn vớt ra rửa sạch bằng nước cất). Sau đó đem sấy khô và cân lại. SVTH: BÙI THANH TRUNG 71 Tính thành phần %: X (%) = [(M – m) x 100]/M  Trong đó:  M: là khối lượng của chitosan ( g )  m: là khối lượng chitosan còn dư sau phản ứng hòa tan ( g)