Khóa luận Sử dụng chỉ thị phân tử Microsatellite đánh giá đa dạng di truyền các dòng keo lá tràm (Acacia auriculiformis)

ủa loài. Vùng flanking rất quan trọng vì nó giúp phát hiện trình tự microsatellite đặc trƣng ở mỗi locus trên nhiễm sắc thể. 2.3.4 Giới hạn của Microsatellite Microsatellite đƣợc chứng tỏ là marker phân tử hữu hiệu, đặc biệt trong nghiên cứu quần thể, thế nhƣng chúng không phải không có hạn chế. Microsatellite đƣợc phát triển cho những chủng đặc trƣng có thể đƣợc ứng dụng thƣờng xuyên với những chủng có mối quan hệ họ hàng gần nhau, tuy nhiên tỉ tệ phần trăm vị trí di truyền đƣợc khuếch đại thành công có thể bị giảm bởi sự gia tăng khoảng cách di truyền. Điểm đột biến trong vị trí bắt cặp của primer trong một loài nào đó có thể dẩn đến sự cố alleles không giá trị(null alleles), nơi mà primer microsatellite không thể đáp ứng để khuếch đại trong thí nghiệm PCR. Sự phân kì trong trình tự ở vùng liên kết có thể dẫn đến sự bắt cặp kém của primer, đặc biệt ở vùng 3’ nơi mà sự kéo dài bắt đầu; sự khuếch đại ƣu tiên của vị trí alleles đặc thù do sự cạnh tranh tự nhiên của PCR có thể dẫn đến việc cá thể dị hợp tử đƣợc ghi nhận từ đồng hợp tử (bộ phận không có giá trị) ( M. J. Hayden and P. J. Sharp, 2001) Sự thất bại của phản ứng PCR có thể thu nhận kết quả khi sự sai khác ở vị trí đặc thù đƣợc khuếch đại. Tuy nhiên, ảnh hƣởng sai khác của quần thể nhỏ và khả năng của sự liên kết giới tính cũng cần đƣợc xem xét để không đƣa ra giá trị sai của alleles không giá trị do sự tăng tính đồng hình trong phân tích quần thể. Sự khác nhau trong kích thƣớc allele cũng không phản ánh sự khác nhau thật sự. Đột biến có thể có từ sự thêm vào hay mất đi của bases và toàn bộ microsatellite có thể chịu sự nén chặt về chiều dài. Tỉ lệ đột biến thì không có tiêu chuẩn để đánh giá. Vùng trung tính của một số vùng microsatellite còn đang nghi vấn, có lẽ do sự biến thiên tính trạng số lƣợng hoặc sự cố trong vùng exon của genes dƣới sự chọn lọc. Khi sử dụng microsatellite để so sánh loài, vị trí đồng hình có thể dễ dàng khuếch đại trong những loài có quan hệ, thế nhƣng số vị trí khuếch đại thành công 24 trong suốt phản ứng PCR có thể giảm do sự tăng khoảng cách di truyền giữa các loài nghi vấn. Đột biến trong alleles microsatellite có thể bị ảnh hƣởng xấu trong trƣờng hợp có một đoạn alleles lớn hơn chứa nhiều bases hơn, và do đó có thể đƣợc dịch sai trong quá trình phiên mã DNA. Một alleles nhỏ hơn tham gia vào việc làm tăng kích thƣớc, trong khi một alleles lớn hơn tham gia để làm giảm kích thƣớc, khi mà chúng có thể là nguyên nhân cho sự giới hạn trên về kích thƣớc; sự ép buộc này đã đƣợc xác định nhƣng giá trị khẳng định là chƣa chuyên biệt. Nếu có một sự khác biệt lớn về kích cỡ giữa alleles của cá thể, điều đó có thể làm tăng sự không bền vững trong sự tái tổ hợp ở quá trình giảm phân. Trong tế bào khối u, nơi mà sự kiểm soát trên phiên mã bị phá hủy, microsatellite có thể tăng thêm hay mất đi thƣờng xuyên ở tỉ lệ đặc biệt cao trong mỗi chu kỳ nguyên phân. Do đó một dòng tế bào khối u có thể chỉ ra những đặc điểm khác biệt di truyền từ những mô kí chủ đó. 2.3.5 Các loại Microsatellite Căn cứ vào cấu tạo của đơn vị lặp lại (2-6 lần) chúng ta có : Mononucleotide SSR (A) AAAAAAAAAAA Dinucleotide SSR (GT)6 GTGTGTGTGTGT Trinucleotide SSR (CTG)4 CTGCTGCTGCTG Tetranucleotide SSR (ACTC)4 ACTCACTCACTCACTC Trinucleotide SSR xuất hiện ít hơn dinucleotide SSR khoảng 10 lần, và tetranucleotide SSR còn hiếm hơn nữa (Ma và ctv., 1996). 2.3.6 Cơ chế hình thành và vai trò của Microsatellite 2.3.6.1 Cơ chế hình thành Microsatellite Cơ chế đột biến hình thành microsatellite vẫn chƣa đƣợc hiểu biết một cách đầy đủ. Di truyền học và các nghiên cứu khác cho rằng cơ chế xuất hiện và hình thành microsatellite là do hai quá trình: quá trình bắt chéo lỗi trong quá trình giảm 25 phân (unequal crossing- over during meiosis) hoặc quá trình trƣợt lỗi trong sao mã (replication slippage). Và quá trình trƣợt lỗi trong sao mã đƣợc coi là nguyên nhân chủ yếu trong việc hình thành các microsatellite, nó xảy ra trên mạch chậm (lagging strand). Quá trình này liên quan đến quá trình trƣợt lỗi của enzyme polymerase trên phân tử DNA mới tổng hợp từ đó tạo ra một chỗ phình nhất thời có thể bị loại bỏ trong quá trình sửa lỗi hoặc có thể kéo dài thêm ở mạch đối diện tạo thành một đoạn lặp lại dài hơn. Hình 2.1: Cơ chế bắt chéo lỗi trong giảm phân Hình 2.2: Cơ chế trƣợt lỗi trong quá trình sao mã 26 2.3.6.2 Vai trò của Microsatellite Rất nhiều microsatellite đã đƣợc tìm thấy ở vùng phía trên của các vùng khởi đầu sao mã của vùng mang mã. Chức năng rõ rệt của những vùng nhƣ vậy vẫn còn chƣa rõ ràng, mặc dù ngƣời ta tìm thấy chúng tồn tại giữa các vùng exon và có liên quan tới các bệnh di truyền. Microsatellite đƣợc dùng nhƣ một marker di truyền để nghiên cứu về di truyền quần thể, quan hệ tiến hóa, lập bản đồ gen. Tuy nhiên có rất nhiều chứng cứ cho rằng trình tự microsatellite cũng đóng vai trò là yếu tố mang mã hoặc nhân tố điều hòa. Microsatellite đƣợc tìm thấy khắp nơi ở phần trƣớc vùng khởi đầu sao mã của vùng mang mã, và một số đã đƣợc tìm thấy có quan hệ với vùng mã hoá. Số lƣợng khác nhau của các đoạn lặp lại của microsatellite ở vùng mã hoá có quan hệ với sự biểu hiện của gene và chức năng của gene. Ở một số trƣờng hợp, sự thay đổi (mất hoặc thêm) các đơn vị lặp lại của microsatellite cũng làm thay đổi chức năng hoạt động của promotor. Vị trí của microsatellite gần hay xa promotor cũng làm hoạt động của promotor thay đổi. Vùng điều khiển có chứa microsatellite hoạt động nhƣ một nhân tố thúc đẩy quá trình phiên mã và những đột biến mất đoạn microsatellite đã làm giảm chức năng của gen. Microsatellite cũng liên kết với các protein bám mà các protein này có chức năng bám dính vào các trình tự khởi động của gene, khi trình tự này đƣợc giải phóng thì gen đƣợc khởi động và sao mã. Điều này chỉ ra rằng microsatellite hoạt động nhƣ một yếu tố điều hòa trong quá trình sao mã, ảnh hƣởng đến quá trình sao mã thông qua ảnh hƣởng đến protein bám. Rất nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng ảnh hƣởng thúc đẩy của microsatellite và protein bám dính của nó là một chức năng của các đoạn lặp lại trong một vùng microsatellite đặc biệt nào đó. Nhƣ một trình tự mang mã, microsatellite đã đƣợc tìm thấy biểu hiện ở rất nhiều protein và sự khác nhau về số lần lặp lại của các trình tự trong microsatellite có thể dẫn đến sự khác 27 nhau về chức năng của protein và hoạt động của gen, do đó có thể ảnh hƣởng đến chức năng sinh lý cũng nhƣ sự phát triển của cơ thể. Một số nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng có sự ảnh hƣởng của chiều dài khác nhau của microsatellite đến hình thái và sự phát triển ở mức độ cơ quan đƣợc tổng kết lại nhƣ một yếu tố chức năng của hệ gen. Những tính chất đặc biệt của microsatellite nhƣ sự đột biến điểm dẫn đến những giả thiết cho rằng microsatellite có thể là một nguồn chủ yếu tạo nên sự đa dạng về di truyền số lƣợng và quá trình tiến hóa thích nghi (Kashi và ctv., 1997). Nó cho phép một quần thể có thể khôi phục lại nguồn đa dạng di truyền đã bị mất trong quá trình chọn lọc, nó hoạt động nhƣ một “núm điều chỉnh” mà qua đó những gen đặc biệt có thể điều chỉnh nhanh chóng các phản ứng thay đổi ít hay nhiều trong quá trình đòi hỏi của tiến hóa (King và ctv., 1997). Do vậy microsatellite là một nguồn rất quan trọng trong việc nghiên cứu đa dạng di truyền và làm cơ sở cho sự thay đổi của tiến hóa. 2.3.7 Các phƣơng pháp phát hiện Microsatellite Có 2 phƣơng pháp để phát hiện microsatellite: phƣơng pháp lai và phƣơng pháp PCR. 2.3.7.1 Phƣơng pháp lai Phƣơng pháp lai phân tử cho phép xác định chính xác kiểu microsatellite bằng cách chuyển qua màng lai, cùng một lúc có thể phát hiện nhiều kiểu microsatellite bằng các mẫu dò khác nhau. Tuy nhiên xác định chiều dài của chúng còn bị hạn chế. Trong phƣơng pháp lai có hai cách: phƣơng pháp phát hiện nhờ đồng vị phóng xạ và phƣơng pháp nhuộm bạc.  Phƣơng pháp phát hiện nhờ đồng vị phóng xạ Phƣơng pháp hiệu quả và đƣợc dùng đầu tiên là đồng vị phóng xạ. Ngƣời ta có thể đánh dấu vào một đầu của primer (end-labelling) hoặc đánh dấu và trộn lẫn một trong bốn thành phần nucleotide A, T, G, C (incorporation-labelling). Nhƣng 28 ngày nay phƣơng pháp dùng đồng vị phóng xạ rất ít đƣợc sử dụng vì nguy hiểm đến sức khỏe con ngƣời và đòi hỏi việc xử lí chất thải tốn kém.  Phƣơng pháp nhuộm bạc (phát hiện không dùng phóng xạ) Phƣơng pháp này rẻ, không hại, nhƣng độ nhạy cao, đòi hỏi một số kỹ thuật rắc rối khi nhuộm. 2.3.7.2 Phƣơng pháp PCR Phƣơng pháp PCR sử dụng màu huỳnh quang để đánh dấu primer forward và sử dụng máy giải trình tự tự động. Phƣơng pháp này đƣợc phát triển cùng với sự phát triển của màng giải trình tự nucleotide để phát hiện sản phẩm PCR đƣợc đánh dấu bởi một chất nhuộm huỳnh quang (end-labelling primer hoặc incorporation). Khi kích thích bởi tia laser, các chất nhuộm màu này giải phóng ra một tín hiệu mà máy tính có thể phát hiện đƣợc bằng cách so sánh sự di chuyển của sản phẩm PCR với DNA chuẩn, chúng ta có thể có kích thƣớc chính xác của đoạn DNA quan tâm. Chất huỳnh quang này đƣợc gắn vào một đầu 5’ của cặp mồi, 40 ng mồi loại này đủ dùng cho 10.000 phản ứng PCR. Phƣơng pháp này có hiệu quả rất cao và đang đƣợc sử dụng phổ biến trên các phòng thí nghiệm trên thế giới. Ngƣời ta có thể đánh dấu bằng 3 loại chất nhuộm huỳnh quang khác nhau, trong cùng một phản ứng PCR và chạy cùng một giếng điện di, kể cả kích thƣớc các đoạn bằng nhau nhƣng chúng ta vẫn có thể xác định đƣợc nhờ màu huỳnh quang khác nhau. Kết quả đƣợc thể hiện trên máy tính, nhờ đó chúng ta có thể xác định đƣợc chính xác kích thƣớc của al, loại trừ những băng lặp lại (stuter DNA) hoặc thêm một nucleotide A… 2.4 Polymerase Chain Reaction (PCR) 2.4.1 Khái niệm 29 Kỹ thuật PCR đƣợc phát minh vào năm 1985 bởi nhà khoa học Mỹ Mullis và cộng sự. Phát minh này đã đem đến cho Mullis giải Nobel Hóa học năm 1993. Đây là phƣơng pháp nhằm khuếch đại một đoạn phân tử DNA nào đó một cách đặc hiệu in vitro nhờ sự xúc tác của enzyme Taq polymerase từ một lƣợng DNA mẫu rất nhỏ. Đây là một kỹ thuật trong sinh học phân tử để tạo dòng DNA rất đơn giản và hiệu quả. Bằng kỹ thuật PCR, hàng triệu đoạn DNA đặc hiệu và đồng nhất sẽ đƣợc thu nhận từ DNA mẫu. Hình 2.3:Nguyên tắc cơ bản của phản ứng PCR 2.4.2 Thành phần và vai trò của các chất trong phản ứng PCR  Mẫu DNA: Mẫu DNA đƣợc ly trích từ nhiều bộ phận khác nhau của đối tƣợng nghiên cứu bằng nhiều phƣơng pháp khác nhau. Đối với DNA thực vật thƣờng đƣợc ly trích từ mô lá, DNA động vật đƣợc ly trích từ máu, lông, mô … 30 Trong kỹ thuật PCR, yêu cầu về độ tinh sạch của DNA mẫu không cần cao. Tuy nhiên để thu đƣợc kết quả tốt nhất nên sử dụng DNA mẫu thực sự tinh khiết. Số lƣợng DNA cần cho một phản ứng PCR khoảng 5-10 ng DNA thuần khiết. Nồng độ DNA có thể xác định đƣợc nhờ sự đo OD (mật độ quang) ở độ dài sóng 260nm. Khi DNA tinh khiết, lƣợng DNA đƣợc tính theo công thức : - 1 OD260nm = 50 ng/ l (đối với DNA sợi kép). - 1 OD260nm = 40 ng/ l (đối với DNA sợi đơn).  Primer (mồi): Là một đoạn acid nucleid có trình tự liên kết đặc hiệu với đoạn DNA cần khuếch đại. Phản ứng PCR sử dụng một cặp primer đặc hiệu bao gồm F-primer (mồi xuôi) và R-primer (mồi ngƣợc). Cặp primer quyết định sự thành công của kỹ thuật PCR. Nếu primer đƣợc thiết kế đúng thì đoạn DNA đích sẽ đƣợc khuếch đại chính xác.  dNTP (dATP, dCTP, dTTP, dGTP): Nồng độ dNTPs thƣờng đƣợc sử dụng là 20 - 200 μM. Nồng độ cao hơn dễ dẫn đến sự khuếch đại “ký sinh". Bên cạnh đó, sự cân bằng trong thành phần các dNTPs cũng ảnh hƣởng đến phản ứng PCR. dATP, dCTP, dTTP, dGTP đƣợc sử dụng với nồng độ nhƣ nhau. Sự mất cân bằng trong thành phần các dNTPs sẽ làm tăng các lỗi sao chép của DNA polymerase. Nồng độ dNTPs thích hợp nhất cho một phản ứng PCR còn phụ thuộc vào nồng độ Mg2+, nồng độ primer, số lƣợng chu kỳ của phản ứng và chiều dài của sản phẩm đƣợc khuếch đại. Vì thế, nồng độ dNTPs tối ƣu cho từng phản ứng phải đƣợc xác định qua thực nghiệm  Dung dịch buffer: Tạo môi trƣờng thuận thích hợp nhất để Taq polymerase hoạt động.  Taq polymerase: 31 Ban đầu, khi chƣa sử dụng loại enzyme Taq - polymerase ngƣời ta phải thêm DNA polymerase trong từng chu kỳ nhân bản, vì DNA polymerase cần cho quá trình tổng hợp DNA nhƣng không chịu đƣợc nhiệt độ lớn hơn 900 C ở giai đoạn tách hai sợi của phân tử DNA. Năm 1988, Taq polymerase đƣợc phát hiện. Đây là một DNA polymerase bền với nhiệt, đƣợc cô lập từ vi khuẩn Thermus aquaticus sống ở suối nƣớc nóng, với enzyme này chỉ cần cho một lần Taq polymerase là đủ. Nồng độ Taq polymerase đƣợc sử dụng thông thƣờng là 0.5 - 5 đơn vị/100μl dung dịch phản ứng. Nếu nồng độ Taq quá cao, những sản phẩm không chuyên tính có thể xuất hiện làm sai lệch kết quả. Nếu nồng độ Taq quá thấp, chúng ta sẽ không có đủ số lƣợng men để xúc tác tạo ra sản phẩm PCR theo ý muốn. Trong phản ứng PCR thì Taq polymerase có khuynh hƣớng thêm một nucleotide loại “A” vào đầu tận cùng 3’ của sản phẩm PCR, điều này rất quan trong trong việc tạo dòng (TA - cloning) và nó sẽ bị loại thải đi nếu sự gắn kết xảy ra ở đầu tận cùng là đầu bằng (blunt end ligation). Ngoài ra có thể làm gia tăng hoạt tính của Taq polymerase bằng cách sử dụng kết hợp với một số enzyme khác: Tli hoặc Pfu. Sử dụng Tli, Pfu và một số enzyme polymerase khác.  Ion kim loại Mg++: Tạo điều kiện thuận lợi cho Taq polymerase hoạt động. 2.4.3 Nguyên tắc của phản ứng PCR Phản ứng PCR thƣờng đƣợc thực hiện qua 25-35 chu kỳ. Mỗi chu kỳ bao gồm các bƣớc: denature (biến tính DNA), annealing (gắn mồi), extension (kéo dài). Giai đoạn denature: tiến hành ở nhiệt độ từ 94 - 96 oC, trong 60 giây (thời gian có thể dài hoặc ngắn hơn tùy theo độ dài DNA mẫu). Đây là bƣớc làm biến tính DNA mẫu từ sợi kép thành sợi đơn dƣới tác dụng của nhiệt độ. Giai đoạn annealing: 50 – 60 oC, 30 giây. Đây là bƣớc primer gắn đặc hiệu vào sợi DNA đích ( ở dạng sợi đơn). Nhiệt độ trong bƣớc này tùy thuộc vào độ dài của cặp primer. 32 Giai đoạn Extension: 72 o C, 60 – 90 giây. Đây là bƣớc kéo dài primer nhờ hoạt động của Taq polymerase. Nhiệt độ 72oC hoạt động của Taq polymerase đạt hiệu quả tối ƣu. Sau 25 -35 chu kỳ, phản ứng tiếp tục giai đoạn ủ ở 72oC trong 5 - 15 phút để hoàn thiện các sản phẩm PCR. 2.4.4 Ứng dụng của kỹ thuật PCR Hiện nay, thành tựu của PCR mở ra nhiều triển vọng cho sinh học phân tử, với nhiều ứng dụng trong sinh học, trong y khoa, trong nông nghiệp, trong lâm nghiệp và thủy sản … Trong nghiên cứu genomic: Nhân bản vô tính với PCR, recombinant PCR, multiplex PCR … Trong nghiên cứu y học: Phát hiện, chẩn đoán đƣợc nhiều loại bệnh do virus, vi khuẩn, ký sinh trùng … gây ra. Trong nông nghiệp và lâm nghiệp: Chọn lọc giống cây trồng nhờ DNA marker (MAS), kiểm tra kết quả chuyển gene … Trong thủy sản: Phát hiện, chuẩn đoán bệnh trên các loài thủy sản. 2.4.5 Ƣu và nhƣợc điểm của kỹ thuật PCR  Ƣu điểm: Cho kết quả nhanh, nhạy, chỉ cần một lƣợng nhỏ DNA là có thể thực hiện đƣợc.  Nhƣợc điểm: Do quá nhạy nên kỹ thuật PCR có thể cho kết quả dƣơng tính giả. Trong một số trƣờng hợp vi sinh vật gây bệnh đã chết hoặc chƣa đủ lƣợng gây bệnh thì phản ứng PCR vẫn cho kết quả dƣơng tính. 2.5 Quy trình ly trích DNA thực vật 33 DNA, vật liệu mang thông tin di truyền đƣợc cấu tạo bởi nucleotide, là yếu tố mở đầu cho mọi nghiên cứu và ứng dụng sinh học phân tử, trong đó bao gồm các nghiên cứu tính đa dạng di truyền trong quần thể. Để có thể tiến hành các thí nghiệm phân tích sâu hơn thì việc thu nhận một lƣợng DNA lớn và sạch là điều kiện đầu tiên. Đối với tách chiết DNA thì mối quan tâm hàng đầu là thu nhận đƣợc các phân tử này ở trạng thái nguyên vẹn tối đa, ít bị phân hủy do các tác nhân cơ học (phân tử bị gãy do nghiền, lắc mạnh) hay hoá học (phân tử bị thủy giải do các enzym (enzym nội bào giải phóng ra môi trƣờng khi tế bào bị phá vỡ hay sự tạp nhiễm trong khi thao tác). Quá trình tách chiết DNA cần thực hiện ở nhiệt độ thấp để ức chế enzym nội bào. Có nhiều quy trình ly trích DNA tổng số nhƣ quy trình của Scott O.Rogers và Arnold J.Bendich (1994), quy trình của Doyle và Doyle (1987, 1990), quy trình của Ziegenhagen và Fladung (1997)… Mỗi phƣơng pháp đều có ƣu và khuyết điểm riêng. Chúng ta có thể dựa vào đối tƣợng đƣợc đem thí nghiệm cũng nhƣ yêu cầu về chất lƣợng, số lƣợng DNA cần thu để chọn phƣơng pháp cho thích hợp. Ngoài ra, giá thành cũng là một trong những yếu tố quyết định đến việc lựa chọn phƣơng pháp tách chiết thích hợp. Các phƣơng pháp ly trích DNA cơ bản gồm ba bƣớc: Bƣớc 1: Phá màng tế bào và màng nhân bằng phƣơng pháp cơ học (nghiền). Thông thƣờng ngƣời ta nghiền tế bào, trong một hỗn hợp chất tẩy (nhƣ SDS, Sarcosyl, CTAB) và proteinase (Proteinase K). Hỗn hợp này sẽ phá vỡ màng tế bào và màng nhân, giải phóng DNA ra môi trƣờng đồng thời phân hủy các protein liên kết với DNA. Để đảm bảo sự toàn vẹn cấu trúc của các bào quan, hạn chế sự hoạt động của các enzyme thuỷ phân nội bào, ngƣời ta có thể phá vỡ cơ học mô và tế bào bằng cách nghiền mịn trong điều kiện lạnh sâu của Nitơ lỏng (-198oC). Sau đó sử dụng chất tẩy mạnh để phá màng tế bào và màng nhân (phá vỡ hóa học). Bƣớc 2: Loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu, chủ yếu là các protein. Sự loại bỏ này dựa trên nguyên tắc hòa tan khác nhau của các loại phân 34 tử khác nhau (nucleic acid/ protein) trong hai pha không hòa tan (phenol, Chloroform/ nƣớc). Mẫu đƣợc lắc nhẹ trong dung dịch phenol/chloroform/iso amylalcohol (tỉ lệ 25/24/1). Dung dịch này có tác dụng làm biến tính protein đồng thời không hòa tan nucleic acid. Protein sau khi bị biến tính sẽ không còn hòa tan trong pha nƣớc có chứa nucleic acid và sau khi ly tâm sẽ tủa thành một lớp nằm giữa pha nƣớc và pha phenol chloroform. Pha nƣớc có chứa nucleic acid đƣợc thu nhận lại làm thí nghiệm. Bƣớc 3: Tủa nucleic acid. Có thể tủa bằng ethanol hoặc isopropanol, nhƣng thông thƣờng ngƣời ta dùng isopropanol. Nucleic acid sẽ đƣợc thu nhận lại bằng ly tâm. Sau đó, cặn tủa đƣợc rửa trong ethanol 70% để loại bỏ các muối hoặc các dấu vết của isopropanol còn dính lại trên mẫu. Mục đích của việc tủa là nhằm thu nhận nucleic acid dƣới dạng cô đặc, nhằm bảo vệ chúng khỏi sự phân hủy của các enzyme, đồng thời có thể hòa tan chúng lại trong dung dịch theo nồng độ mong muốn. Một số vấn đề có thể gặp phải khi tách chiết DNA: - DNA bị phân hủy hoặc bị gãy. - Có lẫn tạp RNA trong mẫu DNA. - Có lẫn tạp polysaccharide trong mẫu DNA. - Có lẫn tạp polyphenol trong mẫu DNA. 2.5.1 Định lƣợng DNA bằng phƣơng pháp quang phổ Mỗi loại phân tử có một đỉnh hấp thụ (tại nơi đó chúng hấp thụ ánh sáng mạnh nhất) ở một độ dài sóng nhất định tùy thuộc vào cấu trúc của chúng. Ví dụ đỉnh hấp thụ của các phân tử acid nucleotide là 260nm. Sự hấp thụ này là do sự tƣơng tác giữa các photon với các electron của vòng purine và pyrimidine. Dựa vào sự hấp thụ này ngƣời ta có thể định lƣợng đƣợc hàm lƣợng DNA có trong mẫu ly trích. 35 Sự hấp thụ ánh sáng ở đây đƣợc tính bằng đơn vị OD (Optical Density). Đối với DNA tinh khiết một đơn vị OD260nm tƣơng ứng với: - 50 g/ml DNA sợi đôi. - 40 g/ml DNA sợi đơn hay RNA. - 20 g/ml oligonucleotide sợi đơn. Từ giá trị OD đo đƣợc, ngƣời ta có thể suy ra đƣợc nồng độ acid nucleotide trong mẫu ly trích. Cách tính trên chỉ đúng với mẫu DNA tinh khiết. Nếu mẫu ly trích có lẫn tạp protein thì kết quả tính toán sẽ không chính xác. Do ngoài đỉnh hấp thụ là 280nm protein cũng hấp thụ ánh sáng ở bƣớc sóng 260nm nhƣ các acid nucleotide và vì thế sẽ làm sai lệch giá trị thật của nồng độ acid nucleotide trong dịch ly trích. Để ƣớc lƣợng độ tinh sạch của mẫu ly trích ngƣời ta tính tỷ lệ OD260nm/OD280nm. Nếu tỷ lệ này nằm trong khoảng 1,7-2,2 thì mẫu ly trích đƣợc xem là sạch.Nếu mẫu bị nhiễm protein thì tỷ lệ này sẽ thấp hơn nhiều. Tuy nhiên, việc định lƣợng bằng phƣơng pháp hấp thu mật độ quang lại không cho biết chất lƣợng của DNA ly trích. Để biết chính xác chất lƣợng DNA ly trích, ngƣời ta sử dụng phƣơng pháp định tính DNA bằng cách điện di trên gel. 2.5.2 Định tính DNA ly trích bằng phƣơng pháp điện di Nguyên tắc của kỹ thuật điện di: Trong cùng một điện trƣờng, các phân tử sẽ di chuyển với vận tốc tùy thuộc vào điện tích và kích thƣớc của chúng. Nếu hai phân tử có cùng khối lƣợng thì phân tử nào có điện tích lớn hơn sẽ di chuyển về điện cực ngƣợc dấu nhanh hơn. Đối với phân tử DNA, việc điện di đƣợc thực hiện trên giá thể bán rắn là gel. Gel là môi trƣờng xốp với các lỗ nhỏ cho phép các phân tử acid nucleotide đi qua. Kích thƣớc phân tử càng lớn thì việc di chuyển qua gel càng chậm. Có hai loại gel 36 đƣợc sử dụng tùy theo kích thƣớc và mức độ phân tách của phân tử acid nucleotide: Gel agarose và gel polyacrylamide.  Gel agrose Lỗ có đƣờng kính trung bình cho phép phân tách các phân tử DNA sợi đôi, kích thƣớc 300-10.000 bp. Các nồng độ agarose khác nhau cho phép tăng hiệu quả phân tách các nhóm phân tử có kích thƣớc khác nhau. Bảng 2.2: Sự phân tách các đoạn DNA trong gel agarose Nồng độ gel agarose (%, w/v) Kích thƣớc đoạn DNA dạng thẳng (kb) 0,6  0,8 0,9  1,2 1,2  1,5 1 20 0,5  7 0,5  5  Gel polyacrylamide Cho những lỗ nhỏ, thích hợp để phân tách những đoạn DNA có kích thƣớc dƣới 500bp, hiệu quả phân tách có thể đạt 1 nucleotide. (Lƣu ý: Gel polyacrylamide ở dạng lỏng là chất gây độc cho hệ thần kinh nên phải cẩn thận khi sử dụng) Bảng 2.3: Sự phân tách các đoạn DNA trong gel polyacrylamide Nồng độ gel polyacrylamide (%, w/v) Kích thƣớc đoạn DNA dạng thẳng (bp) 4 5 8 200  800 80  200 40  100 37 11 10  50 Sau khi phân tách bằng điện di, để phát hiện các phân tử DNA trên gel, ngƣời ta sử dụng một số phƣơng pháp phát hiện nhƣ sau: Đối với gel agarose: Nhuộm bằng ethidium bromide. Chất này sẽ gắn xen vào giữa các base của phân tử DNA và phát huỳnh quang dƣới tia tử ngoại. Điều này cho phép phát hiện vị trí các đoạn DNA trên gel. Đối với gel polyacrylamide: Các phân tử DNA thƣờng đƣợc đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ và vị trí của nó sẽ đƣợc phát hiện bằng kỹ thuật phóng xạ tự ghi. Ngoài ra, các phân tử DNA còn có thể đƣợc đánh dấu bằng các chất nhuộm chuyên biệt. Dựa vào kết quả điện di, chúng ta có thể biết đƣợc chất lƣợng của DNA ly trích nhƣ gẫy, lẫn tạp, …qua các band màu thể hiện. 2.6 Tổng quan về cây Keo lá tràm (Acacia auriculiformis) 2.6.1 Vài nét về chi Keo (Acacia) 2.6.1.1 Đặc điểm sinh học của các loài Keo Chi Keo (Acacia) là một chi của một số loài cây thân bụi và thân gỗ có nguồn gốc tại đại lục cổ Gondwana, thuộc phân họ Trinh nữ (Mimosoideae) thuộc họ Đậu (Fabaceae), lần đầu tiên đƣợc nhà nghiên cứu Linnaeus miêu tả năm 1773 tại châu Phi. Hiện nay, ngƣời ta biết có khoảng 1300 loài cây Keo trên toàn thế giới, trong đó khoảng 950 loài có nguồn gốc ở Australia, và phần còn lại phổ biến trong các khu vực khô của vùng nhiệt đới và ôn đới ấm ở cả hai bán cầu nhƣ: châu Phi, miền nam châu Á, châu Mỹ. Tuy nhiên, chi Acacia không phải là chi đơn ngành mà đƣợc chia tách Acacia thành 5 chi mới ( 38 Loài sinh trƣởng xa nhất về phía bắc của chi này là Acacia greggii (Keo vuốt mèo), đạt tới 37°10' vĩ bắc ở miền nam Utah, Hoa Kỳ. Loài sinh trƣởng xa nhất về phía nam là Acacia dealbata (Keo bạc), Acacia longifolia (Keo bờ biển hay Keo vàng Sydney), Acacia mearnsii (Keo đen) và Acacia melanoxylon (Keo gỗ đen), đạt tới 43°30' vĩ nam ở Tasmania, Australia, trong khi Acacia caven đạt tới vĩ độ tƣơng tự nhƣ thế về phía nam, tại khu vực đông bắc tỉnh Chubut, Argentina. Trong tiếng Anh, các loài ở Australia gọi chung là wattle (cây Keo Öc), còn các loài châu Phi và châu Mỹ gọi chung là acacia (cây Keo) (Bùi Việt Hải,1998). Lá của các loài Keo nói chung là loại lá hình lông chim phức. Tuy nhiên, ở một số loài đặc biệt ở Australia và các đảo trên Thái Bình Dƣơng thì các lá chét bị triệt tiêu và các cuống lá có dạng phẳng và bẹt, hƣớng lên trên, có tác dụng giống nhƣ lá; chúng đƣợc gọi là cuống dạng lá. Hƣớng thẳng đứng của các cuống dạng lá bảo vệ cho các loài cây này không bị quá nóng do ánh sáng dữ dội của Mặt Trời, do chúng chắn ít ánh sáng hơn so với các lá cây nằm ngang. Một số loài (chẳng hạn Acacia glaucoptera) thiếu cả lá lẫn cuống dạng lá, nhƣng có cành dạng lá, là một phần của thân cây đã biến đổi thành dạng tƣơng tự nhƣ lá để có chức năng quang hợp. Hình 2.4: Hình thái lá các loài Keo(Acacia) Các hoa nhỏ có 5 cánh hoa rất nhỏ, gần nhƣ ẩn kín trong các nhị hoa dài và đƣợc phân bổ trong các cụm hoa dày dặc dạng hình cầu hay hình trụ; chúng có màu 39 vàng hay màu kem ở một số loài, một số loài khác thì màu hơi trắng hay thậm chí là tía (chẳng hạn Acacia purpureapetala) hoặc đỏ (trong loài đƣợc trồng gần đây Acacia leprosa). Các loài thƣờng có gai, đặc biệt ở các loài sinh trƣởng trong khu vực khô cằn. Chúng thƣờng là các cành bị ngắn đi, cứng và sắc, hoặc đôi khi là lá kèm dạng lá biến hóa thành. Ví dụ nhƣ: Acacia armata là cây gai Kangaroo ở Australia, Acacia giraffa ( Hình2.5:Hình thái một số loài Keo A) Keo tuyến sóng, sóng rắn B) Keo tai tƣợng C) Keo bình linh,Keo dậu D) Keo lá tròn, Mimosa Đà Lạt 2.6.1.2 Công dụng của các loài Keo (Acacia) 40 Thần thoại Ai Cập đã gắn loài Keo (Acacia) với các đặc trƣng của cây của sự sống do nhiều loài trong chi Acacia chứa một số loại ancaloit có các tác động tới thần kinh, trong đó DMT và NMT là nổi bật và có ích nhất. Lá, thân và/hoặc rễ có thể ủ với một số thực vật chứa MAOI để thu đƣợc chất có tác dụng ảnh hƣởng đến tuổi thọ khi uống. Vỏ cây Acacia arabica đƣợc coi là phƣơng thuốc có ích trong điều trị việc xuất tinh sớm.( Trong công nghiệp, cây Keo đƣợc ứng dụng trong công nghệ thuộc da, làm chất cao su (catechu), làm chất làm se.Cung cấp các loại gỗ có giá trị để làm đồ gỗ nội thất và có độ bóng cao (Acacia melanoxylon-Keo gỗ đen, hay Acacia homalophylla..).Ngoài ra một số loại Keo đƣợc dùng để sản xuất nƣớc hoa nhƣ Acacia farnesiana bởi nó có mùi thơm rất mạnh. Vỏ các loài Keo khác nhau rất giàu tanin và là một mặt hàng xuất khẩu quan trọng; các loài có giá trị lớn nhất trong ứng dụng này là Acacia pycnantha (Keo vàng), Acacia decurrens (Keo vỏ dà), Acacia dealbata (Keo bạc) và Acacia mearnsii (Keo đen). Gỗ Keo đƣợc sử dụng trong sản xuất hộp đựng pháp điển của ngƣời Do Thái- một biểu tƣợng tinh thần, và còn là một trong những biểu tƣợng có quyền lực nhất trong Hội Tam Điểm, thể hiện linh hồn của Thƣợng Đế và sự tinh khiết của tâm hồn. Một số loài đƣợc sử dụng nhƣ là các loại cây cảnh; phổ biến nhất là Acacia dealbata (Keo bạc) có các lá từ màu lục xám tới màu bạc và các hoa màu vàng sáng; nó đôi khi còn bị gọi sai thành "trinh nữ" (mimosa) tại một số khu vực có trồng, bởi sự nhầm lẫn với cây trinh nữ thực thụ thuộc chi Mimosa Trong văn hóa ẩm thực, hạt của một số loài Keo đƣợc dùng làm thực phẩm và các một loạt các sản phẩm khác trong ẩm thực. Ví dụ, hạt của Acacia niopo đƣợc nƣớng và dùng nhƣ là thuốc hít tại Nam Mỹ. Tại Lào và Thái Lan, các loại rễ của Acacia pennata (gọi là cha-om) đƣợc sử dụng trong súp, cà ri, trứng ốp lết hay các món xào. 41 Tại Việt Nam, các loài cây Keo tai tƣợng (Acacia mangium) và Keo lá tràm (Acacia auriculiformis) đƣợc trồng để làm nguyên liệu sản xuất giấy, cải tạo vƣờn rừng. Bảng 2.4:Các ancaloit trong các loài Keo (Alexander Shulgin. TiHKAL) Loài Hoạt chất ancaloit Bộ phận chứa hoạt chất của cây A. baileyana 0,02%tryptamin và β-cacbolin Lá A. maidenii DMT và NMT Cuống lá A. albida DMT Lá A. confusa DMT và NMT Lá, cuống lá và vỏ cây A. cultriformis Tryptamin Lá và cuống lá A. laeta DMT Lá A. mellifera DMT Lá A. nilotica DMT Lá A. phlebophylla DMT Lá A. podalyriaefolia tryptamin Lá A. senegal DMT Lá A. seyal DMT Lá A. sieberiana DMT Lá A. simplicifolia DMT và NMT Lá, cuống lá, vỏ thân cây A. vestita Tryptamin Lá và cuống lá 2.6.2 Vài nét về cây Keo lá tràm (Acacia auriculiformis A. Cunn ex Benth) 42 Tên Việt Nam hay tên địa phƣơng thƣờng gọi là Keo lá tràm hoặc Tràm bông vàng. Tên khoa học: Acacia auriculiformis A. Cunn ex Benth, thuộc họ phụ Mimosoideae, họ Leguminosae. Theo báo cáo của Tổ chức nghiên cứu Lâm nghiệp của Liên hiệp quốc (IUFRO) tại hội thảo triển khai cho châu Á (Sri Lanka, 1984) thì cây Keo lá tràm là một trong số những loài rất chủ yếu cạnh các loài khác nhƣ Eucalyptus carnaldulensis,Leucaena leucocephala, Acacia mangium và Bamboos đƣợc giới thiệu để trồng rừng thâm canh ở các vùng đất thấp của khu vực nhiệt đới ẩm. Keo lá tràm đƣợc biết đến ở ngoài nơi phân bố tự nhiên của nó nhƣ là một loài có khả năng thích ứng nhất trong số những cây trồng rừng ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới ẩm. Hình 2.6. Keo lá tràm 2.6.2.1 Các đặc điểm sinh học và sinh thái Hình thái Keo lá tràm là loại cây gỗ nhỏ đến trung bình, thƣờng chỉ cao 8-20m, ở địa phận thuận lợi có thể cao 25 đến 30m, đƣờng kính 80cm với đoạn thẳng dài,cành 43 nhỏ, dễ trồng bằng hạt, sống lâu, có khả năng cố định đạm và tự tỉa cành tốt (Hƣớng dẫn kỹ thuật trồng rừng Keo lá tràm-Sở nông nghiệp và phát triển nông thôn Thanh Hóa). Có thể sinh trƣởng trên nhiều loại đất, kể cả đất nghèo kiệt, thoát nƣớc kém. Cây mọc nhanh, tốc độ sinh trƣởng cao trong vài năm đầu. Song, trên một nơi nếu trồng nhiều chu kì liên tục có thể dẫn tới nghèo Kali và Mg trong đất. Gỗ giác màu vàng, gỗ lõi màu nâu sẫm, tỷ tỵong cơ bản (độ ẩm 12%) là từ 0.5 đến 0.65, hiệu suất bột giấy 49%, sợi dài 0.85mm, nhiệt trị 4700-4900kcal/kg, dùng làm trụ mỏ, nguyên liệu bột giấy (giấy gói), ván dăm, thân cành làm củi tốt do nhiệt lƣợng của than cao. Trong lâm sinh dùng làm cây trồng phù trợ cải tạo đất, che bóng. Ở miền Nam gỗ Keo lá tràm đƣợc gọi là gỗ cẩm lai giả, thích hợp cho chế tác đồ mộc (Bùi Việt Hải, 1998) Lá của loài Keo lá tràm là loại lá chét hình lông chim phức, lá giả dài 10- 16cm, rộng 1.5-2.5 cm và có 3 gân chính. Khi hạt nảy mầm, hai lá đầu tiên đại diện cho bộ trinh nữ, các lá về sau thì giống lá tràm nên đƣợc gọi là Keo lá tràm. Cây có nhiều cành nhánh và thân thƣờng cong. Vỏ cây màu xám hoặc nâu, khi nhỏ tuổi cây có vỏ nhẵn song khi càng nhiều tuổi vỏ cây càng thô.quả. Quả khô hình xoắn , khi chín tự nứt để phát tán hạt. Hạt nhỏ, màu nâu đen. Phân bố Cây Keo lá tràm phân bố tự nhiên ở ven biển Indonesia, vùng sa mạc nửa khô hạn Papua New Guinea, ở trung tâm và đông bắc Australia. Phạm vi phan bố nằm ở các vĩ độ 5-170 độ Nam, độ cao phân bố có thể lên đến 400m nhƣng thƣờng phổ biến ở độ cao dƣới 100m. Keo lá tràm thƣờng gặp ở vùng khí hậu nóng ẩm tới cận ẩm, nhiệt độ bình quân 22-240oC, lƣợng mƣa thay đổi từ 760mm-2000mm, nơi không có băng giá và sƣơng muối. Tại những nơi đất bazan, lƣợng mƣa 2000mm, sau 11năm chiều cao của cây có thể đạt 13.7m và chu vi thân cây đạt từ 1.3m đến 70cm ( Kushalapa,1992). Đặc điểm sinh thái 44 Keo lá tràm có biên độ sinh thái rát rộng, có khả năng thích nghi với điều kiện sinh thái tƣơng đối khắc nghiệt (nóng và khô hạn), chịu đƣợc đất nghèo dinh dƣỡng, tầng đất mỏng. Có khả năng sinh trƣởng trên nhiều loại đất khác nhau nhƣ: đất sét, đất podson, đất laterit và ngay cả trên những vùng đất khô hay đụn cát cố định, pH từ 3-9, lƣợng mƣa từ 200-1700mm. Keo lá tràm có thể đƣợc xếp vào cây ƣa sáng hoàn toàn. Các đặc trưng lâm học Keo lá tràm là một trong số những loài cây có khả năng thích nghi cao, sinh trƣởng nhanh, ổn định. Keo lá tràm có khả năng cố định đạm và thích ứng rộng với các điều kiện khác nhau. Nó không những có thể tồn tại và sinh trƣởng tốt ở những vùng có mùa khô kéo dài mà cả ở những vùng có lƣơng mƣa hàng năm lên đến 6000mm (Bùi Việt Hải). Và mặc dù phân bố tự nhiên ở độ cao dƣới 400m nhƣng trồng đƣợc ở những độ cao lớn hơn. Ví dụ: ở Zimbabue (1.100-1.200 m) và Uganda (1.200-1.500 m). Keo lá tràm là loài cây có khả năng sinh trƣởng nhanh, tăng trƣởng chiều cao trong những năm đầu có thể đạt 2-3m mỗi năm. Tại Việt Nam trên các thực địa thích hợp, chiều cao cây đạt ở 10-12 năm tuổi có thể lên đến 25-30m, đƣờng kính 15-20m (xếp sau A.mangium và A.crassicarpa). 2.6.2.2 Công dụng và tiềm năng gây trồng Công dụng chính của Keo lá tràm là cung cấp gỗ chất lƣợng tốt cho nhiều mục đích khác nhau nhƣ dùng làm nguyên liệu sản xuất giấy, dùng để chế tác hàng thủ công mỹ nghệ, làm củi than đốt rất tốt. Gỗ có tỷ trọng cao, chứa 59% cellulose, 24% lignin, 19% pentosan và giá trị nhiệt lƣợng đạt 4.800-4.900 kcal/kg. Keo lá tràm có khả năng cải tạo đất trồng nên thƣờng đƣợc gây trồng rộng rãi. Ngoài ra còn dùng lấy chất nhuộm màu và lấy tanin từ vỏ cây. 45 Phần 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện 3.1.1 Thời gian thực hiện Đề tài đƣợc thực hiện từ 03/2007 đến 08/2007 3.1.2 Địa điểm thực hiện Mẫu lá các dòng Keo lá tràm đƣợc thu thập tại Trạm thực nghiệm lâm nghiệp Bàu Bàng(Tỉnh Bình Dƣơng ) của Viện khoa học lâm nghiệp Việt Nam. Mẫu lá đƣợc phân tích tại Phân viện Nghiên cứu khoa học kĩ thuật lâm nghiệp Nam Bộ và Trung tâm Công nghệ sinh học TP.Hồ Chí Minh. 3.2 Vật liệu thí nghiệm Thu thập các dòng Keo lá tràm khác nhau (xem phụ lục). Cách lấy mẫu: Mẫu lá tƣơi đƣợc lấy tại rừng trên những cây có đánh dấu số dòng khác nhau, cho vào túi nylon, đánh dấu mẫu và đƣa về trữ trong tủ lạnh để tiến hành ly trích DNA. Nguyên tắc thu thập mẫu: Thu thập lá non của các dòng Keo lá tràm có kí số khác nhau. 3.3 Phƣơng pháp thí nghiệm Trên cơ sở của các thông tin thu thập trong và ngoài nƣớc, chỉ thị phân tử SSR(Microsatellite) đƣợc chọn để sử dụng trong nghiên cứu này do bởi : Chỉ thị này xuất hiện rải rác trên genome của sinh vật và cho độ đa hình lớn. Chỉ thị đồng trội nên dễ phát hiện. 46 Đơn giản nhƣng cho hiệu quả phân tích cao Ngoài ra, theo một số nghiên cứu kết quả do SSRs mang lại khi phân tích các loài Keo cho kết quả phân tích cao hơn và có tính chính xác cao hơn so với những chỉ thị phân tử khác. Ví dụ : hiệu quả cao hơn RAPD khoảng 7lần (Kraic và cộng tác viên, 1998) và cao hơn 3lần so với RFLP (Butcher và cộng tác viên, 2000). 3.4 Thiết bị và dụng cụ Chày và cối (Đức). Bình và khay đựng Nitơ lỏng. Cân điện tử (Ohaus - Mỹ). Bồn ủ nhiệt (Memmert-Anh). Tủ lạnh 4oC và -20oC. Máy Vortex (IKA - Đức). Máy hút và tủ cấy vô trùng (Việt Nam /Anh). Máy vi ly tâm lạnh (Hettich - Đức). Nồi hấp Autoclave (ToMy - Nhật Bản). Lò Viba (Electrolux). Tủ sấy (Jencons-Anh). Máy điện di (Biorad). Máy chụp ảnh DNA (Biorad - Thụy Điển). Đầu típ các loại (Đức). Pipet các loại (Nichiryo – Nhật Bản). Máy PCR (BioRad – Thụy Điển). Tủ lạnh các loại (Sanyo - Nhật Bản). Eppendorf các loại(Pháp). 47 3.5 Ly trích DNA 3.5.1 Hóa chất Các hóa chất sử dụng trong thí nghiệm đƣợc liệt kê trong Bảng 3.1 Bảng 3.1: Các hóa chất sử dụng trong quá trình ly trích DNA HÓA CHẤT CÔNG DỤNG CÁCH PHA CTAB(C19H42NBr) (M=364,5 g/mol) Phá vỡ màng tế bào, màng nhân Hòa tan trong nƣớc cất 2 lần ở 65oC Ethanol 80% Rửa DNA Pha với tỷ lệ 7 thể tích ethanol 100% và 3 thể tích nƣớc cất 2 lần đã hấp tiệt trùng Nitơ lỏng Giúp nghiền mẫu nhanh Dung dịch gốc Chloroform Biến tính protein và các sắc tố có trong mẫu. Tách lớp sau khi ly tâm Dung dịch gốc TE 10X Ổn định DNA Hòa tan DNA Pha 100ml: 10ml Tris-HCl 1M + 2ml EDTA 0,5M + 88ml nƣớc cất 2 lần. Hấp 121oC/20 phút trƣớc khi dùng. Mercapto Ethanol Bảo vệ DNA Dung dịch gốc EB(Extraction Buffer) Dung dịch ly trích Pha 100ml: 900µl CTAB (lắc nhẹ trong bồn ủ 65oC cho tan, hạn chế tạo bọt). Bổ sung 6 µl Mercaptro Ethanol. Bọc giấy bạc, trữ ở 4oC, tránh ánh sáng trực tiếp. Isopropanol Tủa DNA ở nhiệt độ thấp, không cần muối Sodium Acetate Dung dịch gốc 48 3.5.2 Quy trình ly trích DNA DNA trong mẫu lá Keo đƣợc ly trích theo quy trình mô tả bởi Butcher và cộng sự (sơ đồ 3.1). Sơ đồ 3.1: Quá trình ly trích mẫu DNA 0.2g lá Keo non Bổ sung 500 μl Chloroform đảo đều o Nghiền mẫu trong Nitơ lỏng(-196o) o Bổ sung 900 μl CTAB(65 o ) o Ủ trong 45-60 phút (65 o ) o Bổ sung 6 μl mercaptoethanol Ly tâm 13000vòng trong 8 phút.Thu dịch nổi Bổ sung 500 μl Phenol+ Chloroform (v/v=1:1).Đảo đều Ly tâm 13000vòng trong 8 phút.Thu dịch nổi Bổ sung 200 μl CTAB tủa, đảo đều trong 5 phút +500 μl Phenol+ Chloroform(v/v=1:1).Đảo đều Tủa DNA trong 600 μl Isopropanol lạnh, ly tâm lạnh ở 4 oC(13000 vòng trong 15 phút).Thu tủa. Rửa bằng 500 μl ethalnol (80%), ly tâm lạnh ở 4o (13000 vòng trong 15 phút), thu tủa, phơi khô ở nhiệt độ phòng Hòa tan tủa DNA trong TE 49 3.5.3 Kiểm tra sản phẩm DNA ly trích Mẫu DNA ly trích đƣợc điện di trên gel Agarose1.5%, trong dung dịch đệm 1X TBE ở hiệu điện thế 60 V, cƣờng độ dòng điện 400 mA trong 60phút. Sau khi chạy điện di xong, ngâm gel trong hỗn hợp Ethidium Bromide 0,5 g/ml và TAE 0,5X trong 15phút. Gel sau khi nhuộm đƣợc rửa nhẹ với TAE 0,5X và đƣa vào máy chụp ảnh DNA. Dƣới tia UV, Ethidium Bromide đã liên kết với sợi đôi DNA sẽ phát quang và tạo thành các band trên gel. 3.6 Thực hiện kỹ thuật SSR  Hóa chất dùng trong phản ứng PCR: PCR buffer MgCl2 . dNTP’s. Taq DNA polymerase. Primer. DNA mẫu (ly trích từ lá Keo). H2O cất chạy PCR. 3.6.1 Qui trình phản ứng PCR Phản ứng PCR với cặp primer đã lựa chọn Thành phần Thể tích sử dụng Nồng độ đầu Nồng độ cuối HN buffer 2,5 μl 10X 1X MgCl2 0,75μl 50mM 1.5mM dNTPs 0,2μl 25mM 0,2mM Primer forward 0.5μl 10 μmol/ μl 0,2 μmol/ μl Primer reverse 0.5μl 10 μmol/ μl 0,2 μmol/ μl DNA mẫu 0.5μl Taq polymerase 0,2μl 5u/ μl 1u/ μl 50 H2O cất 19,85μl Tổng thể tích: 25µ Bảng 3.2: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR Chu kỳ Nhiệt độ (oC) Thời gian 1 94 2 phút 2 - 29 94 30 giây 55-60 30 giây 72 1 phút 30 72 5 phút 31 4 Forever Lƣu ý: Sau khi phản ứng PCR hoàn chỉnh, chờ cho nhiệt độ trong máy về 4 oC trong 5 phút. Đem sản phẩm trữ ở 4oC hay -20oC để có thể sử dụng với trong thí nghiệm sau này. Các thao tác tiến hành pha mix phải thực hiện trong tủ cấy để đảm bảo điều kiện vô trùng và các thành phần phải luôn đƣợc giữ trong điều kiện lạnh . Trình tự của các primer sử dụng trong đề tài theo chiều 5’ – 3’ Bảng 3.3: Trình tự các SSR’Primer sử dụng Primer Trình tự (5’-3’) Nucleotide lặp lại Am008 F: CCACCCGTTACCCATTTATG R: CCGTGATTGACTCTCAGCG (TG)14 Am012 F: TGAGTCGATCGCTTAGCTTG R: TCCCGTTATTATGCCAAAGTG (TC)15(AC)7-(AC)10AG Am014 F: TACTAACGTTGCTATATGAGAAAGG R: CTGGTTGTTCGCTTATATGG (ATAC)3(AC)26(AT)3,(GTAT)2(AT)3AC 51 Am018 F: CACGGCTGTTATTTCCTTCG R: GGAAAGAGGTGTGACAGAGGAC (AC)14 Am326 F: GGACCAAACTTATGCAACACC R: GCATCAATGTACTAAACCATTTCC (CA)20 Am341 F: CCATTCGAGCATCCTAAGAG R: CGTATGGCTGAGCTACTTAATCA (CA)12(TA)2 Am502 F: CAAATGGCCAAGTTACGACTG R: TTCTGGTAATCCAAACTTATGTGG (TTC)3-(GGA)8, AGA(GGA)2 Am522 F: ATGAGTTTGACCCGACTTGA R: TGCGTAACACGATTATCCT (AAT)3-(AGT)2(GGT)7 Am770 F: CAGAGGTGGCAGATGATGTC R: AAGCCTTTAGTTGGGCGTTC CTC(CAC)5CGC,(CAC)3 3.6.2 Điện di sản phẩm PCR Lƣu ý: Khi tiến hành nạp gel và gắn lƣợc cần tránh tạo bọt khí trong bản gel và tại các giếng. Bƣớc1: Rửa các tấm kính(0.75mm) với nƣớc. Lau khô bằng giấy mềm. Rửa lại 2lần bằng cồn 70 oC. Dùng giấy không bụi lau lại thật sạch Lắp các tấm kính vào bộ phận đổ gel điện di đứng vào. Bƣớc2: Chuẩn bị gel phân tích polyacrylamide(7.5%): H2O 4.89ml Tris HCl 1.5M,pH 8.8 2.5ml Monomer 2.5ml TEMED 10 μl 10% APS 100 μl Bơm dịch gel vào bộ phận đổ gel. Thêm iso propanol vào để làm đều mặt gel. Đợi gel đông hoàn toàn (khoảng 20phút), thấm hút dịch isopropanol. Bƣớc3: Chuẩn bị gel gom polyacrylamide(7.5%): H2O 2.133ml Tris HCl 1.5M,pH 8.8 0.33ml 52 Monomer 0.83ml TEMED 3μl 10% APS 30μl Bơm dịch gel vào bộ phận đổ gel. Gắn lƣợc tạo giếng. Đợi gel đông hoàn toàn. Tháo lƣợc. Gắn bản gel vào buồng điện di đứng. Chuẩn bị load mẫu điện di. Bƣớc4: Trộn 10µl mẫu với 10µl loading dye5x (BioRad) rồi nạp vào giếng. Vận hành máy điện di ở 60V, 400A trong 60 phút. Bƣớc5: Di chuyển gel ra khỏi tấm kính và đem nhuộm ethium bromide trong 15 phút. Rửa lại với TAE 0.5X. Tiến hành chụp gel. 53 Phần 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Quá trình ly trích Li trích DNA là một bƣớc khởi đầu rất quan trọng, vì nó quyết định sự thành công cho phản ứng PCR sau này. Qui trình li trích DNA theo sơ đồ 3.1 đạt hiệu quả tốt vì DNA li trích có độ tinh khiết cao, không bị lẫn tạp DNA lạ. Dịch trích DNA chứa chất mercaptoethalnol có khả năng phá vỡ thành tế bào rất mạnh. Bƣớc sử dụng Chloroform đƣợc lặp lại 2 lần liên tiếp kết hợp với li tâm đã loại bỏ hết protein và polysaccharide có trong mẫu. Do đó, DNA thu đƣợc tƣơng đối tốt, đảm bảo cho phản ứng PCR xảy ra. Bƣớc pha tủa và pha loãng mẫu sẽ giúp giảm nồng độ tạp chất còn lẫn trong sản phẩm li trích sau cùng, bƣớc li tâm tiếp theo sẽ giúp thu đƣợc DNA tinh sạch với nồng độ thấp ở khoảng giữa ống và không bị lẫn tạp chất đã lắng xuống đáy ống. Hình điện di sản phẩm ly trích DNA 4.2 Phản ứng PCR 54 Phản ứng PCR qua nhiều thí nghiệm với nhiều quy trình nhiệt độ và thành phần thay đổi đã tìm đƣợc điều kiện thích hợp nhất. Quy trình PCR ở trên là phù hợp và cho kết quả tin cậy. Do các đoạn DNA thu đƣợc từ sản phẩm PCR có kích thƣớc không quá khác biệt nhau nên sự đa hình rất khó nhận thấy trong sản phẩm khi điện di trên gel thông thƣờng. Vì vậy cần phải tiếp tục phân tích trên máy giải trình tự ABI 3100 để thu đƣợc những kết quả chính xác hơn. Sau khi tách chiết, mẫu ADN tách chiết từ các mẫu lá thí nghiệm này đƣợc sử dụng để thanh lọc các mồi SSR để tìm đa hình và xem mồi nào có thể đƣợc sử dụng để đánh giá mối quan hệ di truyền giữa các cá thể Keo lá tràm nghiên cứu. Kết quả thanh lọc các cặp mồi thu đƣợc : Thanh lọc với cặp mồi Am341: Cá thể số 91 không xuất hiện band. Có sự khác nhau về trọng lƣợng các band giữa các cá thể. Đồng thời có sự biến động về di truyền giữa các cá thể. Thanh lọc với cặp mồi Am 522: Có thu đƣợc đa hình giữa một số dòng. Cá thể số 142 và 178 có trọng lƣợng phân tử nhỏ hơn các dòng khác. . 55 Thanh lọc với cặp mồi Am 502. Thanh lọc với cặp mồi Am 770: Cặp mồi Am 770 cũng có thể sử dụng để nhận biết sự khác biệt giữa các cá thể: cá thể số 8 và 36 không có band. Thanh lọc với cặp mồi Am 326. 56 Tƣơng tự nhƣ mồi Am 770, cặp mồi Am 326 cũng đƣợc dùng để nhận biết cá thể 116, 10, 30, 169 và 134 với các cá thể khác. Nhƣ vậy 3 cặp mồi Am 326, Am 341 và Am 770 có thể đƣợc sử dụng để phân biệt với các cá thể khác trong thí nghiệm này. Cần thử nghiệm tiếp để tìm đƣợc căp mồi chung cho toàn bộ cá thể nghiên cứu. Kết quả thanh lọc các mồi SSR trong thí nghiệm này, bƣớc đầu đã cho thấy các mồi đều cho dạng đa hình giữa các cá thể, trong đó mồi Am 341 có thể phân biệt dùng để phân biệt cá thể số 91 (thuộc nhóm sinh trƣởng trung bình) với các cá thể khác. Cặp mồi Am 770 có thể đƣợc dùng để nhận biết cá thể số 8 (thuộc nhóm cá thể có sinh trƣởng nhanh), trong khi mồi Am 326 có thể dùng để nhận biết các cá thể 116, 10, 30, 169 và 134 với các thể khác. Tuy nhiên, cặp mồi Am 326 chỉ có thể sử dụng để tìm hiểu mối quan hệ di truyền giữa các cá thể chứ không sử dụng đƣợc để tìm hiểu mối liên kết của chỉ thị phân tử và tính trạng tăng trƣởng nhanh trong quần thể Keo lá tràm này đƣợc. Những thí nghiệm thanh lọc với các cặp mồi khác còn đang đƣợc tiếp tục tiến hành để phát hiện thêm các cặp mồi có thể dùng để phân biệt giữa các cá thể , đặc biệt là có liên quan đến tính trạng sinh trƣởng nhanh , và có thể đƣợc sử dụng trong công tác chọn giống Keo lá tràm theo hƣớng chất lƣợng với độ chính xác cao. 57 Phần 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Từ các kết quả thu đƣợc, chúng tôi rút ra một số kết luận nhƣ sau: Sử dụng lá keo non để ly trích sẽ thu đƣợc lƣợng DNA mẫu tốt nhất. Kết quả thanh lọc cho thấy cặp mồi Am 341, Am 326 và Am 770 có thể đƣợc sử dụng để tìm hiểu mối quan hệ của các cá thể. Tuy nhiên để sử dụng những chỉ thị này tìm hiểu sự liên hệ với tính trạng tăng trƣởng nhanh thi có thể sử dụng mồi Am 341 và Am 770. Luận văn thực hiện là một phần trong đề tài lớn với việc ứng dụng chỉ thị phân tử ADN trong chọn giống Keo lá tràm theo hƣớng tăng trƣởng nhanh. Tổng số mồi SSR dự kiến sử dụng là 50 cặp. Tuy nhiên do số kinh phí cấp hàng năm hạn chế nên mỗi năm chỉ đủ kinh phí mua 5-6 cặp mồi và hoá chất thí nghiệm. Vì thế, luận văn chỉ mới thực hiện bƣớc thanh lọc đƣợc trên 9 cặp mồi. Do số cặp mồi thanh lọc còn ít nên việc sử dụng phần mềm NTSYS để phân tích mối quan hệ di truyền sẽ chƣa đƣợc chính xác, vì thế luận văn chƣa thể có kết luận về mối quan hệ di truyền giữa các cá thể nghiên cứu. 58 5.2 Đề nghị Trong các công trình nghiên cứu tiếp theo về Microsatellite để mang lại các kết quả khả quan hơn trong việc thu nhận các đoạn DNA mã hoá cho các tính trạng chiều cao cây, thể tích thân, phẩm chất gỗ, khả năng chống chịu sâu bệnh.. cần lƣu ý một số vấn đề sau: - Tiếp tục áp dụng và hoàn thiện kỹ thuật Microsatellite để lập hồ sơ kiểu gene cho các giống và keo phục vụ cho việc trao đổi dữ liệu, thông tin về đa dạng di truyền giữa các giống, đồng thời phục vụ cho công tác lai tạo và chọn lọc giống. - Từ kết quả nghiên cứu lần này tiếp tục phát triển thêm, nhiều cặp mồi SSR cần phải đƣợc thử nghiệm, thanh lọc để chọn lựa primer phù hợp hơn cho việc đánh giá mối quan hệ di truyền gữa các cá thể Keo lá tràm một cách chính xác, để xây dựng cơ sở di truyền hoàn chỉnh và tin cậy cho các giống có phẩm chất cao tại Việt Nam nhằm tạo thuận lợi cho những nhận định, kiểm tra, phân tích sau này. -Cần chú ý thu thập thông tin về các QTL (Quantitive trait loci) có liên quan đến tính trạng tăng trƣởng nhanh để tìm đƣợc những cặp mồi thích hợp cho quá trình phân tích. Trên cơ sở đó, cặp mồi tìm đƣợc sẽ đƣợc dùng để xác định sự liên hệ với các tính trạng tăng trƣởng nhanh ở quần thể Keo lá tràm nghiên cứu. 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 1. Bùi Chí Bửu – Nguyễn Thị Lang – 1999: Di truyền phân tử - Những nguyên tắc căn bản trong chọn giống cây trồng- Nhà xuất bản Nông nghiệp Thành Phố Hồ Chí Minh. 2. Lê Trọng Cúc – 2002: Đa dạng sinh học và bảo tồn thiên nhiên – Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Hà Nội. 3. Đỗ Thị Hoàng Diễm :Luận văn khóa luận tốt nghiệp 2002-2006. 4. Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng – 1997: Sinh học phân tử - Nhà xuất bản giáo dục. 5. Bùi Việt Hải – 1998:Nghiên cứu một số cơ sở khoa học cho kỹ thuật tỉa thƣa rừng trồng Keo lá tràm cung cấp gỗ nguyên liệu giấy sợi vùng miền Đông Nam Bộ. 60 6. Phạm Thành Hổ : Bài giảng CNSH cây trồng. 7. Nguyễn Thị Lang – 2002: Các phƣơng pháp cơ bản trong nghiên cứu công nghệ sinh học – Nhà xuất bản Nông nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh. 8. Lâm Vỹ Nguyên: Luận văn khóa luận tốt nghiệp 2002-2006. 9. Phạm Bình Quyền - Nguyễn Nghĩa Thìn – 2002. Đa dạng sinh học - Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Hà Nội. 10. Nguyễn Nghĩa Thìn – 2005: Đa dạng sinh học và tài nguyên di truyền thực vật - Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Hà Nội. 11. Trần Ngọc Việt : Luận văn khóa luận tốt nghiệp 2002-2006. TÀI LIỆU TIẾNG NƢỚC NGOÀI 13. Butcher PA.; Decroocq S.;Gray Y. và Moran GF.,2000: Development, inheritance and cross- species amplification of Microsatellite markers from Acacia mangium. 14. Wickneswari R and Norwati M 199: Genetic diversity of natural population of Acacia auriculifofmis. Aust.J.Bot. 41:65-77. 15. Kenneth Berendzen, Iain Searle, Dean Ravenscroft, .v.v..,2005: A rapid and versatile combined DNA/RNA extraction protocol and its application to the analysis of a novel DNA marker set polymorphic between Arabidopsis thalian ecotypes Col-0 and Landsberg erecta 61 16. T. A. Holton, 1999. Plant Genotyping by Analysis of Microsatellites – Centre for Plant Conservation Genetics. Southern Cross University, Lisomore, Australia 17. Powell W; Morgante M; Andre C; Hanafey M; Vogel J; Tingey S; Rafalski A: The comparison of RFLP, RAPD, AFLP and SSR (Microsatellite) markers for germplasm analysis 18. Antonio A.F. Garcia, Luciana L. Benchimo, Antônia M.M. Barbosa, Isaias O. Geraldi: Comparison of RAPD, RFLP, AFLP and SSR markers for diversity studies in tropical maize inbred lines TRANG WEB PHỤ LỤC Phụ lục 1: Danh sách các dòng Keo trong thí nghiệm. STT Các dòng PT tốt Dòng PT TB Dòng PT chậm Dòng số V(cm3) Dòng số V (cm3) Dòng số V(cm3) 1 12 19.42 70 15.07 177 6.61 2 33 19.6 140 15.1 51 7.58 3 41 19.64 167 15.18 132 7.67 4 30 19.73 99 15.2 176 7.88 5 1b 19.85 94 15.23 104 7.9 6 1c 20.18 138 15.41 151 8.04 7 29 20.8 76 15.42 88 8.08 8 38 20.92 91 15.52 131 8.87 9 159 21.06 67 15.59 178 9.03 10 84 21.11 2 15.6 5 9.09 11 7 21.3 61 16.06 170 10 12 145 21.42 50 16.15 150 10.75 13 25 21.52 72 16.37 144 10.84 14 19 21.54 162 16.42 166 11.21 15 1f 21.59 11 16.48 148 11.32 16 158 21.73 4 16.95 92 11.43 17 9 21.86 10 16.99 47 11.79 18 8 22.51 23 17.22 175 11.82 19 36 23.21 71 17.22 135 12.26 20 3 23.4 65 17.23 103 12.36 21 34 23.76 16 17.25 142 12.48 22 18 24.02 71b 17.49 163 12.6 23 1k 24.27 89 17.66 168 12.75 24 44 24.45 31 17.75 169 12.86 25 57 24.5 137 17.84 136 12.88 26 85 25.16 97 18.02 86 13.26 27 13 25.45 152 18.1 56 13.33 28 1 25.57 78 18.15 73 13.49 29 58 25.82 172 18.22 83 13.56 30 147 26.65 81 18.23 87 13.72 31 64 27.87 60 18.41 82 13.85 32 1e 27.94 133 18.62 100 13.97 33 26 28.08 32 18.64 14 14,16 34 43 29.83