Khóa luận Sử dụng kỹ thuật RAPD khảo sát sự đa dạng di truyền của quần thể nấm Rhizoctonia solani gây bệnh khô vằn lúa

ả các lá trên cây lúa sẽ bị chết. Ở các vùng nhiệt đới, bệnh đốm vằn thƣờng làm cho hầu hết các lá trên cây lúa đều bị chết (theo Ou, 1983). 2.2.2. Điều kiện phát sinh và phát triển bệnh Mầm bệnh tồn lƣu trên đồng ruộng từ những cây lúa bị bệnh trong mùa trƣớc. Hạch của nấm nổi trên mặt ruộng trong quá trình làm đất. Nó có thể trôi giạt theo nƣớc và tiếp xúc với cây lúa, thông qua đó gây bệnh cho cây lúa. Nấm xâm nhập vào mô cây qua khí khổng hoặc có thể xuyên trực tiếp qua cutin (Ou, 1983). Thông thƣờng, nấm xâm nhập vào từ mặt trong của lá nhƣng đôi khi nấm cũng xâm nhập từ cả 2 mặt của phiến lá. Nấm có khả năng gây bệnh trong phạm vi nhiệt độ 23 - 350C, nhiệt độ tối thích là 300C- 320C, ẩm độ tƣơng đối 96 - 97% (theo Ou, 1983). Ngoài ra, khi đồng ruộng có lƣợng đạm quá cao sẽ kích thích 8 bệnh phát triển và lƣợng Kali quá thấp sẽ làm cho bệnh nặng thêm. Các cây lúa có tán rộng, bẹ dày sẽ ít nhiễm bệnh hơn so với các cây lúa thấp và có bẹ ngắn. Ngay sau khi các vết bệnh đầu tiên đã hình thành, sợi nấm mọc nhanh chóng trong cây lúa và các mô của chúng. Các vết bệnh sẽ phát triển ra 2 bên và lan rộng lên bên trên, sau đó, vết bệnh thứ 2 sẽ hình thành. Khi các vết bệnh còn non, các sợi nấm phát triển rất tích cực nhƣng đối với các vết bệnh đã bạc màu thì sợi nấm phát triển rất chậm. Bệnh có thể phát triển theo chiều ngang ( lây nhiễm sang cây bên cạnh) hoặc chiều đứng (bệnh phát triển từ gốc lên lá bông lúa). Bệnh phát triển càng cao thì năng suất sẽ càng giảm. Sự lây nhiễm chiều ngang của bệnh phụ thuộc nhiều vào điều kiện ngoại cảnh nhƣ: nhiệt độ, ẩm độ, mật độ sạ, cấy lúa… Ngƣợc lại, sự phát triển dọc của bệnh phụ thuộc nhiều vào cây lúa nhƣ giống kháng, lƣợng N, K trong thân cây. (Nguồn: www.mard.gov.vn) 2.2.3. Phòng và chống bệnh khô vằn lúa Hiện nay vẫn chƣa có đƣợc những phƣơng pháp trừ nấm hoàn toàn hiệu quả và an toàn cho môi trƣờng. Tuy nhiên, có thể dùng nhiều biện pháp để phòng bệnh nhƣ: Làm sạch cỏ. Cày bừa, lật đất để vùi hạch nấm. Đốt rơm rạ sau khi thu hoạch. Sạ cấy với mật độ thích hợp. Bón cân đối N - P - K, không nên bón N nhiều và bón thúc muộn. Ngoài ra, ta có thể dùng các thuốc hoá học nhƣ: validacin, anvil, rovral, monceren, topsin-m, carbenzim… để trừ bệnh. Các loại nấm đối kháng với R. solani nhƣ Trichoderma spp cũng là một trong những sự lựa chọn tốt. (Nguồn: www.mard.gov.vn) 9 2.3. Các phƣơng pháp thƣờng dùng trong nghiên cứu sự đa dạng di truyền 2.3.1. Phƣơng pháp RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) Trong phân tích genome, restriction endonuclease là nhóm enzyme có nhiệm vụ cực kỳ quan trọng. Đó là nhóm của DNase, ghi nhận các trình tự đặc biệt của nucleotide, và cắt DNA tại vị trí rất đặc biệt. Ngƣời ta xem nó nhƣ là chìa khóa để nghiên cứu kỹ thuật DNA tái tổ hợp (recombinant). Nguyên tắc của phƣơng pháp RFLP: sự đa hình chiều dài các đoạn DNA cắt bởi các enzyme giới hạn (restriction enzyme), là phƣơng pháp tạo nên các đoạn cắt khác nhau phân biệt đƣợc bằng điện di đồ, các đoạn cắt còn đƣợc gọi là các fingerprinting đặc trƣng cho từng phân tử DNA. Xử lý các mẫu DNA bằng cùng một enzyme cắt giới hạn, các gen có cấu trúc khác nhau tạo nên số lƣợng đoạn cắt có chiều dài khác nhau, còn những gen có cấu trúc hoàn toàn giống nhau tạo nên các đoạn cắt giống nhau. Quy trình của phƣơng pháp RFLP Quy trình phƣơng pháp RFLP thông thƣờng: - Tách chiết và tinh sạch DNA. - Cắt các mẫu DNA cần phân tích bởi cùng một enzyme cắt giới hạn. - Điện di và thực hiện phản ứng lai Southern blot. Quy trình phƣơng pháp RFLP dựa trên PCR (phƣơng pháp RFLP-PCR): - Tách chiết DNA tổng số. - Thực hiện phản ứng PCR để khuếch đại trình tự đích. - Xử lý các sản phẩm PCR bằng enzyme cắt giới hạn. - Phân tích trên gel các sản phẩm PCR đã đƣợc cắt. Phƣơng pháp này đã đƣợc rất nhiều ngƣời sử dụng để nghiên cứu về sự đa dạng di truyền. Năm 1988, Mc. Couch và ctv đã sử dụng marker phân tử RFLP để thiết lập bản đồ di truyền trên cây lúa bao gồm 135 loci. Bản đồ phủ trên 12 nhiễm sắc thể với tổng cộng 1389 cM trên genome cây lúa từ cặp lai IR34583 (Indica) và Bulu Dalam (Javanica). 10 Ba năm sau, Saito và ctv đã thiết lập 1 bản đồ khác dựa trên cặp lai kasalath (Indica) và FI134 (Japonica) với 347 RFLP marker, phủ trên 12 NST với tổng cộng 1.836 cM với 347 loci. ( theo Nguyễn Thị Lang, 2002). 2.3.2. Phƣơng pháp AFLP (Amplified fragment length polymorphism) AFLP đƣợc định nghĩa là sự đa hình các đoạn cắt khuếch đại, là kỹ thuật kết hợp giữa RFLP và PCR. AFLP sử dụng enzyme cắt giới hạn cắt DNA bộ gene, sử dụng những phân đoạn DNA làm khuôn cho phản ứng khuếch đại PCR. AFLP có thể dùng để phân biệt các cá thể rất gần nhau, thậm chí ngay cả những dòng đẳng gene. Sự khác nhau trong chiều dài các đoạn khuếch đại có thể do những thay đổi của các base trong vùng trình tự primer, hoặc thêm, mất đoạn ở giữa hai vị trí cắt. Thông thƣờng, restriction enzyme sử dụng trong AFLP là một cặp enzyme, một enzyme cắt thƣờng xuyên (tạo ra những trình tự nhỏ) và một enzyme cắt không thƣờng xuyên (nhằm hạn chế số lƣợng các đoạn cắt). Cặp enzyme thƣờng đƣợc dùng nhất là EcoRI - MseI. Sau khi cắt bằng cặp enzyme này, một trình tự nối mạch đôi (adaptor) sẽ đƣợc gắn vào hai đầu đoạn DNA cắt bằng enzyme ligase. Đoạn adaptor gồm 2 phần: phần trình tự lõi và phần trình tự đặc hiệu cho vị trí cắt enzyme. Mồi của phản ứng PCR đƣợc thiết kế dựa trên trình tự adaptor và chứa một trình tự chọn lọc khoảng vài nucleotide. Chỉ những phân đoạn DNA nào chứa cả trình tự adaptor và trình tự nucleotide chọn lọc mới đƣợc khuếch đại, chính trình tự chọn lọc sẽ làm giảm sự xuất hiện sản phẩm PCR và làm đơn giản quá trình phân tích. AFLP nhanh, không phức tạp nhƣ RFLP nhƣng vẫn khảo sát đƣợc toàn bộ gene. Kỹ thuật này đòi hỏi ít lƣợng DNA ban đầu, không cần biết trƣớc trình tự đích và độ lặp lại phản ứng cao, các primer sử dụng không cần đặc hiệu loài (các mồi thƣơng mại có thể dùng cho hầu hết các loài). Tuy nhiên AFLP là một marker trội, điều này làm hạn chế phân biệt cá thể đồng hợp và dị hợp. Năm 1999, Liu đã áp dụng phƣơng pháp AFLP để phân nhóm di truyền trên cây khoai lang. Ngoài ra, AFLP cũng đã đƣợc áp dụng thành công để xây dựng nên bản đồ QTL tìm đƣợc gen chịu mặn (theo Nguyễn Thị Lang, 2002). 11 2.3.3. Microsatellite Rải rác ở những vị trí khác nhau trên bộ gene eukaryote là những vùng có tính biến dị cao. Những vùng này có chứa các trình tự DNA gọi là VNTR (variable number tandem repeat) còn gọi là các tiểu vệ tinh. Các VNTR này đặc trƣng bởi số lần lặp lại của trình tự lõi (đơn vị trình tự) DNA nhƣ: (AC)n, (AG)n, (AT)n, (TAT)n, (TCT)n, (CAG)n …. Microsatellite là các VNTR có số đơn vị trình tự lõi từ 1-6bp, số lần lặp lại của microsatellite khoảng 70 lần. Do số lần lặp lại của mỗi microsatellite là khác nhau ở mỗi cá thể nên tính đa hình tạo ra khi sử dụng phƣơng pháp này là rất cao. Dựa trên trình tự DNA microsatellite đƣợc bảo tồn ở các cá thể cùng loài cho phép chúng ta thiết kế mồi để khuếch đại trình tự lặp lại trong toàn bộ kiểu gene, trình tự mồi sử dụng trình tự đặc hiệu ở hai đầu locus microsatellite. Kích thƣớc các đoạn DNA đƣợc khuếch đại thƣờng từ 100 - 200 bp. Kết quả tạo ra các đoạn DNA có chiều dài khác nhau phân tách trên gel polyacrylamide. Xác định trình tự đặc hiệu hai đầu locus microsatellite là bƣớc đầu tiên rất quan trọng trong việc phân tích kỹ thuật này. Do đó, việc sử dụng microsatellite gặp phải nhƣợc điểm lớn là phải xác định trình tự đặc hiệu cho mỗi locus đa hình. Ƣu điểm lớn nhất của microsatellite là có tính đa hình cao và là một marker đồng trội. Microsatellite đƣợc sử dụng rất nhiều trong phân tích genome, do tính đa hình phong phú, tiết kiệm thời gian so với các phƣơng pháp khác. Tại Việt Nam, phƣơng pháp microsatellite đã thành công trong việc phân nhóm di truyền lúa mùa địa phƣơng, xây dựng bản đồ gen rầy nâu và xây dựng bản đồ gen kháng mặn trên lúa (Nguyễn Thị Lang, 2002). 2.3.4. Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) 1.1.1. 2.3.4.1. Giới thiệu về kỹ thuật RAPD Kỹ thuật RAPD dựa trên kỹ thuật PCR, bằng cách sử dụng những primer ngắn (khoảng 10 nucleotide) có trình tự biết trƣớc, bắt cặp và nhân bản ngẫu nhiên những đoạn DNA có trình tự bổ sung với trình tự của các primer. Theo nguyên tắc, khi 2 cá thể hoàn toàn giống nhau, sau khi thực hiện phản ứng RAPD ở điều kiện 12 nhƣ nhau sẽ tạo ra số lƣợng các đoạn DNA bằng nhau và chiều dài các đoạn DNA tƣơng ứng bằng nhau. Khi có đột biến làm xuất hiện hay mất đi một vị trí bắt cặp ngẫu nhiên sẽ tạo ra số lƣợng và chiều dài các đoạn DNA khác nhau giữa các cá thể, vì vậy kỹ thuật RAPD có thể phát hiện đột biến. Kỹ thuật RAPD giúp nhận diện những chỉ thị phân tử (marker) trội (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999). Về cơ bản kỹ thuật RAPD đƣợc thực hiện theo ba bƣớc: - Tách chiết DNA tổng số, nhân DNA bằng máy PCR - Điện di trên gel agarose hoặc gel polyacrylamid - Xác định tính đa dạng di truyền bằng các phần mềm thông dụng (NTSYSpc, UPGMA cluster, Gelcompar, lập dendrogram) các số liệu thu đƣợc cho thấy sự gần gũi hoặc cách biệt di truyền của các mẫu nghiên cứu (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999). 1.1.2. 2.3.4.2. Một số vấn đề thƣờng gặp khi thực hiện phản ứng RAPD Nồng độ primer tối ƣu thƣờng nằm trong khoảng từ 0,2 – 0,3 mM. Nồng độ DNA mẫu khác nhau có thể làm thay đổi số băng trên bảng gel điện di. Vì vậy nồng độ DNA mẫu xem là thích hợp cho mỗi phản ứng: 10 – 50 ng/25 μl thể tích phản ứng. PCR buffer thƣờng đƣợc cung cấp theo Taq - polymerase và có thể có hoặc không có Mg2+. Kỹ thuật RAPD phụ thuộc rất nhiều vào nồng độ Mg2+, nếu nồng độ Mg2+ khác nhau thì sản phẩm RAPD sẽ khác nhau, sự thay đổi nồng độ Mg2+ thƣờng thay đổi số lƣợng băng DNA trên gel. Taq - polymerase của các nhà sản xuất khác nhau cho kết quả sản phẩm khác nhau rất lớn. Vì vậy, loại Taq - polymerase và nồng độ của Taq đòi hỏi phải chính xác và đƣợc xác định qua thực nghiệm. Việc chọn loại Taq polymerase phù hợp là rất quan trọng. 13 Chu kỳ nhiệt có thể có sự thay đổi về số chu kỳ và nhiệt độ, điều này phụ thuộc vào máy PCR và độ dày của eppendorf. RAPD thƣờng đƣợc tiến hành với 45 chu kỳ (KurtWeising và ctv, 1995). 2.3.4.3. Những ưu điểm của kỹ thuật RAPD Về mặt kĩ thuật : phƣơng pháp RAPD không đòi hỏi ta phải biết trƣớc trình tự gen của sinh vật cần nghiên cứu. Số lƣợng DNA cần thiết ít và không cần quá tinh sạch. Thời gian thực hiện ngắn, thao tác đơn giản. Về mặt kinh tế: chi phí thực hiện thấp. Kỹ thuật RAPD thƣờng đƣợc sử dụng kết hợp với những kỹ thuật cao cấp khác để đánh giá sự đa dạng di truyền và nhận diện chỉ thị phân tử có độ tin cậy cao (Nguyễn Thị Lang, 2002). 1.1.3. 2.3.4.4 Những hạn chế của kỹ thuật RAPD 1.1.4. Kỹ thuật RAPD có độ chính xác không cao và không ổn định. Khả năng nhân bản trong phản ứng PCR cao nhƣng khả năng xuất hiện đa hình thấp và độ tin cậy không cao. Khả năng nhận diện chỉ thị phân tử thấp và có độ tin cậy không cao (Nguyễn Thị Lang, 2002). 1.1.5. 2.3.4.5. Ứng dụng cũa kỹ thuật RAPD Kỹ thuật RAPD đƣợc phát minh và sử dụng ngay sau khi kỹ thuật PCR ra đời, mặc dù cho kết quả có độ tin cậy không cao nhƣng vẫn còn đƣợc sử dụng do ƣu điểm dễ thực hiện và chi phí thấp. Những ứng dụng của kỹ thuật RAPD: Đánh giá đa dạng di truyền: đã đƣợc áp dụng trên các đối tƣợng: cúc lai, cà phê, bắp, đậu nành, lúa mì, lúa mạch, dâu tây, khoai tây, cà chua.v.v. Cần quan tâm đến yếu tố nồng độ DNA, điều kiện thí nghiệm, chƣơng trình chạy PCR và cần lựa chọn primer thích hợp cho sự đa hình cao. Đối với nấm bệnh thực vật thì kỹ thuật RAPD đã đƣợc áp dụng để phân tích đa dạng di truyền của nhiều loại nấm khác nhau: Leptosphaeria maculans (Desm.) Ces. et de Not, Corynespora cassiicola (Nguồn: NUWS20050722.084916/public/04Chapter3.pdf). 14 Nhận diện chỉ thị phân tử: ở Việt Nam, nghiên cứu đa dạng di truyền và mối tƣơng quan giữa kiểu gen RGA và kiểu hình phản ánh bệnh đạo ôn của một số giống lúa ở Việt Nam (Nguyễn Thị Lang, 2002). Ngoài ra kỹ thuật RAPD còn đƣợc áp dụng xây dựng bản đồ gen (Nguyễn Thị Lang, 2002). 1.1.6. 2.3.4.6. Những cải tiến của kỹ thuật RAPD Đã có vài cải tiến của kỹ thuật RAPD đƣợc mô tả. Kỹ thuật thứ nhất là sử dụng cùng lúc 2 primer khác nhau thay vì sử dụng 1 primer nhƣ kỹ thuật RAPD thông thƣờng. Phƣơng pháp này có thể làm tăng hoặc giảm đi số băng so với khi sử dụng một primer. Việc lựa chọn, sử dụng cùng lúc 2 primer khác nhau một cách phù hợp cũng có thể làm tăng tính đa hình của những primer cho sản phẩm ít đa hình. Cải tiến thứ 2 là cắt DNA bằng các enzyme giới hạn trƣớc hoặc sau khi thực hiện phản ứng PCR. Sự cắt này cũng có thể tạo ra hai kết quả. Một là có thể làm giảm số lƣợng các băng khó xác định (complex band), điều đó làm dễ dàng hơn cho việc đánh giá đa dạng di truyền. Hai là tạo ra sự đa hình ở các mẫu có hạn chế về sự đa hình. Tuy nhiên việc sử dụng những cải tiến tuỳ thuộc vào chiến lƣợc nhằm làm tăng số chỉ thị đa hình có thể hoặc đạt đƣợc các chỉ thị đồng trội. Những cải tiến này có hạn chế là làm giảm đi lợi thế của kỹ thuật RAPD cụ thể là tốc độ, giá thành và sử dụng phức tạp hơn (Kurt Weising và ctv, 1995). 2.4. Các kết quả nghiên cứu về sự đa dạng di truyền của nấm R.solani 2.4.1.Nghiên cứu trong nƣớc Nguyễn Thị Nghiêm (1997) bằng phƣơng pháp đánh dấu phân tử với kỹ thuật PCR sử dụng hai primer chuyên biệt ERIC1 và ERIC2 đã chia 137 dòng nấm R. solani Kühn thu thập ở đồng bằng sông Cửu Long thành 33 nhóm nấm mang tính đa dạng di truyền khác nhau.(dẫn theo Nguyễn Thị Tiến Sỹ, 2005) Nguyễn Thị Huệ (2003), dựa trên kỹ thuật RFLP của vùng rDNA-ITS cho biết hai dòng nấm R. solani phân lập từ cây húng quế và cây bông cho các đoạn cắt giới hạn có kích thƣớc khác nhau khi đƣợc cắt bởi enzyme MboI. 15 Hồ Viết Thế (2005), khi cắt bằng enzyme HaeIII trên vùng rDNA-ITS của 4 dòng R. solani phân lập từ nhiều cây ký chủ khác nhau, đều cho hai đoạn cắt giống nhau. Do đó, không thể phân tích đƣợc tính đa hình về mặt di truyền của 4 dòng này khi cắt bằng enzyme HaeIII. (dẫn theo Nguyễn Thị Tiến Sỹ, 2005) Nguyễn Thị Tiến Sỹ (2005), dựa trên kỹ thuật RFLP của vùng ITS-rDNA với việc sử dụng 3 enzyme cắt TaqI, AluI, HaeIII đã nhận thấy có sự đa hình các đoạn cắt giới hạn trong vùng rDNA-ITS của 9 dòng R. solani phân lập từ các cây ký chủ khác nhau. 2.4.2 Các nghiên cứu ở nƣớc ngoài Ducan và ctv (1993) đã dùng phƣơng pháp RAPD để xác định tính đa dạng di truyền của 23 dòng nấm R. solani phân lập đƣợc với các primer T7 (GTAATACGACTCACTATAG), R1 (GTCCSTTCSGTCGGTGCT) , USP (GTAAAACGACGGCCAGT), họ đã tạo ra nhiều sản phẩm đa dạng trên bộ gen của nấm có kích thƣớc từ 0.1 đến 1.5 kb. Matsumoto và ctv. (1996), dựa trên phân tích RFLP của gen rDNA 28S đã chỉ ra sự khác nhau giữa 3 nhóm tiếp hợp AG-1, AG-2, và AG-4 khi cắt bằng các enzyme giới hạn BamHI, HaeIII, HhaI và HpaII. Năm 2004, Mayee và ctv đã sử dụng phƣơng pháp RAPD để nghiên cứu sự đa dạng di truyền của 20 dòng nấm R.solani phân lập đƣợc trên rễ cây bông vải ở Ấn Độ. Các nhà nghiên cứu này đã sử dụng 8 primer. Kết quả phản ứng RAPD đƣợc xử lí đã cho thấy hệ số di truyền của các dòng nấm này khoảng từ 0,35 -1 và hệ số di truyền trung bình của mỗi nguồn nấm là 0,67. Yang và ctv (1995) đã sử dụng phƣơng pháp RAPD để khảo sát sự đa dạng di truyền của các dòng nấm Rhizoctonia solani từ nhiều nơi khác nhau nhƣ: Western Australia, Newdegate, Esperance. Tất cả các dòng nấm đƣợc nghiên cứu đều thuộc AG-8. (Nguồn: www.cababstractsplus.org/google/abstract.asp?AcNo=2004305722) 1999, Bounoun và các ctv cũng dựa trên phản ứng RAPD để chia nhỏ phân nhóm AG-3 thành các nhóm phụ khác nhau. Họ đã sử dụng đến 40 primer. Các đoạn 16 đặc hiệu đƣợc xác nhận bằng kỹ thuật Southern blot. (Nguồn: Chƣơng 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 3.1. Thời gian và địa điểm - Thời gian: từ 01/03/2005 đến 30/08/2005 - Địa điểm: Trung tâm Phân Tích Thí Nghiệm, Trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. 3.2. Vật liệu nghiên cứu 3.2.1. Nguồn nấm 17 dòng phân lập nấm R. solani do Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật, khoa Nông Học cung cấp. Các dòng nấm này đƣợc phân lập từ các phiến lá và bẹ lá lúa bị bệnh khô vằn. Kí hiệu nấm và địa điểm thu thập đƣợc trình bày ở bảng 3.1. 3.2.2. Những hoá chất đƣợc sử dụng trong nghiên cứu 3.2.2.1. Những hoá chất sử dụng để li trích DNA: - Nitơ lỏng - Lysis buffer: 50 mM Tris-HCl, pH 7.2, 50 mM EDTA, 3% SDS, 1% β- mercaptoethanol. - Hỗn hợp phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1) - Hỗn hợp chloroform:izoamyl alcohol (24:1) - Natri acetate 3 M, pH 8.0 - Isopropanol 100%, Ethanol 70% - TE 1X: 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0. 3.2.2.2. Những hoá chất dùng để thực hiện phản ứng RAPD: - Dung dịch đệm PCR 5X (amplification buffer): 200 mM Tris-HCl (pH 8,4), 500 mM KCl) (Promega ) - MgCl2 25 mM (Promega) 17 - dNTP 10 mM (gồm dATP, dTTP, dGTP, dCTP) (Promega) - Taq DNA polymerase 5 UI/µl (Promega) - Primer (Bảng 3.2) Bảng 3.1. Kí hiệu và địa điểm thu thập 17 dòng phân lập nấm R. Solani đƣợc sử dụng trong nghiên cứu Bảng 3.2. Tên và trình tự của các primer đã sử dụng trong nghiên cứu Tên primer Trình tự (5’- 3’) OPL-08 AGCAGGTGGA OPL-05 GGGCGGTACT STT Kí hiệu nấm Địa điểm thu thập 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 L31 L38 L50 L54 L55 L56 L58 L59 L61 L63 L64 L651 L66 L72 L75 L781 L79 Cát Hải, Hải Phòng Quỳnh Lƣu, Nghệ An Dakmil, Dak Lak Phú Lộc, Thừa Thiên- Huế Đức Phổ, Quãng Ngãi Tuy Phƣớc, Bình Định Ninh Hoà, Khánh Hoà Chƣ Xê, Gia Lai Nhơn Trạch, Đồng Nai Đạ Tẻh, Lâm Đồng Châu Đức, Bà Rịa Vũng Tàu Đồng Xoài, Bình Phƣớc Tân Châu, Tây Ninh Cần Đƣớc, Long An Giồng Trôm, Bến Tre Hồng Dân, Bạc Liêu Mỹ Tú, Sóc Trăng 18 OPM-13 GGTGGTCAAG 3.2.2.3. Những hoá chất sử dụng để điện di sản phẩm RAPD - Agarose - TAE 0,5X - Loading dye 6X - Ethidium bromide 3.2.3. Các dụng cụ và thiết bị đƣợc sử dụng trong nghiên cứu 3.2.3.1. Các dụng cụ và thiết bị được sử dụng trong ly trích: - Khay đựng nitơ - Cối và chày sứ - Eppendorf 1,5 ml - Micropipette các loại - Đầu tip các loại - Bồn ủ nhiệt (water bath) - Máy vortex - Máy ly tâm lạnh - Tủ 4oC và - 20oC 3.2.3.2. Các dụng cụ và thiết bị được sử dụng trong phản ứng RAPD: - Hộp đá khô -20oC - Eppendorf 0,2 ml - Micropipette 10 µl, 100 µl và các loại đầu tip tƣơng ứng - Máy luân nhiệt - Tủ thao tác vô trùng 3.2.3.3. Các dụng cụ và thiết bị dùng trong điện di - Cân kĩ thuật 4 số - Lò viba - Khay đổ gel 19 - Bồn và máy điện di (Bio-rad) - Máy chụp hình gel (Gel doc). - Ống đong 3.3. Phƣơng pháp tiến hành 3.3.1. Ly trích DNA tổng số của nấm R. solani Quy trình ly trích DNA tổng số: dựa trên quy trình đƣợc đề xuất bởi Lee và Taylor (1990), đã đƣợc Nguyễn Thị Tiến Sỹ cải tiến năm 2005. Quy trình ly trích DNA tổng số - Nghiền 0,1 – 0,3 g sợi nấm đã đƣợc làm khô kiệt trong nitơ lỏng. - Thêm 600 µl lysis buffer và vortex cho tới khi hỗn hợp đồng nhất. Nếu hỗn hợp quá đặc thì cho thêm lysis buffer (cho tới 700 µl). - Ủ 30 phút ở 65oC. - Thêm một thể tích tƣơng ứng (600 µl) hỗn hợp phenol, chloroform và isoamyl alcohol (tỉ lệ 25:24:1), và lắc nhẹ. - Ly tâm 20 phút với tốc độ 13500 vòng/phút ở nhiệt độ phòng. - Chuyển dịch nổi (khoảng 400 µl) vào một ống eppendorf mới. - Thêm 400 µl hỗn hợp chloroform, izoamyl alcohol (24:1), lắc nhẹ. Ly tâm 20 phút với tốc độ 13500 vòng/phút ở nhiệt độ phòng (25 – 28oC). - Hút lấy dịch nổi (khoảng 200 µl) vào một eppendorf mới. - Kết tủa DNA bằng cách thêm 0,03 thể tích natri acetate 3M (6 µl) và 0,5 thể tích isopropanol (100 µl). Trộn nhẹ nhàng nhƣng cẩn thận. - Ly tâm 5 phút (14000 vòng/phút ở 4oC) - Loại bỏ dịch nổi, rửa phần kết tủa 3 lần với ethanol 70% lạnh. - Làm khô DNA kết tủa, hòa tan DNA với một thể tích TE 1X (từ 50-100 µl) và trữ ở 4oC hoặc -20oC cho đến khi sử dụng. - Kiểm tra sự có mặt và độ tinh sạch của DNA bằng cách điện di trên gel agarose. 3.3.2. Tối ƣu hoá phản ứng RAPD: 20 Phản ứng RAPD đƣợc thực hiện theo qui trình do Ducan và các cvt đề xuất năm 1993 (Bảng 3.3 và 3.4). Tuy nhiên khi thực hiện phản ứng RAPD theo qui trình này chúng tôi thấy thời gian thực hiện phản ứng quá dài (5 giờ), lƣợng hoá chất sử dụng quá nhiều cho một phản ứng và sản phẩm cũng chƣa thật tốt . Do đó, qui trình cần đƣợc tối ƣu để có thể rút ngắn thời gian thực hiện và có kết quả tốt . Bảng 3.3. Chu trình nhiệt của phản ứng RAPD Các bƣớc của phản ứng Nhiệt độ Thời gian Giai đoạn khởi động Chạy chu kỳ (45 chu kỳ) Tách DNA khuôn Ủ bắt cặp Kéo dài Giai đoạn kết thúc 94 o C 94 o C 36 o C 72 o C 72 o C 2 phút 1 phút 1 phút 2 phút 7 phút Bảng 3.4. Thành phần hoá chất để thực hiện phản ứng RAPD Hoá chất phản ứng Nồng độ gốc Thể tích sử dụng Nồng độ cuối PRC buffer MgCl2 dNTP’S Primer Taq polymerase DNA mẫu Nƣớc cất 5X 25 mM 10 mM 10 mM 5U/µl 20-50 ng/µl 5 µl 3 µl 1 µl 0,75 µl 0, 3µl 2 µl 11, 75 µl 1X 3 mM 0,4 mM 0,3 mM 1,5 U 20 -50 ng Tổng 25 µl 3.3.2.1. Thí nghiệm 1 : Khảo sát số lượng chu kì phản ứng : Mục đích của nghiệm thức này là khảo sát sự ảnh hƣởng của số chu kì nhiệt của phản ứng lên kết quả của phản ứng RAPD. 21 Chu trình nhiệt đƣợc thực hiện theo bảng 3.3 với số chu kì lần lƣợt thay đổi là 35, 40 và 45. Kết quả khảo sát đƣợc phân tích trên gel agarose 2% Đánh giá kết quả: dựa vào số băng hình thành và sự thể hiện rõ các băng. 3.3.2.2. Thí nghhiệm 2 : Khảo sát ảnh hưởng của các nồng độ hoá chất lên phản ứng RAPD: a/ Thí nghiệm 2.1 : Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ MgCl2 và primer lên phản ứng RAPD Mục đích: Xác định nồng độ MgCl2 và primer thích hợp cho phản ứng RAPD cho các dòng phân lập nấm R.solani. Nồng độ của MgCl2 và primer đƣợc lần lƣợt thay đổi trong các nghiệm thức để có thể tìm thấy nồng độ thích hợp nhất cho phản ứng RAPD (bảng 3.6). Các thành phần còn lại đƣợc giữ nguyên nhƣ ở bảng 3.4. Kết quả khảo sát đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp điện di trên gel. Đánh giá kết quả: số băng hình thành, độ rõ của các băng sản phẩm và không xuất hiện tạp. Bảng 3.5. Nồng độ MgCl2 và primer đƣợc khảo sát trong thí nghiệm 2.1 Nghiệm thức Hóa chất Nồng độ gốc Thể tích sử dụng Nồng độ cuối 1 MgCl2 Primer 25 mM 10 mM 3μl 0,75 μl 3 mM 0,3 mM 2 MgCl2 Primer 25 mM 10 mM 3,5 μl 0,75 μl 3,5 mM 0,3 mM 3 MgCl2 Primer 25 mM 10 mM 4 μl 0,75 μl 4 mM 0,3 mM 4 MgCl2 Primer 25 mM 10 mM 4 μl 1μl 4 mM 0,4 mM 5 MgCl2 25 mM 4 μl 4 mM 22 b/ Thí nghiệm 2.2 : Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ Taq polymerase và DNA mẫu lên phản ứng RAPD Mục đích: Xác định nồng độ Taq polymerase và DNA mẫu thích hợp cho phản ứng RAPD trên nấm R.solani. Sau khi đã chọn đƣợc nồng độ MgCl2 và primer thích hợp trong thí nghiệm 2.1, thí nghiệm 2.2 đƣợc thực hiện với nồng độ của Taq polymerase và DNA mẫu lần lƣợt thay đổi (bảng 3.7). Buffer, dNTP’S giữ nguyên nồng độ nhƣ ở bảng 3.4. Nồng độ MgCl2 và primer là nồng độ tối ƣu đã thu đƣợc trong thí nghiệm 2.1. Kết quả khảo sát đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp điện di trên gel. Đánh giá kết quả: số băng hình thành, độ rõ của các băng sản phẩm và không xuất hiện tạp. Bảng 3.6. Nồng độ DNA mẫu và Taq polymerase đƣợc khảo sát trong thí nghiệm 2.2 Primer 10 mM 0.5 μl 0,2 mM Nghiệm thức Hoá chất Nồng độ gốc Thể tích sử dụng Nồng độ cuối 23 3.3.3. Thực hiện phản ứng RAPD: Phản ứng RAPD đƣợc thực hiện theo qui trình nhiệt và thành phần hoá chất đã đƣợc tối ƣu sau các thí nghiệm trên. Kết quả phản ứng đƣợc điện di trên gel agarose 2%. Các băng sản phẩm điện di sẽ đƣợc mã hoá và xử lí bằng phần mềm NTYSYSpc 2.1. 3.3.4. Điện di sản phẩm RAPD Quy trình thực hiện Cho 0.5g agarose vào 25 ml dung dịch TAE 0,5X (nồng độ 2%). Đun sôi hỗn hợp trên khoảng hai phút trong lò viba. Để nguội ở nhiệt độ phòng còn khoảng 50oC. Đổ gel vào khay (đặt lƣợc tạo giếng trƣớc khi đổ gel), chú ý tránh bọt khí khi đổ gel. Để gel đông đặc lại ở nhiệt độ phòng, rút lƣợc ra khỏi gel, cho gel vào bồn điện di chứa dung dịch TAE 0,5X. Trộn 10µl sản phẩm RAPD với 4µl loading dye và cho vào giếng của gel. Vận hành máy điện di ở 50V trong khoảng 50 – 60 phút. 1 DNA mẫu Taq polymerase 20 - 50ng/µl 5 U/µl 2 µl 0,2 µl 1 U 2 DNA mẫu Taq polymerase 20-50 ng/µl 5 U/µl 2 µl 0,25 µl 1,25 U 3 DNA mẫu Taq polymerase 20-50 ng/µl 5 U/µl 2 µl 0,3 µl 1,5 U 4 DNA mẫu Taq polymerase 20-50 ng/µl 5 U/µl 1 µl 0,25 µl 1,25 U 24 Đọc kết quả điện di. 1.1.6.1. 3.3.5. Phân tích kết quả RAPD Các băng thu được từ kết quả điện di RAPD được mã hóa thành dạng nhị phân 0 và 1, băng nào có thì chuyển thành 1, băng không có chuyển thành 0. Bảng mã hóa được lưu dưới dạng file excel (xls) và chuyển sang phần mềm NTSYS phiên bản 2.1 để xử lý. Sơ đồ phân nhóm (dendrogram) và ma trận tương đồng được xây dựng bởi chương trình similarity và SAHN- UPGMA. Chƣơng 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả ly trích DNA tổng số của nấm R.solani Ly trích DNA là một quá trình quan trọng có tính quyết định để thực hiện các phản ứng tiếp theo trong các kỹ thuật nhƣ RAPD, PCR, RFLP..... Nếu sản phẩm ly trích lúc đầu không tinh sạch, có quá nhiều tạp chất hoặc DNA bị đứt gãy thì khi thực hiện các phản ứng sẽ không có đƣợc sản phẩm hoặc có thêm những sản phẩm không mong muốn. Đối với phản ứng RAPD, để có kết quả tốt và chính xác thì cần phải có những mẫu DNA tinh sạch. Theo qui trình li trích đã nêu ở mục 3.3.1, chúng tôi đã thu đƣợc những mẫu DNA khá tinh sạch để có thể thực hiện phản ứng RAPD (hình 4.1). 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 25 Hình 4.1 Ảnh điện di DNA tổng số của các dòng phân lập nấm R. solani. 1: L31, 2: L38, 3: L50, 4: L54, 5: L55, 6: L56, 7: L58, 8: L59, 9: L61, 10: L63, 11: L64, 12: L651, 13: L66, 14: L72, 15: L75, 16 : L781, 17: L79 Nguyễn Thị Tiến Sỹ (2005) đã li trích DNA tổng số của R. solani theo qui trình của Lee và Taylor (1990) có bổ sung thêm bƣớc li trích với hỗn hợp chloroform :izoamyl alcohol. Trong nghiên cứu này, DNA tổng số đã đƣợc li trích theo qui trình li trích của Nguyễn Thị Tiến Sỹ (2005) đã cải tiến nhƣng rút ngắn thời gian ủ các eppendorp chứa sợi nấm nghiền và lysis buffer ở 650C từ 1 giờ xuống còn 30 phút để tiết kiệm thời gian hơn nhƣng sản phẩm li trích vẫn rất tốt. Nhƣ vậy, qui trình mà chúng tôi đã thực hiện là khá tốt cho việc li trích DNA của nấm R.solani và rút ngắn đƣợc thời gian hơn so với qui trình của Nguyễn Thị Tiến Sỹ đã thực hiện. 4.2. Tối ƣu hoá phản ứng RAPD 4.2.1. Lƣợng DNA mẫu Lƣợng DNA mẫu ảnh hƣởng rất lớn lên kết quả của phản ứng RAPD. Nếu nồng độ DNA mẫu quá cao trong một phản ứng, nó sẽ làm ức chế phản ứng, làm phản ứng không có sản phẩm hoặc có nhiều sản phẩm phụ mà ta không mong muốn. Trong phản ứng RAPD, lƣợng DNA mẫu tối ƣu là khoảng 20-50 ng/µl. Do đó, trƣớc khi thực hiện phản ứng, chúng tôi đã tiến hành pha loãng mẫu để đạt đƣợc nồng độ DNA mong muốn. Tuỳ vào nồng độ của DNA tổng số mà pha loãng theo các mức độ khác nhau. DNA sau khi pha loãng đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose nồng độ 0.8% cùng với 1 mẫu DNA chuẩn có nồng độ 20 -50 ng. Khi các băng điện di trong các mẫu pha loãng có nầng độ DNA ngang bằng với băng của mẫu DNA chuẩn thì các các mẫu pha loãng đã đạt đƣợc nồng độ DNA mong muốn. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 26 Hình 4.2 Ảnh điện di DNA của các dòng phân lập nấm R. Solani sau khi pha loãng. 1: L31, 2: L38, 3: L50, 4:L54, 5: L55, 6: L56, 7: L58, 8: L59, 9: L61, 10: L63, 11: L64, 12: L651, 13: L66, 14: L72, 15: L75, 16 : L781, 17: L79, 18: băng DNA chuẩn 4.2.2. Khảo sát chu kì phản ứng: RAPD dùng trong thí nghiệm này đƣợc thực hiện theo qui trình nhiệt do Ducan và các cộng sự đề xuất năm 1993. Chu trình nhiệt này có 45 chu kỳ và bao gồm: quá trình biến tính 940C trong 1 phút, bắt cặp: 360C trong 1 phút và 720C trong 2 phút. Nhằm tiết kiệm thời gian mà vẫn có đƣợc kết quả tốt, chúng tôi đã tiến hành khảo sát số chu kì phản ứng của quy trình nhiệt lần lƣợt là 35, 40 và 45 chu kì. Kết quả khảo sát đƣợc trình bày ở hình 4.3. 1 2 3 27 Hình 4.3. Ảnh điện di sản phẩm RAPD của dòng nấm L651 với primer OPL-08 ở các số chu kì khác nhau của quy trình nhiệt. 1: 35 chu kì, 2: 45 chu kì, 3: 40 chu kì Hình 4.3 cho thấy, khi phản ứng RAPD thực hiện ở 35 chu kì, các băng có xuất hiện nhƣng rất mờ. Giữa 40 và 45 chu kì, sản phẩm phản ứng hầu nhƣ không có khác biệt gì nhiều về chất lƣợng sản phẩm. Các băng nhiều và rõ. Do đó, qui trình nhiệt có 40 chu kì đƣợc chọn để thực hiện các thử nghiệm tiếp theo. 4.2.3. Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ hoá chất lên phản ứng RAPD: Để phản ứng RAPD cho phản ứng tối ƣu nhất thì cần có sự tƣơng thích giữa các thành phần hoá chất trong phản ứng. Vì thế, với mục đích tối ƣu hoá phản ứng chúng tôi đã thay đổi lần lƣợt nồng độ của các chất trong phản ứng RAPD. Trƣớc hết chúng tôi đã khảo sát kết hợp 5 nồng độ của MgCl2 và primer. Các kết quả đƣợc thể hiện trong hình 4.4: Hình 4.4. Ảnh điện di sản phẩm RAPD của dòng nấm L66 và primer OPL-05 với các nồng độ MgCl2 và primer khác nhau. Lane 1-3: MgCl2: 3 mM, 4 mM, 4,5 mM, primer: 0,3 mM, lane 4-5: MgCl2: 4 mM, primer: 0,4mM, 0,5 mM Qua hình 4.4 cho thấy nghiệm thức thứ 5 (MgCl2: 4 mM, primer: 0,2 mM cho kết quả tốt nhất. Số băng nhiều nhiều và rõ. Đối với nghiệm thức 1 và 2 nồng độ MgCl2 (3 mM và 3.5 mM) quá thấp, làm giảm số băng sản phẩm điện di. Nồng độ primer cao cũng làm ức chế số lƣợng sản phẩm. Ở nghiệm thức 3,4 và 5 cùng 1 2 3 4 5 28 nồng độ MgCl2 (4 mM) nhƣng với nồng độ primer cao hơn (0,3 mM và 0,4 mM), số băng sản phẩm của nghiệm thức 3 và 4 ít hơn hẳn so với nghiệm thức 5. Nhƣ vậy, qua thí nghiệm 2.1, chúng tôi đã chọn nghiệm thức 5 với nồng độ của MgCl2 (4 mM) và primer (0,2 mM) khá tốt cho phản ứng RAPD.(bảng 4.1). Hình 4.5. Ảnh điện di sản phẩm RAPD của dòng nấm L 66 và primer OPL-05 với các nồng độ Taq và DNA mẫu khác nhau. Lane 1-3: Taq: 0,2 µl, 0,25µl, 0,3µl, DNA mẫu: 2µl, lane 4: taq: 0,25µl, DNA mẫu: 1µl Sau khi xác định đƣợc nồng độ của MgCl2 và primer cho RAPD, chúng tôi đã tiếp tục khảo sát 4 nồng độ khác nhau của Taq polymerase kết hợp với DNA mẫu. Kết quả đƣợc thể hiện qua hình 4.5. Thí nghiệm khảo sát nồng độ Taq và DNA mẫu (thí nghiệm 2.2) đƣợc thực hiện với nồng độ MgCl2 (4 mM) và primer 1 2 3 4 29 (0,2 mM) đã đƣợc xác định trƣớc đó. Ở thí nghiệm này, nghiệm thức 4 (Taq: 0,25µl và DNA mẫu: 1µl) cho kết quả tốt nhất. Ở nghiệm thức 1, lƣợng Taq ít (0,2 µl) nên không cho sản phẩm. Lƣợng Taq quá cao cũng ức chế phản ứng, tạo ít băng sản phẩm. Ngoài ra, lƣợng DNA mẫu cao (2 µl) cũng là 1 nguyên nhân ức chế phản ứng. Nhƣ vậy, nghiệm thức 4 đƣợc lựa chọn để thực hiện phản ứng RAPD của các dòng phân lập nấm R. solani trong khoá luận này. Sau khi thực hiện các thí nghiệm đã thu đƣợc thành phần hoá chất cho phản ứng RAPD khá tốt. Thành phần hoá chất này đƣợc trình bày ở bảng 4.1 và đƣợc sử dụng để khảo sát sự đa dạng di truyền của các dòng phân lập nấm R. solani. Bảng 4.1. Thành phần hoá chất cho phản ứng RAPD đƣợc sử dụng để khảo sát sự đa dạng di truyền của R. solani Hoá chất Nồng độ gốc Thể tích sử dụng Nồng độ CUỐI Buffer MgCl2 dNTP’S primer Taq polymerase DNA mẫu Nƣớc cất 5X 25 mM 10 mM 10 mM 5U 20-50 ng 5 µl 4 µl 1 µl 0,5 µl 0.25 µl 1µl 13,25 µl 1X 4 mM 0,4 mM 0,2 mM 1,25 U 20- 50 ng Tổng 25 µl 4.3. Phản ứng RAPD của các dòng phân lập nấm R. solani Sự đa dạng di truyền của các dòng phân lập nấm R.solani đƣợc khảo sát bằng phản ứng RAPD với 3 primer OPM-13, OPL-05, OPL-08. Sản phẩm của phản ứng đƣợc điện di trên gel agarose 2%. Các đoạn DNA có cùng trọng lƣợng phân tử sẽ di chuyển đến cùng một vị trí trên gel. Sự khác biệt giữa các dòng nấm đƣợc thể hiện bằng sự khác biệt về số lƣợng và vị trí của các băng DNA trên gel 30 Hình 4.6. Ảnh điện di sản phẩm RAPD của 17 dòng phân lập nấm R.solani với primer OPM-13. 1: L31, 2: L38, 3: L50, 4:L54, 5: L55, 6: L56, 7: L58, 8: L59, 9: L61, 10:L63, 11: L64, 12: L651, 13: L66, 14: L72, 15: L75, 16 : L781, 17: L79 Hình 4.7. Ảnh điện di sản phẩm RAPD của 17 dòng nấm R.solani với primer OPL - 05. 1: L31, 2: L38, 3: L50, 4:L54, 5: L55, 6: L56, 7:ladder, 8: L58, 9: L59, 10: L61, 11: L63, 12: L64, 13: L651, 14: L66, 15: L72, 16 : L75, 17: L781, 18: L79 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 31 Hình 4.8. Ảnh điện di sản phẩm RAPD của 17 dòng nấm R.solani với primer OPL - 08. 1: L31, 2: L38, 3: L50, 4:L54, 5: L55, 6: L56, 7: L58, 8: L59, 9: ladder, 10: L61, 11: L63, 12: L64, 13: L651, 14: L66, 15: L72, 16 : L75, 17: L781, 18: L79 Hình 4.6, 4.7 và 4.8 cho thấy cả 3 primer đều bắt cặp và cho ra những sản phẩm khá tốt với DNA của các dòng nấm R.solani. Với 2 primer OPL-08 và OPL- 05, sản phẩm RAPD tạo ra nhiều băng và đa số là các băng đa hình và chỉ có một băng đồng hình (primer OPM-13). Các băng này có kích thƣớc từ 100 đến 2000 bp. Đối với primer OPM-13, số băng không nhiều và nhỏ ( 100 đến 800 bp) nhƣng hầu hết là các băng đa hình. Qua hình 4.6, 4.7, và 4.8 ngoài các băng rõ còn có một số băng bị mờ hoặc hình điện di bị nhoè không rõ băng. Điều này có thể là do quá trình điện di không tốt làm cho băng tách không rõ. Cũng có thể là do điện cực bị cong. Ngoài ra, các băng mờ còn có thể do thao tác PCR không tốt hoặc qui trình chƣa phù hợp làm giảm lƣợng sản phẩm. Ngoài ra, sự tƣơng quan giữa nồng độ của các chất trong hỗn hợp phản ứng chƣa thật sự phù hợp hoàn toàn với nhau và với từng primer khác nhau cũng là nguyên nhân quan trọng làm sản phẩm RAPD không đƣợc tốt. Primer OPM-13 chỉ cho tối đa 5 băng sản phẩm (hình 4.6). Đây là primer cho sản phẩm có số băng ít nhất trong 3 primer đƣợc sử dụng. Tuy nhiên, các băng sản phẩm hầu nhƣ đều đa hình, chỉ có 1 băng đồng hình khoảng 300bp. Có 3 dòng nấm L61, L66 và L72 chỉ cho có 2 băng : 1 băng đồng hình và 1 băng đa hình. Điều này có thể là do đặc điểm di truyền của các dòng nấm làm hạn chế sự bắt cặp. Tuy vậy, 3 băng đa hình của 3 dòng nấm này có kích thƣớc khác nhau nên vẫn phân biệt đƣợc 3 dòng nấm này với nhau và với các dòng nấm khác trong đƣợc nghiên cứu trong khoá luận này. Băng sản phẩm lớn nhất 800bp chỉ xụất hiện duy nhất ở dòng nấm L64. Do đó có thể tiếp tục nghiên cứu primer này nhƣ chỉ thị phân tử cho các dòng nấm L61, L64, L66 và L72. Primer OPL-05 cho ra nhiều băng sản phẩm hơn trên các dòng nấm (hình 4.7). Cao nhất là 10 băng. Với primer này cũng không có dòng nấm nào cho sản 32 phẩm RAPD giống nhau và tất cả các băng đều đa hình. Các băng do primer này tạo ra có kích thƣớc khá lớn ( khoảng 250 bp đến 2 kb). Primer OPL-08 cho 11 băng sản phẩm, kích thƣớc khoảng 150 bp đến 1500bp (hình 4.8). Tất cả các băng đều là đa hình. Dòng nấm L61 chỉ cho 2 băng 350 bp và 550 bp, do đó có thể dễ dàng phân biệt dòng nấm này với 16 dòng nấm còn lại. Các dòng nấm L55, L56 và L58 có sản phẩm RAPD hoàn toàn giống nhau. Điều đó này cho thấy primer OPL-08 không thích hợp làm chỉ thị để phân biệt 3 dòng nấm này. 4.4. Đánh giá sự đa dạng di truyền của các dòng phân lập nấm R. solani Kết quả điện di sản phẩm RAPD đƣợc mã hoá dạng nhị phân, có băng ghi 1, không có băng ghi 0 (Phụ lục ). Số liệu thu đƣợc đem xử lí bằng phần mềm NTSYS 2.1. Kết quả đƣợc hiển thị theo bảng ma trận tỷ lệ tƣơng đồng (bảng 4.2) và sơ đồ phân nhóm (hình 4.9) 33 Hình 4.9. Sơ đồ phân nhóm của 17 dòng phân lập nấm R.solani dựa trên kết quả RAPD với 3 primer OPM-13, OPL-05 và OPL-08 34 Qua hình 4.9 cho thấy tỷ lệ tƣơng đồng di truyền của 17 dòng nấm sử dụng trong nghiên cứu này biến thiên từ 53 - 89 %. Sơ đồ phân nhóm (hình 4.9) có nhiều nhánh, từ đó cho thấy có sự đa dạng di truyền giữa các dòng nấm nghiên cứu. 17 dòng phân lập nấm R. solani đƣợc chia làm 2 nhóm lớn nhƣ sau : Nhóm 1 (N1) gồm 2 dòng nấm : L31, L38 có tỷ lệ tƣơng đồng khoảng 58%. Hai dòng nấm này có cùng hệ số di truyền, từ đó có thể thấy sự di truyền của 2 dòng nấm này có thể tƣơng đƣơng nhau. Nhóm 2 (N2) là 1 nhóm lớn gồm 15 dòng nấm có tỷ lệ tƣơng đồng khoảng 56 - 89% . Trong nhóm này thì dòng nấm L66 (N2.1) có tỷ lệ tƣơng đồng di truyền thấp nhất : 56% với các dòng nấm còn lại. Điều này cho thấy dòng nấm L66 rất khác biệt so với 14 dòng nấm còn lại. 14 dòng nấm còn lại (N2.2), có thể chia thành 2 nhóm nhỏ hơn : - N2.1.1 gồm 12 dòng nấm L50, L54, L55, L56, L58, L59, L61, L651, L72, L75, L781 và L79 có tỷ lệ tƣơng đồng di truyền từ 63 - 89%. Nhánh này chia làm nhiều nhánh nhỏ khác nhau. Điều này cho thấy là các dòng nấm này có cùng nguồn gốc nhƣng đã phân chia theo nhiều hƣớng khác nhau để thích nghi với môi trƣờng sống. Dựa vào sơ đồ phân nhóm ta có thể thấy di truyền của các dòng nấm khá xa nhau, nhƣ vậy có khả năng là sự mẫn cảm với thuốc bảo vệ thực vật của chúng có thể khác nhau. - N2.1.2 gồm 2 dòng nấm L63 và L64 với tỷ lệ tƣơng đồng là 68%. Hai dòng nấm này cùng chung 1 nhánh nên tuy hệ số tƣơng đồng của 2 dòng nấm này 35 khá thấp (68%) nhƣng xét về tƣơng quan di truyền thì 2 dòng nấm này có quan hệ gần nhau hơn so với tƣơng quan di truyền với 15 dòng nấm còn lại. Sơ đồ phân nhóm (hình 4.9) còn cho thấy sự khác biệt của các dòng nấm phân lập từ các vùng địa lí khác nhau. Hai dòng nấm L31 (Hải Phòng) và L38 (Nghệ An) (N1) thu thập từ miền Bắc và Bắc Trung bộ có tỷ lệ tƣơng đồng di truyền khá thấp với 15 dòng phân lập còn lại đƣợc thu thập tại miền Trung, miền Nam và Tây Nguyên. Điều này có thể là do khí hậu của miền Bắc và Bắc Trung bộ có 4 mùa rõ rệt và thƣờng có mùa đông rất lạnh nên các dòng nấm đã tự biến đổi nhằm phù hợp với vùng địa lí sinh sống. Trong 15 dòng phân lập nấm R. solani còn lại đƣợc thu thập từ miền Trung (L54, L55, L56, L58), Tây Nguyên (L50, L59, L63) và miền Nam (8 dòng còn lại) thì các dòng nấm phân lập từ Tây Nguyên có quan hệ khá gần với các dòng đƣợc phân lập từ miền Trung (tỷ lệ tƣơng đồng di truyền từ 65-84%), ngoại trừ dòng L63 (Lâm Đồng) có tƣơng quan di truyền rất gần với dòng L64 (Vũng Tàu) thu thập tại miền Đông Nam bộ (hình 4.9). Điều này cho thấy các dòng phân lập nấm R. solani đƣợc thu thập tại các vùng địa lí lân cận nhau thì sẽ có tƣơng quan di truyền gần nhau. 12 dòng phân lập ở miền Trung, Tây Nguyên và miền Nam (N2.1.1) có tỷ lệ tƣơng đồng di truyền khoảng 64% và chia làm 2 nhóm nhỏ trên sơ đồ phân nhóm. Hai nhóm này có chung một gốc. Điều này chứng tỏ các dòng phân lập nấm R. solani ở miền Trung, Tây Nguyên và miền Nam có chung một nguồn gốc nhƣng đã tiến hoá theo hai hƣớng khác nhau để phù hợp với môi trƣờng mới. Các dòng phân lập nấm R. solani ở miền Nam cũng phân thành 2 nhóm rõ rệt với tỷ lệ tƣơng đồng là 67% cho hai miền Đông Nam bộ và Tây Nam bộ. Các dòng nấm phân lập tại các tỉnh Tây Nam bộ (L72, L75, L781, L79) có sự di truyền gần nhau hơn với tỷ lệ tƣơng đồng di truyền lên đến 76% (hình 4.9). Trong khi đó, các dòng nấm phân lập từ các tỉnh vùng Đông Nam bộ (L61, L64, L651, L66) có tỷ lệ tƣơng đồng khá thấp, chỉ khoảng 66%. Hơn nữa, hai dòng nấm L64 và L66 có hệ số tƣơng đồng khá thấp (56 và 66%) và tách biệt khỏi nhóm của các dòng phân lập nấm thu thập từ miền Trung và miền Nam trên sơ đồ phân nhóm (hình 4.9). Điều 36 này cho thấy đã có sự phát sinh những dòng nấm mới để phù hợp với sự thay đổi của môi trƣờng. Ngoài ra, giữa các dòng phân lập nấm R. solani còn cho thấy sự khác biệt giữa các dòng nấm thu thập từ các vùng đất cao và thấp. Tỷ lệ tƣơng đồng di truyền giữa 2 dòng nấm L50 (thu thập ở Daklak) và L781 (thu thập ở Sóc Trăng) chỉ có 49%. Hay tỷ lệ tƣơng đồng của dòng phân lập R. solani thu thập tại Lâm Đồng (L63) và dòng nấm thu thập tại Sóc Trăng (L781) cũng chỉ có 49%. Điều này có thể là do sự khác biệt về khí hậu, nhiệt độ, ẩm độ và cả cách canh tác của các vùng này. Ma trận tỷ lệ tƣơng đồng di truyền (bảng 4.2) cũng cho thấy rằng : các dòng phân lập nấm R.solani ở các tỉnh gần nhau thì thƣờng gần giống nhau. Ví dụ các dòng phân lập R. solani thu thập từ Bạc Liêu và Sóc Trăng có tỷ lệ tƣơng đồng di truyền khá cao: 89% và tƣơng quan di truyền rất gần nhau (hình 4.9). Hay giữa 2 dòng phân lập R. solani thu thập từ Bình Định và Quãng Ngãi có tỷ lệ tƣơng đồng di truyền khoảng 84%. Điều này cho thấy các dòng phân lập nấm R. solani ở các vùng lân cận nhau sẽ có di truyền tƣơng tự nhau. Nhƣ vậy, có khả năng sự đáp ứng với các biện pháp phòng trừ của các dòng nấm ở các vùng lân cận nhau sẽ tƣơng tự nhau. Điều này sẽ giúp cho việc đƣa ra các biện pháp phòng trừ nấm bệnh một cách tốt hơn. Trong 17 dòng nấm phân lập dùng trong nghiên cứu này thì có dòng nấm L66 thu thập tại Tân Châu, Tây Ninh là có tỷ lệ tƣơng đồng di truyền thấp nhất, chỉ khoảng 56%. Điều này cho thấy có thể tại Tân Châu đã xuất hiện dòng nấm mới để thích nghi với các biện pháp phòng trừ nấm bệnh tại đây. Do đó, cần phải nghiên cứu thêm về dòng nấm này để có thể đƣa ra biện pháp phòng trừ hữu hiệu hơn. Nhƣ vậy, phân tích dữ liệu RAPD đã cho chúng ta thấy sự đa dạng di truyền của 17 dòng phân lập nấm R. solani trong khoá luận này. Ma trận tỷ lệ tƣơng đồng và sơ đồ phân nhóm còn cho thấy mối quan hệ di truyền giữa các dòng nấm. Các dòng nấm đƣợc thu thập tại các vùng càng gần nhau thì càng có tƣơng quan di truyền càng gần nhau và ngƣợc lại, các dòng thu thập tại các tỉnh càng xa nhau thì 37 tƣơng quan di truyền càng xa nhau. Ngoài ra, các dòng nấm thu thập từ các vùng có điều kiện khí hậu càng khác nhau thì có sự tƣơng quan di truyền càng xa nhau. Với phổ kí chủ rộng, nấm R. solani rất dễ dàng lây truyền bệnh cho các vùng đất nông nghiệp lân cận với vùng lúa đã bị bệnh. Các nhà khoa học đã chứng minh đƣợc có đến 188 loại cây thuộc 32 họ là kí chủ của dòng nấm R. solani gây bệnh trên lúa. Khi điều kiện không thuận lợi cho sự sống và sinh sản, R. solani có thể tồn lƣu trong đất nhiều năm chờ điều kiện thuận lợi hoặc biến đổi để phù hợp với môi trƣờng sống mới. Chính sự biến đổi đa dạng này đã gây khó khăn rất lớn cho việc phòng và trị nấm. Do đó, cần phải nghiên cứu nhiều hơn về di truyền của dòng nấm này để có thể xây dựng một chiến luợc phòng và trị nấm thực sự hiệu quả và an toàn cho môi trƣờng. 38 Chƣơng 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận - Li trích thành công DNA tổng số của 17 dòng phân lập nấm R. solani. - Xây dựng đƣợc qui trình RAPD khá tốt có thể dùng để phân tích sự đa dạng di truyền của các dòng phân lập nấm R. solani. - Dự trên dữ liệu phản ứng RAPD với 3 primer OPL-05, OPL-08 và OPM- 13 trên 17 dòng phân lập nấm R. solani gây bệnh khô vằn lúa có tỷ lệ tƣơng đồng di truyền từ 53% - 89%. 5.2. Đề nghị - Tăng số lƣợng mẫu và phạm vi lấy mẫu để có kết quả khái quát hơn. - Tăng số primer sử dụng trong phản ứng RAPD nhằm đạt đƣợc những kết quả chính xác hơn. - Tiếp tục tối ƣu hoá phản ứng RAPD cho các dòng phân lập nấm R. solani. 39 Chƣơng 6 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1. Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999. Di truyền phân tử : Những nguyên tắc cơ bản trong chọn giống cây trồng. NXB Nông Nghiệp, Tp. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 2. Đƣờng Hồng Dật, 1976. Sổ tay bệnh hại cây trồng tập 1. NXB Nông Thôn, Việt Nam. 3. Lê Văn Huy, 2006. Nghiên cứu đa dạng di truyền của quần thể nấm Corenespora cassiicola (Berk & Curt) Wei gây bệnh trên cây cao su (Hevea Brasiliensis Muell. Arg.) tại trại thực nghiệm Lai Khê, Viện nghiên cứu cao su Việt Nam bằng kĩ thuật RAPD. Luận văn tốt nghiệp ngành Công Nghệ Sinh Học. Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 4. Nguyễn Thị Huệ, 2003. Khảo sát một số đặc tính và đánh giá sự đa dạng của các mẫu phân lập Rhizoctonia solani thu thập từ một số cây kí chủ khác nhau. Luận văn tốt nghiệp ngành Nông Học. Đại học Nông Lâm, Tp. Hồ Chí Minh, Việt Nam 5. Nguyễn Thị Lang, 2002. Phƣơng pháp cơ bản trong nghiên cứu công nghệ sinh học. NXB Nông Nghiệp, Tp. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 6. Nguyễn Việt Long, 2001.Hiệu quả phòng trừ bệnh đốm vằn trên lúa của hai chủng vi khuẩn đối kháng với nấm Rhizoctonia solani trên ruộng lúa nƣớc ở Đồng Tháp. Luận văn thạc sĩ ngành Nông Học, Đại học Nông Lâm, Tp. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 40 7. Nguyễn Đức Lƣợng, 2001. Công nghệ sinh học. NXB đại học quốc gia, Tp. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 8. Nguyễn Đức Lƣợng và ctv., 2002. Công nghệ gen. NXB đại học quốc gia, Tp. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 9. Vũ Triệu Mân và Lê Lƣơng Tề, 1998. Giáo trình bệnh cây Nông Nghiệp. NXB Nông Nghiệp, Hà Nội, Việt Nam 10. Nguyễn Minh Nguyệt, 2003. Khảo sát một số đặc tính của nấm Rhizoctonia solani phân lập từ cây bông (Gossypium sp.) và cây bắp (Zea may L.). Luận văn tốt nghiệp ngành Nông học. Đại học Nông Lâm, Tp Hồ Chí Minh, Việt Nam 11. Ou S. H., 1983. Bệnh hại lúa (Viện Bảo Vệ Thực Vật dịch). NXB Nông Nghiệp, Hà Nội, Việt Nam. 12. Nguyễn Thị Tiến Sỹ, 2005. Sử dụng kỹ thuật RFLP khảo sát sự đa dạng di truyền của nấm Rhizoctonia solani phân lập từ nhiều cây ký chủ khác nhau. Luận văn tốt nghiệp ngành Công Nghệ Sinh Học. Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh, Việt Nam. Tiếng Anh 13. Carling D.E. and Sumner D.R., 1992. Rhizoctonia spp 157-165. In: Singlton L., Mihail J.D. and Rush C.M. (eds), Methods for research on soilborne phyto- pathogenic fungi. APS Press, St. Paul, Minnesota. 14. Ducan S, Barton JE and O’Brien PA, 1993. Analysis of variation in isolates of Rhizoctonia solani by random amplified polymorphic DNA assay. Mycologycal Research 97, 1075-1082 15. Fenille R. C., Ciampi M. B., Kuramae E. E., and Souza N. L., 2003. Identification of Rhizoctonia solani associated with soybean in Brazil by rDNA-ITS sequences. Fitopatol. bras. vol. 28. 16. Hsiang T. and Dean J. D., 2001. DNA sequencing for anastomosis grouping of Rhizoctonia solani isolates from Poa annua. International turfgrass society 9: 674-678. 41 17. Hugh G.Griffin, 1994. PCR Technology current innovations. CRC Press, Boca Raton , Ann Arbor, London, Tokyo. 179-209. 18. Kunigana S., Natsuaki T., Takeuchi T., and Yokosawa R., 1997. Sequence variation of the rDNA ITS regions within and between anastomosis groups in Rhizoctonia solani. Curr. Genet. 32: 237 – 243. 19. Kurt W., Hilde N., Kirsten W. and Weiland M., 1995. DNA fingerprinting in plant and fungi. CRC Press. 322p. 20. Lee S.B., and Taylor J.W., 1990. Isolation of DNA from fungal mycelia and single spores, In: Weising K., Nybom H., Wolff K., and Meyer W., 1995, DNA fingerprinting in plants and fungi. CRC Press, Boca Raton, Ann Arbor, London, Tokyo. p. 70-71. 21. Liu Z. L. và Sinclair J. B., 1992. Genetic diversity of Rhizoctonia solani anastomosis group 2. Phytopathology 82: 778 – 787. 22. Liu Z. L. và Sinclair J. B., 1993. Differentiation of intraspecific groups within anastomosis group 1 of Rhizoctonia solani using ribosomal DNA internal transcribed spacer and isozyme comparisions. Canadian Journal of Plant Phathology 15: 272 – 280. 23. Matsumoto M., Furuya N., Takanami Y. and Matsuyama N., 1996. RFLP analysis of the PCR-amplified 28S rDNA in Rhizoctonia solani. Mycoscience 37: 351 – 356. 24. Mayee C.D., Monga D., Sharma T.R., Rathore S.S, 2004. Differentiation of isolates of cotton root rot pathogens Rhizoctonia solani and R. bataticola using pathogenicity and RAPD markers. Journal of Plant Biochemistry and Biotechnology. 135-139. Wedsite 25. www.cabi.org 26. www.mard.gov.vn 27. www.ppd.gov.vn 42 28. NUWS20050722.084916/public/04Chapter3.pdf 29. www. Cababstarctsplus.org/google/abstract.asp?AcNo=2004305722 30. Chƣơng 7 PHỤ LỤC Bảng 7.1. Bảng số liệu mã hoá sản phẩm RAPD trƣớc khi xử lí bằng phần mềm NTYSYS L31 L38 L50 L54 L55 L56 L58 L59 L61 L63 L64 L651 L66 L72 L75 L781 L79 OPM-13 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 1 1 1 0 1 1 1 0 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 0 0 1 1 1 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 1 1 0 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 OPL-05 1 0 1 1 1 1 0 1 1 1 0 0 1 1 1 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 1 1 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 1 1 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 1 1 0 1 1 1 1 1 0 1 1 0 1 1 0 1 0 0 1 1 1 0 1 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 1 1 OPL-08 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 1 1 0 0 0 0 43 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 0 0 1 0 0 0 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 0 0 0 1 1 1 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 1 1 1 0 0 1 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0