Tách chiết, tinh sạch và tính chất của protease từ nội tạng và đầu tôm sú
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN IV
TÓM TẮT KHÓA LUẬN .V
DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT IX
DANH SÁCH CÁC BẢNG X
DANH SÁCH HÌNH VÀ ĐỒ THỊ XI
Chương 1. MỞ ĐẦU .1
1.1.ĐẶT VẤN ĐỀ 1
1.2.MỤC ĐÍCH VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI .2
Chương 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
2.1. KHÁI QUÁT CHUNG VỀ ENZYME .3
2.1.1. Lược sử các công trình nghiên cứu enzyme 3
2.1.2. Định nghĩa về enzyme .4
2.1.3. Cấu tạo phân tử .4
2.1.4. Danh pháp quốc tế và phân loại .6
2.1.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động enzyme 6
2.2. KHÁI QUÁT PROTEASE VÀ PROTEASE CỦA TÔM .8
2.2.1. Giới thiệu về tôm .8
2.2.2. Khái quát protease 10
2.2.2.1. Định nghĩa protease .10
2.2.2.2. Protease của tôm 11
2.2.2.3. Tình hình nghiên cứu protease trong nước và ngoài nước 12
a). Nghiên cứu trong nước 12
b). Nghiên cứu ngoài nước 13
2.2.3. Ứng dụng của protease .14
2.3. PHưƠNG PHÁP TÁCH VÀ LÀM SẠCH ENZYME TRONG NGHIÊN
CỨU 15
2.3.1. Phương pháp trích ly enzyme 15
2.3.2. Phương pháp làm sạch enzyme .16
2.3.3. Giới thiệu phương pháp sắc ký lọc gel .18
2.3.3.1. Bản chất của phương pháp .18
2.3.3.2. Chọn lựa và chuẩn bị gel 20
a). Chọn lựa gel .20
b). Chuẩn bị gel và bảo quản .20
2.3.3.3. Dựng cột và chuẩn bị mẫu .20
a). Dựng cột lọc gel .20
b). Chuẩn bị mẫu .21
2.3.3.4. Một số ứng dụng của phương pháp lọc gel 21
2.3.3.5. ưu và nhược điểm của sắc ký lọc gel 22
a). ưu điểm 22
b). Nhược điểm .22
2.4. XÁC ĐỊNH TRỌNG LưỢNG PHÂN TỬ BẰNG ĐIỆN DI SDS-PAGE .22
2.5. PHưƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG XÚC TÁC CỦA ENZYME .24
2.5.1. Phương pháp Biuret 24
2.5.2. Phương pháp Lowry 25
2.5.3. Phương pháp Bradford .25
2.5.4. Phương pháp BCA [Bicinchoninic Acid] (1985) 26
2.5.5. Phương pháp đo phổ .26
Chương 3. VẬT LIỆU VÀ PHưƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27
3.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM 27
3.2. VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ DỤNG CỤ NGHIÊN CỨU .27
3.2.1. Vật liệu 27
3.2.2. Hóa chất 28
3.2.3. Thiết bị 28
3.3. CÁC PHưƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐÃ ÁP DỤNG 29
3.4. PHưƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29
3.4.1. Chiết rút thu dịch chiết protease nội tạng và đầu tôm sú .29
3.4.2. Thu nhận chế phẩm protease 29
3.4.3. Bố trí thí nghiệm 30
3.4.3.1. Xác định dung môi và chế độ tách chiết protease từ nội tạng và đầu
tôm sú thích hợp 31
3.4.3.2. Xác định tác nhân tủa thích hợp và nồng độ thu CPT từ DC 32
3.4.3.3. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính protease của CPT .33
a). Nhiệt độ 33
b). pH .33
c). Nồng độ muối ăn 34
3.4.4. Tinh sạch enzyme bằng sắc ký lọc gel .35
3.4.5. Xác định trọng lượng phân tử bằng phương pháp điện di SDS-PAGE 35
3.4.6. Phương pháp xử lý số liệu .35
Chương 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .36
4.1. XÁC ĐỊNH DUNG MÔI VÀ TỶ LỆ CHIẾT TÁCH ENZYME .36
4.1.1. Khả năng tách chiết protease của nước cất ở các tỷ lệ khác nhau .36
4.1.2. Khả năng tách chiết protease của nước muối sinh lý ở các tỷ lệ khác
nhau .38
4.1.3. Khả năng tách chiết protease của đệm phosphate pH 7,0 ở các tỷ lệ khác
nhau .39
4.1.4. Khả năng tách chiết protease của đệm Tris-HCl pH 7,5 ở các tỷ lệ khác
nhau .41
4.1.5. Lựa chọn dung môi tách chiết protein-enzyme thích hợp .42
4.2. XÁC ĐỊNH TÁC NHÂN TỦA THU HỒI CHẾ PHẨM TỪ DC .44
4.2.1. Khả năng tủa protease của cồn ở các tỷ lệ khác nhau .44
4.2.2. Khả năng tủa protease của acetone ở các nồng độ khác nhau .46
4.2.3. Khả năng tủa protease của (NH ) SO ở các nồng độ muối bão hòa khác
4 2 4
nhau .47
4.2.4. So sánh khả năng tủa thu CPT của các tác nhân .49
4.3. KHẢO SÁT MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HưỞNG ĐẾN HOẠT TÍNH
PROTEASE CỦA CPT .51
4.3.1. Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính enzyme proease của CPT từ mẫu nội
tạng tôm sú 51
4.3.2. Ảnh hưởng pH đến hoạt tính protease của CPT từ mẫu nội tạng tôm sú
.52
4.3.3. Ảnh hưởng nồng độ muối ăn đến hoạt tính protease của CPT từ mẫu nội
tạng tôm sú 53
4.4. TINH SẠCH PROTEASE CPT BẰNG SẮC KÝ LỌC GEL 55
4.5. XÁC ĐỊNH TRỌNG LưỢNG PHÂN TỬ- ĐIỆN DI SDS – PAGE 59
Chương 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 64
5.1. KẾT LUẬN 64
5.2. ĐỀ NGHỊ 65
TÀI LIỆU THAM KHẢO 66
PHỤ LỤC .1
Phụ lục chương 3 69
1. Phương pháp xác định hàm lượng protein theo Bradford 1
2. Xác định hoạt tính protease bằng phương pháp Amano 3
3. Phương pháp sắc ký lọc gel 7
4. Điện di SDS-PAGE .9
a). Chuẩn bị hộp điện di 9
b). Chuẩn bị mẫu protein .10
c). Đưa mẫu vào các giếng 10
Phụ lục chương 4 80
DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng Trang
Bảng 2.1. Nội dung các nhóm phương pháp xác định khả năng xúc tác của enzyme
. 24
Bảng 4.5. Hàm lượng protein và hoạt tính protease từ DC của các dung môi của
mẫu nội tạng và đầu 42
Bảng 4.9. Ảnh hưởng của tác nhân tủa đến hoạt tính protease và hàm lượng
protease của CPT . 49
Bảng 4.14. Hoạt tính riênng, độ tinh sạch và hiệu suất tinh sạch của enyzme
protease sau sắc ký lọc gel 58
Bảng 4.16. Trọng lượng phân tử protein mẫu nội tạng chạy điện di SDS-PAGE 62
Bảng 4.17. Trọng lượng phân tử protein mẫu đầu chạy điện di SDS-PAGE . 62
DANH SÁCH HÌNH VÀ ĐỒ THỊ
Hình Trang
Hình 2.1. Tôm sú . 9
Hình 2.2. Công thức cấu tạo protease . 10
Hình 2.3. Nguyên tắc hoạt động của sắc ký 17
Hình 2.4. Tách các phân tử bằng lọc gel . 18
Hình 2.5. Sắc ký lọc gel loại muối 21
Hình 2.6. Công thức cấu tạo chất màu Coomassie. 26
Hình 3.1. Mẫu nội tạng và đầu tôm sú 27
Hình 4.1. Sắc ký đồ kết quả tinh sạch với Bio-Gel P 100 của CPT tủa
cồn từ DC mẫu nội tạng 55
Hình 4.2. Sắc ký đồ kết quả tinh sạch với Bio-Gel P 100 của CPT tủa
cồn từ DC mẫu đầu tôm 55
Hình 4.3. Sắc ký đồ kết quả tinh sạch với Bio-Gel P100 của CPT tủa
acetone từ DC mẫu nội tạng 56
Hình 4.4. Sắc ký đồ kết quả tinh sạch với Bio-Gel P100 của CPT tủa
acetone từ DC mẫu đầu tôm . 56
Hình 4.5. Sắc ký đồ kết quả tinh sạch với Bio-Gel P 100 của CPT tủa muối
(NH ) SO từ DC mẫu nội tạng . 57
4 2 4
Hình 4.6. Sắc ký đồ kết quả tinh sạch với Bio-Gel P 100 của CPT tủa
muối (NH ) SO từ DC mẫu đầu . 57
4 2 4
Hình 4.7. Kết quả điện di enzyme sau tinh sạch của mẫu nội tạng 60
Hình 4.8. Kết quả điện di enzyme sau tinh sạch của mẫu đầu 60
Đồ Thị
Đồ thị 4.1. Ảnh hưởng tỷ lệ (NT/nước cất) đến hoạt tính protease và hàm lượng
protein của DC nội tạng 36
Đồ thị 4.2. Ảnh hưởng tỷ lệ (đầu /nước cất) đến hoạt tính protease và hàm lượng
protein của DC đầu tôm sú 37
Đồ thị 4.3. Ảnh hưởng tỷ lệ (NT/nước muối sinh lý) đến hoạt tính protease
và hàm lượng protein của DC nội tạng . 38
Đồ thị 4.4. Ảnh hưởng tỷ lệ (đầu/nước muối sinh lý) đến hoạt tính protease
và hàm lượng protein của DC đầu 38
Đồ thị 4.5. Ảnh hưởng tỷ lệ (NT/đệm phosphate) đến hoạt tính protease
và hàm lượng protein của DC nội tạng 39
Đồ thị 4.6. Ảnh hưởng tỷ lệ (đầu/đệm phosphate) đến hoạt tính protease
và hàm lượng protein của DC đầu 40 .
Tách chiết, tinh sạch và tính chất của protease từ nội tạng và đầu tôm sú
96 trang |
Chia sẻ: maiphuongtl | Lượt xem: 2647 | Lượt tải: 1
Bạn đang xem trước 20 trang tài liệu Khóa luận Tách chiết, tinh sạch và tính chất của protease từ nội tạng và đầu tôm sú (Penaeus monodon), để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
i tạng
0
5
10
15
20
2
3
35
40
Nước (1/4) Muối (1/3) Đệm P (1/7) Tris-HCl (1/7)
Dung môi chiết
Hà
m
lượ
ng
pr
ote
in
(m
g/g
)
0
20
40
60
80
100
120
14
Ho
ạt
tín
h p
ro
tea
se
(U
/g)
HL HT
Đồ thị 4.10. Ảnh hƣởng loại dung môi chiết đến hoạt tính protease và hàm
lƣợng protein của DC đầu
Nhận xét: Từ đồ thị 4.9 và đồ thị 4.10 cho thấy khả năng chiết của dung môi
khác nhau và ảnh hƣởng rất nhiều đến hoạt tính protease và hàm lƣợng protein của
DC.
Mẫu nội tạng: với dung môi Tris-HCl cho kết quả hàm lƣợng protein và
hoạt tính protease DC tốt nhất.
Mẫu đầu: thì dung môi Tris-HCl cho kết quả hoạt tính protease DC tốt
nhất, nhƣng hàm lƣợng protein của DC cho kết quả tốt với dung môi nƣớc
cất.
44
Dung môi đệm phosphate và Tris-HCl có khả năng tách chiết protein-
enzyme của mẫu nội tạng cho kết quả hàm lƣợng protein và hoạt tính enzyme tốt
hơn dung môi nƣớc cất và muối sinh lý. Điều này có thể do dung môi đệm Tris-HCl
đảm bảo đƣợc điều kiện pH của môi trƣờng phù hợp khả năng khuếch tán protein
của protease hệ tiêu hóa tôm vào DC, hiệu suất thu hồi protein-enzyme mong muốn
tốt hơn. Để rõ hơn các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình tách chiết protease nhƣ: pH,
nhiệt độ ủ, thời gian ủ cần phải nghiên cứu sâu hơn.
Lƣợng protein của DC mẫu đầu bằng dung môi nƣớc cất cao nhất, nhƣng
hiệu suất thu hồi protease không cao, protein thu hồi không thể hiện hoạt tính
protease.
Nhƣ vậy, chọn dung môi chiết đệm Tris-HCl 0,05M pH 7,5 với tỷ lệ
mẫu/dung dịch đệm Tris-HCl = 1/7 (w/v) để thu DC sử dụng trong các thí nghiệm
tiếp theo.
4.2. XÁC ĐỊNH TÁC NHÂN TỦA THU HỒI CHẾ PHẨM TỪ DC
Dung môi hữu cơ thƣờng để kết tủa thuận nghịch protase trong DC mà
không làm giảm hoạt tính của chúng là ethanol (cồn 96o) và acetone. Hóa chất
thƣờng dùng để kết tủa thuận nghịch protease trong DC mà không giảm hoạt tính
protease của chúng là muối (NH4)2SO4. Quá trình kết tủa protase muốn đạt đƣợc
hiệu suất cao mà không làm giảm nhiều hoạt tính enzyme và hàm lƣợng protein của
CPT cần phải tiến hành trong điều kiện lạnh 0 - 4oC, tỷ lệ hay nồng độ của tác nhân
tủa và điều kiện tủa thích hợp nhất.
4.2.1. Khả năng tủa protease của cồn ở các tỷ lệ khác nhau
Chuẩn bị DC nội tạng và đầu của dung môi chiết Tris-HCl (tỷ lệ 1/7), tiến
hành tủa bằng cồn 96o với các tỷ lệ DC/cồn (v/v) lần lƣợt là: 1/1; 1/2; 1/3; 1/4; 1/5;
1/6; 1/7; 1/8 ở 4oC thời gian tủa là 60 phút. Ly tâm lạnh ở 4oC, tốc độ 6.000
vòng/phút trong 15 phút thu tủa là chế phẩm enzyme thô (CPT). Chế phẩm enzyme
thô này đƣợc hòa với dung dịch đệm phosphate 0,1M pH 7,0 (lƣợng ít nhất), đƣa về
45
cùng thể tích. Xác định hàm lƣợng protein và hoạt tính protease của CPT. Kết quả
trình bày trong bảng 4.6 (Phụ lục chƣơng 4), đồ thị 4.11 và đồ thị 4.12.
0
2
4
6
8
10
12
14
1/1 1/2 1/3 1/4 1/5 1/6 1/7 1/8
Tỷ lệ DC mẫu NT/cồn (v/v)
H
àm
lư
ợn
g
pr
ot
ei
n
(m
g/
g)
0
100
200
300
400
500
600
H
oạ
t t
ín
h
pr
ot
ea
se
(U
/g
)
HL HT
Đồ thị 4.11. Ảnh hƣởng của tỷ lệ (DC NT/cồn) đến hoạt tính protease và hàm
lƣợng protein của CPT
0.00
2.00
4.00
6.00
8.00
10.00
12.00
14.00
16.00
18.00
20.00
1/1 1/2 1/3 1/4 1/5 1/6 1/7 1/8
Tỷ lệ DC mẫu đầu/cồn (v/v)
H
àm
lư
ợn
g
pr
ot
ei
n
(m
g/
g)
0.00
20.00
40.00
60. 0
80.0
100.00
120.00
140.00
H
oạ
t t
ín
h
pr
ot
ea
se
(U
/g
)
HL HT
Đồ thị 4.12. Ảnh hƣởng của tỷ lệ (DC đầu/cồn) đến hoạt tính protease và hàm
lƣợng protein của CPT
Nhận xét: Qua kết quả thực nghiệm cho thấy, khi tăng thể tích cồn lên thì
khả năng tủa protein cũng tăng. Điều này có thể giải thích: khi tăng thể tích cồn làm
tăng diện tích tiếp xúc của các phân tử protein trong DC với dung môi cồn, sẽ tách
triệt để hơn các phân tử nƣớc bao xung quanh phân tử protein, làm giảm tính tan
của protein, tăng khả năng tủa của chúng. Khi tỷ lệ DC/cồn ở 1/6 (v/v) thì có hiệu
46
suất thu hồi protein có hoạt tính protease tốt nhất. Hiệu suất này không duy trì khi
tiếp tục tăng lƣợng cồn lên tỷ lệ 1/7 và 1/8, khi đó khả năng tủa protease sẽ giảm,
protein không mong muốn và các tạp chất kết tủa sẽ tăng ảnh hƣởng đến hoạt tính.
Vì vậy chọn tác nhân tủa cồn với tỷ lệ 1/6 (v/v) để kết tủa thu CPT trong các nghiên
cứu tiếp theo.
4.2.2. Khả năng tủa protease của acetone ở các nồng độ khác nhau
Chuẩn bị DC nội tạng và đầu của dung môi chiết Tris-HCl (tỷ lệ 1/7), tiến
hành tủa bằng acetone với các nồng độ (%) lần lƣợt là: 50%, 55%, 60%, 65%, 70%,
75%, ở 4oC trong 60 phút. Ly tâm thu CPT. Xác định hàm lƣợng protein và hoạt
tính protease của CPT. Kết quả trình bày trong bảng 4.7 (Phụ lục chƣơng 4), đồ thị
4.13 và đồ thị 4.14.
0
2
4
6
8
10
12
14
16
50% 55% 60% 65% 70% 75%
Nồng độ % acetone với DC mẫu nội tạng
H
àm
lư
ợn
g
pr
ot
ei
n
(m
g/
g)
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
H
oạ
t t
ín
h
pr
ot
ea
se
(U
/g
)
HL HT
Đồ thị 4.13. Ảnh hƣởng nồng độ acetone đến hoạt tính protease và hàm lƣợng
protein của CPT từ mẫu nội tạng
47
15.5
16
16.5
17
17.5
18
18.5
50% 55% 60% 65% 70% 75%
Nồng độ % acetone với DC mẫu đầu
H
àm
lư
ợn
g
pr
ot
ei
n
(m
g/
g)
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
H
oạ
t t
ín
h
pr
ot
ea
se
(U
/g
)
HL HT
4.14. Ảnh hƣởng nồng độ acetone đến hoạt tính protease và hàm lƣợng protein
của CPT từ mẫu đầu
Nhận xét:
Từ đồ thị 4.13và đồ thị 4.14 cho thấy tác nhân acetone kết tủa protein của
DC từ mẫu nội tạng ở nồng độ 65% cao nhất, của DC từ mẫu đầu ở nồng độ 55%.
Nội tạng tôm là nơi chứa hệ protease nhiều nhất, giúp cho quá trình tiêu hóa thức ăn
cung cấp năng lƣợng cho tôm. Điều mong muốn của chúng tôi là thu protease từ nội
tạng tôm, chính vì thế chúng tôi chọn nồng độ acetone 65% để tủa thu hồi CPT cho
các thí nghiệm tiếp theo.
4.2.3. Khả năng tủa protease của (NH4)2SO4 ở các nồng độ muối bão
hòa khác nhau
Chuẩn bị DC mẫu nội tạng và đầu của dung môi chiết Tris-HCl (tỷ lệ 1/7),
tiến hành tủa bằng muối sulfate amon với các nồng độ phần trăm bão hòa lần lƣợt là
50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, ở 4oC trong 60 phút, ly tâm thu CPT. Xác định
hàm lƣợng protein và hoạt tính protease. Kết quả trình bày trong bảng 4.8 (Phụ lục
chƣơng 4), đồ thị 4.15 và đồ thị 4.16.
48
0
5
10
15
20
25
50% 55% 60% 65% 70% 75%
Nồng độ % muối bão hòa với DC mẫu nội tạng
Hà
m
lư
ợn
g p
ro
te
in
(m
g/
g)
360
380
400
420
440
460
480
500
520
Ho
ạt
tí
nh
pr
ot
ea
se
(U
/g
)
HL HT
Đồ thị 4.15. Ảnh hƣởng nồng độ phần trăm muối (NH4)2SO4 bão hòa đến hoạt
tính protease và hàm lƣợng protein của CPT từ mẫu nội tạng
0
5
10
15
20
25
50% 55% 60% 65% 70% 75%
Nồng độ % muối bão hòa với DC mẫu đầu
H
àm
lư
ợn
g
pr
ot
ei
n
(m
g/
g)
0
20
40
60
80
100
1 0
1 0
H
oạ
t t
ín
h
pr
ot
ea
se
(U
/g
)
HL HT
Đồ thị 4.16. Ảnh hƣởng nồng độ phần trăm muối (NH4)2SO4 bão hòa đến hoạt
tính protease và hàm lƣợng protein của CPT từ mẫu đầu
Nhận xét:
Từ đồ thị 4.15 và đồ thị 4.16 cho thấy nồng độ muối (NH4)2SO4 bão hòa 70%
thì CPT của mẫu nội tạng và mẫu đầu có hoạt tính protease và hàm lƣợng protein
cao nhất so với các nồng độ muối bão hòa khác. Vì vậy, chọn nồng độ muối
(NH4)2SO4 bão hòa 70% để tủa thu hồi CPT sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.
49
4.2.4. So sánh khả năng tủa thu CPT của các tác nhân
Khả năng tủa của mỗi tác nhân ảnh hƣởng rất nhiều đến hoạt tính protease và
hàm lƣợng protein của CPT. Tiến hành so sánh khả năng tủa của các tác nhân: cồn
(tỷ lệ 1/6 v/v), acetone (65%) và muối sulfate amon 70%. Kết quả so sánh đƣợc
trình bày trong bảng 4.9, đồ thị 4.17 và đồ thị 4.18 sau:
Bảng 4.9. Ảnh hƣởng của tác nhân tủa đến hoạt tính protease và hàm lƣợng
protease của CPT
Tác nhân tủa
Nội tạng Đầu
HL
protein
(mg/g)
HT
protease
(U/g)
HTR
(U/mg)
HL
protein
(mg/g)
HT
protease
(U/g)
HTR
(U/mg)
CỒN 1:6 11,83 490,19 41,45 18,40 121,98 6,63
ACETON 65% 14,80 471,98 31,70 17,00 106,00 6,24
(NH4)2S04 70% 22,70 496,49 21,74 23,00 122,73 5,34
0
5
10
15
20
25
CỒN 1:6 ACETON 65% Sulfateamon 70%
Tác nhân tủa
Hà
m
lư
ợn
g p
ro
te
in
(m
g/
g)
455
460
465
470
475
480
485
490
495
500
Ho
ạt
tí
nh
pr
ot
ea
se
(U
/g
)
HL HT
Đồ thị 4.17. Ảnh hƣởng của các tác nhân tủa đến hoạt tính protease và hàm
lƣợng protein của CPT từ DC mẫu nội tạng
Từ đồ thị 4.17 ta thấy, khả năng tủa các tác nhân cũng ảnh hƣởng rất lớn đến
hoạt tính protease và hàm lƣợng protein của CPT. Tác nhân tủa (NH4)2SO4 70% cho
kết quả tủa tốt nhất. Tuy nhiên hoạt tính riêng khi tủa bằng cồn cao hơn tủa bằng
acetone 1.769 lần và cao hơn tủa bằng (NH4)2SO4 1,213 lần.
50
0
5
10
15
20
25
CỒN 1:6 ACETON 65% Sulfateamon 70%
Tác nhân tủa
Hà
m
lư
ợn
g p
ro
te
in
(m
g/
g)
95
100
105
110
115
120
125
Ho
ạt
tí
nh
pr
ot
ea
se
(U
/g
)
HL HT
Đồ thị 4.18. Ảnh hƣởng của các tác nhân tủa đến hoạt tính protease và hàm
lƣợng protein của CPT từ DC mẫu đầu
Kết quả khảo sát CPT từ DC mẫu đầu không có sự khác biệt so với CPT từ
mẫu nội tạng. Tủa bằng (NH4)2SO4 70% cũng cho kết quả hoạt tính protease và hàm
lƣợng protein của CPT tốt hơn tủa bằng cồn và acetone, nhƣng hoạt tính riêng của
CPT tủa bằng cồn vẫn cho kết quả tốt nhất.
Chúng ta thấy: sử dụng cồn làm tác nhân tủa thì giá thành rẻ, quá trình thu
CPT đơn giản, nhanh (chỉ cần đƣa bột nhão thu đƣợc sau khi ly tâm vào tủ chân
không), sau khi làm khô, hoạt tính enzyme không giảm. Tiến hành thu hồi lƣợng
cồn trong khối dịch sau khi thu kết tủa để sử dụng lại nhiều lần, sẽ giảm đáng kể chi
phí sản xuất, vệ sinh và an toàn môi trƣờng cũng hoàn toàn đảm bảo; Với tác nhân
sulfate amon, ƣu điểm không làm giảm hoạt độ enzyme, không gây mùi khó chịu
nhƣ cồn và acetone nhƣng có nhƣợc điểm là: trong CPT có muối sulfate amon, phải
tinh sạch loại muối tiếp. Phƣơng pháp tinh sạch loại muối thƣờng áp dụng là dùng
màng thẩm tích hay sắc ký lọc gel. Hai quá trình này rất tốn thời gian: đối với
phƣơng pháp thẩm tính phải kéo dài 14 đến 20 giờ và phải tiến hành trong điều kiện
nhiệt độ thấp; sắc ký loại muối bằng Bio-Gel G 25 chi phí tốm kém, quá trình thực
hiện phức tạp, thời gian sắc ký lâu. Mặt khác, sulfate amon có tính ăn mòn cao, làm
rỉ sắt thép, xâm thực bê tông mạnh, các thiết bị, dụng cụ tiếp xúc với nó phải làm từ
hợp kim đặc biệt.
51
Căn cứ vào hoạt tính riêng, sự phân tích trên và hiệu quả kinh tế của quá
trình tủa chúng tôi chọn cồn 96o với tỷ lệ 1/6 (v/v) để làm tác nhân tủa protease
trong DC nội tạng và đầu tôm để thu CPT là thích hợp nhất.
4.3. KHẢO SÁT MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN HOẠT
TÍNH PROTEASE CỦA CPT
Do điều kiện thời gian của đề tài, nên chúng tôi chỉ tiến hành khảo sát một số
yếu tố ảnh hƣởng đến hoạt tính protease của CPT trong DC của mẫu nội tạng tôm
sú, để giúp chúng tôi tìm hiểu thêm một số tính chất hoạt động của protease trong
nội tạng tôm nói chung và đầu tôm nói riêng để có biện pháp bảo quản tôm tốt hơn
trong quá trình chế biến.
4.3.1. Ảnh hƣởng nhiệt độ đến hoạt tính enzyme proease của CPT từ
mẫu nội tạng tôm sú
Xác định hoạt tính protease trong CPT tủa cồn của DC mẫu nội tạng theo
phƣơng pháp Amano. Ủ emzyme của CPT với casein 1% pH 7,0 trong 60 phút và
nhiệt độ ủ thay đổi lần lƣợt là: 30oC, 37 oC, 47 oC, 57 oC, 67 oC, 77oC.
Kết quả xác định hoạt tính đƣợc trình bày trong bảng 4.10 (Phụ lục chƣơng
4) và đồ thị 4.19.
0
200
400
600
800
27 37 47 57 67 77
Nhiệt độ
Ho
ạt
tín
h p
ro
tea
se
(U
/g)
Đồ thị 4.19. Yếu tố nhiệt độ ảnh hƣởng đến hoạt tính protease của CPT
Từ đồ thị 4.19 cho thấy đƣờng biểu diễn hoạt tính protease của CPT đạt nhiệt
độ hoạt động cực đại ở 47oC. Khi nhiệt độ tăng cao hơn nhiệt độ tối ƣu, hoạt tính
52
protease giảm rất nhanh và hầu nhƣ mất hoạt tính hoàn toàn ở nhiệt độ lớn hơn
77
oC. Nhiệt độ thích hợp cho hoạt tính protease nội tạng của tôm tuy thấp hơn so
với bromelin của dứa và papain của đu đủ nhƣng cao hơn nhiệt độ tối ƣu thích hợp
của động vật trên cạn.
Trái với suy nghĩ lâu nay của nhiều ngƣời cho rằng protease động vật hoạt
động tối ƣu ở nhiệt độ 37oC và khoảng nhiệt độ tối ƣu từ 35 - 45oC, thực nghiệm
cho thấy enzyme nội tạng của tôm có nhiệt độ thích hợp ở 47oC. Tuy nhiên, kết quả
này có sự khác biệt với kết quả nghiên cứu của tác giả Nguyễn Văn Lệ công bố năm
1996, protease trong đầu tôm Bộp và tôm Rảo có nhiệt độ thích hợp nhất ở 55o và
60
o
C, theo Reece P. (1988) thì enzyme nội tạng cá Thu Đại Tây Dƣơng, cá Hồi
nƣớc ngọt vùng bắc cực đã tinh sạch gồm 2 nhóm: nhóm protease-acid có hoạt tính
cao nhất ở 37oC và nhóm protease-kiềm có hoạt tính cao nhất ở 45oC. Kết quả này
chứng tỏ nhiệt độ của môi trƣờng sống có ảnh hƣởng đến nhiệt độ hoạt động của
enzyme. Mặt khác CPT mà chúng tôi nghiên cứu, ngoài protease còn nhiều protein
và các tạp chất khác, chính các tạp chất này có thể làm ảnh hƣởng đến nhiệt độ hoạt
động của protease trong CPT. Để làm rõ vấn đề này cần phải nghiên cứu sâu thêm.
Điều này rất có ý nghĩa trong chế biến tôm và nghiên cứu ứng dụng protease
của nội tạng tôm trong công nghệ thực phẩm, cũng nhƣ các ứng dụng khác của
protease.
4.3.2. Ảnh hƣởng pH đến hoạt tính protease của CPT từ mẫu nội tạng
tôm sú
Xác định hoạt tính protease trong CPT tủa cồn của DC mẫu nội tạng theo
phƣơng pháp Amano. Ủ emzyme của CPT với casein 1% thay đổi theo pH lần lƣợt:
5; 6; 7; 8; 9 trong 60 phút ở 47oC. Kết quả trình bày trong bảng 4.11 (Phụ lục
chƣơng 4) và đồ thị 4.20.
53
0
100
200
300
400
500
600
5 6 7 8 9
Độ pH
Ho
ạt
tín
h p
rot
eas
e
Đồ thị 4.20. Ảnh hƣởng pH đến hoạt tính protease của CPT nội tạng tôm sú
Nhận xét:
Từ đồ thị 4.20 cho thấy protease CPT mẫu nội tạng của tôm sú hoạt động
mạnh nhất tƣơng ứng tại pH 7. Kết quả này giống với kết quả nghiên cứu của tác
giả Tạ Thị Yến (2005), pH tối ƣu CPT từ nội tạng-thịt-chỉ tôm sú là pH 7,5. có sự
khác biệt khi so sánh với kết quả nghiên cứu của tác giả Phạm Thị Trân Châu cùng
cộng sự: pH tối ƣu CPT từ đầu tôm biển là pH 8,5, so sánh với protease từ nội tạng,
gan mực ống của tác giả Đỗ Văn Ninh (2004) hoạt động tốt ở pH kiềm (pH 8,5 -
9,5).
Kết quả nghiên cứu trên, có thể sơ bộ kết luận: hệ protease trong nội tạng của
tôm sú hoạt động tối ƣu ở khoảng pH trung tính. Điều này phù hớp với đặc điểm
cấu tạo của hệ tiêu hóa trong nội tạng tôm sú.
4.3.3. Ảnh hƣởng nồng độ muối ăn đến hoạt tính protease của CPT từ
mẫu nội tạng tôm sú
Kết quả xác định hoạt tính CPT protease của nội tạng ở nồng độ muối ăn
khác nhau đƣợc trình bày trong bảng 4.12 (Phụ lục chƣơng 4) và đồ thị 4.21.
Nhận xét:
Qua kết quả thực nghiệm cho thấy, nồng độ muối ăn ảnh hƣởng rất lớn đến
hoạt tính protease của CPT. Nồng độ muối ăn 3% cho kết quả hoạt tính protease đạt
cực đại.
54
0
100
200
300
400
500
600
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
Nồng độ muối ăn (%)
HT
p
ro
tea
se
(U
/g)
HT
Đồ thị 4.21. Ảnh hƣởng nồng độ muối ăn đến hoạt tính protease CPT mẫu nội
tạng tôm sú
Điều này có thể lý giải là do muối ăn phân ly thành Na+ và Cl - , nồng độ
muối thấp lớp vỏ hydrate của phân tử protein cũng chƣa bị biến đổi, chƣa gây biến
tính protein. Mặc khác, các ion này cũng liên kết với các phần mang điện trong
phân tử enzyme, làm tăng điện tích của các trung tâm hoạt động này. Kết quả những
biến đổi trên làm tăng cƣờng sự tƣơng tác giữa phân tử enzyme và phân tử protein,
làm thay đổi chiều hƣớng và sự phân bố electron trong phân tử protein, điểm tƣơng
tác tại các liên kết trong phân tử protein dễ bị cắt đứt hơn trƣớc. Ở nồng độ muối ăn
tăng lên trên 3% thì hoạt tính protease của CPT giảm rất nhanh, khi nồng độ muối
tăng lên trên 5% thì hoạt tính protase giảm chậm lại. Do muối ăn có tính phân ly
mạnh nên khi nồng độ cao, các ion đã liên kết mạnh với các phân tử nƣớc, tạo áp
suất thẩm thấu lớn, kéo các phân tử nƣớc khỏi liên kết với phân tử protein, làm cấu
trúc không gian bậc cao của phân tử mất đi, phân tử protein duỗi ra, bị biến tính, kết
tủa, làm hoạt tính enzym giảm và protein của cơ chất cũng bị biến tính, khó bị thủy
phân.
Nhƣ vậy, nồng độ muối 3% tối ƣu cho hoạt động của protease CPT, kết quả
này giúp chúng ta hiểu biết thêm về tính chất của enyzme protease trong nội tạng
tôm, giúp cho quá trình bảo quản và chế biến tôm sau thu hoạch sẽ tốt hơn rất nhiều.
55
4.4. TINH SẠCH PROTEASE CPT BẰNG SẮC KÝ LỌC GEL
CPT với các tác nhân tủa: cồn 96o (tỷ lệ 1/6 v/v), acetone (65%) và muối
sulfate amonium (70%) tủa DC từ mẫu đầu và mẫu nội tạng tôm đƣợc tinh sạch
bằng sắc ký lọc gel.
Kết quả thu nhận enzyme qua các hình sắc ký đồ sau:
Hình 4.1. Sắc ký đồ kết quả tinh sạch protease với Bio -Gel P100 của CPT tủa
cồn từ DC mẫu nội tạng
Kết quả sắc ký lọc gel tinh sạch của mẫu nội tạng tủa cồn thu đƣợc 2 peak:
Peak 1: từ ống 10 đến 18: 18 ml.
Peak 2: từ ống 23 đến 30: 16 ml.
Hình 4.2. Sắc ký đồ kết quả tinh sạch protease với Bio-Gel P 100 của CPT tủa
cồn từ DC mẫu đầu tôm
Kết quả sắc ký tinh sạch của mẫu đầu tủa cồn thu đƣợc 2 peak:
56
Peak 1: từ ống 14 đến 17: 8 ml.
Peak 2: từ ống 20 đến 30: 22 ml
Hình 4.3. Sắc ký đồ kết quả tinh sạch protease với Bio-Gel P 100 của CPT tủa
acteone từ DC mẫu nội tạng.
Kết quả tinh sạch của mẫu nội tạng tủa bằng acetone thu đƣợc 2 peak:
Peak 1: từ ống 9 đến 18: 20 ml.
Peak 2: từ ống 20 đến 30: 22 ml.
Hình 4.4. Sắc ký đồ kết quả tinh sạch protease với Bio-Gel P 100 của CPT tủa
acetone từ DC mẫu đầu
Kết quả tinh sạch của mẫu đâu khi tủa bằng acetone thu đƣợc 2 peak:
57
Peak 1: từ ống 9 đến 13: 10 ml.
Peak 2: từ ống 21 đến 30: 20 ml.
Hình 4.5. Sắc ký đồ kết quả tinh sạch protease với Bio-Gel P 100 của CPT tủa
muối (NH4)2SO4 từ DC mẫu nội tạng
Kết quả sắc ký tinh sạch mẫu nội tạng khi tủa bằng muối sulfate amonium
thu đƣợc:
Peak 1: từ ống 12 đến 18: 14 ml
Peak 2: từ ống 21 đến 31: 22 ml.
Hình 4.6. Sắc ký đồ kết quả tinh sạch protease với Bio-Gel P 100 của CPT tủa
muối (NH4)2SO4 từ DC mẫu đầu tôm
Kết quả sắc ký tinh sạch của mẫu đầu khi tủa bằng muối sulfate amonium thu
đƣợc 2 peak:
Peak 1: từ ống 9 đến 13: 10 ml.
Peak 2: từ ống 21 đến 30: 20 ml.
58
Tiến hành xác định hoạt tính protease và hàm lƣợng protein từng peak sau
tinh sạch. Kết quả đƣợc trình bày trong bảng 4.13 (Phụ lục chƣơng 4).
Qua kết quả so sánh hoạt tính protease và hàm lƣợng protein của từng peak
thu đƣợc sau sắc ký chúng tôi nhận thấy, peak 2 có hoạt tính protease và hàm lƣợng
protein cao hơn. Chứng tỏ peak 2 có nhiều protein-enzyme mà chúng tôi quan tâm
hơn. Để so sánh hiệu suất thu hồi protein-enzyme và độ tinh sạch sau sắc ký chúng
tôi lựa chọn lƣợng enzyme thu hồi ở peak 2 của quá trình sắc ký để so sánh hoạt
tính riêng và độ tinh sạch protease. Kết quả trình bày trong bảng 4.14 và đồ thị 4.22
Bảng 4.14. Hoạt tính riêng, độ tinh sạch và hiệu suất tinh sạch của protease sau
sắc ký lọc gel
Enzyme tinh sạch từ
CPT
Mẫu Nội Tạng Mẫu Đầu
HTR
(U/mg)
Độ
tinh
sạch
Hiệu
suất
(%)
HTR
(U/mg)
Độ tinh
sạch
Hiệu
suất
(%)
CPT tủa cồn 106,06 2,80 67,28 32,43 4,89 56,90
CPT tủa acetone 57,07 1,80 66,02 38,94 6,24 72,75
CPT tủa (NH4)2SO4 78,26 3,60 82,75 46,35 8,68 76,67
0
20
40
60
80
100
120
CPT tủa cồn CPT tủa
acetone
CPT tủa
(NH4)2SO4
Enzyme sau sắc ký
Ho
ạt
tín
h r
iên
g c
ủa
en
zy
me
(U
/m
g)
HTR mẫu NT HTR mẫu Đầu
Đồ thị 4.22. Ảnh hƣởng của quá trình tinh sạch lọc gel đến HTR của enzyme
Kết quả ở bảng 4.13 cho thấy, khi tủa protein bằng tác nhân cồn, acetone hay
muối sulfate amon hoạt tinh riêng của protease từ mẫu nội tạng và mẫu đầu tôm sú
qua bƣớc tinh sạch đều tăng lên rất đáng kể. Sau qua trình tủa, hoạt tính riêng
59
protease của CPT tăng lên rất nhiều so với DC vì quá trình tủa đã loại bớt đƣợc một
số tạp chất và enzyme không thể hiện hoạt tính protease. Các protein lạ này sẽ bị
loại bỏ tiếp tục qua quá trình sắc ký. Dựa trên nguyên tắc phân đoạn của sắc ký lọc
gel với Bio-Gel P 100 cho phép thu đƣợc những phân tử protein trọng lƣợng phân
tử nằm trong khoảng 5.000 Da đến 100.000 Da. Protein-enzyme ra khỏi cột gel
đƣợc đo hấp thụ ở bƣớc sóng 280 nm bằng hệ thống detector trong hệ thống sắc ký
và đƣợc thể thể hiện dạng sắc ký đồ bằng phần mền LP-Data View trên máy tính.
Dựa vào sắc ký đồ chúng ta thu những phân đoạn dịch protein-enzyme của từng
peak. Do đó, enzyme sau sắc ký loại bỏ hầu hết những tạp chất, protein có kích
thƣớc nằm ngoài giới hạn tách của Bio-Gel P 100 nên HTR của enzyme sau tinh
sạch cao nhất.
Kết quả tinh sạch bằng sắc ký lọc gel cho thấy, enzyme thu đƣợc nhờ tác
nhân tủa cồn của mẫu nội tạng cho HTR cao nhất (106,06 U/mg), sau đó là muối
(NH4)2SO4 (78,26 U/mg). Nhƣng độ tinh sạch và hiệu suất tinh sạch của tác nhân
tủa muối (NH4)2SO4 thì cao hơn tủa cồn, tủa acetone ở mẫu nội tạng và mẫu đầu.
Điều này chứng tỏ, dùng muối (NH4)2SO4 thích hợp cho việc tủa thu CPT protease
từ DC mẫu nội tạng và đầu tôm sú. Tuy nhiên xét về mặt kinh tế và quy mô sản xuất
công nghiệp thì tác nhân tủa cồn vẫn mang lại hiệu quả kinh tế cao hơn.
4.5. XÁC ĐỊNH TRỌNG LƯỢNG PHÂN TỬ- ĐIỆN DI SDS – PAGE
Tiến hành chạy điện di dịch enzyme thu đƣợc từng peak sau sắc ký của mẫu
đầu và mẫu nội tạng. Sau sắc ký lọc gel Bio-Gel P 100 thu đƣợc 12 mẫu, tiến hành
2 lần điện di: lần thứ nhất là 6 mẫu enzyme peak 1 và peak 2 của mẫu nội tạng; Lần
thứ 2 là 6 mẫu enzyme peak 1 và peak 2 của mẫu đầu.
Thứ tự cho mẫu vào giếng nhƣ sau:
Giếng 1: Thang protein chuẩn.
Giếng 2: Peak 1 mẫu tủa cồn.
Giếng 3: Peak 2 mẫu tủa cồn.
Giếng 4: Peak 1 mẫu tủa acetone.
60
Giếng 5: Peak 2 mẫu tủa acetone.
Giếng 6: Peak 1 mẫu tủa muối (NH4)2SO4.
Giếng 7: Peak 2 mẫu tủa muối (NH4)2SO4
Hình 4.7. Kết quả điện di enyzme sau tinh sạch lọc gel của mẫu nội tạng.
Hình 4.8. Kết quả điện di enzyme sau tinh sạch của mẫu đầu
Dựa vào thang chuẩn trên gel điện di, tiến hành xác định giá trị Rf của từng
vạch. Kết quả trình bày tronng bảng 4.15 (Phụ lục chƣơng 5). Từ đó xây dựng
1 2 3 4 5 6 7 Kdal
97.4
66.2
45
31
21.5
14.4
1 2 3 4 5 6 7 Kdal
97.4
66.2
45
31
21.5
14.4
61
phƣơng trình hồi quy tuyến tính giữa giá trị Rf và lg trọng lƣợng phân tử của các
protein trong thang chuẩn bằng phần mềm Excel.
y = -1.0289x + 2.0786
0.000
0.500
1.000
1.500
2.000
2.500
0.000 0.200 0.400 0.600 0.800 1.000
Rf
L
g(
tr
ọn
g
lư
ợn
g
ph
ân
tử
).
Đồ thị 4.23. Sự tƣơng quan giữa giá trị Rf và Lg (trọng lƣợng phân tử)
Phƣơng trình hồi quy tuyến tính thu đƣợc từ đồ thị 4.22 là:
Y = -1.0289x + 2.0786
Trong đó: Y là lg (trọng lƣợng phân tử protein)
X là Rf: tỷ số giữa khoảng cách di chuyển của protein và khoảng cách di
chuyển của vạch màu bromophenol blue cuối cùng tính từ gel phân tách.
Từ phƣơng trình hồi quy tuyến tính, có thể suy ra công thức tính trọng lƣợng phân
tử của protein theo công thức sau:
Trong đó: M là trọng lƣợng phân tử (đơn vị: Kdal)
Xác định trọng lƣợng phân tử protein của enzyme thu đƣợc sau tinh sạch.
Kết quả trình bày trong bảng 4.15 và bảng 4.16.
Bảng 4.16. Trọng lƣợng phân tử protein mẫu nội tạng chạy điện di SDS-PAGE
M = 10
Y
62
Mẫu Nội Tạng Tủa Giếng Vạch Rf Lg(Y)
M
(Kdal)
Tủa Cồn (1/6)
2: Peak
1
1 0,349 1,721 52,565
2 0,488 1,577 37,755
3: Peak
2
1 0,233 1,84 69,257
2 0,349 1,721 52,565
3 0,488 1,577 37,755
Tủa Acetone 65%
4: Peak1
1 0,233 1,84 69,257
2 0,349 1,721 52,565
3 0,477 1,589 38,811
5: Peak
2
1 0,233 1,84 69,257
2 0,349 1,721 52,565
3 0,465 1,601 39,896
Tủa Muối (NH4)2SO4
6: Peak
1
1 0,244 1,828 67,373
2 0,465 1,601 39,896
7: Peak
2
1 0,116 1,96 91,25
2 0,465 1,601 39,896
Bảng 4.17. Trọng lƣợng phân tử protein của mẫu đầu chạy điện di SDS-PAGE
Mẫu Đầu Tủa Giếng Vạch Rf Lg(Y)
M
(Kdal)
Tủa Cồn
2: Peak 1 0 0 0 0
3: Peak 2
1 0,349 1,721 52.565
2 0,477 1,589 38.811
Tủa Acetone
4: Peak1
1 0,233 1,.840 69.257
2 0,349 1,721 52.565
3 0,477 1,589 38.811
5: Peak 2
1 0,233 1,840 69.257
2 0,349 1,721 52.565
3 0,465 1,601 39.896
Tủa Muối
(NH4)2SO4
6: Peak 1
1 0,233 1,840 69.257
2 0,465 1,.601 39.896
7: Peak 2
1 0,349 1,721 52.565
2 0,465 1,601 39.896
63
Nhận xét:
Qua kết quả thực nghiệm chúng tôi nhận thấy, hầu hết các giếng đều xuất
hiện vạch protein, những vạch này có vị trí gần giống nhau. Số vị trí vạch xuất hiện
trên gel điện di chứng tỏ protein-enzyme thu đƣợc từ mẫu đầu và nội tạng tôm sú
không chỉ là một loại enzyme thể hiện hoạt tính protease. Kết quả này phù hợp với
cơ sở lý thuyết đã trình bày trong phần tổng quan. Tuy nhiên những vạch protein
trên gel điện di cũng chƣa khẳng định đƣợc chúng là những protein thuộc enyzme
mà đề tài quan tâm. Để hiểu biết chính xác hơn có thể sử dụng kỹ thuật lai phân tử
để xác định hoạt tính protease của từng vạch.
Khi tủa bằng muối (NH4)2SO4 chạy điện di xuất hiện vị trí vạch protein rất
rõ, vị trí và số lƣợng vạch protein ở mẫu nội tạng và mẫu đầu rất giống nhau số
lƣợng vạch protein-enzyme ở peak 2 nhiều hơn. Điều này rất phù hợp với kết quả
xác định hoạt tính protease và hàm lƣợng protein sau sắc ký lọc gel. Kết quả này
một lần nữa khẳng định khả năng tủa thu hồi CPT của muối (NH4)2SO4 tốt nhất.
Khi tủa bằng cồn: kết quả điện di enzyme thu hồi sau tinh sạch của mẫu nội
tạng và mẫu đầu có sự khác biệt.
Mẫu nội tạng: kết quả điện di của enzyme ở peak 1và peak 2 có xuất
hiện vạch protein, lƣợng protein tạp ở peak 1 nhiều hơn peak 2.
Mẫu đầu: kết quả điện di của enzyme ở peak 1 không xuất hiện vạch
protein rõ ràng trong khi dó ở peak 2 cho kết quả vị trí vạch protein rất
rõ, lƣợng protein tạp tƣơng đối cao.
Khi tủa bằng acetone: Kết quả chạy điện di cho thấy, vị trí vạch protein trên
gel điện di giữa hai mẫu không có sự khác biệt.
Nhƣ vậy trọng lƣợng phân tử của protease chiết tách và tinh sạch từ mẫu nội
tạng và đầu tôm từ 37.775 Da đến 69.257 Da.
.
64
Chƣơng 5
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
5.1. KẾT LUẬN
Từ những kết quả thu đƣợc từ các thí nghiệm của đề tài, chúng tôi xin rút ra
kết luận cho quá trình tách chiết, tinh sạch và khảo sát tính chất của protease từ đầu
và nội tạng tôm sú.
Quá trình tách chiết protease từ nội tạng và đầu tôm sú:
Dung môi tách chiết: đệm Tris-HCl 0,05M pH 7,5 với tỷ lệ mẫu/dung dịch
Tris-HCl = 1/7 (w/v) thích hợp nhất để thu DC.
Tỷ lệ DC/cồn = 1/6 (v/v) là tỷ tối ƣu để tủa protease từ DC thu CPT.
Nồng độ acetone 65% là nồng tối ƣu để tủa enzyme potease từ DC thu CPT.
Nồng độ muối (NH4)2SO4 70% độ bão hòa là nồng độ tối ƣu để tủa protease
từ DC thu CPT.
Điều kiện tối ƣu cho hoạt động của protease CPT mẫu nội tạng tôm sú:
protease hoạt động tối ƣu nhất ở nhiệt độ 47oC và pH =7, nồng độ muối ăn 3%.
Sau khi tinh sạch enzyme thu đƣợc từ CPT tủa bằng cồn, acetone và muối
(NH4)2SO4, HTR và hiệu suất tinh sạch sắc ký lọc gel Bio-Gel P 100 của enzyme
thu đƣợc sau tinh sạch.
Mẫu nội tạng:
Khi tủa cồn: HTR enzyme tinh sạch tăng lên so với HTR enzyme của
CPT từ 38,46 U/mg tăng lên 106,06 U/mg; Hiệu suất tinh sạch 67,28%.
Khi tủa acetone: HTR enzyme tinh sạch tăng lên so với HTR enzyme
của CPT từ 31,70 U/mg tăng lên 57,07 U/mg. Hiệu suất tinh sạch 66,02%.
Khi tủa muối (NH4)2SO4: HTR enzyme tinh sạch tăng lên so với HTR
enzyme của CPT từ 21,74 U/mg tăng lên 78,26 U/mg. Hiệu suất tinh sạch
82,75%.
65
Mẫu đầu:
Khi tủa cồn: HTR enzyme tinh sạch tăng lên so với HTR enzyme của
CPT từ 6,63 U/mg tăng lên 32,43U/mg. Hiệu suất tinh sạch 56,90%.
Khi tủa acetone: HTR enzyme tinh sạch tăng lên so với HTR enzyme
của CPT từ 6,24U/mg tăng lên 38,94 U/mg. Hiệu suất tinh sạch 72,75%.
Khi tủa muối(NH4)2SO4: HTR enzyme tinh sạch tăng lên so với HTR
enzyme của CPT từ 5,34 U/mg tăng lên 46,35 U/mg. Hiệu suất tinh sạch
76,67%.
Trọng lƣợng phân tử protease chiết tách từ mẫu nội tạng và đầu tôm sú trong
khoảng 37.755 đến 66.200 Da.
5.2. ĐỀ NGHỊ
Hiện nay nhu cầu sử dụng protease trong công nghiệp chế biến và bảo quản
thực phẩm là rất lớn. Để góp phần đáp ứng nhu cầu này, chúng tôi xin đề nghị:
Tối ƣu hóa quá trình tách chiết và tinh sạch protease từ đầu tôm sú.
Khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến hoạt tính protease sau tinh sạch để có
cách bảo quản chế phẩm enzyme tinh sạch một cách thích hợp.
Tiếp tục nghiên cứu các yếu tố ảnh hƣởng đến hoạt động của protease trong
hệ tiêu hóa tôm để góp phần bảo quản tôm sau thu hoạch một cách hiệu quả hơn
Nghiên cứu phát triển công nghệ sản xuất các chế phẩm protease thƣơng mại
từ nội tạng và đầu tôm và các loài động vật thủy sinh khác.
Nghiên cứu, phát triển ứng dụng chế phẩm protease nội tạng của động vật
thủy sinh trong các lĩnh vực chế biến thủy sản, công nghệ thực phẩm, dƣợc mỹ
phẩm và các lĩnh vực khác.
66
TÀI LIỆU THAM KHẢO
TIẾNG VIỆT
1. Nguyễn Đức Lƣợng, 2004. Công nghệ enzyme. Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia
Tp. Hồ Chí Minh.
2. Nguyễn Tiến Thắng, 2003. Một số kỹ thuật phòng thí nghiệm sinh học. Viện
Sinh Học Nhiệt Đới Tp. Hồ Chí Minh.
3. Nguyễn Tiến Thắng, 2003. Công nghệ enzyme protein. Viện Sinh Học Nhiệt
Đới Tp. Hồ Chí Minh.
4. Đỗ Văn Ninh, 2004. Tối ưu hóa quá trình phân giải protein của proteza trong
thịt cá và thử nghiệm sản xuất sản phẩm mới từ protein được thủy phâm. Luận
án Tiến sĩ Kỹ thuật, Đại học Thủy Sản Nha Trang.
5. Nguyễn Việt Dũng, 1999. Nghiên cứu sự biến đổi của tôm sau khi chết và
phương pháp bảo quản nguyên liệu. Luận án Tiến sĩ Kỹ thuật, Đại học Thủy
Sản Nha Trang.
6. Phạm Thị Trân Châu, 1993. Công nghệ enzyme và ứng dụng protease trong
công nghệ chế biến. Tạp chí Thủy sản, số 1.
7. Tạ Thị Yến, 2005. Nghiên cứu tách chiết và một số tính chất của protease trong
tôm sú (P.monodon) đang lột vỏ. Luận văn Kỹ sƣ Công nghệ chế biến Thủy sản,
Đại học Thủy Sản Nha Trang.
8. Đậu Thị Kim Dung, 2005. Khảo sát hoạt tính và tinh sạch protease từ hai chủng
nấm mốc Aspergillus oryzae và Aspergillus kawasaki trên môi trường bán rắn.
Luận văn Kỹ sƣ Công nghệ Sinh học, Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh.
TIẾNG NƢỚC NGOÀI
9. Bradford, MM. A rapid and sensitive for the quantitation of microgram
quantitites of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical
Biochemistry 72: 248-254, 1976.
10. Rajni, H.K. The workshop 2005 “ Enzyme Technology and Biosensors”. Hanoi,
03/2005.
11. Stein Ivar Aspmo, Svein Jarie Horn, Vincent G. H. Eijsink, 2004. Enzymatic
hydrolysis of Atlantic cod (Gadus morhua L.) viscera. Process Biochemistry.
67
INTERNET
12.
13.
14.
PHỤ LỤC
Phụ lục chƣơng 3
1. Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng protein theo Bradford
Trong các phƣơng pháp xác định hàm lƣợng protein thì đây là phƣơng pháp
có độ nhạy cao, có thể xác định tới 1 g, hoá chất đơn giản ít tốn thời gian. Một ƣu
điểm lớn của phƣơng pháp này là ít bị cản trở bởi các hoá chất sử dụng trong nghiên
cứu protein, nhất là amoniumsufate.
Nguyên tắc:
Phƣơng pháp này dựa trên sự thay đổi bƣớc sóng hấp thu cực đại của thuốc
nhuộm Coomassie Brillant Blue khi tạo phức hợp với protein. Trong dung dịch
mang tính acid khi chƣa kết nối với protein thì thuốc nhuộm ở dạng màu đỏ có bƣớc
sống thấp thu cực đại là 465 nm và khi kết hợp với protein thì thuốc nhuộm chuyển
sang dạng màu xanh dƣơng và hấp thu cực đại ở mức cực đại ở bƣớc sóng 595 nm.
Độ hấp thu ở bƣớc sóng 596 nm có liên hệ một cách trực tiếp với nồng độ protein.
Để xác định protein trong mẫu, đầu tiên ta xây dựng một đƣờng chuẩn với
dung dịch protein chuẩn đã biết đƣợc nồng độ. Sau khi cho dung dịch protein vào
thuốc nhuộm màu, màu sẽ xuất hiện sau 2 phút và bền tới 1giờ. Tiến hành đo dung
dịch bằng máy quang phổ kế (Spectrophotometer) ta đƣợc ODx, độ hấp thụ sẽ tỷ lệ
với lƣợng protein trong mẫu. Thực hiện một đối chứng với HCl (ODo). Lấy giá trị
OD = ODX – ODO. Lƣợng protein trong mẫu dung dịch đo đƣợc xác định bằng
cách dựa vào đƣờng chuẩn từ giá trị OD ở trục tung, từ đó suy ra giá trị nồng độ
protein tƣơng ứng trên trục hoành.
Hóa chất
Dung dịch albumine 0.1%.
Nƣớc cất
Dung dịch thuốc thử Bradford: thành phần thuốc thử trong 100 ml nhƣ sau
o Coomassie Brilliant Blue: 0.001g.
o Ethanol tuyệt đối: 4.7 g.
o Phosphoric acid: 85%.
Phẩm màu Coomassie Brilliant Blue đƣợc hoà tan trong ethnol trong một
chai đựng màu tối có nắp, bổ sung phosphoric acid và chỉnh tới 100 ml bằng nƣớc
cất. Lắc đều và giữ lạnh dƣới 4oC.
Dựng đƣờng chuẩn albumine
Pha loãng dung dịch albumine thành các nồng độ khác nhau: 0, 10, 20, 30,
40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 g/ml.
Bảng 3.1. Dựng đƣờng chuẩn albumine
Ống nghiệm
Đối
chứng
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Nồng độ ( g/ml) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
Dung dịch
albumin chuẩn
( l)
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
Nƣớc cất ( l) 1000 990 980 970 960 950 940 930 920 910
Thuốc thử
Bradford (ml)
2 2 2 2 2 2 2 2 2 2
Ống số 0 tƣơng ứng với ống đối chứng chứa nƣớc cất. Tất cả các ống sau khi
pha đúng nồng độ, để khoảng 20 phút.
Tiến hành đo mật độ quang của dung dịch ở bƣớc sóng 595 nm.
Dựng đƣờng chuẩn.
Định lƣợng protein trong mẫu thí nghiệm
Lấy 1ml mẫu thí nghiệm cho vào ống nghiệm, thêm vào 2 ml thuốc thử Bradford.
Đem đo mật độ quang ở bƣớc sóng 595 nm.
Từ đó suy ra hàm lƣợng protein có trong mẫu thí nghiệm.
Mẫu đƣợc pha loãng sao cho mật độ quang đo đƣợc trong khoảng đƣờng chuẩn.
Kết quả tính toán:
Từ phƣơng trình đƣờng chuẩn và mật độ quang của mẫu khoả sát ta suy ra hàm
lƣợng protein của mẫu là X ( g/ml) có trong m (g) nguyên liệu.
Vậy lƣợng protein có trong 1 gam nguyên liệu là:
Hình 3.2. Đƣờng chuẩn albumine
2. Xác định hoạt tính protease bằng phƣơng pháp Amano
Nguyên tắc:
Dùng protein “casein” làm cơ chất xúc tác định hoạt tính phân giải protein
của protease trên cơ sở định lƣợng sản phẩm tạo thành trong phản ứng bằng phản
ứng màu với thuốc thử Folin. Dựa vào đồ thị chuẩn để tính lƣợng Tyrosin tƣơng
ứng với lƣợng sản phẩm thuỷ phân dƣới tác dụng của enzyme.
Hoá chất:
HCL 0.1 M
X
1000. m Hàm lƣợng protein (mg/g) =
Ma2CO3 0.4 M
Dung dịch Trichloracetic 0.4 M
Tyrosin tinh khiết
NaOH 0.1 M
Thuốc thử Folin
H3PO4 1/30 M
Đệm phosphate (pH 7) 0.1 M
Dụng cụ và thiết bị
Ống nghiệm, pipette, bình định mức, giấy lọc.
Bể ổn nhiệt
Máy đo quang phổ UV – Vis
Máy đo pH
Xây dựng đƣờng chuẩn tyrosine
Bảng 3.2. Đƣờng chuẩn tyrosine
Ống số
Đối
chứng
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Nồng độ ( g/ml) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
Dung dịch tyrosine
chuẩn ( l)
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
Dung dịch HCl ( l) 1000 990 980 970 960 950 940 930 920 910
Na2CO3 (ml) 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5
Thuốc thử Folin
(ml)
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
Pha dung dịch tyrosine ở các nồng độ khác nhau : 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70,
80, 90, 100 gtyrosine / mlHCl nhƣ bảng 3.3.2. Thêm 5 ml dung dịch Na2CO3 0,4M vào
dung dịch tyrosine ở các nồng độ khác nhau ở trên và thêm 1 ml thuốc thử Folin
vào dung dịch hỗn hợp. Sau khi trộn đều, để ổn định dung dịch ở 37 0,50C trong
20 phút. Đo độ hấp thụ của dung dịch này ở bƣớc sóng 660 nm. Ghi nhận kết quả
As10, As20, As30, As40, As50, As60, As70, As80, As90. As100
Đối với ống đối chứng dùng 1 ml acid HCl 0,1M thay cho tyrosine. Đo độ
hấp thu của dung dịch này ở bƣớc sóng 660 nm và ghi nhận kết quả này là Aso.
Trị số mật độ quang của các ống từ 1 đến 9 sau khi trừ đi trị số của ống đối chứng
sẽ đƣợc giá trị OD1 đến OD9. Vẽ đồ thị dựa vào biến thiên của OD theo nồng
độ protein. Đồ thị này gọi là đƣờng chuẩn tyrosine.
Xác định hoạt tính protease
Hoạt tính enzyme đƣợc khảo sát ở nhiệt độ 370C và pH = 7.
Cho 1 ml dung dịch cơ chất casein 1% vào ống nghiệm, ủ ở 37 0,50C trong 10
– 15 phút.
Sau thời gian ủ, cho 1 ml dịch chiết enzyme thô vào và lắc đều. Đem ủ hỗn hợp
này ở 37 0,50C trong một giờ.
Cho vào 2 ml dung dịch TCA 0,4M để ngừng phản ứng enzyme.
Để ổn định dung dịch trong 25 phút, sau đó lọc dung dịch này qua giấy lọc để
loại tủa.
Cho 5 ml dung dịch Na2CO3 vào 1ml dịch lọc.
Thêm 1 ml thuốc thử Folin.
Trộn đều, để yên ở 37 0,50C trong 20 phút.
Khi dung dịch xuất hiện màu xanh, đem đo độ hấp thu ở bƣớc sóng 660 nm
(ghi nhận kết quả này là Am).
Mẫu đối chứng : lấy 1 ml nƣớc cất thay cho 1 ml dung dịch enzyme và tiến
hành các bƣớc tƣơng tự nhƣ mẫu thí nghiệm với cùng điều kiện. Ghi nhận kết quả
độ hấp thụ là A0.
Hàm lƣợng tyrosine đƣợc giải phóng do protease thủy phân đƣợc tính bằng
cách lấy Am – A0 rồi lấy kết quả so với đƣờng chuẩn tyrosine để xác định hoạt
tínhprotease theo tính toán sau :
Một đơn vị hoạt tính (ĐVHT) protease đƣợc xác định là lƣợng enzyme để
tạo ra lƣợng amino acid tƣơng đƣơng với 100 g tyrosine trong 1 ml dịch lọc dƣới
điều kiện thí nghiệm. Ký hiệu là: U
Hoạt tính protease (ĐVHT/ml) = (Am – A0).F.1/100.n
Hoạt tính protease (ĐVHT/g) =
F = [10/ As10 + 20/ As20 + 30/ As30 + 40/ As40 + 50/ As50 +
60/ As60 + 70/ As70 + 80/ As80 + 90/ As90+100/ As100]/10
Am : độ hấp thu của mẫu
A0 : Độ hấp thu của ống đối chứng
F : Hệ số tƣơng quan giữa hàm lƣợng tyrosine và độ hấp thu ở bƣớc
sóng 660 nm trên đƣờng chuẩn.
n : Hệ số pha loãng của enzyme
1/100 : Hệ số chuyển đổi
V : Thể tích của dung dịch enzyme
m : khối lƣợng chế phẩm enzyme thô.
Tính toán hoạt tính riêng (HTR) của protease: từ kết quả hàm lƣợng protein
(mg/ml) và hoạt tính protease (U/ml) tính hoạt tính riêng của enzyme.
HTR (U/mg) =
Số đơn vị hoạt tính
mg protein enzyme
(Am – A0).F.1/100.n.V
m
Hình 3.3. Đƣờng chuẩn tyrosine
3. Phƣơng pháp sắc ký lọc gel
Sử dụng cột sắc ký bio-rad, kích thƣớc 30 x 1,5 cm; thể tích: 53 ml (thể tích
= chiều cao cột x (đƣờng kính/2)2 x 3,14 ( ) = 30 x (1,5/2)2 x 3,14).
Cân 4g gel Bio-Gel P100, cho bột gel từ từ vào dung dịch đệm phosphate
0.1M pH 7.0 đựng trong cốc. Sau khi thể huyền phù đồng nhất của các hạt gel hình
thành, không cần phải khuấy, hãy để ổn định 12 giờ và 20oc trong suốt quá trình
hydrate hóa
Sau khi quá trình hydrate xảy ra hoàn toàn, gạn lớp nổi trên bề mặt. Chuyển
dung dịch vào một bình hút chân không có gắn với vòi hút chân không. Khử khí của
dung dịch trong khoảng 10-15 phút, thỉnh thoảng lắc nhẹ (xoay) bình..
Để gel ổn định cho đến khi 90-95% số hạt ổn định, gạn hoặc loại lớp nổi trên
bề mặt bằng cách hút để lọai các hạt mịn. Lặp lại công việc trên 4 lần để loại hơn
90% hạt mịn làm cản trở quá trình lọc gel.
Gắn phễu đổ gel vào cột, đóng lỗ thoát của cột và cho dung dịch đệm làm
đầy 20% thể tích cột. Rót đều dung dịch gel vào cột thành một dòng di chuyển nhẹ.
tránh làm bắn gel, đảm bảo việc nhồi cột đều và tránh bị bọt khí. Khi lớp nền đã
hình thành trong cột từ 2 đến 5 cm, mở khóa đầu ra của cột cho đến khi cột đƣợc
nạp đầy gel (packed). Khi cột đã đƣợc nạp đầy gel, khóa đầu ra (outlet) của cột và
gắn flow adaptor. Mở khóa đầu ra của cột và cho dung dịch đệm với thể tích gấp hai
lần thể tích lớp nền (106 ml) chảy qua cột lúc điều khiển tốc độ chảy. Đóng đầu ra
của cột và điều chỉnh flow adaptor xuống đến lớp nền gel. Nạp mẫu vào trên bề mặt
lớp nền bằng cách dùng xylanh bơm mẫu vào trên lớp nền gel qua flow adaptor.
Chuẩn bị mẫu: mẫu chạy sắc ký phải sạch (không bị nhiễm bẩn và không có
các hạt rắn); hòa tan hoàn toàn trong dung dịch đệm. Lọc mẫu qua milipore (màng
lọc 0,45 micrometre) sẽ làm gia tăng độ bền/thời gian sử dụng của cột. nếu vì tính
chất của mẫu mà không thể đem lọc đƣợc thì nên ly tâm mẫu.
Dùng xylanh hút mẫu, bơm mẫu vào hệ thống sắc ký, dịch ra khỏi cột đƣợc
đo độ hấp thụ ở bƣớc sóng 280 nm bằng detector trong hệ thống sắc ký và đƣợc thể
hiện độ hấp thu dƣới dạng sắc ký đồ bằng phần mền LP-Data View trên máy tính.
Dịch đƣợc thu tự động bằng máy thu mẫu (collector), mỗi phân đoạn 2 ml.
Thu các fraction chứa dịch protease đã tinh sạch qua sắc ký lọc gel, tiến hành
xác định hoạt tính protease theo phƣơng pháp Amano, pH 7.0 và hàm lƣợng protein
theo phƣơng pháp Bradford.
Tính hiệu suất về hoạt tính protease và độ tinh sạch của enzyme sau tinh sạch
bằng sắc ký lọc gel
Tính hiệu suất về hoạt tính protease và độ tinh sạch của enzyme sau tinh sạch
bằng sắc ký lọc gel.
Trong đó:
HTenzyme1: hoạt tính protease trƣớc tinh sạch (đvht/ml dung dịch enzyme trƣớc
tinh sạch).
Hiệu suất về hoạt tính enzyme
100
1
2
x
HTenzyme
HTenzyme
HTtenzyme2: hoạt tính protease sau tinh sạch (đvht/ml dung dịch enzyme sau tinh
sạch).
Hoạt tính riêng của protease sau tinh sạch (dvht/mg)
autinhsachHLproteins
HTenzyme2
Độ tinh sạch của protease sau sắc ký
1
2
engenzymeHoattinhri
engenzymeHoattinhri
Trong đó:
Hlproteainsautinhsach: hàm lƣợng protein sau tinh sạch.
Hoattinhriengenzyme1: hoạt tính riêng của protease trƣớc tinh sạch.
Hoattinhriengenzyme2: hoạt tính riêng của protease sau tinh sạch.
4. Điện di SDS-PAGE
a). Chuẩn bị hộp điện di
Khuôn kính để đổ gel, lƣợc cài và hộp điện di phải đƣợc rửa sạch và lau khô
bằng cồn. Sau đó ráp thành khuôn để chuẩn bị đổ gel
Đổ gel phân tích:
Chuẩn bị gel phân tích polyacrylamide 10 %
Nƣớc cất 4 ml
Acrylamide 30 % 3.3 ml
Tris-HCl, (pH 8,8) 2.5 ml
SDS 10 % 100 μl
APS 10 % 100 μl
Dung dịch đƣợc trộn bằng máy khuấy từ, sau đó cho 4 μl TEMED vào dung
dịch, khuấy đều và nhanh chóng dùng pipette 1000 ml cho vào khung kiếng đổ gel.
Gel sẽ đƣợc bơm đến vạch cách lƣợc là 0,5 cm. Chú ý không bơm quá nhanh sẽ tạo
bọt trong gel. Cẩn thận bơm tiếp một lớp nƣớc cất lên trên bề mặt gel để tạo cho bề
mặt gel phẳng. Gel sẽ đông lại trong 20-30 phút.
Đổ gel tập trung
Gel tập trung thƣờng đƣợc pha ở nồng độ 4 % và gel có thành phần nhƣ sau
Nƣớc cất 2.7 ml
Acrylamide 30 % 670 μl
Tris-HCl (pH 6,8; 1 M) 2.5 ml
SDS 10 % 40 μl
APS 10 % 4 μl
TEMED 4 μl
Khuấy đều dung dịch trên máy khuấy từ. Trƣớc khi đổ gel tập trung, ta phải
đổ bỏ phần nƣớc phía trên gel phân tích bằng cách nghiêng và dùng giấy thấm.
Tƣơng tự gel phân tích, sau khi cho 4 μl TEMED vào, dung dịch phải đƣợc
đƣa nhanh vào khung đổ gel. Dùng giấy thấm để loại hết nƣớc trên bề mặt gel phân
tích. Cho gel tập trung vào, đƣa lƣợc vào lớp gel. Chú ý, lƣợc đƣợc đƣa vào cẩn
thận để tránh tạo lớp bọt dƣới phía chân lƣợc. Gel tập trung sẽ đông tụ lại khoảng
sau 20 phút. Đánh dấu lại các vị trí lỗ giếng.
b). Chuẩn bị mẫu protein
Pha mẫu tỷ lệ 1:1. Cho vào ống eppendorf 100 μl mẫu protein và 100 μl
dung dịch chuẩn bị mẫu nhƣ trên. Trong thí nghiệm này các mẫu protein/enzyme
lấy từ dịch protein sau khi tinh sạch bằng sắc ký lọc gel
Lắc đều và đun cách thủy ở 95oC, 5 phút, để nguội.
c). Đưa mẫu vào các giếng
Sau khi gel tập trung đông, lắp bộ khung đổ gel vào khung chạy điện di. Đổ
đầy dung dịch chạy điện di vào phía bên dƣới và bên trên bộ điện di Cẩn thận lấy
lƣợc ra và cho mẫu vào các giếng. Lƣợng mẫu là 10 μl đƣa vào các lỗ giếng. Chú ý
không để mẫu tràn qua các giếng bên cạnh, ghi chép lại vị trí các mẫu đƣa vào
giếng để dễ thảo luận sau này.
Chạy điện di: Sau khi hoàn tất việc đƣa mẫu vào, đậy nắp hộp điện di lại và
cho dòng điện đi qua. Dòng điện chạy điện di là 25 mA / 80 V
Thông thƣờng, thời gian để chạy điện di là 3 giờ. Ta có thể quan sát quá trình dịch
chuyển của protein nhờ vào dải băng màu xanh của Bromophenol Blue R-250.
Nhuộm gel: Gel đƣợc lấy ra khỏi hộp gel cẩn thận và cho vào dung dịch
nhuộm đã pha. Để làm nhanh quá trình nhuộm màu, hệ thống sẽ đƣợc đặt trên máy
lắc. Thông thƣờng thời gian nhuộm khoảng 1 giờ.
Tẩy màu: Tẩy gel bằng dung dịch tẩy, ngâm gel trong dung dịch tẩy và đặt
trên máy lắc 2 giờ. Kết thúc quá trình tẩy gel khi nhận thấy gel đã sạch lớp màu nền
và các băng protein hiện rõ trên gel.
Phân tích kết quả, chụp hình gel và xác định trọng lƣợng phân
tử phân tích kết quả, chụp hình gel.
Đo khoảng cách di chuyển của các band protein từ gel phân tách tới các
band protein và khoảng cách di chuyển từ gel phân tách tới vạch màu cuối cùng.
Tính giá trị Rf :
Vẽ biểu đồ lg của các giá trị trọng lƣợng phân tử của các protein chuẩn và
các giá trị Rf của chúng.
Trọng lƣợng phân tử của các vạch protein chƣa biết trọng lƣợng phân tử
có thể xác định thông qua giá trị Rf của chúng.
Trọng lƣợng phân tử của các protein chƣa biết trọng lƣợng phân tử có thể
xác định thông qua giá trị Rf của chúng qua phƣơng pháp ngoại suy từ đồ thị.
Rf =
Khoảng cách di chuyển của protein
Khoảng cách di chuyển của vạch màu
bromophenol blue
Phụ lục chƣơng 4
Bảng 4.1. Ảnh hƣởng tỷ lệ (mẫu/nƣớc cất) đến hoạt tính protease và hàm lƣợng
protein của DC nội tạng và đầu
Tỷ lệ mẫu/nƣớc
cất
(w/v)
Mẫu Nội Tạng Tôm Mẫu Đầu Tôm
HL protein
(mg/g)
HT
protease
(U/g)
HL protein
(mg/g)
HT
protease
(U/g)
1/1 5,92 152,34 10,46 51,51
1/2 8,02 214,84 23,42 52,28
1/3 10,32 267,45 30,37 54,51
1/4 11,32 312,15 36,77 56,02
1/5 10,45 261,90 30,76 55,17
Bảng 4.2. Ảnh hƣởng tỷ lệ (mẫu/nƣớc muối sinh lý) đến hoạt tính protease và
hàm lƣợng protein của DC nội tạng và đầu
Tỷ lệ mẫu/nƣớc
muối sinh lý
(w/v)
Mẫu Nội Tạng Tôm Mẫu Đầu Tôm
HL protein
(mg/g)
HT protease
(U/g)
HL protein
(mg/g)
HT protease
(U/g)
1/1 5,16 182,98 12,76 62,96
1/2 9,24 320,02 19,13 75,85
1/3 10,62 394,32 22,25 82,57
1/4 10,32 369,20 19,61 79,10
1/5 9,65 337,70 15,54 71,88
Bảng 4.3. Ảnh hƣởng tỷ lệ (mẫu/đệm phosphate) đến hoạt tính protease và
hàm lƣợng protein của DC nội tạng và đầu
Tỷ lệ mẫu/đệm
phosphate
(w/v)
Mẫu Nội Tạng Tôm Mẫu Đầu Tôm
HL protein
(mg/g)
HT protease
(U/g)
HL protein
(mg/g)
HT protease
(U/g)
1/1 8,13 213,01 6,61 54,70
1/2 11,82 300,22 11,28 73,79
1/3 15,99 362,38 15,37 83,21
1/4 17,72 405,50 20,04 87,84
1/5 22,10 439,13 19,69 102,59
1/6 25,26 484,75 21,23 114,76
1/7 27,37 511,12 20,04 121,53
1/8 26,96 482.00 18,63 112,76
1/9 26,37 464,40 15,66 91,72
1/10 26,10 453,83 13,26 84,47
Bảng 4.4. Ảnh hƣởng tỷ lệ (mẫu/đệm Tris-HCl) đến hoạt tính protease và hàm
lƣợng protein của DC nội tạng và đầu
Tỷ lệ mẫu/đệm Mẫu Nội Tạng Tôm Mẫu Đầu Tôm
Tris-HCl
(w/v)
HL protein
(mg/g)
HT protease
(U/g)
HL protein
(mg/g)
HT protease
(U/g)
1/1 5,42 83,42 6,60 58,85
1/2 10,37 208,99 12,83 79,22
1/3 13,83 265,77 18,61 85,42
1/4 15,69 344,13 24,28 86,08
1/5 24,02 460,63 27,03 90,67
1/6 24,64 505,24 29,67 102,27
1/7 28,75 543,52 30,18 121,54
1/8 26,32 509,96 30,74 92,21
1/9 27,09 523,95 29,24 77,58
1/10 25,90 501,57 19,64 72,05
Bảng 4.6. Ảnh hƣởng của tỷ lệ DC/cồn đến hoạt tính protease và hàm lƣợng
protein của CPT
Tỷ lệ
DC/cồn
(v/v)
Mẫu Nội Tạng Tôm Mẫu Đầu Tôm
HL
protein
(mg/g)
HT
protease
(U/g)
HTR
(U/mg)
HL
protein
(mg/g)
HT
protease
(U/g)
HTR
(U/mg)
1/1 3,44 114,13 33,18 11,60 64,13 5,53
1/2 6,88 186,07 27,05 12,30 79,35 6,45
1/3 8,24 329,50 39,99 15,49 99,56 6,43
1/4 10,84 390,47 36,02 16,70 105,86 6,34
1/5 12,40 465,63 37,55 18,17 111,03 6,11
1/6 11,83 490,19 41,44 18,40 121,98 6,63
1/7 11,71 458,46 39,15 15,20 99,26 6,53
1/8 10,8 406,02 37,594 13,91 90,98 6,54
Bảng 4.7. Ảnh hƣởng của nồng độ phần trăm acetone với DC đến hoạt tính
protease và hàm lƣợng protein của CPT
Nồng độ
acetone với
mẫu
(%)
Mẫu Nội Tạng Tôm Mẫu Đầu Tôm
HL
protein
(mg/g)
HT
protease
(U/g)
HTR
(U/mg)
HL
protein
(mg/g)
HT
protease
(U/g)
HTR
(U/mg)
50% 7,43 114,95 8,77 17,18 115,37 6,72
55% 10,80 211,43 16,51 17,94 164,03 9,14
60% 11,94 304,08 25,32 17,59 127,45 7,22
65% 14,80 471,98 31,70 17,09 106,14 6,24
70% 14,16 427,55 33,04 16,85 89,07 5,28
75% 13,73 417,76 33,16 16,48 64,15 3,88
Bảng 4.8. Ảnh hƣởng của nồng độ phần trăm muối sulfate amon bão hòa với
DC đến hoạt tính protease và hàm lƣợng protein của CPT
Nồng độ (%)
sulfate amon
bão hòa với
DC
Mẫu Nội Tạng Tôm Mẫu Đầu Tôm
HL
protein
(mg/g)
HT
protease
(U/g)
HTR
(U/mg)
HL
protein
(mg/g)
HT
protease
(U/g)
HTR
(U/mg)
50% 15,20 413,77 24,30 8,49 43,98 5,18
55% 20,89 450,75 21,45 16,35 79,73 4,88
60% 20,60 456,11 21,12 20,10 97,75 4,86
65% 22,58 485,17 21,36 21,30 109,54 5,14
70% 22,70 496,49 21,74 23,12 122,73 5,34
75% 20,15 467,77 23,08 20,70 107,27 5,18
Bảng 4.10. Ảnh hƣởng của nhiệt độ hoạt động đến hoạt tính protease của CPT
tủa cồn từ mẫu nội tạng.
Nhiệt độ 30 37 47 57 67 77
Hoạt tính (U/g) 357,28 497,15 577,01 362,46 126,29 29,13
Bảng 4.11. Ảnh hƣởng của pH hoạt động đến hoạt tính protease của CPT tủa
cồn từ mẫu nội tạng.
pH 5 6 7 8 9
Hoạt tính (U/g) 378,68 430,40 552,49 414,09 349,27
Bảng 4.11. Ảnh hƣởng của nồng độ muối ăn đến hoạt tính protease của CPT
tủa cồn từ mẫu nội tạng.
Nồng độ muối ăn
(%)
HT protease (U/g)
0 449,16
1 457,80
3 552,49
5 442,23
7 423,62
9 394,34
11 373,11
13 324,54
15 298,13
17 235,67
19 213,57
21 201,76
Enzyme
tinh sạch
từ CPT
tủa với
Peak
Mẫu Nội Tạng Mẫu Đầu
HT
protease
(U/g)
HL protein
(mg/g)
HT
protease
(U/g)
HL protein
(mg/g)
Cồn
Peak 1 96,20 2,01 31,24 1,89
Peak 2 329,83 3,11 69,01 2,14
Acetone Peak 1 124,36 3,24 21,05 1,23
Bảng 4.9. Hoạt tính protease và hàm lƣợng protein của enzyme sau tinh sạch
Bảng 4.14. Giá trị Rf và trọng lƣợng phân tử trong thang chuẩn protein
Rf Trọng lƣợng phân tử (Kdal) lg(trọng lƣợng phân tử)
0.140 97.4 1.989
0.244 66.2 1.821
0.372 45 1.653
0.523 31 1.491
0.756 21.5 1.332
0.907 14.4 1.158
Peak 2 311,59 5,46 77,12 1,98
Muối
Peak 1 137,03 1,76 27,85 1,43
Peak 2 410,86 5,25 94,04 2,03
Các file đính kèm theo tài liệu này:
- NGUYEN VAN NAM.pdf