Khóa luận Thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa legumain

ụ là biotin, cần acetyl - CoA và Mg++ cho phản ứng xúc tác. 1.1.4. Cấu trúc phân tử Enzyme [2] 1.1.4.1. Bản chất hóa học của enzyme Enzyme có tất cả các thuộc tính hóa học của các chất protein về hình dạng phân tử: đa số enzyme có dạng hình cầu (dạng hạt). Tỷ lệ giữa trục dài và trục ngắn của phân tử vào khoảng 1 - 2 hoặc 4 - 6. Về khối lượng phân tử: các enzyme có khối lượng phân tử lớn, thay đổi rất rộng từ 12000 dalton đến 1.000.000 dalton hoặc lớn hơn. Do kích thước phân tử lớn, các enzyme không đi qua được màng bán thấm. Enzyme tan trong nước, khi tan tạo thành dung dịch keo; chúng cũng tan trong dung dịch muối loãng, glycerin và các dung môi hữu cơ có cực khác. Enzyme không bền và dễ dàng bị biến tính dưới tác dụng của nhiệt độ cao. Enzyme bị biến tính thì mất khả năng xúc tác. Mức độ giảm hoạt tính của enzyme tương ứng với mức độ biến tính của protein trong chế phẩm. Kiềm, acid mạnh, kim loại nặng cũng làm cho enzyme biến tính. Cũng như protein, enzyme cũng có tính chất lưỡng tính. 1.1.4.2. Thành phần cấu tạo của enzyme Cũng như protein, enzyme có thể là protein đơn giản hoặc protein phức tạp. Trên cơ sở đó, người ta thường phân enzyme thành hai nhóm: enzyme một thành phần (enzyme một cấu tử) và enzyme hai thành phần (enzyme hai cấu tử). Trường hợp enzyme là một protein đơn giản gọi là enzyme một thành phần. Trường hợp enzyme là một protein phức tạp nghĩa là ngoài protein đơn giản còn có một nhóm ngoại nào đó không phải protein gọi là enzyme hai thành phần. Phần protein của enzyme hai thành phần được gọi là apoprotein hay apoenzyme, còn phần không phải protein gọi là nhóm ngoại hoặc coenzyme. Phần không phải protein thường là những chất hữu cơ đặc hiệu có thể gắn chặt vào phần protein hoặc có thể chỉ liên kết lỏng lẻo và có thể tách khỏi phần protein khi cho thẩm tích qua màng. Coenzyme là phần không phải protein của enzyme trong trường hợp khi nó dễ tách khỏi phần apoenzyme khi cho thẩm tích qua màng bán thấm và có thể tồn tại độc lập. Phần không phải protein của enzyme được gọi là nhóm ngoại hay nhóm prosthetic, khi nó liên kết chặt chẽ với phần protein của enzyme bằng liên kết đồng hóa trị. Một phức hợp hoàn chỉnh gồm cả apoenzyme và coenzyme được gọi là holoenzyme. Một coenzyme khi kết hợp với các apoenzyme tạo thành các holoenzyme khác nhau xúc tác cho quá trình chuyển hóa các chất khác nhau nhưng giống nhau về kiểu phản ứng. Coenzyme trực tiếp tham gia phản ứng xúc tác, giữ vai trò quyết định kiểu phản ứng mà enzyme xúc tác và làm tăng độ bền của apoenzyme đối với các yếu tố gây biến tính. Còn apoenzyme có tác dụng nâng cao hoạt tính xúc tác của coenzyme và quyết định tính đặc hiệu của enzyme. Các coenzyme thường là các dẫn xuất của các vitamin hòa tan trong nước. Cần chú ý là sự phân biệt coenzyme và nhóm ngoại chỉ là tương đối, vì khó có thể có một tiêu chuẩn thật rành mạch để phân biệt “liên kết chặt chẽ” và “liên kết không chặt chẽ”, nhất là trong những năm gần đây, người ta đã chứng minh rằng, nhiều coenzyme cũng kết hợp vào apoenzyme của chúng bằng liên kết đồng hóa trị. Do đó, ngày nay người ta ít chú ý đến sự phân biệt coenzyme và nhóm ngoại. Ngoài ra, trong thành phần cấu tạo, rất nhiều enzyme có chứa kim loại. Thuộc loại enzyme hai thành phần gồm có hầu hết các enzyme của các lớp 1, 2, 4, 5, 6. Các enzyme thủy phân (lớp 3) thường là enzyme một thành phần có chứa ion kim loại hoặc đòi hỏi ion kim loại làm cofactor (đồng yếu tố). 1.1.4.3. Cấu trúc bậc 4 của enzyme Trong nhiều trường hợp, các chuỗi polypeptide có cấu trúc bậc ba có thể kết hợp với nhau tạo thành phân tử enzyme có cấu trúc bậc bốn. Như vậy cấu trúc bậc bốn là cách sắp xếp đặc trưng trong không gian của các chuỗi polypeptide riêng biệt trong phân tử enzyme. Đến nay người ta đã xác định rằng số lớn các enzyme trong tế bào đều có cấu trúc bậc bốn. Các enzyme có cấu trúc bậc bốn là enzyme olygomer và polymer do nhiều đơn vị nhỏ cấu tạo nên, mỗi đơn vị nhỏ là do một chuỗi polypeptide. Các đơn vị nhỏ trong một phân tử enzyme có thể giống nhau, nhưng cũng có thể khác nhau về cấu tạo và chức năng, hoặc cũng có thể một số giống nhau, một số khác nhau. Những enzyme do nhiều đơn vị nhỏ cấu tạo nên còn được gọi là các enzyme polymer và các đơn vị nhỏ được gọi là protomer. So với các enzyme monomer, các enzyme có cấu trúc bậc bốn có những điểm sai khác sau đây: - Có trọng lượng phân tử tương đối lớn, vào khoảng hơn 100.000kD - Phân tử thường chứa một vài trung tâm hoạt động, có khi có đến 3,4 trung tâm hoạt động. - Khả năng tương tác của một trung tâm hoạt động với cơ chất sẽ phụ thuộc vào trạng thái chức năng của các trung tâm hoạt động khác. Trong một số trường hợp, mỗi tiểu phần có một trung tâm hoạt động nhưng sự tương tác giữa các tiểu phần sẽ ảnh hưởng đến cấu hình không gian của trung tâm hoạt động trên mỗi tiểu phần, do đó ảnh hưởng đến hoạt động xúc tác của enzyme. Trong một số trường hợp khác, các nhóm định chức của trung tâm hoạt động lại nằm trên các tiểu phần khác nhau, do đó hoạt động của enzyme chỉ thể hiện khi có sự kết hợp đúng đắn giữa các tiểu phần. Như vậy, enzyme có cấu trúc bậc bốn có tính tổ chức của một hệ thống hợp tác cao. - Là điều kiện cần thiết để xuất hiện tính chất allosteric của enzyme. Cần nói thêm rằng, enzyme allosteric (enzyme dị lập thể, dị không gian) là enzyme mà chất trao đổi có thể làm ảnh hưởng (ức chế hoặc hoạt hóa) lên tác dụng của chúng. Hình như hiện tượng dị lập thể (allosteric) bắt đầu xảy ra trước hết ở các enzyme được xây dựng nên từ một số tiểu đơn vị vì hiệu ứng dị lập thể có ảnh hưởng đến độ bền của liên kết giữa các tiểu đơn vị này (xem thêm ở phần enzyme dị lập thể). - Gồm các tiểu phần dưới đơn vị: Đa số các enzyme có cấu trúc bậc bốn chứa từ 2 - 4 protomer, một số enzyme khác chứa từ 6 - 8 protomer. Một số enzyme chứa đến 12 protomer ví dụ như arginine. - Sự sắp xếp của các mảnh dưới đơn vị trong phân tử enzyme thường có tính chất đối xứng cao. 1.1.4.4. Trung tâm hoạt động của enzyme Trung tâm hoạt động của enzyme là phần của phân tử enzyme trực tiếp kết hợp với cơ chất, tham gia trực tiếp trong việc tạo thành và chuyển hóa phức chất trung gian giữa enzyme và cơ chất để tạo thành sản phẩm phản ứng. Trung tâm hoạt động bao gồm nhiều nhóm chức năng khác nhau của amino acid, phân tử nước liên kết và nhiều khi có cả cofactor hữu cơ (coenzyme) và vô cơ. Ở các enzyme một thành phần, trung tâm hoạt động thường bao gồm một tổ hợp các nhóm chức năng của amino acid không tham gia tạo thành trục chính của sợi polypeptide. Trung tâm hoạt động của các enzyme hai thành phần thường bao gồm nhóm ngoại (vitamin, ion kim loại ...) và các nhóm chức năng của các amino acid ở phần apoenzyme. Theo quan niệm của Fisher thì trung tâm hoạt động của enzyme đã được hình thành sẵn với một cấu tạo nhất định chỉ cho phép cơ chất có cấu tạo tương ứng kết hợp vào. Do đó có thể ví sự tương ứng đó như “ổ khóa với chìa khóa. a b Hình 1.2: Mô hình Fisher (a) và mô hình Koshland (b) Thuyết này tuy cũng giải thích được một số hiện tượng nhưng không giải thích thỏa đáng được nhiều kết quả thu được trong thực nghiệm. Vì vậy, Koshland đã đưa ra một giả thuyết khác hấp dẫn và tế nhị hơn. Theo thuyết này thì đặc điểm của vùng trung tâm hoạt động là rất mềm dẻo và linh hoạt, các nhóm chức năng của trung tâm hoạt động của enzyme tự do chưa ở tư thế sẵn sàng hoạt động, khi tiếp xúc với cơ chất, các nhóm chức năng ở trong phần trung tâm hoạt động của phân tử enzyme thay đổi vị trí trong không gian, tạo thành hình thể khớp với hình thể của cơ chất. Cũng vì vậy, người ta gọi mô hình này là mô hình “tiếp xúc cảm ứng” hoặc “khớp cảm ứng”. Giữa cơ chất và trung tâm hoạt động tạo thành nhiều tương tác yếu, do đó có thể dễ dàng bị cắt đứt trong quá trình phản ứng để giải phóng enzyme và sản phẩm phản ứng. Trung tâm hoạt động của các enzyme có cấu trúc bậc 4 có thể nằm trên một phần dưới đơn vị hoặc bao gồm các nhóm chức năng thuộc các phần dưới đơn vị khác nhau.[5] 1.1.5. Cơ chế tác dụng của Enzyme Vận tốc phản ứng hóa học được xác định bởi giá trị năng lượng hoạt hóa tức là mức năng lượng các chất tham gia phản ứng phải đạt được để cắt đứt liên kết cần thiết và hình thành các liên kết mới. Năng lượng hoạt hóa càng lớn thì vận tốc phản ứng càng chậm và ngược lại. Do làm giảm năng lượng hoạt hóa phản ứng, các chất xúc tác có tác dụng thúc đẩy vận tốc phản ứng hóa học. Như vậy, trong các phản ứng có xúc tác, chất xúc tác làm giảm năng lượng hoạt hóa của phản ứng hóa học, có nghĩa là nó chỉ tham gia vào các phản ứng trung gian mà không đóng vai trò là chất tham gia phản ứng. Sau phản ứng, chất xúc tác lại phục hồi về trạng thái ban đầu để tiếp tục xúc tác. Hầu như tất cả các biến đổi hóa sinh trong tế bào và cơ thể sống đều được xúc tác bởi enzyme ở pH trung tính, nhiệt độ và áp suất bình thường trong khi đa số các chất xúc tác hóa học khác lại chỉ xúc tác ở nhiệt độ và áp suất cao. Trong phản ứng có sự xúc tác của enzyme, nhờ sự tạo thành phức hợp trung gian enzyme - cơ chất mà cơ chất được hoạt hóa. Khi cơ chất kết hợp vào enzyme, do kết quả của sự cực hóa, sự chuyển dịch của các electron và sự biến dạng của các liên kết tham gia trực tiếp vào phản ứng dẫn tới làm thay đổi động năng cũng như thế năng, kết quả là làm cho phân tử cơ chất trở nên hoạt động hơn, nhờ đó tham gia phản ứng dễ dàng. Năng lượng hoạt hóa khi có xúc tác enzyme không những nhỏ hơn rất nhiều so với trường hợp không có xúc tác mà cũng nhỏ hơn so với cả trường hợp có chất xúc tác thông thường. Nhiều hoạt động thực nghiệm đă cho thấy quá tŕnh tạo thành phức hợp enzyme cơ chất và sự biến đổi phức hợp này thành sản phẩm, giải phóng enzyme tự do thường trải qua ba giai đoạn theo sơ đồ sau: E + S → ES → P + E Trong đó E là enzyme, S là cơ chất (Substrate), ES là phức hợp enzyme - cơ chất, P là sản phẩm (Product) - Giai đoạn thứ nhất: enzyme kết hợp với cơ chất bằng liên kết yếu tạo thành phức hợp enzyme - cơ chất (ES) không bền, phản ứng này xảy ra rất nhanh và đòi hỏi năng lượng hoạt hóa thấp. - Giai đoạn thứ hai: xảy ra sự biến đổi cơ chất dẫn tới sự kéo căng và phá vỡ các liên kết đồng hóa trị tham gia phản ứng. - Giai đoạn thứ ba: tạo thành sản phẩm, c̣ác enzyme được giải phóng ra dưới dạng tự do Các loại liên kết chủ yếu được tạo thành giữa E và S trong phức hợp ES là tương tác tĩnh điện, liên kết hydrogen, tương tác Van der vaals. Mỗi loại liên kết đòi hỏi những điều kiện khác nhau và chịu ảnh hưởng khác nhau khi có nước. 1.1.6. Ứng dụng của Enzyme Hiện nay, việc sản xuất chế phẩm enzyme các loại đã và đang phát triển mạnh mẽ trên qui mô công nghiệp. Thực tế đã có hàng nghìn chế phẩm enzyme bán trên thị trường thế giới, các chế phẩm này đă được khai thác và tinh chế có mức độ tinh khiết theo tiêu chuẩn công nghiệp và ứng dụng. Các chế phẩm enzyme phổ biến như amylase, protease, catalase, cellulase, lipase, glucoseoxydase...[2,7] Chế phẩm enzyme không chỉ được ứng dụng trong y học mà còn được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực công nghiệp khác nhau, trong nông nghiệp, trong hóa học… “ý nghĩa của việc sử dụng enzyme trong các lĩnh vực thực tế không kém so với ý nghĩa của việc sử dụng năng lượng nguyên tử”. 1.1.6.1. Ứng dụng trong y dược Enzyme có một vị trí quan trọng trong y học. Đặc biệt là các phương pháp định lượng và định tính enzyme trong hóa học lâm sàng và phòng thí nghiệm chẩn đoán. Do đó, hiện nay trong y học đă xuất hiện lănh vực mới gọi là chẩn đoán enzyme, có nhiệm vụ: - Phân tích xác định nồng độ cơ chất như glucose, ure, cholesterol… với sự hổ trợ của enzyme. - Xác định hoạt tính xúc tác của enzyme trong mẫu sinh vật. - Xác định nồng độ cơ chất với sự hổ trợ của thuốc thử enzyme đánh dấu. - Dùng enzyme để định lượng các chất, phục vụ công việc xét nghiệm chẩn đoán bệnh, ví dụ dùng để kiểm tra glucose nước tiểu rất nhạy. D - Glucose + O2 D - Glucono-δ-lactone + H2O2 Glucose oxidase - Dùng enzyme làm thuốc ví dụ: protease làm thuốc chữa tắc nghẽn tim mạch, tiêu mủ vết thương, làm thông đường hô hấp, chống viêm, điều trị ung thư, làm thuốc tăng tiêu hóa protein, thành phần của các loại thuốc dùng trong da liễu và mỹ phẩm... - Trong y học các protease cũng được dùng để sản xuất môi trường dinh dưỡng để nuôi cấy vi sinh vật sản xuất ra kháng sinh, chất kháng độc… Ngoài ra người ta còn dùng enzyme protease để cô đặc và tinh chế các huyết thanh kháng độc để chữa bệnh.[6, 3] 1.1.6.2. Ứng dụng trong hóa học Cho đến nay, việc ứng dụng enzyme trong hóa học là do enzyme có cảm ứng cao đối với nhiệt độ, pH và những thay đổi khác của môi trường. Một trong những ứng dụng chế phẩm enzyme đáng được chú ý nhất trong thời gian gần đây là dùng chất mang để gắn phức enzyme xúc tác cho phản ứng nhiều bước. Ví dụ tổng hợp glutathion, acid béo, alcaloid, sản xuất hormone…Cũng bằng cách tạo phức, người ta gắn vi sinh vật để sử dụng trong công nghệ xử lý nước thải, sản xuất alcohol, amino acid… Trong nghiên cứu cấu trúc hóa học, người ta cũng sử dụng enzyme, ví dụ dùng protease để nghiên cứu cấu trúc protein, dùng endonuclease để nghiên cứu cấu trúc nucleic acid … Dùng làm thuốc thử trong hóa phân tích.[3] 1.1.6.3. Ứng dụng trong công nghiệp Việc sử dụng enzyme trong công nghiệp là đa dạng, phong phú và đã đạt được nhiều kết quả to lớn. Thử nhìn thống kê sơ bộ sau đây về các lĩnh vực đã dùng protease ta có thể thấy được sự đa dạng: công nghiệp thịt, công nghiệp chế biến cá, công nghiệp chế biến sữa, công nghiệp bánh mì , bánh kẹo, công nghiệp bia, công nghiệp sản xuất sữa khô và bột trứng, công nghiệp hương phẩm và mỹ phẩm, công nghiệp dệt, công nghiệp da, công nghiệp phim ảnh, công nghiệp y học... 1.1.6.4. Ứng dụng trong nông nghiệp Có thể sử dụng các loại chế phẩm enzyme khác nhau để chuyển hóa các phế liệu, đặc biệt là các phế liệu nông nghiệp cải tạo đất phục vụ nông nghiệp. Ở Nhật hằng năm đă sản xuất hàng vạn tấn chế phẩm cellulase các loại để dùng trong nông nghiệp. Có chế phẩm chứa cả cellulase, hemicellulase, protease và amylase. Công nghệ này khá phổ biến ở nhiều quốc gia. Nước ta việc dùng enzyme vi sinh vật góp phần trong sản xuất phân hữu cơ đang được khai thác để thay thế cho phân hóa học. 1.2. Giới thiệu về Enzyme Protease [1, 2, 6, 7] 1.2.1. Khái niệm Protease còn được gọi là các proteolytic enzyme, là nhóm enzyme xúc tác quá trình thuỷ phân liên kết liên kết peptit (-CO-NH-)n trong phân tử protein, polypeptit đến sản phẩm cuối cùng là các axit amin. Ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năng thuỷ phân liên kết este và vận chuyển axit amin. Hình 1.3: Mô hình enzyme Protease thủy phân phân tử Protein. Sự phân bố của Protease rất rộng rãi trên nhiều đối tượng từ vi sinh vật (vi khuẩn, nấm và virus), đến thực vật (đu đủ, dứa...) và động vật (gan, dạ dày bê...). So với protease động vật và thực vật, protease vi sinh vật có những đặc điểm khác biệt. Các protease thủy phân các liên kết peptid bên trong chuỗi polypeptid được gọi là các endoprotease và được chia thành 4 loại trên cơ sở các nhóm hóa học tham gia vào quá trình xúc tác: Serin proteinase (EC3.4.21), Cystein proteinase (EC3.4.22), Aspartic proteinase (EC3.4.23) và Metalloproteinase (EC3.4.24). Protease (peptidase) thuộc phân lớp 4 của lớp thứ 3 (E.C.3.4) Hình 1.4: Sơ đồ phân loại protease Trong cơ thể, các protease đảm nhiệm nhiều chức năng sinh lý như: hoạt hóa zymogen, đông máu và phân hủy sợi fibrin của cục máu đông, giải phóng hormon và các peptid có hoạt tính sinh học từ các tiền chất, vận chuyển protein qua màng… Ngoài ra, các protease có thể hoạt động như các yếu tố phát triển của cả tế bào ác tính và tế bào bình thường, là tăng sự phân chia tế bào, sinh tổng hợp ADN… 1.2.2. Ứng dụng của Protease 1.2.2.1. Trong công nghiệp chế biến thịt Protease được dùng làm mềm thịt nhờ sự thủy phân một phần protein trong thịt, kết quả làm cho thịt có một độ mềm thích hợp và có vị tốt hơn. Ưu điểm của việc thuỷ phân protease bởi enzyme là bảo toàn được vitamin của nguyên liệu, không tạo ra các sản phẩm phụ, không làm sẫm màu dịch thuỷ phân. 1.2.2.2. Trong chế biến thuỷ sản Khi sản xuất nước mắm thường thời gian chế biến thường là dài nhất, hiệu suất thuỷ phân (độ đạm) lại phụ thuộc rất nhiều địa phương, phương pháp gài nén, nguyên liệu cá. Nên hiện nay quy trình sản xuất nước mắm ngắn ngày đã được hoàn thiện trong đó sử dụng chế phẩm enzyme thực vật (bromelain và papain) và vi sinh vật để rút ngắn thời gian làm và cải thiện hương vị của nước mắm. Tuy nhiên vẫn còn một số tồn tại cần phải hoàn thiện thêm về công nghệ. 1.2.2.3. Trong công nghiệp sữa Protease được dùng trong sản xuất phomat nhờ hoạt tính làm đông tụ sữa của chúng. Protease từ một số vi sinh vật như A. candidus, P. roquerti, B. mesentericus,… được dùng trong sản xuất pho mát. Trong công nghiệp sản xuất bánh mì, bánh quy... protease làm giảm thời gian trộn, tăng độ dẻo và làm nhuyễn bột, tạo độ xốp và nở tốt hơn. 1.2.2.4. Trong sản xuất bia Protease có ý nghĩa quan trọng trong việc làm tăng độ bền của bia và rút ngắn thời gian lọc. Protease của A. oryzae được dùng để thủy phân protein trong hạt ngũ cốc, tạo điều kiện xử lý bia tốt hơn. 1.2.2.5. Trong công nghiệp da Protease được sử dụng làm mềm da nhờ sự thủy phân một phần protein của da, chủ yếu là collagen, thành phần chính làm cho da bị cứng. 1.2.2.6. Trong công nghiêp dệt Proteinase vi sinh vật được sử dụng để làm sạch tơ tằm, tẩy tơ nhân tạo (các sợi nhân tạo được bằng các dung dịch cazein, gelatin) để sợi được bóng, để nhuộm. Protease có tác dụng thủy phân lớp protein serisin đã làm dính bết các sợi tơ tự nhiên, làm bong và tách rời các loại tơ tằm, do đó làm giảm lượng hoá chất để tẩy trắng. 1.2.2.6. Trong y dược Điều chế dịch đạm thủy phân dùng làm chất dinh dưỡng, chất tăng vị trong thực phẩm và sản xuất một số thức ăn kiêng. Điều chế môi trường dinh dưỡng của vi sinh vật để sản xuất vaccine, kháng sinh,… Protease tự nhiên hay tổng hợp chưa được sử dụng trực tiếp trong việc điều trị ung thư ở người. Mặc dù vậy, các chất ức chế protease đang được nghiên cứu sâu hơn về cơ chế, kiểu hoạt động và khả năng ứng dụng thực tế chống ung thư trong tương lai kể cả các chất ức chế protease được tổng hợp nhân tạo 1.3. Giới thiệu về Legumain [22, 23, 24] 1.3.1. Khái niệm Legumain là endopeptidase cysteine một enzyme thủy phân cysteine ​​và đặc hiệu nghiêm ngặt cho sự thủy phân của liên kết asparaginyl. Enzyme này thuộc họ peptidase C13 và nằm trên nhiễm sắc thể 14q32.1 và mã hóa 433 axit amin và tìm ​​thấy chủ yếu trong lysosome. Cho đến nay, legumain đã được biết đến  chỉ có trong thực vật và máu sán lá. Nhưng hiện tại, các nhà khoa học thấy rằng legumain  hiện tại có ở cả trong động vật có vú.  Các nhà khoa học đã nhân bản vô tính và giải trình tự legumain người và một phần của legumain lợn. Một mức độ thấp của hoạt động được rõ ràng phát hiện trong nhau thai của con người, nhưng không ai được phát hiện trong bạch cầu máu. Legumain được đưa ra bởi Kembhavi và cộng sự từ một enzyme thủy phân hiện có mặt trong rất nhiều cây thuộc họ đậu và các hạt giống khác, sau đó chúng được phân lập và được biểu hiện đặc tính enzyme từ Vigna aconitifolia ( bướm đậu) . Legumain đặc trưng cho sự thủy phân các liên kết asparaginyl. trình tự axit amin của legumain Ricinus communis từ (thầu dầu đậu) cho thấy nó có tương đồng với một enzyme từ Schistosoma mansoni sán lá. Vào thời điểm đó, các enzyme sán lá chưa được biết đến cụ thể, các hoạt động thử nghiệm đã được giới thiệu bởi Kembhavi và cộng sự. Cysteine ​​peptidase tạo thành một trong những nhóm chính của các enzyme phân giải protein, và có thể được chia thành khoảng 30 họ riêng biệt trên cơ sở cấu trúc phân tử của chúng. Ba họ của enzyme thủy phân protein được biết đến được thể hiện trong động vật có vú. Đông đảo nhất là họ papain. trong đó bao gồm các protease B, H, L, S và các chất khác. Chủ yếu là các enzym ty thể, chịu trách nhiệm về sự phân giải protein trong ty thể hệ thống cơ quan nội bào và cũng được tiết ra tác dụng ngoại bào. Trong phần bào thể của tế bào (phần tế bào ở ngoài nhân), có các thành phần của 2 họ khác của enzyme thủy phân cystein: các họ của captain (họ C2) và caspase (interleukin 1β-converting enzyme C14). Các Peptidase trung gian đã giới hạn sự phân giải protein của chất nền bào thể. Việc giải trình tự các động có vú rõ ràng là tương đồng với legumain từ các loài khác. Legumain lợn là một glycoprotein trong khoảng 34 kDa, giảm dần đến 31 kDa. Nó là một enzyme thủy phân asparaginyl, thủy phân Z-Ala-Ala-Asn-7-(4-methyl) coumarylamide. Hoạt động tối đa được thấy ở pH=5,8 dưới các điều kiện khảo nghiệm bình thường, và enzyme này không thể biến tính đảo ngược ở pH bằng 7 và trên 7. Các nhà nghiên cứu đã tinh chế legumain từ thận lợn, legumain lợn là một glycoprotein trong khoảng 34kDa. Thận lợn đã được chọn làm nguồn để tách chiết legumain. Chúng tôi đã tìm được quy trình độc đáo để tinh chế enzyme, vì legumain ổn định ở pH =3-6, và ở nồng độ muối thấp, nó có xu hướng bị hấp phụ với bất kì vật liệu rắn nào. Khi một phần nhỏ ammonium sulfate khoảng 1,2-3,2M đã được thảm tách ở pH=5.0, một lượng kết tủa đã tạo thành để legumain hấp phụ. Các enzyme được tách bằng cách tăng nồng độ muối ở pH=6.0 đã cho thấy sự gia tăng lớn hoạt tính đặc trưng. 1.3.2. Cấu trúc và vai trò của Legumain Hình 1.5: Cấu trúc không gian của legumain Trước đây chúng ta biết đến legumain chỉ có trong động vật không xương sống. Hiện nay các nhà nghiên cứu đã phát hiện legumain có cả trong động vật có vú, nó được biết đến như là endopeptidase lysosomal. Ở động vật có vú legumain ức chế bởi chế bởi iodoacetamide và maleimides, nhưng không bị ảnh hưởng bởi hợp chất E64. E64 là một chất ức chế mạnh của cystein peptidases của họ C1 cũng như cathepsins B, H, L, nhưng 10µM E64 không ảnh hưởng đáng kể tới tỉ lệ thủy phân của Z-Ala-Ala-Asn-NHMec bằng mô chiết xuất. trong tất cả trường hợp. hoạt tính của legumain bị ức chế hoàn toàn bởi 50nM ovocystatin. Các legumain của động vật có vú liên quan đến việc xử lý các chuỗi axitamin và protein của vi khuẩn nội sinh cho lớp MHCII trình bày trong các hệ thống lysosomal / endosomal. Sự thủy phân các liên kết asparaginyl là quan trọng trong quá trình dịch mã của hydrolysis ty thể. Ví dụ, sự phân hủy tạo ra 2 chuỗi của cathesins B và H, và đây cũng là sự thủy phân của liên kết asparaginyl trong sự xử lý cathepsin D lợn và β-N-acetylhexosaminidase. Cho đến bây giờ điều này vẫn chưa chỉ ra rằng peptidase có thể chịu trách nhiệm cho điều này, nhưng chúng ta có thể đề xướng rằng đó là legumain. Legumain có thể được tiết ra từ các tế bào. ở pH trung hòa enzyme không ổn định có thể có khả năng giới hạn hoạt tính ngoài tế bào của nó, có lẽ ngoại trừ trong một môi trường acid hóa quanh tế bào. Enzyme này hoạt động ở pH tối ưu trong khoảng 5,5. 1.3.3. Chức năng của Legumain  Legumain đã được tìm thấy được đánh giá cao trong biểu hiện một số loại khối u, chẳng hạn như tuyến tiền liệt, đại tràng và ung thư vú. Ngoài ra, nó còn được  đánh giá cao  trong biểu hiện  ung thư đại tràng. Biểu hiện của nó đã được quan sát thấy có sự quy định trong quá trình phát triển khối u trong cơ thể, cho thấy một phản ứng môi trường, và có vẻ là một phản ứng ức chế gen, được tăng rõ rệt trong các tế bào phải chịu sự ức chế này. Legumain được biểu hiện cả trong tế bào và trên bề mặt tế bào bởi các tế bào khối u và khối u liên kết màng tế bào. Nó được tìm thấy đặc biệt là trong các túi màng liên kết tập trung ở chân xâm lấn của tế bào ung thư. Đáng chú ý là bề mặt tế bào các protease thường liên kết với các tế bào khối u xâm hại và di căn. Những nghiên cứu cho thấy biểu hiện gia tăng legumain có thể đóng một vai trò trong việc thúc đẩy sự tiến triển của khối u và cho rằng khối u thể hiện ở mức cao nên legumain được dự kiến ​​sẽ để hiển thị một hành vi hung hăng hơn và có tiên lượng xấu. Tuy nhiên, không có dữ liệu sẵn có xác định các mối quan hệ của sự biểu hiện legumain và lâm sang hoặc sinh học trong ung thư vú. Nhưng tỷ lệ sự biểu hiện legumain trong ung thư vú. (n = 432) và các mô vú không có khối u (n = 128) đã được nghiên cứu bởi miễn dịch mô hóa học. CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. Vật liệu 2.1.1. Sinh phẩm Vector tái tổ hợp pBT mang gen mã hóa legumain do phòng Công nghệ tế bào động vật – Viện Công nghệ sinh học cung cấp. Vector biểu hiện pET-32c(+) do phòng Công nghệ tế bào động vật – Viện Công nghệ sinh học cung cấp. Hình 2.1: Hình ảnh pET-32c(+) 2.1.2. Hóa chất và môi trường Các hóa chất tinh khiết được sử dụng trong các nghiên cứu sinh học phân tử của Biolabs, Invitrogen, Sigma và Fermantas gồm: Các hóa chất để tách plasmid: Sol I (Tris-HCl 1M pH8, EDTA 0,5M pH8, Glucose, H2O khử ion), Sol II (NaOH 3M, SDS 10%), Sol III (CH3COOK 3M, CH3COOH, H2O khử ion ), isopropanol, ethanol, phenol, chloroform, RNAse … Các hóa chất dùng cho phản ứng PCR: MgCl2, các loại đệm cho các enzyme khác nhau, Taq-pholymeraza, dNTP. Các hóa chất dùng trong điện di ADN: Agarose 0,8%, EtBr , nước cất 1 lần… LB lỏng (g/l): 5g NaCl, 10g Trypton, 5g Yeast Extract LB đặc (g/l): 5g NaCl, 10g Trypton, 5g Yeast Extract, 15g Agar Chất kháng sinh Ampicilin 2.2. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm 2.2.1. Dụng cụ Pipet, effendoft, đầu côn, ống fancol, đĩa Petri, ống nghiệm, que cấy, đèn cồn, giấy bạc, nhiệt kế, … 2.2.2. Thiết bị Một số thiết bị sử dụng bao gồm: Bảng 2.2: Tên thiết bị phòng thí nghiệm Tên thiết bị Hãng sản xuất Nước sản xuất Box cấy Esco Singapo Tủ ấm OSI Pháp Máy li tâm lạnh Fresco Đức Máy vortex IKA Đức Tủ lạnh sâu Frigo Đan Mạch Máy điện di DNA Amersham Pharmacia Biotech Thủy Điện Máy PCR PTC - 100 Mỹ Máy đo pH Thermo Mỹ Máy khuấy từ Velp Europe Máy soi chụp ảnh gel BioRad Mỹ Bể ổn nhiệt Memmert Đức Tủ sấy khô Modulyo Anh 2.3. Phương pháp nghiên cứu Từ nguồn nguyên liệu là plasmid (pBT) chứa đoạn gen mã hóa legumain và vector chứa biểu hiện pET-32c(+), quy trình thiết kế vector biểu hiện mang gen mã hóa legumain được tiến hành như sau: • Bước 1: Cắt và tinh sạch đoạn gen mã hóa legumain và vector biểu hiện pET-32c(+). • Bước 2: Thực hiện phản ứng lai đoạn gen mã hóa legumain và vector biểu hiện pET-32c(+) . • Bước 3: Biến nạp sản phẩm lai vào tế bào khả biến E.coli chủng DH5a. • Bước 4: Nuôi chủng E.coli ở trong môi trường chọn lọc có chứa Ampicilin. • Bước 5: Tách DNA plasmid, điện di DNA plasmid của những dòng khuẩn lạc này để thu được những dòng có khả năng mang gen mã hóa legumain. * Bước 6: Thực hiện phản ứng PCR với mồi cặp mồi T7R/T7F * Bước 7: Giải trình tự sản phẩm PCR với mồi cặp mồi T7R/T7F và kiểm tra trên ngân hàng gen có đúng là gen mã hóa legumain không. 2.3.1. Phương pháp tách chiết DNA plasmid Tách chiết và tinh sạch DNA plasmid là một bước thí nghiệm quan trọng trong các nghiên cứu nhân dòng phân tử cũng như trong hàng loạt nghiên cứu khác của lĩnh vực sinh học phân tử. Các plasmid thường được tinh sạch từ môi trường nuôi cấy dịch thể được chuẩn bị bằng cách nuôi cấy một khuẩn lạc đơn mang plasmid (thể biến nạp). Có nhiều phương pháp được sử dụng hiện nay để tách chiết DNA plasmid như sử dụng các loại Sol, sử dụng TELT, tách bằng kit chuyên dụng. Các phương pháp này cho phép thu nhận chế phẩm DNA plasmid ở dạng tương đối tinh sạch. Phương pháp được sử dụng ở đây là tách DNA plasmid bằng các loại Sol. Nguyên lý của phương pháp: dựa vào lợi thế của việc biến tính bằng kiềm đối với DNA plasmid và DNA nhân và sự hồi tính một cách chọn lọc DNA plasmid sau khi trung hòa dung dịch. Các bước tiến hành: Bướ 1: Thu cặn tế bào ▪ Hút 1,5ml dịch nuối cấy vào ống eppendorf ▪ Ly tâm 12000 vòng/phút trong vòng 1 phút, loại dịch, thu cặn tế bào ▪ Ly tâm 12000 vòng/phút trong 1 phút, loại cạn dịch Bước 2: Phá tế bào và loại trừ protein ▪ Bổ sung 150µl dung dịch Sol I, vortex để hòa tan hoàn toàn căn tế bào ▪ Sau đó bổ sung 150µl dung dịch Sol II, đảo nhẹ nhàng 3 lần ▪ Bổ sung 150µl dung dịch Sol III, đảo nhẹ nhàng ▪ Thêm 450µl clorofom : phenol : isoaminalcohol tỷ lệ 25:24:1, chiết ở nhiệt độ phòng (RT) ▪ Ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút ở 4oC. Bước 3: Tủa DNA plasmid ▪ Hút 400µl dịch nổi chuyển sang ống mới ▪ Bổ sung 400µl isopropanol giữ ở -20oC trong 3 phút ▪ Ly tâm 13000 vòng/phút trong 15 phút ▪ Loại dịch thu DNA plasmid Bước 4: Rửa DNA plasmid ▪ Bổ sung 400 µl ethanol 70% ly tâm 13000 vòng/phút ▪ Hòa tan DNA plasmid trong 30ml H2O + RNAse đảo nhẹ, spin ▪ Bảo quản ở 4°C/-20°C 2.3.2. Phương pháp cắt DNA bằng enzyme giới hạn Mục đích của bước này là để kiểm tra xem DNA plasmid vừa tách chiết có mang đoạn gen mã hóa legumain hay không. Sau phản ứng cắt, kiểm tra bằng điện di trên gel Agarose 0,8%. Nếu kích thước bằng với kích thước đoạn gen gắn vào vector chứng tỏ việc tạo dòng thành công. Ngoài ra, còn được sử dụng để xử lý đoạn gen mã hóa legumain và vector biểu hiện tạo đầu dính, thuận lợi cho việc gắn gen vào vector biểu hiện. Enzyme giới hạn là những endonucleotid có khả năng thủy phân DNA mạch kép ở các vị trí có trình tự xác định. Có hai kiểu là cắt đầu bằng và cắt đầu so le. Ở đây sử dụng hai enzyme cắt đầu so le là EcoRI và HindIII (Fermantas) 5’…G AATTC…3’ 3’…CTTAA G…5’ Vị trí cắt của EcoRI 5’…A AGCTT …3’ 3’…CTTAA G …5’ Vị trí cắt của HindIII Thành phần của phản ứng cắt (tổng thể tích là 10ml): Bảng 2.3: Bảng thành phần phản ứng cắt thử Thành phần Thể tích (ml) EcoRI (Fermantas) 0,4 HindIII(Fermantas) 0,4 DNA plasmid 3 BufferR (Fermantas) 1 H2O 5,2 Thành phần phản ứng cắt lượng lớn Thành phần phản ứng cắt vector biểu hiện pET-32c(+) (tổng thể tích là 30ml) Bảng 2.4: Thành phần phản ứng cắt mở vòng pET-32c(+) Thành phần Thể tích (ml) EcoRI (Fermantas) 2,5 HindIII (Fermantas) 2,5 pET-32c(+) 15 Buffer R (Fermantas) 3 H2O 7 Thành phần phản ứng cắt vector tái tổ hợp pBT – gen mã hóa legumain (tổng thể tích là 30ml) Bảng 2.5: Thành phần phản ứng cắt plasmid tái tổ hợp pBT-legumain Thành phần Thể tích (ml) EcoRI (Fermantas) 2,5 HindIII (Fermantas) 2.5 pBT- gen mã hóa legumain 15 Buffer R (Fermantas) 3 H2O 7 2.3.3. Phương pháp thôi gel [26] ▪ Chạy điện di mẫu cắt cần nghiên cứu, nhuộm gel bằng EtBr, đặt lên máy soi gel, quan sát và cắt đoạn gen mã hóa legumain kích thước khoảng (900bp) vào ống effendof. ▪ Bổ sung 600ml Binding thôi gel của Fermantas ▪ Ủ 50°C trong 10 phút để gel tan hoàn toàn ▪ Kiểm tra màu hỗn hợp (vàng) ▪ Chuyển hỗn hợp gel tan sang cột QIA quick column và đặt vào ống thu mẫu ▪ Ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút ▪ Loại dịch qua cột và đặt ống trở lại ống thu ▪ Bổ sung 500ml Wash buffer, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, loại dịch qua cột ▪ Bổ sung 750ml PE buffer, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút ▪ Loại dịch qua cột, tiếp tục ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút ▪ Đặt cột vào ống effendof mới ▪ Bổ sung H2O để trong 10 phút ở nhiệt độ phòng ▪ Bảo quản ở - 20°C 2.3.4. Phương pháp lai [25] Sau khi thu được sản phẩm thôi gel của đoạn gen mã hóa legumain tiến hành gắn sản phẩm này vào vector biểu hiện pET-32c(+) với thành phần phản ứng như sau: Bảng 2.6: Thành phần phản ứng lai Thành phần Thể tích (ml) Buffer T4 1 T4 ligase 1 Gen mã hóa legumain 6 pET-32c(+) 2 Lai ở 16°C qua đêm. 2.3.5. Phương pháp tạo tế bào khả biến ▪ Chủng E.coli DH5µ được nuôi qua đêm trên môi trường LB ở máy lắc 37°C, 200 vòng/phút ▪ Cấy chuyển 20% và tiếp tục nuôi lắc 1,5h ở 37°C, 200 vòng/phút, để OD=0,4-0,6 ▪ Để 4°C trong 1h ▪ Ly tâm 4000 vòng/phút trong 5 phút, thu tế bào loại dịch ▪ Bổ sung 300ml CaCl2 0,1M búng nhẹ cho tan đều ▪ Ly tâm 4000 vòng/phút trong 5 phút, thu cặn tế bào và loại dịch ▪ Bổ sung 60ml CaCl2 0,1M + 30ml Glyxerol 60% ▪ Bảo quản ở -70°C 2.3.6. Phương pháp biến nạp vào tế bào khả biến [25] Quá trình biến nạp sản phẩm lai vào tế bào khả biến được thực hiện bằng phương pháp sốc nhiệt. Các bước thực hiện như sau: ▪ Làm tan tế bào khả biến trong đá 30 phút ▪ Bổ sung sản phẩm lai và để trong đá 30 phút ▪ Sốc nhiệt 42°C trong 60 giây, chuyển nhanh sang đá ▪ Bổ sung 250ml môi trường LB và lắc 37°C, ở 200 vòng/phút trong 1 giờ ▪ Sau đó, đem cấy trải đều 100ml trên đĩa Petri có bổ sung Ampicilin là 100mg/ml ▪ Nuôi ở tủ 37°C qua đêm 2.3.8. Phương pháp điện di trên gel agarose 0,8% [25] * Nguyên tắc: Đây là phương pháp sử dụng để phân tích định tính cũng như định lượng của acid nucleic. Acid nucleic là đại phân tử tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt, khi nó ở trong điện trường nó sẽ chịu tác động của lực hút điện trường và di chuyển về phía cực dương của điện trường. Tính linh động của phân tử này phụ thuộc vào hai chỉ tiêu là trong lượng phân tử của acid nucleic và nồng độ các chất cấu thành gel: - Trọng lượng phân tử: các DNA có kích thước lớn sẽ chuyển động chậm trong gel agarose còn DNA có kích thước nhỏ sẽ chạy nhanh hơn. Các DNA ở dạng siêu xoắn cũng chuyển động nhanh hơn DNA ở dạng thẳng. - Nồng độ các chất cấu thành gel: đoạn gen càng nhỏ thì nồng độ agarose càng phải tăng lên để phát hiện các đoạn gel nhỏ tới nucleotide * Phương pháp đổ gel ▪ Đun gel agarose 0,8%, để cho gel nguội đến khoảng 50-60°C ▪ Đổ gel vào khuôn có cài sẵn răng lược cho gel đông lại ▪ Nhấc lược ra, đặt bản gel vào bể điện di ▪ Đổ dung dịch TAE 1X vào bể điện di ▪ Trộn mẫu cần điện di với Loading Dye và tra vào giếng. Dung dịch đệm Loading Dye có tác dụng làm tăng trong lượng riêng của acid nucleic, vì vậy nó sẽ kéo phân tử acid nucleic lắng xuống đáy giếng. ▪ Tiến hành chạy điện di ở 100V. Quan sát khi mẫu chạy được 2/3 bản gel thì tắt máy, nhấc bản gel ra và nhuộm trong dung dịch EtBr khoảng 5-10 phút, vớt gel ra rửa qua nước và đặt lên máy soi gel để quan sát các băng DNA hoặc chụp ảnh Quá trình điện di dài hay ngắn còn phụ thuộc vào điện thế của thiết bị, nếu điện thế ổn định thì sau 30-40 phút sẽ điện di xong. Thuốc nhuộm EtBr có tác dụng phát huỳnh quang dưới ánh sáng tia tử ngoại giúp cho việc hiện hình các băng rõ hơn. 2.3.9. Phương pháp PCR (Polymerase chain reaction) [25] Kỹ thuật PCR còn được gọi là kỹ thuật nhân gen in vitro do Karl Mullis và cộng sự phát minh vào năm 1985. Đây được xem là một trong số các phát minh có tính đột phá lớn nhất của lĩnh vực sinh học phân tử và công nghệ sinh học hiện đại. Nguyên tắc của kỹ thuật PCR: phối hợp khả năng lai đặc hiệu của DNA và khả năng tổng hợp DNA in vitro của DNA polymeraza để nhân bản in vitro các đoạn DNA (gen) khác nhau lên hàng triệu lần so với ban đầu. Do DNA polymeraza hoạt động theo nguyên tắc cần phức hợp khuôn – mồi, trong môi trường thích hợp có các dNTP thì sẽ kéo dài mồi thành sợi bổ sung với sợi khuôn. Vì vậy, để nhân bản được đoạn DNA đích, người ta cần phải biết được trình tự đoạn nucleotide ở hai đầu của đoạn DNA cần nhân bản để từ đó thiết kế các cặp mồi (primer) đặc hiệu. Dựa trên trình tự khuôn DNA đã được xác định, cặp mồi thiết kế đặc hiệu cho phản ứng PCR (in vitro) có trình tự như sau: T7F: 5’-TAATACGACTCACTATAGGG -3’ T7R: 3’-TAGTTATTGCTCAGCGGTGG -5’ Chúng tôi tiến hành PCR trực tiếp từ khuẩn lạc *Thành phần phản ứng PCR Bảng 2.7: Thành phần phản ứng PCR Thành phần Thể tích (ml) Buffer 10X 2.5 dNTPs (100mM) 2.5 T7F 1 T7R 1 DNA khuôn Khuẩn lạc Taq polymerase 5U 0,2 H2O khử ion vô trùng 17,8 Tổng thể tích 25 * Chu trình nhiệt của phản ứng PCR PCR gồm nhiều chu kỳ lặp lại của 3 bước cơ bản sau đây Bước 1: Biến tính hay tách sợi DNA kép thành sợi DNA đơn ở nhiệt độ 94°– 95° trong 30 đến 60 giây. Bước 2: Gắn mồi vào sợi DNA. Nhiệt độ phụ thuộc vào Tm của mồi, nhưng lưu ý nhiệt độ gắn phải thấp hơn vài độ so với Tm trong 30 đến 60 giây. Nhiệt độ gắn mồi của cặp mồi T7F/T7R là 52°C. Bước 3: Kéo dài chuỗi mới ở 72oC trong 30 giây đến vài phút tùy thuộc kích thước đoạn gen cần nhân bản. Bảo quản ở 4°C Phản ứng PCR phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau như: nhiệt độ, các thành phần phản ứng cũng như nồng độ DNA khuôn và mồi. 2.3.10. Phương pháp xác định trình tự nucleotide tự động bằng hệ thống điện di mao quản Dựa vào sự kéo dài chuỗi DNA mới theo nguyên tắc bổ sung bởi DNA polymerase khi có mặt của các ddNTP và primer. Phản ứng kéo dài được làm ngừng bằng cách bổ sung dideoxyribonucleosid triphosphate (ddNTP). Mỗi ddNTP sử dụng có thể được gắn với một phân tử huỳnh quang và mỗi nucleotide cho một màu riêng biệt. Cho tất cả bốn loại ddNTP đã đánh dấu vào cùng một ống. Sau đó các đoạn DNA có màu được phân tách theo kích thước bằng điện di trên cùng một ống điện di mao quản. Các đoạn DNA khác nhau sẽ phân tách trên gel mao quản và xuất hiện dưới dạng các đỉnh với màu đi kèm. Các đỉnh được phát hiện bằng cách sử dụng nguồn laser và detector. Đọc trình tự DNA bằng cách xác định màu của đỉnh khi chúng đi qua detector và thông tin này sẽ được chuyển trực tiếp đến một máy tính và sẽ xác định được trình tự DNA.[18] CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả thu nhận gen legumain và vector pET-32c(+) có đầu dính bổ sung Để tiến hành thiết kế vector biểu hiện pET-32c(+) mang gen mã hoá legumain, chúng tôi được phòng Công nghệ tế bào động vật, Viện Công nghệ sinh học cung cấp vector tách dòng tái tổ hợp pBT-legumain, gen proteinase legumain trong vector đã được xác định trình tự nucleotide, gen này có sự tương đồng 100% với các trình tự có mã số đăng ký AY409389, DQ895070 và SY:DQ891884. Quá trình thiết kế vector biểu hiện pET-32c(+) mang gen mã hoá legumain khởi đầu với việc vector tách dòng tái tổ hợp pBT-legumain được xử lý với enzyme EcoRI và HindIII, thu được đoạn gen mã hóa legumain (900bp). Đồng thời vector pET-32c(+) cũng được cắt mở vòng với EcoRI và HindIII. Sau đó, sử dụng enzyme nối T4-ligase để nối đoạn gen mã hóa legumain với vector pET-32c(+) tạo ra vector tái tổ hợp pET-32c(+)-legumain (Hình 3.1). EcoRI HindIII pBT-legumain EcoRI HindIII Legumain 900bp pET32c+ 6800bp Legumain 900bp pET32c+ 5900bp Hình 3.1: Sơ đồ thiết kế vector biểu hiện 3.1.1. Kết quả xử lý vector tách dòng pBT-legumain với enzyme EcoRI và HindIII Sau khi nhận được plasmid tách dòng pBT có gắn đoạn gen mã hóa legumain và vector biểu hiện pET-32c(+) từ phòng Công nghệ tế bào động vật-Viện Công nghệ sinh học, chúng tôi tiến hành biến nạp vào tế bào vi khuẩn E.coli DH5α để thu lượng lớn plasmid. Các plasmid thu được đem xử lý với enzyme giới hạn EcoRI và HindIII nhằm thu nhận đoạn gen legumain có 2 đầu dính của 2 enzyme giới hạn trên. Kết quả thể hiện trên hình 3.2. 1 2 3 Legumain (900bp) 1000bp 750bp Hình 3.2: Điện di pBT-legumain trước và sau khi cắt bằng EcoRI và HindIII Giếng 1: Thang DNA chuẩn (Fermantas) Giếng 2: pBT-legumain gốc Giếng 3: pBT-legumain sau khi cắt với 2 enzyme giới hạn Qua hình 3.2 ta thấy ở giếng 3 có 2 băng đậm và sáng đây là chiều dài của pBT-legumain. Có 2 băng bởi vì plasmid tồn tại ở hai dạng xoắn và siêu xoắn, siêu xoắn tốc độ di chuyển nhanh hơn. Ở giếng 4 có 3 băng thêm một băng so với giếng 3, điều này là do sau khi chúng ta sử dụng enzyme cắt sẽ xuất hiện đoạn gen này. Kích thước của đoạn gen này khoảng 900bp, đây chính là đoạn gen mã hóa legumain. Tuy nhiên để thu được đoạn gen này, chúng tôi tiến hành tinh sạch thu đoạn gen từ gel agarose. 3.1.2. Kết quả tinh sạch đoạn gen mã hóa legumain từ agarose Toàn bộ sản phẩm cắt được điện di trên agarose, cắt băng gel chứa đoạn gen legumain và tiến hành tinh sạch sử dụng bộ kit của hãng Fermantas. Sản phẩm sau khi tinh sạch được điện di kiểm tra trên gel. Kết quả điện di đoạn gen mã hóa legumain được trình bày trên hình 3.3. 750bp Legumain (900bp) 1000bp 1 2 Hình 3.3: Kết quả điẹn di kiểm tra gen mã hóa legumain sau khi tinh sạch từ gel agarose Đường chạy 1: Chỉ thị phân tử DNA (Fermentas) Đường chạy 2: gen legumain Kết quả điện di trên trên agarose cho thấy trên đường chạy số 2 có một băng, có kích thước khoảng 900bp, có độ tinh sạch cao đảm bảo cho các thí nghiệm tiếp theo. 3.1.3. Kết quả xử lý vector biểu hiện pET-32c(+) với enzyme EcoRI và HindIII Vector biểu hiện pET-32c(+) đồng thời cũng được xử lý với các enzyme giới hạn EcoRI và HindIII tạo đầu dính bổ sung với gen legumain. Kết quả thể hiện trên hình 3.4. 1 2 Hình 3.4: Kết quả cắt kiểm tra vector pET32c+ với 2 enzyme giới hạn EcoRI và HindIII Giếng 1. pET-32c(+) gốc không xử lý với enzyme Giếng 2. pET-32c(+) sau khi xử lý với 2 enzyme giới hạn EcoRI và HindIII Ở hình 3.4 giếng 1 có hai băng sáng bởi vì plasmid tồn tại ở hai dạng xoắn và siêu xoắn, giếng thứ 2 chỉ có một băng vì khi sau được sử lý bằng enzyme EcoRI và HindIII plasmid chuyển thành dạng thẳng. Như vậy, chúng tôi đã cắt thành công vector biểu hiện pET-32c(+) đảm bảo cho phản ứng tiếp theo. 3.2. Kết quả gắn đoạn gen mã hóa legumain vào vector biểu hiện pET-32c(+) Phản ứng gắn đoạn gen mã hóa legumain vào vector pET-32c(+) đã được xử lý bằng enzyme EcoRI và HindIII được thực hiện nhờ T4-ligase như trên bảng 3.1. Bảng 3.1: Thành phần phản ứng gắn gen mã hóa legumain vào pET-32c(+) Thành phần Thể tích (ml) Buffer T4 1 T4 ligase 1 Gen mã hóa legumain 4 Vector pET-32c(+) 4 Tổng thể tích 10 Hỗn hợp phản ứng được ủ ở 16°C qua đêm Dưới tác dụng của enzyme nối đoạn gen mã hóa legumain dễ dàng gắn vào vector pET-32c(+) để tạo ra vector tái tổ hợp. Tuy nhiên, tổng phản ứng gắn kết sẽ có nhiều trường hơp xảy ra, do vậy để chọn được dòng vector biểu hiện tái tổ hợp pET-32c(+)/legumain chúng tôi tiến hành biến nạp sản phẩm gắn kết và chọn dòng. 3.3. Kết quả chọn dòng vector tái tổ hợp pET-32c(+) mang gen legumain 3.3.1. Kết quả biến nạp sản phẩm gắn kết pET-32c(+) và gen legumain Sản phẩm lai được biến nạp vào tế bào khả biến E.coli chủng DH5a nhờ sốc nhiệt ở 42°C trong 60 giây và nuôi trong môi trường LB ở nhiệt độ 37°C. Nhờ bộ máy tổng hợp của vi khuẩn, plasmid tái tổ hợp được tạo ra với số lượng lớn các bản sao. Đem cấy trải đều 100ml trên đĩa Petri có bổ sung Ampiclilin (25 mg/ml) ở nồng độ cuối là 50 ml/ml. Sau khi nuôi qua đêm ở 37°C trên đĩa Petri xuất hiện nhiều khuẩn lạc màu trắng (Hình 3.5). Hình 3.5: Đĩa Petri chứa khuẩn lạc sau khi biến nạp Kết quả biến nạp thu được khá nhiều khuẩn lạc trắng, tuy nhiên để chọn được khuẩn lạc nào chứa vector biểu hiện tái tổ hợp mang gen legumain chúng tôi tiến hành PCR trực tiếp từ khuẩn lạc để chọn dòng. 3.3.2. Kết quả PCR từ khuẩn lạc chọn dòng vector pET-32c(+)/legumain Chúng tôi tiến hành chọn 5 khuẩn lạc làm khuôn cho phản ứng PCR với cặp primer T7F/R. Kết quả thu được được điện di kiểm tra trên gel agarose (Hình 3.6). 1 2 3 4 5 6 2000bp 1500bp 1600bp Hình 3.6. Kết quả PCR từ 10 khuẩn lạc trắng chọn dòng vector tái tổ hợp pET32c(+) mang gen legumain Giếng 1: Thang DNA chuẩn của (Fermantas) Giếng 2 ®6: Sản phẩm PCR từ các khuẩn lạc 1-5 Kết quả PCR chọn dòng trực tiếp từ 5 khuẩn lạc (Hình 3.6) cho thấy tất cả các sản phẩm PCR đều xuất hiện một băng sáng đậm có kích thước bằng tổng kích thước của gen legumain và phần của vector pET-32c(+) nằm trong vùng giữa 2 primer T7F và T7R. Chúng tôi nhận thấy có thể cả 5 khuẩn lạc đã chọn đều mang plasmid tái tổ hợp pET-32c(+) chứa gen legumain. Chúng tôi chọn 1 khuẩn lạc là khuẩn lạc số 2 để nuôi cấy tách chiết plasmid tái tổ hợp. Để kiểm tra gen đã gắn được vào vector pET-32c(+) có chắc chắn là gen legumain hay không, gen gắn vào vector có đúng chiều và khớp khung đọc hay không, chúng tôi tiến hành giải trình tự plasmid này với cặp primer T7F/R. 3.6. Kết quả tách dòng và xác định trình tự legumain Sau khi tiến hành xác định trình tự vùng gen ngoại lai gắn vào vector pET-32c(+) với cặp primer T7F/R, chúng tôi thu được kết quả như sau: 1 atgagcgata aaattattca cctgactgac gacagttttg acacggatgt 51 actcaaagcg gacggggcga tcctcgtcga tttctgggca gagtggtgcg 101 gtccgtgcaa aatgatcgcc ccgattctgg atgaaatcgc tgacgaatat 151 cagggcaaac tgaccgttgc aaaactgaac atcgatcaaa accctggcac 201 tgcgccgaaa tatggcatcc gtggtatccc gactctgctg ctgttcaaaa 251 acggtgaagt ggcggcaacc aaagtgggtg cactgtctaa aggtcagttg 301 aaagagttcc tcgacgctaa cctggccggt tctggttctg gccatatgca 351 ccatcatcat catcattctt ctggtctggt gccacgcggt tctggtatga 401 aagaaaccgc tgctgctaaa ttcgaacgcc agcacatgga cagcccagat 451 ctgggtaccg acgacgacga caaggccatg ggatatctgt ggatccGAAT 501 TCTGATCAAC AGGCCCAATG GCACAGATGT CTATCAGGGA GTCCCGAAGG 551 ACTACACTGG AGAGGATGTT ACCCCACAAA ATTTCCTTGC TGTGTTGAGA 601 GGCGATGCAG AAGCAGTGAA GGGCATAGGA TCCGGCAAAG TCCTGAAGAG 651 TGGCCCCCAG GATCACGTGT TCATTTACTT CACTGACCAT GGATCTACTG 701 GAATACTGGT TTTTCCCAAT GAAGATCTTC ATGTAAAGGA CCTGAATGAG 751 ACCATCCATT ACATGTACAA ACACAAAATG TACCGAAAGA TGGTGTTCTA 801 CATTGAAGCC TGTGAGTCTG GGTCCATGAT GAACCACCTG CCGGATAACA 851 TCAATGTTTA TGCAACTACT GCTGCCAACC CCAGAGAGTC GTCCTACGCC 901 TGTTACTATG ATGAGAAGAG GTCCACGTAC CTGGGGGACT GGTACAGCGT 951 CAACTGGATG GAAGACTCGG ACGTGGAAGA TCTGACTAAA GAGACCCTGC 1001 ACAAGCAGTA CCACCTGGTA AAATCGCACA CCAACACCAG CCACGTCATG 1051 CAGTATGGAA ACAAAACAAT CTCCACCATG AAAGTGATGC AGTTTCAGGG 1101 TATGAAACGC AAAGCCAGTT CTCCCGTCCC CCTACCTCCA GTCACACACC 1151 TTGACCTCAC CCCCAGCCCT GATGTGCCTC TCACCATCAT GAAAAGGAAA 1201 CTGATGAACA CCAATGATCT GGAGGAGTCC AGGCAGCTCA CGGAGGAGAT 1251 CCAGCGGCAT CTGGATGCCA GGCACCTCAT TGAGAAGTCA GTGCGTAAGA 1301 TCGTCTCCTT GCTGGCAGCG TCCGAGGCTG AGGTGGAGCA GCTCCTGTCC 1351 GAGAGAGCCC CGCTCACGGG GCACAGCTGC TACCCAGAGG CCCTGCTGCA 1401 CTTCCGGACC CAAAGCTTgc ggccgcactc gagcaccacc accaccacca 1451 ctgagatccg gctgctaaca aagcccgaaa ggaagctgag ttggctgctg 1501 ccaccgctga gcaataacta g *Ảnh Chromas kết quả sequence Sau khi xử lý trình tự, chúng tôi thu được trình tự amino acid như sau: 1 MSDKIIHLTD DSFDTDVLKA DGAILVDFWA EWCGPCKMIA PILDEIADEY 51 QGKLTVAKLN IDQNPGTAPK YGIRGIPTLL LFKNGEVAAT KVGALSKGQL 101 KEFLDANLAG SGSGHMHHHH HHSSGLVPRG SGMKETAAAK FERQHMDSPD 151 LGTDDDDKAM GYLWIRILIN RPNGTDVYQG VPKDYTGEDV TPQNFLAVLR 201 GDAEAVKGIG SGKVLKSGPQ DHVFIYFTDH GSTGILVFPN EDLHVKDLNE 251 TIHYMYKHKM YRKMVFYIEA CESGSMMNHL PDNINVYATT AANPRESSYA 301 CYYDEKRSTY LGDWYSVNWM EDSDVEDLTK ETLHKQYHLV KSHTNTSHVM 351 QYGNKTISTM KVMQFQGMKR KASSPVPLPP VTHLDLTPSP DVPLTIMKRK 401 LMNTNDLEES RQLTEEIQRH LDARHLIEKS VRKIVSLLAA SEAEVEQLLS 451 ERAPLTGHSC YPEALLHFRT QSLRPHSSTT TTTTEIRLLT KPERKLSWLL 501 PPLSNN* Từ trình tự amino acid thu được chúng tôi có thể khẳng định rằng đã thiết kế thành công vector biểu hiện mang gen mã hoá cho proteinase legumain, gen legumain chèn vào vector đúng chiều và khớp khung đọc đảm bảo cho quá trình phiên mã và dịch mã sau này. KẾT LUẬN 1. Đã thiết kế thành công vector biểu hiện đoạn gen mã hóa legumain. Đoạn gen này đã được gắn vào vector pET-32c(+) vào giữa các vị trí nhận biết của enzyme giới hạn EcoRI và HindIII. KIẾN NGHỊ Tiếp tục nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa legumain trên các hệ biểu hiện hợp lý Nghiên cứu để tối ưu hóa quá trình biểu hiện và tinh chế legumain phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo. TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 1. Nguyễn Hữu Chấn, 1983. Enzyme và xúc tác Sinh học. Nxb Y học, Hà Nội. 2. Phạm Thị Trân Châu, Trần Thị Áng, 2000. Hóa sinh học. Nxb Giáo dục, Hà Nội. 3. Đỗ Ngọc Liên, Phạm Thị Trân Châu, 1972. Enzyme I, II. Đại học Tổng hợp, Hà Nội. 4. Nguyễn Tiến Thắng, Nguyễn Đình Huyên, 1998. Giáo trình sinh hóa hiện đại. Nxb Giáo dục, Hà Nội. 5. Nguyễn Xuân Thắng, Đào Kim Chi, Phạm Quang Tùng, Nguyễn Văn Đồng, 2004. Hóa sinh học. Nxb Y học, Hà Nội. 6. Lê Ngọc Tú, La Văn Chứ, Phạm Trân Châu, Nguyễn Lân Dũng, 1982. Enzyme vi sinh vật. Nxb KH&KT, Hà Nội. 7. Lê Ngọc Tú (chủ biên), Lê Văn Chứ, Đặng Thị Thu, Phạm Quốc Thăng Nguyễn Thị Thịnh, Bùi Đức Hợi, Lưu Duẫn, Lê Doãn Diên, 2000. Hóa sinh Công nghiệp, Nxb KH&KT, Hà Nội. 8. Khuất Hữu Thanh, 2006. Cơ Sở Di Truyền Phân Tử và Kỹ Thuật Gen.Nxb Khoa Học và Kỹ thuật, Hà Nội 9. Hồ Huỳnh Thùy Dương (2003), Sinh học phân tử, Nxb Giáo dục. 10. PGS-TS Phan Tuấn Nghĩa (2004), Bài giảng Các kĩ thuật mới trong công nghệ sinh học, 11. Quyền Đình Thi, Nông Văn Hải (2008), Những kỹ thuật PCR và ứng dụng trong phân tích DNA, Nxb Khoa học tự nhiên và công nghệ. TÀI LIỆU TIẾNG ANH 12. Barrett, A. J., and Rawlings, N. D. (1996) Perspect. Drug Discov. Design 6, 1-11 13. Kembhavi, A. A., Buttle, D. J., Knight, C. G., and Barrett, A. J. (1993) Arch. Biochem. Biophys. 303, 208-213 14. Dalton, J.P., Hola-Jamriska, L., and Brindley, P. J. (1995) Parasitology 111, 575-580 15. Sanger, F., Nicklen, S., and Coulson, A. R (1977) Proc. Natl.Acad.Sci.U. S. A. 74, 5463-5467 16. Capranico G, Supino R, Binaschi M, et al. Influence of structural modifications at the 3’ and 4’ positions of doxorubicin on the drug ability to trap topoisomerase II and to overcome multidrug resistance. Mol Pharmacol 1994;45:908-15. 17. Alonso, J. M., and Granell, A. (1995) Plant Physiol. 109, 541-547 18. Capranico G, Zunino F, Kohn KW, Pommier Y. Sequence-selective topoisomerase II inhibition by anthracycline derivatives in SV 40 DNA; relationship with DNA binding affinity and cytotoxicity. Biochemistry 1990;29:562-9. 19. Yano M, Hirai K, Naito Z, et al. Expression of cathepsin B and cystatin C in human breast cancer. Surg Today 2001;31:385-9 20. Kembhavi AA, Buttle DJ, Knight CG, Barrett AJ. The two cysteine endopeptidases of legumain seeds; purification and characterization by use of specific fluorometric assays. Arch Biochem Biophys 1993;303:208-13. 21. Chen JM, Đano PM, Rawlings ND, et al. Cloning, isolation, and characterization of mammalian legumain, an asparaginyl endopeptidase. J Biol Chem 1997;272: 8090-8 22. Liu C, Sun C, Huang H, Janda K, Edgington T. Overexpression of legumain in tumors is significant for invasion/metastasis and a candidate enzymatic target for product therapy. Cancer Res 2003;63:2957-64. 23. Alvarez-Fernandez M, Brrett AJ, Gerhartz B, Dando PM, Ni J, Abrahamson M. Inhibition of mammalian legumain by some cystatine is due to a novel second reactive site. J Biol Chem 1999;274:19195-203. 24. Jing-May Chen, Pam M. Dando, Neil D. Rawlings, Molly A. Brown, Nina E.Young…(Cloning, Isolation, and Characterization of Mammalian Legumain, an Asparaginyl Endopeptidase ), 1996 25. SAMBROOK J AND RUSSELL WD (2001). Molecular cloning: A laboratory manual, 3rd, ed. Cold spring harbor laboratory press, cold spring habor NY 26. DNA extraction kit manual (QUIAGEN)