Khóa luận Thiết lập quy trình điện di protein SDS- PAGE và ứng dụng đánh giá phản ứng của cây lúa đối với thuốc sinh học kích kháng

nol. Vortex cho hỗn hợp đồng nhất. Ly tâm 5.000 vòng/phút trong 10 phút ở 40C. 6. Loại bỏ phenol, thêm 5 ml 0,1 M amonium acetate trong methanol 100% ( trữ mẫu ở -200C). 8 7. Vortex và ủ mẫu ở -200C trong 1 giờ hoặc qua đêm. Thu kết tủa bằng cách ly tâm 20.000 vòng/phút trong 20 phút ở 40C. 8. Rửa kết tủa với 0,1 M amonium acetate trong methanol, tiếp tục rửa với acetone 80%, và cuối cùng là rửa với ethanol 70%. Mỗi lần rửa nhƣ vậy thì ủ mẫu ở -20 0C trong 15 phút. Sau đó đổ bỏ dịch và thu kết tủa. 9. Thêm acetone 80% chứa 10 mM DTT. Trữ -800C cho tới khi sử dụng. 2.2.3 Quy trình có sử dụng PMSF (Fan shuguo, 2002) 1. 1 g mẫu đƣợc nghiền trong cối, lọc và giấy lọc. 2. Đƣa vào dung dịch nhƣ sau (100 mM/l Tris– HCl , 4 M/l EDTA, 0,5 M/l DTT và 1 M/l PMSF). 3. Mẫu đƣợc chuyển sang ống Falcon 15 ml và ly tâm với vận tốc 5.000 vòng/phút ở 40C trong 15 phút. 4. Hút lấy dịch nổi chuyển sang ống Falcon 50 ml và thêm vào 40 ml acetone. 5. Ly tâm để loại bỏ EDTA, lipid, đƣờng saccharide. 6. Ly tâm mẫu với vận tốc 5.000 vòng/phút ở 40C trong 5 phút. Loại bỏ acetone, thêm vào 40 ml acetone khác. (Chú ý có thể thêm (NH4)2SO4 để cho kết tủa). 7. Lặp lại 3 lần loại bỏ acetone nhƣ trên sau đó lấy phần tủa. 8. Thêm acetone vào trộn đều. 9. Hút dịch và chuyển vào eppendorf 1,5 ml sau đó ly tâm vận tốc 16.000 vòng/phút ở nhiệt độ 40C trong thời gian 20 phút. 10. Loại bỏ acetone, giữ kết tủa trong tủ ấm 370C trong 5 phút để phơi khô. 11. Pha kết tủa lại với 1x TE và sử dụng. 2.3 Phƣơng pháp điện di trên gel polyacrylamide 2.3.1 Sơ lƣợc về lịch sử gel polyacrylamide và sự phát triển của phƣơng pháp điện di trên gel polyacrylamide Điện di là một phƣơng pháp đƣợc sử dụng chủ yếu trong nghiên cứu sinh học phân tử. Nó cho phép phân tách trọng lƣợng của các phân tử sinh học, từ đó ta có thể xác định đƣợc trọng lƣợng phân tử của chúng. 9 Vào khoảng thập niên 1930 phƣơng pháp điện di trên gel đầu tiên đƣợc biết đến. Raymond và Winstraub (1959) lần đầu tiên giới thiệu về gel polyacrylamide. Ornstein và Davis (1964) thực hiện điện di trên gel polyacrylamide không liên tục. Beber và Osborn (1969) đã giới thiệu về tác nhân gây biến tính protein và sodium dodecyl sulfate. Laemmli (1970) phát triển phƣơng pháp SDS– PAGE trong phân tách 28 thành phần của T4– phage. 2.3.2 Gel polyacrylamide Acrylamide là một đơn phân tử có cấu trúc: CH2=CH–CO–NH2 và bis- acrylamide có cấu trúc: CH2=CH–CO–NH–CH2–NH–CO–CH=CH2. Acrylamide là một độc tố thần kinh mạnh, khi hít phải sẽ làm mê mệt. Nó có khả năng thấm qua da khi tiếp xúc trực tiếp. Hiệu quả độc tố sẽ tích tụ dần. Vì vậy khi thực hiện làm thí nghiệm với acrylamide nên đeo khẩu trang và găng tay. Tuy nhiên ở dạng đã đƣợc polymer hóa thành polyacrylamide thì lại không độc. Nhƣng khi tiếp xúc trực tiếp với nó vẫn nên mang găng tay bảo vệ vì có thể sẽ còn một lƣợng nhỏ acrylamide vẫn chƣa đƣợc polymer hóa. (Sambrook và ctv, 2001) Gel polyacrylamide là gel đƣợc tạo thành do sự polymer hóa các đơn phân tử acrylamide và N,N’-methylene-bis-acrylamide. Kích thƣớc lỗ gel phụ thuộc vào chiều dài của chuỗi polymer và mức độ polymer hóa. Gel polyacrylamide đƣợc mô tả qua 2 đặc điểm: %C và %T. 1. Tổng lƣợng đơn phân tử acrylamide chứa trong gel (%T) %T= (g acrylamide + g bis- acrylamide) x 100% Tổng thể tích (ml) 2. Lƣợng bis- acrylamide chứa trong gel (%C) %C= g bis- acrylamide x 100% g acrylamide + g bis- acrylamide Quá trình polymer hóa đƣợc xúc tác bởi ammoniumpersulfate (APS), N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine (TEMED). Sử dụng gel polyacrylamide chạy điện di thì việc chuẩn bị gặp nhiều khó khăn hơn so với chạy điện di trên gel agarose. 10 Sự di chuyển của các phân tử sinh học trên gel phụ thuộc vào kích thƣớc của lỗ gel, điện tích của phân tử cần phân tách và điện trƣờng. Giới hạn trọng lƣợng phân tử của các phân tử sinh học mà gel có thể phân tách tùy thuộc vào nồng độ acrylamide và bis-acrylamide: nếu nồng độ gel thấp sẽ tạo ra lỗ gel lớn, cho phép phân tách các phân tử sinh học có kích thƣớc lớn và ngƣợc lại nếu nồng độ gel cao sẽ tạo ra lỗ gel nhỏ, cho phép phân tách các phân tử sinh học có kích thƣớc nhỏ (xem phụ lục 2). 2.3.3 Phƣơng pháp SDS-PAGE (Laemmli, 1970) Phƣơng pháp SDS- PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate- Polyacrylamide Gel Electrophoresis) còn đƣợc gọi là phƣơng pháp điện di trên gel acrylamide không liên tục và mẫu protein đƣợc gây biến tính (discontinuous and denaturing). SDS là một tác nhân làm biết tính và âm tính hóa các phân tử protein. Trong kĩ thuật này protein đƣợc xử lý với chất tẩy SDS và tác nhân khử cầu nối disulfite là 2- mercaptoethanol hoặc dithiotheitol (DTT). Khi xử lý protein với 2- mercaptoethanol hay dithiotheitol thì các tác nhân này sẽ cắt đứt các cầu nối disulfite (S – S) của protein, vì vậy protein từ cấu trúc bậc 2, 3, 4 đƣợc biến đổi thành chuỗi polypeptide bậc một và nhờ sự có mặt của SDS tất cả các protein đều đƣợc tích điện âm. Nhờ đó, dƣới tác động của điện trƣờng sự di chuyển trong gel của các phân tử protein chỉ phụ thuộc vào kích thƣớc, những phân tử có kích thƣớc lớn sẽ di chuyển chậm hơn những phân tử có kích thƣớc nhỏ khi đi qua một lỗ gel có kích thƣớc nhất định. Dƣới tác dụng của điện trƣờng các phân tử tích điện âm sẽ di chuyển về cực dƣơng. Để đƣa các protein trong mẫu về cùng một vạch xuất phát đồng thời tạo ra sự phân tách tốt hơn, ngƣời ta thƣờng sử dụng phƣơng pháp điện di trên gel không liên tục (discontinuous gel). Trong phƣơng pháp này gel gồm 2 lớp: Lớp gel gom (stacking gel): Thông thƣờng lớp gel này có nồng độ gel thấp vào khoảng 4 – 5%, và nằm phía trên nơi tạo giếng bơm mẫu. Khi có tác động của điện trƣờng các protein có trong mẫu sẽ bắt đầu di chuyển từ những giếng mẫu qua lớp gel này. Nhờ đó, các protein trong mẫu đƣợc dồn lại và tạo một lớp băng mỏng 11 nằm ngay phía trên lớp gel phân tách, tạo điều kiện thuận lợi hơn trong việc phân tách protein [5]. Lớp gel phân tách (separating gel) (lớp dƣới): Lớp gel này có nồng độ gel cao hơn so với lớp gel gom, và nằm phía dƣới. Có tác dụng chính trong việc tạo ra các băng protein có trọng lƣợng phân tử, kích thƣớc khác nhau từ một hỗn hợp protein xuất phát ban đầu [5]. Kĩ thuật SDS- PAGE có thể xác định đƣợc những phân tử protein có trọng lƣợng phân tử từ 10.000 – 200.000 Daltons. Những phân tử protein có trọng lƣợng lớn hơn 200.000 Daltons thƣờng đƣợc xác định trên gel có nồng độ acrylamide ít hơn 2,5% [5]. 2.3.4 Nhuộm gel sau khi điện di Nếu protein không đƣợc đánh dấu phóng xạ, thì sau khi điện di để thấy đƣợc sự phân tách của các băng protein trên gel chúng ta cần phải tiến hành nhuộm gel. Sự lựa chọn phƣơng pháp nhuộm đƣợc xác định dựa trên nhiều yếu tố bao gồm độ nhạy, giải nhuộm, tiện dụng, tính kinh tế, thiết bị nhuộm, thiết bị đọc sẵn có. Coomassie Brilliant Blue R- 250 thích hợp dùng để nhuộm cho hầu hết các protein và thƣờng đƣợc sử dụng. Đối với Coomassie Brilliant Blue G- 250 nên sử dụng để nhuộm đối với những protein có trọng lƣợng phân tử polypeptide thấp. Nhuộm bạc Hình 2.3 Cấu trúc protein trƣớc và sau khi biến tính bởi SDS 12 (Rabilloud, 1990) là phƣơng pháp rất nhạy đối với protein và nên sử dụng nhuộm gel khi điện di để đánh giá sự tinh khiết của mẫu protein. Nhuộm bạc cho phép phát hiện một cách nhanh chóng và nhạy các băng protein trên gel ngoại trừ những protein không đƣợc phân tách trên gel. a) Nhuộm Coomassie Brilliant Blue Nhuộm bằng Coomassie Brilliant Blue R- 250 là phƣơng pháp nhuộm phổ biến nhất thƣờng đƣợc sử dụng phát hiện protein trên gel polyacrylamide (Wilson, 1983). Rất dễ phát hiện khi có khoảng 0,1 – 1 µg protein trên băng. Dung dịch nhuộm bao gồm các thành phần nhƣ: 0,1% Coomassie Brilliant Blue R- 250 (w/v), 40% methanol (v/v), 10% acid acetic (v/v). Tùy theo hàm lƣợng protein mà ta có thể thay đổi tỉ lệ thành phần các chất cũng nhƣ chất nhuộm. Nếu trên gel chứa polypeptide có trọng lƣợng phân tử thấp thì ta có thể nhuộm trong hỗn hợp dung dịch 0,1% Coomassie Brilliant Blue R- 250 (w/v), 50% methanol (v/v), 10% acid acetic (v/v) khoảng một giờ. Ngoài ra, chúng cũng có thể đƣợc nhuộm với 0,025% Coomassie Brilliant Blue G- 250 (w/v) trong methanol và acid acetic từ 1 – 2 giờ. b) Nhuộm bạc Phƣơng pháp này có thể phát hiện protein nhạy gấp trăm lần so với phƣơng pháp nhuộm bằng Coomassie Brilliant Blue (Merril, 1990). Những băng chứa khoảng 10 – 100 ng protein hay nucleic acid có thể dễ dàng đƣợc nhìn thấy. Thông thƣờng ngƣời ta sử dụng muối bạc nitrate. Các bƣớc tiến hành nhuộm bạc phức tạp hơn rất nhiều so với nhuộm bằng Coomassie Brilliant Blue [9]. Các bƣớc nhuộm (Kyle Coachman, Jeff Ranish và Steve Hahn, 2002) 1. Ngâm gel trong acid acetic 7% khoảng 10 phút. 2. Ngâm gel trong methanol 50% khoảng 20 phút. 3. Rửa gel trong nƣớc siêu sạch khoảng 10 phút. 4. Chuẩn bị dung dịch nhuộm: Chuẩn bị dung dịch A gồm: 0,8 g bạc nitrate, 4 ml nƣớc siêu sạch.Chuẩn bị dung dịch B gồm: 21 ml nƣớc siêu sạch, 250 µl NaOH 30%, 1,4 ml NH4OH 14,8 M. 13 5. Nhỏ từ từ từng giọt dung dịch A vào dung dịch B. Ngay lập tức thêm vào hỗn hợp dung dịch 76 ml nƣớc siêu sạch. 6. Ngâm gel trong dịch nhuộm khoảng 15 phút. 7. Rửa gel thật kỹ lại với nƣớc siêu sạch. 8. Ngâm gel trong dịch giải nhuộm (200 ml nƣớc siêu sạch, 1 ml citric acid 1%, 100 µl formaldehyde 37%) cho tới khi có thể thấy rõ các băng protein. Thông thƣờng từ 2 – 15 phút. 2.3.5 Một số yếu tố cần quan tâm trong điện di trên gel polyacrylamide a) Hệ đệm điện di và các tác nhân gây biến tính protein Hệ đệm quyết định nhu cầu về năng lƣợng và ảnh hƣởng đến sự phân tách protein. Hệ đệm bao gồm đệm dùng để pha gel và đệm dùng để chạy điện di. Hệ đệm của gel không liên tục đầu tiên đƣợc phát triển bởi Ornstein (1964) và Davis (1964). Họ đã ứng dụng để phân tách protein nguyên thể, tức là những protein chƣa bị biến tính. Hệ đệm họ sử dụng gồm bốn yếu tố: (i) gel gom dùng đệm Tris– HCl pH 6,8; (ii) gel phân tách dùng đệm Tris– HCl pH 8,8, (iii) đệm điện di Tris– glycine pH 8,3; (iv) mẫu cần phân tách dùng đệm Tris– HCl pH 6,8. Nhƣng với hệ đệm đƣợc sử dụng nhƣ vậy thì trong mô hình này họ không thể tiến hành phân tách đƣợc một khoảng rộng về trọng lƣợng protein. Dựa trên mô hình và hệ đệm của Ornstein và Davis, Laemmli đã phát triển trong việc sử dụng thêm tác nhân khử cầu nối disulfite và SDS. Nhờ đó, việc phân tách protein trên gel chỉ phụ thuộc vào trọng lƣợng phân tử của protein. Do đó việc phân tách protein trở nên dễ thực hiện hơn và không bị phụ thuộc vào điện tích của các phân tử sinh học. Tuy nhiên mô hình của ông cũng gặp một số khó khăn. Nhiều protein không đƣợc phân tách theo mong muốn khi sử dụng SDS– PAGE (Andrews, 1986; Hames, 1990; See và Jackowski, 1989). Hiện tƣợng này xảy ra là do: (i) cấu trúc disulfite của protein không bị tác động, và protein không bị âm tính hóa bão hòa bởi SDS. (ii) Những glycoprotein và lipoprotein trong mẫu không bị âm tính hóa bão hòa bởi SDS, bởi vì thành phần không phải protein của chúng không tƣơng tác với SDS. 14 b) Điều kiện năng lƣợng Năng lƣợng cung cấp trong điện di là điện năng. Có rất nhiều thiết bị nguồn điện khác nhau đƣợc sản xuất phục vụ trong điện di. Một số thiết bị cho phép chạy tự động sau khi ta chỉnh các thông số mong muốn (hiệu điện thế, cƣờng độ dòng điện, thời gian điện di) và cũng có một số thiết bị đòi hỏi phải có sự giám sát về thời gian (Allen và ctv, 1984). Giới hạn chính của các mô hình điện di là khả năng làm thất thoát năng lƣợng khi điện năng chuyển hóa thành năng lƣợng điện trƣờng. Sự thất thoát là do một phần năng lƣợng điện đã đƣợc chuyển hóa thành nhiệt năng (Wooolley, 1987). Nhiệt năng này có thể gây ra một số ảnh hƣởng xấu đến kết quả điện di nhƣ: băng protein bị méo, cong; tăng sự khuếch tán; sự hoạt động trở lại của enzyme trong mẫu; sự biến tính protein. Do đó một thiết bị điện di tốt phải đảm bảo đƣợc sự chuyển nhiệt từ gel ra môi trƣờng ngoài. Thông thƣờng, điện di nên chỉnh hiệu điện thế (volt) và cƣờng độ dòng điện (ampe) sao cho quá trình điện di xảy ra nhanh chóng mà vẫn đảm bảo đƣợc sự phân tách protein mẫu. 2.3.6 Phƣơng pháp điện di hai chiều Kỹ thuật điện di hai chiều trên gel polyacrylamide (2– DE) là một kỹ thuật có khả năng phân tích hơn 1.800 protein trên cùng một bản gel, nó là một công cụ quan trọng cơ bản trong những thí nghiệm mà các protein phức tạp đƣợc tách ra để phân tích đồng thời.Các bƣớc cơ bản trong kỹ thuật 2– DE: Chuẩn bị mẫu và làm hòa tan mẫu: Phƣơng pháp chuẩn bị mẫu tùy thuộc vào mục đích nghiên cứu. Các yếu tố nhƣ độ tan, điện tích, kích thƣớc và điểm đẳng điện của protein đều đƣợc lƣu ý trong quá trình chuẩn bị mẫu. Việc chuẩn bị mẫu cũng giúp làm giảm bớt sự phức tạp của một hỗn hợp protein. Các đoạn protein đƣợc dùng trong chạy điện di hai chiều phải đƣợc duy trì trong dung dịch đệm biến tính có lực ion thấp để duy trì tính nguyên vẹn của protein và giữ chúng ở trạng thái hòa tan. Điện di theo chiều thứ nhất: Protein đƣợc tách ra dựa trên điểm đẳng điện pI của chúng, ở pH mà protein không tích điện và không di chuyển trong điện trƣờng. 15 Kỹ thuật này đƣợc gọi là isoelectric focusing (IEF). Đối với điện di hai chiều, IEF là công cụ tốt nhất để thực hiện phân tích protein theo nồng độ pH. Protein là một phân tử ion lƣỡng tính. Khi mà protein đƣợc đặt trong môi trƣờng với gradient pH và bị phụ thuộc vào một trƣờng điện từ, ban đầu nó sẽ di chuyển đến điện cực trái dấu với nó. Trong suốt quá trình tồn tại của chúng qua gradient pH, protein sẽ có thể nhận hay mất proton. Cân bằng trạng thái của protein: Ở trạng thái bình thƣờng protein có thể mang điện tích âm, điện tích dƣơng hay cân bằng về điện tích. Điều đó phụ thuộc vào số lƣợng nhóm ( –NH2) và (–COO – ) của các phân tử amino acid cấu tạo nên protein. Do đó, trƣớc khi thực hiện điện di theo chiều thứ hai, các phân tử protein cần phải đƣợc gây biến tính và đồng nhất về điện tích. Ở bƣớc này ngƣời ta xử lý protein với 2-mercaptoethanol hay dithiotheitol, các tác nhân này sẽ cắt đứt các cầu nối disulfite (S–S) của protein, vì vậy protein từ cấu trúc bậc 2, 3, 4 trở thành chuỗi polypeptide và nhờ sự có mặt của SDS tất cả các protein đều đƣợc tích điện âm. Phân tách protein theo chiều thứ hai: Dƣới tác dụng của điện trƣờng do protein mang điện tích âm sau khi cân bằng trạng thái nên protein sẽ di chuyển từ cực âm sang cực dƣơng. Khi protein di chuyển qua gel polyacrylamide, sự cọ sát của các hạt acrylamide với phân tử protein tạo ra lực kháng làm ngăn cản sự di chuyển của protein. Protein có trọng lƣợng phân tử càng lớn thì lực cản càng mạnh. Nhuộm protein: Để có thể nhìn thấy đƣợc protein sau khi điện di, gel phải đƣợc nhuộm, trừ khi chúng ta đã đánh dấu protein. Sự lựa chọn phƣơng pháp nhuộm đƣợc xác định dựa trên nhiều yếu tố bao gồm độ nhạy, dải nhuộm, tiện dụng, tính kinh tế, và thiết bị nhuộm, thiết bị đọc sẵn có. Thu nhận và phân tích hình ảnh protein: Việc thu nhận hình ảnh theo kỹ thuật số là một trong những yếu tố quan trọng làm cho phƣơng pháp 2-DE là phƣơng tiện thực tế trong việc thu nhận dữ liệu trong nghiên cứu. Phần mềm phân tích protein PDQuest (Bio– Rad) cho phép chúng ta phân tích đƣợc các hình ảnh gel, chú giải các điểm protein và thu nhận dữ liệu. Phần mềm PDQuest cũng tham 16 gia điều khiển các thiết bị ghi nhận hình ảnh và hệ thống thu thập protein điểm của hệ thống thiết bị phân tích protein Spot Cutter. 2.4 Một số nghiên cứu ứng dụng điện di protein SDS- PAGE 2.4.1 Nghiên cứu trong nƣớc ứng dụng điện di protein SDS- PAGE Năm 2005, Trần Linh Thƣớc (Đại học Khoa học tự nhiên Thành phố Hồ Chí Minh) đã sử dụng phƣơng pháp SDS- PAGE trong đề tài “Nghiên cứu các hệ thống biểu hiện gen trong E.Coli để sản xuất protein tái tổ hợp” để chứng minh sự biểu hiện của gen và sự hiện diện của protein tái tổ hợp. Năm 2005, nhóm nghiên cứu (Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng, trƣờng Đại học Cần Thơ đã nghiên cứu ứng dụng phƣơng pháp điện di protein SDS- PAGE để đánh giá độ thuần của một số bộ hạt giống rau các loại. Hạt giống rau đƣa vào đánh giá là loại hạt lai F1 đƣợc sản xuất trong nƣớc và nhập khẩu. Năm 2005, Võ Thị Hoàng Mi (Đại học Mở Bán công Thành phố Hồ Chí Minh) đã sử dụng phƣơng pháp SDS- PAGE kết hợp với phƣơng pháp Western blot trong đề tài “Các phƣơng pháp chuẩn đoán thƣơng hàn thông dụng” với mục đích phân tách các thành phần protein kháng nguyên S. typhi. Năm 2007, Võ Công Thành và ctv (Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng trƣờng Đại học Cần Thơ) đã ứng dụng kỹ thuật điện di protein SDS-PAGE để cải thiện thành công phẩm chất nhiều giống lúa đặc sản đang bị thoái hóa của Đồng bằng sông Cửu Long. Trong chọn tạo giống lúa, kỹ thuật này giúp phát hiện nhanh những tính chất nổi bật nhƣ mùi thơm, protein, amylose để các nhà khoa học chọn lọc đƣợc những dòng, giống có phẩm chất tốt. Một số giống lúa đặc sản đƣợc cải thiện phẩm chất thành công và nhiều giống lúa triển vọng ra đời bằng kỹ thuật này. Năm 2007, Phạm Văn Phƣợng (Đại học Cần Thơ) đã ứng dụng kỹ thuật điện di SDS-PAGE protein để nghiên cứu đặc điểm di truyền và chọn giống lúa. Kỹ thuật điện di SDS-PAGE protein đã giúp nhà chọn giống sớm tuyển chọn chính xác những cá thể mong muốn ngay từ thế hệ đầu của các tổ hợp lai nên đã rút ngắn ½ thời gian tuyển chọn so với phƣơng pháp truyền thống. Kỹ thuật điện di SDS-PAGE protein giúp đánh giá đa dạng di truyền và phân biệt hai loài lúa hoang ở Đồng bằng 17 sông Cửu Long dựa vào mức độ ăn màu Coomassie của băng protein chỉ thị dạng basic glutelin. 2.4.2 Nghiên cứu ngoài nƣớc ứng dụng điện di protein Fan Shuguo (1999) ứng dụng điện di protein để đánh giá tính chịu mặn khác nhau của một số loại cây trồng. Nazrul Islam, M. Lonsdale, N. M. Upadhyaya, T. J. Higgins, H. Hirano và R. Akhurst (2004) đã thực hiện nghiên cứu đề tài ly trích protein từ lá lúa cho điện di hai chiều và ứng dụng nó trong phân tích hệ protein của lúa. Scott A. Young và ctv (1995) đã thực hiện nghiên cứu sự tích lũy peroxidase trong mạch gỗ của lúa trong suốt quá trình phản ứng không tƣơng thích với Xanthomonas oryzae pv oryzae. Họ bắt đầu chủng X. oryzae pv oryzae cho lúa khi lúa đƣợc 2 – 3 lá. Sau đó cắt lấy những mẫu lá khi đã chủng đƣợc 48 giờ, tiến hành ly trích protein của lá sau đó tiến hành điện di trên gel polyacrylamide trong điều kiện protein mẫu không bị biến tính (Discontinuous and nondenaturing). Chọn lấy băng protein có kích thƣớc tƣơng ứng với peroxidase (42 kD), tiếp tục tiến hành điện di SDS- PAGE và lai trên màng PVDF. Vạch protein sẽ đƣợc phát hiện trên màng nhờ nhuộm CBB. Sau đó rửa và thu mẫu để giải trình tự. 18 Chƣơng 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài Thời gian: Đề tài đƣợc thực hiện từ ngày 15 tháng 03 năm 2007 đến ngày 31 tháng 08 năm 2007. Bộ môn Bảo vệ Thực vật, Khoa Nông học, Đại học Nông Lâm Tp. HCM. Phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học Thực vật – Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Môi trƣờng – Trƣờng Đại học Nông Lâm Tp. HCM. 3.2 Hóa chất và vật liệu dùng trong thí nghiệm 3.2.1 Thuốc sinh học Chế phẩm sinh học sử dụng để xử lý cho lúa là thuốc sinh học trừ sâu rầy và virus có tên thƣơng hiệu là AMINO 15SL, đƣợc sản xuất tại công ty Hợp Danh Sinh học Nông nghiệp Sinh Thành. Thành phần gồm có polyamid + polyamin 15%, humic acid 5%. Liều lƣợng sử dụng theo hƣớng dẫn: pha 50 ml chế phẩm với 16 lít nƣớc phun cho 500 m2 cây trồng. Phun lần 2 sau lần thứ nhất 1 tuần. Công dụng theo nhà sản xuất đƣa ra: (i) ức chế men tiêu hóa của sâu rầy gây chết triệt để kể cả thành trùng của bƣớm, rầy cánh dài; (ii) kiềm hãm sự nhân bản của virus trong tế bào cây trồng; (iii) cung cấp chất dinh dƣỡng đặc hiệu cho cây trồng mau phục hồi, duy trì năng suất. 3.2.2 Hóa chất dùng trong ly trích protein Nitơ lỏng Dithiothreitol (Bio- Rad) Acetone (Merck) Sodium dodecyl sulfate (Merck) NaCl (Merck) 2- mercaptoethanol (Merck) Sodium phosphate (Merck) Ethanol (Merck) Sucrose (Merck) EDTA TE 1x Tris- HCl (Merck) 19 Amonium acetate (Merck) Methanol (Merck) 3.2.3 Hóa chất điện di Ammonium persulfate (Merck) Sodium Dodecyl Sulfate (Merck) Methanol (Merck) Tris- HCl (Merck) Axit acetic (Merck) Bromophenol blue (Merck) 2- mercaptoethanol (Merck) Dithiothreitol (Bio- Rad) Glycerol (Merck) Glycine (Merck) CBB R- 250 (Bio- Rad) TEMED (Bio- Rad) Acrylamide và N,N’-methylene-bis-acrylamide (Bio- Rad) 3.2.4 Trang thiết bị thí nghiệm Hộp nhựa Becher 50 ml Ống đong 100 ml Găng tay Máy hút và tủ cấy vô trùng (Anh Quốc) Chén sứ và chày (Đức) Eppendorf 0,2 ml; 1,5 ml Cân phân tích 4 số (Ohaus - Mỹ) Pipet các loại (Bio– Rad) Đầu típ các loại (Đức) Máy ly tâm lạnh (Hettich –Đức) Máy vortex Nồi hấp (Autoclave- Tomy) Máy đo pH Bộ nguồn điện di (Bio– Rad ) Bồn điện di đứng Mini-PROTEAN 3 Cell (Bio– Rad) Tủ lạnh 40C, tủ lạnh -200C và tủ lạnh -700C (Sanyo– Nhật) 3.3 Phƣơng pháp tiến hành nghiên cứu 3.3.1 Chuẩn bị mẫu và lấy mẫu lúa 3.3.1.1 Chuẩn bị mẫu lúa Hạt lúa đƣợc ngâm 36 giờ trong nƣớc. Ủ hạt ở nhiệt độ 30 – 350C, 9 giờ, trong tối. Khi hạt đã nứt nanh, chọn những hạt nứt nanh đều nhau, gieo trong các hộp nhựa (hình 3.1). Thí nghiệm đƣợc bố trí 3 lô, gồm 12 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức gồm 3 hộp và đƣợc đánh dấu nhƣ bảng 3.1. Sau khi gieo, tiếp tục ủ tối trong 6 giờ hoặc cho tới khi hạt lên mầm trắng dài 1 – 2 mm. Bắt đầu cung cấp ánh sáng, nƣớc, phân bón đầy đủ để cây mạ phát triển mạnh, khỏe đến giai đoạn 4 lá. 20 3.3.1.2 Xử lý thuốc và lấy mẫu lúa Khi cây mạ phát triển đến giai đoạn 4 lá, bắt đầu tiến hành xử lý thuốc sinh học kích kháng theo bố trí bảng 3.2. Lô I: Lô đối chứng, không xử lý thuốc sinh học kích kháng. Lô II: Xử lý nồng độ thuốc theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất. Lô III: Xử lý nồng độ thuốc gấp 2 lần so với hƣớng dẫn của nhà sản xuất. Bảng 3.1 Bảng bố trí phân lô thí nghiệm theo nghiệm thức Lô Nghiệm thức 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 I C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9 C10 C11 C12 II X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 X9 X10 X11 X12 III Y1 Y2 Y3 Y4 Y5 Y6 Y7 Y8 Y9 Y10 Y11 Y12 Chú thích: C: Mẫu đối chứng, X: Mẫu xử lý nồng độ thuốc theo hướng dẫn của nhà sản xuất, Y: Mẫu xử lý nồng độ thuốc gấp 2 lần so với hướng dẫn của nhà sản xuất Hình 3.1 Lúa mầm sau khi gieo trong hộp nhựa 2 ngày Lúa mầm 21 Bảng 3.2 Thời gian xử lý thuốc trƣớc khi lấy mẫu theo từng nghiệm thức 3.3.2 Ly trích protein tổng số từ lá lúa Trong nghiên cứu này chúng tôi đã thực hiện khảo sát 3 quy trình ly trích protein tổng số: quy trình có sử dụng SDS (Samuel S.M. Sun, 1994), quy trình có sử dụng phenol (Hurkman và Tanaka, 1986) và quy trình cải tiến. Sau khi ly trích tiến hành điện di các mẫu protein ly trích đƣợc để chọn ra quy trình tốt nhất ly trích tất cả mẫu lúa còn lại cho các thí nghiệm sau. 3.3.2.1 Các bƣớc ly trích protein theo quy trình có sử dụng SDS 1. Nghiền 0,2 g mẫu lá với 1 ml dung dịch ly trích (0,25 M NaCl, 1% SDS, 1% 2– mercaptoethanol, 0,05 M sodium phosphate pH 7,5) trong cối thành dịch. 2. Chuyển dịch nghiền vào một eppendorf 1,5 ml, và ly tâm với tốc độ 14.000 vòng/phút trong thời gian 10 phút ở nhiệt độ 200C. 3. Sử dụng pipette hút dịch nổi vào một eppendorf 1,5 ml mới; tránh hút lớp lipid ở trên cùng. 4. Ly tâm dịch nổi vừa hút với tốc độ 14.000 vòng/phút trong thời gian 10 phút ở nhiệt độ 200C. 5. Tiếp tục hút dịch nổi vào một eppendorf khác. 6. Thêm acetone 80%, ly tâm 5000 vòng/phút trong 5 phút ở 40C. Thu kết tủa, phơi khô và thêm vào eppendorf 100 l 1x TE, trữ ở nhiệt độ 40C tới khi dùng. 3.3.2.2 Các bƣớc ly trích protein theo quy trình có sử dụng phenol 1. Nghiền 0,5 g mẫu lá tƣơi trong nitơ lỏng bằng cối và chày thành bột mịn, cho vào eppendorf 1,5 ml. Nghiệm thức 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Thời gian xử lý thuốc trƣớc khi lấy mẫu 6 giờ 12 giờ 18 giờ 24 giờ 30 giờ 36 giờ 42 giờ 48 giờ 54 giờ 60 giờ 66 giờ 72 giờ 22 2. Thêm vào eppendorf chứa mẫu 0,5 ml Tris- phenol pH 8,8 và 0,5 ml dịch ly trích (0,1 M Tris-HCl pH 8,8, 10 mM EDTA, 0,4% 2– mercaptoethanol, 0,9 M sucrose). 3. Vortex đều hỗn hợp dung dịch trong eppendorf. (Lưu ý bước này nên thực hiện nhanh vì phenol có thể gây biến tính protein) 4. Ly tâm 5000 vòng/phút trong thời gian 10 phút ở nhiệt độ 40C. 5. Thu dịch nổi vào eppeendorf 1,5 ml khác, thêm vào 1 ml dịch ly trích. Vortex cho hỗn hợp đồng nhất. Ủ mẫu ở nhiệt độ -200C trong một giờ. Ly tâm 12.000 vòng/phút trong thời gian 10 phút ở nhệt độ 40C. 6. Hút dịch nổi vào eppendorf 1,5 ml khác. Thêm 1 ml 0,1 M amonium acetate trong methanol 100%. 7. Vortex và ủ mẫu ở nhiệt độ -200C trong 1 giờ hoặc qua đêm. Thu kết tủa bằng cách ly tâm 12.000 vòng/phút trong thời gian 20 phút ở nhiệt độ 40C. 8. Rửa kết tủa với 0,1 M amonium acetate trong methanol, tiếp tục rửa với acetone 80%, và cuối cùng là rửa với ethanol 70%. Mỗi lần rửa nhƣ vậy thì ủ mẫu ở -20 0C trong 15 phút. Sau đó đổ bỏ dịch và thu kết tủa. 9. Thêm acetone 80% chứa 10 mM DTT. Trữ -800C cho tới khi sử dụng. 3.3.2.3 Các bƣớc ly trích protein theo quy trình có sử dụng SDS cải tiến 1. Nghiền 0,5 g mẫu lá lúa trong nitơ lỏng thành bột mịn, cho vào eppendorf 1,5 ml. 2. Thêm 1ml dịch ly trích (0,5 M EDTA, 0,05 M sodium phosphate 1% SDS, 0,25 M NaCl , 1% 2- mercaptoethanol, 1 M Tris- HCl pH 8,0) vào eppendorf, vortex cho đồng nhất. Ủ mẫu ở nhiệt độ -200C trong một giờ. 3. Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 15 phút ở 40C. 4. Hút dịch nổi vào eppendorf khác. Thêm 400 µl ( acetone 80%, 0,2 M DTT), vortex hoặc lắc đều. Tủa protein ở nhiệt độ -200C trong một giờ hoặc qua đêm. 5. Ly tâm 13.000 vòng/phút trong thời gian 15 phút ở nhiệt độ 40C. 6. Đổ dịch trong. Thêm 100 µl 1x TE, ủ 370C trong 1 giờ. 7. Thêm 400 µl ethanol 70%. Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 5 phút ở 40C. 23 8. Đổ dịch trong, lặp lại tƣơng tự bƣớc 7. 9. Đổ dịch trong, phơi khô mẫu, sau đó pha mẫu với 100 µl 1x TE trữ mẫu ở nhiệt độ -700C đến khi sử dụng. 3.3.3 Điện di kiểm tra mẫu protein đã ly trích 3.3.3.1 Chuẩn bị hóa chất a) Hóa chất đổ gel  Pha gel phân tách (separating gel) có nồng độ 12%T Cho các thành phần sau theo thứ tự vào ống Falcon 15 ml sạch : 4 ml 30% Acrylamide/Bis (29:1), 2,5 ml Tris– HCl 1,5 M pH 8,8, 3,4 ml nƣớc cất 2 lần khử ion, 0,1 ml 10% SDS. Sau khi cho đầy đủ các thành phần trên theo đúng thể tích vào ống Falcon. Tiếp tục thêm vào ống Falcon 50 µl ammonium persulfate 10%, 10 µl TEMED và lắc nhẹ ống Falcon vài lần (tránh tạo bọt khí), dùng pipettte loại 100 – 1000 µl bơm từ từ dung dịch gel vào khuôn, đổ gel sao cho mức dung dịch gel cao hơn 7 cm (tránh tạo bọt khí trong khuôn gel). Sau đó, nhẹ nhàng đặt một lớp nƣớc cất lên trên lớp gel để mặt gel đƣợc phẳng. Chờ gel đông (khoảng 20 – 30 phút). Với 10 ml dung dịch gel có thể đổ đƣợc 2 gel 100 x 100 x 0,75 mm.  Pha gel gom (Stacking gel) có nồng độ 4%T Cho các thành phần sau theo thứ tự vào ống Falcon 15 ml khác: 1,3 ml Acrylamide/Bis (29:1) 30%, 2,5 ml Tris– HCl 0,5 M pH 6,8, 6,1 ml nƣớc cất 2 lần khử ion, 0,1 ml SDS 10%. Sau khi gel phân tách đã trùng ngƣng hoàn toàn, đổ hết nƣớc bên trên. Tiến hành đổ lớp gel gom bằng cách dùng pipette loại 100 – 1000 µl hút 2 ml dung dịch gel gom vào becher 50 ml, thêm vào dung dịch 10 µl ammonium persulfate 10%, 2 µl TEMED. Dùng pipette trộn đều và bơm vào khuôn gel. Đồng thời đƣa lƣợc vào gel để tạo các giếng mẫu (Lưu ý: tránh tạo bọt khí trong khuôn gel). Sau khi gel gom đã trùng ngƣng hoàn toàn, ta tiến hành tháo lƣợc ra khỏi khuôn gel cẩn thận tránh tạo bọt khí trong các giếng (Lưu ý: nếu có bọt khí trong giếng ta dùng pipette loại 100 – 1000 µl bơm khí mạnh vào giếng để làm vỡ bọt khí). Tiếp theo ta lắp dĩa gel vào bộ phận điện di, cho dung dịch điện di vào bồn. 24 b) Chuẩn bị dung dịch nạp mẫu (sample buffer) và dung dịch đệm điện di (electrode buffer) Pha dịch nạp mẫu gồm: 3,55 ml nƣớc cất 2 lần khử ion; 1,25 ml Tris-HCl 0,5 M pH 6,8; 2,5 ml glycerol; 2 ml SDS 10% (w/v); 0,2 ml bromophenol blue 0,5%(w/v). Khi dùng thêm vào 50 µl 2- Mercaptoethanol hoặc 0,5 ml dithiothreitol 2 M (DTT). Dung dịch đệm điện di là Tris– glycine, pH 8,3. Pha 1l Tris– glycine (196mM glycine, 0,1% SDS, 50 mM Tris– HCl pH 8,3). c) Chuẩn bị dung dịch nhuộm và dung dịch giải nhuộm  Dung dịch nhuộm Coomassie Brilliant Blue R- 250 Pha hỗn hợp theo tỉ lệ nhƣ sau vào một hộp nhựa có nắp: 0,2% Coomassie Brilliant Blue R- 250 (w/v), 45% methanol (v/v), 45% nƣớc cất hai lần khử ion (v/v), 10% acid acetic (v/v). Đậy kín lại và giữ trong tối đến khi sử dụng.  Dung dịch giải nhuộm Pha hỗn hợp sau theo đúng tỉ lệ vào một hộp nhựa khác: 25% methanol (v/v), 65% nƣớc cất hai lần khử ion (v/v), 10% acid acetic (v/v). Đậy kín, giữ trong tối đến khi sử dụng. 3.3.3.2 Chuẩn bị mẫu và chạy điện di Dùng pipette loại 0,5 – 10 µl hút 3 µl dung dịch nạp mẫu và 7 µl mẫu protein vào một eppendorf 0,2 ml sạch, trộn đều, đậy nắp và gia nhiệt ở 950C từ 3 – 5 phút gây biến tính protein. Sau khi gia nhiệt có thể ly tâm 10.000 vòng/phút trong 3 phút. 3.3.3.3 Tiến hành điện di và xem kết quả 1. Dùng pipette loại 0,5 – 10 µl nạp mẫu vào các giếng (10 µl/giếng). 2. Tiến hành chạy điện di ở hiệu điện thế 100 V, cƣờng độ dòng điện 15 mA, trong thời gian 120 phút hoặc điện di cho tới khi vạch màu của dịch nạp mẫu cách đáy gel khoảng 0,5 – 1cm. 3. Sau khi điện di, tháo gel ra khỏi khuôn, rửa sạch gel bằng nƣớc 5 phút (cẩn thận tránh làm đứt gel). Nhuộm gel trong thời gian 30 – 45 phút. 4. Sau khi nhuộm xong, rửa gel với nƣớc 5 phút. Tiến hành giải nhuộm bằng cách ngâm gel trong dung dịch giải nhuộm cho đến khi nền gel trở nên trong suốt 25 không màu. Sau khi giải nhuộm xong, protein đƣợc phát hiện nhờ các vạch màu xanh lam trên nền gel trong suốt. 3.3.4 Thí nghiệm khảo sát chọn điều kiện điện di Điều kiện điện di ảnh hƣởng lớn đến kết quả điện di. Nếu điều kiện điện di không phù hợp với protein thì rất có thể sẽ làm các băng protein bị cong, hoặc các protein bị biến tính do sự hoạt động trở lại của các enzyme. Đồng thời nó cũng có thể làm cho các băng protein không phân tách rõ ràng. Trong thí nghiệm này chúng tôi tiến hành khảo sát điều kiện điện di cho phù hợp với protein của lá lúa nhằm chọn ra điều kiện điện di thích hợp. Bố trí 3 thí nghiệm khác nhau (bảng 3.3) Bảng 3.3 Thí nghiệm khảo sát điều kiện điện di Thí nghiệm Điều kiện điện di Gel gom Gel phân tách 1 200 V, 13 mA, 20 phút 200 V, 18 mA, 100 phút 2 100 V, 20 mA, 10 phút 100 V, 20 mA, 80 phút 3 100 V, 15 mA, 20 phút 100 V, 15 mA, 100 phút Mẫu sử dụng trong thí nghiệm này là mẫu protein ly trích theo quy trình tốt nhất trong 3 quy tình khảo sát. Chỉ tiêu theo dõi: hình dạng các băng protein và sự phân tách của các băng trên gel. 3.3.5 Khảo sát nồng độ gel Nồng độ gel ảnh hƣởng rất lớn đến độ phân tách của các băng protein trên gel. Vì nếu nồng độ gel càng cao thì kích thƣớc lỗ gel càng nhỏ lại và sẽ cản trở sự di chuyển của của các protein có kích thƣớc càng lớn. Nói cách khác là với mỗi một nồng độ gel thì cho phép phân tách protein ở một khoảng trọng lƣợng phân tử xác định. Để thấy đƣợc một cách rõ ràng các băng protein của lúa trên gel, cần khảo sát nồng độ của gel phân tách cho phù hợp với protein tổng số đƣợc ly trích từ lá lúa. Phải lựa chọn nồng độ gel sao cho các băng protein trên gel đƣợc phân tách rõ ràng. 26 Tiến hành thử nghiệm bằng cách đổ các miếng gel có nồng độ gel phân tách khác nhau và thử nghiệm trên các mẫu protein. Nồng độ của gel gom đƣợc giữ nguyên là 4% T, nồng độ của gel phân tách đƣợc thay đổi 12% T, 13% T, 14% T. Ta tiến hành chạy điện di cùng điều kiện với hiệu điện thế ổn định ở 100 V, cƣờng độ dòng điện 15 mA, thời gian điện di là 120 phút, nhuộm gel trong 0,2% CBB (w/v) ở nhiệt độ phòng 250C. 3.3.6 Điện di các mẫu protein để kiểm tra phản ứng của cây lúa đối với thuốc sinh học kích kháng Thí nghiệm 1: Tiến hành điện di tất cả các mẫu protein ly trích đƣợc từ tất cả các mẫu lúa và so sánh qua lại giữa 12 nghiệm thức mẫu protein của lúa. Cách tiến hành 1. Chuẩn bị đổ 6 miếng gel có nồng độ gel phân tách là 12%, nồng độ gel gom là 4%. Chuẩn bị sẵn tất cả các mẫu protein đã ly trích của 12 nghiệm thức. 2. Dùng micropipette nạp mẫu vào các giếng với tỉ lệ 3 l dịch nạp mẫu và 7 l mẫu. Trƣớc khi nạp mẫu vào giếng, hỗn hợp mẫu và dịch nạp mẫu đƣợc gia nhiệt ở 95 0 C trong thời gian 5 phút. 3. Tiến hành điện di tất cả các miếng gel ở hiệu điện thế 100 V, cƣờng độ dòng điện 15 mA, thời gian 120 phút. 4. Sau khi điện di xong, cẩn thận lấy các gel ra khỏi khuôn. Nhuộm gel trong dung dịch nhuộm CBB 0,2% (w/v) trong thời gian 30 phút. Sau khi nhuộm xong, cẩn thận lấy gel ra, rửa sạch gel bằng nƣớc và ngâm gel trong dung dịch giải nhuộm cho đến khi xuất hiện các băng protein trên gel hay cho tới khi nền gel trở nên trong suốt. Nếu có protein trong mẫu thì sẽ xuất hiện các băng màu lam trên gel. Thí nghiệm 2: Điện di kiểm tra kết quả của mẫu protein đƣợc ly trích từ lô II. Thực hiện điện di 2 miếng gel theo điều kiện giống thí nghiệm 1. Gel 1: nạp các mẫu từ X1 – X9 hình 4.11. Gel 2: nạp các mẫu từ X4 – X12 hình 4.12. Thí nghiệm 3: Điện di kiểm tra kết quả của mẫu protein đƣợc ly trích từ lô III. Tiến hành nhƣ thí nghiệm 2 đối với các mẫu Y1 – Y12. 27 Chƣơng 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết quả thử nghiệm các quy trình ly trích protein Giai đoạn tách chiết protein tổng số là một giai đoạn tuy dễ thực hiện nhƣng không phải là đơn giản. Giai đoạn này rất quan trọng vì nó là yếu tố hàng đầu quyết định sự thành công của thí nghiệm. Có nhiều phƣơng pháp ly trích protein khác nhau nhƣng mục đích cuối cùng của các phƣơng pháp là làm sao thu đƣợc lƣợng protein có độ tinh khiết cao phục vụ cho nghiên cứu. Muốn vậy, ngoài việc có đƣợc một phƣơng pháp ly trích thì kinh nghiệm trong thao tác cũng đóng vai trò quan trọng. Việc tách chiết phải đảm bảo sao cho protein không bị biến tính, đứt gãy hoặc thất thoát. Tiến hành khảo sát các quy trình ly trích để chọn ra quy trình tối ƣu trong việc ly trích protein tổng số từ lá lúa. Đối với quy trình có sử dụng SDS tiến hành ly trích thử nghiệm 6 mẫu lúa. Kết quả (hình 4.1a) cho thấy, mẫu protein ly trích đƣợc sau khi tiến hành điện di SDS- PAGE cho ít băng protein, và các băng protein rất mờ. Điều này có thể do các mẫu protein tổng số ly trích đƣợc theo quy trình này còn lẫn nhiều tạp lipid, polysaccharide nên khi điện di các băng không phân tách đƣợc rõ ràng. Hoặc do protein bị biến tính trong quá trình ly trích, đặc biệt là khi bảo quản mẫu ở 40C các protein là enzyme có thể sẽ hoạt động đƣợc trong nhiệt độ này và phân hủy các protein trong mẫu. Quá trình nghiền mẫu lúa với dịch ly trích nên thực hiện nhanh, vì trong dịch ly trích có 2- mercaptoethanol có khả năng cắt đứt cầu nối (S – S) trong protein và làm protein biến tính. Khi protein biến tính nếu tiếp tục nghiền có khả năng sẽ làm đứt gãy protein. Bƣớc tủa protein nên thực hiện ở nhiệt độ âm sâu sẽ giúp tủa tối đa protein và làm giảm tối thiểu lƣợng protein bị biến tính do chính enzyme nội bào gây ra. Các muối giúp hòa tan protein trong dung dịch cần đƣợc giữ ở pH 8.0, vì ở pH này protein ổn định. 28 Để khảo sát quy trình ly trích có sử dụng phenol, tiến hành ly trích thử nghiệm 6 mẫu lúa. Tất cả 6 mẫu đƣợc ly trích trong quy trình này đều cho kết quả không tốt (hình 4.1b). Mỗi mẫu chỉ cho từ 2 – 4 băng protein trên gel, các băng không phân tách rõ. Để giải thích cho kết quả này chúng tôi cho rằng là do phenol có khả năng phá hủy hợp chất polysaccharide và nó cũng có khả năng phá hủy cả protein. Khi thực hiện bƣớc này nên tiến hành nhanh, tránh đến mức tối đa sự phân hủy protein do phenol gây ra. Trong quy trình này có một số ƣu điểm: (i) EDTA đƣợc sử dụng trong dịch ly trích với mục đích khá quan trọng là ngăn cản sự hoạt động của các emzyme nội bào bằng cách tham gia gắn các ion Mg++, Ca++. Vì các enzyme nội bào muốn hoạt động mạnh phải gắn với các cation hóa trị II đặc biệt là với Mg++. (ii) Amonium acetate đƣợc sử dụng trong bƣớc tủa protein với mục đích là đệm làm tăng khả năng tủa protein. Sau khi tiến hành thử nghiệm 2 quy trình ly trích trên, mẫu protein thu đƣợc trong 2 quy trình không tốt và không đủ điều kiện tiến hành điện di. Do đó, sau khi Hình 4.1 Kết quả điện di SDS– PAGE mẫu protein ly trích của các quy trình (a) Mẫu protein được ly trích theo quy trình 1 (b) Mẫu protein được ly trích theo quy trình 2 (c) Mẫu protein được ly trích theo quy trình 3 (a) (b) (c) 29 rút ra một số kinh nghiệm chúng tôi đã thí nghiệm cải tiến quy trình có sử dụng SDS để ly trích 6 mẫu lúa. Kết quả ly trích 6 mẫu đạt đƣợc là khá tốt (hình 4.1c). Mẫu protein sau khi điện di SDS- PAGE có sự phân tách các băng khá rõ ràng, ít bị tạp (smear rất mờ). Kết quả tốt đạt đƣợc ở trong quy trình này so với 2 quy trình trƣớc là tổng hợp của nhiều yếu tố: (i) khi nghiền mẫu với nitơ lỏng các mô sẽ mềm hơn và các tế bào dễ dàng tách rời nhau hơn; khi đó với tác động của 2- mercaptoethanol màng tế bào sẽ bị phá vỡ và phóng thích protein; (ii) việc sử dụng EDTA trong quy trình đã ngăn cản các enzyme nội bào hoạt động trong dịch ly trích. (iii) các muối trong dịch ly trích kết hợp với Tris- HCl ở pH 8,0 đã giữ ổn định protein hòa tan trong dung dịch; (iv) khi tủa protein bằng acetone ở -200C sẽ ngăn cản những enzyme nội bào hoạt động. Từ kết quả ly trích của quy trình cải tiến, nhận thấy mẫu protein đƣợc ly trích theo quy trình này đủ điều kiện để tiến hành điện di. Thực hiện ly trích tất cả mẫu lúa còn lại theo quy trình này để làm thí nghiệm. Sau đây là một số điểm cần lƣu ý khi tiến hành ly trích protein tổng số lá lúa chúng tôi rút ra từ thực nghiệm: 1. Dụng cụ cần khử trùng cẩn thận phòng ngừa tạp nhiễm. 2. Mang bao tay để bảo vệ và khử trùng bằng cồn 70% cẩn thận tránh tạp nhiễm. 3. Mẫu sau khi lấy ra khỏi tủ -200C phải đƣợc cắt và ngâm ngay trong nitơ lỏng. 4. Thao tác nhẹ nhàng khi nghiền mẫu lá lúa thật nhuyễn thành bột mịn. 5. Bƣớc tủa protein trong acetone nên thực hiện ở nhiệt độ âm sâu. 6. Nếu có sử dụng phenol trong ly trích thì nên thao tác nhanh, tránh sự phân hủy protein 7. Khi trữ mẫu nên trữ ở nhiệt độ dƣới -700C. Nhƣng tốt nhất là sử dụng ngay sau khi ly trích. 4.2 Kết quả thí nghiệm khảo sát chọn điều kiện điện di Kết quả điện di ở điều kiện thí nghiệm 1 (hình 4.2a) cho thấy các băng protein bị cong, méo. Hiện tƣợng này có thể là do thời gian điện di lâu 120 phút trong hiệu điện thế 200 V làm nhiệt độ môi trƣờng điện di tăng. Do đó chúng tôi tiến hành thí nghiệm 2 tăng Ampe lên 20 mA và giảm hiệu điện thế xuống còn 100 V. Kết quả 30 đạt đƣợc trong thí nghiệm này là sự phân tách các băng protein không rõ ràng, điều này là do quá trình điện di xảy ra nhanh các băng protein chƣa thể phân tách. Rút kinh nghiệm từ 2 thí nghiệm trên chúng tôi tiến hành thí nghiệm 3. Trong thí nghiệm này chúng tôi tiến hành giảm Ampe xuống còn 15 mA và vẫn giữ hiệu điện thế là 100 V. Kết quả (hình 4.2c) cho thấy các băng protein phân tách rõ ràng và không bị cong, méo. Từ kết quả đó chúng lựa chọn điều kiện điện di theo thí nghiệm 3 để tiến hành các thí nghiệm sau. 4.3 Kết quả thí nghiệm khảo sát chọn nồng độ gel Các miếng gel đƣợc chạy điện di với hiệu điện thế ổn định ở 100V, 15mA, trong thời gian 120 phút. Kết quả điện di (hình 4.3) cho thấy mức độ phân tách các mẫu protein trên gel 12% T, 13% T, 14% T là khá giống nhau . Thể hiện rõ ở mẫu Y6, Y7 và Y8 ở trên gel 13% T và trên gel 12% T đƣợc phân tách rõ . Mẫu protein Y5 ở gel 13% T chỉ thấy rất ít băng có thể không phải do ảnh hƣởng của nồng độ gel. Hiện tƣợng đó có thể là do protein trong mẫu ít (ít hơn 0,1 µg) không đủ để ăn màu Coomassie Brilliant Blue. Hàm lƣợng protein ít có thể là do quá trình bảo quản mẫu không tốt, ly trích mẫu không đạt hoặc do khi gia nhiệt biến tính trƣớc khi nạp (a) (b) (c) Hình 4.2 Kết quả khảo sát điều kiện điện di phù hợp với protein lá lúa (a) Kết quả điện di với điều kiện thí nghiệm 1 (b) Kết quả điện di với điều kiện thí nghiệm 2 (c) Kết quả điện di với điều kiện thí nghiệm 3 31 mẫu protein đã bi đứt gãy. Những mẫu Y6, Y8 ở gel 12% T và X4, X5 ở gel 14% T ăn màu CBB đậm có thể do hàm lƣợng protein trong mẫu nhiều hơn 1 µg. Ngoài ra ta còn thấy ở nồng độ gel 14% T, khoảng cách phân tách giữa các băng hẹp hơn so với khoảng cách phân tách giữa các băng của gel 13% T, và khoảng cách đó đối với gel 12% T là rộng nhất. Nhƣ vậy, ở điều kiện hiệu điện thế ổn định và cƣờng độ dòng điện không đổi, nếu nồng độ gel càng cao thì khoảng thời gian chạy điện di phải càng nhiều, sự phân tách các băng protein tốt hơn và rõ hơn. Từ kết quả trên chứng tỏ nồng độ gel từ 12% T – 14% T không ảnh hƣởng nhiều đến kết quả điện di. Do đó chúng tôi quyết định sử dụng gel 12% T để tiến hành điện di cho các thí nghiệm sau nhằm tiết kiệm kinh phí. a) b) c) Hình 4.3 Kết quả điện di SDS– PAGE các mẫu protein khảo sát nồng độ gel a) Là hình điện di protein lá lúa trên gel có nồng độ 12% T b) Là hình điện di protein lá lúa trên gel có nồng độ 13% T c) Là hình điện di protein lá lúa trên gel có nồng độ 14% T 32 4.4 Đánh giá phản ứng của lúa đối với thuốc sinh học 4.4.1 Kết quả điện di của tất cả các mẫu protein trong 12 nghiệm thức Hình 4.4 Kết quả điện di so sánh mẫu protein của 6 nghiệm thức (nghiệm thức 1, 2, 3, 4, 5 và 6) Hình 4.5 Kết quả điện di so sánh mẫu protein của 6 nghiệm thức (nghiệm thức 4, 5, 6, 7, 10 và 11) Hình 4.6 Kết quả điện di so sánh mẫu protein của 5 nghiệm thức (nghiệm thức 5, 8, 9, 10 và 12) 33 Từ kết quả điện di SDS- PAGE tất cả các mẫu protein trong 12 nghiệm thức (hình 4.4, hình 4.5, hình 4.6) so sánh các hình chúng tôi nhận thấy rằng tất cả các mẫu protein đều cho một dải băng đồng hình. Không có sự khác biệt nào về các dải băng đồng hình đó. Có thể là do thuốc chƣa kịp tác động lên sự sinh trƣởng và phát triển của cây lúa do thời gian tác đông còn ít (sau 72 giờ), hoặc do thời điểm xử lý thuốc còn sớm (giai đoạn lúa 4 lá) nên hệ protein của lúa có thể chƣa có sự biến đổi. Ngoài ra có thể với điều kiện trồng lúa dƣới ánh sáng đèn neon, và ở trong phòng sẽ gây ra một số hạn chế về sinh trƣởng và phát triển dẫn đến lúa không thể hấp thu đƣợc thuốc. Cũng không loại trừ khả năng phƣơng pháp SDS- PAGE chƣa đủ nhạy để phát hiện sự khác biệt. 4.4.2 Kết quả điện di mẫu protein của lúa ở lô II Tiến hành điện di 12 mẫu protein của lô 2, kết quả (hình 4.7) không tìm thấy sự khác biệt về băng protein giữa các mẫu protein của lúa đƣợc xử lý thuốc theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất. Các mẫu protein ly trích đƣợc trong lô lúa này cho kết quả là một dải băng protein đồng hình. Điều này xảy ra có thể là do thời gian tác dụng thuốc không đủ, lúa chƣa kịp phản ứng với thuốc nên hệ protein của lúa chƣa có thay đổi đáng kể. Tuy nhiên nếu có xảy ra sự thay đổi nhỏ trong hệ protein của lúa thì cũng rất khó để phát hiện: có thể lƣợng protein khác biệt quan tâm trong quá trình ly trích không nhận đƣợc, hoặc lƣợng protein đó quá ít không thể phát hiện bằng nhuộm CBB. Ngoài ra không loại trừ khả năng với phƣơng pháp SDS- PAGE thì chƣa đủ nhạy để phát hiện sự khác biệt. Hình 4.7 Kết quả điện di SDS– PAGE mẫu protein ly trích từ lô II Thực hiện điện di ở nồng độ gel 12% T, hiệu điện thế ổn định ở 100V cường độ dòng điện 15 mA, thời gian điện di 120 phút. 34 4.4.3 Kết quả điện di mẫu protein của lúa ở lô III Kết quả thu đƣợc trong hình 4.8 cũng không cho sự khác biệt nào dù trong thí nghiệm này ta đã tác dụng thuốc với liều lƣợng gấp đôi so với hƣớng dẫn của nhà sản xuất. Từ kết quả này ta có thể giải thích rằng thời gian tác dụng thuốc chƣa đủ ảnh hƣởng lên sinh lý của cây mạ. Do thời gian ta tác dụng thuốc và lấy mẫu còn ngắn, chỉ trong vòng 72 giờ đồng hồ. Ngoài ra với điều kiện trồng lúa trong phòng nhƣ vậy thì khả năng hấp thụ thuốc càng khó xảy ra nhanh chóng do sinh lý của cây không bình thƣờng. Hình 3.8 Kết quả điện di SDS– PAGE mẫu protein ly trích từ lô III Thực hiện điện di ở nồng độ gel 12% T, hiệu điện thế ổn định ở 100V cường độ dòng điện 15 mA, thời gian điện di 120 phút. 4 Thực hiện điện di ở nồng độ gel 12% T, hiệu điện thế ổn định ở 100V, cường độ dòng điện 15 mA, thời gian điện di 120 phút. 35 Chƣơng 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Trong đề tài này chúng tôi đã hoàn thành đƣợc một số nội dung: 1. Thiết lập đƣợc quy trình ly trích protein trên lá lúa. 2. Thiết lập đƣợc phƣơng pháp điện di SDS- PAGE trên mẫu protein lá lúa. 3. Ở điều kiện trồng lúa trong phòng với ánh sáng đèn neon, khi xử lý thuốc sinh học AMINO 15SL lên lúa trong thời gian từ 6 – 72 giờ thì chƣa tìm thấy sự khác biệt nào về protein tổng số khi phân tích bằng kỹ thuật SDS- PAGE. 5.2 Đề nghị 1. Tiếp tục thử nghiệm chế phẩm sinh học đó nhƣng tăng thời gian tác dụng thuốc và tăng liều lƣợng thuốc 2. Mở rộng thử nghiệm thuốc khi lúa đƣợc trồng trong nhà lƣới và trên điều kiện thí nghiệm ngoài đồng ruộng để khẳng định rõ hiệu quả của thuốc. 3. Tiếp tục nghiên cứu hệ protein của cây lúa bằng các phƣơng pháp phân tích proteomics khác nhƣ điện di 2 chiều, sắc kí. 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT 1. Biện Tuấn An, 2006. Khảo sát hệ vi khuẩn methylobacterium sp. trên lúa (oryza sativa L.) ở Tây Ninh. Khóa luận tốt nghiệp Kỹ sƣ Công nghệ Sinh học, Đại học Nông Lâm, TP. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 2. Bùi Huy Đáp, 1999. Một số vấn đề về cây lúa, NXB Nông Nghiệp. 3. Chu Lý Hải Anh, 2006. Khảo sát ảnh hưởng của vi khuẩn methylobacterium sp. lên sự phát sinh cơ quan ở cây lúa (ozyra sativa L.) nuôi cấy in vitro. Khóa luận tốt nghiệp Kỹ sƣ Công nghệ Sinh học, Đại học Nông Lâm, TP. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 4. Lê Minh Triết, 2003. Bài Giảng Môn Học Cây Lúa. Khoa Nông Học, Đại Học Nông Lâm, TP. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 5. Nguyễn Thị Lang, 2002. Phương Pháp Cơ Bản Trong Nghiên Cứu Công Nghệ Sinh Học. Nhà xuất bản Nông Nghiệp TP. Hồ Chí Minh. 6. Nguyễn Tiến Thắng, 2004. Tài liệu hướng dẫn thực tập: Công Nghệ Enzyme và Protein. Viện Sinh Học Nhiệt Đới, TP. Hồ Chí Minh. 7. Võ Tòng Xuân, Trần Thanh Bé, Nguyễn Ngọc Đệ, Dƣơng Ngọc Thành và Đỗ Văn Xê, 1986. Trồng lúa năng suất cao. Nhà xuất bản Thành phố Hồ Chí Minh, Hồ Chí Minh. 83 trang. TIẾNG NƢỚC NGOÀI 8. Allen R. C., Saravis C. A. and Maurer H. R., 1984. Gel electrophoresis and Isoelectrics Focusing of protein: Selected Techniques. De Gruyter, Berlin. 9. Davis B. J., 1964. Disc electrophoresis. II. Method and appication to human serum proteins. Ann. N. Y. Acad. Sci. 121, 404 – 427. 10. David E. Garfin, Jay A. Glasel and Murray P. Deutscher, 1995. Introduction to Biophysical Methods for Protein and Nucleic Acid Research. Electrophoretic Method. pp. 53 – 109. 37 11. Department of health and ageing office of the gene technology regulator, 2005. The biology and ecology of rice (O. sativa) in Australia. 12. Hurkman and Tanaka, 1986. “Phenol extraction followed by methanolic ammonium acetate precipitation – an effective protocol for sample preparation from protein-poor, recalcitrant tissues such as plants”. Plant Physiology, Vol. 81, pp. 802-806. 13. IRRI, 2002. IRRI rice almanac, Third edition, Manila, Philippine, IRRI. p. 253. 14. Laemmli U. K., 1970. Cleavage of structural proteins during the asembly of the head of bacterio- phage T4. Nature. London. 227, 680 – 685. 15. Nazrul Islam, Lonsdale M., Upadhyaya N.M., Higgins T. J., Hirano H. and Akhurst R., 2004. Protein extraction from mature rice leaves for two- dimensional gel electrophoresis and its application in proteome analysis. Proteomics, Vol. 4, pp. 1903-1908. 16. Ornstein L., 1964. Disc electrophoresis. I . Background and theory. Ann. N. Y. Acad. Sci. 121, 321 – 349. 17. Sambrook and Russell. Molecular cloning-A laboratory manual. Volume 2, 3 rd edition, 2001. Cold spring harbor laboratory press, New York. 18. Samuel S.M.Sun, 1994. Methods in plant molecular biology and agricultural biotechnology: a laboratory training manual. Asian Vegetable Research and Development Center. Shanhua, Tainan, Taiwan (ROC). 94 p. 19. Scott A. Young, Ailan Cuo, James A. Cuikema, Frank F. White, và Jan E. Leach, 1995. Department of Plant Pathology, Throckmorton Hall (S.A.Y., F.F.W., J.E.L.), and Division of Biological Sciences (J.A.G.), Kansas State University, Manhattan, Kansas 66506-5502; and Waksman Institute, Rutgers University, Piscataway, New Jersey 08855 (A.G.) 20. Woolley P., 1987. Thermal instability of electrophoresis gel. Electrophoresis 8, 339 – 345. PHỤ LỤC Phụ lục 1: Bảng pha gel theo các nồng độ khác nhau * Đệm gel phân tách: 1,5 M Tris-HCl, pH 8,8 Đệm gel gom: 0,5 M Tris-HCL, pH 6,8 Phụ lục 2: Khoảng phân tách protein theo nồng độ gel polyacrylamide Acrylamide (%) Khoảng phân tách protein (kDa) 15 12 – 43 10 16 – 68 7,5 36 – 94 5,0 57 – 212 Phần trăm gel Nƣớc khử ion 30% acrylamide/ bis (29:1) *Đệm điện di 10% w/v SDS (ml) (ml) (ml) (ml) 4% 6.1 1.3 2.5 0.1 5% 5.7 1.7 2.5 0.1 6% 5.4 2.0 2.5 0.1 7% 5.1 2.3 2.5 0.1 8% 4.7 2.7 2.5 0.1 9% 4.4 3.0 2.5 0.1 10% 4.1 3.3 2.5 0.1 11% 3.7 3.7 2.5 0.1 12% 3.4 4.0 2.5 0.1 13% 3.1 4.3 2.5 0.1 14% 2.7 4.7 2.5 0.1 15% 2.4 5.0 2.5 0.1 16% 2.1 5.3 2.5 0.1 17% 1.7 5.7 2.5 0.1