Khóa luận Thử nghiệm khả năng ứng dụng Enzyme protease từ nội tạng tôm trong sản xuất Chitin

iệt quan tâm với Chitin và polisaccharide từ vỏ tôm thải bỏ và hƣớng hoạt động chính vào các thị trƣờng xuất khẩu. 22 Theo tiến sĩ Arisol Alimuniar - giám đốc kỹ thuật, ông hy vọng sản xuất khoảng 150-180 triệu sản phẩm Chitin-Chitosan /năm góp phần cùng các nƣớc sản xuất chính khác nhƣ Nhật Bản, Mỹ, Na Uy, Canada và Nga. Giá cả của các loại sản phẩm Chitin-Chitosan biến động từ 30 USD đến 400 USD/kg tuỳ thuộc vào chất lƣợng sản phẩm, lƣợng bán Chitin và Chitosan đạt khoảng 2 tỷ USD. (Nguyễn Đổng, 1994) Nhiều nƣớc nhƣ Nhật, Mỹ, Anh, Hội Chitin thuộc cộng đồng Châu Âu “ECCHIS” đã và đang nghiên cứu một cách có hệ thống và đề cập nhiều nội dung khoa học trong đó có việc ứng dụng Chitin nhƣ một chất hấp phụ trao đổi ion để tinh chế nƣớc giải khát. Hiện nay, có khoảng 10 công ty lớn, hầu hết ở Nhật, sản xuất Chitin – chitosan trên thế giới. Công ty Protan biopolymer, một trong những công ty lớn trên thế giới sản xuất Chitin – Chitosan đã nghiên cứu ra nhiều sản phẩm có nguồn gốc Chitin sử dụng để xử lý nƣớc, khử các ion kim loại độc, bọc hạt và nhiều ứng dụng khác trong nông nghiệp. Ngày nay, ngƣời ta tập trung vào các dẫn xuất của Chitin và khả năng ứng dụng của những dẫn xuất này. Toàn bộ quá trình hoạt động khoa học của R.A.A. Muzzarelli (Đại Học Y Khoa Ancona – Ý) tập trung vào Chitin và dẫn xuất của nó. Cho đến nay, trên thế giới đã có nhiều quy trình sản xuất Chitin – Chitosan, với nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau, nhƣng chủ yếu là vỏ tôm, cua, ghẹ. 2.3.5.2. Tình hình nghiên cứu Chitin ở Việt Nam Việc nghiên cứu, sản xuất Chitin – Chitosan và các ứng dụng của chúng trong sản xuất, phục vụ đời sống là một vấn đề tƣơng đối mới ở nƣớc ta. Năm 1978, trƣờng Đại Học Thủy Sản bắt đầu nghiên cứu chiết tách Chitin – Chitosan. Trƣớc yêu cầu xử lý phế liệu thủy sản ngày càng cấp bách, trƣớc những thông tin khoa học, kỹ thuật mới về Chitin – Chitosan, cũng nhƣ tiềm năng thị trƣờng của chúng, đã thúc đẩy các nhà khoa học nƣớc ta bắt tay vào nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất Chitin – Chitosan ở bƣớc cao hơn, đồng thời nghiên cứu các ứng dụng của chúng ở các lĩnh vức khác nhau. Gần đây, khi Chitin – Chitosan trở thành nhu cầu trong nhiều ngành công nghiệp và có gía trị thì rất nhiều cơ quan nghiên cứu nhƣ: trƣờng Đại Học Nông Lâm TP. 23 HCM, Đại Học Tổng Hợp TP. HCM, Đại Học Thủy Sản, Đại Học Cần Thơ,… đã tập trung vào nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng công nghệ này. Tuy nhiên, chất lƣợng sản xuất và những ứng dụng của nó chƣa đƣợc đánh giá đầy đủ. Ở phía Bắc, Viện Khoa Học Việt Nam đã kết hợp với Xí Nghiệp Thủy Đặc Sản Hà Nội sản xuất Chitosan và ứng dụng trong lĩnh vực nông nghiệp và có hiệu quả bƣớc đầu. Ở phía Nam, Trung Tâm Công Nghệ và Sinh Học Thủy Sản phối hợp với một số cơ quan khác nhƣ: Đại Học Y Dƣợc TP. HCM, Phân Viện Khoa Học Việt Nam, Viện Khoa Học Nông Nghiệp Miền Nam đã và đang nghiêu cứu, sản xuất và ứng dụng Chitin – Chitosan trong các lĩnh vực: nông nghiệp, y dƣợc và mỹ phẩm. 2.3.6. Các phƣơng pháp chiết tách Chitin Sơ đồ chung cho quá trình sản xuất Chitin Nguyên liệu Khử khoáng Khử protein Tẩy màu Chitin Nguyên liệu dùng trong sản xuất Chitin có thể sử dụng vỏ tôm, cua, ghẹ, nang mực,… Nguyên liệu có thể sử dụng nguyên liệu khô hoặc tƣơi. Tuy nhiên, việc sử dụng nguyên liệu khác nhau sẽ xử lý ở chế độ khác nhau. Chitin đã đƣợc tách chiết từ vỏ tôm từ hơn một thế kỉ nay, nhƣng cho đến nay việc tách chiết này vẫn đƣợc thực hiện bằng phƣơng pháp hóa học là chính. 2.3.6.1. Phƣơng pháp hóa học Quy tắc chung: loại bỏ tạp chất (protein, khoáng, lipid) từ vỏ tôm. Ưu điểm: nhanh, dễ thực hiện Nhược điểm: - Tốn nhiều hóa chất - Gây ô nhiễm môi trƣờng - Ảnh hƣởng đến sức khỏe ngƣời lao động 24 - Chất lƣợng sản phẩm lại không cao. Chế phẩm Chitin nhận đƣợc thƣờng có màu vàng do tác động của các hóa chất đƣợc sử dụng trong quy trình tách chiết (đều ở nồng độ cao). Bên cạnh đó, trong phƣơng pháp này, quá trình khử protein đƣợc thực hiện bằng NaOH: + NaOH ảnh hƣởng đến độ nhớt của Chitosan, cụ thể hơn là NaOH cắt mạch polysaccharide của Chitin, làm giảm độ nhớt của Chitosan xảy ra trong quá trình deacetyl hoá. + Dịch thủy phân protein sẽ loại bỏ do lẫn kiềm đồng thời acid amin của thủy phân không còn giá trị đích thực của chúng. Phƣơng pháp của Heckman Vỏ tôm tƣơi Rửa sạch Sấy khô ở 1000C Nghiền thành bột Ngâm trong HCl 2N trong 48 giờ (có lắc hoặc khuấy liên tục) Ly tâm Trung hòa bằng dung dịch NaOH ở 1000C trong 12 giờ Tách cặn Rửa, ly tâm theo thứ tự: nƣớc, ethanol, ether Làm khô Nghiền tinh Bột Chitin có màu kem 25 Phƣơng pháp của Samuer P. Meyers và Keuns. Lee Vỏ tôm tƣơi Rửa sạch và làm khô Xay nhuyễn, sàng Tách protein: NaOH 3,5%, 2 giờ, 650C Lọc, rửa sạch Tách vô cơ: HCl 1N, 30 phút, nhiệt độ phòng Lọc, rửa sạch Tẩy màu bằng Aceton Rửa sạch, làm khô ở 600C, 6 giờ Chitin Phƣơng pháp của Trƣờng Đại học Thủy sản (Nha Trang) Vỏ tôm tƣơi Rửa sạch Phơi khô Ngâm vỏ tôm trong HCl 5% ở nhiệt độ phòng, 48 giờ Rửa sạch Thủy phân bằng NaOH 8% ở 1000C trong 48 giờ Rửa sạch Tẩy màu với KMnO4 1%, H2SO4 10% trong 1 giờ Rửa sạch 26 Khử màu lần 2 bằng Na2S2O3 trong 15 phút Rửa sạch Sấy khô Chitin Phƣơng pháp của Nguyễn Thị Anh Đào và Nguyễn Thị Thu Thủy (LVTN, 1993) Phế liệu tôm Rửa sạch, tách thịt Vỏ tôm Rửa sạch, làm khô Tách protein bằng NaOH 3.5%, W:V= 1:15, 80 – 1000C 75 phút (Tôm thẻ), 90 phút (Tôm choáng) Rửa sạch Tách vô cơ bằng HCl 1N, W:V= 1:10 ( Tôm thẻ) = 1:15 (Tôm choáng) Ở nhiệt độ phòng, 60 phút (Tôm thẻ), 90 phút (Tôm choáng) Rửa sạch, làm khô Chitin thô Tẩy màu bằng Javel W:V=1:20-1:30, 10 phút hoặc H2O2 3% / NaOH 5%, W:V= 1:20-1:30, 3 giờ (Tôm thẻ), 4 giờ (Tôm choáng) Chitin 27 2.3.6.2. Phƣơng pháp sinh học Trong thời gian gần đây, phƣơng pháp chế biến sinh học, sử dụng các Enzyme protease để khử protein trong nguyên liệu để thay thế cho NaOH, Enzyme này có thể có nguồn gốc từ động vật, thực vật hoặc vi sinh vật đã đƣợc nghiên cứu và bƣớc đầu áp dụng để thay thế phƣơng pháp hóa học nhằm hạn chế những khiếm khuyết do phƣơng pháp hóa học gây ra. Trong các loại protease thì chimotripsin papain và protease của vi sinh vật đƣợc sử dụng hiệu quả. * Trần Thị Luyến và cộng tác viên trƣờng Đại học Thủy Sản đã nghiên cứu thành công sử dụng Enzyme papain làm tác nhân thủy phân protein của vỏ tôm trong công nghệ sản xuất Chitin theo quy trình sau: Vỏ tôm khô Vỏ tôm tƣơi Ngâm HCl 10%, tỉ lệ 1W/10V, Ngâm HCl 10%, tỉ lệ 1W/5V, nhiệt độ phòng trong 5 giờ nhiệt độ phòng trong 5 giờ Rửa sạch Khử protein bằng papain 13%, tỉ lệ 1W/5V, pH=5 ÷ 5.5, 70-800C, 4 giờ Rửa sạch Tẩy màu Làm khô ở 600C Chitin Quy trình papain cho sản phẩm có độ nhớt cao, đặc biệt độ deacetyl cao. Nhƣ vậy, để nâng cao chất lƣợng của Chitosan có thể sử dụng Enzyme papain thay thế cho NaOH khử vỏ tôm. 28 Ngoài ra, Viện Công Nghệ Sinh Học - Viện Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam còn tách chiết Chitin nhờ sử dụng Enzyme bromelin từ dịch ép vỏ dứa – Enzyme với hoạt tính thủy phân protein mạnh theo quy trình sau [5]: Vỏ dứa Vỏ + đầu tôm tƣơi Nghiền nhỏ Phơi khô Chiết rút Enzyme protease Sấy lại cho khô giòn ở 400C bằng nƣớc máy từ 2-3 lần Nghiền nhỏ Xử lý bột đầu - vỏ tôm với dịch ép vỏ dứa đến khi toàn bộ lƣợng khoáng trong nguyên liệu bị loại bỏ hết (thử với dung dịch HCl) Rửa sạch Lƣợng protein còn lại đƣợc loại bỏ tiếp bằng dung dịch NaOH 1% hoặc 2% Rửa sạch Tẩy màu với KMnO4 0.1%, C2H2O4 1% Sấy khô Chitin Ưu điểm của phương pháp: - Sử dụng nguồn protease từ nƣớc ép vỏ dứa, hoàn toàn không cần đến HCl, một thành phần quan trọng hàng đầu không thể thiếu trong phƣơng pháp hóa học để loại bỏ chất khoáng. - Tốn ít NaOH - Hiệu suất thu hồi Chitin cao hơn - Chất lƣợng chế phẩm Chitin cũng tốt hơn phƣơng pháp hóa học thông thƣờng. Nhược điểm: Mất nhiều thời gian hơn phƣơng pháp hóa học. 29 Chƣơng 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Địa điểm thí nghiệm Thí nghiệm đƣợc thực hiện tại phòng thí nghiệm của phòng Các chất có hoạt tính sinh học - Viện Sinh học nhiệt đới. 3.2. Nguyên liệu Nội tạng và vỏ tôm dùng trong thí nghiệm đƣợc thu về từ các công ty chế biến thủy sản trong thành phố. Nội tạng đƣợc thu trực tiếp tại bàn xử lý của phân xƣởng chế biến các công ty trên, sau đó cho vào các túi PE, cấp đông và bảo quản ở - 200C. Hình 3.1: Nội tạng tôm Vỏ tôm tƣơi rửa sạch. Một phần để ráo trên rổ thƣa trong 30 phút, đem xay nhỏ. Một phần đem phơi khô, sau đó sấy lại cho khô giòn ở 400C rồi xay nhỏ. Đây là 2 nguồn nguyên liệu vỏ tôm khô và tƣơi để thu nhận Chitin. 3.3. Hóa chất và các thiết bị thí nghiệm chủ yếu đã sử dụng  Hoá chất dùng trong nghiên cứu đạt tiêu chuẩn dùng cho phân tích trong phòng thí nghiệm.  Các thiết bị thí nghiệm chủ yếu đã sử dụng: - Cân điện tử 2200g độ chính xác 10-6(g) SATORIUS – CHLB Đức - Máy đo quang phổ UV - Vis - Máy ly tâm lạnh ROTINA - CHLB Đức - Máy đo pH – PHM 83 Autical pH meter – Đan Mạch - Bể ổn nhiệt 30 3.4. Phƣơng pháp nghiên cứu 3.4.1. Các phƣơng pháp sử dụng trong nghiên cứu [4] 3.4.1.1. Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng protein theo Bradford Ưu điểm - Dễ sử dụng, hoá chất đơn giản (chỉ cần một loại thuốc thử) - Độ nhạy cao (có thể phát hiện protein ở hàm lƣợng 1-20 g) - Ít tốn thời gian - Phức chất giữa thuốc nhuộm và protein tƣơng đối ổn định. - Phƣơng pháp này ít bị cản trở bởi các hoá chất sử dụng trong nghiên cứu protein, nhất là Amoniumsulfate. Hoá chất và thiết bị Hoá chất Dung dịch Albumin chuẩn Thuốc thử Bradford Hình 3.2: Máy ly tâm lạnh Hình 3.3: Bể ổn nhiệt Hình 3.4: Máy đo quang phổ UV- Vis 31 Thiết bị Máy đo quang phổ UV-Vis Nguyên tắc Phƣơng pháp này dựa trên sự thay đổi bƣớc sóng hấp thu cực đại và sự thay đổi màu xảy ra khi Coomasie Brilliant Blue liên kết với protein trong dung dịch Acid. Trong dung dịch mang tính Acid khi chƣa kết nối với protein thì thuốc nhuộm ở dạng màu đỏ có bƣớc sóng hấp thu cực đại là 465 nm và khi kết hợp với protein thì thuốc nhuộm chuyển sang màu xanh dƣơng và hấp thu cực đại ở bƣớc sóng 595 nm. Độ hấp thu ở bƣớc sóng 595 nnm có liên hệ một cách trực tiếp với nồng độ protein. Dạng proton hoá của thuốc nhuộm Coomasie Brilliant Blue có màu da cam đỏ. Thuốc nhuộm liên kết chặt chẽ với các protein, tƣơng tác với tất cả các nhóm kị nƣớc và các nhóm mang điện tích dƣơng trên phân tử protein. Trong môi trƣờng của các gốc mang điện tích dƣơng, sự proton hoá không xảy ra và màu xanh xuất hiện. Màu sẽ xuất hiện trong 2 phút và ổn định trong gần 1 giờ. Các bước tiến hành Để xác định protein trong mẫu, đầu tiên ta xây dựng một đƣờng chuẩn với dung dịch protein chuẩn đã biết đƣợc nồng độ. Sau khi cho dung dịch protein vào thuốc nhuộm màu, màu sẽ xuất hiện sau 2 phút và bền tới 1 giờ. Tiến hành đo dung dịch bằng máy quang phổ kế ta đƣợc ODx, độ hấp thu sẽ tỷ lệ với lƣợng protein trong mẫu. Thực hiện một đối chứng với HCl (ODo). Lấy giá trị OD = ODx-ODo. Lƣợng protein trong mẫu dung dịch đo đƣợc xác định bằng cách dựa vào đƣờng chuẩn từ giá trị OD ở trục tung, từ đó suy ra giá trị nồng độ protein tƣơng ứng trên trục hoành. Dựng đƣờng chuẩn Albumine Pha loãng dung dịch Albumine thành các nồng độ khác nhau: 0,10, 20, 30, 40, 50 g/ml. Lập các ống nghiệm theo bảng sau: Ống nghiệm 0 1 2 3 4 5 Nồng độ dung dịch Albumine ( g/ml) 0 10 20 30 40 50 Dung dịch Albumine (ml) 1 1 1 1 1 1 Dung dịch thuốc thử Bradford (ml) 2 2 2 2 2 2 Ống 0 tƣơng ứng với thời gian xuất phát ban đầu 0 phút, thực hiện phản ứng ở các ống còn lại 1,2,3,4,5, mỗi ống cách nhau 1 phút. 32 Tiến hành đo mật độ quang của dung dịch ở bƣớc sóng 595 nm. Đồ thị đƣờng chuẩn protein đƣợc lập ở hình 3.5 (Phụ lục trang 61) Định lƣợng protein trong mẫu thí nghiệm Lấy 1 ml mẫu thí nghiệm cho vào ống nghiệm, thêm vào 2 ml thuốc thử Bradford. Đem đo mật độ quang ở bƣớc sóng 595 nm. Từ đó suy ra hàm lƣợng protein có trong mẫu thí nghiệm. Mẫu đƣợc pha loãng sao cho mật độ quang đo đƣợc trong khoảng đƣờng chuẩn. Mật độ quang của mẫu trừ đi mật độ quang của ống đối chứng, chiếu vào đƣờng chuẩn để suy ra lƣợng protein có trong dung dịch mẫu thí nghiệm ( g/ml). 3.4.1.2. Phƣơng pháp xác định hoạt tính Enzyme protease (phƣơng pháp Amano) Hóa chất HCl 0,1 M Na2CO3 0,4M Dung dịch Trichloacetic (TCA 0,4 M) Tyrosin tinh khiết Thuốc thử Folin Đệm phosphat pH = 7; 0,1 M Dung dịch Casein 1% Dụng cụ và thiết bị Ống nghiệm, pipette, bình định mức, giấy lọc. Bể ổn nhiệt Máy đo quang phổ UV - Vis Máy đo pH Nguyên tắc Dùng protein casein làm cơ chất, xác định hoạt tính phân giải protein của Enzyme protease trên cơ sở định lƣợng sản phẩm tạo thành trong phản ứng bằng phản ứng màu với thuốc thử Folin. Dựa vào đồ thị chuẩn để tính lƣợng Tyrosin tƣơng ứng với lƣợng sản phẩm thủy phân dƣới tác dụng của Enzyme. Hoạt động của Enzyme đƣợc biểu diễn bằng đơn vị hoạt tính thủy phân protein của Enzyme. 33 Các bước tiến hành Xây dựng đƣờng chuẩn Tyrosin Pha dung dịch Tyrosin ở các nồng độ khác nhau: 10, 20, 30, 40, 50 g/ml dung dịch HCl. Thêm 5 ml dung dịch Na2CO3 0,4M vào 1 ml dung dịch Tyrosin đã pha trên. Thêm 1 ml thuốc thử Folin đã pha loãng 5 lần vào dung dịch hỗn hợp. Trộn đều, để yên dung dịch ở 470C ±0,50C trong 20 phút. Đo độ hấp thụ của dung dịch này ở bƣớc sóng 660nm. Ghi nhận kết quả As10, As20, As30, As40, As50. Đối với ống đối chứng: Dùng 1 ml HCl 0,1M thay cho Tyrosin. Đo độ hấp thu của dung dịch này ở bƣớc sóng 660nm, ghi nhận kết quả là As0. Trị số mật độ quang của các ống từ 1 đến 5 trừ đi trị số của ống đối chứng sẽ đƣợc giá trị OD1 đến OD5. Vẽ đồ thị dựa vào biến thiên của OD theo nồng độ protease. Đồ thị này gọi là đƣờng chuẩn Tyrosin ở hình 3.6 (Phụ lục trang 61) Xác định hoạt tính Enzyme protease Cho 1 ml dung dịch Casein 1% vào ống nghiệm, ủ ở 470C ±0,50C trong 10-15 phút. Cho 1 ml dịch chiết Enzyme thô vào lắc đều. Đem ủ hỗn hợp này ở 470C ±0,50C trong 1 giờ. Cho vào 2 ml dung dịch TCA 0,4M để ngừng phản ứng Enzyme. Để yên dung dịch trong 25 phút, lọc dung dịch này qua giấy lọc để loại tủa. Hút 1 ml dịch lọc . Cho 5 ml dung dịch Na2CO3 vào 1 ml dịch lọc. Thêm vào 1 ml thuốc thử Folin. Trộn đều, để yên ở 470C ±0,50C trong 20 phút. Khi dung dịch xuất hiện màu xanh, đem đo độ hấp thụ ở bƣớc sóng 660nm (ghi nhận kết quả này là Am). Mẫu đối chứng: Lấy 1 ml nƣớc cất thay cho 1 ml dung dịch Enzyme và tiến hành các bƣớc nhƣ mẫu thí nghiệm với cùng điều kiện. Ghi nhận kết quả này là A0. Tính toán Nguyên tắc 34 Hàm lƣợng Tyrosin đƣợc giải phóng do protease thủy phân đƣợc tính bằng cách lấy (Am- A0) rồi lấy kết quả so với đƣờng chuẩn Tyrosin để xác định hoạt độ protease. Một đơn vị hoạt tính (ĐVHT) Enzyme protease đƣợc xác định là lƣợng Enzyme để tạo ra lƣợng amino acid tƣơng đƣơng với 100 g Tyrosin trong 1 ml dịch lọc dƣới điều kiện thí nghiệm. Hoạt tính Enzyme protease (ĐVHT/ml)= (Am- A0)*F*n*1/100 Hoạt tính Enzyme protease (ĐVHT/g)= (Am- A0)*F*n*1/100*V/m F= [(10/As10-A0)+(20/As20-A0)+(30/As30-A0)+(40/As40-A0)+(50/As50-A0)]/5 Am: độ hấp thu của mẫu A0: độ hấp thu của ống đối chứng F : hệ số tƣơng quan giữa hàm lƣợng Tyrosin và độ hấp thu ở bƣớc sóng 660nm trên đƣờng chuẩn. n: hệ số pha loãng của Enzyme 1/100: hệ số chuyển đổi V: thể tích của dung dịch Enzyme m: khối lƣợng chế phẩm Enzyme thô. 3.4.2. Phƣơng pháp tách chiết và thu nhận Enzyme protease từ nội tạng tôm [4] Quá trình tách chiết thu Enzyme đƣợc tiến hành trong điều kiện nhiệt độ thấp (0- 4 0C) để hạn chế sự biến tính của protein – Enzyme dƣới tác động của môi trƣờng. Quy trình Nội tạng tôm Nghiền mịn Chiết rút Enzyme protease Ly tâm thu dịch chiết Dịch chiết Enzyme thô Kết tủa Enzyme protease (cặn tủa) Ly tâm thu chế phẩm thô Chế phẩm Enzyme protease thô 35 Thu nhận chế phẩm Enzyme protease thô bằng máy đông khô. Chế phẩm thô này đƣợc bảo quản trong ngăn đá ở nhiệt độ -200C và sử dụng trực tiếp cho các thí nghiệm. Các bước tiến hành Nội tạng đƣợc nghiền mịn với cát thạch anh trong cối inox đặt trong đá vụn. + Chiết rút thu dịch chiết Dùng nƣớc muối sinh lý 0,9% đã đƣợc làm lạnh trong tủ lạnh với tỷ lệ dung môi/mẫu = 3/1 trong 40 phút. Trong quá trình chiết khuấy đảo liên tục, ly tâm tốc độ 6000 vòng/phút trong 15 phút để thu dịch chiết. + Thu nhận chế phẩm protease Kết tủa thuận nghịch protein – Enzyme trong dịch chiết thu đƣợc bằng tác nhân thích hợp: Ethanol 960 (cồn) với tỷ lệ Ethanol: dịch chiết = 4:1 trong 60 phút. Cồn đã đƣợc làm lạnh trong tủ lạnh cho từ từ vào dịch chiết đến tỷ lệ gây tủa protease, giữ lạnh 0-40C trong 60 phút, sau đó ly tâm tốc độ 6000 vòng/phút trong 10 phút thu chế phẩm thô. Xác định hoạt tính của Enzyme chế phẩm thô theo phƣơng pháp Amano. 3.4.3. Phƣơng pháp sản xuất Chitin bằng Enzyme protease từ nội tạng tôm Việc sản xuất Chitin bằng cách ứng dụng Enzyme protease từ nội tạng tôm để loại protein đƣợc thực hiện theo quy trình sau: Vỏ tôm (tƣơi, khô) Xử lý Xay nhỏ Thủy phân protein trƣớc Khử khoáng trƣớc Nồng độ 3÷8% Nhiệt độ bt÷70 0 C pH 3÷9 Xử lý với Enzyme protease thô Xử lý với HCl, trong 5 giờ, t 0 phòng Thời gian 1÷6 giờ tỷ lệ: tƣơi (1W/5V), khô (1W/10V) Xác định hàm lƣợng protein trong dịch thủy phân Rửa sạch Dịch lọc Lọc (còn hàm lƣợng protein) Xử lý với Nhiệt độ bt÷70 0 C Sử dụng làm Vỏ tôm Enzyme protease thô pH 3÷9 thức ăn gia súc Thời gian1÷6 giờ 36 Rửa sạch Xác định hàm lƣợng protein trong dịch thủy phân Xử lý với HCl, trong 5 giờ, t 0 phòng Lọc Dịch lọc tỷ lệ: tƣơi (1W/5V), khô (1W/10V) (còn hàm lƣợng protein) Rửa sạch Vỏ tôm Sử dụng làm thức ăn gia súc Chitin thô Rửa sạch Chitin thô Chitin thô Tẩy màu với KMnO4 1%; H2SO4 10%; trong 1,5 giờ Rửa sạch Tẩy màu lần 2 với Na2S2O3 2%, trong 15 phút Rửa sạch Làm khô Chitin Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát Các bước tiến hành - Giai đoạn khử khoáng Trong vỏ tôm, thành phần khoáng chủ yếu là CaCO3, Ca3(PO4)2 nên chúng tôi chọn HCl để khử khoáng, vì sau khi khử khoáng các muối Clorua tạo thành hòa tan trong nƣớc đƣợc rửa trôi đi ở công đoạn rửa. - Giai đoạn rửa Công đoạn này có tác dụng rửa trôi hết lƣợng CaCl2 tạo thành và đồng thời loại bỏ lƣợng HCl dƣ. - Giai đoạn khử protein Việc dùng chế phẩm Enzyme protease từ nội tạng tôm có tác dụng: thủy phân protein trong liên kết Chitin – protein và một số protein khác để giải phóng các axit amin, các liên kết peptid thấp phân tử, NH3,… 37 - Giai đoạn rửa Chitin thô tạo thành đƣợc rửa sạch nhằm loại hết lƣợng Enzyme protease dƣ và protein hòa tan. - Giai đoạn khử màu Công đoạn khử màu thƣờng tùy thuộc vào nguyên liệu, trong vỏ tôm thƣờng tồn tại sắc tố chủ yếu là Asthaxanthin. KMnO4 là chất oxy hóa mạnh. Nhiều nghiên cứu cho thấy KMnO4 còn có tác dụng khử một số tạp chất do trong quá trình ngâm Axit và khử protein một số tạp chất chƣa bị khử. Vì vậy, để khử màu trong sản xuất Chitin, tôi sử dụng KMnO4 / H2SO4. Tuy nhiên, cần nghiên cứu hàm lƣợng Na2S2O3 thích hợp để tẩy màu của KMnO4 dƣ trong điều kiện nhiệt độ và thời gian xử lý thích hợp. Trong quá trình khử phải luôn khuấy đều để màu bay hơi đƣợc đều đặn. Khử cho đến màu tím của KMnO4 mất hết. 3.4.4. Bố trí thí nghiệm xác định điều kiện thủy phân vỏ tôm thích hợp bằng chế phẩm thô protease nội tạng tôm [3] 3.4.4.1. Xác định nồng độ Enzyme thủy phân thích hợp Vỏ tôm tƣơi Vỏ tôm khô Xử lý Xử lý Xử lý với Enzyme protease thô theo các nồng độ khác nhau với nhiệt độ = 370C pH = 7 thời gian = 4 giờ tỷ lệ vỏ tôm/dịch thủy phân = 1W/10V Đo hàm lƣợng protein và hoạt tính Enzyme protease Chọn đƣợc nồng độ thích hợp (đo hàm lƣợng protein hòa tan giảm mạnh nhất) 3% 4% 5% 6% 7% 8% 38 3.4.4.2. Xác định nhiệt độ thủy phân thích hợp Vỏ tôm tƣơi Vỏ tôm khô Xử lý Xử lý Xử lý với Enzyme protease thô theo nồng độ thích hợp ở các nhiệt độ khác nhau với pH = 7 thời gian = 4 giờ tỷ lệ vỏ tôm/dịch thủy phân = 1W/10V Đo hàm lƣợng protein và hoạt tính Enzyme protease Chọn đƣợc nhiệt độ thủy phân thích hợp 3.4.4.3. Xác định pH thủy phân thích hợp Vỏ tôm tƣơi Vỏ tôm khô Xử lý Xử lý Xử lý với Enzyme protease thô theo nồng độ thích hợp, nhiệt độ thủy phân thích hợp với pH khác nhau với thời gian = 4 giờ tỷ lệ vỏ tôm/dịch thủy phân = 1W/10V Đo hàm lƣợng protein và hoạt tính Enzyme protease Chọn đƣợc pH thủy phân thích hợp 3.4.4.4. Xác định thời gian thủy phân thích hợp Vỏ tôm tƣơi Vỏ tôm khô Xử lý Xử lý 5 6 7 8 9 4 3 Nhiệt độ phòng 40 0 C 45 0 C 50 0 C 70 0 C 39 Xử lý với Enzyme protease thô theo nồng độ thích hợp, nhiệt độ thích hợp, pH thích hợp với thời gian khác nhau với tỷ lệ vỏ tôm/dịch thủy phân = 1W/10V Đo hàm lƣợng protein và hoạt tính Enzyme protease Chọn đƣợc thời gian thủy phân tốt nhất Khảo sát xem dùng Enzyme protease thủy phân vỏ tôm với các thông số nào thì thu đƣợc Chitin tốt nhất. 3.5. Các phƣơng pháp xử lý số liệu - Mỗi thí nghiệm bố trí song song 3 mẫu, lấy kết quả trung bình cộng của 3 mẫu. Mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần, kết quả là trung bình cộng của 3 lần thí nghiệm. - Số liệu đƣợc xử lý để vẽ đồ thị trên phần mềm Excel với hệ số tƣơng quan R≥0.95. 6 4 giờ 6 giờ 5 giờ 3 giờ 2 giờ1 giờ 40 Chƣơng 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Quá trình thủy phân vỏ tôm bằng chế phẩm thô protease nội tạng tôm trên vỏ tôm đƣợc thủy phân protein trƣớc 4.1.1. Ảnh hƣởng của nồng độ Enzyme thủy phân Nồng độ Enzyme là một trong những yếu tố ảnh hƣởng lớn đến quá trình thủy phân. Vì vậy, muốn tìm điều kiện thích hợp cho quá trình thủy phân, việc xác định nồng độ Enzyme thích hợp là điều cần thiết đầu tiên. Nồng độ Enzyme quá thấp thì không đủ lƣợng để thủy phân, còn nồng độ Enzyme cao quá mức tới hạn thì tốc độ phản ứng tăng chậm, thậm chí không tăng, điều này là hao phí và không cần thiết. Thí nghiệm đƣợc tiến hành nhƣ sau: thí nghiệm đƣợc giữ ở điều kiện: nhiệt độ = 37 0C, pH = 7, trong thời gian 4 giờ, tỷ lệ vỏ tôm / thể tích dịch Enzyme = 1/10 với nồng độ Enzyme thay đổi: 3, 4, …, 8%. Thu dịch thủy phân, xác định hàm lƣợng protein và hoạt tính Enzyme protease dịch thủy phân của từng mẫu thí nghiệm. Trên cơ sở kết quả đo hàm lƣợng protein, xác định đƣợc nồng độ chế phẩm thô protease thủy phân thích hợp (đo hàm lƣợng protein giảm mạnh nhất). Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 4.1a và 4.1b (Phụ lục trang 62) và biểu diễn trên hình 4.1a và 4.1b dƣới đây 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 3 4 5 6 7 8 Nồng độ Enzyme trong dịch thủy phân (%) % giả m (% ) Hoạt tính Enzyme protease giảm (%) Hàm lượng protein giảm (%) Hình 4.1a: Ảnh hƣởng của nồng độ Enzyme trong dịch thủy phân đến sự giảm hàm lƣợng protein hòa tan và hoạt tính Enzyme protease trong quá trình thủy phân vỏ tôm khô 41 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 3 4 5 6 7 8 Nồng độ Enzyme trong dịch thủy phân (%) % giả m (% ) Hoạt tính Enzyme protease giảm (%) Hàm lượng protein giảm (%) Hình 4.1b: Ảnh hƣởng của nồng độ Enzyme trong dịch thủy phân đến sự giảm hàm lƣợng protein hòa tan và hoạt tính Enzyme protease trong quá trình thủy phân vỏ tôm tƣơi Nhận xét Ở cả vỏ tôm khô và tƣơi: - Khi nồng độ Enzyme trong dịch thủy phân từ 3% đến 6%, sự giảm hàm lƣợng protein hòa tan tăng mạnh và tƣơng đối đều. - Khi nồng độ Enzyme trong dịch thủy phân ở cả vỏ tôm khô và tƣơi đạt 6%, hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân giảm đạt giá trị cực đại. - Khi nồng độ Enzyme trong dịch thủy phân từ 7% trở đi (7;8%;…), lƣợng protein hòa tan bắt đầu giảm. Điều này đƣợc giải thích nhƣ sau: - Khi nồng độ Enzyme thấp 3-5%, lƣợng Enzyme thấp không đủ thủy phân vỏ tôm nên hàm lƣợng protein giảm không nhiều. - Khi nồng độ Enzyme tăng quá 6% (7;8%;…), lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân càng tăng (lƣợng protein tăng này là của Enzyme cao chênh lệch so với 6%) nhƣng hàm lƣợng protein vỏ tôm không đổi nên lƣợng Enzyme chênh lệch này trở nên dƣ thừa khi dùng thủy phân cùng một lƣợng vỏ tôm nên tăng nồng độ Enzyme quá 6% thì hàm lƣợng protein tiếp tục giảm. Vì vậy, ta chỉ cần sử dụng Enzyme ở nồng độ 6% là thích hợp thủy phân vỏ tôm để tránh hao phí và không cần thiết. - Nồng độ Enzyme trong dịch thủy phân thích hợp ở cả vỏ tôm khô và tƣơi là 6%, do khi xét trong cùng một lƣợng vỏ tôm, hàm lƣợng protein hòa tan ở cả vỏ tôm khô và tƣơi chênh lệch không đáng kể: 42 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 32 40 45 50 55 60 65 70 Nhiệt độ ( 0 C) % gi ảm (% ) Hoạt tính Enzyme protease giảm (%) Hàm lượng protein giảm (%) Nguyên liệu Hàm lƣợng protein ( g/ml) Vỏ tƣơi 125,7 Vỏ khô 116,4 ( Nguồn từ thực nghiệm) 4.1.2. Ảnh hƣởng của nhiệt độ thủy phân Sau khi xác định đƣợc nồng độ Enzyme thủy phân thích hợp là 6%, tiến hành xác định nhiệt độ thủy phân thích hợp bằng cách bố trí thí nghiệm theo cách sau: Thí nghiệm đƣợc giữ ở điều kiện: pH = 7, trong thời gian 4 giờ, tỷ lệ vỏ tôm / thể tích dịch Enzyme = 1/10 với nồng độ Enzyme 6%. Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 4.2a và 4.2b ( Phụ lục trang 63) và biểu diễn trên hình 4.2a và 4.2b dƣới đây 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 32 40 45 50 55 60 65 70 Nhiệt độ ( 0 C) % gi ảm (% ) Hoạt tínhEnzyme protease giảm (%) Hàm lượng protein giảm (%) Hình 4.2a: Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm khô Hình 4.2b: Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm tƣơi 43 Nhận xét - Ở nhiệt độ phòng (320C) hoạt tính Enzyme hoạt động yếu nên mức độ giảm của hàm lƣợng protein hòa tan không cao. - Ở nhiệt độ 32-550C (đối với vỏ khô) và 32-600C (đối với vỏ tƣơi), do nhiệt độ càng tăng thì tốc độ phản ứng càng tăng nên mức độ giảm của hàm lƣợng protein trong khoảng nhiệt độ này tăng đều và mạnh. - Ở nhiệt độ 55-650C (đối với vỏ khô) và 60-650C (đối với vỏ tƣơi), hàm lƣợng protein hòa tan bắt đầu giảm và giảm mạnh nhất ở nhiệt độ 700C do tăng nhiệt độ từ 60 0C trở đi (đối với vỏ khô) và 650C (đối với vỏ tƣơi), protein bắt đầu bị biến tính và mất hoạt tính mạnh ở 700C. Như vậy: Nhiệt độ thủy phân thích hợp với vỏ tôm khô là ở 550C và với vỏ tôm tƣơi là ở 60 0C. Khoảng nhiệt độ này (55-600C) nằm trong khoảng nhiệt độ thích hợp cho chế phẩm thô protease nội tạng tôm hoạt động tốt (ở 570C) [4]. Kết quả này phù hợp với kết quả nghiên cứu của Ths. Nguyễn Văn Lệ về đầu tôm Bộp [6]. Nếu so sánh với kết quả thủy phân protein của thịt cá bằng Enzyme protease nội tạng cá Thu, cá Ngừ và gan mực ống [3] hay với protease B. subtilis S5 [7], thì kết quả này cũng tƣơng đồng. Điều này rất có ý nghĩa trong chế biến tôm vì để phát huy tối đa hoạt tính thủy phân protein của Enzyme nội tạng tôm cần duy trì nhiệt độ cao (55-600C). Khoảng nhiệt độ này không phải là khoảng nhiệt độ thích hợp cho vi sinh vật gây thối rửa nên tôm thủy phân bằng Enzyme nội tạng tôm ở khoảng nhiệt độ này sẽ không bị hƣ hỏng trong thời gian ngắn dù không sử dụng chất chống thối. 4.1.3. Ảnh hƣởng của pH thủy phân pH môi trƣờng có ảnh hƣởng mạnh mẽ đến quá trình thủy phân. Vì vậy, việc xác định giá trị pH thích hợp cho quá trình thủy phân là rất cần thiết. Sau khi xác định đƣợc nồng độ Enzyme thủy phân thích hợp là 6%, nhiệt độ thủy phân thích hợp đối với vỏ tôm khô là 550C, vỏ tôm tƣơi là 600C, tiến hành xác định pH thích hợp bằng cách bố trí thí nghiệm theo cách sau: Thí nghiệm đƣợc giữ ở điều kiện: trong thời gian 4 giờ, tỷ lệ vỏ tôm / thể tích dịch Enzyme = 1/10 với nồng độ Enzyme 6%, nhiệt độ với vỏ khô ở 550C, với vỏ tƣơi ở 600C. Kết quả đƣợc 44 trình bày ở bảng 4.3a và 4.3b (Phụ lục trang 64) và biểu diễn trên hình 4.3a và 4.3b dƣới đây 0 10 20 30 40 50 60 70 3 4 5 6 7 8 9 pH % giả m (% ) Hoạt tínhEnzyme protease giảm (%) Hàm lượng protein giảm (%) Hình 4.3a: Ảnh hƣởng của pH đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm khô 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 3 4 5 6 7 8 9 pH % giả m (% ) Hoạt tính Enzyme protease giảm (%) Hàm lượng protein giảm (%) Hình 4.3b: Ảnh hƣởng của pH đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm tƣơi Nhận xét Ở cả vỏ tôm khô và tƣơi: - Trong khoảng pH = 3-6, mức độ giảm của hàm lƣợng protein hòa tan tăng đều. - Trong khoảng pH = 8-9, mức độ giảm của hàm lƣợng protein hòa tan giảm đều. - Tại giá trị pH = 7, mức độ giảm của hàm lƣợng protein hòa tan đạt giá trị cực đại. Giá trị pH môi trƣờng này phù hợp với pH tối ƣu cho hoạt động thủy phân của chế phẩm protease thô. - Vì Enzyme protease tôm là các protease hoạt động mạnh trong môi trƣờng từ trung tính đến kiềm nên mức độ giảm của hàm lƣợng protein trong khoảng pH = 7-9 45 nhiều hơn mức độ giảm của hàm lƣợng protein trong khoảng pH = 3–6 (do đây là môi trƣờng Axit, Enzyme protease không hoạt động mạnh). 4.1.4. Ảnh hƣởng của thời gian thủy phân Thí nghiệm đƣợc giữ ở điều kiện: nồng độ Enzyme thủy phân thích hợp là 6%, nhiệt độ thủy phân thích hợp đối với vỏ tôm khô là 550C, vỏ tôm tƣơi là 600C, pH= 7, tỷ lệ vỏ tôm / thể tích dịch Enzyme = 1/10. Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 4.4a và 4.4b (Phụ lục trang 65) và biểu diễn trên hình 4.4a và 4.4b dƣới đây 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 1 2 3 4 5 6 Thời gian thủy phân (giờ) % giả m (% ) Hoạt tính Enzyme protease giảm (%) Hàm lượng protein giảm (%) Hình 4.4a: Ảnh hƣởng của thời gian thủy phân đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm khô Hình 4.4b: Ảnh hƣởng của thời gian thủy phân đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm tƣơi Nhận xét Ở cả vỏ tôm khô và tƣơi: - Trong khoảng thời gian 1-3 giờ, hàm lƣợng protein hòa tan tăng mạnh nhƣng vẫn chƣa đủ để thủy phân hầu hết lƣợng protein của vỏ tôm. - Thời gian thủy phân thích hợp nhất khi đạt đƣợc 4 giờ. Lúc này, hiệu suất thủy phân cao đồng thời đảm bảo chất lƣợng sản phẩm tốt [3]. Thời gian thủy phân 4 giờ 0 10 20 30 40 50 6 7 80 90 1 2 3 4 5 6 Thời gian thủy phân (giờ) % giả m (% ) Hoạt tính Enzyme protease giảm (%) Hàm lượng protein giảm (%) 46 đủ dài để Enzyme phân cắt các liên kết trong cơ chất là vỏ tôm, tạo thành các sản phẩm cần thiết của quá trình thủy phân. - Từ 5 giờ trở đi (5; 6; 7 giờ), mức độ giảm của hàm lƣợng protein hòa tan tăng không đáng kể so với tại thời điểm 4 giờ. Do vậy, để tránh lãng phí về thời gian và lợi ích về kinh tế chọn thời gian thủy phân lúc 4 giờ là thích hợp. 4.2. Quá trình thủy phân vỏ tôm bằng chế phẩm thô protease nội tạng tôm trên vỏ tôm đƣợc khử khoáng trƣớc 4.2.1. Ảnh hƣởng của nhiệt độ thủy phân Thí nghiệm đƣợc giữ ở điều kiện: nồng độ Enzyme thủy phân là 6%, pH = 7, trong thời gian 4 giờ, tỷ lệ vỏ tôm / thể tích dịch Enzyme = 1/10. Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 4.5a và 4.5b (Phụ lục trang 66) và biểu diễn trên hình 4.5a và 4.5b dƣới đây: 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 27 40 45 50 55 60 65 70 Nhiệt độ ( 0 C) % gi ảm (% ) Hoạt tính Enzyme protease giảm (%) Hàm lượng protein giảm (%) Hình 4.5a: Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm khô sau khử khoáng Nhận xét - Ở nhiệt độ bình thƣờng (270)-600C mức độ giảm của hàm lƣợng protein hòa tan tăng mạnh. - Ở nhiệt độ 600C hàm lƣợng protein giảm đạt giá trị cực đại. - Ở nhiệt độ 65-700C hàm lƣợng protein hòa tan bắt đầu giảm do trong khoảng 65- 70 0C protein bắt đầu bị biến tính làm cho hoạt tính Enzyme giảm. 47 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 27 40 45 50 55 60 65 70 Nhiệt độ ( 0 C) % gi ảm (% ) Hoạt tính Enzyme protease giảm (%) Hàm lượng protein giảm (%) Hình 4.5b: Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm tƣơi sau khử khoáng Nhận xét - Ở nhiệt độ bình thƣờng (270)-550C mức độ giảm của hàm lƣợng protein hòa tan tăng mạnh. - Ở nhiệt độ 550C hàm lƣợng protein giảm đạt giá trị cực đại. - Ở nhiệt độ 60-700C hàm lƣợng protein hòa tan bắt đầu giảm do trong khoảng 60- 70 0C protein bắt đầu bị biến tính nên hoạt lực Enzyme cũng giảm theo. Như vậy: Nhiệt độ thủy phân thích hợp nhất đối với vỏ tôm khô sau khử khoáng là ở 60 0C, đối với vỏ tôm tƣơi là ở 550C. Điều này đƣợc giải thích tƣơng tự nhƣ ở mục 4.1.2 4.2.2. Ảnh hƣởng của pH thủy phân Sau khi xác định đƣợc nhiệt độ thủy phân thích hợp đối với vỏ tôm sau khử khoáng, tiến hành xác định pH thủy phân thích hợp bằng cách bố trí thí nghiệm theo cách sau: Thí nghiệm đƣợc giữ ở điều kiện: trong thời gian 4 giờ, tỷ lệ vỏ tôm / thể tích dịch Enzyme = 1/10 với nồng độ Enzyme 6%, nhiệt độ với vỏ khô ở 600C, với vỏ tƣơi ở 550C. Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 4.6a và 4.6b (Phụ lục trang 67) và biểu diễn trên hình 4.6a và 4.6b dƣới đây 48 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 3 4 5 6 7 8 9 pH % gi ảm (% ) Hoạt tính Enzyme protease giảm (%) Hàm lượng protein giảm (%) Hình 4.6a: Ảnh hƣởng của pH đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm khô sau khử khoáng 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 3 4 5 6 7 8 9 pH % giả m (% ) Hoạt tính Enzyme protease giảm (%) Hàm lượng protein giảm (%) Hình 4.6b: Ảnh hƣởng của pH đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm tƣơi sau khử khoáng Nhận xét Ở cả vỏ tôm khô và tƣơi sau khử khoáng: - Trong khoảng pH 3-6, mức độ giảm của hàm lƣợng protein hòa tan tăng đều. - Trong khoảng pH 8-9, mức độ giảm của hàm lƣợng protein hòa tan giảm đều. - Tại giá trị pH = 7 (pH trung tính), mức độ giảm của hàm lƣợng protein hòa tan đạt giá trị cực đại. Điều này hoàn toàn phù hợp với pH thích hợp cho hoạt động thủy phân của chế phẩm thô protease. Điều này đƣợc giải thích tƣơng tự nhƣ ở mục 4.1.3 49 4.2.3. Ảnh hƣởng của thời gian thủy phân Sau khi xác định đƣợc nhiệt độ và pH thủy phân thích hợp, tiến hành xác định thời gian thủy phân thích hợp bằng cách bố trí thí nghiệm theo cách sau: Thí nghiệm đƣợc giữ ở điều kiện: pH = 7, trong thời gian 4 giờ, tỷ lệ vỏ tôm / thể tích dịch Enzyme = 1/10 với nồng độ Enzyme 6%, nhiệt độ với vỏ khô ở 600C, với vỏ tƣơi ở 550C. Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 4.7a và 4.7b (Phụ lục trang 68) và biểu diễn trên hình 4.7a và 4.7b dƣới đây 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 1 2 3 4 5 6 Thời gian thủy phân (giờ) % gi ảm (% ) Hoạt tính Enzyme protease giảm (%) Hàm lượng protein giảm (%) Hình 4.7a: Ảnh hƣởng của thời gian thủy phân đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm khô sau khử khoáng Hình 4.7b: Ảnh hƣởng của thời gian thủy phân đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm tƣơi sau khử khoáng 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 1 2 3 4 5 6 Thời gian thủy phân (giờ) % giả m (% ) Hoạt tính Enzyme protease giảm (%) Hàm lượng protein giảm (%) 50 Nhận xét Ở cả vỏ tôm khô và tƣơi sau khử khoáng: - Trong khoảng thời gian 1- 4 giờ, hàm lƣợng protein hòa tan tăng mạnh. - Từ 5 giờ trở đi, hàm lƣợng protein hòa tan hầu nhƣ không tăng. - Thời gian thủy phân tốt nhất khi đạt đƣợc 4 giờ. Điều này đƣợc giải thích tƣơng tự nhƣ ở mục 4.1.4 4.3. Kết quả so sánh hiệu suất và đánh giá cảm quan giữa các mẫu sản phẩm Chitin thu đƣợc Nguyên liệu Khối lƣợng nguyên liệu ban đầu (g) Lƣợng Chitin thu đƣợc (g) Hiệu suất tách chiết Chitin (%) Vỏ tƣơi khử khoáng trƣớc 100 19 19 Vỏ khô khử khoáng trƣớc 100 24,2 24,2 Vỏ tƣơi thủy phân protein trƣớc 100 18,08 18,08 Vỏ khô thủy phân protein trƣớc 100 20,6 20,6 Nhận xét - Ở cả 2 nhóm khử khoáng trƣớc và thủy phân protein trƣớc: vỏ khô đều cho hiệu suất cao hơn và màu sắc tƣơi, trắng hơn vỏ tƣơi: + Ở nhóm khử khoáng trƣớc: hiệu suất của vỏ khô là 24,2% và vỏ tƣơi là 19%. + Ở nhóm thủy phân protein trƣớc: hiệu suất của vỏ khô là 20,6% và vỏ tƣơi là 18,08%. - Nhóm khử khoáng trƣớc cho hiệu suất cao hơn và và màu sắc tƣơi, trắng hơn nhóm thủy phân protein trƣớc: + Hiệu suất của vỏ khô khử khoáng trƣớc là 24,2% và vỏ khô thủy phân protein trƣớc là 20,6%. + Hiệu suất của vỏ tƣơi khử khoáng trƣớc là 19% và vỏ tƣơi thủy phân protein trƣớc là 18,08%. 51 Nguyên liệu Sản phẩm Hình 4.8: Nguyên liệu và sản phẩm Hình 4.8: Nguyên liệu và sản phẩm Vỏ tôm khô Vỏ tôm tƣơi Chitin vỏ khô khử khoáng trƣớc Chitin vỏ khô thủy phân protein trƣớc Chitin vỏ tƣơi thủy phân protein trƣớc Chitin vỏ tƣơi khử khoáng trƣớc 52 Chƣơng 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận Qua 3 tháng nghiên cứu thực nghiệm, đã xác định đƣợc các thông số thích hợp cho quá trình thủy phân protein vỏ tôm bằng chế phẩm protease thô từ nội tạng tôm nhƣ sau:  Đối với vỏ tôm thủy phân protein trƣớc: - Nồng độ Enzyme thủy phân thích hợp ở cả vỏ khô và vỏ tƣơi là 6%. - Nhiệt độ thủy phân thích hợp: ở vỏ khô là 550C, ở vỏ tƣơi là 600C. - pH thủy phân thích hợp ở cả vỏ khô và vỏ tƣơi là 7 - Thời gian thủy phân thích hợp ở cả 2 loại vỏ là 4 giờ.  Đối với vỏ tôm khử khoáng trƣớc: - Nhiệt độ thủy phân thích hợp: ở vỏ khô là 600C, ở vỏ tƣơi là 550C. - pH thủy phân thích hợp ở cả vỏ khô và vỏ tƣơi là 7. - Thời gian thủy phân thích hợp ở cả 2 loại vỏ là 4 giờ. 5.2. Đề xuất ý kiến - Tiếp tục khảo sát nồng độ Enzym thích hợp cho quá trình thủy phân vỏ tôm đƣợc khử khoáng trƣớc. - Theo dõi pH trong quá trình thủy phân nhằm kiểm soát chặt chẽ quá trình tối ƣu hóa. - Trang bị thêm nhiều thiết bị phục vụ nghiên cứu về Enzyme và phục vụ sản xuất chế phẩm Enzyme từ nội tạng tôm cũng nhƣ các động vật thủy sinh khác. - Điều kiện thí nghiệm tốt hơn và thời gian giới hạn của đề tài đủ dài để có thể kiểm soát chất lƣợng Chitin tốt hơn. - Tiếp tục nghiên cứu phƣơng pháp tẩy màu tốt hơn. - Thực hiện tối ƣu hóa quá trình thu nhận chế phẩm Enzyme thô. - Thực hiện tối ƣu hóa quá trình thủy phân protein vỏ tôm bằng Enzyme protease từ đầu tôm để có thể áp dụng vào quy mô công nghiệp. 53 - Nghiên cứu phát triển công nghệ sản xuất các chế phẩm protease thƣơng mại từ nội tạng và đầu tôm cũng nhƣ các loài động vật thủy sinh, đáp ứng yêu cầu Enzyme protease của các cơ sở sản xuất, thay thế nguồn Enzym nhập khẩu. - Tiếp tục nghiên cứu, phát triển ứng dụng chế phẩm protease thủy sản trong các lĩnh vực chế biến thủy sản, công nghiệp thực phẩm và các lĩnh vực khác của sản xuất và đời sống, tạo đầu ra cho ngành sản xuất Enzyme. 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT [1]. Phan Huỳnh Anh, 2007. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến việc tách chiết và tính chất của Enzyme protease từ nội tạng và đầu tôm sú (Penaeus Monodon). Khóa luận tốt nghiệp cử nhân khoa học, Đại học Mở TP. HCM. [2]. Vũ Ngọc Bội, 2004. Nghiên cứu quá trình thủy phân protein cá bằng Enzyme protease từ B. subtilis S5. Luận án tiến sĩ sinh học, trƣờng Khoa học tự nhiên - Đại học quốc gia TP. HCM. [3]. Lê Công Chánh, 2000. Nghiên cứu chiết rút Chitin từ nang mực. Khóa luận tốt nghiệp Kỹ sƣ Thủy sản, Đại học Thủy sản, Nha Trang. [4]. Nguyễn Văn Lệ, 1996. Nghiên cứu và sử dụng proteinaza đầu tôm trong chế biến thủy sản. Luận án phó tiến sĩ khoa học sinh học, trƣờng Khoa học tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội. [5]. Nguyễn Đức Lƣợng, 2002. Công nghệ vi sinh tập I, Nhà xuất bản Đại học quốc gia TP. HCM. [6]. Đỗ Văn Ninh, 2003. Tối ưu hóa quá trình thủy phân protein của protease trong thịt cá và thử nghiệm sản xuất sản phẩm mới từ protein được thủy phân. Luận án tiến sĩ kỹ thuật, Đại học Thủy sản, Nha Trang. [7]. Nguyễn Văn Thiết và Đỗ Ngọc Tú, Viện Công Nghệ Sinh Học - Viện KH và CN Việt Nam, số 2/2006. Phương pháp Enzyme tách chiết Chitin từ vỏ tôm. Tạp chí Dƣợc liệu, tập 11, trang 77 – 80. [8]. Khoa Công Nghệ Sinh Học, Trƣờng Đại học Nông Lâm TP. HCM, 2004. Công nghệ Enzyme, 113 trang. INTERNET [9]. [10]. [11]. 55 PHỤ LỤC Hình 3.5: Đƣờng chuẩn protein Hình 3.6: Đƣờng chuẩn protease * Công thức tính hiệu suất thu Chitin: bằng phƣơng pháp trọng lƣợng H = (mChitin / mvỏ tôm)*100 (%) Trong đó: H : hiệu suất thu Chitin (%) mChitin: khối lƣợng Chitin thu đƣợc (g) mvỏ tôm : khối lƣợng vỏ tôm nguyên liệu (g) 56 Bảng 4.1a: Ảnh hƣởng của nồng độ Enzyme trong dịch thủy phân đến sự giảm hàm lƣợng protein hòa tan và hoạt tính Enzyme protease trong quá trình thủy phân vỏ tôm khô Bảng 4.1b: Ảnh hƣởng của nồng độ Enzyme trong dịch thủy phân đến sự giảm hàm lƣợng protein hòa tan và hoạt tính Enzyme protease trong quá trìnhthủy phân vỏ tôm tƣơi Nồng độ Enzyme trong dịch thủy phân (%) Tổng hoạt tính Enzyme protease lúc 0 giờ (UI) Tổng hoạt tính Enzyme protease sau 4 giờ thủy phân (UI) Hoạt tính Enzyme protease giảm (%) Tổng hàm lƣợng protein lúc 0 giờ (µg) Tổng hàm lƣợng protein sau 4 giờ thủy phân (µg) Hàm lƣợng protein giảm (%) 0 0 0 3 146,1 128,14 12,3 12512 6408,65 48,78 4 152,9 121,4 20,6 15876,67 5136,1 67,65 5 163,26 110,2 32,5 19283,67 4628,08 76 6 181,97 109,09 40,05 21568,33 3826,22 82,26 7 198,69 123,94 37,62 26804,33 7290,78 72,8 8 208,92 172,57 17,4 27004 8452,25 68,7 Nồng độ Enzyme trong dịch thủy phân (%) Tổng hoạt tính Enzyme protease lúc 0 giờ (UI) Tổng hoạt tính Enzyme protease sau 4 giờ thủy phân (UI) Hoạt tính Enzyme protease giảm (%) Tổng hàm lƣợng protein lúc 0 giờ (µg) Tổng hàm lƣợng protein sau 4 giờ thủy phân (µg) Hàm lƣợng protein giảm (%) 0 0 0,00 3 190,8 147,35 22,77 22295 11985,8 46,24 4 197,35 134,24 31,98 24229 9102,84 62,43 5 206,64 123,36 40,3 30190 7517,31 75,10 6 213,94 111,89 47,7 34097 5871,5 82,78 7 216,55 125,36 42,11 37194 10808,6 70,94 8 226,21 160,36 29,11 37748,3 12925,02 65,76 57 Bảng 4.2a: Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm khô Thời gian thủy phân (giờ) Nhiệt độ ( 0 C) Tổng hoạt tính Enzyme protease (UI) Hoạt tính Enzyme protease giảm (%) Tổng hàm lƣợng protein (µg) Hàm lƣợng protein giảm (%) Lúc 0 giờ 60,06 0 15885 0,00 Sau 4 giờ 32 56,41 6,08 8747 44,5 40 48,53 19,19 7679 51,66 45 41,98 30,1 6941 56,30 50 35,45 40,98 6884,3 56,66 55 12,55 79,10 4591,3 71,10 60 13,8 77,02 4946,3 68,86 65 19,31 67,85 6183 61,08 70 55,09 8,28 8755 44,94 Bảng 4.2b: Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm tƣơi Thời gian thủy phân (giờ) Nhiệt độ ( 0 C) Tổng hoạt tính Enzyme protease (UI) Hoạt tính Enzyme protease giảm (%) Tổng hàm lƣợng protein (µg) Hàm lƣợng protein giảm (%) Lúc 0 giờ 51,23 0 16859 0 Sau 4 giờ 32 42,19 2,50 12140,7 27,99 40 36,3 17,65 11664 30,81 45 33,18 29,14 8089 52,02 50 38,3 35,24 7908,7 53,09 55 12,75 75,11 7257,7 56,95 60 7,43 85,50 5958,3 64,66 65 10,56 79,39 6135,7 63,6 70 48,92 4,51 9690,7 42,52 58 Bảng 4.3a: Ảnh hƣởng của pH đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm khô pH Tổng hoạt tính Enzyme protease lúc 0 giờ (UI) Tổng hoạt tính Enzyme protease sau 4 giờ thuỷ phân (UI) Hoạt tính Enzyme protease giảm (%) Tổng hàm lƣợng protein lúc 0 giờ (µg) Tổng hàm lƣợng protein sau 4 giờ thủy phân (µg) Hàm lƣợng protein giảm (%) 3 38,61 36,75 4,82 8350,39 5909,57 29,93 4 40,90 34,44 15,80 8404,24 4530,73 46,09 5 42,70 32,79 23,21 9552,33 4149 56,57 6 44,21 31,27 29,26 9189,33 3672,98 60,03 7 48,03 27,81 42,10 12490,33 4215 66,25 8 54,82 35,39 35,44 11861,11 4295,21 63,79 9 49,49 33,75 31,8 10810,6 4158,12 61,54 Bảng 4.3b: Ảnh hƣởng của pH đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm tƣơi pH Tổng hoạt tính Enzyme protease lúc 0 giờ (UI) Tổng hoạt tính Enzyme protease sau 4 giờ thủy phân (UI) Hoạt tính Enzyme protease giảm (%) Tổng hàm lƣợng protein lúc 0 giờ (µg) Tổng hàm lƣợng protein sau 4 giờ thủy phân (µg) Hàm lƣợng protein giảm (%) 3 33,95 23,62 30,43 18071,33 9866,95 45,4 4 34,06 20,50 39,79 17853,33 7942,95 55,51 5 38,90 18,00 53,73 19779,33 6190,93 68,7 6 42,23 16,80 60,22 24054,7 5972,78 75,17 7 44,4 14,05 68,40 25501,7 4480,2 82,43 8 46,30 19,81 57,21 25831 4658,5 81,97 9 47,3 23,41 50,5 26611,3 5395,1 79,73 59 Bảng 4.4a: Ảnh hƣởng của thời gian thủy phân đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm khô Thời gian thủy phân (giờ) Tổng hoạt tính Enzyme protease (UI) Hoạt tính Enzyme protease giảm (%) Tổng hàm lƣợng protein (µg) Hàm lƣợng protein giảm (%) 0 1007,40 0 215900 0 1 694,85 31,02 131591,05 39,05 2 648,22 35,65 108684,06 49,66 3 633,18 37,15 92189,3 57,3 4 462,87 54,05 38171,12 82,32 5 481,06 52,24 38862 82 6 596 40,84 39941,5 81,5 Bảng 4.4b: Ảnh hƣởng của thời gian thủy phân đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm tƣơi Thời gian thủy phân (giờ) Tổng hoạt tính Enzyme protease (UI) Hoạt tính Enzyme protease giảm (%) Tổng hàm lƣợng protein (µg) Hàm lƣợng protein giảm (%) 0 408,985 0,00 81068,33 0 1 303,51 25,79 62017,27 23,5 2 283,47 30,69 51551,35 36,41 3 262,73 35,76 26979,54 66,72 4 197,83 51,63 14649,05 81,93 5 213,9 47,7 15346,23 81,07 6 229,85 43,8 15435,41 80,96 60 Bảng 4.5a: Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm khô sau khử khoáng Thời gian thủy phân (giờ) Nhiệt độ ( 0 C) Tổng hoạt tính Enzyme protease (UI) Hoạt tính Enzyme protease giảm (%) Tổng hàm lƣợng protein (µg) Hàm lƣợng protein giảm (%) Lúc 0 giờ 250,8 0 20518,33 0 Sau 4 giờ 27 233,47 6,91 13355,38 34,91 40 223,13 11,03 10657,22 48,06 45 174,86 30,28 7298,37 64,43 50 124,02 50,55 4678 77,2 55 101,45 59,55 3763 81,7 60 40,7 83,77 3220 84,3 65 47,9 80,90 3401,7 83,42 70 199,16 20,59 4794 76,64 Bảng 4.5b: Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm tƣơi sau khử khoáng Thời gian thủy phân (giờ) Nhiệt độ ( 0 C) Tổng hoạt tính Enzyme protease (UI) Hoạt tính Enzyme protease giảm (%) Tổng hàm lƣợng protein (µg) Hàm lƣợng protein giảm (%) Lúc 0 giờ 249,8 0 17541,7 0 Sau 4 giờ 27 205,7 17,65 11384,56 35,1 40 153,97 38,36 7121,93 59.4 45 120,41 51,80 4330 75,32 50 74,6 70,14 3352,7 80,9 55 30,85 87,65 1952,5 88,9 60 49,21 80,3 2032,9 88,41 65 87,31 65,05 2216,5 87,4 70 161,27 35,44 2374,7 86,5 61 Bảng 4.6a: Ảnh hƣởng của pH đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm khô sau khử khoáng pH Tổng hoạt tính Enzyme protease lúc 0 giờ (UI) Tổng hoạt tính Enzyme protease sau 4 giờ thủy phân (UI) Hoạt tính Enzyme protease giảm (%) Tổng hàm lƣợng protein lúc 0 giờ (µg) Tổng hàm lƣợng protein sau 4 giờ thủy phân (µg) Hàm lƣợng protein giảm (%) 3 237,13 156,27 34,10 19459 8931,68 54,1 4 213,75 115,83 45,81 21350 8382,01 60,74 5 241,81 119,87 50,43 22598 7199,72 68,14 6 233,73 94,43 59,60 24164 7096,97 70,63 7 267,9 84,7 68,38 25317,3 4633,07 81,7 8 245,7 101,51 58,69 22422 4724,32 78,93 9 246,05 112,08 54,45 22499,33 5489,84 75,6 Bảng 4.6b: Ảnh hƣởng của pH đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm tƣơi sau khử khoáng pH Tổng hoạt tính Enzyme protease lúc 0 giờ (UI) Tổng hoạt tính Enzyme protease sau 4 giờ thủy phân (UI) Hoạt tính Enzyme protease giảm (%) Tổng hàm lƣợng protein lúc 0 giờ (µg) Tổng hàm lƣợng protein sau 4 giờ thủy phân (µg) Hàm lƣợng protein giảm (%) 3 235,7 154,05 34,64 18485 10111,3 45,3 4 232,38 118,82 48,87 21265,3 9390,76 55,84 5 236,9 96,89 59,10 25155,7 7521,55 70,1 6 234,023 69,69 70,22 27411 4761,29 82,63 7 252,31 38,56 84,72 29379 2776,5 90,55 8 251,91 50,98 79,76 26641,7 3103,2 88,35 9 234,43 50,48 78,47 20390,33 3059,4 85 62 Bảng 4.7a: Ảnh hƣởng của thời gian thủy phân đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm khô sau khử khoáng Thời gian thủy phân (giờ) Tổng hoạt tính Enzyme protease (UI) Hoạt tính Enzyme protease giảm (%) Tổng hàm lƣợng protein (µg) Hàm lƣợng protein giảm (%) 0 989,9 0 118326,67 0 1 801,324 19,05 57518,6 51,39 2 600,18 39,37 39024,14 67,02 3 445,94 54,95 23792,97 79,89 4 245,4 75,21 16878,93 85,74 5 336,9 65,97 16936,50 85,69 6 379 61,71 17157,40 85,50 Bảng 4.7b: Ảnh hƣởng của thời gian thủy phân đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm tƣơi sau khử khoáng Thời gian thủy phân (giờ) Tổng hoạt tính Enzyme protease (UI) Hoạt tính Enzyme protease giảm (%) Tổng hàm lƣợng protein (µg) Hàm lƣợng protein giảm (%) 0 978,4 0 120718,5 0 1 866,07 11,48 68990,62 42,85 2 568,84 41,86 49808,45 58,74 3 474,52 51,50 38006,08 68,52 4 358,12 63,40 19784,6 83,61 5 391,16 60,02 19364,85 83,96 6 399,48 59,17 19761,62 83,63