Khóa luận Tìm hiểu một số phương pháp phân tích vi sinh vật gây bệnh có trong thực phẩm

rite. - Thử nghiệm VP: Dùng que cấy vòng cấy vào các ống môi trường MR-VP một ít sinh khối từ khuẩn lạc thuần đã ủ 18 – 24 giờ trên môi trường KIA hoặc TSI. Ủ yên các ống môi trường này ở 37oC trong 24 – 48 giờ hoặc đến 10 ngày khi cần thiết. Thử nghiệm VP là (+) khi có màu đỏ trên bề mặt môi trường, là (-) khi bề mặt môi trường không đổi màu. - Thử nghiệm khả năng thủy phân tyrosine: cấy vi khuẩn vào thạch nghiêng Tyrosine, ủ ở 35oC trong 48 giờ. Sự xuất hiện của sinh khối, khuẩn lạc là chỉ thị tyrosine bị phân hủy. - Thử nghiệm với canh Lysozyme Broth: cấy vi khuẩn vào 2,5ml môi trường Nutrient Broth chứa 0,001% lysozyme. Thực hiện tương tự với môi trường Nutrient Broth không chứa lysozyme. Ủ ống nghiệm ở 35oC trong 24 giờ. Kiểm tra sự tăng trưởng trong môi trường chứa lysozyme và môi trường đối chứng. Ủ những ống âm tính thêm 24 giờ trước khi kết luận kết quả thử nghiệm. c. Các thử nghiệm phân biệt các loài trong Bacillus nhóm 1 Để phân biệt các loài khác nhau trong Bacillus nhóm 1 cần tiến hành bổ sung các thử nghiệm sau: - Thử nghiệm tính di động: dùng que cấy vòng cấy dịch 24 giờ nuôi cấy thẳng vào giữa môi trường kiểm tra di động cho B.cereus. Ủ ở 30oC, từ 18 – 24 giờ và kiểm tra dưới ánh đèn kiểu mọc dọc theo đường cấy. Loài di động mọc khuếch tán vào môi trường theo hướng xa đường cấy. Loài không di động chỉ mọc trong và dọc theo đường cấy. Bổ sung 0,2ml nước cất vô trùng vào bề mặt môi trường thạch nghiêng Nutrient Agar. Cấy huyền phù vi khuẩn vào. Ủ thạch nghiêng từ 6 – 8 giở ở 30oC. Nhỏ nước vô trùng lên phiến kính và đặt sinh khối vào. Quan sát ngay dưới kính hiển vi để kiểm tra sự di động. Hầu hết các chủng B.cereus và B.thuringiensis là di động, B.anthracis và hầu hết các chủng B.mycoides không di động. - Sự hình thành rễ giả: chạm nhẹ que cấy vòng mang huyền phù 24 giờ nuôi cấy lên giữa đĩa Nutrient Agar. Ủ ở 30oC trong 48 – 72 giờ. Kiểm tra sự phát triển của rễ giả, đặc trưng bởi việc tạo những khuẩn lạc có cấu trúc giống như rễ hoặc tóc mở rộng vài centimet từ vị trí cấy. B.cereus không tạo cấu trúc rễ giả, thường tạo những nhóm khuẩn lạc xù xì khác với cấu trúc rễ giả đặc trưng của B.mycoides. - Thử nghiệm làm tan máu: cấy chủng lên môi trường thạch máu Trypticase Soy. Ủ ở 35oC trong 24 giờ. B.cereus làm tan máu mạnh và tạo vùng tan máu hoàn toàn () 2 – 4mm xung quanh vùng phát triển. B.thuringiensis và B.mycoides cũng tan máu . B.anthracis thường không làm tan máu sau 24 giờ. - Sự tạo độc tố protein dạng tinh thể: cấy huyền phù tế bào 24 giờ lên ống thạch nghiêng Nutrient Agar, ủ 24 giờ ở 30oC, sau đó để ở nhiệt độ phòng 2 – 3 ngày. Thực hiện nhuộm bằng phẩm màu fuchsin. Quan sát dưới kính hiển vi những tinh thể độc tố hình tứ giác (dạng kim cương) được nhuộm màu tối nhỏ hơn bào tử. Tinh thể độc tố của B.Thuringiensis xuất hiện nhiều sau 3 – 4 ngày nuôi cấy nhưng không thể phát hiện được bằng kỹ thuật nhuộm cho đến khi bào tử nang vỡ ra. Do đó, nếu không quan sát được bào tử tự do, cần để thêm vài ngày ở nhiệt độ phòng rồi tiến hành kiểm tra lại. B.cereus và các Bacillus khác cùng nhóm không có tinh thể độc. d. Cách tính kết quả Tính số tế bào B.cereus trên 1g mẫu dựa vào số khuẩn lạc mọc ở mỗi độ pha loãng và hiệu chỉnh bằng tỷ lệ khẳng định (% khuẩn lạc được xác nhận là B.cereus). Ví dụ, số khuẩn lạc đếm được ở độ pha loãng 10-4 là 65, và có 4 trong số 5 khuẩn lạc được chọn xác nhận là B.cereus sau khi kiểm tra bằng các phản ứng sinh hóa. Như vậy, số tế bào B.cereus trong 1g thực phẩm là 65 4/5 10.000 10 = 5.200.000 (phải nhân với 10 vì chỉ có 0,1ml mẫu được sử dụng để trải đĩa). 2.5.4.2. Định lượng B.cereus bằng phương pháp MPN Phương pháp MPN được sử dụng để định lượng B.cereus trong những mẫu thực phẩm không được có B.cereus nhiều hơn 10 tế bào/g. Phương pháp này cũng được sử dụng để kiểm tra những mẫu thực phẩm có tinh bột khô mà phương pháp đếm khuẩn lạc không thích hợp. Cấy 1ml mẫu có độ pha loãng 10-1, 10-2 và 10-3 vào ống nghiệm chứa 10ml canh Trypticase Soy-Polymycin. Thực hiện 3 ống nghiệm lặp lại cho mỗi độ pha loãng (hệ 9 ống nghiệm). Ủ ở 30oC trong 48 2 giờ. Kết quả là (+) khi có sự tăng trưởng của B.cereus. Cấy ria từ các ống (+) lên môi trường thạch MYP. Ủ đĩa ở 30oC trong 24 – 48 giờ. Chọn những khuẩn lạc màu hồng eosin, lecithinase (+), cấy chuyển sang thạch nghiêng Nutrient Agar để tiến hành các phản ứng sinh hóa khẳng định B.cereus. Dựa vào bảng MPN tính trị số MPN/g mẫu dựa vào số ống (+) B.cereus được khẳng định: TSP (+), MYP (+), các thử nghiệm sinh hóa khác. 2.6. Clostridium 2.6.1. Tổng quan Giống Clostridium là các vi khuẩn gram dương, hình que, kỵ khí, sinh bào tử, phần lớn di động, có thể thủy giải saccharide và protein trong các hoạt động thu nhận năng lượng. Những loài thủy giải saccharide có thể lên men các loại đường polysaccharide tạo thành acetic acid, butyric và rượu. Nhiều loài có thể thủy giải protein và chuyển hóa không hoàn toàn các acid amin tạo thành mùi rất khó chịu trong sản phẩm. Hầu hết giống Clostridium thuộc nhóm ưa nhiệt vừa, tuy nhiên có một số loài thuộc nhóm ưa nhiệt và một số loài khác thuộc nhóm ưa lạnh. Các loài Clostridium hiện diện trong đất, một số loài trong nhóm này gây bệnh cho người và động vật, một số loài khác gây hư hỏng thực phẩm, khử sulphite thành sulphur tạo ra màu đen và gây mùi khó chịu. Các loài gây ngộ độc thực phẩm quan trọng là C.botulinum và C.perfringens. Ngoài ra, loài C.tetani là tác nhân gây bệnh uốn ván, một số loài khác như C.novyi, C.perfringens, C.septicum, C.sordellii… gây hoại tử cho mô bị nhiễm, gây biến chứng tại các vết thương nhưng cho đến nay chưa xác định được các đặc điểm bệnh lý. Đặc điểm quan trọng của một số loài thuộc giống Clostridium thường gặp là như sau: - C. botulinum là loài sống kỵ khí bắt buộc, chỉ tăng trưởng được trong môi trường trung tính, không có sự cạnh tranh với các vi sinh vật khác. Các dòng khác nhau trong loài này có các đặc điểm nuôi cấy khác nhau và 6 kiểu kháng nguyên được ký hiệu từ A – F. Kiểu kháng nguyên A, B và F có hoạt tính thủy giải protein tạo nên một vòng phân giải xung quanh khuẩn lạc trên môi trường Willis và Hobbs, trong khi đó kiểu kháng nguyên C, D, E không có các đặc tính này. Kiểu kháng nguyên A thường được tìm thấy trong các mẫu thịt trong khi đó kiểu E chỉ được phân lập từ các mẫu cá. - C.terani là loài kỵ khí bắt buộc, bị chết ngay khi tiếp xúc với không khí. Loài này có đặc điểm tạo khối kết tụ khi được nuôi cấy trong môi trường lỏng. Loài này được tìm thấy trong đất, trong phân các loài động vật và người, là loài gây bệnh uốn ván rất nguy hiểm. - C.perfringens là loại kỵ khí không bắt buộc, rất ít khí tạo bào tử trong các môi trường nuôi cấy nhân tạo, nhưng có thể quan sát được bào tử khi nuôi cấy trong môi trường Ellner, môi trường co bổ sung muối mật và bicarbonate hay quinoline. Loài này có sáu kiểu kháng nguyên được ký hiệu từ A – F. Kiểu kháng nguyên A thường gây hoại tử cho các vết thương và gây ngộ độc thực phẩm. 2.6.2. Nguyên tắc Mật độ vi khuẩn Clostridium được xác định bằng cách sử dụng môi trường có chứa ferri ammonium citrate và disodium sulphite, ủ ở 37oC trong 1 – 2 ngày. Nếu nghi ngờ có Clostridium ưa nhiệt có thể ủ thêm ở 50oC. Trên môi trường này các khuẩn lạc Clostridium có màu đen do phản ứng giữa ion sulphide (S2-) và ion sắt (Fe2+) có trong môi trường. 2.6.3. Môi trường và hóa chất - Pepton đệm Buffered Peptone Water (BPW). - Iron Sulphite Agar (ISA). - Perfringens Selective Agar (hay Shahidi Ferguson Perfringens, SFP). 2.6.4. Quy trình phân tích Mẫu được giải đông ở nhiệt độ không quá 45oC và được phân tích ngay sau khi giải đông. Cân 10g (hoặc 25g) mẫu trong túi PE vô trùng, bổ sung 90ml (hoặc 225ml) nước pepton đệm và đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu. Mẫu được tiếp tục pha loãng thập phân tùy mật độ hiện diện của Clostridium trong mẫu. Trước khi cấy, mẫu được xử lý nhiệt ở 70 – 80oC trong 20 phút để diệt bớt tế bào sinh dưỡng của các vi sinh vật khác. Cấy vào đĩa vô trùng 1ml dịch mẫu đã được pha loãng thích hợp vào một đĩa petri vô trùng. Đổ 15ml môi trường ISA hoặc SFP Agar đã được ủ ấm ở 45oC vào đĩa, lắc đều. Sau khi môi trường đã đông, đổ thêm lên trên bề mặt khoảng 10ml ISA hoặc SFP Agar. Một phương pháp khác là cho vào một ống nghiệm vô trùng 1ml dịch mẫu ở nồng độ thích hợp, thêm 12ml ISA hoặc SFP Agar đã được ủ ấm ở 45oC vào ống, trộn đều mẫu. Sau khi môi trường đã đông, đổ thêm lên trên bề mặt 2 – 3ml ISA hoặc SFP Agar. Đĩa hoặc ống nghiệm đã cấy mẫu được ủ ở 37oC trong 24 – 48 giờ trong các bình kỵ khí. Nếu nghi ngờ Clostridium chịu nhiệt, thực hiện ủ song song ở 37oC và 50oC. Thông thường, việc đọc kết quả trên đĩa là dễ hơn trong ống nghiệm. ISA là môi trường không chọn lọc nên các loài vi khuẩn sinh H2S khác không phải là Clostridium cũng tăng trưởng được và tạo khuẩn lạc màu đen trên môi trường này. Để khẳng định khuẩn lạc là Clostridium cần thực hiện thêm những quy trình tiêu chuẩn để giúp khẳng định kết quả. 2.6.5. Báo cáo kết quả Đếm tất cả các khuẩn lạc đen, hoặc có thể bao quanh bởi vòng đen. Mật độ Clostridium trong mẫu được tính từ số khuẩn lạc đếm được nhân với hệ số pha loãng mẫu và được trình bày ở dạng CFU/g hay CFU/ml sản phẩm. 2.7. Coliform và E.Coli 2.7.1. Tổng quan Bao gồm một số vi khuẩn Gram âm, không tạo bào tử, hiếu khí hoặc kỵ khí không bắt buộc, có khả năng lên men đường lactoza, sinh hơi trong vòng 48 giờ ở nhiệt độ nuôi cấy thích hợp. Coliform ưa nhiệt (coliform phân): lên men lactoza ở nhiệt độ 44oC. E.Coli thuộc nhóm Coliform ưa nhiệt và là loại coliform rất bền với phenol 0,085 và sinh indol ở nhiệt độ 42 – 44oC. Xác định lượng Coliform và E.coli cho biết mức độ ô nhiễm và tình trạng vệ sinh trong phân xưởng sản xuất. 2.7.2. Định lượng Coliforms, Coliforms chịu nhiệt, Coliforms phân và E.coli bằng phương pháp MPN 2.7.2.1. Nguyên tắc Số lượng Coliforms, Coliforms chịu nhiệt, Coliforms phân và E.coli trong mẫu thực phẩm chứa mật độ thấp của nhóm vi khuẩn này có thể được xác định bằng phương pháp MPN (Most Probable Number). Phương pháp này dựa vào nguyên tắc mẫu được pha loãng thành một dãy thập phân (hai nồng độ kế tiếp nhau khác nhau 10 lần); 3 hoặc 5 mẫu có độ pha loãng thập phân liên tiếp được ủ trong ống nghiệm chứa môi trường thích hợp có ống bẫy khí Durham. Mỗi nồng độ pha loãng được ủ từ 3 đến 5 ống lặp lại. Theo dõi sự sinh hơi và đổi màu để tính sự hiện diện trong từng ống thử nghiệm; đây là các ống dương tính. Ghi nhận số ống nghiệm cho phản ứng dương tính ở mỗi nồng độ pha loãng và dựa vào bảng tính MPN để suy ra số lượng nhóm vi sinh vật tương ứng hiện diện trong 1g (hoặc 1ml) mẫu ban đầu. 2.7.2.2. Môi trường và hóa chất - Môi trường lỏng Lauryl Sulphate Broth LSB (canh Lauryl Sulphate). - Môi trường lỏng Brilliant Green Lactose Bile Salt (canh BGBL). - Môi trường lỏng E.coli (E.coli medium, canh EC). Các môi trường lỏng trên được chuẩn bị trong các ống nghiệm chứa ống Durham úp ngược. Sau khi khử trùng, chỉ sử dụng các ống nghiệm không có bọt khí bên trong ống Durham. - Canh Tryptone. - Môi trường rắn Simmon Citrate Agar (thạch Simmon Citrate). - Dung dịch nước muối pepton SPW (Saline Pepton Water). - Thuốc thử Kovac’s. - Thuốc thử Methyl Red. - Thuốc thử -napthol. 2.7.2.3. Quy trình phân tích Chuẩn bị đồng nhất mẫu hoặc pha loãng mẫu để có dịch mẫu có độ pha loãng 10-1. a. Định lượng Coliforms Tuần tự cấy 1ml dịch mẫu đã pha loãng 10-1 vào 3 ống nghiệm giống nhau, mỗi ống chứa 10ml canh LSB. Thực hiện tương tự với dịch mẫu đã pha loãng 10-2 và 10-3. Đây là trường hợp xác định MPN bằng hệ 3 dãy nồng độ và 3 ống nghiệm lặp lại (hệ 3 3 hay 9 ống nghiệm). Nếu nghi ngờ số lượng Coliforms trong mẫu quá cao, phải sử dụng các mẫu có bậc pha loãng cao hơn. Ủ các ống nghiệm ở 37oC trong 48 giờ. Ghi nhận số ống có sinh hơi. Dùng que cấy vòng (khuyên cấy) cấy chuyển dịch mẫu từ các ống LSB (+) sang các ống có chứa canh BGBL và ủ ở 37oC 1oC trong 48 giờ. Ghi nhận số ống cho kết quả (+) (có sinh hơi) ứng với mỗi độ pha loãng. b. Định lượng Coliforms chịu nhiệt Dùng que cấy vòng chuyển một vòng dịch mẫu từ các ống canh LSB (+) sang môi trường canh EC ủ ở 44,5 0,2oC trong 24 giờ. Đếm số lượng các ống cho kết quả (+) (sinh hơi) ở mỗi độ pha loãng. c. Định lượng Coliforms phân Dùng que cấy vòng ria dịch mẫu từ các ống (+) trên môi trường dịch EC sang môi trường thạch đĩa EMB. Ủ các đĩa này ở 37oC trong 24 giờ. Các khuẩn lạc tròn, dẹt hình đĩa và có ánh kim tím là khuẩn lạc của Coliforms phân hay E.coli giả định. Chọn khuẩn lạc đường kính lớn hơn 1mm và cấy chuyển vào canh Trypton, ủ ở 44,5 0,2oC trong 24 giờ. Nhỏ thuốc thử Kovac’s vào các ống nghiệm. Ống nghiệm có sự xuất hiện của màu đỏ trong môi trường trong vài phút là ống (+). Thực hiện tương tự cho tât cả các ống (+) trên môi trường EC. Ghi nhận số lượng các ống cho kết quả (+) trên môi trường Trypton tương ứng với mỗi độ pha loãng. d. Định lượng E.coli Trước tiên thực hiện tương tự như trường hợp định lượng Coliforms phân như trên. Dùng que cấy vòng ria dịch mẫu từ các ống (+) trên môi trường canh EC sang môi trường thạch đĩa EMB. Ủ các đĩa này ở 37oC trong 24 giờ để tìm các khuẩn lạc E.coli giả định (tròn, dẹt hình đĩa và có ánh kim tím). Chọn khuẩn lạc đường kính lớn hơn 1mm và cấy vào các môi trường MRVP, Simmon Citrate Agar để thực hiện các thử nghiệm IMViC. Khuẩn lạc E.coli giả định cho kết quả thử nghiệm IMViC tuần tự là + + - - chính là E.coli. Ống nghiệm cho kết quả (+) trong môi trường EC và khuẩn lạc E.coli giả định trên môi trường EMB cho kết thử nghiệm IMViC như trên là ống nghiệm có E.coli (+). Thực hiện tương tự cho tất cả các ống nghiệm cho kết quả (+) trong môi trường EC và tạo được khuẩn lạc E.coli giả định trên môi trường EMB. Ghi nhận số lượng các ống nghiệm có E.coli (+) ở mỗi độ pha loãng của mẫu. 2.7.2.4. Cách đọc kết quả Ở tất cả các trường hợp nêu trên, từ số lượng các ống nghiệm có E.coli (+) ở mỗi độ pha loãng của mẫu, dùng bảng MPN thích hợp (bảng 3 3 tức 9 ống nghiệm) để tính ra mật độ vi sinh vật trong mẫu và biểu diễn dưới dạng trị số MPN/g hay MPN/ml mẫu ban đầu chưa pha loãng. 2.7.3. Định lượng Coliforms, Coliform phân bằng phương pháp đếm khuẩn lạc 2.7.3.1. Nguyên tắc Mẫu đã được đồng nhất hóa được cấy một lượng nhất định lên môi trường thạch chọn lọc thích hợp chứa lactose. Đếm số khuẩn lạc lên men lactose và sinh acid sau khi ủ ở 37 1oC trong 24 – 48 giờ. Ngoài lactose, môi trường chọn lọc cho Coliforms còn chứa muối mật ức chế vi khuẩn gram dương và chất chỉ thị pH như aeutral red, crystal violet. Trên môi trường này khuẩn lạc Colifoms có màu đỏ đến màu đỏ đậm, đường kính > 0,5 mm, xung quanh khuẩn lạc có vùng tủa của muối mật. Việc khẳng định được thực hiện bằng cách nuôi cấy trên môi trường canh chọn lọc như BGBL. Để định lượng Coliforms phân, thực hiện tương tự nhưng thay đổi nhiệt độ ủ là 44oC. Mật độ Coliforms hay Coliforms phân được tính dựa trên số lượng khuẩn lạc điển hình đếm được, tỉ lệ khẳng định và độ pha loãng mẫu trước khi cấy vào đĩa. Để phát hiện được bộ phận tế bào Coliforms bị tổn thương hay bị giảm sức sống do quá trình chế biến hay bảo quản thực phẩm, bộ phận này có thể không tăng trưởng được trong môi trường chọn lọc, trước tiên mẫu được cấy vào một môi trường không chọn lọc như TSA, trước khi bổ sung môi trường chọn lọc. 2.7.3.2. Môi trường và hóa chất - Môi trường Tryptone Soya Agar (TSA) được chuẩn bị trong các bình hay chai thủy tinh, hấp khử trùng và bảo quản ở 4 – 8oC. Trước khi sử dụng, môi trường được đun chảy và làm nguội ở 45oC trong bể điều nhiệt. - Violet Red Bile Agar (VRB) được chuẩn bị vô trùng trong các chai thủy tinh, đun chảy và làm nguội ở nhiệt độ 45oC trong bể điều nhiệt trước khi sử dụng. Có thể sử dụng môi trường Desoxycholate Agar thay cho VRB. - Môi trường canh Brilliant Green Lactose Broth (BGBL) được phân phối 10ml vào mỗi ống nghiệm vô trùng chứa một ống Durham úp ngược. Hấp khử trùng. Sau khi hấp kiểm tra các ống để đảm bảo không có bọt khí trong ống Durham. - Môi trường canh EC Broth được chuẩn bị tương tự như trường hợp môi trường BGBL. - Môi trường canh Trypton Broth được phân phối 5ml vào mỗi ống nghiệm, hấp khử trùng. - Thuốc thử Kovac’s hay Indol. 2.7.3.3. Quy trình phân tích Mẫu được đồng nhất hóa và pha loãng tương tự như phần định lượng tổng số vi khuẩn hiếu khí sao cho chứa <100 tế bào Coliforms trong 1ml dung dịch pha loãng. Chuyển 1 ml dịch pha loãng mẫu đã chọn vào đĩa petri. Bổ sung vào mỗi đĩa đã cấy mẫu khoảng 5ml môi trường TSA đã được đun chảy và ổn định trong bể điều nhiệt ở 45oC. Lắc tròn đĩa petri xuôi và ngược chiều kim đồng hồ, mỗi chiều 3 – 5 lần để trộn đều dịch mẫu với môi trường. Để ở nhiệt độ phòng trong 1 – 2 giờ để hồi phục các tế bào bị tổn thương. Bổ sung vào mỗi đĩa 10 – 15ml môi trường thạch VRB ở nhiệt độ 45oC lên trên môi trường TSA. Chờ cho môi trường trong đĩa đông đặc, lật ngược đĩa và ủ ở 37 1oC trong 24 – 48 giờ. Thực hiện tương tự trên mẫu ở 2 nồng độ pha loãng liên tiếp sao cho mỗi đĩa sẽ xuất hiện từ 10 – 100 khuẩn lạc và lặp lại ít nhất 2 đĩa ứng với mỗi nồng độ pha loãng. - Thử nghiệm khẳng định Coliforms: Trong trường hợp mẫu có chứa các nguồn carbon khác không phải lactose, để tránh các trường hợp vi sinh vật sử dụng các nguồn carbon trong mẫu để lên men và tạo khuẩn lạc có hình dạng tương tự Coliforms cần thực hiện thêm bước khẳng định như sau: Chọn ít nhất 5 khuẩn lạc nghi ngờ, dùng que cấy vòng cấy chuyển sang các ống nghiệm chứa môi trường BGBL (trường hợp khẳng định Coliforms tổng số) hoặc môi trường EC (trường hợp khẳng định Coliforms phân). Ủ các ống BGBL ở 37 1oC và các ống EC ở 44oC trong 24 – 48 giờ. Kết quả khẳng định là (+) khi vi khuẩn tăng trưởng làm đục môi trường và sinh hơi trong ống Durham. Tính tỉ lệ khẳng định là tỉ số giữa số khuẩn lạc cho kết quả (+) với số khuẩn lạc được dùng trong thử nghiệm khẳng định. Ngoài ra, trường hợp thử nghiệm khẳng định Coliforms phân, các khuẩn lạc cho kết quả (+) trên EC cần được thực hiện thử nghiệm indol ở 44oC. Thử nghiệm khẳng định Coliforms phân chỉ được xem là (+) khi vừa là (+) trên môi trường EC vừa là (+) trên thử nghiệm Indol. 2.7.3.4. Cách tính kết quả Dựa vào số khuẩn lạc đếm được và tỉ lệ khẳng định, tính mật độ của Coliforms và Coliforms phân theo công thức sau: A (CFU/g hay CFU/ml) = R N: tổng số khuẩn lạc đếm được. ni: số đĩa có số khuẩn lạc được chọn tại mỗi độ pha loãng. v: dung tích mẫu (ml) cấy vào mỗi đĩa. fi: độ pha loãng có số khuẩn lạc được chọn tại các đĩa đếm. R: tỉ lệ khẳng định. 2.7.4. Định lượng E.coli bằng phương pháp đếm khuẩn lạc 2.7.4.1. Nguyên tắc Mẫu đã được đồng nhất hóa được cấy một lượng nhất định lên môi trường thạch chọn lọc thích hợp chứa lactose, ủ ở 44oC trong 24 giờ, đếm các khuẩn lạc có hình dạng đặc trưng của Coliforms. Khẳng định các khuẩn lạc đã đếm là E.coli bằng các thử nghiệm IMViC. 2.7.4.2. Môi trường và hóa chất - Môi trường canh Tryptone Soya Agar (TSA) và môi trường thạch Violet Red Bile Agar (VRB) được chuẩn bị tương tự phần định lượng Coliforms. - Môi trường canh Escherichia coli Broth (EC Broth) được phân phối 10ml trong mỗi ống nghiệm chứa ống Durham úp ngược, hấp khử trùng để nguội và kiểm tra không có sự hiện diện của bọt khí trong ống Durham. Các ống EC này được bảo quản ở 2 – 8oC cho đến khi sử dụng. - Môi trường canh Lactose Tryptone Lauryl Sulphate Broth (LST Broth) được chuẩn bị tương tự như môi trường canh EC. - Môi trường canh Tryptone Broth được chuẩn bị tương tự phần định lượng Coliforms. - Môi trường canh MR-VP Broth được phân phối 5ml vào mỗi ống nghiệm, hấp khử trùng để nguội và bảo quản ở 2 – 8oC cho đến khi sử dụng. - Môi trường thạch Simmon Citrate được chuẩn bị dưới dạng các ống thạch nghiêng có màu xanh lục. - Thuốc thử Kovac’s. 2.7.4.3. Quy trình phân tích Mẫu được đồng nhất, pha loãng và định lượng tương tự như phần Coliforms phân với bước khẳng định được tiến hành như sau: Chọn 5 khuẩn lạc nghi ngờ, dùng que cấy vòng cấy chuyển sang môi trường canh EC, ủ ở 44 0,5oC trong 24 giờ. Chọn các ống cho kết quả (+) (sinh hơi) và dùng que cấy vòng cấy chuyền sang các môi trường sau: canh Tryptone, canh MR-VP, thạch Simmon Citrate. Ủ các môi trường trên ở 44 0,5 oC trong 24 giờ. Thực hiện thử nghiệm Indol, Methyl Red, Voges Proskauer, Citrate. Ghi nhận số khuẩn lạc cho thử nghiệm khẳng định E.coli (+) (IMViC là + + - -). 2.7.4.4. Cách tính kết quả Tính tỉ lệ khẳng định và tính mật độ E.coli (CFU/ml hay CFU/mg) theo công thức tương tự ở trên. 2.8. Tổng nấm men nấm mốc 2.8.1. Tổng quan Nấm men và nấm mốc là nhóm vi sinh vật rất đa dạng, cho đến nay có hơn 400.000 loài nấm men và nấm mốc đã được mô tả. Đây là nhóm vi sinh vật nhân thật, có vách tế bào là lớp vỏ chitin, có nhân và các bào quan khác. Tất cả các loài men và mốc đều thuộc nhóm vi sinh vật dị dưỡng, chúng cần nguồn carbon hữu cơ để cung cấp năng lượng từ môi trường bên ngoài. Vì thế vi sinh vật này thường xuyên được phân lập từ thực phẩm hay các nguồn giàu dinh dưỡng khác. Có thể phân biệt nấm men và nấm mốc theo khái niệm đơn giản như sau: nấm mốc là vi nấm dạng sợi, sinh sản bằng bào tử hoặc khuẩn ty, nấm men là những tế bào đơn tính phát triển theo kiều nảy chồi, thỉnh thoảng có thể tồn tại ở dạng khuẩn ty giả trong đó các tế bào kết nhau thành chuỗi. Đơn vị hình thành khuẩn lạc của nấm mốc và nấm men là nấm để tạo nên một khuẩn lạc khi nuôi cấy trong môi trường. Mầm có thể là một bào tử, một tế bào hay một đoạn khuẩn ty. Quá trình tăng trưởng của nấm men và nấm mốc phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố từ môi trường. Hầu hết nấm mốc, nấm men đều thuộc nhóm vi sinh vật ưa mát, nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển của chúng trong khoảng 20 – 28oC, một số ít trong nhóm này ưa lạnh hay ưa nóng. Nước hoạt tính cũng là một nhân tố ảnh hưởng rất quan trọng đến tăng trưởng. Hầu hết các loài nấm mốc và nấm men phát triển tốt trong cơ chất có nước hoạt tính khoảng 85% hay lớn hơn, một số ít loài có thể tăng trưởng trong cơ chất có nước hoạt tính thấp hơn khoảng 60 – 70%. Nấm mốc và nấm men tăng trưởng được trong vùng pH từ 2 – 9, trong đó pH thích hợp nhất nằm trong khoảng 4 – 6,5. Hầu hết nấm mốc, nấm men đều thuộc nhóm hiếu khí bắt buộc, một số có thể phát triển trong điều kiện vi hiếu khí. Một số loài có thể tiếp nhận oxy nguyên tử từ cơ chất của chúng, nhưng dù ở dạng nào, oxy vẫn là nguyên tố cần thiết cho quá trình phát triển của nấm mốc và nấm men. Trong thực phẩm, nấm mốc và nấm men hiện diện có thể tăng trưởng làm thay đổi màu của thực phẩm, làm phát sinh mùi hay vị lạ, làm hư hỏng hay thay đổi cơ cấu của thực phẩm, một số có thể tạo độc tố gây ngộ độc thực phẩm. 2.8.2. Nguyên tắc Mật độ nấm mốc, nấm men trong mẫu được xác định chung dưới dạng tổng nấm mốc nấm men bằng kỹ thuật pha loãng, trải và đếm khuẩn lạc trên môi trường Dichloran Glycerol Agar (DG18) hay Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol Agar (DRBC). Môi trường DG18 được sử dụng cho các loại mẫu thực phẩm có hàm lượng nước thấp như các loại thực phẩm khô: gạo, ngũ cốc, tiêu, các loại thực phẩm có dầu, có hàm lượng đường hay muối cao. Môi trường DRBC được sử dụng cho các mẫu có hàm lượng nước cao như sữa và các sản phẩm của sữa, các loại rau quả và trái cây tươi, các loại đồ hộp… Đối với mẫu có mật độ nấm mốc thấp, ví dụ như mỹ phẩm, môi trường được sử dụng là môi trường Malt Extract Agar (MEA) hay Potato Dextrose Agar (PDA) chứa 40ppm chloramphenicol hay chlotetracyline. 2.8.3. Môi trường và hóa chất - Dung dịch pha loãng (nước pepton 1%). - Môi trường thạch Dichloran Glycerol Agar (DG18). - Môi trường thạch Dichloran Rose Bengal Chloramplenicol Agar (DBRC). - Môi trường thạch Malt Extract Agar (MEA). - Môi trường thạch Potato Dextrose Agar (PDA). - Môi trường thạch Sabouraud Dextrose Agar (SDA). - Môi trường thạch Sabouraud Dextrose Broth (SDB). Các loại môi trường thạch được chuẩn bị trong các đĩa petri, làm khô bề mặt trong điều kiện vô trùng, tránh ánh sáng trước khi sử dụng. Môi trường thạch Sabouraud Dextrose Agar còn được chuẩn bị dưới dạng các ống thạch nghiêng. 2.8.4. Quy trình phân tích định tính Đối với mẫu có nguy cơ nhiễm và mật độ nhiễm nấm mốc quá thấp việc phân tích thường được thực hiện một cách định tính theo quy trình như sau: Mẫu được pha loãng 10-1 và đồng nhất trong môi trường SDB. Dịch đồng nhất được ủ ở 30oC, theo dõi từng ngày đến 7 ngày. Các khuẩn lạc nấm mốc xuất hiện trên các đĩa môi trường này được cấy chuyền lên bề mặt ống thạch nghiêng SDA để định danh khi cần thiết. 2.8.5. Quy trình phân tích định lượng Cân 10g mẫu trong túi PE vô trùng, bổ sung 90ml dung dịch pha loãng. Trường hợp mẫu dạng khô, ngâm mẫu trong dung dịch khoảng 30 phút trước khi đồng nhất mẫu. Mẫu được đồng nhất bằng máy dập mẫu trong 2 phút và được pha loãng thành các dãy nồng độ thập phân liên tiếp thích hợp. Hút vô trùng 0,1ml dịch mẫu lên các đĩa môi trường DBRC hoặc DG18. Nếu mật độ nấm men và nấm mốc trong mẫu thấp, có thể cấy 1ml mẫu. Dùng que gạt thủy tinh trải dịch mẫu đều trên bề mặt đĩa môi trường cho đến khô. Đặt ngửa đĩa trong bao nylon, để hở miệng bao, ủ ở nhiệt độ 25oC trong 5 – 7 ngày. Đĩa được đặt ngửa để tạo độ ẩm thích hợp cho sự phát triển nấm men mốc và hạn chế làm khô thạch. Thực hiện ba đĩa cho mỗi nồng độ pha loãng. Đếm và tính số khuẩn lạc nấm mốc và nấm men trên tất cả các đĩa cấy. Khi cần thiết phải quan sát bằng kính hiển vi soi nổi hay kính lúp để phân biệt khuẩn lạc nấm men hay nấm mốc. Kết quả được ghi nhận bằng đơn vị CFU/g. Nếu có yêu cầu phân loại hay định danh các loài nghi ngờ sinh độc tố, các khuẩn lạc nấm mốc được cấy chuyền vào trong các ống thạch nghiêng SDA để gởi đến các phòng thí nghiệm chuyên định danh và phân loại nấm. Cần lưu ý rằng trong thời gian ủ nấm mốc có thể tạo bào tử và phát tán vào trong môi trường nuôi cấy tạo nên các khuẩn lạc mới. Để hạn chế hiện tượng này, trong suốt thời gian ủ, không được chạm tay hoặc di chuyển các đĩa cho đến khi đếm kết quả. Mặt khác, khi tiến hành đếm khuẩn lạc cần hạn chế việc mở đĩa để hạn chế sự phát tán của bào tử vào trong không khí, gây nhiễm vào trong mẫu hay môi trường nuôi cấy khác. CHƯƠNG 3: CÁC PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM VI SINH VẬT KHÔNG TRUYỀN THỐNG 3.1. Phương pháp phát quang sinh học ATP trong giám sát vệ sinh Phân tử adenosine triphosphate (ATP) được tìm thấy trong tất cả các tế bào sống (tế bào Eukaryote và Prokaryote) nên sự phát hiện ATP là dấu hiệu để nhận biết vật chất sống đang tồn tại. ATP có thể được phát hiện một cách nhanh chóng bởi lượng ánh sáng phát ra thông qua sự kết hợp với enzyme luciferase nhờ một máy đo ánh sáng. Kỹ thuật này có thể phát hiện được 1pg ATP (10-12g), tương ứng với khoảng 1000 tế bào vi khuẩn (10-15g ATP/tế bào). Độ nhạy này có được khi sử dụng với những hóa chất thương mại (thường đắt tiền). Sự phân tích sẽ diễn ra chỉ trong vài phút và vì thế phương pháp này được xem là nhanh hơn và thuận lợi hơn so với phương pháp đếm khuẩn lạc. Việc dùng phương pháp đo hàm lượng ATP để xác định rõ số vi sinh vật đang hiện diện đã được biết đến vào năm 1960. Tuy nhiên, phương pháp này đòi hỏi nhiều sự cải tiến trong việc thiết kế máy đo lượng ánh sáng phát ra (giảm giá thành và có thể mang đi được) và những hóa chất ổn định sự phát sáng. Phương pháp này được ứng dụng trong 3 lĩnh vực: giám sát vệ sinh, kiểm tra những loại chất lỏng như nước rửa làm sạch hệ thống, đánh giá chất lượng vi sinh của thực phẩm. Để đánh giá chất lượng vi sinh của thực phẩm bằng ATP thì ATP của vi sinh vật cần phải được tách chiết ra khỏi tế bào vi sinh vật và được định lượng dựa vào cường độ ánh sáng phát ra. Phản ứng phát sáng của đom đóm (Photinus pyralis) là có hiệu quả nhất, được biết đến như phản ứng phát sáng sinh học để xác định hàm lượng ATP. Phản ứng này đòi hỏi D-luciferin và ion Mg2+ để hoạt động, đây là thành phần đắt tiền trong bộ kit thương mại. Chất dioxetanone thì được hình thành bởi sự tạo phức hợp của luciferase với oxy và phức hợp Mg-ATP. Sau đó, ánh sáng vàng-xanh (bước sóng cao nhất là 562nm) được phát ra. Để kiểm tra tình trạng vệ sinh bề mặt thiết bị trong sản xuất, chế biến thực phẩm, tổng số vi khuẩn hiếu khí trong thành phẩm, người ta xác định tổng lượng ATP của mẫu. Tổng hàm lượng ATP này bao gồm hàm lượng ATP của tế bào eukaryote và ATP của tế bào vi sinh vật. Thông thường ATP không có nguồn gốc là tế bào vi sinh vật thì được tách chiết bởi những chất tẩy không ion ví dụ như Triton X-100. ATP này sau khi được tách chiết khỏi tế bào sẽ được thủy phân bằng cách xử lý với enzyme ATPase trong vòng 5 phút. Tiếp theo, ATP của tế bào vi sinh vật sẽ được ly trích bằng chất trichloacetic acid (5%). Ánh sáng phát ra bởi phản ứng phát sáng được đo bằng các loại máy đo ánh sáng đo được cường độ ánh sáng thấp. Ngày nay sự phát quang sinh học đã được sử dụng khá rộng rãi để đánh giá chất lượng vệ sinh bề mặt thiết bị sử dụng trong quá trình sản xuất, chế biến, đánh giá chất lượng thực phẩm, mỹ phẩm. Quy trình thực hiện rất đơn giản, cho kết quả rất nhanh chóng trong vài phút và có thể dễ dàng tự động hóa. Nguyên tắc chung của quy trình này là như sau: Mẫu được thu bằng cách dùng que bông vô trùng quẹt một diện tích nhất định trên bề mặt dụng cụ, thiết bị. Sau đó que bông được cho vào dung dịch ly trích ATP, xử lý với ATPase và cho phản ứng phát sáng. Gần đây nhiều hệ thống phát hiện được thiết kế, chế tạo chứa sẵn những hóa chất nằm trong dụng cụ quẹt mẫu bằng tay và sự phát sáng xảy ra ở phía đầu của dụng cụ quẹt mẫu, sau đó dụng cụ này được đặt trong máy đo lượng ánh sáng phát ra. Để biết mật độ của vi sinh vật, so sánh trị số ánh sáng đo được với một đường chuẩn tương quan giữa lượng ánh sáng phát ra và mật độ tế bào vi sinh vật đã được biết trước. 3.2. Phương pháp ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) Những tiến bộ kỹ thuật trong vài thập niên vừa qua thúc đẩy sự phát triển của nhiều kỹ thuật chẩn đoán huyết thanh nhanh nhạy, chính xác các bệnh truyền nhiễm. Mặt khác, sự phát triển của những kỹ thuật tự động cho phép đơn giản hóa các thao tác thực hiện. Nguyên tắc của phương pháp miễn dịch là phản ứng kết hợp giữa một tế bào (kháng nguyên) với một kháng thể đặc hiệu. Tín hiệu của phản ứng miễn dịch có thể nhận biết thông qua sự ngưng tủa hay kết dính của kháng nguyên – kháng thể hoặc bằng cách sử dụng những kháng thể đã được đánh dấu (bằng chất nhuộm phát huỳnh quang, đồng vị phóng xạ hay enzyme). Trong số các phương pháp phân tích miễn dịch, phương pháp hấp phụ miễn dịch dùng enzyme (enzyme-linked immunosorbent assay – ELISA hay enzyme immunosorbent assay – EIA) được quan tâm nhiều do có tính đơn giản và hiệu quả cao. Phương pháp này có thể được sử dụng cho hầu hết các loại kháng nguyên với độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Nguyên tắc kỹ thuật ELISA là sử dụng kháng thể đơn dòng phủ bên ngoài những đĩa giếng (microplate). Nếu có sự hiện diện của kháng nguyên mục tiêu trong mẫu, kháng nguyên này sẽ được giữ lại trên bề mặt giếng. Các kháng nguyên này sẽ được phát hiện bằng cách sử dụng kháng thể thứ cấp có gắn với enzyme như horseradish peroxidase hay alkaline phosphatase. Khi bổ sung một cơ chất đặc hiệu của enzyme vào giếng, enzyme xúc tác phản ứng thủy phân cơ chất để tạo ra các sản phẩm có màu hay phát sáng. Bằng cách theo dõi sự đổi màu, có thể phát hiện sự hiện diện và định lượng lượng kháng nguyên. ELISA đã được sử dụng rộng rãi dưới dạng các bộ hóa chất (kit) thương mại (phát hiện Salmonella, thuốc trừ sâu…) và có thể được cải tiến để tự động hóa. ELISA có thể sử dụng phát hiện và định lượng vi sinh trong thực phẩm trong thời gian vài giờ sau khi tăng sinh. Kỹ thuật này có độ nhạy phát hiện khoảng 106 CFU/ml (một số báo cáo cho rằng giới hạn này có thể đạt được 104). Tuy nhiên trong phương pháp này vẫn cần thực hiện bước tăng sinh và tăng sinh chọn lọc trước khi thực hiện các phản ứng miễn dịch. Transin Salmonella (Diffchamb AB, Sweden) là một bộ kit phát hiện nhanh Salmonella spp dựa trên nguyên tắc ELISA sandwich. Khi mẫu được cho vào giếng, nếu có sự hiện diện của vi sinh vật mục tiêu, kháng nguyên tiên mao của vi sinh vật sẽ tạo phức hợp với kháng thể cố định trên giếng và kháng thể tự do có gắn enzyme peroxidase tạo thành một phức hợp kép (sandwich). Sau đó, các kháng thể gắn enzyme ở dạng tự do không tạo phức hợp sandwich sẽ bị rửa khỏi phản ứng. Phức hợp sandwich được phát hiện nhờ sự bổ sung cơ chất của phản ứng (ure peroxide và tetramethylbenzidine). Enzyme peroxidase sẽ thủy phân cơ chất tạo sản phẩm có màu xanh dương. Phản ứng được kết thúc bằng cách bất hoạt enzyme bằng dung dịch kết thúc làm acid hóa môi trường và chuyển màu xanh thành màu vàng. Sự hình thành màu vàng chứng minh sự hiện diện của kháng nguyên mục tiêu hay sự hiện diện của vi sinh vật mục tiêu và mật độ của vi sinh vật có thể được xác định bằng cách đo cường độ bằng máy so màu. Một ví dụ khác về sản phẩm ELISA thương mại là quy trình phát hiện độc tố đường ruột và định danh độc tố (loại A đến E) của Staphylococci trong thực phẩm. Quy trình này có thời gian ngắn (4 giờ), nhạy (1 ng/ml hay mg) và có thể phát hiện đồng thời sự hiện diện của nhiều loại độc tố của Staphylococcus (nhưng không thể phân biệt các loại độc tố). Phản ứng ELISA được thực hiện dựa trên kỹ thuật “sandwich”. Bộ kit này có tên thương mại là TECRATM (TECRA Diagnostic, Roseville, 2069, Australia), là sản phẩm đầu tiên được chứng nhận bởi AOAC. 3.3. Phương pháp lai phân tử (Hybridization) Từ những năm 1980, nhiều nghiên cứu được tiến hành nhằm ứng dụng các thành tựu của kỹ thuật di truyền, sinh học phân tử vào lĩnh vực thực phẩm. Hiện nay, nhiều hệ thống đã được thiết lập dựa trên DNA để định lượng vi sinh vật và độc tố. Tuy nhiên, chỉ có phương pháp lai phân tử (hay còn được gọi là phương pháp mẫu dò, probes), phương pháp PCR (polymerase chain reaction) là được thương mại hóa dưới dạng các bộ kit phát hiện vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm. Phương pháp sử dụng mẫu dò để phát hiện vi sinh vật trong thực phẩm được dựa trên sự phát hiện một đoạn gen đặc trưng của vi sinh vật. Cơ sở của việc sử dụng mẫu dò là quá trình lai phân tử. Quá trình này bao gồm sự tách rời hai mạch đôi của chuỗi xoắn kép DNA khi nhiệt độ vượt quá nhiệt độ nóng chảy (Tm) của phân tử DNA và sự tái bắt cặp giữa các đoạn DNA có trình tự nucleotide bổ sung khi nhiệt độ trở lại bình thường. Một trong hai mạch DNA bổ sung (gọi là DNA mục tiêu là DNA của tế bào vi sinh vật) được cố định trên một giá thể rắn hoặc nằm ngay trên tế bào hay mô. Sự lai phân tử xảy ra khi đoạn mồi có trình tự nucleotide bổ sung với một vùng trình tự trên DNA mục tiêu gặp nhau do chuyển động nhiệt và khi nhiệt độ môi trường thấp hơn Tm ít nhất vài độ. Sự lai phân tử còn có thể xảy ra giữa DNA và RNA. Quá trình lai phân tử chịu ảnh hưởng rất nhiều bởi các yếu tố nồng độ DNA trong môi trường, nhiệt độ và thời gian phản ứng, kích thước các trình tự lai và lực ion của môi trường. Một ví dụ về hệ thống phát hiện bằng mẫu dò là hệ thống Gen-trak (Framingham, USA). Hệ thống này sử dụng que thử với mẫu dò để phát hiện Listeria trong mẫu bơ sữa và mẫu môi trường. Mẫu dò là những đoạn oligomer DNA đánh dấu bằng hóa chất phát quang. Quy trình phân tích có thể được chia thành 6 bước: (1) phá vỡ tế bào thu nhận rRNA; (2) mẫu dò DNA có đuôi oligodeoxyadenylic nucleotide (dA) và mẫu dò phát hiện (reporter probe) chứa fluorescein isothiocyanate (F) ở đầu 5’ và 3’ của phân tử được đặt vào phản ứng; (3) que thử được bao bọc bởi polydeoxythymidine (dT) để gắn được với oligodA của mẫu dò; (4) que thử được đặt vào ống đo chứa mẫu dò phát hiện được đánh dấu bằng enzyme; (5) sau khi rửa loại phần enzyme thừa, que thử được đặt vào ống đo chứa cơ chất tạo màu; (6) sau khi ủ để hiện màu, màu được phát hiện ở bước sóng 450 nm. 3.4. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) là một phương pháp in vitro để tổng hợp DNA dựa trên khuôn là một trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng bản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme polymerase và một cặp mồi (primer) đặc hiệu cho đoạn DNA này. Kỹ thuật này do Karl Mullis và cộng sự (Mỹ) phát minh vào năm 1985. Hiện nay, kỹ thuật này được sử dụng rộng rãi để phát hiện, tạo ra các đột biến gen, chẩn đoán bệnh, phát hiện các mầm bệnh vi sinh vật có trong thực phẩm. Tất cả các DNA polymerase đều cần những mồi chuyên biệt để tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn. Mạch khuôn thường là một trình tự DNA của gen (gọi là trình tự DNA mục tiêu) đặc trưng cho loài vi sinh vật mục tiêu hoặc là gen quy định việc tổng hợp một loại độc tố chuyên biệt của vi sinh vật này. Mồi la những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn và nhờ hoạt động của DNA polymerase đoạn mồi này được nối dài để hình thành mạch mới. Phương pháp PCR được hình thành dựa trên đặc tính này của DNA polymerase. Khi có sự hiện diện của hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu của một trình tự DNA trong phản ứng PCR, ở điều kiện đảm bảo hoạt động của DNA polymerase, đoạn DNA nằm giữa hai mồi sẽ được khuếch đại thành số lượng lớn bản sao đến mức có thể thấy được sau khi nhuộm bằng ethidium bromide và có thể thu nhận được đoạn DNA này cho các mục đích tái thao tác trên gen. Như vậy, để khuếch đại một trình tự DNA xác định, cần phải có những thông tin tối thiểu về trình tự của DNA, đặc biệt là trình tự base ở hai đầu đoạn DNA đủ để tạo các mồi bổ sung chuyên biệt. Các mồi này gồm một mồi xuôi (sens primer) và một mồi ngược (antisens primer) so với chiều phiên mã của gen. Phản ứng PCR là gồm nhiều chu kỳ lặp lại nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm ba bước là: - Bước 1 (bước biến tính, denaturation): trong một dung dịch phản ứng bao gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn Tm của phân tử, thường là ở 94 – 95oC trong vòng 30 – 60 giây. Mạch đôi DNA tách ra thành dạng mạch đơn. - Bước 2 (bước lai, anealation): trong bước này, nhiệt độ được hạ thấp hơn Tm của các mồi cho phép các mồi bắt cặp với mạch khuôn. Trong thực nghiệm nhiệt độ này dao động trong khoảng 40 – 70oC, tùy thuộc vào Tm của các mồi sử dụng và kéo dài từ 30 – 60 giây. - Bước 3 (bước tổng hợp, elongation): nhiệt độ được tăng lên đến 72oC giúp cho DNA polymerase (vốn là polymerase chịu nhiệt) hoạt động tổng hợp tốt nhất. Thời gian của bước này tùy thuộc độ dài trình tự DNA cần khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút. Trong phản ứng PCR một chu kỳ bao gồm ba bước trên sẽ được lặp đi lặp lại nhiều lần, mỗi lần lại làm tăng gấp đôi lượng mẫu của lần trước. Đây là sự khuếch đại sẽ cho ra khoảng 106 bản sao. Sau phản ứng PCR, các DNA được nhuộm bởi ethidium bromide và có thể quan sát thấy thông qua việc điện di sản phẩm PCR trong gel agarose và quan sát dưới tia UV (bước sóng 312 nm). Hiện nay có nhiều ứng dụng của phản ứng PCR trong các bộ kit thương mại dùng để phát hiện đặc hiệu các chủng vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm hoặc những loài khó nuôi cấy. Một số ưu điểm chính của phương pháp PCR dùng trong phát hiện vi sinh vật gây bệnh là: - Thời gian cho kết quả nhanh. - Có thể phát hiện được những vi sinh vật khó nuôi cấy. Việc nuôi tăng sinh là đơn giản hơn và đôi khi không cần thiết. - Hóa chất cần cho phản ứng PCR dễ tìm và dễ tồn trữ hơn so với trường hợp huyết thanh học. Không cần dụng cụ và môi trường chẩn đoán phức tạp, có thể thực hiện ở hiện trường. - Ít tốn kém về mặt nhân sự, có thể được tự động hóa để làm giảm chi phí phát hiện các vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm. Mặc dù vậy phương pháp PCR vẫn còn một số nhược điểm cần khắc phục: - Sự ức chế hoạt tính của Taq DNA polymerase bởi thành phần của mẫu vật do mẫu thực phẩm thường có những thành phần phức tạp. Tuy nhiên, việc chiết tách và tinh chế DNA từ thực phẩm hay môi trường trước khi thực hiện phương pháp PCR thường cho phép loại bỏ những hợp chất ức chế. - Mật độ vi sinh vật gây bệnh hiện diện trong mẫu thực phẩm thường thấp, nên trong đa số trường hợp cần có bước nuôi cấy làm giàu để có được mật độ đủ để phát hiện bằng PCR. - Phương pháp này không phân biệt được tế bào sống với tế bào chết, do vậy có thể dẫn đến trường hợp dương tính giả do DNA từ tế bào chết. Ngược lại phương pháp này cho phép phát hiện bào tử, dạng tiềm sinh hay tế bào đã chết của các vi sinh vật gây bệnh hoặc gây ngộ độc. Một giải pháp chung đối với các nhược điểm trên là kết hợp một bước tăng sinh ngắn và một bước ly tâm loại bỏ thành phần môi trường nuôi cấy và rửa tế bào trước khi tiến hành phản ứng PCR. Việc phát hiện các mầm bệnh vi sinh vật đơn lẻ trong thực phẩm bằng phương pháp PCR thường gây tốn kém. Do đó, các nhà nghiên cứu đang tìm cách làm giảm chi phí bằng cách sử dụng đồng thời nhiều cặp mồi trong một phản ứng PCR (gọi là phản ứng multiplex PCR) để có thể phát hiện đồng thời nhiều vi sinh vật gây bệnh khác nhau. Tại Việt Nam đã có một số nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR trong việc phát hiện vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm thực hiện tại trung tâm khoa học và công nghệ sinh học và phòng thí nghiệm công nghệ sinh học phân tử, trường đại học khoa học tự nhiên, đại học quốc gia TP.HCM. Dựa trên kết quả nghiên cứu trên một số đối tượng vi khuẩn gây bệnh, một quy trình chung cho việc phát hiện vi khuẩn gây bệnh trong mẫu thực phẩm bằng phương pháp PCR được đề nghị như sau: - Bước 1: tăng sinh trên môi trường không hoặc ít chọn lọc (TSB hoặc TSB có bổ sung một số thành phần dinh dưỡng đặc biệt khác) trong khoảng thời gian từ 10 – 20 giờ (tùy từng đối tượng vi sinh vật, loại mẫu thực phẩm cùng điều kiện lưu giữ mẫu). - Bước 2: thu dịch nuôi cấy, ly tâm bỏ mảnh vụn, ly tâm gộp sinh khối tế bào vi khuẩn, huyền phù tế bào trong dung dịch TE (10mM Tris-HCl pH8,0, 1mM EDTA) với thể tích bằng 1/10 thể tích dịch nuôi cấy ban đầu, xử lý bằng nhiệt ở 100oC trong 10 phút, ly tâm loại bỏ tạp chất không tan ức chế phản ứng PCR. - Bước 3: thực hiện phản ứng PCR. - Bước 4: điện di trên gel agarose 1,5%, xem kết quả trên đèn UV. Toàn bộ quy trình phát hiện vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm từ khi tiếp nhận mẫu đến khi cho kết quả khoảng 14 – 24 giờ (10 – 20 giờ tăng sinh và 4 giờ thực hiện phản ứng PCR và xem kết quả). 3.5. Một số phương pháp thử nhanh khác 3.5.1. Kỹ thuật phân tách và tăng mật độ Để phân lập tế bào vi sinh vật mục tiêu với tế bào các vi sinh vật khác cần thực hiện kỹ thuật phân tách. Trong quá trình đồng nhất mẫu, mẫu thường được pha loãng thập phân tạo ra một thể tích lớn nguyên liệu (250ml), nhưng chỉ dùng vài ml mẫu cho quy trình phát hiện. Có thể rút ngắn thời gian và tăng hiệu quả phát hiện bằng cách làm tăng mật độ các vi sinh vật mục tiêu trong mẫu. Một kỹ thuật phân tách được sử dụng rộng rãi là phân tách miễn dịch – từ tính (Immunomagnetic separation – IMS). Trong phương pháp này, giai đoạn phân lập có thể được rút ngắn bằng cách thay thế môi trường tăng sinh chọn lọc bằng một quy trình tương tự nhưng không cần nuôi cấy. IMS sử dụng những hạt có từ tính cao được bao bọc bên ngoài bởi những kháng thể của vi sinh vật mục tiêu. Các hạt này giúp hấp thụ chọn lọc vi sinh vật mục tiêu này có thể được phát hiện bằng các quy trình vi sinh truyền thống. Dynabeads® (Dynal A/S, Oslo, Norway) là một sản phẩm dựa trên kỹ thuật IMS. Quy trình này sử dụng những hạt polystyrene từ tính cao có đường kính 2,8m (Dynabeads® M-280) và 4,5m (Dynabeads® M-450).Cả hai loại M-280 và M-450 đều có thể được bao phủ bên ngoài bằng một loại kháng thể tùy chọn. 3.5.2. Kỹ thuật màng lọc phát huỳnh quang trực tiếp (Direct Epifluorscent Technique – DEFT) và màng lọc lưới kỵ nước (Hydrophobic Grid Membrane) Đặc điểm chung của phương pháp màng lọc là lọc thu nhận tế bào từ một lượng lớn thể tích được lọc. Số lượng tế bào trong dung dịch mẫu lọc có thể xác định bằng cách quan sát và đếm trên kính hiển vi hoặc bằng cách nuôi cấy màng và đếm khuẩn lạc xuất hiện. Phương pháp màng lọc là một dạng cải biên của phương pháp phân tích vi sinh truyền thống nhằm làm tăng mật độ vi sinh vật mục tiêu, loại bỏ tác nhân ức chế tăng trưởng. Phương pháp này rất thích hợp đối với mẫu có mật độ tế bào thấp. Màng lọc có thể được làm bằng nitrocellulose, cellulose acetate ester, nylon, polyvinyl chloride và polyester có kích thước lỗ 0,45 hoặc 0,22m, đường kính màng lọc khoảng 130 – 150mm. Sự lọc được hỗ trợ bằng hút chân không hoặc lực ép dương. Hiện nay phương pháp màng lọc được cải tiến về chất liệu màng (màng lưới kỵ nước, cấu tạo polycarbonate), chất nhuộm phát quang. Các màng lọc này rất mỏng có thể quan sát bằng kính hiển vi. Độ nhạy của kỹ thuật phát huỳnh quang trực tiếp (DEFT) phụ thuộc vào mật độ tế bào thu được trên màng lọc trước khi nhuộm. Kỹ thuật này cho phép phân biệt tế bào sống và tế bào chết bằng cách nhuộm nhân với phẩm nhuộm phát huỳnh quang acridine orange. Màu sắc phát quang của tế bào bị nhuộm sẽ thay đổi trong suốt các quá trình tăng trưởng. Thuốc nhuộm phát màu đỏ vởi RNA và màu xanh với DNA. Thông thường thì tế bào sống cho màu đỏ da cam trong khi các tế bào chết cho màu xanh lục. Năm 1991, phương pháp ISO-GRID® ứng dụng trên đối tượng Salmonella đã được AOAC công nhận áp dụng cho mọi loại thực phẩm. 3.5.3. Kỹ thuật màng petri (Petrifilm) Trong kỹ thuật này, môi trường dinh dưỡng dạng đông khô được cố định trên một giá thể mỏng và được phủ bằng một màng bảo vệ. Khi sử dụng, lớp màng bảo vệ được tách một phần để có thể bổ sung 1ml dịch mẫu lên bề mặt môi trường, sau đó phủ lại bằng màng bảo vệ. Môi trường dinh dưỡng sẽ hỗ trợ cho sự tăng trưởng của vi sinh vật trong thời gian ủ và số khuẩn lạc xuất hiện có thể được đếm trực tiếp. Kỹ thuật này đã được dùng trong các ứng dụng kiểm tra tổng vi khuẩn hiếu khí, số coliform, coliform phân, nấm mốc, nấm men. Ưu điểm của kỹ thuật này là dễ thao tác, tiết kiệm không gian ủ và bảo quản, thời hạn sử dụng lâu và không cần hấp khử trùng môi trường. 3.5.4. Kỹ thuật Redigel Kỹ thuật này sử dụng các chất dinh dưỡng và gel pectin chứa trong một ống nghiệm. Ống môi trường này có thể được sử dụng ngay không cần phải đun chảy thạch. Trước tiên nhỏ 1ml mẫu vào ống nghiệm, trộn đều. Sau đó đổ tất cả vào một đĩa petri đặc biệt đã được tráng sẵn một lớp calcium. Khi chất lỏng tiếp xúc với calci, gel calcium pectate sẽ hình thành và trương lên thành thạch như môi trường thạch thông thường. Sau khi ủ ở điều kiện thích hợp, tiến hành đếm khuẩn lạc giống như phương pháp đếm đĩa thông thường. 3.5.5. Kỹ thuật độ dẫn điện, trở kháng (conductance/impedance) Kỹ thuật này nhằm phát hiện và định lượng nhanh vi sinh vật dựa trên sự tăng độ dẫn điện của môi trường do sản phẩm trao đổi chất có tính ion được tiết vào môi trường bởi vi sinh vật. Môi trường nuôi cấy chọn lọc có tác dụng như dung dịch điện phân. Sự thay đổi về độ dẫn điện được ghi nhận bởi các thiết bị đo nhờ vậy giúp phát hiện sự hiện diện của vi sinh vật trong môi trường nuôi cấy. Kỹ thuật này không áp dụng được cho trường hợp môi trường nuôi cấy chứa hàm lượng ion cao (ví dụ môi trường chọn lọc Listeria) vì giá trị độ dẫn điện nằm ngoài giới hạn đo của thiết bị. Phương pháp này được ứng dụng rất sớm trong công nghiệp thực phẩm và công nghiệp sữa. Trong nhiều trường hợp cho kết quả của phương pháp này có tương quan tốt với kết quả của phương pháp đếm khuẩn lạc và có ưu điểm là thời gian phát hiện nhanh. Tuy nhiên phương pháp này cần điều kiện môi trường chuẩn, ổn định, cần thiết bị và môi trường đặc biệt. Trong một kỹ thuật tương tự, KOH (potassium hydroxide) được cố định trong agar và được sử dụng làm cầu dẫn điện. nối với hai điện cực của thiết bị đo điện. Trong quá trình tăng trưởng, một trong những sản phẩm biến dưỡng của vi sinh vật là CO2 sẽ làm phân rã bằng thiết bị đo độ dẫn và thời gian cần thiết để làm thay đổi độ dẫn được gọi là thời gian phát hiện. Các thiết bị giám sát thường có chương trình tự động xác định sự hiện diện của vi sinh vật khi độ dẫn vượt qua một giá trị quy ước. Giới hạn phát hiện của phương pháp này đạt đến mức 1 tế bào sống. Hiện nay có nhiều thiết bị giám sát sự thay đổi độ dẫn điện trong môi trường nuôi cấy vi sinh vật dùng cho kỹ thuật này như Bactometer 123 (Bactomatic Ltd), Malthus 2000 (Malthus Instruments Ltd)… 3.5.6. Kỹ thuật đo vi lượng calorie (Microcalorimetry) Kỹ thuật này sử dụng thiết bị rất nhạy cho phép đo sự thay đổi nhiệt lượng rất nhỏ trong quá trình trao đổi chất của vi sinh vật. Mật độ vi sinh vật trong mẫu có thể để được xác định bằng cách đo lượng nhiệt sinh ra hoặc xác định thời gian lượng nhiệt sinh ra đạt đến ngưỡng đo. Kỹ thuật này còn có thể được dùng để định danh vi sinh vật dựa trên sự khác biệt về nhiệt lượng tạo ra bởi một vi sinh vật trên những nền cơ chất khác nhau. 3.5.7. Kỹ thuật đo mức phóng xạ (Radiometry) Trong kỹ thuật này người ta sử dụng cơ chất chứa carbon đồng vị phóng xạ 14C trong môi trường nuôi cấy vi sinh vật để khảo sát CO2 có chứa 14C sinh ra trong quá trình trao đổi chất của vi sinh vật. Mật độ vi sinh vật được xác định bằng cách đo lượng 14CO2 sinh ra hoặc thời gian cần thiết để lượng 14CO2 đạt đến ngưỡng phát hiện. Hệ thống phát hiện dựa trên kỹ thuật đồng vị phóng xạ này rất nhạy nhưng do tính độc hại nên không được ưa dùng trong công nghiêp thực phẩm. KẾT LUẬN Nội dung bài báo cáo đã tổng hợp được một số kiến thức cơ bản, có thể được sử dụng như tài liệu dùng trong phòng thí nghiệm hoặc để củng cố một số kiến thức cần thiết. Nêu được tổng quan cũng như về phương pháp xác định một số vi sinh vật thường xuất hiện trong thực phẩm. Những phương pháp truyền thống có thể được sử dụng để dùng trong những phòng thí nghiệm có cơ sở vật chất hạn chế, giúp cho việc tìm hiểu và nghiên cứu học tập của sinh viên. Còn ở những phòng thí nghiệm có chức năng lớn, có đủ các máy móc trang thiết bị hiện đại để sử dụng những phương pháp hiện đại giúp cho việc xác định chính xác và nhanh chóng các loại vi sinh vật. Trong tương lai, các trường nên trang bị các máy móc thiết bị hiện đại để giúp sinh viên có thể tiếp cận được các phương pháp hiện đại, giúp phát triển và tận dụng các năng lực nghiên cứu của sinh viên. TÀI LIỆU THAM KHẢO Lê Thanh Mai (2009). Các phương pháp phân tích ngành công nghệ lên men, Nhà xuất bản Khoa học & kỹ thuật. Trần Linh Thước (2009). Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mĩ phẩm, Nhà xuất bản Giáo dục. Hà Huy Khôi (2004). Dinh dưỡng và vệ sinh an toàn thực phẩm, Nhà xuất bản Y học.