Khóa luận Tìm hiều quy trình công nghệ sản xuất nấm Metarhizium spp trừ sâu hại cây trồng

ng 3 thập kỷ gần đây đã và đang phát triển với nhịp độ nhanh các ngành khoa học nói chung và các biện pháp sinh học nói riêng để điều hòa số lượng các cá thể dịch hại xuống mức thấp nhất. Các hướng chính của đấu tranh sinh học trong Khóa Luận Tốt Nghiệp SVTH: Phan Công Nhật 10 phòng trừ dịch sâu, bệnh hại, cỏ dại,... gây ra đã được các nhà khoa học định hướng và xác lập thành một thể thống nhất dựa trên hai hướng chính sau đây: 1.4.1. Tính toán để nâng cao hoạt tính của sinh vật có ích Xác định thành phần và hiệu quả của các loài côn trùng ký sinh- ăn thịt có ích và các tác nhân vi sinh vật gây bệnh trên cơ thể sinh vật hại có sẵn ngoài tự nhiên, nhằm mục đích duy trì sự xuất hiện của chúng trên đồng ruộng để làm giảm một phần hoặc tiến tới giảm hẳn khối lượng sử dụng thuốc trừ sâu. Xây dựng cơ cấu cây trồng thích hợp để tạo ra các nguồn thức ăn có các cơ chế không thích hợp với các loài sâu, bệnh, nhện hại gây ra như gieo trồng các loài cây có khả năng chuyển gen độc, các cây có khả năng miễn dịch, các giống mới có khả năng kháng được sâu bệnh hại,.... Xác lập các biện pháp canh tác thích hợp để nâng cao hoạt tính của các sinh vật có ích. Sử dụng các loại thuốc trừ sâu hóa học có ảnh hưởng thấp nhất đối với các quần thể côn trùng ký sinh - ăn thịt và bắt mồi, cũng như không ảnh hưởng tới môi trường sống cộng đồng. 1.4.2. Nghiên cứu tạo ra các chế phẩm sinh học trong phòng trừ sinh vật gây hại Sản xuất và sử dụng rộng rãi các loại thuốc trừ sâu vi sinh vật trên cơ sở các nguồn vi khuẩn, virus, vi nấm và các thuốc kháng sinh. Sử dụng các chất có hoạt tính sinh học như các pheromon sinh dục, các hormon sinh trưởng, các chất dẫn dụ ăn uống, các chất gây ngán và các chất xua đuổi côn trùng,... Sản xuất trên quy mô công nghiệp để phóng thả các loại côn trùng và nhện kí sinh - ăn thịt có ích lên đồng ruộng nhằm hạn chế được quần thể sâu hại. Phóng thả các côn trùng có hại đã được gây vô sinh nhằm tạo ra sự cạnh tranh sinh dục với quần thể sâu hại ngoài tự nhiên. Khóa Luận Tốt Nghiệp SVTH: Phan Công Nhật 11 Sử dụng các côn trùng ăn thực vật, các tuyến trùng và các tác nhân gây bệnh chuyên tính hẹp đã qua kiểm dịch để diệt trừ các loài cỏ gây hại cho cây trồng. Trong hai hướng trên, hiện nay các nhà khoa học đặc biệt chú ý đến hướng thứ hai, bởi hướng này hầu hết phải dựa trên nền tảng nghiên cứu của công nghệ sinh học mới có thể phát triển sản xuất ra các loại thuốc trừ sâu sinh học đạt chất lượng cao, mang tính ổn định để sử dụng rộng rãi trong phòng trừ dịch hại cây trồng, lâm nghiệp. Đến nay, trên thế giới đã có rất nhiều công trình khoa học nghiên cứu về CNSH trong bảo vệ thực vật, nhiều nước đã thu được những kết quả tốt trong quá trình triển khai ứng dụng các chế phẩm sinh học phòng trừ sâu hại, bệnh hại, cỏ dại và chuột hại bảo vệ cây trồng. 1.5. Tính ưu việt của chế phẩm sinh học Không gây độc hại cho con người động vật và cây trồng, có khả năng tiêu diệt một cách chọn lọc các loài sâu bệnh. Phần lớn các tác nhân sinh học nói chung có tính đặc hiệu cao trong việc tiêu diệt các loại côn trùng. Trong khi đó, thuốc trừ sâu hóa học gây độc cho người, gia súc nếu tiếp xúc lâu dài, một số là tác nhân gây ung thư. Do không độc hại đối với con người, lại không ảnh hưởng xấu đến hệ sinh vật quanh hệ rễ của cây trồng, nên chế phẩm thuốc trừ sâu bệnh có nguồn gốc vi sinh vật không phá vỡ cân bằng hệ sinh thái, không gây ô nhiễm môi trường sống. Việc sử dụng các chế phẩm vi sinh vật diệt sâu bệnh cho đến nay chưa phát hiện được hiện tượng “ lờn thuốc” ở các loài côn trùng. Đây cùng là ưu điểm hơn hẳn của biện pháp sinh học với biện pháp hóa học. Các vi sinh vật diệt sâu bệnh có thể nhiễm lên sâu bệnh bằng nhiều cách khác nhau: bằng con đường tiêu hóa (ở vi khuẩn), qua da, tầng cuticum (ở nấm),… Khóa Luận Tốt Nghiệp SVTH: Phan Công Nhật 12 Các vi sinh vật diệt sâu bệnh, côn trùng có thể tồn tại trong điều kiện môi trường không thuận lợi (không vật chủ, điều kiện khí hậu khắc nghiệt,…) ở nhiều dạng khác nhau: dạng bào tử, dạng hạch nấm hay giả hạch nấm. Khả năng phát tán rộng trong tự nhiên của các giống vi sinh vật có ý nghĩa rất lớn trong việc tăng cường lây lan tạo thành dịch ở côn trùng, sâu bệnh. Ngoài ra một số nấm, vi khuẩn, virus còn có thể được lan truyền rộng, nhờ dòng không khí, nước mưa và côn trùng,… Với tất cả các đặc điểm sinh học tự nhiên như trên, các vi sinh vật diệt sâu bệnh, có thể xuất hiện bất cứ lúc nào có thể nói là bất ngờ, với một tốc độ rất nhanh, mang tính chất một ổ bệnh, dẫn đến gây chết côn trùng, sâu bệnh hại cây trồng trên địa bàn rộng. Chính vì vậy chúng giúp bảo vệ cây trồng có hiệu quả rất đáng kể. Khóa Luận Tốt Nghiệp SVTH: Phan Công Nhật 13 CHƯƠNG 2 ĐẶC ĐIỂM CHUNG CỦA VỀ NẤM METARHIZIUM SPP 2.1. Phân loại Ngành : Ascomycota Lớp : Sordariomycetes Bộ : Hypocreales Họ : Clavicipitaceae Chi : Metarhizium Loài : M. anisopliae và M. flavoviride Hình 2.1. Metarhizium anisopliae Trong 2 loài nấm Metarhizium anisopliae và Metarhizium flavoviride, loài Metarhizium anisopliae Sorok ,1883 được sử dụng nhiều trong phòng trừ sâu hại cây trồng (Phạm Thì Thùy,2010). 2.2. Đặc điểm hình thái [4] Khóa Luận Tốt Nghiệp SVTH: Phan Công Nhật 14 Sợi nấm phát triển trên bề mặt sâu bệnh có màu từ màu trắng đến màu xanh, cuống sinh bào tử ngắn mọc tỏa tròn trên đám sợi nấm dày đặc. Bào tử trần hình que có kích thước 3,5 x 6,4 x 7,2 µm, màu từ lục xám đến oliu - lục, bào tử xếp thành chuỗi khá chặt chẽ và nhìn bằng mắt thường người ta có thể thấy bào tử được tạo ra trên bề mặt cơ thể côn trùng một lớp phấn khá rõ màu xanh lục. Sợi nấm khi phát triển bên trong côn trùng có chiều rộng khoảng 3 - 4 µm, dài khoảng 20µm, chia thành nhiều tế bào ngắn, trong tế bào có thể thấy rõ nhiều giọt mỡ. Nấm M. anisopliae có bào tử dạng hình trụ, hình hạt đậu, khuẩn lạc có màu xanh thỉnh thoảng có màu tối hoặc màu hồng vỏ quế, chúng phát triển chậm trên môi trường không có peptone (ví dụ như môi trường PDA, Czapek - Dox), thích hợp trên môi trường có pepton, cụ thể trên môi trường Sabouraud nấm phát triển tốt trong điều kiện nhiệt độ 25⁰C sau 7 - 10 ngày nuôi cấy thì khuẩn lạc có đường kính 4 - 6 cm. Loài nấm Metarhizium anisopliae có hai loài (varities) dạng bào tử nhỏ và lớn, dạng bảo tử nhỏ Metarhizium var. anisopliae có kích thước bào tử 3,5 - 5,0 x 2,5 - 4,5 µm, dạng bào tử lớn là Metarhizium anisopliae var. major có kích thước bào tử 10,0 - 14,0 µm. Để phân biệt hai loài nấm trên, tác giả Tsai và cs (dẫn theo Phạm Thị Thùy, 2010) đã nghiên cứu đặc tính huyết thanh khác nhau của hai loài này và xác định rằng loài Metarhizium anisopliae là chủng gây bệnh mạnh nhất trên côn trùng thuộc bộ cánh cứng Coleoptera. Nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu và tìm thấy có khoảng 204 loài sâu bệnh, côn trùng thuộc họ Elaridae và Curculionidae dễ bị nhiễm bệnh bởi nấm Metarhizium anisopliae. 2.3. Độc tố diệt côn trùng của nấm lục cương Metarhizium [4] Độc tố diệt côn trùng của nấm lục cương gồm một số ngoài độc tố có tên là Destruxin A, B, C hay D. Các ngoại độc tố đó là các sản phẩm thứ cấp vòng Khóa Luận Tốt Nghiệp SVTH: Phan Công Nhật 15 peptit, L - prolyn, L - leucine, anhydride, L - prolyn - L - valine anhydride và Desmethyl Destruxin B. Theo tài liệu của tác giả Lysenko và Kucera thì nấm M. anisopliae cũng sinh độc tố Destruxin A và độc tố Destruxin B. Theo Suzuki và cộng sự (1970) thì: Destruxin A có công thức nguyên là C29H47O7N5, có điểm sôi là 188⁰C. Destruxin B có công thức nguyên là C30H51O7N5, có điểm sôi là 234⁰C. Độc tố Destruxin A có bản chất hóa học là D - 2 hydroxy - 4 - pentenoy - L - prolyl - isoleucyl - N - methyl - L valyl - N - methyl - L - alanyl - alanyl lacton. Độc tố Destruxin B có bản chất hóa học là D - α hydroxy - γ - methylvaleryl - L - prolyl - L - isoleucyl - N - methyl - L valyl - N - methyl - L - alanyl - β alanyl lacton. Lần lượt từ năm 1961 và 1962, Y. Kodaira (dẫn theo Phạm Thị Thùy, 2010) đã tách ra được độc tố Destruxin A, và Destruxin B từ dịch nuôi cấy nấm lục cương M. anisopliae. S. Tamura và cs từ năm 1965 – 1970 đã tiến hành nuôi cấy nấm lục cương. Các tác giả cũng tách được những độc tố trên từ môi trường Czapek - Dox có chứa 0,5% pepton. Từ 1 lít dịch nuôi cấy người ta có thể thu nhận được 13 - 15 mg độc tố Destruxin A và B, dịch lọc được xử lý bằng than hoạt tính rồi được phản hấp phụ bằng N - butanol, sau đó được tách ra bằng benzene và được làm sạch trên bột nhôm oxit trung tính (dẫn theo Phạm Thị Thùy, 2010). Năm 1971, người ta đã tổng hợp nhân tạo được Destruxin B. Có khoảng 70 loài côn trùng bị tiêu diệt bởi nấm lục cương M. anisopliae. Dưới kính hiển vi điện tử với độ phóng đại lớn, năm 2000 các nhà khoa học Mỹ đã chụp được chuỗi bào tử M. anisopliae kéo dài với mật độ giống như dạng khôi mô giậu. 2.4. Cơ chế tác động của nấm lên sâu bệnh và con đường truyền bệnh [5, 7] Khóa Luận Tốt Nghiệp SVTH: Phan Công Nhật 16 2.4.1. Cơ chế tác động Hầu hết những loài nấm gây bệnh cho sâu bệnh đều xâm nhập vào cơ thể vật chủ qua lớp da (vỏ) cơ thể. Bào tử nấm bám vào bề mặt cơ thể vật chủ. Trong điều kiện đủ độ ẩm bào tử mọc mầm và xâm nhiễm vào bên trong cơ thể sâu, côn trùng qua lớp vỏ chitin nhờ áp lực cơ giới hoặc hoạt động enzyme của nấm. Nấm tiết ra loại enzyme làm mềm lớp vỏ chitin, qua lỗ thủng đó bào tử xâm nhập vào bên trong cơ thể sâu và tạo thành một lỗ thủng tại nơi bào tử mọc. Do khả năng xâm nhập vào bên trong cơ thể côn trùng qua lớp vỏ cơ thể nên nấm có thể ký sinh được sâu, côn trùng chích hút và cả những pha phát triển của côn trùng như trứng, nhộng mà các vi sinh vật khác không ký sinh được. 2.4.2. Con đường truyền bệnh Nguyên nhân gây bệnh chủ yếu là lây lan từ cá thể ốm sang cá thể khỏe thông qua tiếp xúc trực tiếp với nhau, hay qua nguồn thức ăn có chứa mầm bệnh. Việc lây truyền theo con đường đẻ trứng của ký sinh hầu như không đáng kể. Bệnh vi nấm rất dễ lan truyền bằng va chạm đơn giản mà ở một số bệnh vi sinh vật khác hầu như không xảy ra. Khi lây bệnh chúng thường lây lan nhờ gió, mưa, chim, thú,… và các bệnh do nấm tạo thành những ổ bệnh kéo dài theo chiều gió thổi, con đường truyền bệnh thông qua các loại độc tố của nấm. Khóa Luận Tốt Nghiệp SVTH: Phan Công Nhật 17 Cho đến nay, người ta đã xác định được nấm này có khả năng kí sinh và gây chết đối với rất nhiều loài sâu bệnh và côn trùng. Trong số đó có tới 34 loài côn trùng cánh cứng và chỉ có 5 loại côn trùng cánh vẩy. 2.5. Cấu tạo và thành phần hóa học của tế bào vi nấm [7, 8] Cũng như trong thành phần cấu tạo của các loại nấm lớn (nấm có quả thế) và các nhóm vi sinh vật khác, tế bào vi nấm gồm có: thành tế bào, chất nguyên sinh, không bào, nhân tế bào và các thể ẩn nhập. Thành phần hóa học của các thể bào vi nấm thay đổi theo loài, theo vị trí tế bào trên sợi nấm so với ngọn nấm (Gibatt, 1996). Các thành phần nguyên tố hóa học của tế bào vi nấm quan trọng nhất là cacbon (40%), oxy (40%), nitơ (7 - 8%) và hydro (2 - 3%). Hydratcacbon quan trọng ở các tế bào nấm là Glycogen và Trehalogen. Glycogen là hydratcacbon dự trữ của nấm. Tương đương với tinh bột ở thực vật. Tỷ lệ hydratcacbon cũng như các thành phần khác của tế bào, thay đổi theo từng loài vi nấm. Hình 2.2. Cơ chế tác dụng của chế phẩm Khóa Luận Tốt Nghiệp SVTH: Phan Công Nhật 18  Sợi nấm, hệ sợi nấm và khuẩn lạc Sợi nấm có vách ngăn, toàn bộ sợi nấm và các nhánh phát triển từ một bào tử nấm được gọi là hệ sợi nấm. Sợi nấm phát triển từ ống nảy mầm và bào tử mọc ra, sợi nấm chỉ tăng trưởng ở ngọn và đều được đo theo chu kỳ thời gian. Trên môi trường nuôi cấy nhân tạo và cả trên một số cơ chất tự nhiên, hệ sợi của vi nấm thường phát triển thành một khối có hình dạng nhất định, thường có tiết diện hình tròn, hoặc gần cầu gọi là khuẩn lạc. Một khuẩn lạc có thể phát sinh từ một đoạn sợi nấm nhưng thông thường nhất là từ bào tử. Tốc độ tăng trưởng của các loại vi nấm thường được tính bằng đường kính khuẩn lạc. Khuẩn lạc của một vài loài nấm còn được đặc trưng bởi màu sắc của sợi nấm. Bề mặt khuẩn lạc của vi nấm có thể mượt, nhẵn bóng, dạng bột, dạng hạt, dạng sợi hoặc dạng xốp. Chưa có nhiều dẫn liệu về những biến đổi sinh lý, sinh hóa trong bào tử nấm thuộc các nhóm phân loại khác nhau, tuy nhiên vẫn có những công trình nghiên cứu nói tới sự biến đổi này. Trong quá trình nảy mầm, sợi nấm rất cần glucoza hoặc các đường đơn khác từ môi trường bên ngoài, ngược lại không cần cung cấp lipit. Glucoza cũng được xem là nguồn cacbon rất cần đối với sự nảy sợi ở nhiều loại vi nấm, chẳng hạn đối với sự nảy sợi của bào tử trần nấm Penicillium griseofulvum. Trong quá trình nảy mầm, sinh trưởng và hình thành bào tử, nấm Metarhizium anisopliae cũng rất cần nguồn cacbon, nitơ và vitamin. Khóa Luận Tốt Nghiệp SVTH: Phan Công Nhật 19 Hình 2.3. Khuẩn lạc Metarhizium anisopliae Hình 2.4 Bào tử nấm M. anisopliae Khóa Luận Tốt Nghiệp SVTH: Phan Công Nhật 20 2.6. Khả năng đồng hóa các nguồn cacbon, nitơ của nấm M. anisopliae [7, 8] Nấm có thể sử dụng các nguồn thức ăn cacbon rất khác nhau, hầu như không có loại hợp chất cacbon hữu cơ nào mà không được nhóm nấm này hay nhóm nấm khác sử dụng. Ví dụ như chi Metarhizium đã sử dụng các nguồn thức ăn cacbon mà các loại vi nấm vẫn thường sử dụng. Nhiều loài nấm còn có khả năng đồng hóa cả các hợp chất hữu cơ rất bền vững hoặc rất độc đối với nhiều loài sinh vật khác (các chất n- alcan, alcaloit, phenol, sterin, nhiều chất kháng sinh, nhiều độc tố, nhiều loại tactan, flavon v.v…). Các loài vi nấm kí sinh côn trùng thường không đòi hỏi khắt khe đối với một loại thức ăn cacbon nào đấy. Chúng có khả năng sử dụng nhiều loại hợp chất cacbon khác nhau, nhưng cũng có loại hợp chất này được đồng hóa tốt hơn loại hợp chất cacbon khác. Có rất nhiều trường hợp ở trong môi trường nuôi cấy có mặt vài nguồn cacbon khác nhau, nấm sẽ phát triển mạnh hơn khi chỉ có riêng từng loài. Các công trình nghiên cứu của Hegendus và cs (dẫn theo Phạm Thị Thùy, 2010) đã xác định môi trường tốt nhất để phân lập nấm M. anisopliae là môi trường có chứa kitin làm nguồn cacbon. Để thực hiện các quá trình sinh lý khác nhau, nấm thường có những nhu cầu về các nguồn thức ăn cacbon khác nhau. Hegendus và cs, cho biết nấm M. anisopliae khi nuôi cấy chìm, nếu bổ sung thêm kitin hoặc hexosamines và glucoza thì thu được lượng bào tử cao nhất. Nhờ khả năng đồng hóa nguồn cacbon phức tạp này mà trong cơ chế diệt côn trùng của các chủng vi nấm M. anisopliae và M. flavoviride, đã được rất nhiều tác giả trên thế giới nghiên cứu và họ đều khẳng định rằng quá trình xâm nhập của các chủng nấm trên, trước hết phải là do quá trình phân hủy lớp vỏ kitin ở ngoài lớp da. Sau đó là phân hủy protein của các mô, đồng thời với protein là sự phá hủy lipit. Quá trình này thực hiện được chính là nhờ vai trò của phức hệ enzyme ngoại bào của các nấm kí sinh trên sâu hại cây trồng. Khóa Luận Tốt Nghiệp SVTH: Phan Công Nhật 21 Tùy từng loại nấm mà có nhu cầu C khác nhau. Khi nuôi các chủng nấm Metarhizium anisopliae trên môi trường có nguồn cacbon khác nhau người ta thấy chúng đồng hóa tốt các loại đường glucoza, maltoza, sacharoza nhưng lại đồng hóa đường rafinoza yếu. Mối quan hệ giữa nguồn thức ăn cacbon với sự hình thành và phát triển của bào tử nấm Metarhizium anisopliae đã được tác giả Jenking và Prior xác định. Các tác giả cho biết tỷ lệ thích hợp giàu sacharoza và peptone trong dịch nuôi cấy nấm Metarhizium anisopliae có ảnh hưởng tới sự sinh trưởng và hình thành bào tử nấm. Thành phần kitin trong môi trường nuôi cấy rất cần thiết đối với các chủng vi nấm côn trùng vì chất kitin đã giúp cho sự sinh trưởng, phát triển và hình thành bào tử đính (conidiospore) cũng như bào tử chồi (blastospore) của nấm. Tuy nhiên không phải tất cả nguồn thức ăn cacbon nào cũng đều hỗ trợ các loài cho sự sinh trưởng và phát triển cũng như sự nảy mầm và hình thành bào tử của nấm. Nghiên cứu về hiệu quả của nguồn cacbon, nitơ và vitamin đối với nấm Metarhizium anisopliae được phân lập từ sâu Inoplus ruoricus người ta nhận thấy quá trình nảy mầm, sinh trưởng và hình thành bào tử nấm Metarhizium anisopliae đã sử dụng cả nguồn nitrat và nitơ amôn. Trong nguồn nitơ đã thử, chỉ có axit amin cystein là ức chế cả sự sinh trưởng và sự hình thành bào tử nấm. Những vitamin đã thử cũng không làm tăng sự sinh trưởng và sự hình thành bào tử của nấm Metarhizium anisopliae. Ngoài việc sử dụng các nguồn nitơ vô cơ, nấm còn có thể sử dụng tốt những nguồn nitơ hữu cơ như protein, peptone và các axit amin. Axit glutamic là một trong những axit amin thích hợp hơn cả cho sự phát triển của nấm Metarhizium anisopliae. Nguồn thức ăn nitơ là protein từ cơ thể côn trùng là nền cơ chất giàu dinh dưỡng nhất cho nấm gây bệnh côn trùng sinh trưởng và phát triển. 2.7. Nhu cầu về chất kích thích sinh trưởng [7, 8] Khóa Luận Tốt Nghiệp SVTH: Phan Công Nhật 22 Vi nấm có mối quan hệ rất khác nhau đối với các loại vitamin và các chất sinh trưởng. Ngoài tác dụng kích thích nảy mầm của bào tử sinh trưởng và tăng trưởng của hệ sợi nấm, cũng có loại vitamin kìm hãm hoặc hạn chế sự sinh trưởng của nấm. Trường hợp bổ sung vitamin vào môi trường nuôi cấy người ta thấy có sự ức chế khoảng 30- 40% quá trình sinh trưởng và phát triển của nấm. Các chủng nấm Metarhizium anisopliae,… nếu bổ sung thêm kitin tự nhiên của châu chấu di cư Locusta migratonia vào môi trường nuôi cấy sẽ làm tăng khả năng sinh bào tử ( Li và Holdom). Các nguyên tố vi lượng có tác dụng kích thích sự phát triển của vi nấm, ví dụ nếu loại ra khỏi môi trường nguyên tố vi lượng Mo, người ta nhận thấy hàm lượng nitratreductaza trong tế bào vi nấm cũng giảm đi 9 lần. Một đặc tính sinh lý, sinh hóa vô cùng quan trọng của vi nấm là khả năng biến đổi các cơ chất khác nhau nhờ hệ thống enzyme sinh ra trong quá trình trao đổi chất. Đối với các chủng vi nấm diệt côn trùng thì hệ enzyme là một trong những yếu tố đặc trưng cho cơ chế lây nhiễm và xâm nhập bệnh vi nấm vào cơ thể sâu bệnh. 2.8. Phổ ký chủ của nấm lục cương Metarhizium spp [4, 7, 8] Những năm trước đây do chưa hiểu biết về vi sinh vật gây bệnh trên sâu bệnh, côn trùng nên không ai phát hiện, tìm thấy những nguồn vi sinh vật hữu ích này mặc dù chúng xuất hiện trong tự nhiên với một tỷ lệ rất nhỏ. Nhiều nơi khi có sâu hại bùng phát, không phun thuốc trừ sâu nhưng năng suất cây trồng cũng không bị giảm sút. Nguyên nhân có thể do các vi sinh vật tấn công và lây lan trong đó có nấm diệt sâu bệnh. Từ năm 1990 trở lại đây hiện tượng nấm kí sinh sâu hại cây trồng đã được Viện Bảo vệ thực vật nghiên cứu trên cơ sở thu thập và tuyển chọn những nguồn nấm có ích làm chủng giống để sản xuất ra các thuốc nấm trừ sâu hại cây trồng. Thực tế cho thấy trên đồng ruộng Việt Nam cũng đã được bổ sung một nguồn đáng kể vi sinh vật kí sinh gây bệnh trên sâu cho nên Khóa Luận Tốt Nghiệp SVTH: Phan Công Nhật 23 nhiều nơi, nhiều vùng cũng xuất hiện rất nhiều loài sâu hại bị nấm kí sinh. Chúng có tác dụng rất lớn trong việc hạn chế một số dịch sâu hại nguy hiểm như châu chấu, sâu róm thông, bọ hại dừa, sâu kèn hại keo tai tượng, sâu xanh ăn lá bồ đề,…. Đến nay nấm gây bệnh côn trùng không còn là một điều xa lạ với các nhà khoa học, các nhà quản lý và cả những người nông dân. Ở Việt Nam, các tác giả đã xác định được nhiều loài sâu hại là kí chủ của nấm Metarhizium spp ( Phạm Thị Thùy và cs , 2003) Dưới đây là danh sách tên những loài hại cây trồng và mối đất bị nấm lục cương Metarhizium anisopliae, Metarhizium flavoviride ký sinh - Châu chấu sống lưng vàng pantanga sucincta - Châu chấu mía Hieroglyphus tonkinensis - Châu chấu múa Hieroglyphus banian - Châu chấu lúa Oxya chinensis - Châu chấu lúa Oxya duminuta - Châu chấu Locusta sp - Bọ hại dừa Brontispa longissima - Họ hại dừa Brontispa sp - Mối đất Coptotermes sp - Mối đất Coptotermes squamosus - Sâu kèn hại keo tai tượng Amasstisa sp - Sâu đo hại quế Culculla paterianria - Sâu keo da láng Spodotera exigua - Sâu xanh bông Helicoverpa armigera - Sâu xanh thuốc lá Helicoverpa assulta - Sâu xanh bướm trắng Pieris rapae - Sâu tơ Plutella xylostella - Sâu khoang spodoptera litura Khóa Luận Tốt Nghiệp SVTH: Phan Công Nhật 24 - Sâu đục quả đậu Maruca testulalis - Sâu đục thân ngô Pyrausta nubilalis - Sâu ăn lá đậu Etiella sp - Bọ xít hôi Leptinotasa acuta - Bọ xít đen Scotinophora lurida - Bọ xít xanh Neraza viridulla - Sâu cắn gié Leucania separate - Rầy nâu Nilaparvata lugent - Rầy điện quang Nephotetix bipunstatus - Bọ hà khoai lang Cylas formicarius - Sâu đo xanh Anomis flava - Châu cấu Hypomesces squamosus - Sâu xanh ăn là bồ đề Fentonia sp - Mọt gạo Sitotroga sp - Sâu róm thông Dendrolimus punctatus - Bọ hung đen hại mía Alissonotum impressicolle - Bọ hung nâu Exolontha sp - Canh cam Anomala cupripes - Sâu róm quế Malacosoma dentate - Sâu đục cành quế Arbela bailbarana - Xén tóc Bacchisa atritaric Khóa Luận Tốt Nghiệp SVTH: Phan Công Nhật 25 Hình 2.5. Sâu xanh hại bông A. Trứng B. Ấu trùng và Bướm trưởng thành Hình 2.6. Bọ lá khoai tây A. Bọ B. Nhộng C. Ấu trùng Khóa Luận Tốt Nghiệp SVTH: Phan Công Nhật 26 Hình 2.7 Châu chấu bị nấm tấn công Hình 2.8. Bọ rầy bị nhiễm nấm Metarhizium Khóa Luận Tốt Nghiệp SVTH: Phan Công Nhật 27 CHƯƠNG 3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VÀ SỬ DỤNG NẤM METARHIZIUM SPP. 3.1. Tình hình nghiên cứu sử dụng Metarhizium trên thế giới [4,8] Những năm cuối của thế kỷ XX, rất nhiều công trình nghiên cứu đã khẳng định trong điều kiện tự nhiên vi nấm là một nhân tố gây chết quan trọng đối với nhiều loài sâu, côn trùng. Mỗi nhóm có thể bị ảnh hưởng bởi một số vi nấm nhất định. Người ta đã xác định hơn 700 loài vi nấm là mầm bệnh cho các loài côn trùng, sâu bệnh. Tuy nhiên, căn cứ vào mức độ gây chết, điều kiện nuôi cấy, điều kiện sản xuất và tác dụng, người ta chỉ tập trung nghiên cứu vào 4 nhóm vi nấm: Metarhizium, Beauveria, Verticilum và Paecilomvces. Những năm gần đây, xuất hiện ngày càng nhiều các công trình nghiên cứu sử dụng vi nấm để diệt sâu bệnh, côn trùng. Và kết quả là 11 chế phẩm vi nấm diệt côn trùng đã được đưa vào sử dụng, trong đó có 3 chế phẩm Metarhizium: chế phẩm BioBlast của Mỹ dùng để diệt mối đất Đài Loan (Coptotermes formosanus); chế phẩm GreenMuscle của Nam Phi để diệt châu chấu (Locusts); chế phẩm BioGreen của Úc để diệt bọ ngô đầu đỏ (Red- headed cockchafer). Từ những năm 80 của thế kỷ trước (1880-1886), Metschnhikov cùng học trò của mình là Isac Craxinstic đã nghiên cứu hàng loạt môi trường nuôi cấy nấm M. anisopliae và đã sản xuất thử hàng nghìn kilogram nấm để tách bào tử thuần khiết, sau đó dùng bào tử nấm trộn với đất bột và đem tung ra đồng ruộng, theo các tác giả thì sau 10 - 14 ngày thí nghiệm cả sâu non và dạng trưởng thành của bọ đầu dài hại củ cải đường chết với tỷ lệ 55 - 80%. Một số nước (Liên Xô, Ba Lan…) bằng kỹ thuật công nghệ hóa sinh hiện đại đã chiết từ hạt gấc, đậu tương…các loại chất có khả năng kìm hãm sinh trưởng và phát triển của sâu bệnh để tạo chế phẩm sinh học BVTV bước đầu đã có những kết quả rất khả quan. Khóa Luận Tốt Nghiệp SVTH: Phan Công Nhật 28 Nói tóm lại việc nghiên cứu và sản xuất chế phẩm các loại không chỉ chế phẩm nấm xanh Metarhizium đã được các nhà khoa học trên thế giới sản xuất hàng vạn tấn chế phẩm sinh học để phòng trừ cho hàng chục triệu hecta cây trồng. 3.2. Tình hình nghiên cứu sử dụng Metarhizium ở Việt Nam Việc nghiên cứu nấm gây bệnh trên sâu bệnh đã được các cán bộ khoa học kỹ thuật ở một số trường đại học và viện nghiên cứu bắt đầu tìm hiểu và đi sâu nghiên cứu chúng từ những năm 70 của thế kỷ trước. Theo Phạm Bình Quyền (1994), cơ sở khoa học của phòng trừ sinh học, phòng trừ tổng hợp là hiểu đúng quy luật cơ chế tự nhiên của sự điều chỉnh số lượng sâu bệnh, nhằm sử dụng tối ưu các cơ chế đó vào việc hạn chế tác hại do chúng gây ra. Năm 1981 GS.TS Nguyễn Lân Dũng nghiên cứu nấm lục cương Metarhizium mô tả hình thái, phân tích cơ chế tác dụng, hướng dẫn cách phân lập nuôi cấy và phương pháp sản xuất sinh khối Metarhizium. Từ năm 1992, Phạm Thị Thùy và cs thuộc viện Bảo vệ thực vật đã phân lập, nuôi cấy và thử nghiệm các chủng Metarhizium thuộc 2 loài Metarhizium anisopliae và Metarhizium flavoviride để phòng trừ cho các loài sâu bọ hại cây nông, lâm nghiệp bằng phương pháp phun trực tiếp bào tử Metarhizium trên đồng ruộng. Năm 1996, Tạ Kim Chỉnh đã phân lập, nuôi cấy một số chủng Metarhizium anisopliae và thử nghiệm để diệt châu chấu di cư và các loài sâu bệnh hại cây nông nghiệp. Phạm Thị Thùy và cộng sự (2002 - 2003), đã nghiên cứu sử dụng nấm Metarhizium anisopliae để diệt bọ hại dừa cho tỉnh Bình Định bằng phương pháp phun trực tiếp. Kết quả cho thấy chế phẩm nấm Metarhizium anisopliae đều có hiệu quả cao với ấu trùng và trưởng thành của bọ dừa, đặc biệt là hiệu quả kéo dài đến 8 tuần sau phun. Điểm giá trị nhất của chế phẩm nấm là hiệu quả kéo dài, Khóa Luận Tốt Nghiệp SVTH: Phan Công Nhật 29 nấm không gây ô nhiễm môi trường và nguy hiểm đối với con người, không làm mất đi những loài kí sinh thiên địch có ích khác. Từ năm 1998 đến năm 2002, Trịnh Văn Hạnh và cs ở Trung tâm nghiên cứu phòng trừ mối đã nghiên cứu tuyển chọn các chủng Metarhizium có hiệu lực cao để phòng trừ các loài gây hại điển hình ở nước ta, như loài mối nhà nguy hiểm nhất Coptotermes formosanus Shiraki. Chế phẩm Metarhizium từ nghiên cứu của Lê Thùy Quyên để diệt trừ các loài sâu xanh bướm trắng, sâu khoang ăn lá và đặc biệt là khả năng tiêu diệt được một số loài côn trùng hại cây trồng trong đất như bọ hung, mối đất. Nấm có hiệu quả cao để phòng trừ bọ hung đen ăn mía, mối đất ăn thông trắng, bồ đề, hại cây điều, cây ăn quả, sâu xanh bướm trắng ăn su hào, bắt cải, sâu khoang hại cà chua…cho kết quả diệt trừ sâu bệnh hơn 70%. Mặc dù có nhiều nghiên cứu đã được tiến hành nhưng chế phẩm thuốc BVTV có nguồn gốc từ sinh học ở Việt Nam trong thời gian qua còn có những mặt hạn chế: - Giá thành sản phẩm cao vì công nghệ sản xuất phức tạp, đòi hỏi chi phí cao, nếu không có sự trợ giá, người nông dân khó chấp nhận. - Tác dụng chậm nên tâm lý người nông dân còn ngại sử dụng. - Công nghệ sản xuất ở một số chế phẩm còn đơn giản, thủ công nên số lượng sản xuất chưa có nhiều để phục vụ sản xuất. Cải tiến hoàn thiện quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm sinh học để giảm giá thành, hiệu quả cao và sản xuất với số lượng lớn để phục vụ sản xuất. Gần đây, quy trình sản xuất nấm Metarhizium spp đã được chuyển giao rộng rãi đến hộ nông dân ở Đồng bằng Sông Cửu Long để phòng trừ rầy nâu hại lúa (Nguyễn Thị Lộc, 2010). 3.3. Hiệu lực phòng trừ sâu hại của chế phẩm Metarhizium anisopliae Khóa Luận Tốt Nghiệp SVTH: Phan Công Nhật 30 Như đã trình bày ở trên, nấm Metarhizium anisopliae được nghiên cứu và sử dụng phòng trừ nhiều loài sâu hại cây trồng. Một số kết quả đánh giá hiệu lực của chế phẩm nấm Metarhizium anispliae đã được Viện bảo vệ thực vật ghi nhận như sau: * Đối với bọ xít hại nhãn, vải (Tessaratoma papillosa). Bảng 3.1 Hiệu lực của chế phẩm nấm Metarhizium anisopliae trên bọ xít hại nhẫn vải (Tessaratoma papillosa) trong phòng thí nghiệm. Hiệu lực phòng trừ (%) sau TN Nồng độ (x 108 bt.ml) 3 5 7 10 12 Tº(C) H(%)TB 4 7.5 25.7 40.5 46.5 50.5 8 9.4 33.6 51.7 58.8 66.2 12 12.4 50.3 63.4 70.3 76.0 28.1 81.7 Kết quả cho thấy chế phẩm nấm Metarhizium anisopliae có hiệu lực tương đối cao với bọ xít hại nhãn vải. Trong điều kiện nhiệt độ trung bình 28,1°C và ẩm độ là 81,7%, ở nồng độ cao 12 x 108 bt/ml sau 12 ngày thí nghiệm hiệu lực của nấm đạt 76%, còn ở nồng độ thấp 4 x 108 bt/ml tỷ lệ chết của bọ xít chỉ đạt 50,5% và sự hiện diện của nấm mọc lại trên bọ xít là 60%. * Đánh giá hiệu lực của các mẻ chế phẩm M.anisopliae đối với các loài sâu hại, thông qua các thử nghiệm trong nhà lưới. - Qua kết quả thí nghiệm cho thấy, hiệu lực của của chế phẩm nấm xanh đối với các loài sâu hại rất cao, đối với rầy nâu là 78-92% ở 7 ngày sau phun (NSP); đối với bọ xít là 76- 90% ở 7 NSP; vào 7 NSP thì hiệu lực của M.anisopliae đối với rầy chổng cánh đạt từ 80,1- 88,3%; đối với bọ cánh cứng hại dừa đạt từ 85,56- 91,6% vào 10 NSP (Nguyễn Thị Lộc, 2004). Khóa Luận Tốt Nghiệp SVTH: Phan Công Nhật 31 Đánh giá hiệu lực diệt côn trùng của chế phẩm M.anisopliae thông qua các thí nghiệm trên diện rộng tại ruộng, vườn cây ăn trái ở Ô Môn- Cần Thơ. Kết quả cho thấy rằng: Chế phẩm nấm xanh có hiệu lực rất tốt (tỷ lệ chết đạt từ 69-91%) đối với côn trùng chích hút như các loài rầy hại lúa, rầy chổng cánh trên cam quýt, rầy mềm hại xoài, bọ xít hại nhãn, bọ xít hại lúa, bọ cánh cứng hại dừa, mối hại cây trồng. Kết quả thử nghiệm còn chứng tỏ rằng đối với sâu non của côn trùng bộ cánh vảy thì nấm trắng có hiệu lực cao hơn nấm xanh, nhưng đối với côn trùng chích hút, mối và bọ cánh cứng hại dừa thì nấm xanh lại có hiệu lực mạnh hơn nấm trắng. Một số chế phẩm từ Metarhizium hiện nay được sử dụng ở Việt Nam Hình 3.1. Chế phẩm Metarhizium anisopliae trừ bọ cánh cứng Hình 3.2. Chế phẩm Metavina 80LS Khóa Luận Tốt Nghiệp SVTH: Phan Công Nhật 32  Chế phẩm Metavina 80LS được sử dụng để diệt mối hại công trình đê, đập.  Chế phẩm Metavina 10DP được sử dụng để phòng mối cho các công trình xây dựng mới hay cải tạo, nâng cấp.  Chế phẩm Metavina 90DP được sử dụng để diệt mối cho các công trình đang sử dụng, xây dựng mới.  Chế phẩm Metament 90DP được sử dụng để diệt tuyết trùng, bọ nhảy, ấu trùng bọ hung, bọ hà, sâu xám. Hình 3.3. Chế phẩm Metament 90DP Hình 3.4. Chế phẩm BIMA Khóa Luận Tốt Nghiệp SVTH: Phan Công Nhật 33 CHƯƠNG 4 QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT CHẾ PHẨM NẤM METARHIZUM SPP TRỪ SÂU HẠI 4.1. Một số yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm [4, 7, 8] 4.1.1. Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy Môi trường nuôi cấy là yếu tố quan trọng cho nấm sinh trưởng và phát triển, nếu môi trường không tốt, nấm mọc yếu hoặc không mọc. Trong quá trình nảy mầm để hình thành bào tử, nấm Metarhizium cần các nguồn C, N. Sự phát triển của nấm phụ thuộc vào các chất ức chế khác nhau. Môi trường thích hợp nhất cho nấm phát triển là môi trường có chứa kitin làm nguồn cacbon. Các nghiên cứu cho thấy, nếu bổ sung thêm chất kitin và glucoza trong quá trình nuôi cấy. Nấm Metarhizium sẽ thu được số lượng bào tử cao, vì thành phần kitin trong môi trường nuôi cấy là rất cần thiết đối với các loại nấm, giúp hình thành và phát triển bào tử đính (conidiospore) và bào tử trần (blastoospore). Ngoài nguồn Nitơ vô cơ ra, nấm Metarhizium còn sử dụng tốt nguồn hữu cơ như protein, peptone, các axit amin trong đó có axit glutamic là axit thích hợp cho nấm phát triển. Các nguyên tố vi lượng như Zn2+, Mg2+ … có tác dụng kích thích cho sự phát triển của nấm. Tùy từng loại nấm Metarhizium mà nhà sản xuất lựa chọn môi trường thích hợp để cho các loại nấm phát triển tốt, đạt chất lượng cao. 4.1.2 Nghiên cứu về ảnh hưởng của nhiệt độ và độ ẩm đến quá trình phát triển của nấm M. anisopliae Nhiệt độ và độ ẩm là hai yếu tố quan trọng có ảnh hưởng lớn đến sự phát triển của nấm. Viện Bảo vệ thực vật (dẫn theo Nguyễn Văn Tuất, 2004) đã xác định phạm vi nhiệt độ thích hợp cho nấm Metarhizium phát triển tốt, nằm trong khoảng 25 - 30⁰C, ẩm độ thích hợp trong phạm vi từ 80- 90%. Trên hoặc dưới Khóa Luận Tốt Nghiệp SVTH: Phan Công Nhật 34 ngưỡng nhiệt, ẩm độ đó thì nấm sẽ phát triển yếu, khi nhiệt độ quá cao thì bào tử dễ bị chết, hoặc không hình thành bào tử. 4.1.3. Ảnh hưởng của ánh sáng Qua nhiều năm sản xuất vi nấm, Viện Bảo vệ thực vật (Nguyễn Văn Tuất, 2004) xác định nấm M. anisopliae phát triển tốt trong điều kiện ánh sáng yếu, chỉ cần một lượng ánh sáng nhỏ trong ngày với thời gian 6-8 giờ cũng đủ cho nấm phát triển tốt. Vì vậy, phòng nuôi cấy nấm phải che ánh sáng mặt trời để hạn chế tia tử ngoại. 4.1.4. Ảnh hưởng của độ thoáng khí Hầu hết các loại nấm côn trùng thuộc loại hiếu khí. Khi nấm phát triển chúng đòi hỏi điều kiện có hàm lượng oxy thích hợp trong cả biên độ rộng cũng như trong dụng cụ nuôi cấy. Phạm Thị Thùy và cs (2010) cho biết, phạm vi thích hợp cho các loài nấm phát triển là 0,3 - 0,7 m3 môi trường / m3 không khí. Nếu sản xuất lớn, cần để độ dày bề mặt của nấm trên khay ray nia khoảng 10 - 15 cm trong phòng sản xuất có không gian thích hợp và điều kiện ẩm độ phù hợp. 4.1.5. Ảnh hưởng của hàm lượng nước Nấm kí sinh côn trùng đòi hỏi hàm lượng nước thích hợp, nếu quá khô hoặc quá ẩm thì nấm đều phát triển không tốt. Tỷ lệ nước thích hợp trong môi trường để nấm phát triển tốt là 30 - 50%. (Phạm Thị Thùy, 2010). 4.1.6. Ảnh hưởng của pH Phạm vi nấm kí sinh côn trùng sống ở pH từ 3,5 - 8,0. Tuy nhiên nấm ưa môi trường axit và phát triển thích hợp nhất ở pH từ 5,5 - 6. Vì vậy các tác giả khuyến cáo bổ sung vào môi trường một lượng nhỏ KH2PO4 và MgSO4 và MgSO4.7H2O, mục đích là để duy trì tính ổn định của pH trong môi trường nuôi cấy (Phạm Thị Thùy, 2010). Các tác giả cho rằng trong quá trình sản xuất, cần chú ý đến những yếu tố ảnh hưởng để tạo ra những điều kiện sản xuất thích hợp, nhằm thu được lượng sinh Khóa Luận Tốt Nghiệp SVTH: Phan Công Nhật 35 khối cao, chất lượng thuốc nấm ổn định và không có hiện tượng gây tạp nhiễm (Nguyễn Văn Tuất, 2004; Phạm Thị Thùy, 2010). 4.2. Công nghệ sản xuất nấm Metarhizium spp [2, 4, 7, 8] 4.2.1. Sử dụng các chủng giống để sản xuất Nguyễn Văn Tuất (2004), Phạm Thị Thùy (2010), cho biết một số nguồn chủng giống có thể dùng để sản xuất chế phẩm nấm Metarhizium spp. - Nấm Metarhizium anisopliae, chọn chủng nấm Metarhizium anisopliae được phân lập trên rầy nâu, trên bọ hại dừa. - Nấm Metarhizium flavoviride, chọn chủng Metarhizium flavoviride được phân lập trên cào cào, châu chấu. 4.2.2. Chọn môi trường a) Môi trường nhân giống cấp 1 (trên ống thạch): Một số môi trường phổ biến đang được sử dụng rộng rãi ở Việt Nam (Theo Nguyễn Văn Tuất, 2004; Phạm Thị Thùy, 2010)  Môi trường Crapek Dox - Agar 20 g - Sacharoza 30 g - NaNO3 3 g - KH2PO4 1 g - MgSO4.7H2O 0,1 g - KCl 0,5 g - FeSO4 0,01g - H2O 1000 ml - pH 5,5  Môi trường Sabouraud - Agar 20 g - Glucoza 40 g Khóa Luận Tốt Nghiệp SVTH: Phan Công Nhật 36 - Pepton 10 g - H2O 1000 ml - pH 6  Môi trường Sabouroud khoáng chất ( PT.Thùy 1992) - Agar 20 g - Pepton 10 g - Glucoza 40 g - MgSO4. 7H2O 0,5 g - KH2PO4 1g - H2O 1000 ml - pH 6 b) Chọn môi trường nhân giống cấp 2  Phương pháp lên men chìm :  Môi trường cao nấm men (Rombach và Agula, 1988): - Cao nấm men 10 g - Pepton 15 g - KH2PO4 1 g - MgSO4. 7H2O 1g - Aga 20 g - H20 1000 ml - pH 6  Môi trường Sabouroud, Dextroza, Aga, cao nấm men ( SDAY) - Cao nấm men 10 g - Pepton 15 g - Sacharoza 10 g - Aga 20 g - H20 1000 ml Khóa Luận Tốt Nghiệp SVTH: Phan Công Nhật 37 - pH = 6,5  Phương pháp lên men xốp:  Môi trường sản xuất: - Bột cám gạo 50% - Bột ngô 30% - Bột đậu tương ( hoặc đậu xanh) 10% - Trấu ( hoặc bã mía, vỏ lạc) 10% Năm 2003- 2004, Phạm Thị Thùy và cs đã nghiên cứu môi trường sản xuất nấm M. anisopliae có thành phần 50% cám gạo, 20% bột ngô, 20% bột đậu, 10% trấu với tỷ lệ nước/ môi trường sản xuất là 50%, cấy chủng nấm M. anisopliae được phân lập trên bọ sữa Phú Quốc, chất lượng chế phẩm nấm đạt cao 3,0 x 1010 BT/g. Đây là kết quả rất tốt có triển vọng rút ngắn số lượng chế phẩm nấm để phòng trừ sâu hại trên 1 ha cây trồng, nhằm giảm giá thành cho nông dân. 4.3. Phương pháp sản xuất [2, 4, 6, 7, 8] 4.3.1. Lên men chìm Với phương pháp này giúp chúng ta dễ dàng thu nhận sinh khối bào tử, tinh thể độc và các sản phẩm khác như chất kháng sinh, các độc tố ở dạng hòa tan trong môi trường dinh dưỡng của Metarhizium anisopliae để diệt sâu bệnh. Ngoài ra phương pháp này có ưu điểm là môi trường dinh dưỡng có thể đáp ứng hoàn toàn với nhu cầu sinh lí của Metarhizium anisopliae. Do đó hiệu suất thu sản phẩm cao, tự động hóa trong công nghệ giúp giảm nhân công và diện tích làm việc không quá lớn.  Các bước tạo chế phẩm từ Metarhizium anisopliae bằng con đường lên men chìm : Bước 1: Chuẩn bị ống giống nuôi 5-7 ngày Bước2 : Nhân giống trong bình 250ml có 100ml môi trường, lắc 200v/ phút, ở nhiệt độ 28 - 300C và nuôi trong 24 giờ. Khóa Luận Tốt Nghiệp SVTH: Phan Công Nhật 38 Bước3: Nhân giống trong bình 1000ml môi trường. Lắc 200v/phút, ở nhiệt độ 28-30oC, nuôi 24 giờ . Bước4: Lên men trong hệ thống tự động, khuấy 550v/phút, ở nhiệt độ 29 - 30oC nuôi trong 72 giờ. Bước 5: Li tâm lạnh 3000v/phút trong 40 phút. Sau đó thu sinh khối và bổ sung chất phụ gia. Bước 6 : Sấy khô ở 30-35oC. Bước 7 : Nghiền nhỏ, vô bao kín, bảo quản ở 5-10oC. Khóa Luận Tốt Nghiệp SVTH: Phan Công Nhật 39  Sơ đồ làm rõ cho các bước Sơ đồ 3.1. Sơ đồ lên men chìm được sản xuất tại một số cơ sở trong nước Trong phương pháp lên men chìm ngoài việc sử dụng các nồi lên men thông thường, người ta còn áp dụng nuôi cấy trong các đệm plastic trên quy mô công nghiệp khi áp dụng nuôi cấy chủng này để thu chế phẩm diệt sâu hại. Khi áp dụng lên men chìm có thể gặp những hạn chế như trang thiết bị phức tạp, kinh phí đầu tư cao, kĩ thuật công nghệ tiên tiến. Khi nuôi cấy Metarhizium anisopliae chỉ thu được bào tử chồi, bào tử này có sức sống kém, thời gian sống ngắn, cấu trúc kém . Nhân giống Lên men Ly tâm Sấy Chế phẩm Giống Khóa Luận Tốt Nghiệp SVTH: Phan Công Nhật 40 4.3.2. Lên men bề mặt không vô trùng Trong điều kiện thiếu trang thiết bị hoàn chỉnh để lên men chìm, người ta có thể sử dụng phương pháp lên men bề mặt không vô trùng để thu nhận chế phẩm diệt côn trùng từ nấm, vi khuẩn. Khâu khó khăn nhất trong quy trình này là hạn chế sự nhiễm tạp của vi khuẩn lạ. Do môi trường không được hấp khử trùng. Để khắc phục ta có thể đun môi trường ở 100⁰C trong 30 phút, khi nguội cho thêm kháng sinh streptomycine 0.01%.  Các bước lên men bề mặt Bước 1 : Nấm nuôi trong ống thạch nghiêng hay đĩa pertri 7-10 ngày ở nhiệt độ 28 - 30 oC Bước 2 : Lấy bào tử Bước 3 : Cho vào các chậu thủy tinh lớn có lớp môi trường dịch 1 – 1,5 cm (chậu phải được sấy ở 100oC trong 30 phút, môi trường dịch nấu sôi ở 100oC trong 30 phút). Bước 4 : Nuôi 12 ngày ở nhiệt độ 25 - 30oC. Bước 5 : Vớt thảm nấm có bào tử, đồng thời cuốn tròn mặt bào tử ở trong. Bước 6 : Thấm cho ráo nước và bổ sung chất phụ gia. Bước 7 : Nghiền nhỏ bằng máy nghiền. Bước 8 : Sấy khô ở 30 - 35oC. Bước 9 : Vô bao, bảo quản ở 5 -10oC. Khóa Luận Tốt Nghiệp SVTH: Phan Công Nhật 41  Sơ đồ làm rõ cho các bước: Sơ đồ 3.2. Sơ đồ lên men bề mặt không vô trùng Nấm Lấy bào tử Vào chậu Nuôi Vớt thảm Nghiền Sấy Chế phẩm Khóa Luận Tốt Nghiệp SVTH: Phan Công Nhật 42 Ngoài ra để đảm bảo được sự phát triển áp đảo của chủng vi sinh vật nuôi cấy, cần tuân thủ các nguyên tắc sau : - Môi trường sau khi đun 100oC trong 30’, được để nguội và cấy bào tử vào, số bào tử này sẽ khuếch tán thành một màng mỏng khắp bề mặt môi trường. Trong thời gian nhất định chúng sẽ ngăn cản không cho không khí khuếch tán vào môi trường. Do vậy cũng làm hạn chế sự tạp nhiễm của các vi sinh vật lạ. Lượng bào tử cấy vào đủ để áp đảo vi sinh vật lạ là 1- 2 tỉ bào tử/cm3 - pH của môi trường trong khoảng 5.0 - 5.5 thích hợp cho sự phát triển của nấm, vi khuẩn. 4.3.3. Lên men xốp  Quy trình sản xuất nấm M.anisopliae của Ninh Thị Huyền Nga Trường Nông Lâm Tp. HCM (2005). Phương pháp này được sử dụng thành công để sản xuất nấm Metarhizium và một số nấm diệt côn trùng khác. Trong quy trình lên men xốp này, tác giả sử dụng các loại cơ chất khác nhau như bột đậu nành, bã đậu phụ, lúa, gạo cùng với dịch dinh dưỡng nuôi cấy nấm Metarrhizium.  Quy trình được mô tả như sau: Bước 1: Chuẩn bị ống giống. Bước 2: Cho vào môi trường xốp trong bình 250 ml, nuôi 4 - 5 ngày ở nhiệt độ 28 -32⁰C. Bước 3: Môi trường xốp trong chậu thủy tinh (khử trùng 100⁰C trong 40 phút) và bổ sung 10% giống, nuôi 10 ngày ở 28 - 32⁰C, độ ẩm tương đối 95%. Bước 4: Làm khô ở nhiệt độ phòng có quạt, độ ẩm dưới 10% hoặc sấy ở 40oC. Bước 5: Nghiền nhỏ, vô bao, bảo quản ở 5 - 10oC trong tối. Khóa Luận Tốt Nghiệp SVTH: Phan Công Nhật 43  Sơ đồ làm rõ cho các bước: Sơ đồ 3.3. Quy trình lên men xốp Ống giống 5 -7 ngày Môi trường dịch thể, lắc 200 vòng/phút, nuôi tº= 28 - 30ºC Môi trường xốp trong bình 250ml, nuôi 4 -5 ngày ở tº = 28 - 32ºC Môi trường xốp trong chậu thủy tinh ( khử trùng 100ºC trong 30 – 40 phút) + 10% giống. Nuôi 10 ngày ở tºC= 28- 32ºC. Nghiền nhỏ. Đóng bao nhãn. Kiểm tra chất lượng. Bảo quản ở 5 - 10ºC Làm khô ở nhiệt độ phòng. Có quạt. Độ ẩm 10% hoặc sấy ở 40ºC Khóa Luận Tốt Nghiệp SVTH: Phan Công Nhật 44 Công thức tính số lượng bào tử trong 1g bột nấm 4000x 1000x a x 10-n D= b D: số bào tử trong 1 g bột nấm a: số bào tử đếm được n: nồng độ pha loãng b: số ô nhỏ nhất của buồng đếm hồng cầu  Quy trình lên men xốp của Viện Bảo vệ thực vật (Nguyễn Văn Tuất, 2004; Phạm Thị Thùy, 2010). Chọn chuẩn nấm: - Sản xuất nấm Metarhizium flavoviride phải chọn chủng Metarhizium flavoviride được phân lập trên cào cào, châu chấu. - Sản xuất nấm Metarhizium anisopliae chọn chuẩn Metarhizium anisopliae được phân lập trên rầy nâu hoặc trên bọ hại dừa. - Chọn môi trường nhân giống cấp 1 và nhân giống cấp 2: - Chuẩn bị các môi trường cấp 1 và cấp 2 - Môi trường cấp 1 khử trùng 0,8 at trong 30 phút. - Môi trường cấp 2 và môi trường sản xuất lên men xốp phải khử trùng 1 at trong 30 phút. Cấy giống cấp 1 vào môi trường nhân giống và môi trường sản xuất theo quy trình sau: Khóa Luận Tốt Nghiệp SVTH: Phan Công Nhật 45 Ống giống thuần Môi trường nhân giống cấp 1 Môi trường nhân giống cấp 2 Rải ra nia để hình thành bảo tử trần (2 ngày) Thu sinh khối, sấy 40- 45ºC trong 6-8 giờ Hỗn hợp phụ gia để tạo chế phẩm nấm Kiểm tra chất lượng bào tử nấm Thử hoạt lực trên sâu Đóng gói, bảo quản và sử dụng Hình 3.4 . Quy trình sản xuất nấm Mat theo phương pháp lên men bề mặt (xốp) ( Quy trình này được cấp Bằng Độc quyền sáng chế số 3451 ngày 7/4/2003) Khóa Luận Tốt Nghiệp SVTH: Phan Công Nhật 46 4.3.4. Tạo chế phẩm ở qui mô nhỏ - thủ công [2] Bước 1: Chuẩn bị môi trường gạo nuôi cấy nấm: ngâm gạo với nước trong 1 - 1 giờ 30 phút (tùy theo gạo mềm cơm hay cứng cơm, rẻ nhất là sử dụng gạo IR 50404), vớt gạo cho vào từng bọc nylon trung bình là 500 g/bọc, buộc kín miệng bằng dây thun. Bước 2 : Hấp khử trùng: cho nước ngập đến vỉ ngăn nước nồi nhôm rồi cho từng bọc gạo nylon vào nồi, hấp thanh trùng khoảng 1 - 1 giờ 30 phút (kể từ nước sôi), đun bằng than đá hoặc củi. Vớt bọc gạo ra ngoài để nguội. Bước 3 : Chủng nấm nguồn vào môi trường gạo: chia dĩa nấm Metarhizium anisopliae gốc thành 6 phần bằng nhau (1/6 để sử dụng 1 bọc gạo nylon), dùng dao rạch nấm gốc thành từng miếng nhỏ, rồi cấy vào một bọc gạo nylon, dùng co ống nước làm miệng, đậy nắp gòn và bịt đầu môi trường. Đem ủ chế phẩm để nơi cao ráo thoáng mát trong điều kiện nhiệt độ từ 28 - 30 độ, lắc bọc chế phẩm một lần/ngày, sau 10 - 14 ngày quan sát thấy nấm xanh bao phủ hết hạt gạo (hạt gạo nhỏ dần), có thể sử dụng được hòa chế phẩm trong nước qua vải lược, mỗi bọc cho 4 bình 16 lít (2 bình/1.000 m2), khi cho chế phẩm vào bình pha thêm 5cc chất bám dính, phun chậm vào gốc lúa và phun xịt lúc trời mát (dẫn theo Huỳnh Thanh Bình 2003). 4.4. Cải tiến quy trình bảo quản giống gốc 4.4.1. Phục hồi giống gốc Nâng cao hoạt tính diệt côn trùng của các chủng nấm đã có từ trước đây bằng cách cấy truyền qua côn trùng rồi phân lập và thuần hóa lại để nâng cao hoạt tính diệt côn trùng của các chủng nấm Metarhizium. Kết quả thí nghiệm cho thấy rằng nếu nấm xanh được nuôi cấy và cấy truyền qua 4 - 5 lần trên môi trường nhân tạo thì khả năng sinh trưởng phát triển sự sinh bào tử và độ độc của chúng đối với côn trùng sẽ giảm đi một cách có ý nghĩa so với nấm mới phân lập. Nhưng sau khi lây nhiễm nấm trở lại ký chủ của Khóa Luận Tốt Nghiệp SVTH: Phan Công Nhật 47 nó rồi phân lập và tạo thuần trở lại thì những đặc tính sinh học này của chúng được phục hồi trở lại. Vì vậy, các tác giả cho rằng sau 4- 5 thế hệ, cần phải phục hồi giống gốc bằng cách cấy lại trên côn trùng ký chủ. 4.4.2. Các phương pháp bảo quản một số giống nấm côn trùng ở Việt Nam Đến nay, Viện Bảo vệ thực vật bảo quản bộ giống nấm theo một số phương pháp sau: a) Bảo quản truyền thống Ở nhiệt độ phòng từ 1- 2 tuần tùy theo điều kiện nuôi cấy khác nhau, sau đó giữ trong lạnh ở nhiệt độ 5- 6ºC, cứ sau 2- 3 tháng cấy truyền lại. Phương pháp này này đơn giản nhưng tốn công, mặt khác giống bảo quản không được lâu. Tuy nhiên phương pháp này hiện nay đang được áp dụng phổ biến vì thuận lợi trong việc sử dụng giống để sản xuất kịp thời mỗi khi có dịch. b) Bảo quản để trong tủ lạnh sâu Dưới âm độ với những nguồn nấm mới có độc tố cao nhưng ít sử dụng, ví dụ như nguồn của nước ngoài, nguồn thu cũ, để lâu không sử dụng,...để sản xuất,.... c) Bảo quản trong dầu khoáng Bằng cách đổ đầy trên bề mặt giống lớp dầu khoáng 1- 2 cm, phương pháp này có thể giữ được 2 – 5 năm. d) Bảo quản theo phương pháp hút bào tử nấm bằng máy hút chân không Sau đó cất giữ trong tủ lạnh, phương pháp này có thể giữ được vài năm. e) Bảo quản trong dịch Slicagel Phương pháp này có thể giữ được 8 – 10 năm. f) Bảo quản trong NitroGel lỏng Phương pháp này có thể giữ được khá lâu 10 – 15 năm. g) Bảo quản bằng phương pháp đông khô vi sinh vật Phương pháp này có thể giữ được 5 – 7 năm. Khóa Luận Tốt Nghiệp SVTH: Phan Công Nhật 48 Việc bảo quản bộ giống nấm mục đích là để lưu giữ bộ gen vi sinh vật quý, mặt khác dùng để so sánh và đối chiếu với các mẫu chuẩn của quốc tế. Trong công nghệ sản xuất chế phẩm nấm, không nên sử dụng những chủng bảo quản lâu. Việc sản xuất nấm sử dụng những chủng mới nguồn địa phương được phân lập trên những đối tượng sâu hại cần phòng trừ, như vậy sẽ đạt hiệu quả cao. Khóa Luận Tốt Nghiệp SVTH: Phan Công Nhật 49 CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1. Kết luận Qua bài khóa luận này, sinh viên đã hiểu biết thêm được ý nghĩa và vai trò của biện pháp đấu tranh sinh học trong phòng trừ sâu bệnh hại cây trồng. Trong số các tác nhân sinh học sử dụng trong phòng trừ sâu hại cây trồng thì nấm xanh Metarhizium anisopliae có tiềm năng khá lớn. Các nghiên cứu của các tác giả cho thấy, nấm xanh có hiệu quả phòng trừ cao đối với nhiều loài sâu hại, đặc biệt là nhóm côn trùng chích hút. Có thể ứng dụng kỹ thuật Công nghệ sinh học để sản xuất nấm xanh Metarhizium anisopliae, tạo chế phẩm để phổ biến cho sản xuất, phòng trừ sâu hại cây trồng. Nguyên liệu sử dụng cho công nghệ sản xuất chủ yếu dựa trên nguồn sẵn có trong nước, giá thành rẻ nên có thể phát triển và duy trì sản xuất, cạnh tranh với các sản phẩm khác. 5.2. Kiến nghị Để tăng cường hiệu quả diệt sâu của chế phẩm, cần nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng của yếu tố ngoại cảnh đến việc bảo quản và duy trì hiệu lực của chế phẩm trên đồng ruộng. Sản xuất thuốc trừ sâu có nguồn gốc từ sinh học là vấn đề phức tạp cần được đầu từ về thời gian, lực lượng cán bộ khoa học và chuyên gia có năng lực, thiết bị đồng bộ và kinh phí ban đầu cho hoàn thiện công nghệ và sản xuất thử nghiệm, thậm chí còn phải hỗ trợ về giá, về quảng cáo sản phẩm, rất cần được nhà nước quan tâm giúp đỡ. Khóa Luận Tốt Nghiệp SVTH: Phan Công Nhật 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Tài liệu tiếng Việt [1]. Hoàng Minh Châu, 1998. Cẩm nang sử dụng phân bón, NXB Thông tin khoa học kỹ thuật hoá chất. [2]. Huỳnh Thanh Bình, 2003. Mô hình sản xuất nấm xanh Metarhizium anisopliae để phòng trừ rầy nâu hại lúa tại nông hộ gia đình tỉnh Sóc Trăng. Trích trong Báo cáo tại hội nghị Khoa học công nghệ toàn quốc về BVTV lần thứ 3 tháng 8 năm 2003. [3]. Nguyễn Thị Chắt,1999. Côn trùng cơ bản. Đại học Nông Lâm - Tp Hồ Chí Minh. [4]. Nguyễn Văn Tuất, 2004. Báo cáo tổng kết khoa học và kỹ thuật Đề tài: Nghiên cứu sản xuất sử dụng thuốc sâu sinh học đa chức năng cho một số loại cây trồng bằng kỹ thuật công nghệ sinh học. Bộ Khoa học và công nghệ - Viện bảo vệ thực vật. [5]. Nguyễn Lân Dũng, 1981. Sử Dụng Vi Sinh Vật Để Phòng Trừ Sâu Hại Cây Trồng, NXB Khoa Học Kỹ Thuật. [6]. Ninh Thị Huyền Nga, 2005. Khảo sát hoạt tính của nấm Metarhizium anisopliae trên sùng trắng, Khóa luận tốt nghiệp, Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. [7]. Phạm Thị Thùy và cộng sự 2003. Nghiên cứu công nghệ sản xuất và ứng dụng chế phẩm Beauveria và Metarhizium để phòng trừ một số sâu hại cây trồng. Tuyển tập công trình nghiên cứu Bảo vệ thực vật NXB Nông Nghiệp. [8]. Phạm Thị Thùy, 2010. Giáo trình Công nghệ sinh học trong Bảo vệ thực vật. Nhà xuất bản giáo dục Việt Nam. [9]. Trần Văn Mão, 2004. Sử dụng vi sinh vật có ích, tập II - Ứng dụng nấm cộng sinh và sinh vật phòng trừ sâu hại. Nhà xuất bản nông nghiệp Hà Hội. Khóa Luận Tốt Nghiệp SVTH: Phan Công Nhật 51 [10]. Trần Như Ngọc, 2006. Luận văn tốt nghiệp Sử dụng kỹ thuật RFLP xác định sự đa dạng di truyền của nấm Metarhizium anisopliae và nấm Beauveri bassiana ký sinh trên côn trùng gây hại. Đại học Nông Lâm- Tp Hồ Chí Minh. 2. Nguồn internet [11]. &sid=1166