Khóa luận Tìm hiểu quy trình định lượng HCV bằng kỹ thuật Real time PCR

viêm gan mãn nhẹ và viêm gan mãn mức độ từ vừa đến nặng. Sự phân biệt này rất quan trọng về tiên lượng và chỉ định điều trị + Viêm gan mãn nhẹ: Viêm gan mãn nhẹ là khi sinh thiết gan cho thấy tổn thương mô học nhẹ. Theo cách tính của Knodell(1980) viêm gan mãn nhẹ là khi số điểm sơ hóa là 0 hoặc 1 và số điểm hoại tính viêm- hoại tử nhỏ hơn 6. + Viêm gan từ mức độ vừa đến nặng: Viêm gan từ mức độ vừa đến nặng là khi sinh thiết gan thấy có tổn thương viêm- họai tử đáng kể hoặc xơ hóa lan rộng. Theo cách tính của Knodell (1980) viêm gan mãn vừa và nặng được xác định là khi số điểm sơ hóa là 3 hoặc 4 và số điểm hoạt tính lớn hơn 6. Nhiễm cấp tính 60% Nhiễm cấp tính 1% 39% Viêm gan nặng Mệt mỏi Không triệu chứng Không triệu chứng Mệt mỏi Viêm gan nặng 2 tuần- 6 tháng 85% 15% Viêm gan mạn Hồi phục Viêm gan không biến chứng 10-30 năm Hồi phục Viêm gan mãn 20% Biến chứng xơ và ung thư Viêm gan không biến chứng 20% Biến chứng xơ và ung thư Hình 1.2: Sơ đồ diễn tiến bệnh siêu vi ( Nguồn: bệnh viện Hòa Hảo) Biện pháp phòng ngừa và điều trị [20.23] Biện pháp phòng ngừa Các vết máu khô từ những người nhiễm HCV có thể lây cho người khác trong khoàng thời gian từ 16 giờ đến 4 ngày, ở nhiệt độ phòng. Do đó, các vết máu cần phải được tẩy sạch và người thực hiện phải mang bao tay cao su. Không dùng chung ống chích, kim tiêm, bông băng. Không dùng chung dao cạo râu, bàn chải đánh răng, dụng cụ cắt móng tay. Quan hệ tình dục không an toàn. Băng vết thương để tránh tiếp xúc máu cho người khác. 1.5.2. Điều trị Điều trị viêm gan siêu vi đòi hỏi phải có kiến thức sâu về viêm gan và thuốc chống siêu vi . Do đó, bệnh nhân nên được điều trị và theo dõi bởi bác sĩ chuyên về viêm gan. Hiện nay, để chống lại viêm gan C là interferon, một thuốc ức chế sự nhân lên của virus. Các thuốc interferon dùng để điều trị viêm gan gồm: interferon α2b (Intron A), interferon α2a (Roferon-A) và interferon alfacon-1 (Infegen). Nhưng interferon chỉ có tác dụng ở khoảng 20% số trường hợp. Hiện nay, tiêm interferon thường được phối hợp với uống ribavirin-một thuốc kháng sinh virus phổ rộng. Điều trị thường mất sáu tháng đến một năm và thành công ở khoảng 40% số người bị HCV. Gần đây, một thuốc khác, interferon pegyl hóa có hiệu quả gấp hai lần interferon thông thường. Vào tháng 1-2001 Cơ quan quản lý thuốc và dược phẩm Mỹ đã cho phép dùng interferon pegyl hóa, interferon-peginterferon alfa-2b để điều trị viêm gan. Theo nghiên cứu của bác sĩ Nguyễn Thu Thủy-bệnh viện Hòa Hảo TP.HCM Hiệu quả điều trị phụ thuộc nhiều yếu tố như: giới tính, thời gian ủ bệnh, độ tuổi…… Yếu tố Thuận lợi Không thuận lợi Giới tính Độ tuổi Thời gian bệnh Xơ gan Cân nặng Nồng độ virus Genotype Nữ <40 Ngắn Không >75 kg Thấp Không phải type 1 Nam >40 Dài Có <75 kg Cao Type 1 Bảng 1.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình điều trị bệnh viêm gan C Do đó, các lời khuyên được đưa ra để giữ gìn sức khỏe và bảo vệ gan: P Theo dõi và tuân theo sự chỉ dẫn của bác sĩ chuyên khoa. P Hạn chế tối đa các chất kích thích như rượu bia các loại nước có gas, các loại hóa chất, các loại phụ gia PHạn chế chất béo động vật. PKhông sử dụng bất ký loại thuốc gì nếu không có chỉ định của bác sĩ đặc biệt các loại thuốc giảm đau, thuốc an thần, thuốc ngủ… PSống khoẻ mạnh, tập luyện vừa phải, ăn uống điều độ, không uống rượu, nghỉ ngơi đầy đủ là những phương thức tốt cho bịnh nhân viêm gan C để giữ gìn sức khoẻ, năng lượng. CHƯƠNG 2. TỔNG QUAN VỀ VIÊM GAN SIÊU VI C 2.1. Hepatitis C virus -HCV [10,11] HCV được xếp vào họ Flaviviridae vì có một số đặc tính về cấu trúc gen tương tự như Flavivirus và Peptivirus. Do số lượng, việc xử lý protein virus và các đặc điểm sao chép có một số khác biệt, nên gần đây HCV được xếp vào giống mới của họ Flaviviridae với tên Hepacivirus. HCV lại có chung các đặc điểm với Picornavirus và các virus thực vật như Potyvirus, làm cho ta lầm tưởng HCV là một mắt xích tiến hóa giữa các virus thực vật và động vật. HCV thuộc nhóm Flavirus HCV là một siêu vi nhỏ, hình cầu, đường kính khoảng 55-65nm. Trọng lượng phân tử vào khoảng 4106 daltons. Bộ gen của siêu vi C là một chuỗi đơn RNA độ 95000 nucleotide chứa một khung đọc mở dịch mã dài mã hóa một polypeptide lớn 3010-3033 amino acid bắt đầu tại codon methionin trong khung đọc đầu tiên và nằm bên trong phần nucleocapside 30-35nm có cấu trúc đối xứng 20 mặt. Ở ngoài cùng là lớp vỏ lipid chứa các protein E1 và E2 tạo thành các phức hợp primer. Kiểu đọc mở HCV mã hóa một tiền chất polyprotein mà tiền chất này được xử lý đồng dịch mã hoặc sau dịch mã để tổng hợp các protein cấu trúc ( C, E1, E2, p7) và các protein không cấu trúc (NS2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a và NS5b). HCV có 6 gentype được ký hiệu theo thứ tự từ 1 đến 6. Mỗi gentype có nhiều type phụ. Trong đó, thường gặp nhất là các type 1a, 1b, 2a, 2b, 3, 4, 5, 6. type 1a và 1b là khó chửa trị nhất vì độc lực mạnh của virus. Bên cạnh đó, HCV thường bị đột biến nên có khả năng tránh được các đáp ứng miễn dịch của cơ thể và dễ chuyển sang nhiễm mạn tính. 2.2. Cấu trúc Protein vỏ E1 HCV [4] Protein vỏ E2 Protein liên kết màng NS2 Protein lõi Hình 2.1. Cấu trúc HCV (Nguồn: James A. Perkin, 2001) Vật liệu di truyền của HCV là một chuỗi RNA mạch( +), chứa khoảng 9400 nucleotide mã hóa cho một polyprotein tiền thể gồm 3011 amino acid. Gen chứa một khuôn đọc mở với các trình tự được trình bày trong hình 2.2 Hình 2.2: Sơ đồ cấu trúc gen HCV (Nguồn: James A. Perkin, 2001) P Đầu 5’ không dịch mã: có chức năng điều hòa dịch mã. PC (nucleocapsid): protein lõi. PE1 (envelope): protein vỏ. PE2 (envelope): protein vỏ. PNS2 (membrane binding protein): một protein liên kết với màng. PNS3 (protease/helicase): các enzyme thủy giải và cắt đứt liên kết hydro. PNS4 (membrane binding protein): một protein liên kết với màng. PNS5 (polymerase): enzyme nhân bản vật liệu di truyền. Gen của siêu vi C là một chuỗi đơn RNA có cực tính dương, gồm khoảng 9500 nucleotide được chia làm ba vùng: (i)Đầu 5’ không mã hóa gồm 341-344 nucleotide. Đây là vùng tương đối bị ít biến đổi nhất giữa các phân type khác nhau. Do đó vùng này như là một chất mồi để phát hiện RNA của siêu vi C bằng phương pháp PCR. Chức năng của vùng này là tham gia vào quá trình điều hòa nhân đôi của siêu vi. (ii)Vùng được mã hóa nằm giữa hai đầu 5’ và 3’. Vùng này chỉ có một khung đọc mở duy nhất gồm 9379-9481 nucleotide, được giải mã để tổng hợp một polyprotein tiền chất của siêu vi gồm khoảng 3000 acid amin. Sau đó, protein này sẽ được các enzyme protease của siêu vi và các enzyme peptidase tín hiệu của tế bào phân cắt thành protein cấu trúc và protein không cấu trúc. (iii)Đầu 3’ không mã hóa: RNA virus chỉ có một khung đọc mẫu duy nhất mã hóa khoảng 3010-3033 aa, hai đầu được gắn kết bởi các vùng không dịch mã 3’ và 5’. Polyprotein được phân cắt sau dịch mã với các peptidase tín hiệu và các protease mã hóa virus NS2-3 và NS 3-4 để sinh ra các protein cấu trúc và không cấu trúc trưởng thành. 2.2.1. Các protein cấu trúc Các protein cấu trúc bao gồm C, E1 và E2 : PProtein capsid = protein C (21 kDa) tạo nên phần nucleocapsid bao bọc bên ngoài chuỗi gen của siêu vi. PProtein E1 (37 kDa) và E2 (61 kDa) là hai glycoprotein của lớp vỏ, liên kết với nhau thành các phức hợp dimer. Ở protein E2 có hai vùng siêu biến là HVR1 (ở vị trí acid amin 390-410) và HVR2 (ở vị trí acid amin 474-480). Vùng siêu biến này thường xuyên bị biến đổi qua mỗi lần siêu vi nhân đôi, tạo ra sự khác biệt giữa các gen của siêu vi C trong cùng một bệnh nhân. HVR1 còn là nơi kích thích hệ thống miễn dịch tạo ra kháng thể trung hòa. Vì vậy kháng thể mà cơ thể tạo ra không theo kịp sự biến đổi liên tục tại vùng HVR1. Đây là cơ chế giúp siêu vi trốn tránh được đáp ứng miễn dịch của ký chủ và làm cho tình trạng nhiễm siêu vi C thường chuyển sang mãn tính. PProtein p7 (7 kDa) mà chức năng vẫn chưa được biết rõ. 2.2.2. Các protein không cấu trúc: PProtein NS2 (23 kDa). PProtein NS3 (68 kDa). PProtein NS4 ( gồm NS4A và NS4B). Protein NS5 ( gồm NS5A và NS5B) : NS5A (56-58 kDa) có liên quan đến chuyển hóa lipid vì nó tương tác với thành phần apolipoprotein Á. Vùng NS5A còn được xem là vùng quyết định nhạy cảm của siêu vi C đối với interferon-alpha.Vùng này làm mất tác dụng của interferon qua trung gian việc ức chế men protein kinase PKR. Một khi PKR bị ức chế, nó sẽ không ức chế quá trình nhân đôi của siêu vi. Nếu có đột biến xảy ra ở vùng NS5A có thể tạo được sự đáp ứng tốt với interferon. NS5B (65kDa) chính là men RNA polymerase phụ thuộc RNA. Men này dùng để tổng hợp chuỗi RNA từ khuôn mẫu là RNA. 2.3. Cơ chế gây bệnh Đầu tiên, HCV gắn vào một thụ thể trên bề mặt tế bào gan nhờ hai glycoprotein bề mặt của nó là E1 và E2, thực hiện quá trình hòa màng. RNA mạch (+) của HCV được dịch mã nhờ hệ thống dịch mã của tế bào chủ. Protein tiền thể tạo ra sẽ được phân cắt bởi enzyme tín hiệu để tạo ra các protein cấu trúc C, E1, E2 và các protein không cấu trúc là NS1-NS5. Sau đó bắt đầu phiên mã ngược để tạo ra mạch RNA mạch (-) bổ sung với mạch (+) đã có nhờ vào enzyme Reverse Tranriptase. Sau đó, capsomer được tạo ra từ các protein thành phần như C, E1, E2 sẽ kết hợp với RNA kép của HCV để tạo thành dạng nucleocapsid. Nucleocapsid này tiến đến tương tác với màng tế bào để thoát ra ngoài, trở thành dạng virus hoàn chỉnh và đi xâm nhiễm một tế bào khác. 2.3.1. Sự sao chép và xâm nhập vào tế bào vật chủ Các bước sao chép được mô tả như sau : PProtein màng của E2 giúp gắn kết virus vào tế bào. P Sự cởi bỏ vỏ ngoài của HCV. P Quá trình dịch mã và xử lý protein. P Sự tổng hợp RNA HCV mạch âm nhờ RNA polymerase được mã hóa trong vùng NS5B. P Tổng hợp RNA HCV mạch dương : Sau khi hình thành, chuỗi RNA mạch âm thành khuôn mẫu để tổng hợp bộ gen RNA mạch dương của virus mới. Quá trình này được thực hiện bởi HCV RNA polymerase. P Sự tạo vỏ ngoài HCV : Sự nảy chồi của HCV, các hạt RNA được tạo vỏ nảy chồi qua màng bào tương. P Sự bài tiết HCV kết hợp chủ yếu với lưới nội bào tương với khoảng 1012 virion HCV mỗi ngày. 2.3.1.1. Nhiễm HCV cấp HCV được truyền từ người sang người theo đường máu hoặc tiếp xúc với dịch cơ thể người mang HCV. HCV có thể lưu hành tự do trong huyết tương và gây nhiễm các tế bào di động như lympho bào, bạch cầu đơn nhân. Ngoài ra, bằng phương pháp lai in situ, PCR và các nghiên cứu miễn dịch huỳnh quang đã tìm thấy các thành phần virus trong tế bào gan, các tế bào lympho B và T, và các đại thực bào, và hóa học mô miễn dịch đã chứng minh các kháng nguyên virus trong các tế bào thượng bì đường mật và trong các tế bào thượng bì tuyến nước bọt. Việc phát hiên này có nhiều ý nghĩa rất quan trọng : -Việc nuôi cấy siêu vi C có thể thực hiện được ở các dòng lympho bào. - Các tế bào đơn nhân có thể là nguồn chứa siêu vi và đặc biệt có thể là nguyên nhân gây tái nhiễm siêu vi C sau khi ghép gan. - Sự lây nhiễm ở các tế bào đơn nhân có thể chọn lọc nên một vài  biến chủ  đặc biệt và tạo điều kiện cho bệnh tồn tại kéo dái. -RNA virus thường được phát hiện 2 ngày sau truyền nhiễm, tuy nhiên không liên tục, cho thấy có các đơn bùng cháy sau chép virus. Khi được xác định bằng định lượng PCR và bằng xét nghiệm DNA nhánh, tình trạng huyết tương tăng lên mức độ cao (180 bộ gene/ml hay nhiều hơn) trước khi xuất hiện các triệu chứng lâm sàng. Mật độ của các hạt tử HCV trong huyết thanh rất thay đổi, từ 1,03 đến 1,72g/ml. Sở dĩ mật độ của HCV thay đổi như vậy là do các virion lưu hành trong máu dưới nhiều dạng khác nhau : hoặc là ở dạng tự do có tính lây nhiễm rất cao nhưng chỉ hiện diện với mật độ tương đối thấp (khoảng 1,03) ; hoặc là ở dạng kết hợp với các đại phân tử, đặc biệt là các lipoprotein hoặc hiện diện trong các phức hợp miễn dịch nhưng mật độ lại cao. 2.3.1.2. Nhiễm HCV mạn  Nhiễm HCV thường có 80% tình trạng virus có trong huyết thanh tồn tại, cho dù không có các triệu chứng lâm sàng và sinh hóa. Lượng virus trong huyết thanh được phát hiện trong quá trình tồn tại biến đổi thay đổi theo từng cá nhân, từ 102 – 1010 gene/ml, và có thể dao động mạnh theo thời gian. Tình trạng virus huyết thanh có lúc không phát hiện được cho là do dao động về số lượng tế bào nhiễm virus, các yếu tố vật chủ tác động lên sự thanh thải virus cũng như hiệu quả sao chép của các loài. CHƯƠNG 3. CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN BỆNH VIÊM GAN C 3.1. Chẩn đoán lâm sàng 3.1.1. Xét nghiệm chẩn đoán tình trạng viêm gan Định lượng các men AST (Alanin Amino Transferase ) và ALT (Aspartate Amino Transferase). Đặc điểm quan trọng về phương diện sinh hóa trong viêm gan siêu vi C là sự dao động của men ALT lúc tăng, lúc giảm thậm chí trong giới hạn bình thường. Sự tăng men gan trong viêm gan C cấp thường thấp hơn so với mức tăng trong viêm gan A và B. 3.1.2. Xét nghiệm đánh giá chức năng gan Chức năng bài tiết mật bị ảnh hưởng dẫn đến tình trạng tăng bilirubin trong máu ( cả bilirubin trực tiếp và bilirubin giáp tiếp) gây vàng da. Bilirubin là sản phẩm chuyển hoá của hemoglobin. Bilirubin gián tiếp và bilirubin trực tiếp thường được đo để tầm soát và theo dõi bệnh gan hay đường mật. Đánh giá chức năng tổng hợp yếu tố đông máu của gan bằng cách khảo sát Prothrombine bình thường 8,2-10,3 Taux de prothrombin bình thường lớn hơn 80%. INR bình thường 0,9-1,3. Đánh giá chức năng tổng hợp Albumin màu của gan. Trị số trung bình Albumin trong máu từ 35-55 g/l và tỷ số Albumin/Globulin bình thường từ 1-1,5. Albumin là protein quan trọng nhất của huyết thanh tham gia vào hai chức năng chính : duy trì áp lực thẩm thấu keo trong huyết tương và liên két vận chuyển phân tử nhỏ như : acid béo, bilirubin… Globulin chủ yếu là immunoglobulins (Ig's)- có nhiều lọai, IgM, IgE...) được tạo ra từ bạch cầu, thuộc về kháng thể và có chức năng nhận ra và "tấn công" các vật lạ xâm nhập cơ thể. Chức năng thải NH3 bình thường là 9-33µmol/L. Khi gan suy NH3 sinh độc cho cơ thể, đặc biệt là hệ thần kinh dẫn đến rối loạn tri giác, hôn mê. 3.1.3. Siêu âm bụng tổng quát Giúp chẩn đoán loại trừ các nghuyên nhân gây tắc mật khác như sỏi mật, u đường mật, u đầu tụy, hoặc các tổn thương như ung thư gan, sán lá gan… Trong viêm gan cấp, cấu trúc gan đồng nhất, gan có thể hơi to. Sinh thiết tế bào gan : quan sát tế bào gan dưới kính hiển vi, xác định mức độ viêm nhiễm chẩn đoán giai đoạn bệnh và đánh giá hiệu quả điều trị. 3.1.4. Xét nghiệm miễn dịch học Tìm anti-HCV trong máu. Tuy nhiên xét nghiệm này dương tính chỉ có tính chất gợi ý về tình trạng nhiễm HCV, không cho kết luận mới nhiễm hay đã nhiễm từ lâu và không thể kết luận chắc chắn là không còn mang HCV. 3.2. Chẩn đoán cận lâm sàng 3.2.1. Phương pháp bDNA Là một kỹ thuật lai phân tử giữa RNA HCV với những probe bắt cặp bổ sung với một trình tự có tính bảo tồn cao ở vùng 5’ không mã hóa. Đây là một phương pháp phát hiện và định lượng trực tiếp. Người ta xử lý huyết tương hoặc huyết thanh người bệnh với protease K nhằm giải phóng RNA HCV từ các hạt virus. RNA được lai với các probe đặc hiệu. Sau đó phức hợp RNA HCV-probe được cố định trên một vi giếng và tiếp tục được lai với các probe khuếch đại tín hiệu, mỗi probe này liên kết với nhiều phân tử alkaline phosphatase. Cuối cùng, cơ chất của enzyme được cho vào vi giếng và tín hiệu hóa quang sẽ được thu nhận bởi máy đọc tín hiệu ánh sáng. Trong phương pháp định lượng bằng bDNA thì việc thiết kế các probe mục tiêu là vô cùng quan trọng. Cả hai loại probe ( probe cố định RNA HCV vào vi giếng và probe khuếch đại tín hiệu RNA HCV ) phải được thiết kế sao cho có thể định lượng mọi genotype HCV với hiệu quả như nhau. Các loại probe này thường có kích thước từ 16-24 nucleotide và nhiệt độ nóng chảy (Tm) vào khoảng 700C nhằm đảm bảo tính đồng nhất của phản ứng lai và tín hiệu tối đa. Phương pháp cho kết quả tuyến tính với các mẫu huyết thanh có nồng độ RNA HCV từ 200000 đến 120000000 phân tử RNA/1ml máu. Các genotype của HCV cũng có ảnh hưởng trên việc định lượng RNA HCV giữa genotype 1 và 2 có độ nhạy chênh lệch nhau vào khoảng 3 lần và giữa genotype 3a và 6a là 1,5 lần. 3.2.2. Phương pháp ELISA Phương pháp này sử dụng nguyến tắc phát hiện phân tử lai dựa vào sự chuyển màu cơ chất hoặc tín hiệu quang, hóa quang dưới sự xúc tác của enzyme kết hợp với kháng thể kháng digoxigenin. Đầu tiên người ta tách chiết RNA HCV từ huyết thanh và chuyển thành cDNA nhờ phản ứng phiên mã ngược. cDNA này được dùng làm bản mẫu cho phản ứng PCR. Trong thành phần của phản ứng PCR, một trong hai primer sẽ được đánh dấu ở đầu 5’ với biotin, như vậy sản phẩm PCR tạo ra sẽ có một mạch được đánh dấu biotin ở đầu 5’. Sau bước nhân bản sản phẩm PCR được biến tính thành dạng mạch đơn và được cho vào các vi giếng. Mặt trong của mỗi vi giếng được phủ streptavidin là một protein có ái lực đặc biệt cao đối vớ biotin sẽ giữ các mạch mang biotin ở đầu 5’. Tiếp theo, người ta cho probe đặc hiệu cho HCV vào vi giếng và tiến hành phản ứng lai. Probe này được đánh dấu ở đầu 3’ với digoxigenin sẽ bắt cặp bổ sung với mạch mang biotin ở đầu 5’. Phức hợp kháng thể kháng digoxigenin – alkaline phosphatase được cho vào và ủ trong một thời gian thích hợp, phần dư thừa sẽ được loại bỏ. Phản ứng màu sẽ xuất hiện khi cơ chất hiện màu của alkaline phosphatase được cho vào. Cường độ màu tương ứng với hàm lượng PCR có trong mẫu. Việc định lượng RNA HCV có trong mẫu được thực hiện bằng cách quy giá trị cường độ màu ỡ mỗi vi giếng vào một đường chuẩn xây dựng từ những mẫu có nồng độ RNA HCV biết trước. Phương pháp này có khả năng phát hiện HCV với nồng độ là 600IU/ml. Độ tuyến tính của phương pháp nằm trong khoảng 600IU/ml đến 850000IU/ml. Phương pháp định lượng bằng PCR ELISA có khả năng sử dụng rộng rãi tại các phòng thí nghiệm vì không đòi hỏi các thiết bị chuyên dụng, không mắc tiền và thao tác không phức tạp, việc đánh giá kết quả đơn giản. Đây là phương pháp định lượng có khả năng thay thế cho định lượng bằng Real-Time PCR ở những nơi không có thiết bị chuyên dụng cho Real-Time PCR. 3.2.3. PCR định lượng cạnh tranh Phương pháp này nhân bản trong cùng eppendorf một trình tự mục tiêu cần định lượng và một trình tự được gọi là chứng định lượng có nồng độ biết trước. Các nồng độ giảm dần của chứng định lượng được cho vào từng phản ứng. Ở phản ứng nào mà tín hiệu sau nhân bản của chứng định lượng và trình tự mục tiêu bằng nhau thì nồng độ thì nồng độ của trình tự mục tiêu chính là nồng của chứng định lượng trong phản ứng đó. Thông thường, chứng định lượng được thiết kế sao cho gần giống với trình tự mục tiêu nhất về kích thước, thành phần nucleotide để sự nhân bản của trình tự mục tiêu không bị ức chế bởi chứng định lượng và ngược lại. Tuy nhiên, chứng định lượng cũng phải phân biệt được với trình tự mục tiêu bằng cách tăng kích thước hay them vị trí nhận biết của một enzyme cắt giới hạn vào trình tự của chứng định lượng. 3.2.4. Kỹ thuật Hybrid Capture Kỹ thuật này dựa trên nguyên tắc lai phân tử giữa một mạch của phân tử DNA mạch đôi và phân tử RNA tạo thành một thể lai DNA:RNA. Các mẫu được xủ lý bằng dung dịch ly giải để giải phóng các nucleic acid có trong tế bào. Sau đó các probe DNA hoặc RNA được cho vào và phản ứng lai được tiến hành trong các ống nghiệm hoặc trong các vi giếng của microtiter plate có phủ một kháng thể đa dòng. Kháng thể đa dòng này bắt giữ toàn bộ các phân tử lai DNA:RNA hiện diện trong phản ứng. Các phân tử nucleic acid khác như phân tử DNA mạch đơn, RNA, thể lai DNA:DNA, RNA:RNA không phản ứng với kháng thể này bị rửa trôi. Một phương pháp khác để cố định các trình tự mục tiêu sử dụng các probe có gắn biotin và phản ứng bắt giữ xảy ra trong các ống nghiệm hoặc trong các microtiter plate có phủ treptavidin. Sau đó, các phân tử lai DNA:RNA đã được bắt giữ sẽ liên kết đặc hiệu với một kháng thể thứ hai cộng hợp với alkaline phosphatase. Một phân tử lai có thể liên kết với nhiều phức hợp kháng thể - alkaline phosphatase nên sẽ làm gia tăng độ nhạy của kỹ thuật. Sau đó, cơ chất phát ánh sáng của alkaline phosphatase là CSPD được cho vào phản ứng và ánh sáng phát ra được phân tích bằng máy đo ánh sáng. Hàm lượng trình tự mục tiêu được định lượng bằng giá trị RLU có hàm lượng tương ứng với hàm lượng trình tự đích có trong mẫu ban đầu. 3.2.5. Kỹ thuật Real-Time PCR Các kỹ thuật cổ điển như Southern blot hay Northern blot đã dẫn đến sự phát triển các phương pháp định lượng dựa trên cơ sở lai phân tử như RNAse protection, dot blot,… Tuy nhiên, các phương pháp này có chung nhựơc điểm là thời gian tiến hành kéo dài và cần một lượng nucleic acid ban đầu lớn. Sự ra đời của kỹ thuật PCR đã khắc phục các nhược điểm nêu trên. Các phương pháp định lượng dựa trên kỹ thuật PCR như PCR ELISA, PCR định lượng cạnh tranh,… ngày càng phát triển. Tuy nhiên, các nhà nghiên cứu khi sử dụng phương pháp này phải giải quyết hai vấn đề lớn, đó là: ảnh hưởng của pha bão hòa trong phản ứng PCR và sự ức chế của phản ứng bởi các chất kìm hãm. Càng về cuối khi khi phản ứng PCR bước vào pha bão hòa, thì hiệu quả nhân bản càng giảm, không còn mang tính lũy thừa. Có nhiều nguyên nhân cho hiện tượng này như lượng primer giảm, nồng độ các sản phẩm PCR quá cao khiến cho primer khó kết hợp với mạch khuôn, các thành phần phản ứng như ezyme, nucleotide, MgCl2… cạn kiệt. Lúc đó nếu căn cứ vào hàm lượng sản phẩm PCR để suy ra hàm lượng nucleic acid ban đầu thì không chính xác vì các mẫu có hàm lượng nucleic acid ban đầu khác nhau sẽ có hàm lượng sản phẩm PCR tại pha bão hòa như nhau. Vấn đề thứ hai là sự tồn tại của các chất kìm hãm phản ứng PCR, cả sau quá trình tách chiết, cũng ảnh hưởng lớn đến hàm lượng sản phẩm PCR sau cùng. Nhiều cải tiến nhằm làm cho phương pháp định lượng dựa trên kỹ thuật PCR trở nên chính xác và có độ tin cậy cao hơn. Holland và cộng sự (1991) đã phát hiện chức năng 5’ exonuclease của Taq polymerase. Bassler và cộng sự (1995), Lee và cộn sự (1993), Livak và cộng sự (1995) đã phát triển các loại mẫu dò có khả năng chuyển năng lượng huỳnh quang. Sự phát triển về thiết bị của các công ty như Perkin Elmer, Idaho Technologies, Acugen… cũng góp phần đáng kể vào việc hình thành một phương pháp định lượng mới, đó là Real – Time PCR. CHƯƠNG 4. QUY TRÌNH REAL-TIME PCR ĐỊNH LƯỢNG HCV 4.1. Kỹ thuật Real-Time PCR 4.1.1. Nguyên tắc Real-time PCR cũng dựa trên PCR thường, nhưng phương pháp này có thể định lượng được hàm lượng DNA/RNA có trong mẫu nhờ các chất nhuộm phát huỳnh quang. Sau khi nhân bản, các sản phẩm PCR mục tiêu sẽ được theo dõi hàm lượng theo một thời gian thật của phản ứng. Giai đoạn kéo dài Giai đoạn bắt cặp Giai đoạn biến tính Hình 4.1: Bước của một chu trình PCR ( Nguồn: Andy Vierstrate, 1999) Thông thường một chu trình Real-Time PCR ba bước: Bước 1: biến tính- nhiệt độ phản ứng là 94oC trong 30 giây đến 1 phút, hai mạch DNA khuôn bị biến tính, duỗi xoắn và tách ra. Bước 2: bắt cặp, Nhiệt độ được hạ thấp xuống nhiệt độ Ta (nhiệt độ bắt cặp) của mồi, khoảng 40-70oC trong 30 giây đến 1 phút, cho phép các mồi bắt cặp vào khuôn. Bước 3: kéo dài (nhiệt độ 72oC), nhiệt độ được tăng lên 72oC, là nhiệt độ thích hợp nhất cho enzyme DNA polymerase để hoạt động tổng hợp mạch mới từ đoạn mồi. Thời gian này tùy thuộc độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại (từ 30 giây đến vài phút). Thông thường một phản ứng PCR không được vượt quá 40 chu kỳ. 4.1.2. Các thành phần trong phản ứng Real-Time PCR Một phản ứng Real-Time PCR thường gồm 6 thành phần cơ bản: 4.1.2.1. DNA mạch khuôn DNA mạch đôi hay mạch đơn đều có thể là nguồn vật chất ban đầu cho phản ứng PCR, chúng được tách chiết từ tế bào thực vật, động vật, vi khuẩn hoặc virus. Ngoài ra, RNA cũng là một nguồn vật liệu cho phản ứng khuếch đại nếu nó được phiên mã ngược thành cDNA. Nồng độ DNA ban đầu trong phản ứng không được quá cao, có thể chỉ cần một phân tử DNA ban đầu cho một phản ứng. Thông thường, nồng độ DNA ban đầu tốt nhất cho phản ứng PCR ở khoảng 105 bản sao/phản ứng. 4.1.2.2. Mồi Đây là một trong những yếu tố quan trọng nhất trong phản ứng PCR, có vai trò làm mồi cho hoạt động kéo dài mạch của DNA polymerase. Do đó, việc thiết kế mồi phải được tiến hành thật chính xác, tránh ảnh hưởng đến hiệu quả và độ chuyên biệt của phản ứng PCR. Nồng độ mồi trong mỗi phản ứng PCR phải được tính toán tối ưu bằng thực nghiệm. Nếu nồng độ mồi quá cao sẽ dẫn đến hiện tượng khuếch đại kí sinh, ngược lại sẽ làm hiệu quả khuếch đại của phản ứng không cao. Giới hạn nồng độ mồi thường là 0.1-1µl. Thiết kế phải tuân thủ những nguyên tắc sau: -Tm của mồi “xuôi” và mồi “ngược” không khác nhau quá 5oC. -Tránh sự bắt cặp bổ sung giữa mồi “xuôi” và mồi “ngược”. -Tránh các cấu trúc “kẹp tóc” trong thành phần mỗi mồi. -Thành phần nucleotide của mồi phải cân bằng. -Tránh các cặp GC lặp đi lặp lại nhiều lần. -Thành phần GC khoảng 40-60%. -Trình tự mồi phải đặc trưng cho trình tự DNA cần nhân bản. 4.1.2.3. Enzyme chịu nhiệt Taq polymerase Enzyme này có thể chịu được nhiệt độ tới 95oC. Một phản ứng PCR từ 25-50µl thông thường có liều lượng Taq polymerase nằm trong giới hạn từ 0.5-2.5 đơn vị. 4.1.2.4. MgCl2 Có vai trò là một cofactor cho enzyme DNA polymerase hoạt động. Ngoài ra, mồi; DNA bản mẫu; dNTPs; EDTA cũng có thể liên kết với MgCl2 và do đó sẽ cạnh tranh với DNA polymerase. Nếu nồng độ MgCl2 cao sẽ dẫn đến hiện tượng khuếch đại kí sinh. Vì vậy, phải thiết kế nồng độ MgCl2 tối ưu nhất cho từng phản ứng PCR cụ thể, thông thường là từ 1.5-4mM. 4.1.2.5. Dung dịch đệm PCR Dung dịch này có vai trò cung cấp những ion cần thiết cho phản ứng xảy ra. Tùy theo nguồn DNA polymerase mà nồng độ và pH của dung dịch đệm cũng như nồng độ KCl tối ưu sẽ thay đổi cho phù hợp. Thông thường, một phản ứng PCR sẽ có dung dịch đệm điển hình là: 50mM KCl, 10nM Tris – HCl, pH 8.3 ở nhiệt độ phòng. 4.1.2.6. dNTPs Gồm bốn loại nucleotide được dùng trong phản ứng PCR là: dATP, dTTP, dGTP, dCTP. Nồng độ của mỗi loại nu trong mỗi phản ứng (với nồng độ MgCl2 1.5mM) là 200-250µl. Nếu nồng độ dNTPs cao hơn 4µl sẽ làm giảm hiệu quả khuếch đại phản ứng PCR, và sự mất cân bằng nồng độ giữa các loại nu sẽ làm tăng lỗi sao chép của DNA polymerase. 4.1.3. Các kiểu phản ứng Real-Time PCR Việc định lượng số bản sao khuếch đại sẽ dựa vào mẫu dò. Mẫu dò là một đoạn oligonucleotide ngắn xác định, được đánh dấu bằng nhiều phương pháp khác nhau dùng để nhận diện các đoạn acid nucleic khác có trình tự bổ sung với nó. Về cơ bản, mẫu dò cũng tương tự như mồi, chỉ khác ở chỗ mẫu dò được gắn thêm một cơ chất có thể phát tín hiệu (thường là đồng vị phóng xạ P32/P33, hoặc chất phát huỳnh quang). Hiện nay có bốn kiểu phản ứng được sử dụng trong kỹ thuật Real-Time PCR với độ nhạy tương đương nhau. Cả bốn phương pháp đều sử dụng các chất nhuộm huỳnh quang, có sự kết hợp bước nhân bản và phát hiện sản phẩm PCR mục tiêu nhằm theo dõi hàm lượng PCR mục tiêu theo thời gian thật của phản ứng. Phương pháp đơn giản nhất là sử dụng một chất hóa học phát huỳnh quang có khả năng gắn vào mọi phân tử DNA mạch đôi. Ba phương pháp còn lại sử dụng các probe có đánh dấu bằng chất huỳnh quang để lai đặc hiệu với sản phẩm PCR mục tiêu. 4.1.3.1. Mẫu dò thủy giải Còn được gọi là Taqman probe. Mẫu dò này được gắn một chất phát huỳnh quang ở đầu 5’ và một chất “dập tắt” huỳnh quang (quencher) ở đầu 3’ sao cho ánh sáng huỳnh quang phát ra bị hấp thu bởi quencher. Quencher là một là một phân tử hấp thu năng lượng ở trạng thái bị kích thích. Trong phản ứng PCR, mẫu dò này sẽ bắt cặp bổ sung đặc hiệu với trình tự DNA mục tiêu, khi Taq polymerase kéo dài mạch bổ sung từ đầu 3’ của mồi đến tiếp xúc với mẫu dò, nó sẽ thể hiện hoạt tính 5’-3’ exonuclease là loại bỏ các nucleotide ở đầu của mẫu dò và thay bằng nucleotide mới. Khi đó, chất phát huỳnh quang sẽ tách rời khỏi mẫu dò và phát tín hiệu, còn quencher bị mất tác dụng dập tắt. Ánh sáng huỳnh quang phát ra sẽ tương ứng với hàm lượng sản phẩm PCR có trong phản ứng. Taqman probe có tính đặc hiệu cao, chỉ bắt cặp và phát tín hiệu nếu trình tự bổ sung với mạch khuôn là hoàn toàn, vì vậy các sản phẩm ký sinh nếu có cũng không được phát hiện. Thông thường, Taqman probe có nhiệt độ nóng chảy (Tm) cao hơn cặp mồi từ 8-10oC nhằm tạo điều kiện cho việc bắt cặp và thủy giải mẫu dò bởi Taq polymerase. 4.1.3.2. Chất nhuộm gắn với DNA mạch đôi Chất nhuộm này gắn vào mọi phân tử DNA mạch đôi. Khi ở trạng thái tự do, chất nhuộm không phát huỳnh quang nhưng sau khi đã gắn vào DNA mạch đôi thì phát huỳnh quang và cường độ huỳnh quang phát ra tỉ lệ thuận với hàm lượng DNA có trong phản ứng PCR. Các chất nhuộm phát huỳnh quang thường được sử dụng là SYBR Green I, ethidium bromide. Trong phản ứng PCR, các chất nhuộm sẽ gắn vào các DNA mới được tổng hợp trong bước kéo dài mạch và rời ra khi các phân tử DNA bị biến tính trong bước biến tính. Mọi DNA mạch đôi hiện diện trong phản ứng đều có khả năng bắt chất nhuộm và phát huỳnh quang nên nếu có các sản phẩm ký sinh trong phản ứng thì sự định lượng trở nên không chính xác. Để phát hiện các sản phẩm ký sinh trong phản ứng, người ta xây dựng một đường cong "nóng chảy" (melting curve) bằng cách nâng dần nhiệt độ phản ứng và đo giá trị cường độ ánh sáng huỳnh quang phát ra tại các thời điểm nhiệt độ khác nhau. Nhiệt độ nóng chảy của phân tử DNA phụ thuộc vào số lượng và thành phần nucleotide. Do đó, dựa vào đường cong "nóng chảy", người ta có thể phát hiện sự hiện diện của các sản phẩm ký sinh và tiến hành các biện pháp khắc phục. Các biện pháp khắc phục rất đa dạng như: thiết kế primer sao cho hiệu quả bắt cặp với trình tự DNA mục tiêu là tối ưu, khảo sát nồng độ các thành phần tham gia phản ứng như Taq polymerase, MgCl2, dNTP… sao cho việc nhân bản là hoàn toàn đặc hiệu. 4.1.3.3. Moleculer Beacon Đây là loại probe có cấu trúc dạng vòng và cuống trong đó cấu trúc dạng vòng bắt cặp bổ sung đặc hiệu với trình tự nucleic acid mục tiêu. Phần cấu trúc dạng prbe của phân tử probe được hình thành từ các lien kết hydro giữa các base bắt cặp bổ sung nằm ở hai đầu mút của probe. Một chất hóa học phát huỳnh quang được gắn vào một đầu của probe và một chất hóa học khác (quencher) có nhiệm vụ “dập tắt” được gắn ở đầu bên kia. Quencher là một chất màu không phát huỳnh quang có nhiệm vụ làm tiêu giảm năng lượng mà nó nhận được từ chất phát huỳnh quang dưới dạng nhiệt và vì thế không cho ánh sáng huỳnh quang nào được phát ra. Trong dung dịch phản ứng, một beacon ở trạng thái tự do sẽ có cấu trúc dạng vòng và cuống. Lúc đó, phần cấu trúc dạng cuốn làm cho hai đầu của probe ở gần với nhau trong không gian; lúc đó quencher sẽ phát huy tác dụng và ngăn cản sự phát huỳnh quang của chất phát huỳnh quang. Khi probe bắt cặp bổ sung với một mạch của trình tự DNA mục tiêu ở nhiệt độ lai của phản ứng thì probe mất cấu trúc dạng vòng và cuốn trở thành dạng thẳng. Điều này làm gia tăng khoảng cách không gian giữa chất phát huỳnh quang và quencher. Chất phát huỳnh quang lúc đó sẽ phát ánh sáng mà các thiết bị có thể tiếp nhận và phân tích. Nếu beacon không bắt cặp bổ sung hoàn toàn với trình tự DNA thì sự lai giữa beacon và trình tự DNA sẽ không xảy ra và vì thế không có sự phát ánh sáng huỳnh quang. Sở dĩ như vậy là vì, về mặt nhiệt động học sự hình thành cấu trúc kẹp tóc ở beacon thuận lợi hơn là sự hình thành phân tử lai không hoàn chỉnh. Điều đó giải thích cho tính đặc hiệu cao của beacon. Khó khăn lớn nhất khi sử dụng probe dạng beacon chính là việc thiết kế probe. Trình tự nucleotide của cất trúc dạng cuống phải được thiết kế sao cho Quencher và chất phát huỳnh quang tiếp xúc với nhau. Nếu không thì một phần ánh sánh huỳnh quang sẽ được phóng thích một cách không đặc hiệu, làm gia tăng mức độ tín hiệu nền của phản ứng dẫn đến việc đánh giá sai kết quả định lượng. Ngược lại, nếu các lien kết trong cấu trúc dạng cuống của phân tử quá mạnh thì Beacon sẽ khó bắt cặp với trình tự DNA mục tiêu và tín hiệu huỳnh quang phát ra cũng không phản ánh đúng hàm lượng sản phẩm PCR có trong phản ứng. Vì vậy, tìm thế cân bằng giữa một cấu trúc ổn định và khả năng bắt cặp với trình tự DNA mục tiêu là điều quan trọng khi thiết kế một Beacon. 4.1.3.4. Probe đôi Phương pháp này có độ đặc hiệu rất cao do việc sử dụng cùng hai probe bắt cặp với trình tự DNA mục tiêu. Một probe mang ở đầu 3’ chất cho “fluorescein” (fluorescein donor) phát ánh sáng màu xanh và probe thứ hai mang ở đầu 5’ chất nhận “fluorescein” (fluorescein donor). Probe thứ hai này được chặn ở đầu 3’ sao cho Taq polymerase không thể kéo mạch từ đầu này. Ánh sáng huỳnh quang từ chất cho chuyển đến chất nhận thông qua hiệu ứng FRET (Fluorescent Resonance Energy Transfer- sự chuyển năng lượng huỳnh quang kiểu cộng hưởng) và chất nhận sẽ phát ra ánh sáng huỳnh quang có màu đỏ. Trong dung dịch phản ứng, khi hai chất cho và nhận cách xa nhau thì tín hiệu nền là tín hiệu huỳnh quang do chất cho phát ra. Đến bước bắt cặp giữa probe với bản mẫu thì có sự sắp xếp giữa hai probe sau cho phần đầu của probe này tiếp xúc với phần cuối của probe kia. Khi đó hiệu ứng FRET xảy ra, chất nhận huỳnh quang phát ra một ánh sáng huỳnh quang mới có bước sóng lớn hơn ánh sáng mà nó nhận được và sẽ được các thiết bị ghi nhận. tương tự như beacon, cường độ ánh sánh huỳnh quang do chất nhận phát ra tỉ lệ thuận với hàm lương sản phẩm PCR có trong phản ứng. Ưu điểm đáng chú ý của phương pháp này là sự thiết kế probe tương đối linh động, dễ dàng hơn so với việc thiết kế beacon. 4.1.4. Khái niệm chu kỳ ngưỡng Khái niệm chu kỳ ngưỡng (Ct) là khái niệm trung tâm của kỹ thuật Real-Time PCR. Nguyên tắc định lượng của kỹ thuật này dựa váo một đường cong chuẩn được xây dựng từ các giá trị chu kỳ ngưỡng của các mẫu đã có nồng độ nucleic acid biết trước. Chu kỳ ngưỡng của một mẫu được định nghĩa là chu kỳ mà tại đó tín hiệu huỳnh quang của mẫu vượt trên tín hiệu huỳnh quang nền của phản PCR và được các thiết bị cảm biến ghi nhận. Chu kỳ ngưỡng rơi vào pha lũy thừa của phản ứng PCR. Vì vậy, việc định lượng trong phản ứng là chính xác vì không chịu bất kỳ ảnh hưởng nào từ pha bão hòa của phản ứng PCR. Các mẫu có nồng độ nucleic acid ban đầu lớn thì sẽ có Ct nhỏ và ngược lại các mẫu có nồn độ nucleic acid ban đầu nhỏ thì sẽ có Ct lớn. Tín hiệu huỳnh quang nền được tạo ra trong phản ứng Real-Time PCR là do các chất phát huỳnh quang có nồng độ xác định có sẵn trong thành phần phản ứng PCR. Chất phát huỳnh quang này khác với chất phát huỳnh quang được sử dụng để định lượng. Trong phản ứng Real-Time PCR sử dụng Taqman probe thì chính quencher của của Taqman probe sẽ đóng vai trò tạo tín hiệu nền cho phản ứng. 4.1.5. Thiết kế đường cong chuẩn cho phản ứng Real-Time PCR Việc định lượng trong phản ứng Real-Time PCR được thực hiện bằng cách so sánh hàm lượng sản phẩm PCR của mẫu xét nghiệm với hàm lượng sản phảm PCR từ các mẫu chuẩn có nồng độ đã biết được nhân bản đồng thời. Các thiết bị thực hiện phản ứng Real-Time PCR sẽ tự động xây dựng một đường cong chuẩn dựa trên chu kỳ ngưỡng của các mẫu có nồng độ nucleic acid biết trước. Sau đó, nồng độ nucleic acid của các mẫu xét nghiệm sẽ được tính toán dựa trên đường cong chuẩn này. Có nhiều cách để thiết kế một đường cong chuẩn cho một phản ứng Real-Time PCR. Ví dụ, trong phản ứng định lượng virus viêm gan siêu vi B, người ta sử dụng các mẫu huyết thanh có nồng độ virus đã biết dựa vào các phương pháp khác như bDNA hoặc bộ kit HBV Monitor để xây dựng đường cong chuẩn. Người ta cũng có thể tin sạch sản phẩm PCR ( được nhân bản với cặp primer sử dụng cho phản ứng Real-Time PCR) từ gel agarose, đo nồng độ của sản phẩm bằng phương pháp đo mật độ quang, từ đó tính ra số bản sao của sản phẩm để xây dựng đường cong chuẩn. Một phương pháp khác là xây dụng một plasmid chứa trình tự HBV cần nhân bản, tạo dòng và sử dụng các plasmid có nồng độ và số lượng bản sao đã biết để xây dựng đường cong chuẩn. Đối với việc định lượng HCV, người ta cũng sử dụng phương pháp bDNA hoặc bộ kit HCV Monitor để xác định nồng độ virus của các mẫu dùng xây dựng đường cong chuẩn. Một số phương pháp khác phức tạp hơn là sử dụng một plasmid biểu hiện có chứa trình tự cần nhân bản để tổng hợp RNA. Các RNA được đánh dấu phóng xạ và số lượng phân tử RNA có trong mẫu được xác định bằng phương pháp isotopic tracing. Mẫu có hàm lượng RNA biết trước được dùng để xây dựng đường cong chuẩn cho phản ứng Real-Time PCR. 4.1.6. Tính lặp lại của phản ứng Real-Time PCR Kết quả phản ứng PCR thường biến động, thay đổi từ lần này sang lần khác. Nhưng phản ứng Real-Time PCR lại có tính lặp lại rất cao. Nguyên nhân sự khác biệt này là do thời điểm phân tích kết quả. Real-Time PCR phân tích kết quả theo thời gian thật, chu kỳ ngưỡng của phản ứng lại luôn rơi vào pha lũy thừa là pha mà phản ứng xảy ra thuận lợi nhất. Trong khi đó, kết quả của phản ứng PCR thông thường chỉ được phân tích khi phản ứng kết thúc thường là vào pha bão hoàn của phản ứng. Như vậy, bất kỳ một biến đổi nhỏ nào ở pha lũy thừa cũng sẽ dẫn đến những khác biệt rất lớn trong pha bão hòa của phản ứng PCR thông thường. 4.1.7. Thiết bị- Dụng cụ A. Máy ly tâm thu huyết thanh B. Máy Stratagene Mx3000P C. Máy ly tâm D. Máy vortex F. Máy ly tâm eppendorf 0.2ml E. Máy ủ nhiệt khô Hình 4.1: Các loại Miropipette dùng trong Real-Time PCR 4.2. Quy trình thực hiện Kỹ thuật Real-Time PCR sử dụng mẫu dò Taqman đặc hiệu cho HCV. Mỗi cặp mồi được thiết kế trong vùng 5’ không mã hóa 5’UTR của bộ gen HCV để nhân bản trình tự mục tiêu có kích thước 95 cặp base. Phản ứng Real-Time PCR còn sử dụng thêm mẫu dò Taqman đặc hiệu cho HCV, được đánh dấu huỳnh quang. Mỗi bản sao của trình tự mục tiêu được nhân bản sẽ tương ứng với một tín hiệu huỳnh quang. Tín hiệu này sẽ được đầu dò máy ghi nhận. Như vậy số lượng bản sao trình tự mục tiêu HCV tạo ra ở từn thời điểm sẽ được ghi nhân chính xác trong suốt quá trình PCR. Dựa vào một đường cong chuẩn thiết lập với những hàm lượng bản sao xác định, có thể tính được số lượng bản sao HCV xác định, có thể tính được số lượng bản sao hiện diện trong mẫu ban đầu. Quy trình thực hiện gồm 5 bước Thu mẫu Tách chiết RNA Phân tích kết quả Thu nhận RNA Thực hiện Real-Time PCR Thực hiện RT 4.3. Thuyết minh quy trình 4.3.1. Phương pháp thu nhận và xử lý mẫu -Lấy máu tĩnh mạch, lấy lúc đói và buổi sáng là tốt nhất. Vì lúc này các thành phần phân tử trong máu là thuần khiết. -Máu chỉ giữ ở 4o-8oC trong tối đa 4 giờ, sau đó phải tách huyết thanh. Phải thực hiện liền nếu không sẽ xảy hiện tượng máu bị ngoại nhiễm từ môi trường xung quanh. -Lấy 3ml máu bệnh nhân cho vào ống nghiệm thu máu chuyên dụng. -Ly tâm ống nghiệm chứa máu 3000 vòng/phút trong 15 phút. -Thu khoảng 0.5ml huyết thanh chuyển vào tube 1.5ml vô trùng. -Giữ tube huyết thanh ở -200C cho đến khi tiến hành xét nghiệm. 4.3.2. Thu nhận RNA Việc tách chiết RNA bao gồm các bước cơ bản sau: (1) phá màng tế bào, (2) loại protein, (3) tủa RNA. Để thu nhận RNA tinh sạch, người ta cần loại bỏ những thành phần tạp nhiễm, mà quan trọng nhất là protein. Việc tách chiết dựa trên nguyên tắc hòa tan khác nhau của các phân tử khác nhau (nucleic/protein) trong hai pha không hòa tan (phenol, chloroform/nước). Các chất trong tách chiết: (1) thành phần có phenol, guianidine thyocianat là những chất làm biến tính protein mạnh , khi xử lí với hóa chất này, tế bào sẽ bị phá vỡ và giải phóng các thành phần nội bào: DNA, RNA, protein…(2) chloroform: thường đi kèm với phenol, có tác dụng bổ sung và loại bỏ hoàn toàn dấu vết phenol, chloroform cũng làm biến tính protein nhưng yếu hơn phenol. Sau khi ly tâm, mẫu xử lí với Trizol sẽ tách thành hai lớp: Lớp dưới là phenol, lớp trên là nước chứa RNA (khi Trizol có pH 4.0), phần protein bị biến tính sẽ nằm ở mặt phân cách hai lớp này và bị loại bỏ. RNA trong phần dịch nổi được thu nhận bằng cách tủa với Isopropanol có bổ sung chất trợ tủa. Chất trợ tủa này là một polymer có cấu trúc mạng lưới nên dễ dàng bắt được các phân tử RNA, nhưng không gây ức chế phản ứng PCR. Sau khi tủa, tủa sẽ được rửa lại 1 lần nữa với ethanol 70% và cuối cùng sẽ được bảo quản trong nước cất đã qua xử lý bằng‎ DEPC, bảo quản ở -20oC đến khi sử dụng. 4.3.3. Quy trình thực hiện -Cho 200µl mẫu (huyết thanh) vào 1 eppendorf có sẵn 900µl dung dịch 1, vortex 30s, để yên 10 phút. Thêm vào 200µl dung dịch 2, trộn đều. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút. -Thu 600µl dịch nổi có chứa RNA vào 1 eppendorf sạch đã có sẵn 600µl dung dịch 3. Trộn đều, để yên 10 phút. Thêm 200µl dung dịch 2. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút. -Loại bỏ dịch nổi, thu cặn màu xanh. Cho từ từ 900µl dung dịch 4 vào. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút. -Loại bỏ dịch nổi, thu cặn. Để khô ở 60oC, 10 phút. Cho vào 50µl dung dịch 5. 4.3.4. Thực hiện phản ứng RT -Thực hiện bước này với các tube RT-Mix được giữ trong khay lạnh hoặc đá đang tan. -Trước và sau khi đặt phản ứng RT phải ly tâm tube để tất cả dung dịch nằm dưới đáy tube. -Đánh dấu các tube bằng k‎ý hiệu mẫu. Cho 15µl chứng (+), chứng (-) hoặc dịch RNA tách chiết vào tube. Phải kiểm tra chắc chắn dịch trong tip phải được cho hết vào tube. Thực hiện mẫu nào, chỉ mở nắp tube tương ứng. Thực hiện xong đóng thật kỹ nắp tube ngay để tránh nguy cơ ngoại nhiễm. Xong, ly tâm và chuyển ngay các tube vào máy PCR. -Lập chương trình cho máy PCR hoạt động: 25oC – 5’, 42oC – 30’, 85oC – 5’, giữ ở 4oC. Chọn chức năng chờ đến khi “Heat lid” đạt 1050 thì chương trình luân nhiệt mới bắt đầu. -Sản phẩm cDNA được dùng để thực hiện phản ứng PCR/real-time PCR. -Nếu chưa thực hiện phản ứng PCR/real-time PCR ngay phải bảo quản cDNA ở - 20oC. Thực hiện phản ứng Real-time PCR -Thực hiện bước này với các tube PCR mix được giữ trong khay lạnh hoặc đá đang tan. -Trước và sau khi đặt phản ứng PCR phải ly tâm tube để tất cả dung dịch nằm dưới đáy tube. -Cho 2.5µl dịch cDNA từ phản ứng RT ở trên vào tube HCV qPCR mix. Phải kiểm tra chắc chắn dịch trong tip phải được cho hết vào tube. Thực hiện mẫu nào, chỉ mở nắp tube tương ứng. Thực hiện xong đóng thật kỹ nắp tube ngay để tránh nguy cơ ngoại nhiễm. Xong, ly tâm và chuyển ngay các tube vào máy real-time PCR cùng với 1 bộ standard. -Bật máy real-time PCR, nhất là đèn của đầu đọc real-time ít nhất 15 phút trước khi chạy chương trình. Bật máy tính và chờ cho máy tính khởi động xong, gọi chương trình real-time PCR lên. Phải kiểm tra chắc chắn máy real-time PCR và máy vi tính đã kết nối với nhau. Chọn chức năng chờ cho đến khi “Heat lid” đạt 1050 thì chương trình luân nhiệt bắt đầu. -Cài đặt vị trí mẫu “Plate setup” trên phần mềm đúng với vị trí mẫu đã đặt trên máy real-time PCR. -Với standard: chọn loại mẫu là và khai báo nồng độ tương ứng với từng standard. -Với mẫu: chọn loại mẫu là không biết, đặt tên hoặc số tương ứng với ký ‎hiệu của mẫu. -Màu “Fam”: phát hiện trình tự mục tiêu HCV, màu “Hex”: phát hiện trình tự chứng nội. -Cài đặt chương trình cho máy real-time PCR hoạt động: 1 chu kỳ: 95oC-5’, 40 chu kỳ: 95oC-15’’, 60o-1’ (chọn đọc kết quả ở bước này). Chọn chức năng chờ cho đến khi đạt 105o thì chương trình luân nhiệt bắt đầu. -Lưu file dữ liệu vào máy tính. Nên chọn lưu ở phân vùng ổ cứng không cài hệ điều hành. Hình 4.2: Quá trình luân nhiệt ( Nguồn: công ty Việt Á, 2011) 4.4. Đọc và giải thích kết quả PHÂN TÍCH KẾT QUẢ: Sau khi kết thúc quá trình Real-Time PCR, chuyển sang chế độ “Analysis” để phân tích. Tùy loại máy có thể phân tích ở dạng “Linear” hoặc dạng “Log” hoặc cả hai. Phân tích chứng dương và chứng âm: Chỉ chọn giếng và âm , chọn màu FAM rồi đến màu HEX. Thí nghiệm đạt yêu và chuyển sang bước phân tích kết quả nếu chứng dương có đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu FAM tuyến tính vượt qua tín hiệu nền ( đường biểu diễn dương tính) và đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu HEX dương tính hoặc thẳng và không vượt qua tín hiệu nền ( đường biểu diễn âm tính ), chứng âm có đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu FAM âm tính và đường biểu diễn tính hiệu huỳnh quang màu HEX dương tính. Những trường hợp khác sự cố-nguyên nhân-khắc phục. Phân tích mẫu: Chọn màu FAM. Có thể phân tích đồ thị ở chế độ đã xử lý hoặc chế độ dữ liệu thô. Nên chọn từng mẫu và phân tích chế độ dữ liệu để có kết quả chính xác nhất. Mẫu có đường biểu diễn dương tính rõ ràng và bắt đầu từ chu kỳ 36 trở về trước, kết luận mẫu dương tính. Mẫu có đường biểu diễn dương tính rõ ràng và bắt đầu từ sau chu kỳ 36, kết luận “mẫu dương tính dưới ngưỡng phát hiện”. Mẫu có đường biểu diễn dương tính không rõ ràng và bắt đầu từ sau chu kỳ 36, kết luận “mẫu nghi ngờ” và đề nghị lấy mẫu lại để thực hiện xét nghiệm hoặc thự hiện lại xét nghiệm sau 1-3 tháng. Mẫu có đường biểu diễn âm tính, kết luận “ không tìm thấy virus trong mẫu”. Những trường hợp khác sự cố-nguyên nhân-khắc phục. In đồ thị kết quả: Chọn chứng âm chứng nội và mẫu in đồ thị. Copy đồ thị vào trang trả kết quả, chú thích các đường biểu diễn “ chứng âm”, “ chứng nội”, “mẫu” Biểu đồ 4.9: Biểu đồ đường chuẩn ( Nguồn: công ty Việt Á, 2011) Qua biểu đồ đường chuẩn ta thấy E=103.9% (nằm trong khoảng 90-105%), R2=1.000 và độ dốc (slope) của đường biểu diễn là -3.232. Có thể kết luận đây là biểu đồ chuẩn lý tưởng. Sau khi đã có đường chuẩn ta sẽ xác định được lượng copies HBV-DNA trong 1ml huyết thanh. Kết quả của quá trình Real-time PCR gồm: một mẫu thử nghiệm và một chứng âm. Bảng 4.1. Kết quả thể hiện quy trình Real-Time PCR Giếng Tên giếng Màu của mẫu dò Ct(dR) Quantity (copies) Copies/ml B10 HBV FAM 28,46 4,83E+02 7,25E+04 E4 (-) FAM No Ct No Ct Hình 4.10: Đường biểu diễn khuếch đại mẫu thử nghiệm (Nguồn: công ty Việt Á, 2011) Phân tích đồ thị -Mẫu dương tính khi đường biểu diễn vượt qua tín hiệu nền. -Mẫu âm tính khi mẫu không vượt qua được tín hiệu nền. -Mẫu nội tại dùng để kiểm tra mẫu có bị ức chế không. Các trường hợp xảy ra trong quá trình thực hiện phản ứng: TH1: Tất cả các mẫu đều dương tính kể cả chứng âm. - Nguyên nhân1: Lô thí nghiệm bị ngoại nhiễm DNA hoặc sản phẩm PCR từ từ môi trường của khu vực thao tác hoặc nhiễm chéo giữa các mẫu. -Biện pháp khắc phục: Tiến hành lại thí nghiệm cẩn thận. Chiếu UV và vệ sinh khu vực thao bằng nước Javel để khử nhiễm. TH2: Tất cả mẫu và chứng nội đều âm tính kể cả chứng dương. - Nguyên nhân: máy bị hư, -Biện pháp khắc phục: sửa hoặc thay máy mới. TH3: Tất cả mẫu đều âm tính kể cả chứng dương nhưng chứng nội dương tính. -Nguyên nhân: hóa chất bị hư. -Biện pháp khắc phục: thay hóa chất mới. TH4: Chứng dương âm, chứng nội trong tube chứng dương dương, các mẫu khác bình thường. -Nguyên nhân: chứng dương hư - Biện pháp khắc phục: thay chứng dương mới. TH5: chứng âm dương, các mẫu khác bình thường, có mẫu âm, có mẫ dương mạnh, dương yếu. - Nguyên nhân: chứng âm bị ngoại nhiễm DNA hoặc sản phẩm PCR từ môi trường từ khu vực thao tác hoặc nhiễm chéo từ mẫu dương tính. - Biện pháp khắc phục: thay chứng âm và tiến hành lại thí nghiệm cẩn thận. TH6: Mẫu và chứng nội đều âm tính. Có mẫu dương tính, có mẫu âm thật sự. -Nguyên nhân: Có thể âm thật sự có thể phản ứng PCR bị ức chế. - Biện pháp khắc phục: Pha loãng mẫu từ 10-100 lần. TH7: Tất cả các mẫu thí nghiệm trong lô đều bất thường. -Nguyên nhân: Tube chứa PCR không tương ứng với máy hoặc máy Real-Time bị hư. - Biện pháp khắc phục: thay Tube khác hoặc thay máy mới. CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN KẾT LUẬN Quy trình định lượng HCV bằng kỹ thuật Real-Time PCR cho thấy được ưu điểm về thời gian, độ nhạy và độ đặc hiệu của quy trình khi ứng dụng trên các mẫu huyết thanh. Đây là kỹ thuật hiện đại được phát triển trong thời gian gần đây, không những cho phép phát hiện mà còn có thể tính toán, xác định được hàm lượng virus có trong mẫu. Tuy nhiên, HCV có nhiều type và nhiều type phụ có khả năng biến đổi cao. Do đó, cần có các nghiên cứu sâu hơn giúp việc định lượng được cụ thể đối với mỗi type. Đặc biệt là type 1a và 1b, là 2 type nguy hiểm phổ biến nhưng khả năng điều trị là thấp nhất. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt [1]. Hồ Huỳnh Thùy Dương, (2002), Sinh học phân tử (Khái niệm-phương pháp-ứng dụng), NXB Giáo dục. [2]. Phạm Hùng Vân. (2009). PCR và Real-time PCR các vấn đề cơ bản và ứng dụng thường gặp, NXB Y học chi nhánh thành phố Hồ Chí Minh. [3]. Nguyễn Thành Vinh, Nguyễn Hoàng Duy. (2010). Tìm hiểu quy trình phân tích viêm gan siêu vi C. Báo cáo thực tập. [4]. Lưu Phương Nam.(2011). Quy trình định lượng HBV bằng phương pháp Real-time PCR. Báo cáo thực tập tốt nghiệp. [5] Nguyễn Hữu Chí (1993), bệnh viêm gan siêu vi, NXB ITAXA. [6] Nguyễn Hữu Chí (1997), viêm gan siêu vi, Bài giảng sau đại học, Đại học y dược TP.HCM. [7] Nguyễn Hữu Chí (1998), một số đặc điểm của bệnh viêm gan siêu vi, NXB TP. HCM. [8] Đinh Dạ Lý Hương, Bùi Hữu Hoàng, Võ Thị Mỹ Dung, Trần Thiện Tuấn Huy, Trần Ngọc Bảo (2000), viêm gan siêu vi từ cấu trúc đến điều trị, NXB y học Hà Nội. [9] Trương Thị Xuân Liên (1994), tình hình nhiễm virus viêm gan C tại TP.HCM [10] Nguyễn Hoàng Chương (1999) . Bước đầu hình thành quy trình nghi nhiễm HCV trong máu người bằng kỹ thuật HN-PCR. Tài liệu tiếng Anh [11]. RE Lanford, D Chavez, FV Chisari and C Sureau. (1993). Lack of detection of negative-strand hepatitis C virus RNA in peripheral blood mononuclear cells and other extrahepatic tissues by the highly strand-specific rTth reverse transcriptase PCR. [12]. K K Young, R M Resnick and T W Myers. (1993 April). Detection of hepatitis C virus RNA by a combined reverse transcription-polymerase chain reaction assay. [13]. Gary L. Davis M.D, Johnson Y.-N. Lau, Mickie S. Urdea, Paul D. Neuwald, Judith C. Wilber, Karen Lindsay, Robert P. Perrillo, Janice Albrecht. (2005). Quantitative detection of hepatitis C virus RNA with a solid-phase signal amplification method: Definition of optimal conditions for specimen collection and clinical application in interferon-treated patients. [14]. J Clin Microbiol, K E Sherman, J O'Brien, A G Gutierrez, S Harrison, M Urdea, P Neuwald and J Wilber. (1993 October). Quantitative evaluation of hepatitis C virus RNA in patients with concurrent human immunodeficiency virus infections. [15]. J Clin Invest, H Lerat, F Berby, M A Trabaud, O Vidalin, M Major, C Trépo, and G Inchauspé. (1996 February 1). Specific detection of hepatitis C virus minus strand RNA in hematopoietic cells. Tài liệu trang web [16]. [17]. [18]. [19]. [20]. http:// Hcvadvocate.org/hepatitis/hepC/vietnamese_info.htm