Khóa luận Tìm hiểu quy trình nhân giống hoa Đồng Tiền in vitro

y mô thực vật, khi White nuôi cấy thành công một thời gian dài đầu rễ cà chua (Lycopersicum esculentum) với môi trường lỏng chứa muối khoáng, glucose, và nước chiết nấm men. Sau đó, White đã chứng minh là có thể thay thế nước chiết nấm men bằng hỗn hợp 3 loại vitamine nhóm B: thiamin (B1), pyridoxin (B6) và nicotinic acid. Từ đó, việc nuôi cấy đầu rễ đã được tiến hành ở nhiều cây khác nhau. Trong thời gian này, Gautheret ở Pháp đã tiến hành các nghiên cứu nuôi cấy mô tượng tầng một số cây gỗ. Sau khi Went và Thimanm (1937) phát hiện chất sinh trưởng đầu tiên là IAA và kết tinh được chất này, Gautheret xác nhận tác dụng kích thích sinh trưởng mô sẹo của IAA và nhóm 3 vitamin do White đề nghị. Cùng với Nobercourt, Gautheret (1939), đã thành công trong việc duy trì sinh trưởng của mô sẹo cà rốt (Daucus carota) trên môi trường bán rắn. Overbeek (1941), chứng minh tác dụng kích thích sinh trưởng của nước dừa trong nuôi cấy phôi. Sau đó, Steward (1948) xác nhận tác dụng của nước dừa trên mô sẹo cà rốt. Trong thời gian này, nhiều chất sinh trưởng nhân tạo thuộc nhóm auxin đã được nghiên cứu và tổng hợp hóa học thành công. NAA, 2,4-D bắt đầu được sử dụng để trừ cỏ lá rộng trong nông nghiệp. Nhiều tác giả nhận thấy cùng với nước dừa, 2,4-D và NAA đã giúp tạo mô sẹo, gây phân chia tế bào thành công ở nhiều đối tượng thực vật trước đó rất khó nuôi cấy. Năm 1951, Skoog và Miller đã phát hiện ra các hợp chất có thể điều khiển sự nhân chồi. Skoog (1954), tình cờ thấy nếu thêm một ít chế phẩm đã để lâu của acid desoxyribonucleic (DNA) lấy từ tinh dịch cá bẹ vào môi trường nuôi cấy các mảnh mô thân cây thuốc lá thì tác dụng kích thích sinh trưởng trở nên rất rõ rệt. Skoog cố tìm bản chất hiện tượng kích thích sinh trưởng của DNA. DNA mới trích ly từ tinh dịch cá bẹ không có tác dụng nhưng nếu đem hấp trong hơi acid thì mẫu DNA mới cũng có hoạt tính như mẫu DNA cũ. Skoog cho rằng chất có hoạt tính là một sản phẩm phân giải của DNA. Năm 1955, chất này được xác lập là 6-furfurylaminopurine và được Skoog đặt tên là “Kinetin” do tác dụng kích thích sự phân bào. Sau này, người ta chứng minh rằng sự phân bào ở thực vật trong tự nhiên cũng do các chất hóa học tương tự kinetin điều khiển và gộp chung các chất này vào nhóm cytokinin. Chất cytokinin đầu tiên được tách từ thực vật bậc cao là zeatin lấy từ mầm ngô. Nikkell (1956) nuôi liên tục được một huyền phù tế bào đơn cây đậu (Phaseolus vulgaris). Skoog và Miller (1957) công bố các kết quả nghiên cứu về ảnh hưởng của tỷ lệ kinetin/auxin trong môi trường nuôi cấy đối với sự hình thành cơ quan của mô sẹo thuốc lá. Khi giảm thấp tỷ lệ kinetin/auxin, mô sẹo có khuynh hướng phát triển rễ, ngược lại nếu tỷ lệ kinetin/auxin tăng thì dẫn đến khuynh hướng tạo chồi ở mô sẹo. Bergmanm (1960) công bố có thể dùng phương pháp lọc đơn giản để thu được một huyền phù không có các tế bào dính cụm mà gồm hầu hết là tế bào đơn. Năm 1960-1964, Morel cho rằng có thể nhân giống vô tính lan bằng nuôi cấy đỉnh sinh trưởng. Từ kết quả đó, Lan được xem là cây nuôi cấy mô đầu tiên được thương mại hóa. Từ đó đến nay, công nghệ nuôi cấy mô và tế bào thực vật đã được phát triển với tốc độ nhanh trên nhiều cây khác và được ứng dụng thương mại hóa. Năm 1962, Murashige và Skoog đã cải tiến môi trường nuôi cấy, đánh dấu một bước tiến trong kỹ thuật nuôi cấy mô. Môi trường của họ đã được dùng làm cơ sở cho việc nuôi cấy nhiều loại cây và vẫn còn được sử dụng rộng rãi cho đến nay. Guha và Maheswari (1966) công bố tạo thành công cây đơn bội từ nuôi cấy túi phấn cây cà độc dược (Dautura inoxia). Một năm sau, nhóm Bourgin và Nitsch (1967) tạo thành công cây đơn bội từ túi phấn thuốc lá. Điều kiện và môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật: Môi trường nuôi cấy là điều kiện tối thiểu cần thiết, là yếu tố quyết định cho sự phân hóa tế bào và cơ quan nuôi cấy. Điều kiện nuôi cấy mô tế bào thực vật: Điều kiện vô trùng: Nuôi cấy in vitro là nuôi cấy trong điều kiện vô trùng. Nếu không đảm bảo tốt điều kiện vô trùng, mẫu nuôi cấy hoặc môi trường sẽ bị nhiễm, mô nuôi cấy sẽ bị nhiễm, chết. Điều kiện vô trùng có ý nghĩa quyết định đến sự thành bại của nuôi cấy mô in vitro. Phương pháp vô trùng vật liệu thông dụng nhất hiện nay là dùng các chất hóa học, tia cực tím có khả năng diệt nấm và vi khuẩn. Vô trùng ban đầu là một thao tác khó và là khâu đầu tiên có ý nghĩa quyết định. Nếu tìm được nồng độ và thời gian xử lý thích hợp sẽ cho tỷ lệ sống cao. Các chất khử trùng thường sử dụng: Bảng 1.2 : Các chất khử trùng Tác nhân vô trùng Nồng độ (%) Thời gian xử lý(phút) Hiệu quả Canxi hypochloride 9-10 5-30 Rất tốt Natri hypochloride 2 5-30 Rất tốt Hydro peroxit 10-12 5-15 Tốt Nước brôm 1-2 2-10 Rất tốt Clorua thủy ngân 0,1-1 2-10 Trung bình, độc Chất kháng sinh 4-5 mg/l 30-60 Khá tốt Phương tiện khử trùng: nồi hấp vô trùng, tủ sấy, buồng và bàn cấy vô trùng, phòng nuôi cấy. Điều kiện ánh sáng và nhiệt độ: Ánh sáng và nhiệt độ là hai yếu tố chính có ảnh hưởng cơ bản đến quá trình sinh trưởng của mô nuôi cấy. Ánh sáng: Sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy chịu ảnh hưởng từ các yếu tố như: thời gian chiếu sáng, cường độ chiếu sáng và chất lượng ánh sáng. Thời gian chiếu sáng tác động đến quá trình phát triển của mô nuôi cấy. Thời gian chiếu sáng thích hợp với đa số các loài cây là 12-18 giờ/ngày. Cường độ chiếu sáng tác động đến sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy. Cường độ chiếu sáng cao kích thích sự tạo chồi. Nhìn chung cường độ ánh sáng thích hợp cho nuôi cấy là 1000-7000 lux. Ngoài ra, chất lượng ánh sáng cũng ảnh hưởng tới sự phát sinh hình thái của mô thực vật in vitro: ánh sáng đỏ làm tăng chiều cao của thân chồi hơn so với ánh sáng trắng. Nếu mô nuôi cấy trong ánh sáng xanh thì sẽ ức chế vươn cao nhưng lại có ảnh hưởng tốt tới sự sinh trưởng của mô sẹo. Hiện nay, trong các phòng thí nghiệm nuôi cấy mô, để cung cấp nguồn ánh sáng có cường độ 2000-2500 lux người ta sử dụng các dàn đèn huỳnh quang đặt cách bình nuôi cấy từ 35-40 cm. Nhiệt độ: Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, nhiệt độ là nhân tố quan trọng ảnh hưởng tới sự phân chia tế bào và các quá trình sinh hóa trong cây. Tùy thuộc vào xuất xứ của mẫu nuôi cấy mà điều chỉnh nhiệt độ cho phù hợp. Nhìn chung nhiệt độ thích hợp nhất cho sự sinh trưởng ở nhiều loài cây là 250C. Môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật: Môi trường dinh dưỡng phải có đầy đủ các chất dinh dưỡng, các chất cần thiết cho sự phân chia, phân hóa tế bào cũng như sự sinh trưởng bình thường của cây. Thành phần hóa học của môi trường đóng vai trò quyết định đến sự thành công hay thất bại của nuôi cấy mô và tế bào thực vật. Mỗi một loại vật liệu khác nhau có những đòi hỏi khác nhau về thành phần môi trường, khi bắt đầu nghiên cứu một số loài mới hoặc giống mới cần phải lựa chọn cho đối tượng nghiên cứu một loại môi trường cơ bản phù hợp. Có rất nhiều loại môi trường nuôi cấy thực vật khác nhau. Trong đó, có một số môi trường cơ bản được sử dụng phổ biến như: MS, B5, SH có hàm lượng khoáng đa lượng cao và một số môi trường khác được mô tả bởi White, Gautheret, Nitsch, Loyd và Mc Cown có hàm lượng khoáng đa lượng thấp hơn. Tuy có nhiều loại môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật nhưng đều gồm một số thành phần cơ bản sau: Các muối khoáng đa lượng và vi lượng. Nguồn cacbon. Các vitamine và amino acid. Các chất bổ sung, chất làm thay đổi trạng thái môi trường. Các chất điều hòa tăng trưởng. a. Các muối khoáng đa lượng và vi lượng: Khoáng đa lượng: nhu cầu khoáng của mô, tế bào thực vật tách rời không khác nhiều so với cây trồng trong điều kiện tự nhiên. Các nguyên tố đa lượng cần phải cung cấp là N, P, K, Ca, Mg và Fe. Khoáng vi lượng: nhu cầu khoáng vi lượng trong nuôi cấy mô thực vật in vitro là lĩnh vực còn ít được nghiên cứu. Trước đây, khi kỹ thuật nuôi cấy mô mới ra đời, người ta không nghĩ đến việc bổ sung khoáng vi lượng vào môi trường nuôi cấy. Các thí nghiệm lúc đó thành công là do agar và hóa chất dùng để pha môi trường không tinh khiết mà có lẫn một số nguyên tố vi lượng cung cấp phần nào cho môi trường nuôi cấy. Các nguyên tố vi lượng cần cung cấp cho tế bào là: Mn, Zn, Cu, B, Co, I, Mo,… b. Nguồn cacbon: Khi nuôi cấy in vitro, các tế bào thực vật thường không có khả năng quang hợp, do đó đòi hỏi phải cung cấp nguồn cacbon cho các hoạt động dinh dưỡng của tế bào. Nguồn cacbon được ưa chuộng nhất hiện nay trong nuôi cấy là đường saccharose, một số trường hợp sử dụng glucose và fructose thay thế cho saccharose nhưng chúng thường nghèo hydrat cacbon so với nhu cầu của thực vật. Ngoài ra, khi khử trùng môi trường, cần chú ý không nên kéo dài thời gian để tránh xảy ra hiện tượng đường hóa, làm môi trường chuyển sang màu vàng dẫn đến ức chế sự sinh trưởng và phát triển của tế bào. c. Các vitamin và acid amin: Ảnh hưởng của các vitamin đến sự phát triển của tế bào nuôi cấy in vitro ở các loài khác nhau thì khác nhau. Thông thường thực vật tổng hợp các vitamin cần thiết cho sự tăng trưởng và phát triển của chúng. Chúng cần vitamin để xúc tác các quá trình biến dưỡng khác nhau. Khi tế bào và mô được nuôi cấy in vitro thì một vài vitamin trở thành yếu tố giới hạn cho sự phát triển của chúng. Các vitamin thường được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô là: thiamine (B1), acid nicotinic (B3), pyridoxine (B6) và myo-inositol. d. Các chất bổ sung, chất làm thay đổi trạng thái môi trường: Nước dừa: được sử dụng để kích thích phân hóa và nhân nhanh chồi ở nhiều loại cây. Thông thường nước dừa được lọc qua màng lọc để khử trùng trước khi bảo quản lạnh. Dịch chiết nấm men: Có tác dụng kích thích sự sinh trưởng và phát triển của mô tế bào. Dịch chiết nấm men là chế phẩm thường dùng trong nuôi cấy vi sinh vật, mô tế bào động vật với nồng độ thích hợp. Ngoài ra, có thể sử dụng dịch thủy phân casein hydrolyase (0,1-1%) hoặc bột chuối với hàm lượng 40g bột khô trong 100g/l nhằm tăng cường sự phát triển của mô sẹo hay cơ quan nuôi cấy. Agar: là chất thường sử dụng để tạo môi trường đặc hay môi trường bán rắn trong nuôi cấy mô thực vật. Khi agar được trộn chung với nước thì tạo ra dạng gel và tan ở nhiệt độ 60-1000C, đặc lại khi nhiệt độ xuống 450C. Vì vậy, agar ổn định trong tất cả các điều kiện nhiệt độ môi trường và không bị phân hủy bởi enzyme thực vật. Hơn nữa agar không phản ứng với các chất trong môi trường. Độ cứng của agar quyết định bởi nồng độ agar sử dụng và pH của môi trường. Than hoạt tính: Việc bổ sung than hoạt tính vào môi trường nuôi cấy có tác dụng khử độc. Ảnh hưởng của than hoạt tính: hút các hợp chất cản, hút các chất điều hòa sinh trưởng và làm đen môi trường. Người ta cho rằng tác dụng cản tăng trưởng của mô cấy trong môi trường có than hoạt tính là do nó hút các chất điều hòa sinh trưởng trong môi trường như: NAA, kinetin, BAP, IAA và 2iP. Khả năng kích thích sự tăng trưởng của mô thực vật là do than hoạt tính kết hợp với các hợp chất phenol độc do mô tiết ra trong suốt thời gian nuôi cấy. e. Các chất điều hòa sinh trưởng: Các chất điều hòa sinh trưởng hay còn gọi là chất kích thích sinh trưởng thực vật là các yếu tố hóa học cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển của thực vật. Chất điều hòa sinh trưởng thực vật có thể là những chất tự nhiên được sản xuất với một hàm lượng rất nhỏ trong một bộ phận nào đó của cá thể thực vật hoặc là những chất được tổng hợp nhân tạo. Các chất điều hòa tăng trưởng gồm 2 nhóm chính: auxin và cytokinin. Ngoài ra còn có gibberlin, ethylene, abscisic acid (ABA). Auxin: Auxin là nhóm chất điều hòa sinh trưởng thực vật được sử dụng rất thường xuyên trong nuôi cấy mô tế bào thực vật. Auxin kết hợp chặt chẽ với các thành phần dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy để kích thích sự tăng trưởng của mô sẹo, huyền phù tế bào và điều hòa sự phát triển sinh hình thái, đặc biệt khi nó được phối hợp với cytokinin. Đặc tính của auxin: auxin là một hợp chất tương đối đơn giản: indol-3-acetic acid (IAA). Các chất có cấu trúc gần giống IAA và cùng có vai trò với IAA trong vài cơ quan đều được gọi là auxin (như IBA; NAA; 2,4-D; 2,4,5-T và phenoxyaxetic acid). Auxin phối hợp với cytokinin giúp sự tăng trưởng chồi non và khởi phát sự tạo mới mô phân sinh ngọn chồi từ nhu mô. Tuy nhiên, ở nồng độ cao, auxin cản trở sự phát triển của các phát thể chồi vừa được thành lập hay các chồi nách (các chồi ở trạng thái tiềm sinh). Auxin ở nồng độ cao kích thích sự tạo sơ khởi rễ (phát thể non của rễ), nhưng cũng cản trở sự tăng trưởng của các sơ khởi này. Trong sự tạo rễ, auxin cần phối hợp với các vitamine (như thiamine mà rễ không tổng hợp được), amino acid (như arginin) và nhất là các chất ortho diphenolic (như cafeic acid, chlorogenic acid). Cytokinin: Cytokinin là một loại hormone thực vật kích thích tế bào phân chia. Các hợp chất này xuất phát từ purine adenin, một trong các base của DNA và RNA. Hợp chất Cytokinin đầu tiên được khám phá là kinetin, tiếp theo là zeatin - một hợp chất có trong phần lớn thực vật và vài vi khuẩn, cấu trúc gần giống Kinetin, nhưng hoạt tính cao hơn gấp 10 lần. Sau zeatin, hơn 30 loại cytokinin khác cũng được cô lập. Ngày nay, người ta gọi cytokinin để chỉ một nhóm hợp chất tự nhiên hay nhân tạo, có đặc tính sinh lý giống kinetin. Nhiều chất tổng hợp có hoạt tính cytokinin, chúng đều là các aminopurin được thay thế ở vị trí thứ 6 như BA. Cytokinin kích thích sự phân chia tế bào với điều kiện có auxin. Cytokinin tác động lên cả hai bước của sự phân chia tế bào: phân nhân và phân bào. Trong nuôi cấy các mô nghèo cytokinin (mô lõi thuốc lá, vỏ rễ đậu), auxin kích thích sự phân đôi nhiễm sắc thể, thậm chí tạo tế bào hai nhân, nhưng không có sự phân vách, sự phân vách chỉ xảy ra khi có cytokinin ngoại sinh. Cytokinin giúp sự gia tăng kích thước tế bào và sinh tổng hợp protein. Trong thân và rễ, cytokinin cản trở sự kéo dài nhưng kích thích sự tăng rộng tế bào lá trưởng thành. Trong các nghiên cứu nuôi cấy mô thực vật, tỷ lệ auxin/cytokinin (A/C) là một yếu tố rất quan trọng: A/C cao giúp sự tạo rễ, A/C thấp giúp tạo chồi. Như cậy, cytokinin hỗ trợ auxin trong tăng trưởng nhưng đồng thời cũng có sự đối kháng giữa auxin (giúp tạo rễ), cytokinin (giúp tạo chồi). Sự cân bằng giữa hai kiểu hormone này là một trong những yếu tố kiểm soát sự phát triển. Các chất kích thích điều hòa tăng trưởng hầu như không tan trong nước cất vì vậy khi pha các chất này cần lưu ý: Nhóm auxin chủ yếu tan trong cồn hoặc bazơ. Nhóm cytokinin chủ yếu tan trong acid hay bazơ. Không nên pha một lượng dung dịch mẹ các chất sinh trưởng quá nhiều vì nó rất dễ biến tính. Gibberellin: Gibberellin là một nhóm trong các chất điều hòa sinh trưởng thực vật gồm hơn 80 hợp chất khác nhau. Các hợp chất này có điểm giống nhau ở cấu trúc hóa học đó là có sườn gibbane, được trích ra từ thực vật, vi sinh vật và được đánh số sau chữ GA. Acid gibberellic3 (GA3) và hỗn hợp giữa GA3 với acid gibberellic7 (GA7) là những gibberellin duy nhất có giá trị thương phẩm do chúng thường được sử dụng trong nuôi cấy mô thực vật. Ảnh hưởng của gibberellin trên sự phát sinh hình thái: khi bổ sung gibberellin vào trong môi trường nuôi cấy mô thực vật thì sẽ làm giảm bớt hoặc ngăn cản sự tạo chồi, rễ bất định và sự phát sinh phôi soma. Ở mô sẹo thuốc lá, GA3 đặc biệt có tác dụng cản sự tạo chồi khi có mặt vào giai đoạn hình thành đỉnh sinh trưởng và nó có tác dụng cản mạnh hơn khi mẫu cấy được nuôi trong điều kiện tối so với ngoài sáng. Trong thực vật, gibberellin có ảnh hưởng: Kích thích vươn thân qua kích thích phân bào và kéo dài tế bào. Tạo ra thân cao ngược với tính lùn cây. Kích thích vươn thân trong điều kiện ngày dài. Kích thích nảy mầm ở hạt cần xử lý lạnh hay ánh sáng để phát sinh nảy mầm. Kích thích sản xuất nhiều loại enzyme như - amylase ở các loại hạt ngũ cốc. Gibberellins ngoại sinh kích thích sự hình thành và phát triển trái. Phát sinh tính cái của hoa lưỡng tính. Ethylene: Ethylene được tổng hợp từ methionine ở nhiều loại mô khi phản ứng với stress. Dường như nó không cần thiết cho sinh trưởng sinh dưỡng. Nó chỉ là một hydrocarbon có ảnh hưởng trên thực vật. Đặc biệt nó được tổng hợp ở mô trái qua quá trình lão hóa hay đang chín đột phát. Là một chất khí, ethylene vận chuyển bằng phương thức khuếch tán từ nơi nó được tổng hợp. Có một chất trung gian rất quan trọng 1- aminocyclopropane – 1-carbonxylic acid (ACC) có thể được vận chuyển và có thể giải thích những ảnh hưởng của ethylene ở xa nơi gây ra sự kích thích. Ethylene có ảnh hưởng đến nhiều quá trình sinh lý của thực vật như: Sinh trưởng và biệt hóa chồi. Hình thành rễ bất định. Rụng lá và trái. Phát sinh ra hoa ở một loài thực vật. Phát sinh tính cái ở hoa lưỡng tính. Nở hoa. Lão hóa hoa và lá. Chín trái. Abscisic acid (ABA): ABA là một phân tử đơn. Tên gọi đầu tiên là abscisin II vì nó kiểm soát quá trình lão hóa ở cây vải. Vào cùng thời điểm đó có một nhóm khác được gọi tên là dormin tác động lên sự nảy mầm. Để trung hòa thì tên gọi mới là abscisic acid. Vì quy luật tác động của ABA trên sự rụng và lão hóa, nên ABA được coi là một chất ức chế. ABA ngoại sinh có tác động ức chế sinh trưởng ở thực vật, nên ABA được xem như là chất bắt đầu (như tổng hợp protein ở hạt) hay như một chất ức chế. ABA được tổng hợp từ mevalonic acid ở lá thuần thục khi phản ứng với stress thiếu nước. Trong hạt cũng giàu ABA do được tích lũy từ lá hay được tổng hợp in situ. Ảnh hưởng của ABA đến các quá trình sinh lý của thực vật: Đóng khí khổng: trong nước có nhiều ABA sẽ làm đóng khí khổng. Gây nên sự vận chuyển sản phẩm quang hợp để phát triển hạt và được hấp thu bởi phôi đang sinh trưởng. Phát sinh tổng hợp protein dự trữ trong hạt. Tác động ngược lại ảnh hưởng của gibberellin đến tổng hợp - amylase ở hạt ngũ cốc đang nảy mầm. Phát sinh và duy trì sự nảy mầm ở hạt và chồi. Quy luật tác động của ABA vẫn chưa xác định rõ, vì nó không chỉ tác động đến sự nảy mầm. Các giai đoạn nuôi cấy mô thực vật: Giai đoạn 1: Chọn lựa và khử trùng mẫu. Mẫu cấy là mảnh thực vật được đặt vào trong môi trường nuôi cấy. Để tiến hành nuôi cấy in vitro thành công, khi lựa chọn mô cấy cần lưu ý đến tuổi sinh lý của cơ quan được dùng làm mẫu cấy, vụ mùa lấy mẫu, chất lượng của cây lấy mẫu, kích thước và vị trí lấy mẫu đó. Mẫu cấy sau khi chọn lựa được rửa sạch bằng xà phòng và khử trùng bề mặt bằng các chất khử trùng hóa học như calcium hypochloride, sodium dichloroisocyanurate, clorua thủy ngân,… Giai đoạn 2: Tạo thể nhân giống. Mẫu được nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng thích hợp để tạo thể nhân giống in vitro. Có hai thể nhân giống in vitro là thể chồi và thể cắt đốt. Tạo thể nhân giống in vitro phụ thuộc vào đặc điểm nhân giống ngoài tự nhiên của cây trồng. Đối với những loài không có khả năng nhân giống, người ta thường nhân giống bằng cách tạo cụm chồi từ mô sẹo. Trong môi trường nhân giống thường bổ sung cytokinin, GA3 và các chất hữu cơ khác. Giai đoạn 3: Nhân giống in vitro. Đây là giai đoạn quan trọng trong nhân giống cây trồng bằng phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật nhằm mục đích tăng sinh khối thể nhân giống. Vật liệu nuôi cấy là những thể chồi, môi trường nuôi cấy thường giống môi trường tạo thể chồi, đôi khi nồng độ chất sinh trưởng giảm thấp cho phù hợp với quá trình nhân giống kéo dài. Điều kiện nuôi cấy thích hợp giúp cho quá trình tăng sinh diễn ra nhanh. Cây nhân giống in vitro ở trạng thái trẻ hóa và được duy trì trong thời gian dài. Giai đoạn 4: Tái sinh cây in vitro hoàn chỉnh. Đây là giai đoạn tạo cây con hoàn chỉnh có đầy đủ thân, lá và rễ để chuẩn bị chuyển ra vườn ươm. Cây con phải khỏe mạnh để nâng cao sức sống khi ra môi trường bình thường. Các chất có tác dụng tạo chồi được loại bỏ, thay vào đó là các chất kích thích quá trình tạo rễ. Điều kiện nuôi cấy gần với điều kiện tự nhiên bên ngoài, một bước làm thích nghi trước khi tách ra khỏi điều kiện in vitro. Sự ra rễ phụ thuộc vào nhiều yếu tố: hàm lượng auxin nội sinh, tỷ lệ C/N, ánh sáng, sự trẻ hóa của mẫu, kiểu di truyền. Người ta thường bổ sung auxin để kích thích quá trình ra rễ in vitro. Giai đoạn 5: Chuyển cây con ra vườn ươm. Cây con đã ra rễ được lấy ra khỏi ống nghiệm, rửa sạch agar và được đặt trong chậu, luống ươm có cơ chất dễ thoát hơi nước, tơi xốp, nơi có bóng râm, độ ẩm cao, cường độ chiếu sáng thấp,… Trong những ngày đầu, cần phủ nilon để tránh sự thoát hơi nước ở lá. Rễ cây trong quá trình nuôi cấy mô sẽ dần dần lụi đi và rễ mới xuất hiện, cây con thường được xử lý ra rễ bằng cách ngâm rễ hay phun lên lá các hợp chất kích thích ra rễ ở nồng độ thấp để rút ngắn thời gian ra rễ. Đây là gian đoạn rất quan trọng trong quá trình nhân giống vô tính vì cây con thường bị chết do sự khác biệt về điều kiện sống giữa in vitro và ex vitro. Ưu điểm và nhược điểm của phương pháp nuôi cấy mô thực vật: Cả về mặt lý luận và thực tiễn, nhân giống thực vật bằng kỹ thuật nuôi cấy mô có những ưu điểm sau: Hệ số nhân giống cao: từ một tế bào sạch bệnh ban đầu có thể nhân nhanh và cung cấp một lượng giống lớn trong thời gian ngắn trên qui mô mặt bằng nhỏ. Các cây đồng nhất về mặt di truyền. Tất cả các bộ phận của cây đều có thể làm vật liệu nhân giống. Chất lượng giống cao: bằng phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, kết hợp với một số biện pháp xử lý nhiệt, xử lý hóa chất có thể làm sạch bệnh trên giống và tái tạo nguồn giống sạch bệnh cho sản xuất. Khắc phục được đặc tính khó nhân giống và bất thụ ở một số cây trồng. Có thể nhân giống quanh năm, hoàn toàn có thể chủ động trong việc lập kế hoạch sản xuất và cung cấp giống. Các tập đoàn giống và giống sản xuất được lưu giữ trong điều kiện vô trùng, cách li hoàn toàn với các nguồn bệnh. Tạo cây có khả năng ra hoa, tạo quả sớm. Dễ dàng tạo giống cây trồng bằng phương pháp chuyển gen. Bên cạnh những đặc điểm nổi bật thuận lợi cho mục đích nhân giống, phương pháp vi nhân giống cũng có những nhược điểm cần khắc phục: Giá thành cây con được sản xuất từ kỹ thuật vi nhân giống còn khá cao. Tiến hành nhân giống phức tạp gồm nhiều giai đoạn liên quan và cần khoảng thời gian dài trước khi có thể thích ứng trồng ngoài vườn ươm. Sự đa dạng của dòng sản phẩm nhân giống rất hạn chế, nghĩa là cây con tạo ra thường ít đồng nhất về mặt kiểu hình. Có thể xảy ra đột biến do tác dụng của các chất điều hòa tăng trưởng bổ sung vào môi trường nuôi cấy. Tầm quan trọng của phương pháp nuôi cấy mô thực vật: Phương pháp nuôi cấy mô thực vật có ý nghĩa vô cùng quan trọng với việc nghiên cứu lý luận sinh học cơ bản, đồng thời đóng góp trực tiếp cho thực tiễn sản xuất và đời sống. Về mặt lý luận sinh học cơ bản: Nuôi cấy mô đã mở ra khả năng to lớn cho việc tìm hiểu sâu sắc bản chất của sự sống. Thông qua nuôi cấy mô thực vật có thể tiến hành so sánh đặc tính cơ thể với các thành phần của chúng khi tách rời khỏi cơ thể, từ đó rút ra mối tương quan giữa các bộ phận trong cây. Thực tế đã cho phép tách và nuôi cấy trước hết là mô phân sinh rồi từ đó cho ra nhóm tế bào không chuyên hóa gọi là mô sẹo, từ mô sẹo có thể kích thích để tái sinh cây hoàn chỉnh. Đây là ưu thế mà các nhà sinh lý, hóa sinh và di truyền học dễ dàng sử dụng trong việc của mình. Trong một cơ thể rất khó phân biệt được từng giai đoạn một cách cụ thể và chính xác theo chu kỳ phát triển của cá thể. Phương pháp nuôi cấy mô có thể khắc phục được khó khăn trên và dễ dàng tạo ra các bước phát sinh hình thái được phân biệt một cách rõ rệt. Điều này tạo thuận lợi cho công tác nghiên cứu về các quy luật sinh trưởng, phát triển cùng mối quan hệ giữa chúng với bên ngoài. Từ đó có thể tìm ra các mấu chốt thúc đẩy sự phát triển của cây trồng theo hướng mong muốn. Bằng phương pháp nuôi cấy mô và tế bào có thể tiến hành nghiên cứu mối quan hệ ký sinh và ký chủ. Như vậy, rõ ràng nhiều vấn đề về bệnh lý sẽ được giải quyết một cách cơ bản. Từ đó, tìm ra những cơ chế miễn dịch của thực vật, giúp cho việc phòng bệnh cho cây tốt hơn, đỡ tốn kém hơn. Về mặt thực tiễn sản xuất: Phương pháp nuôi cấy mô được sử dụng để bảo quản và nhân nhanh các giống cây quý, có giá trị kinh tế cao. Hiện nay, phương pháp này ngày càng phổ biến trong công tác giống cây trồng. Bằng phương pháp nuôi cấy mô, chỉ sau một thời gian ngắn có thể tạo được một sinh khối lớn có hoạt chất sinh khối được tạo ra vẫn giữ nguyên được thuộc tính, nghĩa là vẫn giữ được khả năng tổ hợp các chất thứ cấp như alkaloid, glycoside, các steroid dùng trong y học, chất dính dùng trong công nghiệp thực phẩm, những chất kìm hãm sinh trưởng của vi khuẩn trong công nghiệp. Các phương pháp nuôi cấy mô thực vật: Nuôi cấy nốt đơn thân: Phương pháp nuôi cấy này sử dụng mẫu cấy là chồi ngọn hoặc chồi bên mang một đoạn thân ngắn. Chồi này sẽ được kích thích cho tăng trưởng, ra rễ để tạo thành cây nguyên vẹn. Chồi được thu từ chồi ngọn và ở các nách lá, sau đó cấy lên môi trường dinh dưỡng với các điều kiện thích hợp để tăng trưởng. Chồi mới tăng trưởng sẽ mang nhiều lá và các chồi bên ở các nách lá tiếp tục được cấy chuyền đến khi đạt đủ số lượng chồi cần thiết thì chúng được cảm ứng ra rễ để trở thành cây con hoàn chỉnh và được chuyển ra trồng trong đất. Phương pháp này đã được thưc hiện thành công trên một số đối tượng như: cây Măng tây, Khoai tây, Lê, Hoa hồng, Cà chua, Dưa chuột, Cà tím,… Nuôi cấy chồi bên: Về nguyên tắc, phương pháp này giống như phương pháp nuôi cấy nốt đơn thân. Điểm khác nhau là trong phương pháp nuôi cấy nốt đơn thân có sự kéo dài chồi, thân và thường không cần đến cytokinin để phát triển. Trong phương pháp nhân chồi bên, chồi được cô lập trên môi trường dinh dưỡng và các chồi bên từ các nách lá phát triển dưới ảnh hưởng của cytokinin với nồng độ cao. Vai trò của cytokinin lúc này là hạn chế ưu thế ngọn để cho các chồi bên có thể phát triển. Các chồi bên này được tiếp tục được tiếp tục chuyển sang môi trường mới có bổ sung cytokinin thì các chồi bên mới tiếp tục được tạo ra. Sau đó, các chồi này được chuyển sang môi trường ra rễ và được đưa ra ngoài vườn ươm khi đã có rễ hoàn chỉnh. Phương pháp nhân giống bằng chồi bên được tiến hành lần đầu tiên trên cây Cẩm chướng, Dâu tây, Cúc đồng tiền. Hiện này, phương pháp này được áp dụng cho nhiều loài thực vật và phổ biến là ở một số loài cây ăn trái. Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng: Một phương thức dễ dàng nhất đạt được mục tiêu trong nuôi cấy mô tế bào thực vật là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng (bao gồm nuôi cấy chóp đỉnh và chồi bên) sau khi vô trùng mẫu và được nuôi cấy trên môi trường thích hợp. Môi trường thích hợp thay đổi theo từng loại cây trồng được đưa vào nuôi cấy, nhưng cơ bản môi trường chứa đầy đủ chất dinh dưỡng gồm các nguyên tố đa lượng, vi lượng và được bổ sung chất kích thích sinh trưởng thích hợp. Từ một đỉnh sinh trưởng sau một thời gian nuôi cấy phát triển thành một chồi hay nhiều chồi. Sau đó, chồi tiếp tục phát triển vươn ra thân, lá, rễ trở thành một cây hoàn chỉnh. Phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng được áp dụng với những cây trồng quan trọng như: Khoai tây, Thuốc lá, Lily…Một số cây thân gỗ như anh đào, mâm xôi, nho,… Nuôi cấy bao phấn và hạt phấn: Kỹ thuật nuôi cấy bao phấn và hạt phấn là kỹ thuật tạo ra cây đơn bội kép. Phương pháp tạo cây đơn bội kép và chọn lọc là phương pháp chọn tạo giống có hiệu quả chọn lọc rất cao, đặc biệt nếu được kết hợp với các phương pháp tạo ra các biến dị di truyền khác như lai hữu tính hoặc gây đột biến nhân tạo. Đây là kỹ thuật không phức tạp lắm, nhưng lại rất có hiệu quả trong chọn tạo giống cây trồng. Gaha và Maheswari (1966), tạo thành công cây đơn bội từ nuôi cấy túi phấn Cà độc dược (Datura inoxia). Đến nay công việc tạo cây đơn bội thông qua nuôi cấy túi phấn và hạt phấn đã thành công ở rất nhiều cây và có những đóng góp to lớn vào việc tăng thêm các kiến thức di truyền thực vật và thực tiễn chọn giống. Sự thành công của kỹ thuật nuôi cấy và tái sinh cây từ bao phấn cho phép xử lý các bao phấn bằng tác nhân gây đột biến, sau đó nuôi cấy và nhân các thể đột biến từ bao phấn đó. Nuôi cấy cơ quan sinh sản: Phương pháp nuôi cấy cơ quan sinh sản như phôi, noãn cũng là một những hướng nghiên cứu quan trọng trong nuôi cấy in vitro. Trong công tác chọn giống thì đây là phương pháp khắc phục tính không giao phối của loài và đồng thời là công cụ để khắc phục tính bất thụ do lai xa. Cấy phôi có thể nhận được phôi lai, cấy noãn có thể phát triển thành hạt có phôi và nảy mầm thành cây con. Nuối cấy protoplast: Nagata và Takebe (1930) đã thành công trong việc làm cho các protoplast tách từ mô thuốc lá tái tạo vỏ cellulose, phân chia và tạo nên một huyền phù tế bào trong môi trường lỏng. Những năm gần đây kỹ thuật nuôi cấy tế bào trần đang mở ra nhiều triển vọng trong nghiên cứu di truyền soma, cải tạo, phục tráng và tạo giống cây mới ở thực vật bậc cao nói chung. Phương pháp này được ứng dụng thành công trên nhiều đối tượng khác nhau. Năm 1971, Takebe đã nhận được cây Thuốc lá nhị bội từ tế bào trần, sau đó Ohiama và Nitch nhận được cây Thuốc lá đơn bội từ tế bào trần đơn bội. Đến nay, kỹ thuật nuôi cấy và tái sinh protoplast đã hoàn thiện đối với cây hai lá mầm cũng như nhiều loại cây một lá mầm và trở thành một trong những công cụ quan trọng trong nghiên cứu di truyền nói chung và di truyền tế bào chất nói riêng cũng như trong công tác giống cây trồng. Nuôi cấy mô sẹo (callus): Trong điều kiện sự cân bằng các chất kích thích sinh trưởng trong thực vật thay đổi, cụ thể trong tế bào đỉnh sinh trưởng hay nhu mô được tách ra nuôi cấy riêng lẻ trên môi trường giàu auxin thì mô sẹo được hình thành. Mô sẹo là một khối tế bào phát triển vô tổ chức và có màu trắng. Khối mô sẹo có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh trong điều kiện môi trường không có chất kích thích sinh trưởng tạo mô sẹo. Cây tái sinh từ mô sẹo có đặc tính giống như cây mẹ và một cụm tế bào mô sẹo có thể tái sinh cùng một lúc cho nhiều chồi hơn là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, tuy nhiên mức độ biến dị tế bào soma lại cao hơn. Lần đầu tiên callus được nuôi cấy từ rễ Cà rốt do Gautheret (1939) thực hiện. Ngày nay, người ta có thể kích thích tạo callus từ bất cứ cơ quan nào, mô nào của cây, song mức độ dễ dàng tạo callus không phụ thuộc vào loài và mô cấy. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Vật liệu: Nguồn mẫu: Cụm chồi giống hoa Đồng Tiền G04.6 có tại Bộ môn Công Nghệ Sinh Học của trung tâm nghiên cứu Khoai Tây, Rau & Hoa. Dụng cụ: Các dụng cụ sử dụng nuôi cấy in vitro (tại trung tâm). Môi trường: MS có bổ sung BA, NAA, đường saccharose, agar, than hoạt tính. Qui trình nhân giống hoa Đồng Tiền in vitro: Qui trình nhân giống in vitro hoa Đồng Tiền được tiến hành theo quy trình cơ bản như sau: Vật liệu ban đầu (mẫu cây non khỏe được chọn ngoài vườn cây mẹ) Tạo thể nhân giống in vitro Nhân giống in vitro Tái sinh cây in vitro hoàn chỉnh Chuyển cây con ra vườn ươm Phương pháp thực hiện: Các giai đoạn, môi trường và phương pháp nhân giống hoa Đồng Tiền in vitro. Vật liệu ban đầu: Hoa Đồng Tiền có thể nhân giống bằng các phương pháp là: phương pháp hữu tính (nhân giống bằng hạt) và phương pháp nhân giống vô tính (nhân giống bằng tách cây, cắm cành, nuôi cấy mô tế bào). Còn trong nuôi cấy in vitro, mẫu cấy có thể là cây con còn non ở ngoài vườn cây mẹ hoặc đế hoa non. Hình 2.1 : Vườn cây mẹ và đế hoa non được chọn. Giai đoạn tạo thể nhân giống in vitro: Môi trường : MS + 0,3-0,5 mg/l BA +30 g/l đường + 7 g/l agar. (Tại Trung Tâm Nghiên Cứu Khoai Tây, Rau & Hoa) Giai đoạn này rất quan trọng, bởi vì mẫu cây hoa Đồng Tiền là những cây non khỏe mạnh được chọn ngoài vườn, nên thường rất bẩn và nhiễm nhiều loại nấm, khuẩn khác nhau. Nếu không khử trùng, làm sạch mẫu cấy kỹ trước khi cấy thì các giai đoạn tiếp theo sẽ không tiến hành được. Mẫu được chọn, đem rửa sạch đất, cát dưới vòi nước máy chảy mạnh. Sau đó ngâm vào dung dịch xà phòng loãng, lắc trên máy lắc khoảng 15-20 phút, tốc độ 150-200 vòng/phút. Rửa sạch cho hết xà phòng rồi tiến hành khử trùng trong dung dịch Calcium Hypochlorit nồng độ 15% trong thời gian 15-20 phút trên máy lắc (để chất khử trùng tác dụng đều lên mẫu). Sau khi khử trùng đem mẫu vừa lắc vào tủ cấy vô trùng rửa sạch bằng nước cất (4-5 lần), rồi tiến hành cấy mẫu. Đưa mẫu cấy ra giấy thấm cho khô nước, dùng pank, dao lần lượt tách các bẹ lá phía ngoài, tách hết các bẹ lá phía trong, tách lấy đỉnh sinh trưởng (tách các đài hoa ở phía ngoài của đế hoa, tách lấy đế hoa) rồi cấy vào môi trường đã chuẩn bị sẵn. a b c Hình 2.2 : Khử trùng và quá trình nhập mẫu (đế hoa) Hình a: Khử trùng mẫu. Hình b, c: Qúa trình nhập mẫu. Giai đoạn nhân giống in vitro: Môi trường: MS + 0,3-0,5 mg/l BA + 25 g/l đường + 7 g/l agar (Tại Trung Tâm Nghiên Cứu Khoai Tây, Rau & Hoa). Phương pháp: Mẫu sau khi nhập khoảng một tuần sẽ phát triển thành cụm chồi. Tiến hành cấy chuyển qua môi trường nhân giống. Trong thời gian này, hệ số nhân có thể đạt 4-5 lần. Thời gian của giai đoạn này dài hay ngắn tùy thuộc vào lượng cây cần nhân. Cứ khoảng 30 ngày thì tiến hành cấy chuyền một lần, cấy 4-5 cụm vào một bịch môi trường, mỗi cụm khoảng 5-6 cây đơn. Hình 2.3 : Cấy chuyền nhân cụm Giai đoạn tái sinh cây hoàn chỉnh: Cây Đồng Tiền sau khi nhân đủ số lượng muốn đưa ra ngoài vườn ươm, ta phải chuyển qua giai đoạn tạo rễ. Cây đưa ra vườn ươm có tỷ lệ sống cao hay thấp là phụ thuộc rất nhiều vào giai đoạn này. Môi trường: MS + 0,3 mg/l NAA + 30g/l đường + 7 g/l agar + 0,2 g/l than hoạt tính. Phương pháp: Cây trong giai đoạn nhân nhanh khi phát triển đủ số lượng và kích thước yêu cầu được chuyển qua môi trường tạo rễ. Khi chuyển tách những cây khỏe mạnh, cấy từng cây đơn sang môi trường tạo rễ với số lượng 10-15 cây/bịch. Giai đoạn này kéo dài từ 7-10 ngày. Hình 2.4 : Cấy chuyền sang môi trường tạo rễ. Giai đoạn chuyển cây con ra vườn ươm: Khi cây đã tạo rễ, chuyển cây ra vỉ, luống ươm có cơ chất dễ thoát nước, tơi xốp, giữ độ ẩm, trong những ngày đầu tiên cần phủ nilon để giảm sự thoát hơi nước ở lá. Để tránh cây con bị mất nước và mau héo dẫn đến chết, vườn ươm phải mát, cường độ chiếu sáng thấp, độ ẩm cao. Hình 2.5 : Chuyển cây ra giá thể Phương pháp nghiên cứu: Trong thời gian làm bài khóa luận tốt nghiệp này, em đã thực hiện một số thí nghiệm để tìm hiểu một só biện pháp kỹ thuật trong nhân giống hoa Đồng Tiền in vitro, nhằm khắc phục những nhựoc điểm và đáp ứng những nhu cầu hiện nay. Thí nghiệm 1: xác định nồng độ BAP tối ưu trong môi trường MS cho nhân nhanh chồi in vitro các giống hoa Đồng Tiền G04.6. Chồi in vitro của giống hoa Đồng Tiền G04.6 được dùng làm mẫu để cấy nhân trên môi trường MS với các nghiệm thức có nồng độ BA khác nhau: Mẫu được cấy vào môi trường MS được bổ sung đồng đều đường saccharose 30 g/l, agar 9 g/l, chuẩn pH 5,6 - 5,8 và bổ sung chất kích thích sinh trưởng 6- benzyl adenine (BA) với các nồng độ lần lượt là 0 mg/l, 0.1 mg/l, 0.3 mg/l, 0.5 mg/l, 0.7 mg/l. Nghiệm thức 1: MS ( đối chứng) Nghiệm thức 2: MS + 0,1 mg/l BA Nghiệm thức 3: MS + 0,3 mg/l BA Nghiệm thức 4: MS + 0,5 mg/l BA Nghiệm thức 5: MS + 0,7 mg/l BA Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên (CRD), với 3 lần lặp lại, ô thí nghiệm 3 bình thủy tinh 250 ml chứa 40 ml môi trường, mỗi bình cấy 3 chồi. Mẫu cấy được nuôi ở điều kiện nhiệt độ phòng 22-240C, cường độ ánh sáng 2200-2500 lux. Chỉ tiêu theo dõi sau 30 ngày cấy: Số chồi/cụm chồi. Trọng lượng cụm chồi (mg): cân phân tích GH-200 Thí nghiệm 2: Xác định nồng độ NAA tối ưu trong quá trình tạo rễ của cây hoa Đồng Tiền G04.6 in vitro. Chồi in vitro của giống hoa Đồng Tiền G04.6 được cấy trên các môi trường MS với các nghiệm thức có nồng độ khác nhau. Mẫu được nuôi cấy trong môi trường MS được bổ sung đồng đều đường saccharose 30 g/l, agar 9 g/l, than hoạt tính 0,2 mg/l, chuẩn pH 5,6-5,8 và chất điều hòa sinh trưởng - napthyl acetic acid (NAA) lần lượt là 0 mg/l, 0.2 mg/l, 0.4mg/l, 0.6 mg/l, 0.8 mg/l, 1.0 mg/l. Nghiệm thức 1: MS (đối chứng) Nghiệm thức 2: MS + 0,2 mg/l NAA Nghiệm thức 3: MS + 0,4 mg/l NAA Nghiệm thức 4: MS + 0,6 mg/l NAA Nghiệm thức 5: MS + 0,8 mg/l NAA Nghiệm thức 6: MS + 1,0 mg/l NAA Thí nghiệm bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên (CRD) với 3 lần lặp lại, ô thí nghiệm 3 bình thủy tinh 250 ml chứa 40 ml môi trường, mỗi bình cấy 3 chồi. Mẫu cấy được nuôi ở điều kiện nhiệt độ phòng 22-240C, cường độ ánh sáng 2200-2500 lux. Chỉ tiêu theo dõi sau 15 ngày cấy: Số lượng rễ/ cây Chiều dài trung bình rễ (cm). Thí nghiệm 3: Xác định giá thể phù hợp cho cây Đồng Tiền in vitro ra vườn ươm đạt hiệu quả nhất. Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên trong nhà lưới có mái che, lặp lại 3 lần, 10 cây/ lần lặp. Nghiệm thức 1: 100% sơ dừa. Nghiệm thức 2: 75% sơ dừa + 25% đất than mùn. Nghiệm thức 3: 50% sơ dừa + 50 % đất than mùn. Mẫu cấy được chọn từ nghiệm thức tốt nhất của thí nghiệm ra rễ. Sau khi ra rễ được 15 ngày, cây được đưa trực tiếp ra vườn ươm tập nắng một tuần. Sau đó, lấy cây ra rửa sạch agar, rửa nhẹ nhàng tránh làm cho rễ bị tổn thương và gãy. Mẫu cây có sức sinh trưởng tốt, đồng đều được trồng vào các giá thể đã chuẩn bị trước. Trong 5 ngày đầu, cây được che nắng bằng lưới đen thoáng từ 9 – 16 giờ mỗi ngày. Các kỹ thuật, chế độ chăm sóc, tưới nước, phun thuốc bảo vệ thực vật được áp dụng theo quy trình chung của nhà mạ cấp I tại Trung tâm Nghiên cứu Khoai Tây, Rau và Hoa – Đà Lạt (Lâm Đồng). Giá thể được sử lý bằng vôi. Dùng khay xốp 100 lỗ, mỗi lỗ có đường kính 3 cm để cấy cây đã ra rễ in vitro. Chỉ tiêu theo dõi sau 20 ngày: Tỉ lệ sống. Chiều cao trung bình/ cây. Số lá trung bình/ cây. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Ảnh hưởng của nồng độ BAP tối ưu trong môi trường MS cho nhân nhanh chồi in vitro giống hoa Đồng Tiền G04.6: a b c d e f Hình 3.1 : Ảnh hưởng của BA đối với quá trình nhân nhanh in vitro hoa Đồng Tiền G04.6 Hình a: So sánh nghiệm thức 1 và nghiệm thức 2 ( MS và MS + 0.1 mg/l BA) Hình b: So sánh nghiệm thức 1 và nghiệm thức 3 ( MS và MS + 0.3 mg/l BA) Hình c: So sánh nghiệm thức 1 và nghiệm thức 4 ( MS và MS + 0.5 mg/l BA) Hình d: So sánh nghiệm thức 1 và nghiệm thức 5 ( MS và MS + 0.7 mg/l BA) Hình e: So sánh nghiệm thức 4 và nghiệm thức 5 ( MS +0.5 mg/l BA và MS + 0.7 mg/l BA) Hình f: So sánh các nghiệm thức Bảng 3.1 : Số chồi/cụm trung bình của chồi sau 30 ngày cấy ở giai đoạn nhân nhanh in vitro hoa Đồng Tiền G04.6. Nghiệm thức Số chồi trung bình/ cụm Nghiệm thức 1 (MS) 1.44 Nghiệm thức 2 (BA = 0.1 mg/l) 2.91 Nghiệm thức 3 (BA = 0.3 mg/l) 6.36 Nghiệm thức 4 (BA = 0.5 mg/l) 7.80 Nghiệm thức 5 (BA = 0.7 mg/l) 7.96 Biểu đồ 3.1: Số chồi/cụm sau 30 ngày cấy ở giai đoạn nhân nhanh in vitro hoa Đồng Tiền G04.6. Bảng 3.2 : Khối lượng trung bình cụm chồi ở giai đoạn nhân nhanh sau 30 ngày cấy. Nghiệm thức Khối lượng/cụm chồi(mg) Nghiệm thức 1 (MS) 288.8 Nghiệm thức 2 (BA = 0.1 mg/l) 432.4 Nghiệm thức 3 (BA = 0.3 mg/l) 476.0 Nghiệm thức 4 (BA = 0.5 mg/l) 634.6 Nghiệm thức 5 (BA = 0.7 mg/l) 594.2 Biểu đồ 3.2 : Trọng lượng cụm chồi trong giai đoạn nhân nhanh sau 30 ngày cấy. Nhận xét: Số chồi giữa nghiệm thức có sự khác biệt rất rõ rệt. Tại nghiệm thức 5 có số chồi/ cụm nhiều nhất (7.96 chồi/ cụm) khác biệt rất có ý nghĩa so với nghiệm thức 1 cho số chồi/ cụm ít nhất (1.44 chồi/ cụm). Khi tăng nồng độ BA, dẫn tới số chồi/ cụm cũng tăng dần. Nghiệm thức 4 và nghiệm thức 5 số chồi/ cụm tương đương nhau. Ở nghiệm thức 5, cho số chồi/ cụm nhiều nhất, nhưng cây lại ốm yếu, không đồng đều, chiều cao cây thấp hơn so với các nghiệm thức còn lại (Có hiện tượng bị ức chế). Kết quả cho thấy môi trường MS bổ sung 0.5 mg/l BA là môi trường cho số chồi/ cụm nhiều, cây đồng đều, khỏe mạnh. BA là loại cytokinin có hiệu quả trong việc tạo chồi, nhưng nồng độ sử dụng tùy vào từng loại bộ phận nuôi cấy và các loại cây khác nhau. Mỗi loại cây cần một nồng độ BA tối ưu để tạo chồi. Nếu sử dụng nồng độ BA cao thì sẽ tạo ra những chồi không bình thường hay có hiện tượng thủy tinh thể. Còn nếu sử dụng BA ở nồng độ thấp thì hiệu quả nhân chồi sẽ không cao. Hu và Wang (1983) cho rằng nồng độ cytokinin cao sẽ làm giảm số lượng chồi sinh sản, khi sử dụng nồng độ BA cao sẽ cho chất lượng chồi không tốt, chồi hình thành dạng hoa thị hoặc những nốt nhỏ ở cuối gốc. Theo Indra D.Bhatt và Uppeandra khi sử dụng BA, kinetin, 2-iP trên môi trường MS, tốc độ nhân nhanh tốt nhất khi bổ sung BA. Theo kết quả nghiên cứu của Kang và CS (1994), BA là chất điều hòa sinh trưởng thích hợp nhất cho sự nhân nhanh chồi. Theo Uppadhya và Chandra (1983) tác động kết hợp giữa BA và auxin sẽ làm tăng số lượng chồi. Nghiên cứu của Pierik và CS (1982), Hempel và CS, 1985 thì BA kích thích sự tăng sinh chồi ở cây hoa Đồng Tiền, nhưng chỉ có những chồi được tạo ra do sự cảm ứng của kinetin 5-10 mg/l là tốt nhất. f e c d b a Ảnh hưởng của nồng độ NAA trong quá trình tạo rễ của giống hoa Đồng Tiền in vitro G04.6: Hình 3.2 : Ảnh hưởng của NAA trong quá trình ra rễ của hoa Đồng Tiền in vitro G04.6. Hình a: So sánh các nghiệm thức Hình b: So sánh nghiệm thức 1 và nghiệm thức 2 ( MS và MS + 0.2 mg/l NAA) Hình c: So sánh nghiệm thức 1 và nghiệm thức 3 ( MS và MS + 0.4 mg/l NAA) Hình d: So sánh nghiệm thức 1 và nghiệm thức 4 ( MS và MS + 0.6 mg/l NAA) Hình e: So sánh nghiệm thức 1 và nghiệm thức 5 ( MS và MS + 0.8 mg/l NAA) Hình f: So sánh nghiệm thức 1 và nghiệm thức 6 ( MS và MS + 1.0 mg/l NAA) Bảng 3.3 : Số rễ trung bình của hoa Đổng Tiền in vitro G04.6 sau 15 ngày cấy. Nghiệm thức Số rễ Nghiệm thức 1 (MS) 1.7 Nghiệm thức 2 (NAA = 0.2 mg/l 1.7 Nghiệm thức 3 (NAA = 0.4 mg/l) 2.1 Nghiệm thức 4 (NAA = 0.6 mg/l) 2.4 Nghiệm thức 5 (NAA = 0.8 mg/l) 2.4 Nghiệm thức 6 (NAA = 1.0 mg/l) 1.9 Biểu đồ 3.3 : Ảnh hưởng của NAA trong quá trình ra rễ hoa Đồng Tiền in vitro G04.6. Bảng 3.4 : Chiều dài trung bình của rễ sau 15 ngày cấy. Nghiệm thức Chiều dài rễ Nghiệm thức 1 (MS) 2.6 Nghiệm thức 2 (NAA = 0.2 mg/l) 1.3 Nghiệm thức 3 (NAA = 0.4 mg/l) 1.2 Nghiệm thức 4 (NAA = 0.6 mg/l) 1.2 Nghiệm thức 5 (NAA = 0.8 mg/l) 1.3 Nghiệm thức 6 (NAA = 1.0 mg/l) 1.3 Biểu đồ 3.4 : Chiều dài trung bình của rễ sau 15 ngày cấy. Nhận xét: Qua bảng trên nhận thấy ở nghiệm thức 1 (đối chứng) và nghiệm thức 2 không có sự khác biệt về số lượng rễ nhưng chiều dài rễ giảm. Ở các nghiệm thức 3 số lượng rễ và chiều dài rễ là trung bình. Ở nghiệm thức 4 và 5 có số lượng rễ là cao nhất và chiều dài rễ là phù hợp với nhu cầu sản xuất giống. Nghiệm thức 6 số lượng rễ giảm so với 2 nghiệm thức trên, do đó không đáp ứng được nhu cầu trong sản xuất giống. Vậy với mục đích của thí nghiệm và để giảm được chi phí trong sản xuất thì nghiệm thức 4 (nồng độ NAA 0,6mg/l) là phù hợp nhất. NAA là một auxin nhân tạo, có hoạt tính mạnh nên thường được sử dụng trong quá trình kích thích ra rễ để tái sinh cây hoàn chỉnh từ chồi in vitro. Sự ra rễ phụ thuộc vào nhiều yếu tố: hàm lượng auxin nội sinh, tỉ lệ C/N, ánh sáng, sự trẻ hóa của mẫu, và kiểu di truyền của mẫu cấy. NAA tác động lên sự kéo dài tế bào. Hiệu quả này là sự nối tiếp cho sự gia tăng tính đàn hồi của thành tế bào và cho sự xâm nhập của nước vào bên trong tế bào, sức căng của thành tế bào giảm đi và tế bào dài ra. Theo Bùi Trang Việt (2002), trên môi trường chỉ chứa auxin (NAA) không phối hợp với cytokinin thì mẫu cấy chỉ tăng kích thước mà không có sự phát sinh hình thái rõ rệt. Trong mô thực vật, cytokinin kích thích sự phân chia tế bào với điều kiện có auxin. Ngược lại, trong sự nuôi cấy các mô nghèo cytokinin, auxin kích thích sự nhân đôi nhiễm sắc thể, thậm chí tạo tế bào hai nhân, nhưng không có sự phân cách, sự phân vách chỉ xảy ra khi có cytokinin ngoại sinh. Ảnh hưởng của giá thể đối với cây Đồng Tiền in vitro khi ra vườn ươm: a b c Hình 3.3 : Cây Đồng Tiền ex vitro trên các giá thể khác nhau Hình a: Gía thể 100% sơ dừa. Hình b: Gía thể 75% sơ dừa + 25% đất than mùn. Hình c: Gía thể 50% sơ dừa + 50% đất than mùn. Bảng 3.5: Ảnh hưởng của giá thể đối với cây hoa Đồng Tiền ex vitro Nghiệm thức Tỷ lệ sống (%) Chiều cao trung bình / cây (cm) Số lá trung bình/ cây Nghiệm thức 1 (100% sơ dừa) 96.67% 3.83 4.24 Nghiệm thức 2 (75% sơ dừa + 25% đất than mùn) 83.33% 3.14 4.36 Nghiệm thức 3 (50% sơ dừa +50% đất than mùn) 73.33% 3.06 4.14 Biểu đồ 3.5 : Tỷ lệ sống của hoa Đồng Tiền ex vitro trêncác giá thể khác nhau Biểu đồ 3.6 : Ảnh hưởng của giá thể đối với chiều cao và số lá hoa Đồng Tiền ex vitro Nhận xét: Kết quả cho thấy nghiệm thức 1 (100% sơ dừa) có sự khác biệt rõ rệt với 2 nghiệm thức còn lại. Ở nghiệm thức 1, tỷ lệ sống, chiều cao của cây hoa Đồng Tiền rất cao (96.67%, 3.83 cm) so với 2 nghiệm thức con lại. Đối với số lá trung bình ở từng loại giá thể thì tương đương nhau, không có sự khác biệt. Qua thí nghiệm này, ta nên dùng giá thể 100% sơ dừa trong giai đoạn đưa cây ra vườn ươm là thích hợp nhất. CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận Với kết quả thu được từ các thí nghiệm, rút ra được kết luận như sau: Tái sinh cây hoa Đồng Tiền bằng đế hoa. Xử lý đế hoa Đồng Tiền trong dung dịch Calcium Hypochlorit nồng độ 15% trong thời gian 15-20 phút. Môi trường thích hợp để tạo thể nhân giống, nhân nhanh hoa Đồng Tiền in vitro là môi trường MS + 0.3-0.5 mg/l BA. Môi trường thích hợp cho giai đoạn tái sinh hoàn chỉnh giống hoa Đồng Tiền in vitro là môi trường MS + 0.3 mg/l NAA. Môi trường MS bổ sung 0.5 mg/l BA có ảnh hưởng phát sinh chồi nhiều, cây đồng đều, khỏe. Môi trường này thích hợp nhân nhanh hoa Đồng Tiền in vitro. Môi trường MS bổ sung 0.6 mg/l NAA thích hợp nhất cho việc tạo cây hoa Đồng Tiền hoàn chỉnh trước khi ra vườn ươm. Cây hoa Đồng Tiền in vitro khi đưa ra ngoài vườn ươm có tỉ lệ cây sống cao, chiều cao cây, số là trung bình/ cây tốt nhất khi trồng cây trên giá thể 100% sơ dừa. Đề nghị Vì thời gian làm đề tài có hạn, em không thể khảo sát tất cả các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tái sinh cây hoa Đồng Tiền in vitro. Nên em có một số đề nghị sau: Khảo sát sự tái sinh cây từ các bộ phận khác của hoa Đồng Tiền. Khảo sát ảnh hưởng của một số chất điều hòa sinh trưởng thực vật để tăng hệ số nhân. Khảo sát các yếu tố ngoại cảnh như nhiệt độ, ánh sáng,… ảnh hưởng đến khả năng tạo chồi, nhân chồi và ra rễ. TÀI LIỆU THAM KHẢO Sách tham khảo trong nước: Bùi Văn Thế Vinh (2008). Bài giảng Công Nghệ Sinh Học thực vật. Trường ĐH Kỹ Thuật Công Nghệ TP. Hồ Chí Minh. Trần Văn Minh (2004). Công nghệ sinh học thực vật. Viện Sinh Học Nhiệt Đới – Trung tâm Khoa học tự nhiên và Công Nghệ Quốc Gia. Nguyễn Văn Uyển (1993). Nuôi cấy mô thực vật phục vụ công tác giống cây trồng. NXB Nông Nghiệp. PGS.PTS Nguyễn Xuân Linh. Hoa và kỹ thuật trồng hoa. Viện khoa học kỹ thuật nông nghiệp Việt Nam – NXB Nông Nghiệp. Nguyễn Văn Linh (1998). Hoa và kỹ thuật trồng hoa. NXB Nông Nghiệp. Nguyễn Văn Uyển (1995). Phân bón và các chất kích thích sinh trưởng. NXB Nông Nghiệp. Sinh lý thực vật đại cương, phần II – Phát triển. NXB Đại học Quốc gia TP HCM. Tài liệu tham khảo nước ngoài: Barbosa, M. H. P., Pasqual, M., Pinto, J. E. B. P., Arello, E. F., Barros, I., 1992. Salt and indoleacetic acid effect in the root process in vitro of Gerbera jamesonii Bolus ex Hook cv. Apple Bloessem. Cienc. Prat. 16, 39-41. Haberlandt G., Sitzungsber Akad. Wiss. Wien, Math-Naturwiss. KI., 1902. First but unsuccessful attempt attempt of tissue using monocots. 111, 69-92. Hempel, M., Petos-Witkowska, B., Tymoszuk, J., 1985: The influence of cytokinins on multiplication and subsequent rooting of gerbera in vitro. Acta Horticulturae 167: 301-305 . Huang, H., LI, L., Shenghui. 2001. Tissue culture of Gerbera jamessonii Bolus. Jishou Daxue Xuebao Ziran Kexueban. 22, 35-41. Gautheret (1940) cultured cambial tissues of Ulmus to study adventinious shoot formation. Gautheret R. J., C. R. Acad. Sci. (Paris). 208, 118-120. Nobecourt P., C. R. Soc Biol. (Paris) 130. 1270-1271.White P. R., Am, J. Bot., (1939). 26. 59-64. Successful continuously growing cambial cultures of carrot and tobacco. Gautheret R. J., C. R. Acad. Sci. (Paris). 1934. In vitro culture of cambial tissues of different tress and shrubs failed. 198, 2195-2196. Guha S. and Maheshwari S. C., 1966. First Haploid plants from Dautura androgenesisNature. 204, 497 and Nature.1966. 212. 97-98. Jerzy, M., Lubomski, M., 1991. Adventitious shoot formation on ex vitro derived leaf explants of Gerbera jamesonii. Scientia Hortic. 47, 155-124. Murashige T. and Skoog F., 1962. Development of MS medium. Physiol. Plant., 15, 473-497. Murashige T., Skoog, F., 1962. Arevised medium for rapid growth and with tobacco tissue culure. Physiol. Plant.15,473-497. Overbeek J. van et al., 1941. Coconut Milk used for growth and development of very young Datura embryos. Scinece. 94, 350-351. Pierik, R. L. M., Segers, H. H. M., 1973. Invitro culture of midrib explants of gerbera. Adventitious formation and callus induction. Z. Pflanzenphysiol. 69, 204-12. PHỤ LỤC Thành phần môi trường khoàng MS (Murashige và Skoog, 1962) Khoáng đa lượng mg/l mM NH4NO3 1650 20.6 KNO3 1900 18.8 CaCl2.2H2O 440 3.0 MgSO4.7H2O 370 1.5 KH2PO4 170 1.25 Khoáng vi lượng mg/l µM KI 0.83 5.0 H3BO3 6.2 100 MnSO4.4H2O 22.3 100 ZnSO4.7H2O 8.6 30 Na2MoO4.2H2O 0.25 1.0 CuSO4.5H2O 0.025 0.1 CoCl2.6H2O 0.025 0.1 Na2.EDTA 37.3 100 FeSO4.7H2O 27.8 100 Vitamine và các chất hữu cơ khác mg/l µM Myo-Inositol 100 555 Nicotinic acid 0.5 4 Pyridoxine HCl 0.5 2.5 Thiamine HCl 0.1 0.3 Glycine 2.0 27 CÁCH PHA MÔI TRƯỜNG MS TẠI TRUNG TÂM Pha 6 dung dịch mẹ A, B, C, D, E, F. Dung dịch Thành phần Lượng hóa chất cần pha trong dung dịch mẹ A KNO3 NH4NO3 CaCl2.2H2O MgSO4.7H2O KH2PO4 19.0g/l 16.5g/l 4.4g/l 3.7g/l 1.7g/l B H3BO3 MnSO4.7H2O ZnSO4.2H2O 0.62g/l 1.69g/l 0.86g/l C CuSO4.5H2O CoCl2.6H2O 0.25g/l 0.25g/l D Na2EDTA FeSO4.7H2O 0.372g/l 0.278g/l E KI Na2MoO4.2H2O 0.83g/l 0.25g/l F (VITAMIN) Glycine Nicotinicacid Pyridoxin-HCl Thiamin-HCl Myo-inositol 200mg/100ml 50mg/100ml 50mg/100ml 10mg/100ml 10.000mg/100ml Pha môi trường làm việc: Chuẩn bị một bình dung tích 1 lít, chứa sẵn 400ml nước cất, sau hòa thêm: 50ml A +5ml B + 1ml C + 5ml D + 5ml E + 5ml F (VITAMIN). 30g đường + chất điều hòa sinh trưởng (nếu cần thiết) + thêm nước cho đủ 1000ml, khuấy đều, trung hòa pH = 5.8, cuối cùng cho 7g agar vào khuấy đều, đun cho tan hết agar đổ vào bình tam giác (hoặc bình nhựa chịu nhiệt) hấp tiệt trùng.