Khóa luận Tìm hiểu quy trình phát hiện enterobacter sakazakii trong sữa bột

. sakazakii (cronobacter spp ) , đã được nêu ra tại cuộc họp giữa các chuyên gia của các tổ chức FAO vào năm 2006. Từ đó các nghiên cứu được tiến hành . Tiêm tế bào não chứa E. sakazakii vào chuột mới sinh ở các mao mạch của não trong của chuột đã được thực hiện. Công việc chỉ ra rằng E. sakazakii (Cronobacter spp.) tồn tại và nhân rộng trong các đại thực bào và cho thấy sự tham gia và di căn tại tế bào nội mô của người Thí nghiệm được tiến hành với từng chủng E. sakazakkii (cronobacter spp) cho thấy sự đa dạng của các đặc tính độc lực giữa các E. sakazakii phân lập, và (Cronobacter spp.) 21 2.3.6 Cơ chế gây bệnh[3] Cho đến nay cơ chế gây bệnh cụ thể của E. sakazakii chưa được xác định. Do đó có thể hiểu E. sakazakii như một tác nhân cơ hội gây nhiễm trùng. Nghiên cứu cho rằng E. sakazakii có một sự nhiễm bệnh giống nhau giữa độc tố của E.coli và coliform. Có một khả năng là các độc tố được truyền qua các sinh vật trong ruột người thông qua thể plasmid. 2.2.6.1 Các nguồn nhiễm bệnh  Người: lây nhiễm từ các mẫu của bệnh nhân như dịch não tủy, máu, đờm, họng, mũi, phân, ruột, vết thương, tủy xương, mắt, tai, dạ dày, bệnh phẩm qua đường hậu môn  Động vật: Ruồi và động vật gặm nhấm được xem như các nguồn gây bênh mặc dù ở một tỷ lệ thấp (0,2%)  Môi trường: từ nước, bụi, đất, vật liệu thực vật, bùn, máy hút bụi  Thực phẩm : trong các loại sữa bột , rau củ quả, Pho mát, sản phẩm sấy khô các loại thảo mộc, gia vị, hạt giống lúa, rau diếp, thịt bò băm nhỏ, xúc xích thịt và rau quả, lên men tinh bột sắn, đậu xanh và mầm cỏ linh lăng, và thịt  Các nguồn khác từ môi trường, các dụng cụ chế biến, các quy trình đóng gói … 2.2.6.2 Triệu chứng  Ủ bệnh : hầu như không có triệu chứng nhất định, các triệu trứng như ăn không ngon, khó chịu, vàng da, sốt cao, tiêu chảy, động kinh  Gây bệnh: trường hợp trẻ sơ sinh, nhiễm trùng tiến triển đến viêm màng não (tình trạng viêm cấp tính của các màng của não và tủy sống), và phát triển cuối của là não úng thủy (bất thường gia tăng số lượng dịch não tủy trong khoang sọ) đặc trưng của bệnh nhiễm trùng hệ thống thần kinh trung ương  Liều lượng: theo các nghiên cứu thì khả năng gây bệnh khi bị nhiễm khoảng 1000 tế bào sẽ gây ra nhiễm trùng, và trong sữa bột cho trẻ em có khoảng < 3 cfu/100g sẽ gây nhiễm trùng 22  Độ tuổi gây bệnh: ở mọi lứa tuổi đều có nguy cơ Nhiễm khuẩn E. sakazakii. Nhưng nguy cơ cao nhất là ở các trẻ sơ sinh, trẻ sinh non có cân nặng nhỏ hơn 2,5kg  Di chứng: Gây ra các bệnh nhiễm trùng, viêm màng não, để lại những di chứng thần kinh, chậm phát triển,… hoặc có thể gây tử vong. 2.2.7 Các biện pháp phòng và xử lí bệnh 2.2.7.1 Các biện pháp phòng bệnh Enterobacter sakazakii được tìm thấy chủ yếu trong sữa vì vậy phải đọc kĩ hướng dẫn trước khi sử dụng sữa, không nên đễ sữa quá lâu sau khi chế biến (không quá 4 giờ), rửa tay sạch trước khi pha sữa. Nước dùng đễ pha sữa phải là nước nước đun sôi thật kĩ trước khi cho giảm nhiệt độ đến 72oC. Làm sạch bình hay ly sữa bằng nước sôi. Quậy thật đều hỗn hợp bột và nước. Thường xuyên tiêm phòng vaccine cho trẻ để tăng đề kháng. Người mẹ nên được hướng dẫn và tìm hiểu thông tin đầy đủ về cách pha chế và bảo quản các sản phẩm sữa bột cho trẻ. 2.2.7.2 Xử lí bệnh Hầu hết các loại nhiễm trùng do vi khuẩn gây ra thuốc đặc trị là các loại thuốc kháng sinh. Riêng E. sakazakii có khả năng kháng một số loại kháng sinh. Vì vậy uống thuốc đúng liều và đúng cách là cách trị bệnh hiệu quả và bảo vệ sức khỏe. Một số loại kháng sinh có hiệu quả trong việc điều trị bệnh do E. sakazakii như chloramphenicol, gentamicin-ampicilin hoặc ampicilin. 2.2.8Tình hình nhiễm E. sakazakii trong sữa bột 2.2.8.1 Việt Nam Tình hình sữa nhiễm khuẩn E. sakazakii tại Việt nam hiện nay chưa có trường hợp nào được công bố. Tuy nhiên các sản phẩm sữa bột nhập khẩu vẫn là mối đe dọa hiện nay. 23 Để phát hiện trong sữa có vi khuẩn nhóm E. sakazakii hay không thì phải thực hiện thêm nhiều công đoạn xét nghiệm. Vì vậy, đến thời điểm này, theo Cục An toàn Vệ sinh thực phẩm (ATVSTP) vi khuẩn E. sakazakii chưa được định danh để đưa vào danh mục các vi khuẩn cần giám sát. Theo các chuyên gia dịch tễ - vi khuẩn E. sakazakii nói trên thuộc nhóm Ecoli (gây bệnh tiêu chảy ở trẻ em). Đây là một loại khuẩn hiếm gặp, có khả năng làm suy giảm hệ thống thần kinh trung ương, gây bệnh tiêu chảy và hạn chế khả năng lưu thông máu đối với tất cả trẻ em. Vi khuẩn này cũng có thể gây bệnh viêm màng não ở trẻ em và tỷ lệ tử vong khoảng 50%. 2.2.8.2 Thế giới Cơ quan Thực phẩm và Dược phẩm Mỹ (FDA) đã có thông báo liên quan đến nhiễm khuẩn Enterobacter sakazakii ở trẻ sơ sinh nuôi bằng sữa bột dinh dưỡng . Các cụm nhiễm E. sakazakii đã được báo cáo một loạt các địa điểm trong vài năm qua của các trẻ sơ sinh ăn sữa bột do các nhà sản xuất khác nhau sản xuất. Một nghiên cứu kiểm tra sữa bột trẻ sơ sinh dựa trên công thức sản phẩm thu được từ một số quốc gia khác nhau và thấy rằng E. sakazakii có thể được thu hồi từ 20 (14%) trong 141 mẫu. Tổng Cục Kiểm tra Chất lượng và Kiểm dịch Trung Quốc đã công bố danh sách 852 loại thực phẩm, đồ uống và mỹ phẩm bị cấm bán ra thị trường do có chứa vi khuẩn E. sakazakii trong đó có cả rượu, thịt cá đông lạnh, nước và bánh quy của Mỹ, Nhật, Tây Ban Nha và sữa bột Đài Loan. Ngoài sữa bột Đài Loan thì nhãn hiệu sữa Pauls do công ty Parmalat Australia sản xuất, một chi nhánh của tập đoàn thực phẩm của Ý cũng nằm trong 852 loại thực phẩm, đồ uống và mỹ phẩm bị cấm lưu hành vì có chứa vi khuẩn độc hại. Các cán bộ kiểm dịch đã tiến hành lấy mẫu xét nghiệm trên 9.624 tấn sữa bột của công ty Đài Loan Wei Quan và phát hiện có Enterobacter sakazakii, một 24 loại vi khuẩn có thể gây bệnh viêm màng não cho trẻ nhỏ. Đây là căn bệnh rất nguy hiểm và gây tỉ lệ tử vong cho tới 50% số trẻ mắc bệnh. Ngoài sữa bột Đài Loan thì nhãn hiệu sữa Pauls do công ty Parmalat Australia sản xuất, một chi nhánh của tập đoàn thực phẩm của Ý cũng nằm trong 852 loại thực phẩm, đồ uống và mỹ phẩm bị cấm lưu hành vì có chứa Enterobacter sakazakii Hình 2.9 : Hai loại sữa điển hình nhiễm E. sakazakii 25 CHƯƠNG 3: CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN ENTEROBACTER SAKAZAKII 3.1 Phương pháp truyền thống 3.1.1 Nguyên tắc Mẫu sữa nghi ngờ có sự hiện diện của Enterobacter sakazakii đễ phát hiện ta thông qua các bước + Tiền tăng sinh + Tăng sinh chọn lọc trên môi trường nuôi cấy đặc trưng + Khẳng định vi khuẩn bằng các thử nghiệm sinh hóa 3.1.2 Môi trường nuôi cấy - Nước đệm pepton (BPW) - Canh thang tryptoza lauryl sulfat cải biến (mLST)/môi trường vancomyxin - Thạch phân lập Enterobacter Sakazakii (ESIATM) - Thạch đậu tương trypton (TSA) 3.1.3 Thiết bị, dụng cụ  Thiết bị khử trùng khô ( tủ sấy) , thiết bị khử trùng ướt (Autoclave)  Pipet  Bể điều nhiệt  Đĩa petri  Tủ ấm  Vòng cấy  Ống nghiệm  Máy đo pH 3.1.4 Lấy mẩu (TCVN 6400) - Dụng cụ Dụng cụ lấy mẫu: ống xăm, môi, thìa hoặc dao trộn 26 Dụng cụ chứa mẫu phải đủ lớn để chưa ¾ thể tích và cho phép trộn mẫu trước khi dùng phương pháp lắc, các vật chứa phải có nắp đậy Các dụng cụ phải là các hợp kim chịu nhiệt ở 180oC hoặc các dụng cụ bằng chất dẻo sử dụng 1 lần. Có thể khử trùng theo các phương pháp sau  Phương pháp A : giữ trong không khí nóng từ 170-175oC kho dưới 2 giờ  Phương pháp B : giữ trong luồng hơi nóng từ 121oC không dưới 20 phút (Autoclave)  Phương pháp C : hơ trên ngọn lửa sao cho các dụng cụ tiếp súc trực tiếp với lửa  Phương pháp D : nhúng các dụng cụ vào ethanol nồng độ ít nhất là 70% Các dụng cụ sau khi khử trùng sẽ được bảo quản trong điều kiện vô trùng trước khi sử dụng - Cách lấy Lấy tối thiểu 100g sau khi lấy bảo quản trong điều kiện vô trùng ở 30oC Luôn luôn lấy mẫu ở điều kiện vô trùng vì đây là lấy mẫu để kiểm tra vi sinh nên điều kiện vô trùng là cần thiết Dùng dao hoặc thìa trộn vô trùng. Loại bỏ lớp sản phẩm trên bề mặt của vùng lấy mẫu, lấy mẫu bằng ống xăm vô trùng. Cắm ống xăm khô sạch vào sản phẩm nếu cần với những vật chứa nằm trên cạnh nó, cho khe cắm hướng xuống phía dưới với tốc độ xuyên đều khi ống xăm chạm tới đáy thùng xoay ống xăm 180o rút ra và đổ sản phẩm vào vật chứa mẫu và đậy ngay nắp lại. Nếu thấy có dấu hiệu không tốt về điều kiện của lớp bột phía trên thì có thể lấy riêng từng lớp khác nhau Mẫu là các sản phẩm đóng gói chưa mở, có thể dùng các vật chứa thích hợp để lấy mẫu sao cho mẫu không dưới 100g 27 3.1.5 Chuẩn bị mẩu thử (TCVN 6263) - Nguyên tắc Chuẩn bị mẫu thử bằng cách pha loãng các mẫu sản phẩm. Bằng các dung dịch pha loãng ban đầu phù hợp với sản phẩm, nếu cần có có thể chuẩn bị pha loãng thập phân tiếp theo. Để giảm bớt số lượng vi sinh vật có trong một đơn vị thể tích để thuận tiện cho việc kiểm tra vi sinh - Cách làm Các thao tác được thực hiện trong môi trường vô trùng, các dụng cụ thực hiện là các dụng cụ và thiết bị dùng trong phòng thí nghiệm vi sinh Trộn kỹ lượng sữa bột trong hộp kính bằng cách lắc đều và đảo liên tục, nếu hộp quá đầy thì có thể chuyển qua hộp có kích thước to hơn để trộn đều. Mở nắp, dùng thìa xúc phần mẫu thử theo yêu cầu. Hâm nóng lọ chứa 90ml dung dịch pha loãng thích hợp tới 45oC ± 1 trong nồi cách thủy Cân 10g mẫu thử cho vào bình thủy tinh thích hợp và rót dần dung dịch pha loãng vào Để hòa tan, xoay tròn từ từ lọ này cho ướt bột sau đó lắc lọ 25 lần với khoảng di động là 300mm trong khoảng 7 giây , có thể dùng máy trộn để thay cho việc lắc Đặt lọ vào nồi cách thủy 5 phút và thỉnh thoảng lắc 28 3.1.6 Qui trình phân tích (TCVN 7850:2008) Chuẩn bị mẫu thử/tiền tăng sinh: cân x g phần mẫu thử cho vào 9 lần x ml BPW Ủ ở 37oC trong 18 giờ ± 2 giờ Ủ ở 44oC trong 24 giờ ± 2 giờ Ủ ở 44oC trong 24 giờ ± 2 giờ Ủ ở 25oC trong 48 giờ Tăng sinh chọn lọc trong môi trường vancomyxin/mLST Chuyển 0.1 ml từ BPW đã cấy vào 10 ml môi trường vancomyxin/mLST Phân lập thạch sinh màu chọn lọc Cấy vạch một vòng đầy dịch cấy từ môi trường vancomyxin/mLST lên Thạch sinh màu (ESIATM) trong đĩa petri Khẳng định: sinh màu vàng chọn năm khuẩn lạc điển hình cấy vạch lên đĩa chứa môi trường TSA Khẳng định:sinh hóa Chọn một khuẩn lạc màu vàng từ đĩa TSA để thử sinh hóa Diễn giải kết quả 29 3.1.7 Cách tiến hành 3.1.7.1 Phần mẫu thử Để chuẩn bị cho dung dịch pha loãng ban đầu, lấy một lượng x gam phần mẫu thử cho vào môi trường tiền tăng sinh BPW với thể tích lớn gấp 9 lần. Sao cho thu được tỷ lệ phần mẫu thử với môi trường tiền tăng sinh được qui định trong phương pháp này. Để yên cho các mẫu khô tan trong môi trong dịch lỏng mà không cần khuấy trộn nếu sau 30 phút không tan hết thì có thể trộn nhẹ nhàng 3.1.7.2 Tiền tăng sinh Ủ mẫu đã cấy trong môi trường PBW tiền tăng sinh ở 37oC trong 18 - 22 giờ. E. sakazakii trong môi trường ban đầu ít hay bị tổn thương. Môi trường này giúp các vi sinh vật phục hồi và tăng số lượng trước khi đi cấy 3.1.7.3 Tăng sinh chọn lọc Sau khi ủ trong môi trường tiền tăng sinh, dùng pipetman chuyển 0,1 ml dịch cấy thu được từ môi trường BPW vào 10ml môi trường vancomyxin/mLST là môi trường tăng sinh E. sakazakii nó .ủ ở 44 oC trong 24 giờ Nên sử dụng nồi cách thủy hoặc tủ ấm để đảm bảo rằng nhiệt độ tối đa 44,5oC 3.1.7.4 Phân lập Enterobacter sakazakii giả định Sau khi ủ ở môi trường vancomyxin/mLST, tiếp tục cấy ria một vòng đầy khoảng 0,1µl lên bề mặt đĩa thạch môi “trường phân lập Enterobacter sakazakii giả định (ESIATM)” ủ ở 44oC trong 24 giờ Sau khi ủ kiểm tra đỉa thạch sinh màu về sự có mặt hay không có mặt của các khuẩn lạc điển hình của Enterobacter sakazakii giả định Các khuẩn lạc điển hình có màu xanh cây đến xanh lục, cỡ nhỏ từ 1 – 3 mm các khuẩn lạc không điển hình thường hơi trong suốt và có màu tím 30 Hình 3.1 : E. sakazakii trong môi trường ESIA 3.1.7.5 Khẳng định Chọn từ 1 đến 5 khuẩn lạc E. sakazakii giả định điển hình đã được kiểm tra trên đĩa thạch ủ. Cấy vạch các khuẩn lạc đã chọn trong môi trường ESIATM lên môi trường TSA sao cho khi ủ quan sát được các khuẩn lạc tách biệt. Ủ đĩa này ở 25oC từ 44 giờ đến 48 giờ sau khi ủ quan sát các khuẩn lạc sinh màu vàng. Một vài chủng đặc biệt của E. sakazakii có thể không sinh màu vàng trong các điều kiện thử nghiệm qui định. Hoặc mất sắc tố do cấy truyền. Trong trường hợp này thì các khuẩn lạc như thế sẽ bị bỏ sót Hình 3.2 : E. sakazakii trên môi trương thạch TSA 31 3.1.8 Phân lập Enterobacter sakazakii trên môi trường vi sinh Brilliance Enterobacter sakazakii Agar[7]. - Nguyên tắc Brilliance™ Enterobacter sakazakii Agar (công thức chuẩn Chromogenic Enterobacter sakazakii Agar) là môi trường sử dụng cho việc phân lập và đếm Enterobacter sakazakii từ mẫu thực phẩm Brilliance Enterobacter sakazakii Agar dựa trên phản ứng anpha- glucosidase, phản ứng này dựa trên sự kết hợp chặt chẽ giữa cơ chất chromogenic 5-bromo-4-chloro-3indolyl-anpha-D-glucopyranoside có mặt trong môi trường. Enzyme anpha-glucosidase, hiện diện trong Enterobacter sakazakii, cơ chất hydrolyses sinh ra khuẩn lạc màu xanh trên đĩa môi trường màu vàng xám. Proteus vulgaris cũng có hoạt tính anpha-glucosidase dương tính yếu và cũng có thể phát triển để sinh ra những khuẩn lạc có màu tương tự như E. sakazakii. Tuy nhiên trên môi trường này, Proteus spp mọc lên những khuẩn lạc màu xám: chúng sản sinh ra hydrogen sulphide trong sự hiện diện của ferric ions hình thành nên ferrous sulphide. Desoxycholate có tác dụng làm ẩn đi sự phát triển của hầu hết vi sinh vật Gram dương . - Môi trường  EE broth  Brilliance Enterobacter sakazakii Agar -Cách tiến hành Các mẫu được giữ ấm trong nước qua đêm, sau đó được làm giàu trong môi trường EE broth Dùng một que cấy vòng lấy 10µl từ canh thang đã được giữ ấm EE broth và trải đều lên bề mặt của thạch Brilliance Enterobacter sakazakii Agar pleate. Giữ ấm đĩa thạch ở 35-37°C trong 24 giờ, và quan sát khuẩn lạc màu xanh lá cây Xác định số khuẩn lạc bằng phương pháp đếm hoặc bằng phương pháp sinh hóa 32 Kết quả : Dương tính các khuẩn lạc có màu xanh lá cây Hình 3.3: Khuẩn lạc Enterobacter sakazakii trên môi trường Brilliance Enterobacter sakazakii Agar 3.1.9 Phân lập Enterobacter sakazakii trên môi trường MacConkey - Nguyên tắc Thạch MacConkey là môi trường chọn lọc cho các vi khuẩn thuộc họ vi khuẩn đường ruột và các trực khuẩn gram âm khác có trong một quần thể hỗn tạp và phân biệt chúng có lên men lactose hay không men lactose. Muối mật và tinh thể màu tím ức chế hầu hết các vi khuẩn gram dương nhưng cho phép các thực khuẩn gram âm mọc được. Đường lactose như là nguồn carbonhydrat duy nhất. Trực khuẩn gram âm, nếu lên men sẽ sinh ra khuẩn lạc màu hồng hoặc màu đỏ. Ngược lại, nếu không lên men lactose thì khuẩn lạc không có màu hoặc khuẩn lạc có màu trong. - Phương pháp thực hiện Sử dụng môi trường MacConkey, và các vi khuẩn được cấy lên môi trường này. Đặt vào tủ ấm 35oC từ 18-24 giờ. Vi khuẩn có thể lên men lactose mạnh hay yếu trong 24 giờ nuôi cấy sinh ra các khuẩn lạc có màu hoặc xuất hiện màu hồng nhẹ 24-48 giờ không nuôi cấy quá 48 giờ như thế sẽ làm đảo lộn kết quả. - Đọc kết quả E. sakazakii có màu xanh 33 Hình 3.4: E. sakazakii trên môi trường Macconkey sau 24 giờ ở 36oC, khuẩn lạc có màu hồng 3.1.10 Khẳng định sinh hóa 3.1.10.1 Môi trường và thuốc thử trong thử nghiệm sinh hóa - Thuốc thử phát hiện oxidase - Môi trường Lysine decarboxylase - Môi trường Ornithin decarboxylase - Môi trường Arginin dehydrolase - Môi trường để lên men hydrat carbon (Nước peptone có phenol, D- sorbitol, L-rhamnose, D- sucrose và amygdalin) - Môi trường lên men carbohyrat hoàn chỉnh + Môi trường cơ bản + Dung dịch hydrat carbon ( D- sorbitol, L- rhamnose, D-sucrose, D- melibiose và amygdalin ) 80 mg/ml + Môi trường carbohyrat hoàn chỉnh - Môi trường simmons citrate - Môi trường ONPG borth - Môi trường MR-VP 34 3.1.10.2 Phép thử Oxydase Dùng kim cấy sử dụng một lần hoặc que cấy bằng thủy tinh lấy 1 phần của mỗi khuẩn lạc đặc trưng đã chọn Ria cấy lên giấy lọc được làm ẩm bằng thuốc thử oxydase. Không sử dụng vòng cấy hoặc que cấy bằng niken/crom Nếu màu của giấy lọc không đổi sang màu tím hoa cà màu tím hoặc màu xanh đậm thì phản ứng được coi là âm tính 3.1.10.3 Phép thử L-Lysin decarboxylase, L-Ornithin decarboxylase Dùng que cấy, que cấy hoặc đũa thủy tinh lấy từng khuẩn lạc đã chọn cấy vào ngay dưới bề mặt môi trường lỏng Lysine decarboxylase và Ornithin decarboxylase ủ các ống này ở 30o C từ 24 giờ Sau khi ủ có màu tím chứng tỏ phản ứng dương tính màu vàng chứng tỏ âm tính 3.1.10.4 Phép thử L- arginin dihydrolase Dùng que cấy hoặc đũa thủy tinh lấy từng khuẩn lạc đã chọn cấy vào ngay dưới bề mặt môi trường lỏng Arginin dehydrolase ủ các ống này ở 30o C từ 24 giờ Sau khi ủ có màu tím chứng tỏ phản ứng dương tính màu vàng chứng tỏ âm tính 3.1.10.5 Phép thử lên men các loại đường khác nhau Dùng que cấy hoặc đũa thủy tinh lấy từng khuẩn lạc đã chọn cấy vào ngay dưới bề mặt môi trường lỏng lên men Hydrat carbon ủ các ống này ở 30oC từ 24 giờ Sau khi ủ có màu vàng chứng tỏ phản ứng dương tính màu đỏ chứng tỏ âm tính 3.1.10.6 Phép thử chỉ sử dụng Citrate Dùng vòng cấy hay que cấy lấy từng khuẩn lạc đã chọn cấy lên bề mặt nghiêng của môi trường Simmons citrate ủ các ống nghiêng này ở 30oC từ 24h Sau khi ủ môi trường chuyển sang màu xanh chứng tở phản ứng dương tính 35 3.1.10.7 Thử nghiệm Nitrate - Nguyên tắc Phương pháp này nhằm xác định vi sinh vật có nitratase để khử nitrate thành nitrite hay không VSV nào có khả năng khử nitrate thành nitrite Đó là các vi sinh vật hiếu khí tùy nghi Các vi sinh vật có khả năng khử nitrate tổng hợp hệ enzyme nitratase xúc tác sự khử nitrate thành nitrite và nitơ phân tử. Sự khử nitrate còn được gọi là sự phản nitrate hóa, diễn ra trong điều kiện không có oxy phân tử . Đây là cách biến dưỡng năng lượng theo phương thức hô hấp kị khí Sản phẩm cuối cùng của sự khử này có thể là nitrite (NO2-), amoniac (NH3), nitơ phân tử (N2), hydroxylamine (NH2OH) hay nitric oxide (NO) Hoạt tính nitratase được định tính dựa trên sự tạo thành nitrite và sự cạn kiệt nitrate Nitrite được tạo ra từ nitrate sẽ phản ứng với sulphanilamide và N- napthylethylenediamine hydrochloride ở pH acid cho hợp chất màu hồng Tuy nhiên do nhiều vi sinh vật tiếp tục chuyển hóa nitrite thành các hợp chất khác nên mặc dù có sự hiện diện của nitratase nhưng môi trường cũng không xuất hiện màu hồng. Trường hợp này tiến hành kiểm chứng sự cạn kiệt của nitrate bằng bụi kẽm kim loại, nitrate sẽ phản ứng với bụi kẽm tạo màu hồng. - Phương pháp tiến hành Có thể thực hiện bằng một số cách sau + Cách 1: môi trường sử dụng là ống môi trường lỏng Nitrate Broth. Cấy sinh khối chủng thuần và ủ ở 37oC qua đêm + Cách 2 : Dùng que cấy vòng thu lấy sinh khối từ khuẩn lạc chủng thuần, khuếch tán dày đặc chủng vật thử nghiệm (E. sakazakii) vào ống nghiệm chứa dung dịch sodium nitrate 0,01M trong đệm phosphate 20 Mm, pH= 7 ủ ở 37oC trong 24 giờ 36 + Cách 3 : nhỏ vài giọt dung dịch sodium nitrate 1% vào dịch nuôi cấy đã nuôi cấy ở cuối pha log. Ủ ở nhiệt độ 37oC trong 4 giờ Sau thời gian ủ, acid hóa môi trường bằng cách bổ sung vài giọt HCl 1N sau đó bổ sung 0,5ml dung dịch sulphanilamide 0,2% và 0,5ml N- napthylethylenediamine hydrochloride được bảo quản trong tủ lạnh để định tính nitrite. Khi phản ứng định tính nitrate (-) thì bổ sung một lượng nhỏ bụi kẽm để định tính nitrate - Đọc kết quả Thử nghiệm nitratase là (+) khi có sự xuất hiện màu hồng Trường hợp không xuất hiện màu hồng, tiếp tục định tính nitrate bằng bụi kẽm. Nếu phản ứng định tính nitrate cho màu hồng ( do sự hiện diện của nitrate ) thì thử nghiệm nitratase là (-), ngược lại nếu không chuyển màu thì thử nghiệm nitratase là (+) Hình 3.5 : Thử nghiêm nitratase (+) khi xuất hiện màu đỏ 3.1.10.8 Thử nghiệm ONPG - Nguyên tắc Các vi khuẩn chỉ lên men lactose khi có sự tổng hợp trong tế bào của enzyme là β-galactosidase có vai trò xúc tác sự thủy phân lactose vào bên trong tế bào. Một số vi khuẩn không có gen mã hóa enzyme β -galactosidase nên không thể lên men lactose Hoạt tính của enzyme này có thể được xác định dựa vào cơ chất tổng hợp là o-nitrophenyl-D-galactopyranoside (ONPG) 37 Sự thủy phân của cơ chất đường này bởi β -galactosidase sẽ phóng thích o- nitrophenol có màu vàng - Phương pháp tiến hành Môi trường dùng cho thử nghiệm này là ONPG Broth chứa 0,6% o- nitrophenyl-D-galactopyranoside trong dung dịch Na2HPO4 1mM Môi trường được khử trùng bằng màng lọc vô trùng với kích thước lỗ 0,45 µm và được phân thành các dung tích 2ml vào trong các ống nghiệm vô trùng Dùng que cấy vòng cấy sinh khối từ khuẩn lạc của chủng thuần vào ống môi trường. Ủ ở 37oC qua đêm - Đọc kết quả Thử nghiệm ONPG là (+) khi có sự chuyển vàng trong ống dung dịch nuôi cấy, là (-) khi không có sự chuyển màu của môi trường Hình 3.6 : Kết quả thử nghiệm ONPG (+) ống nghiệm màu vàng 3.1.10.9 Thử nghiệm tính di động trên thạch mềm - Nguyên tắc Vi sinh vật di động nhờ cấu trúc protein gọi là tiên mao có nhiều ở vi khuẩn hình que, một số vi khuẩn hình cầu Khả năng di động là một trong những căn cứ có thể dùng để phân biệt vi sinh vật. Khả năng này có thể được quan sát dựa vào sự tăng trưởng và di động của vi sinh vật vào bên trong môi trường thạch mềm - Cách tiến hành 38 Sử dụng thạch mềm chứa 0,5% agar. Môi trường được đun tan, phân phối thành dung tích 5ml vào các ống nghiệm vô trùng, và được hấp khử trùng ở nhiệt độ 121oC trong 15 phút các ống môi trường này được làm nguội ở trạng thái đứng và bảo quản ở 4 – 10oC . Dùng que cấy thẳng thu sinh khối từ khuẩn lạc của chủng thuần sau khi ủ ở nhiệt độ thích hợp 18-24 giờ trên môi trường KIA hay môi trường thích hợp khác Chúng được cấy bằng cách đâm sâu đầu que cấy xuyên vào giữa môi trường trong ống nghiệm đến độ sâu khoảng 2cm Các ống được ủ ở nhiệt độ 37oC trong 24- 48 giờ nếu cho kết quả (-) thì được ủ tiếp ở nhiệt độ 25oC trong 5 ngày. Thực hiện song song việc ủ ở điều kiện tương tự, một ống môi trường không chứa vi sinh vật để làm ống đối chứng. Nhiệt độ có ảnh hưởng rất quan trọng đến sự di chuyển của vi sinh vật nên ta ủ ở cả hai điều kiện nhiệt độ khác nhau. - Đọc kết quả Thử nghiệm là (+) khi vi sinh vật mọc lan khỏi đường cấy và làm đục môi trường xung quanh, là (-) khi vi sinh vật chỉ mọc trong đường cấy môi trường xung quanh vẫn trong. Ở ống đối chứng không có vi sinh vật tăng trưởng nên môi trường trong 3.1.9.10 Thử nghiệm VP (voges-proskauer) - Nguyên tắc Có thể giúp phân biệt các loài Enterobacteriaceae dựa trên sự oxi hóa acetoin từ 2,3-butanediol thành diacetyl. Sự oxi hóa acetoin thành diacetyl được tăng cường nhờ xúc tác của anpha-naphthol. Diacetyl kết hợp với nhân guannidine có trong pepton kết tụ thành phức diacetyl- guannidine có màu đỏ - Phương pháp tiến hành Môi trường được sử dụng cho thử nghiệm VP là môi trường MR-VP có pH = 6,9 39 Dùng que cấy vòng cấy vào các ống môi trường MR-VP một ít sinh khối từ khuẩn lạc của chủng thuần cần xác định đã được ủ 18-24 giờ trên môi trường KIA hoặc TSI Ủ các ống này ở 37oC trong 24-48 giờ. Sau khi ủ bổ sung thuốc thử koblentz vào môi trường: thuốc thử Koblentz gồm dung dịch A là 5 % anpha-naphthol trong cồn, dung dịch B là 40% KOH. Trước tiên nhỏ 6 giọt dung dịch A, sau đó nhỏ 2 giọt dung dịch B - Đọc kết quả Thử nghiệm VP là (+) khi có màu đỏ xuất hiện trên mặt môi trường, là (-) khi bề mặt môi trường không đổi màu Hình 3.7 : Kết quả thử nghiệm VP ( Voges-Proskauer) (+) cho màu đỏ 3.2 Các phương pháp hiện đại 3.2.1 Phương pháp PCR Sử dụng phương pháp PCR vào việc phát hiện các loại vi sinh vật đã được nghiên cứu nó được xem như là một phương pháp mới cho kết quả tốt hơn so với các phương pháp truyền thống. Những lợi thế của phương pháp này là độ nhạy, độ chính xác cao và được tự động hóa bằng các thiết bị công nghệ cao nên chi phí đầu tư cho phòng thí nghiệm cao, các yếu tố kĩ thuật , tiêu chuẩn cần phải tuân thủ Một số vấn đề thường gặp của phương pháp PCR là do độ nhạy cao của nó, làm sai lệch kết quả thường do việc bị ô nhiễm. Hoặc phổ biến nhất là do các nguồn khuếch đại dẫn đến các ức chế phản ứng PCR, sai sót trong việc hút pipet. Các nguồn ô nhiễm có thể có trong dịch cơ thể thực phẩm kiểm tra, DNA mục tiêu 40 3.2.1.1 lịch sử phát triển PCR (Polymerase Chain Reaction), (Phản ứng Trùng Phân, Phản ứng chuỗi Polymerase, hay phản ứng PCR). Bản chất của PCR là sự tổng hợp nhân tạo nhằm tạo ra các đoạn ADN mới. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) được Kary Mullis và cộng sự (Mỹ) phát minh năm 1985 và kể từ đó đã tạo nên một tác động to lớn đối với các nghiên cứu sinh học trên toàn thế giới 3.2.1.2 Nguyên tắc Ðây là phương pháp in vitro sử dụng các cặp mồi để tổng hợp số lượng lớn các bản sao từ một trình tự ADN đặc biệt dựa trên hoạt động của enzyme polymerase. Phương pháp PCR dựa trên hoạt động của ADN polymerase trong quá trình tổng hợp ADN mới từ mạch khuôn. Tất cả các ADN polymerase đều cần những mồi, là những đoạn ADN ngắn có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn. Ðoạn mồi này sau đó sẽ được nối dài ra nhờ hoạt động của ADN polymerase để hình thành một mạch mới mới hoàn chỉnh. Một phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm ba giai đoạn: - Giai đoạn biến tính: tách chuỗi ADN từ mạch đôi thành dạng mạch đơn - Giai đoạn bắt cặp: gắn cặp mồi đặc trưng theo nguyên tắc bổ sung - Giai đoạn kéo dài chuỗi: tổng hợp chuỗi AND mới giống chuỗi AND gốc 41 Hình 3.8 : Cơ chế của phản ứng PCR 3.2.1.3 Các thành phần tham gia vào quá trình PCR  ADN khuôn ADN khuôn (DNA template) hay còn gọi là ADN mục tiêu được sử dụng làm cái khuôn để các mồi PCR gắn vào vị trí bổ sung với nó, sau đó với sự tham gia của các thành phần cần thiết, phản ứng tổng hợp sẽ diễn ra tạo lên một đoạn ADN 42 mới giống hệt đoạn ADN nằm giữa hai vị trí gắn mồi. Từ chu kỳ thứ hai trở đi, ngoài ADN khuôn ban đầu, những đoạn ADN vừa được tổng hợp cũng được sử dụng làm khuôn cho những chu kỳ tổng hợp tiếp theo.  Mồi PCR Việc lựa chọn primer rất quan trọng cho một phản ứng PCR. Đoạn mồi cần có kích thước hợp lí, từ 18-25 nucleotide, có trình tự bổ sung với trình tự 2 đầu mạch khuôn. Mồi càng dài khả năng tổng hợp ADN càng chính xác. Ngược lại khi mồi quá ngắn quá trình bắt cặp giữa mồi và khuôn không thuận lợi nên cho kết quả PCR kém độ chính xác có 2 loại mồi là mồi xuôi ( forward primer, kí hiệu là F), và mồi ngược (reverse peimer, kí hiệu là R) tham gia phản ứng PCR Mồi xuôi bắt cặp và gắn ở đầu 3’ của mạch khuôn 5’ 3’, mồi ngược bắt cặp bổ sung gắn ở đầu 3’của mạch khuôn 3’ 5’. Mồi ảnh hưởng đến rất nhiều đến phản ứng PCR, để đảm bảo hiệu quả phản ứng PCR cần chọn các mồi xuôi và ngược có trình tự không bổ sung với nhau, tránh xảy ra hiện tượng các cặp mồi bắt cặp nhau, có nhiệt độ nống chảy (tm) gần giống nhau.Nếu biết trình tự của các đoạn gen cần khuếch đại thì có thể tổng hợp nhân tạo các primer tương ứng để thể hiện PCR và tách chúng ra bằng kĩ thuật điện di. Hiệu quả PCR cao khi có mồi phù hợp với khuôn và khoảng cách giữa mồi xuôi và ngược không qúa 1kb  dNTP dNTP (A, T, G, C là những “viên gạch” để xây dựng lên sợi ADN mới trong phản ứng chuỗi. Nồng độ của dNTP thường sử dụng cho mỗi phản ứng là 200M. Nếu nồng độ dNTP quá cao nó sẽ liên kết với Mg2+, một ion rất cần cho sự hoạt động của enzym tổng hợp, vì vậy mà sẽ ảnh hửng tới phản ứng tổng hợp. dNTP rất nhậy cảm với sự thay đổi nhiệt độ, cứ sau 35 chu kỳ của PCR thì dNTP hầu như đã bị suy giảm, trong một môi trường acid nó sẽ chuyển hoá nhanh thành dNDP và dNMP. Do vậy mà dNTP là chất không bền, đặc biệt sử dụng cho PCR.  Enzym tổng hợp ADN. 43 Là một thành phần quan trọng của phản ứng PCR. Trong điều kiện thích hợp cùng với các thành phần cần thiết khác, enzym hoạt động tổng hợp nên ADN mới. Nồng độ sử dụng enzym phụ thuộc vào mỗi loại enzym và thuộc tính của nó, có thể sử dụng từ 1 đến 2 đơn vị enzym sẽ cho hiệu quả tốt nhất với PCR có thể tích 25l. Nếu quá nhiều enzym có thể sẽ làm tăng nồng độ glycerol trong dung dịch phản ứng, dẫn tới quá trình tổng hợp không đồng đều giữa các vị trí và tạo ra hình ảnh điện di không rõ nét. Ngược lại, nếu quá ít sẽ thiếu enzym và kết quả nhận được là sản phẩn tổng hợp không đầy đủ.  Dung dịch đệm PCR Dung dịch đệm chung nhất của PCR bao gồm các thành phần KCl, MgCl2 và Tris. Muối KCl góp phần làm tăng hiệu quả của phản ứng, thông thường những mồi cho sản phẩm PCR với kích thước lớn hơn thì hoạt động tốt hơn trong môi trường có nồng độ muối thấp hơn và ngựơc lại những đôi mồi cho sản phẩm PCR ngắn hơn sẽ hoạt động tốt hơn trong môi trường có nồng độ muối cao hơn. MgCl2 là nhân tố cần thiết để enzym Taq hoạt động, nếu nồng độ MgCl2 thấp, sẽ ức chế sự hoạt động của enzym Taq, tuy nhiên nếu nồng độ quá cao sẽ cho kết quả PCR không đặc hiệu. Tris có vai trò giữ cho pH dung dịch ổn định, sự thay đổi nồng độ của Tris không ảnh hưởng nhiều đến kết quả phản ứng PCR. 3.2.1.4 Phương pháp xác định Enterobacter sakazakii bằng phản ứng PCR[3] Trang thiết bị và dụng cụ - Tủ cấy vô trùng - Tủ lạnh lưu mẫu - Máy khuấy từ - Máy nhiệt khô - Máy ly tâm - Vortex mixer (máy trộn mẫu) - Các loại Eppendorf 0,2; 0,5; 1,5 ml - Micropipette với các loại thể tích từ 0,5 µl đến 100 µl 44 - Cân phân tích - Bếp điện - Kéo, đèn cồn - Bộ điện di nằm ngang và bộ nguồn - Máy tru trình nhiệt (Mastercycler) - Tủ UV Chuẩn bị mẫu  Mẫu sữa bột Các loại sữa bột cho trẻ em bị nghi ngờ có sự hiện diện của Enterobacter sakazakii. Các mẫu được lấy trong môi trường vô trùng mỗi mẫu lấy không hơn 100g Cho 100g mẫu vào bình chứa với thể tích thích hợp và cho vào 900ml nước cất vô trùng ở nhiệt độ 45oC và ủ qua đêm ở nhiệt độ 37oC . sau khi ủ lấy ra 2ml dung dịch đã được ủ cho vào eppendorf để tách chiết DNA  Mẫu vi sinh vật Các loại vi khuẩn được nuôi giữ trong môi trường TSB có chứa 15% glycerol ở nhiệt độ - 20 oC và được cấy trên môi trường TSA trước khi đem thử Tách chiết DNA Nguyên tắc : Việc thu nhận DNA từ tế bào vi khuẩn được tiến hành thông qua nhiều bước. Các giai đoạn cơ bản của tách chiết DNA bao gồm: (1) Phá màng tế bào và màng nhân. (2) Loại protein. (3) Tủa DNA. Đối với mẫu sữa bột Trước khi chiết xuất DNA, 2ml mẫu được đem đi ly tâm ở mức 5 900 xg trong 10 phút loại bỏ phần dung dịch nổi phần cặn là vi khuẩn 45 Thêm 800µl đệm phosphate (1 phần 120 mM NaH 2PO4 và 9 phần 120 mM Na2HPO 4 ), 700 µl phenol và 100 µl 20% (m / v) sodium dodecyl sulfate (SDS) hỗn hợp này được vortexed trong 2 phút và sau đó ủ ở 60oC trong 20 phút. Sau khi ủ, mẫu được ly tâm trong 5 phút tại 1 500 xg lấy phần dung dịch là dung dịch DNA loại bỏ phần cặn bên dưới là các xác protein Bổ sung vào phần dung dịch với 600 µl phenol gồm phenol: chloroform: isoamylalcohol (25:24:1) hòa tan hỗn hợp trên và được ủ trên nước đá 1 giờ và sau đó ly tâm trong 10 phút ở 15 000 xg Sau khi ly tâm loại bỏ phần dung dịch . phần cặn được rửa bằng cồn ethanol 70% và ly tâm trong 5 phút ở 15 000 x g sau khi ly tâm hút phần dung dịch ra cẩn thận không được làm mất phần cặn. Làm khô phần cặn bằng không khí khô sau đó bổ sung thêm 100µl TE (10 mM Tris (Fluka), 1 mM EDTA (Merck), pH 8). Để hòa tan phần cặn Phản ứng PCR Gene Primer Sequence (5’ – 3’) ompA ESSF ESSR GGATTTAACCGTGAACTTTTCC CGCCAGCGATGTTAGAAGA Phản ứng xảy ra với thể tích 25 µl có chứa 1 U (0,35 µl) Taq ADN polymerase , 2,5 µl đệm magiê cùng với enzym, 2 mM (1,5 µl) MgCl2, 1 µl dimethyl sulfoxide (DMSO), 1 mM (1 µl) dNTPs, 0.5 µM (0,5 µl) mỗi mồi và 750 µg / ml (1 µl) mẫu DNA, và 1 µl DNA chiết xuất từ vi khuẩn E. sakazakii đã được thêm vào để biểu hiện kết quả và 1 µl nước cất vô trùng (mẫu chứng dương) Phản ứng PCR được thực hiện bằng máy chu trình nhiệt ( Mastercycler ). Các mức nhiệt độ được lập sẵn như sau. 46 Giai đoạn biến tính : Hỗn hợp được giữ ở nhiệt độ 95oC trong 2 phút làm biến tính tách 2 đoạn DNA quá trình này được thực hiện trong 35 chu kì trong 35 giây ở 95oC để biến tính thêm Giai đoạn gắn mồi: Nhiệt độ được hạ xuống 61oC trong 1 phút Giai đoạn kéo dài DNA : tăng lên 72oC trong 1 phút để kéo dài đoạn mồi và giai đoạn này kéo dài 10 phút Sau khi trải qua chu trình nhiệt hỗn hợp sẽ được cho lên gel agarose có chứa ethidium bromide và đem điện di và được đọc kết quả dưới tia UV Đọc kết quả Hình 3.9 : Kết quả sau khi điện di sử dụng cặp mồi ESSF và ESSR giếng 1-17 đều cho kết quả (+) tính với đoạn gen ompA. Giếng 1 là chứng dương và giếng C là chứng âm M là trọng trượng phân tử 3.2.2 Phương pháp real time PCR 3.2.2.1 Lịch sử phát triển Vào năm 1992 – 1993, Higuchi và cộng sự đã tiên phong phân tích PCR kinetic (PCR động) bằng cách thiết lập hệ thống phát hiện các sản phẩm khuếch đại khi các sản phẩm này được tích lũy. Hệ thống Real - time bao gồm máy luân nhiệt có hệ thống chiếu mẫu bằng tia UV và tín hiệu huỳnh quang được thu nhận qua CCD (charge coupled device) camera. Ethidium bromide được thêm vào trong mỗi 47 hỗn hợp phản ứng Real - time PCR. Khi có sự khuếch đại, số lượng ADN sợi đôi ngày càng tăng, ethidium bromide xen vào ADN mạch đôi, do đó tín hiệu huỳnh quang tăng lên Ngày nay, các nhà khoa học không ngừng cải tiến kỹ thuật Real - time PCR, đồng thời phát minh ra các chất chỉ thị huỳnh quang: SYBR Green I, FAM, HEX, Texas Red®, CyTM5, 3.2.2.2 Khái niệm và nguyên lí hoạt động - Khái niệm Real - time PCR là phương pháp khuếch đại và đồng thời phát hiện đoạn ADN chuyên biệt thông qua các chất chỉ thị huỳnh quang. Trong phản ứng Real - time PCR, quá trình nhân bản ADN đang diễn ra theo từng chu kỳ nhiệt được theo dõi trực tiếp Real - time PCR gồm hai quá trình diễn ra đồng thời: nhân bản ADN bằng phản ứng PCR và đo độ phát huỳnh quang tỷ lệ thuận với số lượng đoạn ADN tạo thành. - Nguyên lí của phương pháp real-time PCR Real-time PCR kiểm soát lượng huỳnh quang giải phóng ra trong phản ứng từ đó có thể biết được lượng sản phẩm PCR trong từng thời điểm (chu kỳ) của quá trình khuếch đại, trái ngược với PCR truyền thống chỉ biết được lượng sản phẩm được khuếch đại ở thời điểm cuối cùng của phản ứng khuếch đại. Real-Time PCR là một phản ứng động. Cho phép phát hiện “Huỳnh quang phát ra nhờ sự khuếch đại của sản phẩm PCR” tại mỗi chu kỳ của phản ứng PCR. Phân tích kết quả phản ứng PCR mà không cần bước điện di trên gel. Phân tích kết quả huỳnh quang phát ra theo thời gian tại mỗi chu kỳ phản ứng PCR bằng máy tính Kỹ thuật real- time PCR sử dụng taqman probe: trong kỹ thuật này, ngoài 2 thành phần cơ bản của real-time PCR còn có thêm 2 thành phần quan trọng để probe có thể phát huỳnh quang được khi có sự hiện diện của các sản phẩm khuếch đại đặc hiệu từ DNA đích, đó là: 48  Taqman-probe là những oligonucleotise có trình tự bổ sung với một trình tự đặc hiệu trên DNA đích. Probe này được đánh dấu ở đầu 5’ bằng chất nhuộm chỉ thị huỳnh quang – fluorescent reporter dye (gọi là reporter) và chất hấp thụ – quencher ở đầu 3’. Reporter và quencher có phổ kích thích và phát quang trùng nhau. Nhờ đó tín hiệu huỳnh quang được hấp thu. Khi ADN đích tích lũy, probe gắn vào ADN đích nhưng chưa phát quang. Khi mạch bổ sung với mạch khuôn mà probe bắt cặp được kéo dài,  Enzyme Taq ADN polymerase tiến tới đầu 5’ của probe. Hoạt tính 5’3’ exonuclease của Taq ADN polymerase sẽ phân cắt đầu 5’ đã được đánh dấu huỳnh quang của probe. Do đó chất chỉ thị huỳnh quang - reporter được phóng thích ra khỏi sự bắt cặp của chất hấp thụ – quencher và tín hiệu huỳnh quang tăng lên. Mức độ huỳnh quang tương ứng với số ADN chuyên biệt mong đợi. Khác với SYBR Green I, primer dimer và các sản phẩm ADN khuếch đại không đặc hiệu sẽ không cho tín hiệu huỳnh quang. Như vậy, tín hiệu huỳnh quang được ghi nhận trong giai đoạn kéo dài. Độ mạnh tín hiệu huỳnh quang tích lũy tăng dần  Chất phát huỳnh quang được chọn làm reporter phải có phổ phát sáng tách biệt với quencher  Reporter phát sáng trong khoảng kích thích của quencher.  Quencher phải nằm gần reporter để hấp thụ hiệu quả. Reporter là chất gắn vào đầu 5’ của taqman probe, có khả năng phát huỳnh quang khi nhận được nguồn sáng kích thích Quencher là chất có khả năng hấp thụ được ánh sáng huỳnh quang phát ra từ reporter khi reporter nhận được ánh sáng kích thích, nó sẽ chuyển ánh sáng hấp thụ được thành ánh sáng, do vậy quencher sẽ pháy ra huỳnh quang nhưng bị cản lại vì kính lọc chỉ dành cho ánh sáng huỳnh quang phát ra từ reporter 49 Hình 3.10 : Sơ đồ phát quang của Taqman-probe 3.2.2.3 Phương pháp tiến hành Hỗn hợp phản ứng real time PCR là 50µl bao gồm - 1x dung dịch đệm PCR - 0,4 µM/L mồi và mẩu dò, 1µl DNA - 200 µmol/L mổi loại dATP, dGTP, dCTP, dTTP - 2,6 unit Taq DNA polymerase, 1,7 mmol/L MgCl2 50 Hoặc sử dụng các bộ kít có chứa sẵn các thành phần của phản ứng ta chỉ cần thêm vào lượng DNA mẫu cần thiết Hình 3.11: Kết quả được đọc bằng máy real time 7500. Hệ thống Real - time PCR gồm máy luân nhiệt được nối với máy quang phổ huỳnh quang và máy vi tính Các điều kiện phản ứng là 94oC trong 2 phút, tiếp theo là 35 chu kỳ của 94oC trong 30s, 58oC trong 30s và 72oC trong 30s một bước mở rộng để kéo dài chuỗi là 72oC trong 7 phút Đoạn mồi và đoạn probe Primer and probe Sequentie (5’- 3’) OmpA-F OmpA-R OmpA-probe GGTGAAGGATTTAACCGTGAACTT GCGCCTCGTTATCATCCAAA CCCGGAAAGCGCATGGCC Đọc kết quả Biểu đồ khuếch đại của Real-time PCR có: trục tung (Y) là cường độ huỳnh quang phát ra từ ống phản ứng khi nhận ánh sáng kích thích, còn trục hoành (X) là các chu kỳ nhiệt. 51 Hình 3.12 : Kết quả khảo sát khả năng khuếch đại của mồi và mẫu dò trên gene OmpA của E. sakazakii Chứng âm 52 CHƯƠNG IV : KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 kết luận Sữa bột là thức ăn dinh dưỡng cho trẻ em nó chứa hầu hết các chất dinh dưỡng cần thiết cho sự phát triển của trẻ sơ sinh như protein, glucid, lipid, vitamin, các muối khoáng. Những hợp chất này rất cần thiết cho khẩu phần ăn hằng ngày của trẻ sơ sinh. Do đó sữa đóng vai trò quan trọng đối với nhu cầu dinh dưỡng của trẻ em. Bên cạnh đó cũng là môi trường thuận lợi cho việc phát triển của vi sinh vật gây bệnh Enterobacter sakazakii là một vi khuẩn Gram (-) hình que, có tiên mao và kị khí tùy nghi có đầy đủ tiêu chuẩn là một colifrom và các đặc điểm chịu nhiệt ở 5- 8oC nên khả năng sống sót của chúng rất cao. Là nguyên nhân gây ra các bệnh nguy hiểm cho trẻ sơ sinh như viêm màng não và viêm ruột hoại tử để lại nhiều di chứng nguy hiểm và có thể gây chết người. Sữa bột được xem là nguồn lây nhiễm E. sakazakii sang người nhiều nhất. Đa số các trường hợp nhiễm bệnh đều do sử dụng các loại sữa nhiễm khuẩn E. sakazakii. Các phương pháp phân lập để phát hiện E. sakazakii đã được nghiên cứu rất nhiều, trong bài tiểu luận này tôi xin đề cập đến một số phương pháp phân lập và phát hiện loại vi khuẩn độc hại này gồm có :  Phương pháp nuôi: cấy dựa vào đặc điểm sống của E. sakazakii sử dụng môi trường thạch để tăng sinh sau đó sử dụng các kiểm nghiệm sinh hóa để khẳng định - Ưu điểm: dễ thực hiện chi phí cho phòng thí nghiệm thấp, thu được sinh khối vi sinh vật. - Nhược điểm: Tốn thời gian, cần sử dụng nhiều loại hóa chất, hiểu rỏ về đặc điểm sinh hóa của vi sinh vật. Dễ bị nhầm lẫn với các chủng vi sinh vật khác, và dễ bị nhiễm các loại vi sinh vật khác trong qúa trình nuôi cấy.  Phương pháp PCR : Là một phương pháp hiện đại dựa vào quá trình tru trình nhiệt để khuếch đại đoạn DNA đặc trưng cho vi khuẩn E. sakazakii 53 - Ưu điểm: phương pháp PCR được xem như là một phương pháp mới cho kết quả tốt hơn so với các phương pháp truyền thống. Những lợi thế của phương pháp này là độ nhạy, độ chính xác và tin cậy cao và được tự động hóa bằng các thiết bị công nghệ cao - Nhược Điểm : Mặc dù kỹ thuật PCR phát hiện nhanh với độ nhạy cao nhưng vẫn cần 18 – 36 giờ cho một xét nghiệm. Kỹ thuật này không có khả năng định lượng chính xác số bản sao của tác nhân cần kiểm tra trong mẫu. Do sử dụng các thiết bị công nghệ cao nên chi phí đầu tư cho phòng thí nghiệm là rất cao  Phương pháp Real-time PCR là một phương pháp cải tiến của phương pháp PCR thông qua các chất chỉ thị huỳnh quang - Ưu điểm và nhược điểm Không cần điện di sau khi thực hiện phản ứng Real - time PCR, quy trình đơn giản, tiến trình thực hiện nhanh, rút ngắn thời gian cho kết quả, độ nhạy cao, độ đặc hiệu cao, ống phản ứng PCR luôn luôn đóng, tránh nguy cơ ngoại nhiễm. Tuy nhiên Real - time PCR đòi hỏi phòng thí nghiệm phải có trang thiết bị máy hiện đại, giá thành khá cao. 4.2 Kiến nghị Sau khi hoàn thành bài khóa luận này, tôi đã nhận thấy Enterobacter sakazakii là một vi sinh rất nguy hiểm đặc biệt là đối với trẻ sơ sinh. Bên cạnh đó các yếu tố độc lực và cơ chế gây bệnh của vi khuẩn E. sakazakii chưa được nghiên cứu rõ. Sự tồn tại của vi khuẩn này rất khó được phát hiện bằng các phương pháp thông thường sẽ dễ gây hiện tượng dương tính giả. Dễ nhầm lẫn với các vi sinh vật khác, gây khó khăn trong việc chuẩn đoán Do đó Tôi có đề nghị là nên có những biện pháp phòng ngừa và phòng tránh hạn chế các rủi ro do Enterobacter sakazakii gây ra. Cụ thể như sau : Nên nuôi con bằng sữa mẹ vì sữa mẹ chứa những yếu tố quan trọng trong hệ miễn dịch của trẻ nhỏ. Đối với các loại sữa bột nên được kiểm tra các chỉ tiêu vi sinh bằng các phương pháp có độ chính xác cao để phát hiện các yếu tố gây bệnh trước khi đến tay người tiêu dùng . Trong quá trình pha chế sữa bột cần làm đúng các chỉ dẫn của 54 nhà sản xuất. Tuyên truyền về những tác hại của Enterobacter sakazakii cho mội người để hạn chế đến mức thấp nhấp những tổn hại do vi sinh vật này gây ra Thông qua bài tiểu luận này, hy vọng sẽ góp phần nào đó giúp mọi người hiểu rõ hơn về nguy cơ gây bênh của các vi sinh vật trong các sản phẩm dinh dưỡng hiện nay đặc biệt là tác hại của Enterobacter sakazakii gây ra cho con người. Góp phần hiểu rõ tầm quan trọng của việc đánh giá chất lượng thực phẩm và việc giữ vệ sinh môi trường sống, bảo quản và pha chế thực phẩm đúng tiêu chuẩn để bảo vệ sức khỏe của chính mình và mọi người. 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt Cấu trúc tế bào vi khuẩn Vietsciences - Nguyễn Lân Dũng- 05/10/2005 Phương pháp phân tích vi sinh – Trần Linh Thước – nhà xuất bản giáo dục TCVN (7850:2008) : Sữa và sản phẩm sữa - Phát hiện Enterobacter sakazakii TCVN 6400 : Sữa và sản phẩm sữa - Hướng dẩn lấy mẩu TCVN (6263:1997): sữa và sản phẩm sữa - Cách chuẩn bị mẩu thử Tài liệu tiếng Anh [1].www.fineli.fi/food.php?foodid=672&lang=en [2]. [3]. [4]. f?sequence=1 [5]. [6]. [7]. enterobacter-sakazakii-agar-cong-thuc-dfi--1847.html 56 PHỤ LỤC Thành phần môi trưởng 1. Nước đệm peptone (BPW)  Thành phần Dịch thủy phân casein bằng enzyme Natri clorua (NaCl) Natri hydro phosphat ngậm 12 phân tử nước Kali dihydro phosphat (KH2PO4) Nước 10,0 g 5,0 g 9,0 g 1.5 g 1 000 ml  Chuẩn bị Hòa tan từng thành phần trong nước bằng cách đun nóng, nếu cần. Chỉnh pH đến 7,0 ± 0,2 ở 25oC nếu cần, cho dung dich vào bình cầu hoặc ống nghiệm theo nhu cầu phân tích và khử trùng 15 phút ở 121oC 2. Canh thang tryptoza lauryl sunfat cải biến (mLST)/môi trường vancomyxin a. Canh thang tryptoza lauryl sunfat cải biến (mLST)  Thành phần Natri Clorua Dịch thủy phân mô động vật và thực vật bằng Enzyme Lactoza (C12H22O11) Kali hydro phosphat (H2HPO4) Dikali hydro phosphat (K2HPO4) Natri lauryl sunfat (C12H25NaO5S) Nước 34,0 g 20,0 g 5,0 g 2,75 g 2,75 g 0,1 g 1000 ml  Chuẩn bị Hòa tan từng thành phần trong nước, bằng cách đun nóng nếu cần, chỉnh về pH 6,8 ± 0,2 ở 25oC, phân phối 10ml mLST vào các ống nghiệm, khử trùng 15 phút ở 121oC 57 b. Dung dịch vanomyxin  Thành phần Vancomyxin Nước 10 mg 10 ml  Chuẩn bị Hòa tan vancomyxin vào nước cất trộn và lọc khử trùng c. Môi trường vancomyxin/mLST Cho 0,1 ml vancomyxin vào 10 ml dung dịch mLST đển thu được nồng độ 10µg trên ml mLST Môi trường vancomyxin/mLST có thể bền đến 1 ngày khi được bảo quản từ 0-5oC 3. Thạch phân lập Enterobacter Sakazakii (ESIATM)  Thành phần Peptone pancreatic của casein Dịch chiết nấm men Natri Clorua NaCl Natri desoxycholat 5-brom-4-cloro α-D glucopyranosit (C14H15BrCINO6) Tím tinh thể Thạch agar Nước 7,0 g 3,0 g 5,0 g 0,6 g 0,15 g 2 mg 12-18 g 1000 ml  Chuẩn bị Hòa tan từng thành phần trong nước bằng cách đun sôi. Chỉnh pH đến 7,0 ± 0,2 ở 25o C, khử trùng 15 phút ở 121oC Làm nguội đến nhiệt độ 44-47oC. Rót 15 ml môi trường này vào các đỉa Petri vô trùng và để cho đông đặc trên mặt phẳng ngang. Môi trường có thể bền đến 15 ngày nếu bảo quản từ 0-5oC 4. Thạch đậu tương trypton TSA  Thành phần 58 Dịch thủy phân casein bằng Enzym Dịch thủy phân đậu tương bằng Enzym Natri Clorua Thạch Nước 15,0 g 5,0 g 5,0 g 9-18 g 1 000 ml  Chuẩn bị Hòa tan từng thành phần trong nước bằng cách đun sôi chỉnh pH đến 7,3 ± 0,2 ở 25oC , khử trùng 15 phút ở 121oC Làm nguội đến nhiệt độ 44-47oC. Rót 15 ml môi trường này vào các đỉa Petri vô trùng và để cho đông đặc trên mặt phẳng ngang 5. Môi trường EE borth ( Enterobacteriaceae Enrichment broth ) Peptone Glucose Disodium hydrogen phosphate Potassium dihydrgen phosphate Ox bile Brilliant green Water 10g 5g 6,45g 2g 20g 0,0135g 1000 ml pH t 7,2 ± 0,2 25oC 6. Môi trường vi sinh Brilliance Enterobacter sakazakii Agar  Thành phần Công thức * gm/lít Tryptone 15.0 Soya peptone 5.0 Sodium chloride 5.0 Ferric ammonium citrate 1.0 Sodium desoxycholate 1.0 59 Sodium thiosulphate 1.0 Chromogen 0.1 Agar 15.0 pH t 7,3 ± 0,2 25oC  Chuẩn bị Cân 43.1g Brilliance Enterobacter sakazakii Agar đổ vào một lít nước cất. Lắc đều và đun sôi đến khi hòa tan hoàn toàn. Thanh trùng bằng nồi hấp ở 121°C trong vòng 15 phút , làm nguội đến 50°C. Trộn đều và đổ vào đia Petri. 7. Môi trường MacConkey Peptone Lactose Mật khô hoặc Desoxychorate Neutral red Crystal violet NaCl Agar Nước 20g 10g 1,5g 2,0g 0,03g 0,0001g 5,0g 14g 1000 ml 8. Môi trường và thuốc thử về đặc tính sinh hóa 8.1 Thuốc thử phát hiện Oxidaza  Thành phần N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine dihydro clorua (C10H16N2.2HCl) Nước 1,0 g 100 ml  Chuẩn bị Hòa tan thành phần trong nước ngay trước khi sử dung 60 8.2 Môi trường Lysine decarboxylase, Ornithin decarboxylase, tách nhóm cacboxyl (decarboxylation ) và Môi trường Arginin dehydrolase cộng 2 hydro  Thành phần L-lysin monohydroclorua C6H14N2O2.HCl Dịch chiết nấm men Glucoza C6H12O6 Bromocresol tía Nước 5,0 g 3,0 g 1,0 g 0,015 g 1000 ml L-lysin monohydroclorua C6H12N2O2.HCl Dịch chiết nấm men Glucoza C6H12O6 Bromocresol tía Nước 5,0 g 3,0 g 1,0 g 0,015 g 1000 ml L-Arginin monohydroclorua C5H14N4O2.HCl Dịch chiết nấm men Glucoza C6H12O6 Bromocresol tía Nước 5,0 g 3,0 g 1,0 g 0,015 g 1000 ml  Chuẩn bị Hòa tan từng thành phần trong nước bằng cách đun nóng, chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng pH là 6,8 ± 0,2 ở 25oC , phân phối 5 ml mổi loại môi trường L – lysine decarboxylation, L- Ornithin decarboxylation và L- Arginin dihydrolation sang các ống nghiệm và khử trùng các ống nghiệm 15 phút ở 121oC 8.3 Môi trường để lên men hydrat cacbon ( nước peptone có phenol red, D- sorbitol, L-rhamnoza, D-sucroza, D-melibioza và amygdalin ) a. Môi trường cơ bản 61  Thành phần Dịch thủy phân casein bằng Enzym Natri Clorua (NaCl) Đỏ phenol Nước 10 g 5g 0,02 g 1000 ml  Chuẩn bị Hòa tan từng thành phần trong nước bằng cách đun nóng, chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng pH là 6,8 ± 0,2 ở 25oC. phân phối vào các bình cầu có dung tích phù hợp khử trùng môi trường này 15 phút ở 121oC b. Dung dịch Hydrat cacbon (D-sorbitol, L-rhamnoza, D-sucroza, D- melibioza và amygdalin ) 80mg/ml  Thành phần Hydrat cacbon Nước 8 g 100 ml  Chuẩn bị Hòa tan riêng bốn thành phần Hydrat cacbon trong nước để thu được 4 dung dịch hydrat cacbon lọc và khử trùng c. Môi trường lên men Hydrat cacbon hoàng chỉnh  Thành phần Môi trường cơ bản Dung dịch hydrat cacbon 875 ml 125 ml  Chuẩn bị Đối với từng loại Hydrat cacbon, them dung dich Hydrat cacbon đã chuẩn bị ở trên vào môi trường cơ bản,một cách vô trùng và trộn. Phân phối 10 ml môi trường hoàng chỉnh của từng hydrat cacbon vào các ống nghiệm 3.1.2.6 Môi trường simon xitrat 62  Thành phần Natri xitrat Na3C6H5O7 Natri Clorua NaCl Dikali hydro phosphat Amoni dihhydro phosphat (NH4H2PO4) Magie sunfat Xanh bromothymol Thạch Nước 2,0 g 5,0 g 1,0 g 1,0 g 0,2 g 0,08 g 8-18 g 1000 ml Hòa tan từng thành phần trong nước bằng cách đun nóng, chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng pH là 6,8 ± 0,2 ở 25oC. Phân phối 10 ml môi trường simon xitrat vào các ống nghiệm ,khử trùng môi trường này 15 phút ở 121oC. Để nghiêng các ống sao cho thạch có chiều sâu 2,5 cm Lưu ý : các giá trị pH được qui về 25oC. Dùng axit Clohydric C(HCl)=1mol/l hoặc dung dịch natri hydroxit C(NaOH)=1mol/l để chỉnh pH nếu cần , và nước được sử dụng là nước cất hoặc nước đả được khử ion 63