Khóa luận Tìm hiểu quy trình phát hiện vibrio trong thủy hải sản đông lạnh

diễn biến phức tạp và tốc độ lây lan nhanh chóng: Đợt 1 (từ 23/10/2007-6/12/2007): xảy ra tại 14 tỉnh với 259 trường hợp (+) với phẩy khuẩn tả, đợt 2 (24/12/2007-5/2/2008): tại thành phố Hà Nội với 32 trường hợp (+). Dịch tiêu chảy cấp xuất hiện do yếu tố môi trường bị ô nhiễm, nguồn nước bị nhiễm khuẩn, bên cạnh đó còn một yếu tố nguy cơ gây gia tăng tỷ lệ nhanh đó chính là việc nhiễm các lọai vi sinh: E.coli, V.chloera, Clostridium perfringens…của một số loại thức phẩm nguy cơ: các loại mắm, rau sống, thức ăn đường phố ăn liền, các loại thực phẩm hải sản tươi sống đông lạnh. Trong năm 2009, cả nước đã xảy ra 147 vụ ngộ độc thực phẩm, trong đó có 5.026 người mắc, 3.938 người đi viện, 33 người tử vong. Vào năm 2010 các vụ ngộ độc thực phẩm thường xuyên xảy ra ở tập thể như: trong quý III/2010 cả nước đã có 48 vụ ngộ độc thực phẩm trong đó có 1.627 người mắc, 12 người tử vong, 75 công nhân của Xí nghiệp may Global (KCN Tiền Hải, huyện Tiền Hải) bị ngộ độc thực phẩm, Bình thuận 11/6/2010 có 127 du khách bị ngộ độc thực phẩm. 2.2.8.2. Tình hình nhiễm Vibrio spp trong thực phẩm thủy hải sản đông lạnh trên thế giới Trên thế giới các vụ ngộ độc thực phẩm do vi sinh vật chiếm khoảng 70% tổng số ca ngộ độc thực phẩm. Tại các nước châu Á Vibrio spp là nguyên nhân hàng đầu gây ra các vụ ngộ độc và các vụ nhiễm Vibrio spp chủ yếu ở các nước Nhật Bản, Trung Quốc và trong khu vực Đông Nam Á. Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đông lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 25 Theo thống kê ở Nhật Bản năm 1997 có 1.960 vụ ngộ độc thực phẩm với 39.989 người mắc, ở Úc mỗi ngày có 11.500 người mắc các bệnh cấp tính do ăn uống gây ra, ở Mỹ hàng năm có đến con số hàng triệu trường hợp ngộ độc thực phẩm. Năm 2001, Tổ Chức Y Tế Quốc Tế (WHO) cho biết có 184.311 trường hợp bệnh tả được báo cáo từ 58 quốc gia (95% các quốc gia này thuộc Phi Châu) và có 2.728 người chết do tiêu thụ thức ăn nhiễm Vibrio spp. Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đông lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 26 CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN VIBRIO TRONG THỦY HẢI SẢN ĐÔNG LẠNH 3.1. Phương pháp truyền thống 3.1.1. Phương pháp định tính 3.1.1.1. Nguyên tắc. Một lượng mẫu xác định (10g hoặc 25g) được tăng sinh trong môi trường chọn lọc đặc trưng. Cấy phân lập từ môi trường tăng sinh sang môi trường phân biệt chọn lọc đặc trưng. Cấy khuẩn lạc nghi ngờ trên môi trường phân lập được khẳng đỉnh bằng các phản ứng sinh hóa và huyết thanh học. Môi trường tăng sinh chọn lọc cho V. cholerae, V. alginolytycus và V. vulnificus là nước peptone kiềm. Trong khi đó môi trường Colistine Polymicine Borth thường được dùng để tăng sinh V. parahaemolyticus. Môi trường thường dùng để phân lập Vibrio là TCBS (Thiosalphate Citrate Bile Sucrose Agar). Các vi sinh vật len men được sucrose trong môi trường này sẽ cho khuẩn lạc màu vàng và làm acid hóa môi trường bên dưới khuẩn lạc. Nếu vi sinh vật không len men được đường sucrose sẽ cho khuẩn lạc màu xanh. 3.1.1.2. Thiết bị và dụng cụ • Tủ ấm 37oC • Bể điều nhiệt 42oC • Cân điện tử có độ chính xác 0,0001g • Mấy nghiền đồng thể • Mấy lắc ống nghiệm • Đĩa petri • Ống nghiệm với các kích cỡ 13, 16, 18mm • Một số thiết bị thông thường khác như: máy đo pH, tủ sấy, nồi hấp thanh trùng, tủ lạnh. 3.1.1.3. Môi trường và hóa chất • Canh pepton kiềm Alkaline Peptone Water (APW). Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đông lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 27 • Canh Colistine Polymicine Broth (Colistine). • Thạch Thiosulphate Citrate Bile salt Sucrose (TCBS Agar). • Canh Tryptone. • Thạch Kligler Iron (KI). • Canh Hugh Leifson Glucose (HLG). • Canh Carbohydrate tím. • Môi trường thử nghiệm Decarboxylase (Moeller). • Dung dịch oxidase. • Dung dịch thử nghiệm String (sodium desoxycholate 5%). • Kháng huyết thanh polyvalent O dùng cho V.cholerae. • Kháng huyết thanh O. • Dung dịch NaOH 1N. • Dung dịch HCl 1N. • Dung dịch dầu phủ vô trùng. • Dung dịch Bromocresol tím. Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đông lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 28 3.1.1.4. Quy trình phân tích. Dùng que cấy vòng lấy mẫu, cấy ria lên mặt đĩa môi trường thạch TCBS để phân lập khuẩn lạc đơn. Ủ trong 18 – 22 giờ.  Khuẩn lạc đặc trưng của Vibrio có hình dạng: KL V.cholerae và V. alginolyticus lớn, đường kính 2-3mm,láng, màu vàng, hơi phẳng, tâm đục, có quầng trắng đục xung quanh. Khuẩn lạc V.parahaemolyticus và V. vulnificus lớn, đường kính 3-4mm, màu xanh đến xanh dương. 25g mẫu + 225ml canh tăng sinh chọn lọc (APW) € đồng nhất trong 30 giây € độ pha loãng 10-1 Chọn khuẩn lạc đặc trưng, cấy sang môi trường không chọn lọc T1N1 (3% NaCl) hoặc TSA bổ sung 3% NaCl. Đem ủ 37 oC trong 18- 24h.  Thử nghiệm sinh hóa và thử nghiệm kháng huyết thanh. Kết luận. Phát hiện hay không phát hiện Vibrio trong 25g (10g) mẫu. Ủ ở 37oC trong 6 – 8 giờ. Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đông lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 29 3.1.1.5. Thuyết minh quy trình Ö Chuẩn bị mẫu Cân chính xác 25g (10g) mẫu cho vào bao PE vô trùng, sau đó thêm 225ml (90ml) dung dịch pha loãng mẫu APW. Tiến hành đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu. Thời gian dập mẫu là 30 giây. Tất cả các thao tác phải thực hiện trong điều kiện vô trùng. Ö Tăng sinh chọn lọc Dùng nước peptone kiềm chứa 1% muối NaCl cho trường hợp V.cholerae và V. alginolyticus, V. vulnificus. Dùng canh Colistine cho trường hợp V.parahaemolyticus. Sau đó đem ủ ở nhiệt độ 37oC trong 24 giờ. Ö Phân lập Sau 24 giờ, dùng que cấy vòng lấy một ít sinh khối trên môi trường APW và cấy lên bề mặt đĩa môi trường thạch TCBS để phân lập khuẩn lạc đơn, ủ 37oC trong 18 – 22 giờ. Hình dạng khuẩn lạc đặc trưng của các loài Vibrio trên môi trường này như sau: khuẩn lạc V.cholerae và V. alginolyticus lớn, đường kính 2-3mm, láng, màu vàng, hơi phẳng, tâm đục, có quầng trắng đục xung quanh. Khuẩn lạc V.parahaemolyticus và V. vulnificus lớn, đường kính 3-4mm, màu xanh đến xanh dương. Hình 3.1: Phân lập Vibrio trên CHROMagar Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đông lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 30 Hình 3.2: Phân lập Vibrio trên môi trường MacConkey Hình 3.3: Khuẩn lạc của vi khuẩn Vibrio spp trên môi trường TCBS Tiếp theo, cấy chuyền sinh khối từ các khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường phân lập TCBS thạch sang môi trường không chọn lọc TSA 2% NaCl, ủ 37 oC trong 18- 24h để thu sinh khối sử dụng cho các thử nghiệm sinh hóa. Ö Thử nghiệm sinh hóa Thử nghiệm sinh hóa quan trọng để phát hiện hay phân biệt các loài Vibrio là: quan sát tính di dộng trên kính hiển vi, quan sát sự di động trên thạch mềm và các thử nghiệm khác. Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đông lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 31 Bảng 3.1. Các đặc điểm sinh hóa của Vibrio cholerea và Vibrio parahaemolyticus Thử nghiệm sinh hóa Vibrio parahaemolyticus Vibrio cholerea ONPG (-) (+) Lactose (-) (-) ADH (-) (-) LDC (+) (+) TDA (-) (-) Indol (+) (+) Manose (+) (+) Sucrose (-) (+) Oxidase (+) (+) NaCl 0% (-) (+) NaCl 3% (+) (+) NaCl 6% (+) (-) NaCl 8% (+) / (-) (-) NaCl 10% (-) (-) Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đông lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 32 + Thử nghiệm trên môi trường TSI, KIA Nhằm xác định vi sinh vật sử dụng các nguồn carbohydrate nào, có sinh ga hay không, có sinh H2S hay không. Cấy chuyển các khuẩn lạc từ môi trường TSA vào các ống thạch nghiêng TSI hoặc KIA. Nới lỏng các nắp ống để tạo điều kiện hiếu khí. Nuôi ủ ở nhiệt độ 37oC trong 18 - 24 giờ. Trên môi trường TSI, V.cholerae làm phần thạch nghiêng và thạch đứng của môi trường chuyển màu vàng, không sinh hơi và không sinh H2S. Trên môi trường KIA, phần thạch nghiêng có màu đỏ và thạch đứng màu vàng, không sinh hơi và không sinh H2S. Hình 3.4: Kết quả thử nghiệm TSI/ KIA + Thử nghiệm với các canh thang trypton muối Cấy khuẩn lạc từ môi trường TSA vào các ống canh thang muối trypton có giải nồng độ NaCl là: 0; 1; 3; 6; 8 và 10 %. Nuôi ủ ở nhiệt độ 37oC trong 18 - 24 giờ, rồi ủ lại các ống âm tính sau 18 - 24 giờ nữa. V. cholerae phát triển được trong ống canh thang có nồng độ NaCl là 0%, 3% và làm đục môi trường. + Thử nghiệm lên men - oxy hoá Cấy khuẩn lạc từ môi trường TSA vào 2 ống môi trường bán lỏng Hugh-Leifson glucoza hoặc O/F glucoza. Phủ khoảng 1 - 2 ml dầu khoáng vô trùng vào một trong 2 ống, ủ các ống nghiệm ở nhiệt độ 37oC trong 1 - 2 ngày. Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đông lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 33 V. cholerae lên men glucoza làm môi trường Hugh - Leifson từ màu tím chuyển thành vàng và môi trường O/F từ màu xanh thành vàng. + Thử nghiệm oxidaza Ðặt giấy lọc lên một nắp đĩa petri, nhỏ khoảng 2 - 3 giọt thuốc thử oxidaza. Dùng que cấy bạch kim (platin) hoặc que cấy nhựa dùng một lần; hoặc que gỗ vô trùng lấy các khuẩn lạc từ môi trường TSA ria lên vị trí đã nhỏ thuốc thử oxidaza. V. cholerae làm vết ria có màu tím thẫm hoặc xanh thẫm sau 10 giây . Chú thích: không dùng que cấy bằng crôm hoặc bằng sắt trong thử nghiệm này. + Nhuộm gram Kỹ thuật nhuộm Gram phát hiện hình thể và tính chất bắt màu của vi khuẩn, với thành phần thuốc nhuộm gồm có tím gentian, dung dịch lugol, Fucsin kiềm bằng cách cố định tiêu bản sau đó nhỏ thuốc nhuộm tím gentian lên trong 2 phút, rửa nước, sau đó nhỏ dung dịch lugol lên trong 2 phút, hất đi, tẩy mầu bằng cồn 90o tới khi bạc màu, rửa nước, nhỏ dung dịch Fucsin kiềm ( pha loãng tỷ lệ 1/10 ) lên trong 1/2 phút, rửa nước, để tiêu bản khô trong không khí hoặc dùng giấy thấm, soi tiêu bản bằng vật kính dầu. Nhận biết vi khuẩn Gram âm bắt màu đỏ, có hình thể mảnh, cong, hình dấu phẩy, không có vỏ, không sinh nha bào, khi nuôi cấy lâu ngày sẽ có sự thay đổi về hình thể so với ban đầu. V. cholerae là vi khuẩn gram âm, hình cong dạng dấu phẩy. Hình 3.5: Vibrio cholerae Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đông lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 34 + Thử nghiệm phát triển ở nhiệt độ 420C Cấy vi khuẩn từ TSA vào một ống canh thang trypton 1% NaCl. Ủ ở nhiệt độ 42oC trong 18 - 24 giờ. V. cholerae phát triển được ở nhiệt độ 42oC làm môi trường bị đục. + Thử nghiệm lên men các nguồn cacbonhydrat Nguyên tắc: - Thử khả năng lên men carbohydrate của các chủng vi sinh vật khác nhau. - Những vi sinh vật khác nhau có khả năng sử dụng các nguồn carbon khác nhau. Carbohydrate chia làm 3 nhóm: - Nhóm 1: Monosaccharide, polyhydroxylic, aldehyde hoặc ketone. - Nhóm 2: polysaccharide và oligosaccharide. - Nhóm 3: polyhydric alcohol và các cycitol. Lên men: Là quá trình trao đổi chất oxy hóa khử, mà chất nhận điện tử cuối cùng không phải là oxy mà là các cơ chất hữu cơ khác. Sản phẩm cuối cùng của quá trình lên men phụ thuộc vào: - Dòng VSV khác nhau. - Cơ chất tự nhiên dùng để lên men. - Thời gian, nhiệt độ, pH của môi trường. Phát hiện vi sinh vật có lên men carbohydrate: - Sản phẩm tạo thành Æ pH môi trường giảm Æ sử dụng chất chỉ thị để phát hiện - Có sinh hơi Phát hiện hơi sinh ra như thế nào? - Môi trường lỏng (VSV hiếu khí) Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đông lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 35 Hình 3.6: Phát hiện vi sinh vật hiếu khí có lên men carbohydrate - Môi trường đặc (VSV kỵ khí) Hình 3.7: Phát hiện vi sinh vật kỵ khí có lên men carbohydrate Cách thực hiện: - Môi trường sử dụng: phenol red broth base đối với VSV hiếu khí và phenol red agar đối với VSV kỵ khí - Nguồn carbon: tùy vi sinh vật - Đọc kết quả: (+): môi trường chuyển sang vàng (-): không đổi màu Cấy vi khuẩn từ TSA vào các ống canh thang bromcresol có chứa một trong các lọai cacbohydrat: sacaroza, lactoza, D-cellobioza, arabinoza, D-manniton, D- Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đông lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 36 mannoza. Ủ các ống canh thang ở nhiệt độ 37oC. Phản ứng dương tính khi môi trường có màu vàng, âm tính khi môi trường giữ nguyên màu đỏ. V. cholerae cho phản ứng sacaroza, manniton, mannoza dương tính và lactoza, cellobioza, arabinoza âm tính. Hình 3.8: Kết quả thử nghiệm carbohydrate + Thử nghiệm decacboxylaza/dehydrolaza Nguyên tắc: xác định khả năng của một vi sinh vật có khả năng tổng hợp các enzyme khử nhóm carboxyl hay tách hydrogen từ các aminoacid như ornithin, lysin hay arginin Æ làm kiềm môi trường nuôi cấy. Cơ sở sinh hóa: Lysine DeCarboxylase Lysine Cadavarine + CO2 Ornithine DeCarboxylase Ornithine Putrescine + CO2 Arginine DeCarboxylase Arginine Agmatine Putrescine + CO2 Cấy vi khuẩn từ môi trường TSA vào các ống canh thang ornithin, lysin, arginin và ống đối chứng không có axit amin. Mỗi ống được phủ 1 - 2 ml dầu khoáng vô Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đông lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 37 trùng, ủ các ống ở nhiệt độ 37oC trong 18 - 24 giờ. Phản ứng dương tính khi môi trường giữ nguyên màu tím hoặc hơi đậm hơn. Phản ứng âm tính khi toàn bộ ống canh thang có màu vàng ổn định trong 4 ngày (tương tự màu của ống đối chứng). V. cholerae cho phản ứng lysin và ornithin dương tính, phản ứng arginin âm tính. Hình 3.9: Kết quả thử nghiệm decacboxylaza/dehydrolaza + Thử nghiệm urê Mục đích: xác định sự hiện diện của enzyme urease ở vi sinh vật thông qua khả năng phân hủy urea. Cơ chế: Urea + H2O Œ CO2 + H2O + NH3 Sản phẩm tạo thành là ammonia carbonat làm đổi màu chất chỉ thị. Cấy vi khuẩn từ TSA vào canh thang urê, ủ ở nhiệt độ 37oC trong 18 - 24 giờ. V. cholerae cho phản ứng âm tính nếu môi trường giữ nguyên màu tím hồng. Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đông lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 38 Hình 3.10:Kết quả thử nghiệm Urea + Thử nghiệm ONPG Để xác định sự hiện của enzyme β-galactosidase. Xét xem VSV có thể sử dụng lactose như một nguồn carbohydrate. Hình 3.11: Cơ chế thử nghiệm ONPG β-galactosidase Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đông lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 39 Lấy vi khuẩn đã phát triển trên môi trường TSI hoặc từ môi trường không chọn lọc khác có chứa 1,0% lactoza vào ống nghiệm có chứa 0,25 ml nước muối sinh lý, hoà tan. Thêm 1 giọt toluen vào ống rồi lắc đều, để yên trong 5 phút. Thêm 0,25 ml dung dịch ONPG, ủ ống nghiệm ở nhiệt độ 37oC. Kiểm tra ống định kỳ trong 24 giờ. V. cholerae cho phản ứng ONPG dương tính khi dung dịch có màu vàng. Có thể dùng đĩa ONPG thay cho thuốc thử ONPG. Hoà tan khuẩn lạc nghi ngờ vào ống nghiệm chứa 0,2 ml nước muối sinh lý. Ðặt đĩa ONPG vào đáy ống rồi ủ ấm và đọc kết quả như trên. Thử nghiệm tính nhạy cảm với hợp chất ức chế phẩy khuẩn O/129 Vibriostat. Dàn vi khuẩn lên đĩa thạch TSA 2% NaCl. Ðặt các đĩa O/129 có chứa 10 mg hoặc 150 mg Vibriostat vào các vị trí khác nhau. Sau đó, lật ngược đĩa rồi ủ ở nhiệt độ 37oC trong 18 - 24 giờ. V. cholerae không phát triển được do bị ức chế bởi Vibriostat tạo một vòng vô khuẩn xung quanh các đĩa O/129. Hình 3.12: Kết quả thử nghiệm ONPG + Tính ưa mặn (NaCl): cấy chuyển từ TSA vào môi trường canh trypton (không có NaCl), canh trypton (3% NaCl), canh trypyon (6% NaCl) và canh trypton(8% NaCl), canh trypton (10% NaCl). Ủ qua đêm ở 37oC. Kết quả tính ưa mặn của V.cholerae , V.parahaemolyticus như sau: Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đông lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 40 Tính ưa mặn V.cholerae V.parahaemolyticus V.culnificus 0% + - - 3% + + + 6% - + + 8% - + - 10% - - - + Thử nghiệm tính nhạy cảm với hợp chất ức chế phẩy khuẩn O/129Vibriostat Dàn vi khuẩn lên đĩa thạch TSA 2% NaCl. Ðặt các đĩa O/129 có chứa 10 mg hoặc 150 mg Vibriostat vào các vị trí khác nhau. Sau đó, lật ngược đĩa rồi ủ ở nhiệt độ 37oC trong 18 - 24 giờ. V. cholerae không phát triển được do bị ức chế bởi Vibriostat tạo một vòng vô khuẩn xung quanh các đĩa O/129. + Thử nghiệm kháng huyết thanh. Mục đích: xác định các dòng Vibrio khác nhau. Nhỏ 1 giọt kháng huyết thanh lên lam kính sạch và một giọt nước muối sinh lý lên một vị trí khác của lam. Dùng que cấy vô trùng khác nhau chuyển vi khuẩn từ TSA lên hai giọt dung dịch trên rồi phân tán đều vi khuẩn. Kết luận dương tính khi có hiện tượng ngưng kết ở giọt có kháng huyết thanh và không có hiện tượng ngưng kết ở giọt nước muối. Sử dụng chủng chứng dương và chủng chứng âm trong quá trình thực hiện. Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đông lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 41 Tóm tắt thử nghiệm kháng huyết thanh V. cholerae theo Bảng 3.2 và Bảng 3.3 Bảng 3.2. Phân biệt V. cholerae O1 và V. cholerae non - O1 Kháng nguyên Kháng huyết thanh đa giá O1 Dung dịch muối sinh lý Kết luận Chủng có kết quả sinh hoá tương tự V. cholerae + - V.cholerae O1 Chủng có kết quả sinh hoá tương tự V. cholerae - - V.cholerae non- O1 Chủng có kết quả sinh hoá tương tự V. cholerae + + Chủng không đặc hiệu với kháng nguyên O nhóm 1 Bảng 3.3. Phân biệt các kiểu huyết thanh chủng V.choleraeO1 Kháng nguyên Kháng huyết thanh Inaba Kháng huyết thanh Ogawa Dung dịch muối sinh lý Kết luận V. cholerae O1 + - - Chủng Inaba V. cholerae O1 - + - Chủng Ogawa V. cholerae O1 + + - Chủng Hikojima V.cholerae O1 - - - Chủng không đặc hiệu Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đông lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 42 3.1.1.6. Đọc kết quả Phát hiện hoặc không phát hiện được V. cholerae trong 25 g (10g) mẫu. 3.2. Phương pháp hiện đại 3.2.1. Phương pháp miễn dịch học – Elisa (Enzyme Linked mmunosorbent Assays) ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) hay EIA (Enzyme ImmunoAssay) là một kỹ thuật sinh hóa để phát hiện kháng thể hay kháng nguyên trong mẫu xét nghiệm. Kỹ thuật ELISA có thể được sử dụng để phát hiện bệnh phát sáng do V.harveyi trên tôm, mẫu nước và có thể xác định tất cả các dòng Vibrio spp. Phương pháp này được thực hiện dựa trên nguyên tắc bắt dính đặc hiệu của kháng nguyên và kháng thể và gồm các bước cơ bản sau: - Kháng nguyên chưa biết được gắn trên một bề mặt. - Kháng thể biết trước được "rửa" qua bề mặt đó. Kháng thể này được gắn kết với enzyme. - Thêm vào một cơ chất (substance); enzyme sẽ biến đổi cơ chất này và tạo tín hiệu có thể xác định được. Đối với các ELISA phát quang, ánh sáng sẽ được phát ra từ mẫu chứa kháng nguyên – kháng thể. Sự hiện diện của phức hợp kháng nguyên – kháng thể sẽ quyết định cường độ sáng phát ra. Với nguyên lý trên, ELISA giúp xác định sự có mặt hay không có mặt cũng như lượng kháng nguyên trong mẫu nghiên cứu. Để tiến hành ELISA cần phải có ít nhất một kháng thể đặc hiệu cho kháng nguyên chưa biết. Thông thường kháng nguyên được cố định tại các giếng của vi phiếm (polystyrene microtiter plate). Phương thức cố định không đặc hiệu: kháng nguyên gắn trực tiếp vào bề mặt của đĩa. Phương thức gắn đặc hiệu ("sandwich" ELISA): kháng nguyên được gắn với một kháng thể đặc hiệu cho cùng kháng nguyên cần kiểm tra. Kháng thể đặc hiệu sẽ được thêm vào, phản ứng tạo phức hợp kháng nguyên – kháng thể có thể sảy ra. Nếu kháng thể được gắn trực tiếp với enzyme, tín hiệu Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đông lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 43 quang học do enzyme làm biến đổi cơ chất sẽ giúp phát hiện kháng nguyên cần kiểm tra. Trong trường hợp sử dụng kháng thể thứ cấp (secondary antibody) được gắn với enzyme thông qua các liên kết cộng hóa trị giữa các phân tử sinh học (bioconjugation), kháng nguyên cần xác định sẽ được nhận biết qua kháng thể thứ cấp này. Giữa các bước của ELISA, các protein và các kháng thể không đặc hiệu, kháng thể không gắn với kháng nguyên sẽ được lấy đi nhờ các loại dịch có tác dụng "rửa". Sau bước "rửa" cuối cùng, chỉ còn kháng thể liên kết với kháng nguyên được giữ lại. Sau khi được thêm vào, cơ chất sẽ chịu tác dụng của enzyme liên kết với kháng thể trong phức hợp kháng nguyên – kháng thể. Phản ứng phát quang (biến đổi cơ chất) sẽ sảy ra. Trước đây các cơ chất tạo màu sắc được sử dụng trong ELISA nhưng ngày nay các chất phát quang được dùng rộng rãi làm tăng tính đặc hiệu và độ chính xác của ELISA. Có những phương pháp ELISA như sau: 3.2.1.1. ELISA gián tiếp (indirect ELISA) Chuyển kháng nguyên đã biết lên bề mặt cứng (được gọi chung là các đĩa). Kháng nguyên sẽ được cố định trên bề mặt. Nồng độ của các mẫu kháng nguyên này dùng để thiết lập đường chuẩn cho việc tính nồng độ của kháng nguyên trong các mẫu chưa biết. Chuyển các mẫu kháng nguyên chưa biết vào các giếng khác. Kháng nguyên chưa biết được hòa tan trong cùng một loại dung dịch đệm giống các mẫu kháng nguyên chuẩn. Thêm dung dịch protein không tương tác (non – interacting protein) như albumin huyết thanh bê (bovine serum albumin) hay casein vào tất cả các mẫu (kể cả mẫu chuẩn). Bước này được gọi là "blocking" do protein huyết thanh có tác dụng ngăn cản sự hấp phụ của các protein khác lên bề mặt của đĩa. Rửa bề mặt đĩa sau đó chuyển kháng thể (biết trước) vào tất cả các giếng của đĩa. Kháng thể sẽ kết hợp với các kháng nguyên đã được cố định mà không kết hợp với protein của huyết thanh. Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đông lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 44 Thêm kháng thể thứ cấp (secondary antibody), kháng thể thứ cấp sẽ kết hợp với bất kỳ một kháng nguyên còn dư (bước này có thể được bỏ qua nếu kháng thể dùng để phát hiện kháng nguyên đã gắn với enzyme). Rửa đĩa, các kháng nguyên gắn enzyme còn dư sẽ được loại bỏ. Thêm cơ chất. Enzyme sẽ làm biến đổi cơ chất làm sản sinh tín hiệu huỳnh quang hay tín hiệu điện hóa học (enzyme có tác dụng như yếu tố khuyếch đại). Hình 3.13: ELISA gián tiếp. 3.2.1.2. Sandwich ELISA Phương pháp được sử dụng để phát hiện kháng nguyên trong mẫu nghiên cứu và bao gồm các bước cơ bản sau (quy trình có thể được thay đổi trong nhiều trường hợp): - Chuẩn bị bề mặt (microtiter) có gắn kháng thể. - Khóa tất cả những vị trí gắn kết không đặc hiệu trên bề mặt. - Phủ mẫu chứa kháng kháng nguyên cần xác định. - Rửa đĩa, kháng kháng nguyên không được gắn kết sẽ bị rửa trôi. - Thêm các kháng thể đặc hiệu cho kháng nguyên cần chẩn đoán. Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đông lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 45 - Thêm kháng thể thứ cấp đã được gắn với enzym (kháng thể thứ cấp đặc hiệu cho kháng thể sơ cấp). - Rửa đĩa, phần không gắn kết sẽ bị rửa trôi. - Thêm cơ chất. Enzym sẽ biến đổi cơ chất tạo màu, phát quang hay tín hiệu hóa điện. Đo cường độ ánh sáng, tín hiệu huỳng quang, tín hiệu điện hóa... qua đó xác định sự có mặt và hàm lượng kháng thể. Hình 3.14: Các bước trong Sandwich ELISA. (1) Phủ đĩa bằng kháng thể (2) Thêm mẫu cần xác định kháng nguyên. Kháng nguyên (nếu có) sẽ gắn với kháng thể; (3) kháng thể dùng để phát hiện được thêm vào và kết hợp với Kháng nguyên; (4) Thêm kháng thể thứ cấp liên kết với enzyme. Kháng thể thứ cấp sẽ gắn với kháng thể dùng để phát hiện; (5) Thêm cơ chất. Enzym sẽ làm biến đổi cơ chất và phát tín hiệu có thể phát hiện và đo được. 3.2.1.3. ELISA cạnh tranh (Competitive ELISA) Các giếng trong kỹ thuật ELISA được gắn một kháng thể sơ cấp chống lại kháng nguyên. Các tác nhân phát hiện là một phức hợp đồng hóa trị của kháng nguyên này và một enzyme thường sử dụng là horseradish peroxidase và alkaline phosphatase. Các tác nhân này được trộn chung với mẫu dịch chiết của kháng nguyên và phức hợp này được cho vào trong giếng. Trong giếng đối chứng (không chứa kháng nguyên trong mẫu), phức hợp kháng nguyên – enzyme có thể gắn lên các kháng thể Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đông lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 46 sơ cấp và sau đó thêm các cơ chất tạo màu, kết quả là hiện màu trong mẫu. Trong các giếng kiểm tra, các phân tử kháng nguyên tự do trong dịch chiết cạnh tranh với các phức hợp gắn trên các kháng thể sơ cấp. Nồng độ kháng nguyên càng cao, phức hợp gắn trên kháng thể sơ cấp càng tí dẫn đến màu trong giếng càng nhạt. Thí nghiệm này nhanh, dễ dàng thực hiện. Hình 3.15: ELISA cạnh tranh. 3.2.2. Kỹ thuật PCR chuẩn (Polymerase Chain Reaction) Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) được Karl Mullis và cộng sự (Mỹ) phát minh năm 1985 và kể từ đó đã tạo nên một tác động to lớn đối với các nghiên cứu sinh học trên toàn thế giới. Ðây là phương pháp in vitro sử dụng các cặp mồi để tổng hợp số lượng lớn các bản sao từ một trình tự DNA đặc biệt dựa trên hoạt động của các dNTP tự do là enzyme polymerase, sau 20-35 chu kì có thể nhân được số bả sao rất lớn của đoạn DNA cần khuếch đại. Kỹ thuật PCR chuẩn chỉ thực hiện được khi biết rõ các trình đặc hiệu ở 2 đầu DNA cần nhân gen (đoạn khuôn) để có thể thiết kế các cặp mồi đặc hiệu . Hiện nay có thể sử dụng kỹ thuật khuếch đại DNA để chuẩn đoán nhanh bệnh do Vibrio spp trong vài giờ mà không mất nhiều thời gian để phân lập vi khuẩn. Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đông lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 47 3.2.2.1 Nguyên tắc Nguyên tắc của phương pháp này là phát hiện một đoạn DNA đặc hiệu cho Vibrio spp. Phương pháp PCR dựa trên hoạt động của DNA polymerase trong quá trình tổng hợp DNA mới từ mạch khuôn. Tất cả các DNA polymerase đều cần những mồi, là những đoạn DNA ngắn có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn. Ðoạn mồi này sau đó sẽ được nối dài ra nhờ hoạt động của DNA polymerase để hình thành một mạch mới hoàn chỉnh. Trong một phản ứng PCR để khuyếch đại một trình tự đặc biệt nào đó, ta cần phải có những thông tin tối thiểu về trình tự đó để thiết kế các mồi bổ sung ở hai đầu mạch bao gồm một mồi xuôi (sense primer) và một mồi ngược (antisense primer) so với chiều phiên mã của gene. Một khi được cung cấp hai mồi bổ sung ở hai đầu, phản ứng sẽ cho ra hàng loạt bản sao của đoạn DNA nằm giữa hai mồi đó. 3.2.2.2. Các giai đoạn của phản ứng PCR Một phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm ba giai đoạn: - Giai đoạn biến tính: trong một dung dịch phản ứng bao gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ cao trong vòng 30 giây – 1phút, thường là ở 940C. - Giai đoạn bắt cặp: ở giai đoạn này, nhiệt độ được hạ thấp cho phép các mồi bắt cặp với khuôn. Trong thực nghiệm, nhiệt độ này dao động trong khoảng từ 30° – 70°C khoảng 40 giây – 1 phút. - Giai đoạn tổng hợp: nhiệt độ được tăng lên đến 720C cho DNA polymerase sử dụng vốn là polymerase chịu nhiệt hoạt động tổng hợp tốt nhất. Thời gian tùy thuộc độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại, thưòng kéo dài từ 20 giây đến nhiều phút. Trong phản ứng PCR, chu kỳ ba giai đoạn sẽ được lặp lại nhiều lần, mỗi lần làm tăng số lượng bản sao lên gấp đôi. Sự khuếch đại của phản ứng là theo cấp số nhân và theo tính toán, sau 30 chu kỳ, sự khuếch đại sẽ là 106 so với số lượng bản mẫu ban đầu. Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đông lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 48 Hình 3.16: Các giai đoạn trong phản ứng PCR. Phát hiện gen cholerae toxin bằng phương pháp PCR: Gen cholera toxin hiện diện trong V.cholerae nhưng nó không biểu hiện trong điều kiện thí nghiệm bình thường. Vì vậy, kỹ thuật PCR cho phép khuếch đại gen tcx được thực hiện để phát hiện V.cholerae. Phương pháp này cung cấp kết quả nhanh và chính xác hơn. • Các bước thực hiện : - Lấy 1ml mẫu môi trường APW vào ống ly tâm 1.5ml và đun sôi trong 10 phút. Lysate có thể sử dụng ngay lập tức cho PCR hoặc được lưu trữ ở -20oC cho đến khi sử dụng. - Mẫu DNA sau khi thu nhận được pha loãng theo nồng độ thích hợp. - Lấy 2 ml mẫu them vào 18ml H2O cất khử ion ( tỷ lệ 1:9 ) Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đông lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 49 - Pha loãng mẫu DNA . - Thực hiện phản ứng PCR 50 ml .Hỗn hợp phản ứng PCR bao gồm các thành phần sau : • 10X Tap buffer 5.0 ml • MgCl2 ( 25Mm ) 1.5 ml • Tris- HCl 10 ml • DATP , Dttp, Dgtp , dctp 4x0.2ml • Primer : • Primer xuôi : 5’-TGA AAT AAA GCA GTC AGG TG-3’ 0.5ml • Primer ngược : 5’-GGT ATT CTG CAC AAT CAG-3’ 0.5ml • Nước cất khử ion 31.5 ml • Tap polymerase ( 2,5 U) 0.2ml Thiết lập phản ứng PCR Thời gian (phút) Nhiệt độ (oC ) Giai đoạn 1 3 94 Giai đoạn 2 Biến tính 1 94 Primer 1 55 Primer mở rộng 1 72 Giai đoạn 3 3 72 Số chu kỳ :20Æ 35 Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đông lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 50 Sơ đồ phản ứng PCR: Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đông lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 51 3.2.3. Kỹ thuật PCR phức ( Multiplex PCR ) Kỹ thuật PCR phức là phương pháp PCR sử dụng đồng thời cùng 1 lúc nhiều cặp mồi đặc hiệu khác nhau, để nhận các đoạn DNA đặc trưng khác nhau trên một phân tử DNA, hoặc trên các phân tử DNA khác nhau. Kỹ thuật PCR phức thường sử dụng để nhân các exon của gen độc tố của Vibrio spp. Kỹ thuật này thường sử dụng để phát hiện sớm tôm, cá bị nhiễm bệnh do các loài virus, vi khuẩn khác nhau. Các bước thực hiện tương tự như kỹ thuật PCR chuẩn, yêu cầu tính toán tỉ lệ cặp mồi và lượng DNTP, enzyme DNA polymerase thích hợp để hiệu quả PCR chính xác . Các bước thực hiện : tương tự như PCR chuẩn . - Thực hiện multiplex PCR gồm 10 gen của DNA tinh khiết .Hỗn hợp phản ứng gồm : • Triphosphates deoxynucleoside. • DNA polymerase Amplitaq (3U). • Nước cất khử ion. • Bộ đệm PCR [60ml Tris-Cl (pH 9.0), 15ml(NH4)2 SO4, 2ml MgCl2] hay đệm C [50ml Tris-Cl (pH 8.9), 50ml KCl, 2.5 ml MgCl2] Các Oligonucleotide primer của đối tượng gene sử dụng là : • V.vulnificus : vvh và viuB • V.parahaemolyticus : tlh, tdh, trh, ORF8. • V.cholera : ompU, toxR, tcpl • Vibrio cổ điển : hlyA Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đông lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 52 Multiplex PCR 3.2.4. Kỹ thuật DNA microarray Kỹ thuật DNA microarray là kỹ thuật lai các đoạn cDNA mạch đơn ngắn được đánh dấu huỳnh quang , với tập hợp các đoạn oligonucleotid đã biết trình tự được gắn ở các vị trí được xác định trên GeneChip để kiểm tra và phát hiện 1 trình tự nucleotide (1 gene) nào đó . Kỹ thuật DNA microray dựa trên cơ sở các đoạn DNA mạch đơn cần nghiên cứu có thể bắt cặp với các mẫu dò có trình tự tương đồng nhau theo nguyên lý Chargaff (A liên kết với T, G liên kết với C) tạo nên các phân tử lai. Dựa vào kỹ thuật phát Thiết lập phản ứng PCR phức Thời gian (phút) Nhiệt độ (oC ) Giai đoạn 1 3 94 Giai đoạn 2 Biến tính 1 94 Primer + V.parahaemolyticus 1 55 + V.vulnificus 1 65 +V. cholera 1 60 Primer mở rộng 1 72 Giai đoạn 3 3 72 Số chu kỳ :20Æ 35 Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đông lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 53 hiện huỳnh quang, với các máy quét scanner chuyên dụng có thể xác định được vị trí của các phân tử lai. 3.2.4.1. Vật liệu và phương pháp Các chủng được sử dụng trong phương pháp này là : V.cholerae 154 serovar 0:1 Inaba Tox (ATCC 14100), V.vulnificus M06-24 (0), V.prahaemolyticus F113 –A, và V.parahaemolyticus nhóm huyết thanh (serotype) 03:K6 BCA 98-03372. Sử dụng môi trường MCPC agar (Modified cellobiose – polymyxin-colistin) và TCBS agar (thiosulfate-citrate – bile-sucrose) dùng để thu nhận khuẩn lạc của 3 loài Vibrio. • V.cholera được nuôi trên môi trường Luria-Bertani agar ở 37oC. • V. vulnificus được nuôi trên môi trường marine agar ở 37oC. • V.parahaemolyticus được nuôi trên môi trường nutrient agar có bổ sung 3 % NaCl ở 37oC. Gene AND xác định: gene AND được lấy từ 1ml khuẩn lạc đem ly tâm 9000xg, sau đó loại bỏ các tế bào bằng 550ml dung dịch TE (10mM Tris-Cl, 1mM EDTA [pH8]). Sau 1 giờ ủ, thêm vào 100ml NaCl 5M cùng với 80 ml cetyltrimethylammonium bromide (ACTAB)–NaCl để tạo phức với polysaccharides. Các mẫu dò của các đối tượng gene sử dụng là : • V.vulnificus : vvh và viuB • V.parahaemolyticus : tlh, tdh, trh, ORF8 • V.cholerae : ompU, toxR, tcpl • Vibrio cổ điển : hlyA Hỗn hợp PCR phức sau khi hợp thành biotin – CTP, phản ứng kết thúc khi cho 5ml dung dịch 0.2M EDTA và phản ứng hỗn hợp làm biến tính ở 95oC trong 5 phút. Chuẩn bị DNA array: pha loãng đầu dò oligonucleotide trong đệm Spotting (0.1 M NaH2PO4, 0.2 NaCl, SDS 0.01 %). Mười hai DNA array độc tạo đốm giống 4 Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đông lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 54 sao chép trên mỗi mảng. Mỗi mảng gồm 1 oligonucleotide chuyên biệt ( khoảng 25 mer ) liên kết với biotin. 3.2.4.2. Các bước thực hiện • Thu thập các mẫu, phá vỡ màng tế bào và tách RNA thông tin . • Phiên mã ngược: thực hiện mã ngược với các mồi oligo, enzyme phiên mã ngược và dNTP các loài tạo nên các phân tử cDNA tương ứng với các mRNA. • Phiên mã in-vitro tạo các mạch RNA đánh dấu huỳnh quang: sử dụng T7 RNA polymerase, biotin – CTP, từ mỗi mạch đơn cDNA tạo nên khoảng 50 - 100 cRNA – Biotin. • Cắt đoạn: đun cRNA – Biotin ở 98oC trong 3 phút trong dung dịch đệm hybridization (4x SSC [1x SSC gồm 15mM NaCl cộng với 0.15 mM sodium citrate] [pH 7.0 ], 5x Denhardt’s soludition [0.1% Ficoll, 0.1% polyvinylpyrrolidone, 0.1 % bovine serum albumin]), cắt thành các đoạn cRNA – biotin khoảng 35-200 ribonucleotide. • Lai: các đoạn cRNA – biotin được chuyển lên các Genechip chứa các mẫu dò cDNA mạch đơn đã biết trình tự thực hiện phản ứng lai. • Nhuộm: rửa genechip để loại bỏ các cRNA đánh dấu huỳnh quang không được lai, sau đó nhuộm các phân tử lai bằng strepavidin-phycoerythrin. • Phân tích: các GeneChip đã nhuộm được đưa vào các thiết bị scanner chuyên dụng quét dự liệu phân tích kết quả . 3.2.5. Kỹ thuật RAPD RAPD là kỹ thuật phát hiện tính đa dạng của ADN nhân bản ngẫu nhiên dựa trên nguyên lý của kỹ thuật PCR. Khác với PCR thông thường cần phải biết thông tin về trình tự ADN của đoạn gen cần nhân bản để thiết kế đoạn mồi, kỹ thuật RAPD chỉ cần một lượng nhỏ ADN có nguồn gốc genom là đủ. Các đoạn mồi được tổng hợp dưới dạng decamer, tức là các oligonucleotit chỉ dài 10 nucleotit theo những trình tự nhất định. Đoạn mồi được bắt cặp với ADN khuôn ở nhiệt độ không cao (khoảng 36oC) cho nên sẽ có nhiều đoạn ADN khác nhau được nhân bản. Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đông lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 55 Chu trình nhiệt để phát hiện tính đa hình ADN nhân bản ngẫu nhiên: 95oC – 5 phút, 95oC – 1 phút, 36oC – 1 phút, 72oC – 2 phút, 45 chu kỳ (từ bước 2 đến bước 4), 720C – 8 phút, kết thúc ở 4oC. Mồi được sử dụng cho phản ứng RAPD ký hiệu là RAPD1 có trình tự như sau: RAPD1: 5’- GGTGCGGGAA-3’ (Mồi RAPD1 đã được sàng lọc trong tổng số 6 mồi vì nó cho kết quả đa hình gen cao nhất) Thành phần tham gia phản ứng RAPD gồm: Nước khử ion vô trùng (18,2 μl), Đệm cho Tag-polymerase (2,5μl), dNTP (2 μl), Mồi RAPD (1μl), Tag-polymerase (0,3 μl), ADN khuôn (ADN tổng số của mỗi chủng V. cholerae – 1 μl). Tổng thể tích cho một phản ứng là 25 μl. Điện di ADN trên gel agaroza Các đoạn ADN có khối lượng và điện tích khác nhau được tách ra khi di chuyển từ cực âm sang cực dương của máy điện di trong một điện trường có điện thế và cường độ thích hợp. Hoá chất điện di: agaroza 1-1,5% (phụ thuộc vào kích thước phân tử ADN); dung dịch đệm TAE 50X (60,5g Tris base; 14,3ml axit axetic; 25ml EDTA 0,5M, pH 8.0), 10mg/ml bromit ethidium (ethidium bromide -EtBr), đệm tra mẫu 10X (Loading buffer: 0,1 ml bromophenol blue 10%; 0,3% glyxerol 100% và dẫn bằng nước đến 1 ml). Quy trình điện di như sau: • Chuẩn bị gel agaroza: Cho 1g agaroza (đối với điện di ADN tổng số và sản phẩm PCR) hoặc 1,5g (đối với điện di sản phẩm RAPD) vào 100ml dung dịch TAE 1X, đun cho agaroza tan hoàn toàn, để nguội khoảng 50-600C, đổ dung dịch agaroza vào khay gel điện di có cài sẵn răng lược. Sau 30-60 phút, khi gel đã đông cứng, gỡ lược ra, đặt bản gel vào bể điện di, đổ đệm TAE 1X ngập cách mặt gel từ 1-2mm. • Mẫu ADN được trộn với đệm tra mẫu theo tỉ lệ 5:1 có tác dụng tạo mầu và để mẫu lắng xuống dưới, tra mẫu vào các giếng nhỏ trên gel, chạy điện di ở điện thế ổn định 100V cùng chỉ thị ADN chuẩn để xác định trọng lượng phân tử, quan sát sự di chuyển của màu để ngừng quá trình điện di. Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đông lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 56 • Bản gel được lấy nhẹ ra khỏi khuôn, ngâm khoảng 10 phút trong dung dịch TAE 1X có EtBr (2mg/ml) trên một máy lắc nhẹ, sau đó rửa bằng nước, quan sát dưới ánh sáng tử ngoại 254nm trên máy soi ADN và chụp ảnh. Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đông lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 57 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN - KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận Qua quá trình làm bài khóa luận này chúng tôi nhận ra rằng Vibrio spp là 1 loài vi khuẩn nguy hiểm cho cả con người và động vật, nhóm vi khuẩn này có thể lây nhiễm trên tất cả các giai đoạn phát triển của động vật thủy sản, trên tất cả các giai đoạn chế biến thực phẩm thủy hải sản và đã gây thiệt hại nghiêm trọng cho ngành thủy hải sản trên thế giới và tại Việt Nam, ảnh hưởng đến nền kinh tế quốc dân. Vi khuẩn này rất nguy hiểm đặc biệt là các độc tố đường ruột của nó. Nó gây ra các vụ nhiễm khuẩn đường ruột còn được coi là 1 siêu kháng nguyên rất nguy hiểm và là sự bắt đầu của các triệu chứng sốc độc hại. Tóm lại, trên thế giới hiện nay có rất nhiều loại vi khuẩn nguy hiểm không chỉ là Vibrio spp mà còn là S.aureus, Clostridium botulinum, E.coli, Salmonella. Đây đều là những vi khuẩn nguy hiểm đến sức khỏe của con người. Việc tìm hiểu và nghiên cứu về chúng là rất cần thiết để đề ra các biện pháp phòng ngừa thích hợp nhưng có lẽ ý thức của mỗi con người là biện pháp phòng ngừa hiệu quả nhất. Có những phương pháp thông dụng để xác định vi khuẩn Vibrio spp. như là phương pháp nuôi cấy trên môi trường đặc trưng, phương pháp ELISA dựa theo nguyên tắc bắt dính đặc hiệu của kháng nguyên và kháng thể, phương pháp PCR dựa vào việc phát hiện đoạn DNA đặc hiệu của vi khuẩn Vibrio sp. và có thể đưa đến những biện pháp phòng ngừa, điều trị thích hợp. 4.2. Kiến nghị Trên cơ sở được biết những mối nguy hại của Vibrio spp gây ra trên hải sản, chúng tôi mong rằng các nhà chức trách cần tiến hành những biện pháp kiểm tra nghiêm khắc đối với những người làm ăn lấy lợi ích kinh tế đặt lên hàng đầu sử dụng những thực phẩm không tươi ngon, không đảm bảo chất lượng trong kinh doanh hải sản cho người tiêu dùng, nhà chức trách nên thường xuyên kiểm tra các cơ sở kinh doanh, các mặt hàng hải sản để tiến hành ngăn chặn kịp thời những hành vi không đúng qui định. Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đông lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 58 Cần mở rộng nghiên cứu nhiều chủng vi khuẩn Vibrio spp khác nhau để tổng hợp, đưa ra các phương pháp xác định chính xác và biện pháp phòng ngừa thích hợp cho bệnh ở động vật thủy sản. Nghiên cứu phát triển và ứng dụng chế phẩm vi sinh vào trong lĩnh vực nuôi trồng thủy sản nhằm nâng cao chất luợng sản phẩm thủy sản, bảo đảm an toàn thực phẩm, đáp ứng nhu cầu ngày càng cao và khắt khe của xã hội. Quá trình kiểm tra chất lượng cần tiến hành thường xuyên ở tất cả các công đoạn sản xuất cuối cùng, kể cả giai đoạn phân phối và bảo quản. Các giai đoạn của thủ tục kiểm tra bao gồm : - Nhận diện các chuẩn mực về chất lượng . - Thiết lập các tiêu chuẩn chất lượng cho mỗi một chuẩn mực . - So sánh các kết quả với tiêu chuẩn . - Đánh giá và phân tích các sai biệt quan sát thấy. - Đề ra các biện pháp sữa chữa . Bên cạnh đó, chúng tôi mong rằng người tiêu dùng hãy thật cảnh giác trước khi lựa chọn các loại thực phẩm nói chung và hải sản nói riêng. Các nhà khoa học cũng cần có thêm nhiều nghiên cứu hơn nữa và thong tin rộng rãi trên các phương tiện thông tin đại chúng để người dân có những kiến thức cơ bản nhằm giảm thiếu những vụ ngộ độc thực phẩm . Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đông lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu trong nước 1. Bùi Quang Tề, (1996). Bệnh tôm cá và giải pháp phòng trị.Tạp chí thuỷ sản số 4/1996. 2. Đỗ thị Hòa, Bùi Quang Tề, Nguyễn Huy Dũng, Nguyễn Thị Muội (2004). Bệnh học thủy sản. NXB Nông Nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh. 3. Trần Linh Thước, (2007). Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mỹ phẩm. NXB Giáo dục. 4. PGS.TS Nguyễn Phùng Tiến, GS.TS Bùi Minh Đức, GS.TS Nguyễn Văn Dịp _ Vi sinh vật trong thực phẩm – kỹ thuật kiễm tra và chỉ tiêu đánh giá chất lượng an toàn thực phẩm. Tài liệu tiếng Anh 1. Tom Defoirdt, Peter Bossier, Patrick Sorgeloos and Willy Verstraete, (2004). The impact of mutations in the quorum sensing systems of Aeromonas hydrophila, Vibrio anguillarum and Vibrio harveyi on their virulence towards gnotobiotically cultured Artemia franciscana. Ghent University, Belgium. Tài liệu web 1. _t%E1%BB%AD 2. 3. php?storyid=236 4. 5. cholerae-trong-san.html Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đông lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 60 6. %20cua%20ong%20To%20Viet%20Chau%20- %20Bo%20Nong%20Nghiep%20va%20PTNT.pdf 7. 3 8. 1&ID=3669 9. trong-san-pham-thuy-san-Phuong-phap-dinh-tinh.thuoc 10. s%E1%BB%B1-da-hinh-gen-c%E1%BB%A7a-cac-ch%E1%BB%A7ng- vibrio-cholerae-b%E1%BA%B1ng-k%E1%BB%B9-thu%E1%BA%ADt-rapd/ 11. 45.pdf 12. 13. cal-AnalyticalManualBAM/UCM070830 14. 15. dinhtenvk02.htm. 16. 17. Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đông lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 61 PHỤ LỤC Một số môi trường chính trong phương pháp truyền thống nuôi cấy và phân lập Vibrio spp ™ Canh thang bromcresol • Pepton : 10,00 g • Natri clorua (NaCl) : 5,00 g • Cao thịt bò : 3,00 g • Tím bromcresol : 0,04 g • Nước cất : 1,00 lít pH = 7,0 0,2 (ở nhiệt độ 250C) • Hoà tan các thành phần trên, chỉnh pH sao cho môi trường sau khi pha đạt yêu cầu như trên rồi rót 2,5 ml vào các ống nghiệm. Hấp ở nhiệt độ 1210C trong 10 phút. Pha các loại dung dịch cacbonhydrat 50% (như: sacaroza, lactoza, D-cellobioza, arabinoza, D-manniton và D-mannoza) trong nước cất rồi lọc vô trùng. Thêm 0,278 0,002 ml dung dịch này vào ống nghiệm chứa 2,5 ml môi trường cơ bản. Môi trường cuối cùng có nồng độ carbohydrat là 5%. ™ Canh thang muối trypton: có giải nồng độ NaCl là: 0; 1; 3; 6; 8 và 10 % NaCl (ký hiệu lần lượt là: T1N0; T1N1; T1N3; T1N6; T1N8 và T1N10) Hoà tan 10 g trypton trong 1 lít nước cất. Sau đó, thêm lần lượt : 10, 30, 60, 80 và 100 g NaCl để được các canh thang trypton có giải nồng độ NaCl như trên. Sau đó, khuấy đều, rồi chỉnh pH sao cho môi trường sau khi hấp có pH = 7,2 (ở nhiệt độ 250C). Tiến hành rót 5 ml môi trường vào mỗi ống nghiệm. Hấp ở nhiệt độ 1210C trong 15 phút. Chú thích: các ống môi trường phải được nút chặt trong quá trình bảo quản để tránh bốc hơi nước làm thay đổi nồng độ muối. ™ Canh thang urê • urê : 20,00 g • Dinatri hydro phosphat (Na2HPO4) : 9,50 g • Dikali hydro phosphat (K2HPO4) : 9,10 g Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đông lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 62 • Cao nấm men : 0,10 g • Ðỏ phenol : 0,01 g • Nước cất : 1,00 lít pH = 6,8 0,1 (ở nhiệt độ 250C) • Hoà tan các thành phần. Không được hấp khử trùng, lọc vô trùng bằng màng lọc có đường kính lỗ là 0,45 ml. Sau đó, rót khoảng 1,5 - 3,0 ml vào các ống nghiệm hoặc đĩa petri đã được sấy vô trùng. ™ Dầu khoáng vô trùng • Rót khoảng 20 - 50 ml dầu khoáng vào bình có nắp xoáy. Hấp dầu ở nhiệt độ 121 0C trong 30 phút. ™ Dung dịch nước muối sinh lý Hoà tan 8,5 g NaCl trong 1 lít nước cất. Hấp khử trùng ở nhiệt độ 1210C trong 15 phút rồi để nguội. ™ Hugh - Leifson Glucoza • Pepton : 2,00 g • Cao nấm men : 0,50 g • Natri clorua (NaCl) : 30,00 g • Dextroza : 10,00 g • Tím bromcresol : 0,015 g • Thạch : 3,00 g • Nước cất : 1 ,00 lít pH = 7,4 (ở nhiệt độ 250C) • Ðun nóng để hoà tan hoàn toàn các thành phần trên rồi chia vào mỗi ống nghiệm khoảng 5 ml. Hấp ở nhiệt độ 1210C trong 15 phút. ™ Môi trường phân lập: thạch Thiosunfat Citrat Bile - muối Sacaroza (TCBS thạch). • Pepton: 10,00 g • Cao nấm men: 5,00 g • Natri xitrat: 10,00 g • Natri thiosunfat (Na2S2O3): 10,00 g Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đông lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 63 • Mật bò: 5,00 g • Sacaroza: 20,00 g • Natri clorua (NaCl): 10,00 g • Sắt (III) xitrat (FeC6H5O7): 1,00 g • Natri cholate: 3,00 g • Xanh bromthymol: 0,04 g • Xanh thymol: 0,04 g • Thạch: 15,00 g • Nước cất vô trùng: 1,00 lít pH = 8,6 (ở nhiệt độ 25oC). • Đun sôi để hòa tan hoàn toàn các thành phần rồi làm nguội ngay tới nhiệt độ khoảng 50oC. Rót 15 – 20 ml vào các đĩa petri vô trùng. Trước khi sử dụng phải làm khô đĩa môi trường bằng cách để qua đêm ở nhiệt độ phòng hoặc đặt đãi trong tủ ấm ở nhiệt độ khoảng 39oC – 45oC. (Không hấp khử trùng môi trường) ™ Môi trường thử decarboxylaza (Môi trường cơ bản) • Pepton : 5,00 g • Cao nấm men : 3,00 g • Glucoza : 1,00 g • Tím bromcresol : 0,02 g • Nước cất : 1,00 lít pH = 6,5 (ở nhiệt độ 250C) • Tuỳ theo loại môi trường cần pha, thêm 5 g một trong các loại axitamin: L- lysin hoặc L-arginin hoặc L-ornithin vào môi trường cơ bản trên. Sau đó, rót 5 ml môi trường vào các ống nghiệm, nới lỏng nắp. Hấp ở nhiệt độ 1210C trong 10 phút. Các ống phải được nút chặt trong khi bảo quản và sau khi cấy. ™ Nước pepton kiềm: Ancalin peptone water (APW). • Pepton: 10,00g • Natri clorua (NaCl): 10,00g • Nước cất: 1,00 lít, pH=8.5 (ở nhiệt độ 25oC) Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đông lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 64 • Hòa tan các thành phần, chỉnh pH theo yêu cầu rồi chia vào các bình chứa thích hợp. Hấp ở nhiệt độ 121oC trong 10 phút. Khi bảo quản phải vặn chặt nắp bình , để tránh bay hơi nước và pH bị thay đổi. ™ Thạch sắt ba đường: Triple Sugar Iron agar –TSI • Pepton: 15,00 g • Proteose pepton : 5,00 g • Cao thịt bò : 3,00 g • Cao nấm men : 3,00 g • Natri clorua (NaCl) : 5,00 g • Lactoza : 10,00 g • Sacaroza : 10,00 g • Glucoza : 1,00 g • Sắt (II) sunphat (FeSO4) : 0,20 g • Natri thiosunphat (Na2S2O3) : 0,30 g • Ðỏ phenol : 0,024 g • Thạch : 12,00 g • Nước cất : 1,00 lít pH = 7,4 (ở nhiệt độ 250C) • Hoà tan các thành phần, chia vào mỗi ống nghiệm khoảng 5 ml. Hấp ở nhiệt độ 1210C trong 15 phút. Trước khi môi trường đông, đặt các ống nằm nghiêng sao cho phần thạch đứng cao khoảng 2 - 3 cm và phần thạch nghiêng khoảng 4 - 5 cm. ™ Thạch sắt hai đường: Klingler Iron Agar – KIA • Polypepton pepton : 20,00 g • Natri clorua (NaCl) : 5,00 g • Lactoza : 20,00 g • Dextroza : 1,00 g • Sắt ammoni xitrat : 0,50 g • Natri thiosulphat (Na2S2O3) : 0,50 g Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đông lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 65 • Phenon đỏ : 0,025 g • Thạch : 15,00 g • Nước cất : 1,00 lit pH = 7,4 (ở nhiệt độ 250C) • Hoà tan các thành phần, chia vào mỗi ống nghiệm khoảng 5 ml. Hấp ở nhiệt độ 1210C trong 15 phút. Trước khi môi trường đông, đặt các ống nằm nghiêng sao cho phần thạch đứng cao khoảng 2 - 3 cm và phần thạch nghiêng khoảng 4 - 5 cm. ™ Thạch trypton muối 2% : TSA 2% NaCl • Trypton : 10,00 g • Natri clorua (NaCl) : 20,00 g • Thạch : 20,00 g • Nước cất : 1,00 lít pH = 7,2 0,2 (ở nhiệt độ 250C) • Ðun sôi để hoà tan các thành phần trên. Hấp ở nhiệt độ 1210C trong 15 phút. Sau đó, để nguội đến nhiệt độ khoảng 45 - 500C rồi rót ra đĩa hoặc ống nghiệm. ™ O/F Glucoza • Trypton : 2,00 g • Natri clorua (NaCl) : 5,00 g • Dikali hydro phosphat (K2HPO4) : 0,30 g • Xanh bromthymol : 0,03 g • Thạch : 2,00 g • Glucoza : 10,00 g • Nước cất : 1,00 lít pH = 6,8 (ở nhiệt độ 250C) • Ðun sôi để hoà tan các thành phần rồi rót 5 ml môi trường vào mỗi ống nghiệm. Hấp ở nhiệt độ 1210C trong 15 phút ™ Thuốc thử ONPG • Dung dịch đệm: + Natri dihydro phosphat ngậm 1 phân tử nước (NaH2PO4.H2O) : 6,90g + Nước cất : 45,00 ml Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đông lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 66 + Dung dịch hydroxit natri (NaOH) 30 % (w/v) : 3,00 ml + Hoà tan NaH2PO4.H2O trong nước cất. Thêm dung dịch NaOH 30% và chỉnh pH = 7,0 (ở nhiệt độ 250C), thêm nước cất vừa đủ 50 ml. Bảo quản dung dịch ở nhiệt độ 2 - 80C. • Dung dịch ONPG: + ONPG (o-nitrophenyl-D-galactoside ) : 80,00 mg + Nước cất ở 370C : 15,00 ml + Dung dịch đệm : 5,00 ml + Hoà tan ONPG trong nước cất ở nhiệt độ 370C. Thêm dung dịch đệm vào rồi lắc đều. Bảo quản ở nhiệt độ 2 - 80C. Trước khi sử dụng phải làm ấm dung dịch đến nhiệt độ 370C. + Chú thích: có thể sử dụng đĩa ONPG được sản xuất sẵn thay cho dung dịch ONPG. + Các đĩa 10 mg và 150 mg O/129 Vibriostat + Cắt giấy lọc thành các mảnh tròn đường kính khoảng 5 - 6 mm rồi đặt vào các đĩa petri, hấp khử trùng. + Chuẩn bị đĩa 150 mg O/129 Vibriostat: hoà tan 2,4 - diamino - 6,7 - diisopropyl - pteridin photphat (O/129) trong nước cất vô trùng theo tỷ lệ 15,0 mg/ml, nhỏ 10ml dung dịch này vào mỗi đĩa. + Chuẩn bị đĩa 10 mg O/129 Vibriostat: hoà tan 2,4 - diamino - 6,7 - diisopropyl - pteridine phosphat (O/129) trong nước cất vô trùng theo tỷ lệ 1,0mg/ml, nhỏ 10ml dung dịch này vào mỗi đĩa. Sấy khô các đĩa, bảo quản trong tủ lạnh, tránh ánh sáng. ™ Thuốc thử Oxidaza • Hoà tan 1,0 g N,N, N', N'-tetrametyl-p-phenylenediamine.2HCl vào 100 ml nước cất vô trùng. Ðựng dung dịch trong lọ sẫm màu hoặc bọc lọ trong giấy bạc. Bảo quản dung dịch ở nhiệt độ 2 - 80C, sử dụng trong vòng 7 ngày.