Khóa luận Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa

a phân tử protein như amin, carboxyl…) Enzyme –SH +Zn2+ => enzyme-S-Zn + H+ Do vậy nhóm –SH trong tâm hoạt động đã bị ester hóa bởi cơ chất, cấu trúc không gian được bảo vệ ổn định. Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa SVTH: Phan Thị Ngọc Châu 14 2.3.4.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme bromelain Giống như các loại chất sinh học khác, bromelain cũng bị ảnh hưởng bởi các yếu tố như nồng độ cơ chất, nồng độ enzyme, nhiệt độ, pH, ion kim loại, một số nhóm chức, phương pháp ly trích, phương pháp tinh sạch. ™ Ảnh hưởng của nhiệt độ Nhiệt độ của phản ứng xúc tác chịu ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố: thời gian tác động càng dài thì nhiệt độ sẽ có những thay đổi làm ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme, nồng độ enzyme, nồng độ cơ chất, dạng tồn tại của enzyme. Bromelain ở dạng tinh khiết thì nhạy với nhiệt: ở 5o C, pH = 4-10, bromelain có hoạt tính tối đa trên Casein trong 24h; ở 55oC, pH=6 trong 20 phút, hoạt tính giảm 50%. Quá trình sấy thăng hoa ( đông khô ) mất hoạt tính 27% ( Nguyễn Đức Lượng, 2004 ). ™ Ảnh hưởng của pH pH là yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của enzyme. pH thích hợp nhất đối với bromelain không ổn định mà phụ thuộc vào nhiệt độ, thời gian phản ứng, bản chất và nồng độ cơ chất, độ tinh sạch của enzyme, bản chất của dung dịch đệm, sự có mặt của chất tăng hoạt. Biên độ pH khá rộng từ 3-10 nhưng pH tối ưu thường nằm trong khoảng 5-8 tùy cơ chất: gelatin:5-6, casein: 7-8 (Nguyễn Đức Lượng, 2004). ™ Ảnh hưởng của các chất kìm hãm Chất kìm hãm là những ion, phân tử vô cơ, hữu cơ,...làm giảm hoạt mất hoạt tính của enzyme, có 2 loại chất kìm hãm: - Chất kìm hãm cạnh tranh: là những chất kìm hãm thuận nghịch enzyme, có cấu trúc tương tự như cấu trúc cơ chất, nên có khả năng cạnh tranh kìm hãm với cơ chất ở trung tâm hoạt động của enzyme. - Chất kìm hãm không cạnh tranh: làm thay đổi cấu trúc không gian của phân tử enzyme theo hướng không có lợi cho hoạt tính xúc tác của enzyme. Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa SVTH: Phan Thị Ngọc Châu 15 ™ Ảnh hưởng của các chất hoạt hóa Là những chất anion, các ion kim loại, chất hữu cơ,...có tác dụng làm tăng hoạt tính xúc tác của enzyme trong giới hạn nồng độ xác định. ™ Ảnh hưởng bởi các ion kim loại Các ion kim loại thường gắn với phân tử protein tại các trung tâm hoạt động, do đó ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của enzyme. Vì bromelain thuộc nhóm protease cystein, trung tâm hoạt động có nhóm –SH đều là hoạt chất hoạt hóa cho bromelain. Ví dụ: Thioglycolic Acid, Cystein, Sulfid, Sisulfid, Cianit… Bromelain bị ức chế bởi những ion hoặc hợp chất có ái lực mạnh hơn nhóm – SH, các tác nhân oxi hóa, halogen hóa, ankyl hóa như: Iodoacetate, bromoacetate, clo acetophenol, H2O2, methyl bromur. Các ion kim loại như: Fe, Cu, Ag, Sb, Zn có xúc tác làm ổn định cấu trúc phân tử bromelain ( Nguyễn Đức Lượng ). ™ Ảnh hưởng của trạng thái và điều kiện bảo quản Bảng 2.2. Ảnh hưởng của trạng thái và điều kiện bảo quản. Hoạt tính (UI/mg protein) Điều kiện bảo quản Dịch chiết Đông khô Nguyên liệu tươi 1600 1150 Bảo quản ở 4oC trong 5 ngày 830 630 Sấy khô ở 4oC 1880 1360 2.3.5. Ứng dụng của enzyme bromelain 2.3.5.1. Trong công nghiệp thực phẩm Chỉ cần một phần enzyme bromelain là có khả năng thuỷ phân 1000 phần thịt. Enzyme bromelain được rãi lên thịt dưới dạng bột hoặc được ngâm trong dung dịch enzyme hoặc tiêm dung dịch enzyme vào thịt để làm mềm thịt. Sử dụng trong quá trình đông tụ sữa: Thông thường để chế biến các sản phẩm từ sữa người ta dùng renin. Renin là loại enzyme được sử dụng làm đông tụ sữa truyền thống. Tuy nhiên lượng renin sản xuất chưa đáp ứng đủ yêu cầu thực tế. Gần Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa SVTH: Phan Thị Ngọc Châu 16 đây sử dụng enzyme thực vật trong chế biến sữa đang được phát triển, trong đó bromelain vỏ dứa đang được quan tâm vào mục đích này. 2.3.5.2. Trong y dược học Bromelain còn có tác dụng làm giảm di căn của bệnh ung thư, liều dùng 200 – 300 mg/kg thể trọng kết hợp với hoá trị hay xạ trị. Trong công nghiệp dược phẩm, nhiều hãng dược phẩm ở Châu Âu đã đưa bromelain vào thành phần thuốc. Ở Mỹ và Anh có thuốc Aranas do hãng W.H Roser điều chế. Chữa bệnh đau tim ( làm tan máu tụ gây đau tim ). Điều trị các bệnh nhiễm trùng ( Jayaran và ctv, 1991 ). Ngăn ngừa bệnh tiêu chảy ở heo con ( Chandler và Mynott, 1998 ). Chữa rối loạn tiêu hóa, giúp tiêu hóa chất đạm tốt, tăng khả năng đề kháng. Phối hợp với kháng sinh trong điều trị các bệnh nhiễm trùng. Điều trị bong gân, căng cơ, đau và nhức cơ. Bromelain trong dứa là hợp chất thiên nhiên có khả năng ức chế protease HIV. Nhờ tác dụng làm dễ tiêu hoá protein, bromelain được điều chế với vài chất khác để bổ sung hay điều trị sự thiếu protease tiêu hoá tự nhiên ( Nielsel và ctv, 2001 ). Thực phẩm chức năng mang tên tinh nghệ - dứa điều trị bệnh loét dạ dày, hành tá tràng, đại tràng, viêm da, bảo vệ gan, mật...Đó là thành quả nghiên cứu của các nhà khoa học tại Dự án hoạt chất sinh học Việt - Bỉ ( Viện Hóa học, Viện Khoa học - công nghệ VN ) năm 2006. Ngoài ra bromelain còn dùng để thuỷ phân gan bò làm cao gan, thuốc bổ. 2.3.6. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về enzyme bromelain 2.3.6.1. Tình hình nghiên cứu enzyme bromelain trong nước Ở nước ta co nhiều công trình công bố về việc nghiên cứu sử dụng enzyme bromelain, các công trình công bố tập trung trong các lĩnh vực tách chiết, tinh sạch và khả năng ứng dụng của enzyme này. Một số công trình nghiên cứu về enzyme bromelain như: Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa SVTH: Phan Thị Ngọc Châu 17 Lê Thị Thanh Mai ( 1997 ) nghiên cứu các phương pháp tinh sạch và ứng dụng bromelain cho thấy có thể thu nhận bromelain theo phương pháp kết tủa bằng aceton hay cô đặc theo phương pháp siêu lọc rồi kết tủa bằng aceton, cũng như có thể tinh sạch bromelain theo phương pháp lọc gel sephadex G75 với hiệu suất cao. Nghiên cứu này còn cho thấy có thể sử dụng bromelain để rút ngắn thời gian chế biến nước mắm. Dương Thị Hương Giang và Lê Thanh Hùng ( 2002 ) nghiên cứu điều kiện nhằm ổn định phương pháp tinh sạch bromelain bằng nước khóm thô cho thấy có thể thu nhận và tinh sạch enzyme bromelain bằng phương pháp sắc ký và trao đổi ion trên cột SP-Streamline với hiệu suất cao. Dương Thị Hương Giang và ctv ( 2005 ) nghiên cứu tinh sạch bromelain từ phụ phẩm vỏ dứa cho thấy có thể tinh sạch bromelain bằng phương pháp sắc ký gel mở rộng với hệ thống cột Stream line 50 và gel trao đổi ion âm SP-Streamline XL với hiệu suất cao. 2.3.6.2. Tình hình nghiên cứu enzyme bromelain ngoài nước Theo Salem và ctv (1995) đã sử dụng tỉ lệ là 0,3% enzyme so với cá gồm papain, tripsin ,ficin và bromelain thêm vào cùng với 25% muối ngay từ lúc đầu của quá trình sản xuất nước mắm trên năm loại cá (sardine, macaroni, bolti, bourri và shark ). Kết quả cho thấy với 0,3% bromelain cho hàm lượng đạm tổng số cao nhất so với các enzyme còn lại trên mẫu cá mòi ( sardine ) sau 180 ngày lên men và cao hơn so với mẫu đối chứng lên men cổ truyền là 30%. Liang và ctv (1999) nghiên cứu hoạt tính của bromelain sau khi bổ sung polyphenol trích ly từ trà xanh của Trung Quốc cho thấy tính bền nhiệt của bromelain được tăng lên. Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa SVTH: Phan Thị Ngọc Châu 18 CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Vật liệu và hóa chất 3.1.1. Nguyên liệu Vỏ quả dứa 3.1.2. Hóa chất Hóa chất để tủa: Cồn 96o, muối ammonium sulphate và aceton. Dung dịch đệm phosphate : NaH2PO4.12H2O, NaH2PO4. Hóa chất xác định hàm lượng protein: thuốc thử Bradford. Hóa chất xác định hoạt tính enzyme. Hóa chất để cố định enzyme: - Đệm phosphate 0.1 M pH 7 - CaCl2 0.02 M - Acid acetic 1% 3.1.3. Thiết bị Máy quang phổ UV-Vis Máy ly tâm. Máy xay vỏ dứa. Máy đo PH. Bể ổn nhiệt. Cân phân tích. Ống nghiệm Bình tam giác. Giấy lọc. Pipet thủy tinh: 1ml, 2ml, 5ml, 10ml. Pipet man các loại. Đầu típ các loại. Cốc thủy tinh 100ml, 250ml. Giá đựng ống nghiệm Ống đong 50ml, 100ml, 500ml Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa SVTH: Phan Thị Ngọc Châu 19 3.2. Quy trính tách chiết Enzyme Bromelain Vỏ dứa Nghiền Lọc Dịch lọc Li tâm Thu dịch Tuả Ly tâm Enzyme thô Chạy sắc ký Cồn 960 Ammonium sulfate Aceton Enzyme Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa SVTH: Phan Thị Ngọc Châu 20 3.2.1. Thuyết minh quy trình Vỏ dứa sau khi thu nhận từ các cơ sở đưa đươc về phòng thí nghiệm. Tại đây, vỏ dứa được xay hoặc nghiền nát. Sau đó, đem đi lọc thu được dịch lọc và mang dịch lọc này ly tâm 5000 vòng/phút trong 10 phút. Sau khi ly tâm loại bỏ cặn và thu lấy dịch. Sau đó, tạo tủa cho dịch này bằng cồn 960 , muối ammonium sulfate, và aceton.. Li tâm các hỗn hộp dịch trên và thu được enzyme thô , chạy sắc ký enzyme thô và thu được enzyme. 3.2.2. Khảo sát các tác nhân tủa enzyme bằng cồn 960, muối ammonium sulfate (NH4)2SO4 và aceton (CH3COCH3) 3.2.2.1 Nguyên tắc Các điều kiện thí nghiệm được tiến hành trong môi trường lạnh nhằm tránh làm mất hoạt tính enzyme và kết tủa thu được tốt hơn. Cho tác nhân tủa đã làm lạnh vào dung dịch enzyme cần tủa giữ ở nhiệt độ lạnh vào bình tam giác. Lắc đều hỗn hợp, để yên trong tủ lạnh 40 phút. Sau đó đem ly tâm lạnh, lấy cặn hòa lại trong dung dịch đệm, bảo quản lạnh. 3.2.2.2. Tủa enzyme bằng cồn 960 Cho dịch lọc là vỏ dứa tủa bằng cồn 960 đã được làm lạnh. Bảng 3.1. Tỉ lệ tủa bằng cồn 960 đối với dịch enzyme từ vỏ dứa Dịch enzyme từ vỏ (ml) 40 40 40 40 40 40 Cồn lạnh 960 (ml) 40 80 120 160 200 240 Dịch enzyme :Cồn 1:1 1:2 1:3 1:4 1:5 1:6 ¾ Cách tiến hành: Cho dung dịch enzyme vào bình tam giác. Cho từ từ lượng cồn 960 đã được làm lạnh vào bình tam giác chứa dịch enzyme. Thể tích enzyme và cồn 960 tương ứng với mỗi tỉ lệ như bảng trên. Khuấy đều. Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa SVTH: Phan Thị Ngọc Châu 21 Để tủ lạnh 40 phút ở nhiệt độ 50C. Lấy dịch đem ly tâm 5000 vòng/phút trong 20 phút, nhiệt độ 50C. Thu tủa. Hòa trong 2ml dung dịch đệm phosphate 0.1 M pH 7. Cho enzyme vào lọ nhỏ, bảo quản ở nhiệt độ 50C. 3.2.2.3. Tủa enzyme bằng muối Ammonium sulfate (NH4)2SO4 Cho dịch lọc là vỏ dứa tủa bằng muối theo các nồng độ % khác nhau. Bảng 3.2. Nồng độ tủa bằng muối (NH4)2SO4 đối với dịch enzyme từ vỏ dứa Dịch enzyme từ vỏ (ml) 40 40 40 40 40 40 40 Nồng độ muối (%) 50 55 60 65 70 75 80 ¾ Cách tiến hành: Cho dung dịch enzyme vào bình tam giác. Cho từ từ lượng muối đã cân vào bình tam giác chứa dịch enzyme. Thể tích enzyme và nồng độ muối ammonium sulfate ((NH4)2SO4) tương ứng như bảng trên. Khuấy đều. Để tủ lạnh 40 phút ở nhiệt độ 50C. Lấy dịch đem ly tâm 5000 vòng/phút trong 20 phút, nhiệt độ 50C. Thu tủa. Hòa trong 2ml dung dịch đệm phosphate 0.1 M pH 7. Cho enzyme vào lọ nhỏ, bảo quản ở nhiệt độ 50C. 3.2.2.4. Tủa enzyme bằng aceton (CH3COCH3) Cho dịch lọc vỏ dứa tủa bằng aceton đã được làm lạnh trước theo các tỷ lệ khác nhau. Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa SVTH: Phan Thị Ngọc Châu 22 Bảng 3.3. Tỉ lệ tủa bằng aceton đối với dịch enzyme từ vỏ dứa Dịch enzyme từ vỏ(ml) 40 40 40 40 40 40 Aceton lạnh (ml) 40 80 120 160 200 240 Dịch enzyme : Aceton 1:1 1:2 1:3 1:4 1:5 1:6 ™ Cách tiến hành: Cho dung dịch enzyme vào bình tam giác. Cho từ từ lượng aceton đã được làm lạnh vào bình tam giác chứa dịch enzyme. Thể tích enzyme và aceton tương ứng với mỗi tỉ lệ như bảng trên. Khuấy đều. Để tủ lạnh 40 phút ở nhiệt độ 50C. Lấy dịch đem ly tâm 5000 vòng/phút trong 20 phút, nhiệt độ 50C. Thu tủa. Hòa trong 2ml dung dịch đệm phosphate 0.1 M pH 7. Cho enzyme vào lọ nhỏ, bảo quản ở nhiệt độ 50C. 3.2.3. Phương pháp xác định hàm lượng protein và hoạt tính bromelain từ dịch chiết enzyme 3.2.3.1. Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford Bradford là một trong những phương pháp để xác định hàm lượng protein. Phương pháp này có một số ưu điểm như sau: − Dễ sử dụng (chỉ cần một loại thuốc thử). − Độ nhạy cao (có thể phát hiện protein ở 1 – 20μg). − Phức chất giữa thuốc nhuộm và protein tương đối ổn định. − Phương pháp này ít bị cản trở bởi các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu protein. ™ Nguyên tắc Phương pháp này dựa trên sự thay đổi bước sóng hấp thu cực đại và sự thay đổi màu xảy ra khi Coomasie Brilliant Blue liên kết với protein trong dung dịch acid. Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa SVTH: Phan Thị Ngọc Châu 23 Trong dung dịch manh tính acid, khi không kết nối với protein thì thuốc nhuộm có bước sóng cực đại ở 465nm. Khi kết hợp với protein thì thuốc nhuộm hấp thu bước sóng cực đại ở 595nm. Độ hấp thu ở bước sóng 595nm liên hệ trực tiếp với nồng độ protein. Dạng proton hóa của thuốc nhuộm Coomasie Brilliant Blue có màu xanh. Thuốc nhuộm liên kết chặt chẽ với các protein, tương tác với tất cả các nhóm kỵ nước và các nhóm mang điện tích dương trên phân tử protein. Trong môi trường của gốc mang điện tích dương, sự proton hóa không xảy ra và màu xanh xuất hiện. Màu sẽ xuất hiện sau 2 phút và ổn định trong gần 1 giờ. ™ Hóa chất và thiết bị ¾ Hóa chất Dung dịch mẫu protein cụ thể trong bài này là mẫu enzyme bromelain cần xác định. Dung dịch albumin chuẩn (0.1 mg/ml): cân chính xác 10mg albumin, thêm 50ml nước cất khuấy tan albumin. Cho toàn bộ dung dịch trên vào bình định mức 100 dẫn nước tới vạch → dung dịch albumin chuẩn có nồng độ 0.1 mg/ml. Giữ ở –200C. Dung dịch thuốc thử Bradford: có thành phần trong 100ml như sau: − Coomasie Brilliant Blue (CBB) 0.001g − Ethanol tuyệt đối 4.7g − Acid phosphoric 85%: 8.5g Phẩm màu CBB được làm tan trong ethanol trong một chai đựng màu tối có nắp. Bổ sung acid phosphoric và chỉnh tới 100ml bằng nước cất. Lắc đều. Bảo quản ở 40C. ¾ Thiết bị Máy đo quang phổ UV – Vis. ™ Các bước tiến hành ¾ Xây dựng đường chuẩn albumin Chuẩn bị các ống đánh số từ 0 đến 10. Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa SVTH: Phan Thị Ngọc Châu 24 Bảng 3.4. Bảng số liệu dựng đường chuẩn albumin Ống nghiệm Đối chứng 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Nồng độ albumin (μg/ml) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Dung dịch albumin (mg/ml) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 Nước cất (ml) 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 Thuốc thử Bradford (ml) 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 Lắc đều các ống nghiệm, tiến hành đo OD dung dịch trong các ống nghiệm bằng máy đo quang phổ UV-Vis. Trị số mật độ quang phổ (OD) của các ống từ 1 đến 10 sau khi trừ đi trị số ống đối chứng (ống 0) sẽ xây dựng được đồ thị biểu diễn sự biến thiên của mật độ quang phổ (∆OD) theo nồng độ protein chuẩn (μg/ml). ¾ Xác định nồng độ protein của mẫu Dịch chiết enzyme từ vỏ dứa cũng được tiến hành tương tự như trên. Thay dung dịch albumin bằng mẫu enzyme cần định lượng, mẫu được pha sao cho trị số mật độ quang đo được nằm trong khoảng của đường chuẩn. Tương tự như vậy, trị số mật độ quang của mẫu thí nghiệm cũng trừ đi trị số mật độ quang của ống đối chứng, rồi chiếu vào đường chuẩn để suy ra lượng protein có trong dung dịch mẫu thí nghiệm (μg/ml). ¾ Tính kết quả Tổng hàm lượng protein trong M ( g ) chế phẩm thô được tính theo công thức: mg protein = b*10-3*m*M Với: b: nồng độ protein trong mẫu suy ra từ đường chuẩn (μg/ml). Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa SVTH: Phan Thị Ngọc Châu 25 m: hệ số pha loãng. M: khối lượng chế phẩm enzyme thô (g). 3.2.3.2. Xác định hoạt tính enzyme theo phương pháp Amano ™ Nguyên tắc: Dùng casein làm cơ chất, xác định hoạt tính phân giải protein của enzyme protease trên cơ sở định lượng sản phẩm tạo thành trong phản ứng bằng phản ứng màu với thuốc thử Folin. Dựa vào đồ thị chuẩn để tính lượng Tyrosin tương ứng với lượng sản phẩm thủy phân dưới tác dụng của enzyme. Hoạt động của enzyme được biểu diễn bằng đơn vị hoạt tính thủy phân protein của enzyme. ™ Hoá chất và thiết bị ¾ Hóa chất: HCl 0.1 M Na2CO3 0.4 M Dung dịch TCA 0.4 M Tyrosin tinh khiết Thuốc thử Folin Đệm phosphate pH 7 0.1 M Dung dịch casein 1% : Cân 1g casein thêm vào 100ml dung dịch đệm phosphate 0.1 M pH 7 ¾ Thiết bị và dụng cụ: Ống nghiệm Pipette Bình định mức Giấy lọc Bể ổn nhiệt Máy đo quang phổ UV – Vis Máy đo pH ™ Các bước tiến hành ¾ Xây dựng đường chuẩn Tyrosin Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa SVTH: Phan Thị Ngọc Châu 26 Bảng 3.5 . Bảng số liệu dựng đường chuẩn Tyrosin Ống nghiệm Đối chứng 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Nồng độ (μg/ml) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Dung dịch Tyrosin chuẩn (μl) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Dung dịch HCl (μl) 1000 99 0 980 97 0 96 0 95 0 94 0 93 0 920 910 900 Na2CO3 (ml) 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 Thuốc thử Folin (ml) 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 Pha dung dịch Tyrosin ở các nồng độ khác nhau : 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 μgTyrosin/ml như bảng. Thêm 5ml dung dịch Na2CO3 0.4 M vào dung dịch Tyrosin ở các nồng độ khác nhau ở trên và thêm 1ml thuốc thử Folin vào dung dịch hỗn hợp. Sau khi trôn đều, để yên dung dịch ở 370C trong 20 phút . Đo độ hấp thụ của dung dịch này ờ bước sóng 660nm. Ghi nhận kết quả As10, As20, As30, As40, As50, As60, As70, As80, As90, As100 . Đối với ống đối chứng: dùng 1ml acid HCl 0.1 M thay cho Tyrosin. Đo độ hấp thu của dung dịch này ở bước sóng 660nm, ghi nhận kết quả là Aso . Trị số mật độ quang của các ống từ 1 – 10 sau khi trừ đi trị số của ống đối chứng sẽ được giá trị ∆OD1 - ∆OD10 . Vẽ đồ thị dựa vào biến thiên ∆OD theo nồng độ protease. Đồ thị này gọi là đường chuẩn Tyrosin. ¾ Xác định hoạt tính enzyme bromelain Cho 1ml dung dịch casein 1% vào ống nghiệm, ủ ở 370 C trong 10 – 15 phút Sau đó, cho 1ml dịch chiết enzyme vào lắc đều. Đem ủ hỗn hợp này ở 370 C trong 60 phút. Cho vào 2ml dung dịch TCA 0.4 M để ngừng phản ứng enzyme. Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa SVTH: Phan Thị Ngọc Châu 27 Để yên dung dịch trong 25 phút, sau đó lọc dung dịch này qua giấy lọc để loại tủa. Sau đó cho 5ml dung dich Na2CO3 vào 1ml dịch lọc. Thêm 1ml thuốc thử Folin. Trộn đều để yên trong 20 phút. Sau đó đem đo độ hấp thụ ở bước sóng 660nm ( ghi nhận kết quả này là Am) Mẫu đối chứng: lấy 1ml nước cất thay cho 1ml dung dịch enzyme và tiến hành các bước tương tự như với mẫu thì nghiệm với cùng điều kiện.Ghi nhận kết quả này là A0 Hàm lượng Tyrosin được giải phóng do protease thủy phân được tính bằng cách lấy (Am – A0) rồi lấy kết quả so với đường chuẩn Tyrosin để xác định hoạt độ protease. Một đơn vị hoạt tính ( ĐVHT ) enzyme protease được xác định là lượng enzyme để tạo ra lượng amino acid tương đương với 100 μg Tyrosin trong 1 μl dịch lọc dưới điều kiện thí nghiệm. Hoạt tính enzyme Bromelain ( ĐVHT/ml ) 100 n*F*) A- (A 0m= Hoạt tính enzyme Bromelain ( ĐVHT/mg ) M*100 V*n*F*) A- (A 0m= Trong đó: F: lượng Tyrosin có trong đường chuẩn(μg). n: hệ số pha loãng của enzyme. M: khối lượng chế phẩm enzyme thô. 1/100: hệ số chuyển pha. A0 : Độ hấp thụ của ống đối chứng. Am : Độ hấp thụ của mẫu. ¾ Tính hoạt tính riêng ( HTR ) của enzyme bromelain Từ kết quả hàm lượng protein và hoạt tính enzyme bromelain tính hoạt tính riêng enzyme bromelain. HTR = Số đơn vị hoạt tính/ mg protein enzyme (ml/mg) Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa SVTH: Phan Thị Ngọc Châu 28 3.3. Enzyme cố định 3.3.1. Định nghĩa enzyme cố định Enzyme cố định ( hay enzyme không tan) là enzyme có sự tham gia hoặt động trong một không gian bị giới hạn. Sự giới hạn hoạt động vốn linh hoặt của enzyme bằng cách gắn nó vào một pha cách ly tách rời khởi pha lỏng tự do và ở đó nó vẫn có khả năng tiếp xúc được với các phần tử cơ chất, effector hay inhibutor ( chất ức chế ). Pha gắn enzyme thường không tan trong nước nhưng cũng có thể là các polyme ưa nước. Enzyme không tan được nghiên cứu và ứng dựng từ những năm 1950. Để chế tạo enzyme cố định có thể dùng phương pháp hấp phụ, liên kết hóa trị để gắn kết enzyme. Chất dùng để gắn kết enzyme gọi là chất mang ( enzyme ), hiện nay người ta thường dùng xenluloza, tinh bột, rephadex, agaroza, alghinat canxi, gel polyacylamit, bột thủy tinh, nylon,…Chế phẩm enzyme không tan có thể ở dạng bột, hạt, phiến, màng mỏng. Trong một số trường hợp không cần thiết phải gắn enzyme vào chất mang mà có thể giữ nó ở bên trong mạng lưới polymer bao quanh lấy phân tử enzyme. Mạng lưới đó có mặt nhờ không cho phép enzyme thoát ra khỏi mạng nhưng vẫn lớn để cơ chất và sản phẩm tạo ra qua lại dễ dàng. Theo thống kê, đầu năm 1995 người ta đã chế tạo được trên 100 chế phẩm enzyme cố định. Lợi ích của việc sử dụng enzyme cố định. Giảm giá thành do enzyme được sử dụng lặp lại nhiều lần với cùng một kiểu phản ứng xúc tác, chế phẩm bền hơn trong điều kiện pH, nhiệt độ áp suất thẩm thấu tối uư, tốc độ phản ứng lớn, dễ tổ chức sản suất ở mức đô tự động hóa cao. Chế tạo enzyme tương đối dễ, đầu tư xây dựng và sản xuất tương đối ít, sản phẩm phản ứng không lẫn lộn với enzyme( chỉ một số ít bị rửa trôi theo dòng chảy của tác nhân), có thể dễ dàng tổ chức sản xuất các sản phẩm lên men bằng enzyme ngoại bào như: rượu etylic, axit hữu cơ, axit amin, vitamin. Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa SVTH: Phan Thị Ngọc Châu 29 3.3.2. Tính chất ưu và nhược điểm của enzyme cố định 3.2.2.1. Ưu điểm Enzyme cố định ngày càng sử dụng rộng rãi là nhờ vào những đặc điểm nổi bật: − Có thể tái sử dụng lặp đi lặp lại nhiều lần một lượng enzyme xác định trong một thời gian dài. Do đó làm giảm giá thành sản phẩm, hiệu quả kinh tế cao, tiết kiệm enzyme, đặc biệt quan trọng đối với những enzyme đắt tiền. Thuận lợi trong các quá trình tự động hoá và liên tục. − Tăng độ tinh sạch của sản phẩm vì enzyme được cố định ở những pha riêng rẽ, dễ dàng tách ra khỏi sản phẩm. Do đó tránh được những ảnh hưởng không tốt đến sản phẩm. Điều này có ý nghĩa đặc biệt quan trọng khi sử dụng enzyme cố định trong sản xuất dược phẩm, trong công nghiệp sản xuất hoá chất tinh khiết và trong phân tích. − Có thể dừng phản ứng ở bất cứ giai đoạn nào khi cần thiết, chỉ cần tách enzyme cố định ra khỏi cơ chất. − Kéo dài thời gian bảo quản và bền vững với chất kiềm hãm cũng như các tác nhân gây biến tính so với enzyme hoà tan. − Hoạt tính ổn định hơn so với enzyme tự do khi có những thay đổi của môi trường như: pH, nhiệt độ,…nhờ các liên kết của enzyme với chất mang như liên kết cộng hoá trị, liên kết hydro, liên kết ion, và các liên kết khác. 3.3.2.2. Nhược điểm Bên cạnh đó enzyme cố định cũng có những nhược điểm nhất định: - Hạn chế khả năng tiếp xúc giữa cơ chất với enzyme cho nên hoạt tính riêng của enzyme thường thấp hơn so với enzyme tự do. - Một lượng enzyme đáng kể bị mất hoạt tính khi cố định bằng phương pháp cộng hoá trị là do chất hoạt hoá và do phản ứng gắn kết không đặc hiệu của các liên kết trên vật liệu cố định vào trung tâm hoạt động của enzyme. Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa SVTH: Phan Thị Ngọc Châu 30 3.3.3. Một số phương pháp cố định enzyme Để có thể thu được chế phẩm enzyme cố định có hoạt tính cao và ổn định thì việc lựa chọn vật liệu cố định cũng như phương pháp cố định là hết sức quan trọng. Dựa vào liên kết giữa chất mang và enzyme, người ta chia làm hai phương pháp cố định: phương pháp vật lí ( liên kết vật lí ) và phương pháp hoá học ( liên kết đồng hoá trị ). Theo Scouten và Gerhartz có bốn phương pháp cố định enzyme là: − Phương pháp liên kết enzyme với vật liệu cố định ( carrier binding ). − Phương pháp hấp thụ vật lí ( physical adsorption ). − Phương pháp nhốt ( entrapment ). − Phương pháp khâu mạch ( cross – linking ). 3.3.3.1. Phương pháp liên kết enzyme với vật liệu cố định ( carrier binding ) Nguyên tắc của phương pháp này là enzyme được nối với chất mang thông qua cầu nối. Cầu nối phải có kích thước không lớn và có hai đầu, một đầu gắn chất mang còn đầu kia gắn với enzyme, đảm bảo liên kết vững chắc của enzyme với chất mang. Phương pháp này thì enzyme không bị rửa trôi khỏi chất mang trong quá trình sử dụng, do liên kết chặt chẽ với vật liệu cố định bằng liên kết cộng hoá trị nên tăng khả năng ổn định với sự thay đổi nhiệt độ. Nhưng do liên kết chặt chẽ enzyme với chất mang, nên cản trở hoạt động của phân tử enzyme, làm giảm khả năng tiếp xúc giữa enzyme với cơ chất, kết quả làm giảm hoạt tính của enzyme cố định. Vật liệu cố định thường không tái sử dụng được, vì vậy phương pháp này chỉ thích hợp với những enzyme đắt tiền và ổn định hoạt tính khi cố định. 3.3.3.2. Phương pháp hấp thụ vật lí ( physical adsorption ) Phương pháp này khá đơn giản, được sử dụng sớm nhất và được ứng dụng rộng rãi để cố định enzyme. Quá trình cố định là trộn lẫn dung dịch enzyme với vật liệu cố định rồi ủ một thời gian cho phép rồi lọc, rửa phần enzyme không hấp thụ. Enzyme được cố định trên chất mang nhờ các liên kết yếu như: liên kết ion, liên kết Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa SVTH: Phan Thị Ngọc Châu 31 hydro, liên kết VanderWall. Nhược điểm của liên kết này chính là quá trình hấp phụ enzyme có thể xảy ra do sự thay đổi pH, nhiệt độ thành phần ion. - Các chất mang hữu cơ dùng cho hấp phụ vật lý: dẫn xuất polymer tự nhiên, DEAE – xenluloza, DEAF- sephadex. Đây là các muối amonit ( mang điện ( - )). - Chất sắc ký xotein - kỵ nước như: agaroza cải biến có gắn các nhóm mang điện ở đầu chuỗi cacbonhydrat của nó ( hai loại lực hấp phụ là lực tĩnh điện và lực kỵ nước gắn kết không thuận nghịch với nhiều enzyme ) - Các chất mang vô cơ: kim loại kiềm thô, Al2O3, TiO2 như: thủy tinh xốp, silicagel, silochrom. Ưu điểm của loại chất này là đô xốp lớn, tính hấp phụ cao, chế tạo ở dạng hạt để tạo reactor cột. Trong phương pháp hấp thụ vật lí thì hoạt tính enzyme cố định thường cao, từ 50 – 100 %. Tuy nhiên, hoạt tính không ổn định lâu dài, enzyme dễ bị hấp thụ do sự thay đổi pH, nhiệt độ, nồng độ enzyme và các thành phần ion. 3.3.3.3. Phương pháp nhốt ( entrapment ) ™ Nhốt trong cấu trúc mạng gel ( entrapment in gel ) Đây là phương pháp khá đơn giản, enzyme ít bị biến đổi qua quá trình cố định. Để gói enzyme vào trong khuôn gel người ta tiến hành trùng hợp hoá các gel khi có mặt đồng thời của enzyme. Sau khi hoàn thành quá trình trùng hợp ta thu được enzyme bị giữ chắc trong gel. Gel đã có enzyme có thể nghiền nhỏ bằng cách đồng hoá hoặc ép qua rây có lỗ nhỏ rồi đem sấy khô ở nhiệt độ thấp. Dẫn xuất enzyme loại này lần đầu tiên do Bernfeld (1933) thu được bằng cách trùng hợp acrylamide với N, N-metylenbisacrylamide. Phương pháp này thường dùng gần đây do chất trùng hợp dễ tạo thành hạt và tuỳ vào điều kiện tiến hành mà gel có độ xốp khác nhau. Alginate và Caraghehan lấy từ rong biển thường có khả năng tạo gel tốt, thuận lợi để gói enzyme và tế bào. Canxialginate là một trong những vật liệu thích hợp cho phương pháp nhốt enzyme. Hỗn hợp enzyme và alginate được nhỏ xuống dung dịch CaCl2 để tạo hạt. Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa SVTH: Phan Thị Ngọc Châu 32 ™ Nhốt enzyme trong các lỗ nhỏ của các sợi tổng hợp Với cách này người ta cho dịch lỏng chảy bên trong sợi, do đó hạn chế được sự phân cực bề mặt và sự bịt lấp thường gặp với các màng. Một nhũ tương của cellulose triacetate trong methylene chlorua và enzyme trong dung dịch đệm có chứa glycerol được ép qua một khuôn lọc dưới áp suất nitơ. Các sợi đi ra khỏi khuôn được nhúng vào một cái bể đông tụ có chứa toluel, sau đó được làm khô trong chân không. Các dợi này bền với acid yếu hoặc kiềm yếu, lực ion cao và chịu được một số dung môi hữu cơ. Tuy nhiên phương pháp nay chỉ thích hợp với những enzyme khó bị mất hoạt tính trong các dung môi không hòa lẫn với nước. ™ Gói enzyme trong bao vi thể ( microcapsul ) Enzyme được gói trong bao vi thể có màng bán thấm, màng này được tạo ra từ các polymer có kích thước lỗ đủ nhỏ để ngăn cản sự khuếch tán ra ngoài. Vì enzyme hoạt động trong môi trường dung dịch nên khả năng tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất lớn hơn, vì vậy mà hoạt tính enzyme cao hơn so với nhốt trong cấu trúc mạng gel. ™ Dạng màng siêu lọc Phương pháp này đơn giản, tương tự như nhốt torng bao vi thể. Enzyme được giữ trong màng siêu lọc. Màng bán thấm này cho phép các cơ chất và sản phẩm có trọng lượng phân tử thấp qua lại tự do nhưng giữ lại enzyme có trọng lượng phân tử cao. 3.3.3.4. Phương pháp khâu mạch ( cross – linking ) Những chất có hai hoặc đa nhóm chức năng như: diisocyanate, glutaraldehyde, hexamethylen diisocyanate được dùng làm cầu nối khâu mạch các phân tử enzyme. Những enzyme được khâu mạch tạo thành mạng lưới không tan trong nước. Theo phương pháp này thì hoạt tính của enzyme cố định thường thấp, do các hợp chất khâu mạch có thể liên kết không đặc hiệu vào trung tâm hoạt động của enzyme và enzyme bị liên kết tạo thành một khối kém linh động. Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa SVTH: Phan Thị Ngọc Châu 33 3.3.4. Cố định enzyme bromelain trên cơ chất Natrialginate bằng phương pháp nhốt 3.3.4.1. Đặc điểm, tính chất của Natrialginate Là chuỗi polymer mạch thẳng không phân nhánh, là dẫn xuất của alginic kết hợp với cation của kim loại Na2+, cấu trúc của alginate gồm hai acid hợp thành: acid α-L-guluronic (gọi tắt là G) và acid β-D-manuronic (gọi tắt là M) qua liên kết 1-4 glycosit. Natrialginate có nguồn gốc từ một loại tảo nâu. Natrialginate có các tính chất sau: - Khả năng tạo độ nhớt. - Khả năng tạo gel. - Khả năng tạo màng. 3.3.4.2. Tạo dung dịch Natrialginate 3% Cân 1.5g Natrialginate hòa tan trong 50ml dung dịch đệm phosphate 0.1 M pH=7. Khuấy đều đến khi tất cả Natrialginate hòa tan hoàn toàn là được. 3.3.4.3. Tiến hành cố định Cân 1,5g enzyme bromelain hòa tan trong dung dịch Natrialginate 3%. Dùng ống Xilanh có đầu kim tiêm (0,3mm), hút dung dịch enzyme hòa tan này, nhỏ từ độ cao 20cm vào trong 200ml dung dịch 0.02 M CaCl2 cùng với sự khuấy lien tục dung dịch này với máy khuấy từ để tạo gel. Quá trình tạo gel xảy ra trong 2h, ở nhiệt độ phòng. Sau khi cố định, dung giấy lọc, lọc enzyme đã được cố định. Kết quả thu được hạt enzyme bromelain được nhốt trong khuôn gel. Dịch lọc thu được đem đi xác định hàm lượng protein theo phương pháp Bradford. 3.3.4.4. Phương pháp xác định hiệu suất cố định protein và hiệu suất cố định hoạt tính của enzyme cố định ™ Phương pháp xác định hiệu suất cố định protein của enzyme cố định Hiệu suất cố định protein được xác định theo công thức sau: 00 ff00 VC 100*)VCV(CH −= Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa SVTH: Phan Thị Ngọc Châu 34 Trong đó: C0: Nồng độ protein ban đầu (µg/ml). V0: Thể tích ban đầu của dung dịch enzyme (ml). Cf: Nồng độ protein trong tổng phần nước lọc (µg/ml). Vf: Tổng thể tích của phần nước lọc (ml). H: Hiệu suất cố định protein (%). ™ Phương pháp xác định hiệu suất cố định hoạt tính của enzyme cố định Hiệu suất cố định hoạt tính enzyme được xác định theo công thức sau: η 00 ff00 VE 100*)VEV(E −= Trong đó: E0: Hoạt tính enzyme trước khi cố định (U/ml). V0: Thể tích dùng để cố định (ml). Cf: Hoạt tính enzyme sau khi cố định (U/ml). Vf: Thể tích enzyme còn lại sau khi cố định (ml). η: Hiệu suất cố định hoạt tính (%). 3.3.5. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố lý hóa đến hoạt tính của enzyme bromelain được cố định trên Natrialginate 3.3.5.1. Khảo sát ảnh hưởng của pH Khảo sát hoạt tính bromelain ở các giá trị pH : 6, 7, 8, 9, 10 trong cùng điều kiện nhiệt độ 370 bằng phương pháp Amano Tuy nhiên, thay vì 1 ml dung dịch enzyme thì ở thí nghiệm này là 1 g enzyme cố định. Tính kết quả và vẽ đổ thị biểu diễn để tìm giá trị pH nào cho hoạt động của bromelain mạnh nhất thì đó là pH tối ưu cho hoạt động của enzyme cố định. 3.3.5.2. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ Khảo sát hoạt tính bromelain ở các giá trị nhiệt độ : 30, 40, 50, 60, 70, 80 trong cùng điều kiện pH bằng phương pháp Amano . Tuy nhiên, thay vì 1 ml dung dịch enzyme thì ở thí nghiệm này là 1 g enzyme cố định. Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa SVTH: Phan Thị Ngọc Châu 35 Tính kết quả và vẽ đồ thị biễu diễn để tìm giá trị nhiệt độ nào cho hoạt động của bromelain mạnh nhất thì đó là nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của enzyme cố định. 3.3.5.3. Khảo sát độ bền nhiệt Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính của enzyme bromelain bằng phương pháp Amano bằng cách giữ nguyên các hàm lượng cơ chất, pH=7. Thay cho 1 ml dung dịch enzyme thì ở thí nghiệm này là 1 g enzyme cố định. Tuy nhiên ủ enzyme và casein ở cùng nhiệt độ 370C trong các khoảng thời gian 60 phút, 80 phút, 100 phút, 120 phút, 140 phút, 160 phút, 180 phút. Các bước tiếp theo tiến hành tương tự. Tính kết quả và vẽ đồ thị biễu diễn để xem ảnh hưởng của thời gian lên hoạt động phân giải của enzyme bromelain cố định trên Natrialginate. 3.3.5.4. Khảo sát số lần tái sử dụng bromelain cố định trên Natrialginate Sau khi xác định được nhiệt độ và pH tối ưu, ta tiến hành khảo sát số lần tái sử dụng bromelain cố định trên Natrialginate thông qua việc xác định hoạt tính bromelain cố định bằng phương pháp Amano. Kết thúc thí nghiệm xác định hoạt tính lần 1, rửa lại bằng nước cất và thu lại hạt enzyme cố định. Lặp lại thí nghiệm cho đến khi hoạt tính của enzyme cố định giảm xuống dưới 50% so với hoạt tính của bromelain cố định lần 1. 3.3.6. Tinh sạch enzyme bromelain bằng sắc ký lọc gel Hình 3.1. Thiết bị lọc gel áp suất thấp ( Bio – Rad ) Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa SVTH: Phan Thị Ngọc Châu 36 3.3.6.1. Nguyên tắc Kỹ thuật sắc ký lọc gel dùng để tách những phân tử có kích thước, trọng lượng phân tử khác nhau bằng cách cho chúng đi qua cột gel. Những phân tử có kích thước đủ nhỏ để lọt vào bên trong lỗ gel sẽ bị trì hoãn và di chuyển chậm qua cột, trong khi những phân tử lớn hơn di chuyển bên ngoài các hạt gel nên sẽ di chuyển nhanh và được giải hấp ( thôi ) ra khỏi cột sớm hơn các phân tử nhỏ. 3.3.6.2. Thiết bị và hóa chất. ™ Thiết bị và dụng cụ: Phễu đổ gel. Bình hút chân không. Cột sắc ký Bio-Rad, kích thước 30 x 1.5 cm; thể tích: 53 ml (thể tích = chiều cao cột x (đường kính/2)2 x 3.14 (π) = 30 x (1.5/2)2 x 3.14). Bình đựng dung dich đệm. Ống nghiệm 50 cái. Vòi hút chân không để khử bọt khí cho các dung dịch. ™ Hóa chất Gel “ Bio- Gel P-100 ”, có các đặc tính: dạng hạt mịn, kích thước hạt 45-90 µm; khả năng ngậm nước: 12 ml/1 g gel khô; phạm vi phân tách: 5.000-100.000 daltons. Đệm phosphate 0.1 M pH 7: khử bọt trước khi dùng. 3.3.6.3. Các bước tiến hành ™ Chuẩn bị gel Cân 5g gel“ Bio- Gel P-100 ” khô. Cho bột gel từ từ vào dung dịch đệm phosphate 0.1 M pH 7 đựng trong cốc. Dùng dung dịch đệm phosphate 0.1 M pH 7 nhiều gấp hai lần so với thể tích lớp nền gel cần cho trong cột. Cụ thể dùng ít nhất 53 x 2 = 106 ml dung dịch đệm. Đối với gel từ Bio-Gel P-30 đến Bio-Gel P-100 cần 12 giờ để ở nhiệt độ 200C để hydrate hóa hoặc 4 giờ nếu bắt đầu ở 1000C. Sau khi thể huyền phù đồng nhất Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa SVTH: Phan Thị Ngọc Châu 37 của các hạt gel hình thành, không cần phải khuấy, hãy để ổn định trong suốt quá trình hydrate hóa. Sau khi quá trình hydrate hóa xảy ra hoàn toàn, gạn lớp nổi trên bề mặt. Chuyển dung dịch vào một bình hút chân không có gắn với vòi hút chân không. Khử khí của dung dịch trong khoảng từ 5 đến 10 phút, thỉnh thoảng lắc nhẹ (xoay) bình. Không dùng đũa khuấy vì nó có thể làm hư gel. Thêm dung dịch đệm để khử khí với thể tích gấp hai lần thể tích lớp nền (106 ml) và lắc nhẹ. Để gel ổn định cho đến khi 90 – 95 % số hạt ổn định. Gạn hoặc loại lớp nổi trên bề mặt bằng cách hút để loại các hạt nổi trên mặt. Gắn phễu đổ gel vào cột, đóng lỗ thoát của cột và cho dung dịch đệm làm đầy 20 % thể tích cột. Rót đều dung dich gel vào cột thành một dòng di chuyển nhẹ. Tránh làm bắn gel, đảm bảo việc nhồi cột đều và tránh bị bọt khí. Khi lớp nền đã hình thành trong cột từ 2 – 5 cm, mở khóa đầu ra của cột cho đến khi cột được nạp đầy gel (packed). Khi cột đã được nạp đầy gel, mở khóa đầu ra của cột (outlet) và gắn flow adaptor. Mở khóa đầu ra của cột, cho dung dịch đệm với thể tích gấp hai lần thể tích lớp nền chảy qua cột lúc đều khiển tốc độ chảy. Đóng đầu ra của cột, điều chỉnh flow adaptor xuống đến lớp nền gel. Nạp mẫu vào trên bề mặt lớp nền bằng cách bơm hoặc tiêm mẫu vào trên lớp nền gel qua flow adaptor. ™ Chuẩn bị mẫu Mẫu chạy sắc ký gồm ba mẫu dịch enzyme bromelain từ vỏ ( sau khi tủa cồn 960, muối Ammonium sulfate và aceton hòa tan với đệm phosphate 0.1 M pH 7 ) với tỉ lệ và nồng độ tối ưu được chạy sắc ký lọc gel. Mẫu chạy sắc ký phải sạch ( không bị nhiễm bẩn và không có hạt rắn ), hòa tan hoàn toàn trong dung dịch đệm. Lọc mẫu qua milipore ( màng lọc 0.45 micrometre ) sẽ làm tăng độ bền và thời gian sử dụng của cột. Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa SVTH: Phan Thị Ngọc Châu 38 Đối với mẫu là dịch tủa với muối (NH4)2SO4 ta cần loại muối trước khi chạy sắc ký bằng phương pháp sắc ký loại muối. Hình 3.2. Loại muối trước khi chạy sắc ký ™ Thu và xác định mẫu tách được Dịch ra khỏi cột được đo độ hấp thụ ở bước sóng 280 nm bằng detector trong hệ sắc ký và thể hiện độ hấp thu ở dạng sắc ký đồ bằng phần mềm LP Data View trên máy tính. Dịch được thu tự động bằng máy thu mẫu (collector), mỗi phân đoạn 2 ml. Dựa trên sắc ký đồ, tiến hành gom các phân đoạn thuộc cùng một peak. Các peak đem đi phân tích hàm lượng protein theo phương pháp Bradford và hoạt tính protease theo phương pháp Amano sau tinh sạch. 3.3.6.4. Tính hiệu suất về hoạt tính enzyme bromelain và độ tinh sạch của enzyme sau tinh sạch bằng sắc ký lọc gel Hiệu suất về hoạt tính enzyme ΗΤ1 ΗΤ2= x 100% Trong đó: HT1: Hoạt tính enzyme Bromelain trước tinh sạch (U/g). HT2: Hoạt tính enzyme Bromelain sau tinh sạch (U/g). HTR của enzyme bromelain sau tinh sạch autinhsachHLproteins HTenzyme2= Độ tinh sạch của enzyme 1enzymeHTR 2enzymeΗΤR= Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa SVTH: Phan Thị Ngọc Châu 39 Trong đó: HTR enzyme 1: Hoạt tính riêng enzyme trước tinh sạch (U/mg). HTR enzyme 2: Hoạt tính riêng enzyme sau tinh sạch (U/mg). 3.3.7. Xác định trọng lượng phân tử enzyme bromelain bằng phương pháp điện di trên gel polyacrylamid (SDS – PAGE) 3.3.7.1. Nguyên tắc SDS – PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate-polyacrylamide Gel Electrophoresis) là một kỹ thuật điện di trên gel polyacrylamide khi có sự hiện diện của SDS, đây là một tác nhân làm biến tính và âm tính hóa các phân tử protein. Trong kỹ thuật này protein được xử lý với chất tẩy SDS và tác nhân khử cầu nối disulfite là mercaptoethanol hoặc dithiotheitol ( DTT ). Với các tác nhân này protein từ cấu trúc bậc 2,3,4 được biến đổi thành chuỗi polypeptide ( bậc 1) và tất cả các protein đều được tích điện âm. Nhờ đó, sự di chuyển trong gel của các phân tử protein chỉ phụ thuộc vào kích thước, những phân tử có kích thước lớn sẽ di chuyển chậm hơn những phân tử có kích thước nhỏ khi đi qua một lỗ gel có kích thước nhất định. Dưới tác dụng của điện trường các phân tử tích điện âm sẽ di chuyển về cực âm của điện trường. Để xác định phân tử lượng của một protein, người ta thường so sánh với một thang phân tử lượng chuẩn, là một hỗn hợp các protein có trọng lượng phân tử khác nhau đã biết. 3.3.7.2. Thiết bị và hóa chất ™ Thiết bị và dụng cụ: Bộ điện di đứng (vertical electrophoresis). Bộ nguồn chạy điện di (electrophoresis power supply) Bio-Rad. Pipetteman các loại: 1000 µl, 200 µl, 10 µl. Đầu típ các loại. Giấy lọc. Găng tay. Phao để eppendorf. Eppendorf. Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa SVTH: Phan Thị Ngọc Châu 40 pH kế. ™ Hóa chất: N, N, N’, N’- tetramethylennediamide (C6H16N2-TEMED) Dung dịch Acrylamide /Bisacryamide 40 % (29:1) (3.3 % C). β – Mercaptoethanol (HSCH2CH2OH) Thang protein chuẩn SDS-PAGE (Bio-Rad), gồm các protein chuẩn có kích thước xác định sau: − Phosphoriylase b 97.400 daltons. − Bonvine serum albumin 66.200 daltons. − Ovalbumin 45.000 daltons. − Carbonic anhydrase 31.000 daltons. − Soybean trypsin inhibitor 21.500 daltons. − Lysozyme 14.400 daltons. Sodium Dodecyl Sulfate (SDS). Ammoniumpersulfate [(NH4)2S2O8] [APS]. Coomasie brilliant blue G-250 dạng viên (Bio-Rad). Cồn tuyệt đối (99.50). Methanol (CH3OH). Tris (hydroxymethyl) aminomethane. Acid acetic. Bromophenol blue. Glycerol (C3H8O3). Glycine (C2H5O2N). Acid clohydric (HCl). Sodium dodecyl sulfate (SDS) 10 %: cân 10g SDS, cho 100 ml nước cất vào khuấy đều cho đến khi tan hết. Dung dịch đệm gel phân tách (separating gel buffer) Tris-Cl 1.5M, pH 8.8 - 0.4% SDS: cân 36.3 g Tris pha trong 100 ml nước cất, thêm dần HCl 6N và khuấy Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa SVTH: Phan Thị Ngọc Châu 41 đều dung dịch trên cho tới khi pH kế chỉ 8.8. Hút 8 ml dung dịch SDS 10% cho vào. Thêm nước cất cho đủ 200 ml, lắc đều giữ ở 40C. Dung dịch đệm gel gom ( stacking gel buffer ) Tris-Cl 0.5M, pH 6.8 - 0.4% SDS: cân 6.05 g Tris pha trong 100 ml nước cất, thêm dần HCl 6N và khuấy đều dung dịch trên cho tới khi pH kế chỉ 6.8. Hút 4 ml dung dịch SDS 10% cho vào. Thêm nước cất cho đủ 100 ml, lắc đều giữ ở 40C. Ammoniumpersulfate 10 % ( chỉ pha trước khi dùng ): cân 0.1 g cho vào một eppendorf 1000 µl, thêm 1 ml nước cất, lắc đều, để ở nhiệt độ phòng. Dung dịch đệm điện di Tris – G lycine pH 8.3: pha dung dịch mẹ 10X chứa 30 g Tris, 144 g Glycine, 10 g SDS hoà tan trong 1000 ml nước cất. Dung dịch nạp mẫu 2X ( 2X treatment buffer ) có thành phần như sau: 2.5 ml dung dịch đệm Tris-Cl 0.5M, pH 6.8; 4ml 10% SDS; 2ml Glycerol; 2mg Bromophenol Blue; 0.2 ml mercaptoethanol; thêm nước đủ 10 ml. Dung dịch nhuộm gel: chuẩn bị 250ml dung dịch nhuộm gel chứa: 0.625 g Comasie Blue G 250, 112.5 ml ethanol tuyệt đối, 112.5 ml nước cất và 25 ml acid acetic, lắc đều, giữ trong chai màu tối. Dung dịch giải nhuộm: 30 ml methanol, 10 ml acid acetic, 60 ml nước cất. 3.3.7.3. Phương pháp ™ Đổ gel ¾ Gel phân tách (Separating gel) Cho các thành phần sau theo thứ tự vào becher 50 ml sạch: 40% Acrylamide/Bis (29:1) 2.5 ml. Tris – HCl 1.5 M pH 8.8 - 0.4 % SDS 2.5 ml. Nước cất 4.445 ml. TEMED 5 µl. Ammoniumpersulfate 10% 50 µl. Tổng thể tích 10 µl. Sau khi cho Ammoniumpersulfate 10 % vào, lắc nhẹ ống Falcon vài lần (tránh tạo bọt khí), dùng pipetteman bơm dung dịch gel vào khuôn, đổ gel sao cho mức Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa SVTH: Phan Thị Ngọc Châu 42 dung dịch gel cao hơn 7 cm (tránh tạo bọt khí trong khuôn gel). Sau đó nhẹ nhàng đặt một lớp nước cất lên trên lớp mặt gel để mặt gel được phẳng. Chờ gel đông (khoảng 20 – 30 phút). ¾ Gel gom (Stacking gel) Cho các thảnh phần sau theo thứ tự vào becher 50 ml sạch khác: 40% Acrylamide/0.8% Bis 0.5 ml. Tris – HCl 0.5 M pH 6.8 - 0.4 % SDS 1 ml. Nước cất 2.476 ml. TEMED 4 µl. Ammoniumpersulfate 10% 20 µl. Tổng thể tích 4 ml. Sau khi gel phân tách đã trùng ngưng hoàn toàn, đỗ hết nước bên trên. Tiến hành đỗ lớp gel gom bằng cách dùng pipetteman bơm dung dịch gel gom vào khuôn. Đồng thời đưa lược vào khuôn để tạo các giếng mẫu (tránh tạo bọt khí trong khuôn gel). Sau khi gel trùng ngưng, tháo lược, lắp đĩa gel vào bộ phận điện di, cho dung dịch điện di vào buồng điện di. ™ Chuẩn bị mẫu và chạy điện di ¾ Xử lí mẫu Hút 30 µl dung dịch nạp mẫu (2X treatment buffer) và 30 µl dung dịch mẫu protein vào một eppendorf sạch, đậy nắp và búng nhẹ cho đều, đun sôi cách thuỷ 5 – 10 phút. Ly tâm 10.000 vòng/phút trong 1 – 5 giây. Chú ý nồng độ protein trong mẫu vừa đủ sao cho hàm lượng protein trong một giếng không vượt quá 20 – 40 µg và hàm lượng protein/băng không vượt quá 0.1 µg. Đối với thang chuẩn protein (Bio-Rad) hút 2 µl vào eppendorf 1 ml chứa 8 µl nước cất và 10 µl dung dịch nạp mẫu. ¾ Tiến hành chạy điện di Dùng pipetteman 10 µl nạp mẫu vào các giếng (20 µl /giếng). Tiến hành chạy diện di ổn định dòng: 100 v. Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa SVTH: Phan Thị Ngọc Châu 43 Sau khi điện di nhuộm gel với dung dịch nhuộm đã chuẩn bị trước (2 – 4 giờ) trong một giờ. Sau đó cho tiến hành giải nhuộm bằng cách ngâm gel trong dung dịch giải nhuộm cho đến khi gel trở nên trong suốt không màu. Sau khi nhuộm xong, protein đã được phát hiện nhờ các vạch màu xanh lam trên nền gel trong suốt. 3.3.7.4. Xác định trọng lượng phân tử của enzyme Bromelain Đo khoảng cách di chuyển của các băng protein từ gel phân tách tới các băng protein và khoảng cách di chuyển từ gel phân tách tới vạch màu cuối cùng. Tính giá trị Rf. Khoảng cách di chuyển của protein Rf = Khoảng cách di chuyển của vạch màu Brommophenol blue Vẽ biểu đồ 1 g của các giá trị trọng lượng phân tử của các protein chuẩn và các giá trị Rf của chúng. Trọng lượng phân tử của các vạch protein chưa biết trọng lượng phân tử có thể xác định thông qua giá trị Rf của chúng, thông qua phương pháp ngoại suy từ đồ thị Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa SVTH: Phan Thị Ngọc Châu 44 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận Trong quá trình “ tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa ”, tôi thấy rằng enzyme bromelain mang lại nhiều lợi ích cho cuộc sống con người như: + Khắc phục khuyết điểm tự nhiên của nguyên liệu. + Nâng cao giá trị thương phẩm của nguyên liệu. + Là công cụ của quá trình chuyển hóa trong dây chuyền chế biến thực phẩm. Tham gia vào các giai đoạn chuyển hóa chính, các giai đoạn hoàn thành sản phẩm. Ngoài enzyme bromelain còn khá nhiều enzyme ở các mức độ tinh sạch khác nhau đang được sử dụng trong công nghệ sản xuất nhiều sản phẩm hữu ích phục vụ con người. Cụ thể là enzyme được sử dụng trong các lĩnh vựa sau: + Thủy phân tinh bột và sản xuất đường. + Trong công nghiệp rượu bia. + Trong công nghiệp chế biến tinh bột và sản xuất bánh kẹo. + Sản xuất nước hoa quả và rượu nho. + Công nghiệp sữa. + Trong chế biến thịt và thủy phân protein + Trong sản xuất da, chất tẩy rửa và dệt may. + Trong công nghiệp chế biến dầu mỡ sinh học. + Làm chất bổ sung thức ăn chăn nuôi và thủy phân vách tế bào vi sinh vật. + Ứng dụng trong y học và làm biosensor. 4.2. Kiến nghị Với những điều kỳ diệu mà mỗi loại enzyme mang lại, tôi mong rằng trong thời gian sắp tới các nhà khoa học tập trung vào nghiên cứu ứng dụng enzyme ở mức độ tinh tế hơn, nhằm tạo ra các sản phẩm có tính đặc thù sinh học cao hơn, có giá trị hơn, chú ý đến việc tìm và tạo ra các enzyme có những tính chất mới, có phổ hoạt động rộng rộng hơn và đa dạng hơn. Trong tương lai, enzyme sẽ có những tính Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa SVTH: Phan Thị Ngọc Châu 45 chất gần giống như xúc tác hóa học. Do vậy có thể thay thế xúc tác hóa học trong một số trường hợp, cho phép tạo ra những sản phẩm có giá trị sử dụng đặc biệt. Xu thế này phù hợp với xu thế chung là thiết lập nền sản xuất sinh thái bền vững, hòa hợp với tự nhiên, thể hiện trong các nội dung sau: + Sử dụng enzyme trong sản xuất các đồng phân quang học có hoạt tính đặc hiệu dùng điều trị bệnh, hoặc cho các mục đích tương tự. + Sử dụng enzyme trong sản xuất thuốc kháng sinh thế hệ mới. + Sử dụng enzyme trong sản xuất giấy khép kín nhằm giảm phế thải và năng lượng tiêu thụ + Gắn đặc hiệu các gốc đường vào peptide, protein hay thuốc chữa bệnh. + Sử dụng enzyme trong công nghệ xử lý môi trường. Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa SVTH: Phan Thị Ngọc Châu 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 1. Phạm Thị Trân Châu, Phan Tiến Hòa, Nguyễn Thị Bảo, 1987. Thành phần và một số hoạt tính của chế phẩm Bromelain chồi ngọn Dứa tây ( Ananas comosusL – Group Quee). Tập chí sinh học, trang 3 – 9. 2. Ths. Phan Văn Dân, Ths. Đào Thị Thu Hiền. Tài liệu thực tập Công Nghệ Enzyme và Protein Viện Sinh Học Nhiệt Đới. Lưu hành nội bộ. 3. Lê Ngọc Tú, La Văn Chứ, Phạm Thị Trân Châu, Nguyễn Lân Dũng, 1982. Enzyme vi sinh vật, nhà xuất bản khoa học kỹ thuật. 4. Nguyễn Đức Lượng,2004. Công nghệ enzyme, nhà xuất bản ĐH Quốc Gia TPHCM. 5. Lê Thanh Mai, 1997. Nghiên cứu về Bromelain và con đường ứng dụng của chúng, luận văn phó tiến sĩ sinh học. Trường ĐH Khoa Học Tự Nhiên. 6. Trần Xuân Ngạch, 2008. Công nghệ enzyme, nhà xuất bản ĐH Đà Nẵng. 7. GS.TS. Mai Xuân Lương. Công nghệ enzyme. Nhà xuất bản Trường ĐH Đà Lạt. 8. PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng, 2010. Giáo trình Công nghệ enzyme. Trường ĐH Kỹ Thuât Công Nghệ TPHCM. Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa SVTH: Phan Thị Ngọc Châu 47 TÀI LIỆU NƯỚC NGOÀI 9. Anthony J. and Cichoke D.C, 1998. Bromelain. Keat Puslising, Inc. New Cannan, Connecticut. 10. Afolso A.R.,Roberto A.E.,1994. Circular dichroism of stem bromelain : a third spectral class with the family of cysteine proteinases . Biochem .J. (1994) 300 : 107- 110 . 11. Chandler D.S and Mynott T.L, 1998. Bromelain protects piglet from diarrhea caused by oral challege with K88 positive enterotoxigenic Eschrichia Coli. Gut ,pp: 196-202. TÀI LIỆU WED 12. 13. 14. nd=login&Itemid=28 15. 16.