Khóa luận Tìm hiểu tuyến trùng ký sinh sâu hại và quy trình công nghệ sản xuất tuyến trùng ký sinh sâu hại

, 1982) và các chất baterioxin và các thực khuẩn bào (bacteriophages) ngăn cản các loài Xenorhabdus khác. Một số hợp chất kháng khuẩn ñược xác ñịnh từ Xenorhabdus spp. (Paul et al.,1981; Mclnerney et al,. 1990a,b). Mỗi một chủng VKCS sản xuất môt vài thành phần của một nhóm và ít nhất một chủng sản xuất hai nhóm kháng khuẩn này không duy trì trong ñiều kiện monoxenic trong xác chết côn trùng một cách vô hạn ñịnh, nhưng chúng thường giữ ñược hiệu lực trong pha giới hạn của sự sinh sản. Một số tác giả ñưa ra giả thuyết rằng hiện tượng hình quan sinh học do VKCS của tuyến trùng Heterorhabditis spp tạo ra ñã giúp xác chết côn trùng ñược bảo vệ trong môi trường ñất. Phản ứng tạo hình quang sinh học ñạt tới ñỉnh ñiểm trong khi tuyến trùng ñang sinh sản và có thể chống chọi với sự phá vỡ xác chết. Các Khoá luận tốt nghiệp SVTH: Lưu Văn Thuyết 26 sinh vật hoại sinh sống ẩn trong ñất thường sợ ánh sáng và do ñó bị khước từ bởi xác chết huỳnh quang. 3.4. Sự di chuyển của tuyến trùng EPN Khả năng di chuyển của tuyến trùng ñược coi là chỉ tiêu cơ bản của tuyến trùng trong việc tuyển chọn các chủng có tiềm năng sử dụng trong PTSH sâu hại. Khả năng tồn tại cũng như khả năng tìm diệt côn trùng vật chủ trong môi trường tự nhiên. Một chủng tuyến trùng không có khả năng di chuyển tốt nếu ñược phun rải ñể phòng trừ sâu hại trong ñất thì chúng sẽ nhanh chóng bị khô, có thể bị chết và khả năng diệt các loài sâu hại trong ñất cũng bị hạn chế. Khả năng vận ñộng và di chuyển của tuyến trùng rất khác nhau phụ thuộc các chủng/loài tuyến trùng khác nhau. Trong môi trường tự nhiên, tuyến trùng di chuyển theo nhiều hướng, nhưng chúng thường ñịnh hướng theo phía côn trùng vật chủ. Hàng loạt các thử nghiệm ñã ñược tiến hành ñể nghiên cứu sự di chuyển chủ ñộng cũng như bị ñộng của tuyến trùng (Epsky & Capinera, 1988 ; kaya1990 Nguyen & smart, 1990). Còn sự di chuyển thụ ñông của EPN có thể do các yếu tố tự nhiên như mưa, gió, ñất, do con người hoặc do côn trùng vv…Sự di chuyển chủ ñộng của tuyến trùng chỉ có thể sẩy ra trong khoảng cách rất ngắn, có thể tính ñược 4 – 90cm từ vị trí ban ñầu, trong sự di chuyển thụ ñộng có thể tính ñến ñơn vị km (Smart & Nguyen, 1994). Nhìn chung, bình thường thì chỉ có một phần nhỏ tuyến trùng là di chuyển chủ ñộng, còn hầu hết là di chuyển thụ ñộng nhờ yếu tố môi trường. 3.5. Khả năng sinh sản của một số chủng EPN trong côn trùng vật chủ Khả năng sinh sản của tuyến trùng là yếu tố quyết ñịnh ñến sản xuất sinh khối chế phẩm sinh học tuyến trùng. Một trong những ưu thế của tuyến trùng trong phòng trừ sâu hại là khả năng sinh sản của chúng rất cao và chúng có khả năng sản xuất sinh khối lớn bằng vật liệu côn trùng sống (in vivo) hoặc Khoá luận tốt nghiệp SVTH: Lưu Văn Thuyết 27 bằng môi trường nhân tạo (in vitro). Khi xâm nhập vào cơ thể côn trùng vật chủ từ một vài IJs ban ñầu chúng có thể sinh sản qua một vài thế hệ làm tăng số lượng lên ñến hàng trăm ngàn cá thể. Một số thí nghiệm ở nước ngoài ñã xác ñịnh khă năng sinh sản của tuyến trùng S. feltiae trên một vật chủ BSL là 200 x 103 IJs và các loài H. bacteriophora là 350 x 103 IJs (Wouts, 1991). Tuy nhiên, sản lượng sinh sản trung bình của hầu hết các loài tuyến trùng khác thì lượng nhỏ hơn khá nhiều, khoảng 30 x 103 ñến 50 x 103 IJs của tuyến trùng từ một vật chủ ấu trùng BSL (Wouts, 1991). 3.5.1. Khả năng sinh sản của một chủng EPN trong BSL Sinh sản của Steinernema TK10 và Steinernema TX1 Thí nghiệm xác ñịnh khả năng sinh sản của các chủng tuyến trùng bản ñịa thông qua việc xác ñịnh thời gian phát tán của IJs và số lượng IJs thu ñược qua từng ngày của các chủng tuyến trùng cho thấy sự khác nhau khá lớn giữa 2 chủng tuyến trùng Steinerema và ñặc biệt giữa các chủng Steinernema so với các chủng Heterorhabditis. ðối với chủng tuyến trùng S-TK10, IJs phát tán ra trong khoảng thời gian rất ngắn chỉ trong 4 ngày. Số lượng thu ñược cao nhất trong ngày ñầu tiên là 15,2 x 103 IJs. Số lượng này giảm một nửa chỉ còn 7,4 x 103 IJs ở ngày thứ 2 và 4.4 x 103 ở ngày thứ 3. Cuối cùng kết thúc ở ngày thứ 4 và thu ñược thấp nhất ở ngày thứ 4 và thu ñược thấp nhất chỉ còn 1,9 x 103 IJs. Sự sinh sản của Heterorhabditis MP11 và Heterorhabdtitis NT3 Với chủng tuyến trùng H-MP11 thời gian phát tán ra ngoài xác chết BSL của IJs là 4 ngày, Bằng với thời gian phát tán của chủng tuyến trùng S- TK10. Tuy nhiên, số lượng IJs phát tán và thu ñược là khá lớn 53,3 x 103. ðến ngày thứ 2 tăng lên gấp 2 lần 82,4 x 103 IJs cao nhất trong 4 ngày. Sau ñó số lượng giảm xuống rất nhanh 19,1 x 103 ở ngày thứ 3 và kết thúc ở ngày thứ 4 thu ñược 7,0 x 103 IJs. Khoá luận tốt nghiệp SVTH: Lưu Văn Thuyết 28 Như vậy thời gian phát tán của chủng H-MP11 ngắn hơn và số lượng IJs thu ñược cũng tập trung hơn so với các chủng tuyến trùng Steinernema ở trên. Tính chất phát tán của IJs như vậy ñược coi như một ñặc tính ưu việt của các chủng heterorhabditis nói chung và H-MP11 nói riêng trong việc sản xuất tuyến trùng bằng nhân nuôi in vivo. Sự phát tán của IJs tập trung trong một thời gian ngắn không những tạo ra IJs tập trung trong một thời gian ngắn không những tạo ra IJs ñồng thời ñều về chất lượng mà còn cho phép xử lý bảo quản IJs tốt hơn. 3.5.2. Tương quan giữa số lượng nhiễm và sản lượng IJs Ngoài yếu tố sự mẫn cảm của côn trùng vật chủ ñối với chủng EPN, thì sản lượng IJs của một chủng EPN còn phụ thuộc khá lớn vào nồng ñộ IJs gây nhiễm ban ñầu của chủng ñó ñối với côn trùng vật chủ. Nói cách khác, sản lượng IJs của một chủng tuyến trùng luôn có tương quan chặt chẽ với nồng ñộ gây nhiễm ban ñầu. Số liệu thí nghiệm về sự tương quan giữa số lượng gây nhiễm ban ñầu và sản lượng IJs thu ñược ñối với chủng S- TK10 trên ấu trùng BSL cho thấy: Ở nồng ñộ gây nhiễm 10 IJs có sản lượng IJs thấp nhất là 12,1 x 103 IJs. Khi số lượng IJs gây nhiễm tăng lên thì sản lượng IJs cũng tăng lên và ñạt giá trị trung bình cao nhất là 34.4 x 103 IJs/BSL. Sản lượng cao nhất trong thí nghiệm này là 40.4 x 103 IJs ở công thức gây nhiễm ban ñầu 70 IJs. Vượt qua số lượng gây nhiễm này ở các công thức gây nhiễm cao hơn là 80, 90, 100IJs thì sản lượng IJs lại có xu hướng giảm dần và sản lượng trung bình chỉ ñạt 22.8 x 103 IJs ở số lượng gây nhiễm ban ñầu 100 IJs. Trong thí nghiệm với chủng S-TX1, với 10 công thức nồng ñộ gây nhiễm, thấp nhất 10 ñến cao nhất là 100 IJs cũng cho kết quả tương tự như thí nghiệm trên với chủng S-TK10. Ở công thức gây nhiễm với số lượng 10, 20, Khoá luận tốt nghiệp SVTH: Lưu Văn Thuyết 29 30 IJs, thì sản lượng IJs chỉ ñạt từ 33.4 x 103 – 37,1 x 103 IJs/BSL. Ở các công thức gây nhiễm cao hơn, từ 40-70 IJs thì sản lượng thu ñược ñều cao hơn 50,0 x 103 IJs. Sản lượng cao nhất trong thí nghiệm này là 66,6 x 103 IJs / BSL. Khi số lượng IJs gây nhiễm ban ñầu tăng lên mức này thì sản lượng thu ñược có xu hướng giảm dần. Rõ ràng trong cùng một ñiều kiện thí nghiệm với các công thức số lượng gây nhiễm giống nhau, nhưng chủng S-TX1 có sản lượng IJs thu ñược từ một BSL cao hơn hẳn (gần gấp ñôi) so với sản lượng IJs của chủng S-TK10 trong thí nghiệm trên ñây, ðiều này cho thấy khả năng sinh sản của tuyến trùng EPN ngoài yếu tố côn trùng vật chủ và số lượng gây nhiễm ban ñầu thì yếu tố nội tại, tức là bản chất di truyền của mỗi EPN có ý nghĩa rất lớn. 3.5.3. Khả năng sinh sản của một số chủng EPN trong sâu hại Khả năng sinh sản của một số chủng tuyến trùng bản ñịa Việt Nam còn ñược thí nghiệm trên ñối tượng sâu xanh (Helicopverpa armigera). ðây là ñối tượng hại khá phổ biến ñối với các vùng trồng thuốc là. Ấu trùng tuổi 3 ñến 5 của sâu xanh thuộc loại ñối tượng lớn, với sinh khối bằng hoặc lớn hơn so với ấu trùng BSL. Sinh sản của chủng D-TX1 trên sâu xanh Thí nghiệm ñánh giá khả năng sinh sản của chủng tuyến trùng của S- TX1 trên sâu xanh cho thấy ở số lượng ban ñầu 10 IJs, sản lượng IJs thu ñược chỉ là 28,0 x 103 IJs. Sau ñó sản lượng thu ñược tăng lên 36,7 x 103 IJs và 40,3 x 103 ở số lượng 20 và 30 IJs ban ñầu. Sản lượng thu ñược cao nhất là 83.3 x 103 IJs/sâu xanh ở số lượng 40 IJs ban ñầu. Số lượng IJs ban ñầu ñược tăng lên tiếp tục từ 50 ñến 100 IJs trong khi ñó sản lượng lại giảm dần từ 59,6 x 103 (50 IJs ban ñầu) xuống còn 41,3 x 103 (100 IJs ban ñầu). sinh sản của chủng H-MP11 trên sâu xanh Khoá luận tốt nghiệp SVTH: Lưu Văn Thuyết 30 ðối với chủng H-MP11, khả năng sinh sản sâu xanh thực nghiệm cho thấy sản lượng IJs thu ñược trung bình 54,0 x 103 IJs ở số lượng gây nhiễm ban ñầu 10 IJs, tăng lên ñến 158,7 x 103 ở số lượng gây nhiễm 50 IJs. Sản lượng cao nhất là 293 x 103 IJs/sâu xanh. Trung bình cao nhất là 213,7 x 103 IJs/sâu xanh ở số lượng 80 IJs ban ñầu. Sau ñó ở số lượng gây nhiễm 100 IJs, sản lượng thu ñược lại giảm còn 168 x 103 IJs. Dựa trên số liệu thực nghiệm, qua phân tích hàm bậc hai, sản lượng của chủng H-MP11 trên sâu xanh se ñạt cao nhất ở số lượng gây nhiễm ban ñầu khoảng 110 IJs, các số lượng IJs khác càng xa giá trị tối ưu này sản lượng IJs sinh ra sẽ càng giảm ñi. Khả năng sinh sản tốt của tuyến trùng trên các loài sâu hại cũng cho biết tuyến trùng có thể nhân nuôi in vivo trên các loài sâu hại khác không phải là côn trùng mồi BSL. Ngoài ra nó còn cho thấy khả năng duy trì sự sinh trưởng phát triển cua tuyến trùng lần ñầu. ðây là một ưu thế của tuyến trùng khi sử dụng phòng trừ sâu hại ngoài thực tế, nó giúp cho hiệu quả phòng trừ sâu hại của tuyến trùng kéo dài có thể ñến 1 năm sau ñó (Mracek & Webster, 1993) Kết quả thử nghiệm ñánh giá khả năng sinh sản của 4 chủng tuyến trùng trên ñây trong cơ thể sâu xanh cũng gần giống với kết quả thử nghiệm về khả năng sinh sản của chủng trên BSL, chỉ khác là ở mức ñộ về sản lượng thu ñược ở ñều lớn hơn một cách tương ứng so với sản lượng thu ñược BSL do sinh khối của sâu xanh lớn hơn sinh khối của BSL. Kết quả này thêm một lần nữa cho thấy khả năng sinh sản của các chủng tuyến trùng bản ñịa là những chủng ñáp ứng về mặt ñộc tố cũng như sinh sản trong cơ thể vật chủ. ðây cũng là những tiêu chí quan trọng khi xem xét việc sử dụng một chủng tuyến trùng cho phòng trừ sâu hại ngoài ñồng ruộng. Khoá luận tốt nghiệp SVTH: Lưu Văn Thuyết 31 CHƯƠNG 4: CÔNG NGHỆ NHÂN NUÔI TUYẾN TRÙNG Ở Việt Nam Ngọc Châu là tác giả của nhiều công trình nghiên cứu và ñã sản xuất thành công chế phẩm EPN trừ sâu hại. Sau ñây là quy trình công nghệ sản xuất tuyến trùng EPN của tác giả (Nguyễn Ngọc Châu, 2008) 4.1. Lựa chọn công nghệ thích hợp Hiện nay trên thế giới ñã phát triển 2 hệ thống công nghệ nhân nuôi sản xuất tuyến trùng là nhân nuôi in vivo và nhân nuôi in vitro hai công nghệ này khác nhau chủ yếu bởi nguồn vật liệu nhân nuôi: vật liệu tự nhiên và vất liệu nhân tạo. Nhân nuôi invivo trên cơ sở sử dụng vật liệu nhân nuôi là côn trùng sống. Một trong những nguồn công nghệ in vivo là ấu trùng tuổi 4 của BSL, một loại vật liệu có sẵn, dễ sản xuất và khá mẫn cảm với các chủng tuyến trùng EPN. Nhân nuôi in vitro trên cơ sở sử dụng nguồn vật liệu nhân nuôi nhân tạo. Trong công nghệ này có thể sử dụng hai loại môi trường, môi trường nhân nuôi ñăc biệt và môi trường lỏng sản xuất bởi vật liệu khác nhau. Môi trường nhân nuôi ñặc biệt sử dụng tạng ñộng vật làm vật liệu. Một số nội tạng như tim, thận, có thể ñể nguyên gây nhiễm không cần xoay nhuyễn chế biến thành bột nhão. Ngoài ra còn tận dụng cả gia cầm ñể chế biến thành dạng bột nhão gọi là chicken offal ñể nhân nuôi tuyến trùng. ðối với môi trường nhân nuôi lỏng thường ở dạng dung dịch ñược phối chế từ các vật liệu dạng lỏng chủ yếu là dầu ăn, dịch men, cholesterol và một số muối khoáng như: Nacl, Mgso4 , Cacl2 và KCl. Mỗi loại môi trường sử dụng các thiết bị nhân nuôi khác nhau: nhân nuôi in vivo chủ yếu sử dụng các ñĩa petri lớn. nhân nuôi in vitro ñược sử dụng các Khoá luận tốt nghiệp SVTH: Lưu Văn Thuyết 32 thiết bị ño khác nhau: bình tam giác miệng rộng , hộp nhựa nylon chịu nhiệt ( ñối với môi trường offal chicken) Tuỳ theo ñiều kiện cụ thể và mục ñích nhân nuôi khác nhau mà có cách sử dụng môi trường khác nhau Sơ ñồ phát triển công nghệ Sản xuất chế phẩm sinh học EPN dù theo công nghệ in vivo và in vitro cũng bao gồm 5 công ñoạn chủ yếu như sau: - Sản xuất vật liệu ban ñầu là nguồn IJS - Gây nhiễm trùng nhân nuôi - Nhân ủ ñể tuyến trùng sinh sôi phát triển Ấu trùng In vitro In vivo Gây nhiễm Môi trường nhân Nhân ủ 12-14 ngày(in vivo) Thu hoạch IJs Xử lý sạch-Phối chế ðóng gói bảo quản Vật liệu ban ñầu IJs Khoá luận tốt nghiệp SVTH: Lưu Văn Thuyết 33 - Thu hoạch tuyến trùng - xử lý làm sạch tuyến trùng Ngoài ra tuỳ mục ñích kinh doanh sử dụng hay cần bảo quản vận chuyển ñi xa mà có thể có 2 công ñoạn sau: - Phối chế tuyến trùng - ðóng gói bảo quản tuyến trùng Về nguyên tắc 5 công ñoạn trên khá giông nhau về quy trình công nghệ, nhưng hai công ñoạn sau thì có thể khác nhau và có thể là bí quyết của các công ty sản xuất chế phẩm sinh học EPN 4.2. Công nghệ nhân nuôi in vivo Do khả năng xâm nhiểm và sinh sản của các loài tuyến trùng Steinernema và Heterohabditis trong vật chủ côn trùng và ñặc biệt là do phổ kí sinh của chúng ñối với côn trùng rất rộng, có thể sử dụng nhiều loại côn trùng làm vật liệu nhân nuôi, sản xuát tuyến trùng. Trong số côn trùng vật chủ ñược sử dụng làm sản xuất tuyến trùng EPN thì ấu trùng bướm sáp lớn – BSL ñược coi là côn trùng khá lý tưởng ñể làm vật liệu nuôi ñối với hầu hết các loài tuyến trùng EPN. BSL là côn trùng khá mẫn cảm với hầu hết các loài và chủng loài tuyến trùng EPN và là môi trường lý tưởng cho tuyến trùng sinh sản. loài côn trùng này sẳn có và dể nuôi bằng vật liệu tự nhiên là sáp ông hoặc vật liệu nhân tạo. Một ấu trùng bướm sáp lớn có thể cho thu hoạch tới 200000 IJS của S.feltiae và của H. bacteriophora. Tuy nhiên số lượng IJS ñược sản xuất trên một ấu trùng bướm sáp lớn phụ thuộc vào chủng loài tuyến trùng và mật ñộ gây nhiểm ban ñầu. các chủng loài tuyến trùng EPN có kích thước IJs nhỏ như ở hầu hết các loài Heterohabditis thì sản lượng lơn ngược lại kích thước lớn như ở hầu hết các loài steinerma thì sản lượng thường nhỏ. Thông thường ñối với các chủng / loài tuyến trùng Steinerma thì sản lượng nhỏ hơn rất nhiều thường chỉ ñạt từ Khoá luận tốt nghiệp SVTH: Lưu Văn Thuyết 34 30000 – 50000 IJS. Quy trình sản xuất invivo chủ yếu tham khảo theo phương pháp Poinar (1979) với hàng loạt các thay ñổi khác nhau. Quy trình sản xuất chế phẩm sinh học EPN bằng in vivo trên cơ sở sử dụng ấu trùng tuổi 5 của BSL làm vật liệu nhân nuôi , gồm các bước như sau: i)nhân nuôi sản xuất ấu trùng BSL ; ii)gây nhiễm IJS cho BSL và nhân ủ trong 12-14 ngày ; iii)thu hoặch IJS bằng kỹ thuật bẫy nước phối chế bảo quản IJs. Công nghệ nhân nuôi in vivo khá ñơn giản , không cần ñầu tư lờn, vì vậy có áp dụng quy mô hộ gia ñình, các trang trại hoặc các ñơn vị sản xuất nhỏ. Tuy nhiên công nghệ này có nhược ñiểm là năng xuất thấp, chất lượng không ổn ñịnh và ñặc biệt là tôn nhiều công lao ñộng nên giá thành cao. Trước khi nhân nuôi sản xuất in vivo tuyến trùng cần tạo vật liệu nguồn ấu trùng BSL. Quy trình nhân nuôi và sản xuất BSL ñược trình bài ở phần sau. 4.2.1. Xâm nhiễm tuyến trùng vào ấu trùng BSL Tuyến trùng xâm nhiễm IJs thường ñược bảo quản lạnh từ 12 – 14oC trước khi xâm nhiễm nên ñể IJs ấm dần lên ñến nhiệt ñộ phòng (20-240C). kiểm tra tuyến trùng dưới kình hiển vi soi nổi. Tuyến trùng còn sống tốt sẽ chuyển ñộng. Lấy 1ml tuyến trùng và pha trong một lượng nước xác ñịnh sao cho có nồng ñộ tuyến trùng ñạt 200IJS/ml. ðếm số lượng IJs bằng hợp ñếm dưới kính hiển vi soi nổi ñể biết chính xác mật ñộ IJs và trên cơ sở ñó ñiều chỉnh nồng ñộ tuyến trùng ñạt 200IJS/ml bằng thêm hay bớt một lượng nước hợp lý ñể ñạt ñược nồng ñộ trên. Khi có ñược nồng ñộ mong muốn thì hút từng ml dung dịch chứa tuyến trùng và cho vào trên giấy lọc. Mỗi hộp cho vào 10 ấu trùng BSL ñã qua xử lý nhiệt ñể không tạo kén. Như vậy nồng ñộ gây nhiễm là khoảng 200IJs/BSL. nếu nồng ñộ gây nhiễm cao thì thì nồng ñộ tuyến trùng sinh ra sẽ ít do bị cạnh Khoá luận tốt nghiệp SVTH: Lưu Văn Thuyết 35 tranh và bị ô nhiễm bởi vi khuẩn bên ngoài. ñậy nắp hộp chứa tuyến trùng và vi khuẩn bên ngoài. Dán nhãn và ñể trong túi nilon. ðặt trong tối ở nhiệt ñộ phòng. Sau khi gây nhiễm hầu hết BSL ñều chết, cẩn thận chuyển BSL ñã chết vào white trap(white 1927) Thông thường BSL bị nhiễm EPN và chết sẽ không có mùi thúi và có màu sắc khá ñặc trưng. BSL bị nhiễm Steinerma sẽ có màu hơi vàng nâu và mềm khi gấp bằng kẹp còn BSL bị nhiễm Herterohabditis sẽ có màu ñỏ gạch và cứng hơn môt chút. Những con BSL bị chết do nhiễm nặng hay chết bởi các nguyên nhân khác thường màu hơi ñen và có mùi thối. tôt nhất là không thu tuyến trùng từ những con này vì số lượng ít và chúng có thể gây ô nhiễm nặng cho cả ñợt. 4.2.2. Thu hoạch tuyến trùng IJs Làm bẫy nước (white trap) theo white (1927): ðặt giấy lọc whatman N01- 90mm trên mặt lõm của ñĩa ñồng hồ trong ñĩa petri thuỷ tinh lớn. ðặt vào nồi hấp 20 phút ở 1210C. Cho vào ñĩa petri khoảng 70ml nước cất hoặc cho thêm formalin ñể tạo thành dung dịch 0.1% formalin. Chú ý: không ñược ñể nước nhỏ vào mặt lõm của ñĩa ñồng hồ. ðặt giấy lọc lên trên ñĩa ñồng hồ và gập mép giấp ngược về phía ñáy ñĩa, sao cho khi ñặt vào ñĩa petri chứa nước, mép giấy tiếp xúc với bề mặt nước. Mỗi ñĩa như vậy khoảng 20-30 BSL sát nhau trên giấy lọc ở sát mép ñĩa ñồng hồ. Khoá luận tốt nghiệp SVTH: Lưu Văn Thuyết 36 Hình 4.1. Ấu trùng BSL Thông thường sau khi nhiễm từ 10-12 ngày, IJs sẽ bắt ñầu phát tán ra khỏi BSL và khi chuyển vào nước trong ñĩa petri. Còn xác BSL còn lại trên ñĩa ñồng hồ. khi tuyến trùng xuất hiện trong ñĩa petri nên tiến hành thu chúng hàng ngày tới khi số lượng giảm (3-4-ngày). ðể thu hoạch, nhấc ñĩa có chứa BSL ra, rót nước chứa IJs vào cốc (rữa ñĩa petri ñể thu huyết trùng) thêm 70ml nước cất hoặc 0.1% formalin và thay ñĩa ñồng hồ. Với hầu hết tuyến trừng EPN thì ấu trùng thoát ra khỏi vật chủ BSL cũng là IJs thuần chủng, nhưng với S.glaseri, khi ấu trùng mới thoát ra từ xác chết của côn trùng thì chúng chỉ là dạng ấu trùng tiền xâm nhiềm và nếu tuyến trùng này di chuyển ngay vào môi trường lỏng chúng sẽ không phát triển hoàn toàn thành dạng IJs ñược. ðể cho chúng thành IJs cần thay ñĩa ñồng hồ và giấy lọc bằng ñĩa petri ñược chuẩn bị ñặc biệt. ðĩa petri này chứa lớp mỏng khoảng 2mm plaster, ñể lớp laster này khô và làm ẩm không nên sũng ướt. kiểm tra mức ñộ ẩm trước khi thu hoạch cộng thêm vài giọt nước nếu thầy cần thiết. vật chủ ñã nhiễm ñược ñặt trên giấy plaster ẩm này, sao ñó di Khoá luận tốt nghiệp SVTH: Lưu Văn Thuyết 37 chuyển trong hai ñến ba ngày vào môi trường nước hoặc 0.1% formalin trong ñĩa petri thuỷ tinh lớn hơn. Chúng có thể thu bằng cách thông thường. 4.2.3. Chuẩn bị cho bảo quản kiểm tra IJs còn hoạt ñộng, Mô vật chủ hoặc tuyến trùng không phải IJs phải ñược loại bỏ. nếu có vấn ñề phát sinh hoặc số lớn tuyến trùng không hoạt ñộng cần ñược xem xét xử lý hoặc loại bỏ, trong khi tiến hành rửa cuối cùng. Tách IJS ra khỏi xác chết vật chủ, môi trường nhân nuôi hoặc tạp chất khác bằng cách cho IJs di chuyển qua rây lọc có kích thước lổ thích hợp (60- 60µm) ñể giữ lại mô vật chủ và tuyến trùng ở các giai ñoạn không lây nhiễm. các giai ñoạn không xâm nhiễm. Các giai ñoạn không xâm nhiễm có thể bị giết khi rửa tuyến trùng bằng dung dịch Hyamine 0.4% trong 15 phút. Nếu muốn tất cả các giai ñoạn không xâm nhiễm cũa hai giai ñoạn Steinerma và Herterohabditis ñều có thể bị chết ở nhiệt ñộ phòng trong một vài ngày . ðể rửa tuyến trùng, cho chúng vào một cái cốc, ñể tuyến trùng lắng ñọng, gạn phần nước phía trên và cho phần nước sạch vào cho ñến khi dung dịch sạch từ 2-4 lần. Nếu dung dịch bị ô nhiễm nặng chúng có thể rửa một lần bằng dung dịch formalin. Có thể ly tâm ở tốc ñộ 300 vòng /phút trong 1 phút có thể ñẩy nhanh quá trình này. Trong thời gian ngắn tuyến trùng có thể ñược cất giữ qua ñêm trong tủ lạnh nhưng nên rửa ít nhất 1 lần trước khi cho vào tủ lạnh. Cuối cùng chuyển tuyến trùng cho vào lọ bảo quản. 4.3. Công nghệ nhân nuôi in vitro Công nghệ sản xuất invitro trên cơ sở sử dụng môi trường nhân tạo ñể sản xuất sinh khối lớn EPN. Quy trình sản xuất chế phẩm sinh học tuyến trùng gồm năm giai ñoạn chủ yếu như sau: i)phân lập VKCS từ xoang máu của ấu trùng bướm sáp lớn ñã ñược gây nhiễm EPN chuyển sang môi trường laura Broth cho nhân nuôi sơ cấp ñể tuyển chọn khuẩn lạc chuẩn (pha I); ii)nhân nuôi thứ cấp VKCS trong môi trường ñể toạ sinh khôi lớn; iii) gây Khoá luận tốt nghiệp SVTH: Lưu Văn Thuyết 38 nhiễm vào môi trường chicken offal ñể tạo sinh khối lớn VKCS; iv) nhân ủ tổ hợp EPN – VKCS trong vòng 24-28 ngày; v) thu hoạch EPN phối chế và bảo quản. Công nghệ này khắc phục ñược những hạn chế của công nghệ in vivo và có khả năng thương mại hoá chế phẩm sinh học EPN với giá thành thấp hơn. 4.3.1. Phân lập VKCS. VKCS của EPN rất mẫn cảm với nồng ñộ Oxy thấp, thay ñổi ñộ thẩm thấu, thiếu nguồn dinh dưỡng và nhân nuôi nhỏ hơn là các chủng thông thường khác (E.coli). Pha sơ cấp Xenohabdus có thể ñược hướng dẫn theo bảng 43 dưới ñây. Các vi khuẩn sơ cấp có thể ñược bảo quản 17% trong môi trường dinh dưỡng glyseron trong chai martney và giữ ở 18oC. Thể treo này ñược làm tan nhanh ở nước nóng 60oC. Các vi khuẩn có thể ñược bảo quản ở 12-24oC và cấy chuyền thường xuyên . Phân lập và nuôi sơ cấp. - Chuyển 10 ấu trùng vào các ẩm 10% vào một ñĩa petri cho nhiễm vào khoảng 100IJs trên mỗi BSL. Không nên cho quá nhiều nước ñề tránh BSL bị ngập nước mà chết trước khi nhiễm tuyến trùng. - Sau 24-48 giời khi ấu trùng BSL Chết chúng sẽ ñược chuyển vào một cốc thuỷ tinh và rửa bằng cồn trong vòng 5-10 phút. - Mổ xác chết bằng một kéo hoặc bằng kim nhọn sắc ñã ñược khử trùng và lấy một giọt huyết tương lên NBTA sử dụng que cấy platin dạng vòng. Chú ý: khi tác mỗ và lấy mẫu huyết tương và không làm vỡ ruột ấu trùng BSL ñể tránh nhiễm bẩn. - Ủ ñĩa môi trường nhân nuôi ở 25oc trong buồn tối. - Chọn lấy một khuẩn lạc ñơn sơ cấp và nhiễm trở lại vào môi trường NBTA agar. Khoá luận tốt nghiệp SVTH: Lưu Văn Thuyết 39 - Nếu ñĩa nhân nuôi chất lượng và không bị nhiễm bẩn (có thể phân loại bằng nhân nuôi thứ cấp này), có thể nhân nuôi bằng cách nhân nuôi tiếp theo. Nhân nuôi thứ cấp - Cấy chuyển một khuẩn lạc vào dịch YS- broth và ủ trong 1-2 ngày ở nhiệt ñộ 25oc trong 200 vòng trên phút trong tối. - Bổ sung thêm 15% glyserol vào dịch nhân nuôi, trộn lắc ñều và lấy 2ml vào ống typ ñã khử trùng. - Sau khi san dịch vào các ống typ, chuyển chúng san bảo quản ở -800c. Luu ý: các ống typ cần ñược ghi nhãn tên chủng, ngày chuẩn bị mẩu. ðể chắc chắn cần thêm mô tả ngắn nguồn giống nhân nuôi trong hồ sơ ñông lạnh -800c, nghĩa là số thứ tự của khay và hộp chứa mẩu, số chủng nuôi, ñặc tính của chủng ( sơ cấp, thứ cấp)… 4.3.2. chuẩn bị môi trường nhân nuôi tổ hợp tuyến trùng Từ nghiên cứu thành công quy trình công nghệ in vitro trên môi trường ñặc trong bình tam giác, ñề tài ñã nghiên cứu, thay thế vật liệu sản xuất môi trường chicken offal từ nguyên liệu lòng gia cầm, một loại vật liệu khá ñắt, không sẳn có trên thi trường với khối lượng lớn bằng nguyên liệu mới là lòng gia súc (lòng lợn) một loại vật liệu khá rẻ, với giá trị tồn tại trên thị trường với khối lượng lớn. Giá rẻ khối lượng tồn tại trên thị trường lớn mà hiệu quả không thua kém gì lòng gia cầm. chuẩn bị môi trường chicken offal Các nội quan như tim gan , ruột,… của gia cầm và gia súc ñều có thể sử dụng ñược trong môi trường nhân nuôi EPN. a. Loại bỏ túi mật ( các muối mật có hại cho sự phát triển của tuyến trùng). Không ñược làm vỡ túi mật khi lấy nó ra. b. Cho vật liệu lòng vào nối áp suất ñể hấp ở 121 ñộ C trong 20-25 phút. Khoá luận tốt nghiệp SVTH: Lưu Văn Thuyết 40 C. Xay nghiến cho nhuyễn vật liệu, trước xay nên dùng kéo cắt ruột thành các ñoạn ngắn khoảng 15cm. d. Bảo quản lạnh nếu chưa trộn môi trường ngay. Tốt nhất là trộn xong sau ñó nếu mới bảo quản ñể giữ an toàn cho không gian trong tủ bảo quản. e. Trộn trong nước và mỡ bò theo các tỷ lệ sau: Môi trường nhân nuôi các loài Steinernema : 8 Dung dịch offal + 2 phần nước (không mỡ bò). Môi trường nhân nuôi các loài Heterorhabditis : 7 Dung dịch offal + 2 phần nước + 1 phần mỡ bò. 4.3.3. Chuẩn bị dụng cụ nhân nuôi Tiến hành cắt xốp thành những miếng nhỏ (kích thước 1cm) sau ñó trộn với môi trường chicken offal ñã chuẩn bị sẵn với tỷ lệ môi trường/xốp (tính theo trọng lượng) là 1.25/1. Mỗi bình tam giác cho một lượng 250-300ml (khoảng 100g) môi trường ñã trộn với xốp. Lau sạch miệng bình và bịt kín bằng nút bông bọc vải thưa và hấp ở 121 ñộ C trong 20 phút. Bình nhân nuôi ñược làm lạnh một thời gian trước khi sử dụng. Trường hợp môi trường có mùi hôi thối do nguyên liệu ñã ñể lâu trước khi chế biến thì có thể sử dụng chất khử mùi. Chú ý: Trong suốt quá trình thao tác cần mang găng tay cao su. ðây là một yêu cầu quan trọng ñể tránh nhiễm trùng cho môi trường nhân nuôi. Dùng túi nilon chịu nhiệt thay cho bình tam giác và hộp nhựa ñể nhân nuôi EPN có thể tiết kiệm chi phí nhân nuôi. Ngoài ra, có thể chuển trực tiếp các tùi nhân nuôi ra ñồng ruộng ñể phun rải mà không cần qua khâu tách lọc vừa mất nhiều thời gian vừa bị hao hụt. 4.3.4. Gây nhiễm vi khuẩn Dịch nhân nuôi vi khuẩn sơ cấp nên ñược ủ trước một ngày trước khi bình nuôi ñược chuẩn bị. Vi khuẩn ñược cấy chuyền vào các ống nghiệm (tốt Khoá luận tốt nghiệp SVTH: Lưu Văn Thuyết 41 nhất nhân nuôi vi khuẩn trong 1 ống týp cho một bình nhân nuôi) có chứa 5ml nutrient broth. Tốt nhất ñể các ống týp qua ñêm trên máy lắc hoặc ít nhất xoáy nước trong ống trước khi ủ. Khi nhiễm rót một ống dịch vi khuẩn vào mỗi bình nhân nuôi. Lắc ñều ñể trộn lẫn dịch vi khuẩn với môi trường trong chất xốp nền. Ủ 2-3 ngày ở 250 ñộ C ñể vi khuẩn phát triển nhanh. 4.3.5. Gây nhiễm tuyến trùng và nhân giống tổ hợp(monoxenic) Sau khi nhân nuôi vi khuẩn xong tiến hành nhiễm tuyến trùng vào các bình ñã chuẩn bị sẵn vi khuẩn. Một bình tam giác ban ñầu có thể chia thành 7 bình mới. Dùng pipet hút 1 lượng nước chứa tuyến trùng khoảng 3-4ml và phun vào từng bình tại 3-5 ñiểm. Sau khi nhiễm tuyến trùng, tốt nhất là tránh rung lắc mạnh bình ñang nhân nuôi tuyến trùng. ðể các bình nhân ủ trong phòng tối ở nhiệt ñộ 25-280C, ẩm ñộ 75-80% trong thời gian 10-14 ngày cho ñến khi thấy tuyến trùng sinh sôi và bám ñầy trên thành bình có thể thu hoạch. Hình 4.2: Nhân nuôi EPN trong bình tam giác Khoá luận tốt nghiệp SVTH: Lưu Văn Thuyết 42 Khi bình nhân nuôi có dấu hiệu không tốt hoặc bị nghi ngờ, IJs ñã vô trùng bề mặt có thể phục vụ như chất gây nhiễm ban ñầu. Khi chủng IJs không nên cho quá nhiều nước cùng với tuyến trùng (tốt nhất là <5ml). Sau 2-3 ngày kiểm tra xem các bình nhân nuôi có thành công không bằng cách lấy mẫu từ bình nuôi cấy trên MacConkey Agar hoặc NBTA (Nutri agar, bromthymol blue và tetrazolium choloride) và sau ñó kiểm tra màu sắc vi khuẩn phù hợp và hình thái ñể biết ñộ thuần khiết. 4.3.6.Thu hoạch IJs ðể tách lọc lấy IJs từ bọt xốp cho xốp vào một ray lọc kích thước lỗ 1- 2mm. ñặt rây vào 1 chậu và cho nước vừa ngập xốp, ñể yên tĩnh trong thời gian 2-6 giờ hoặc nếu cần có thể ñể lâu ñến 12 giờ, nhưng không nên ñể lâu quá 24 giờ vì thời gian lâu quá sẽ không có lợi cho tuyến trùng. Không ñược rót nước lên trên xốp vì sẽ rửa mất một phần chất dinh dưỡng (ñể nuôi tuyến trùng). Thông thường trong vòng 2 giờ ñầu sẽ có khoảng 95% IJs di chuyền qua ñáy rây lọc xuống chậu nước. Làm lắng tuyến trùng và rửa tuyến trùng ñể loại bỏ các phần khác và IJs không hoạt ñộng. Có thể dùng rây lọc kích thước lỗ nhỏ 0,5mm ñể lọc và loại bỏ các phần không cần thiết. ðối với các chủng Steinernema có thể sử dụng dung dịch Hyamine ñể giết các dạng không phải IJs trước khi lọc qua rây. Cần phải rửa tuyến trùng nhiều lần tới khi nước sạch. Trong trường hợp cần thiết có thể dùng sục khí ñể phá vỡ những thành phần nhỏ của dung dịch sau khi rửa IJs. 4.3.7. Xử lý sự cố ðể tránh ô nhiễm các bình hoặc hộp nhân nuôi cần hết sức chú ý bất kỳ thao tác nào trong quá trình thao tác. Chỉ cần 1 giọt nước nhỏ trong khi sản xuất cũng có thể gây ôi nhiễm, hoặc một sự thay ñổi ñột ngột cũng có thể tạo ra pha thứ cấp của VKCS. Thậm chí khi nhiệt ñộ nhân ủ không thích hợp, ẩm Khoá luận tốt nghiệp SVTH: Lưu Văn Thuyết 43 ñộ không phù hợp vì nhiều nguyên nhân hay yếu tố khác. Sự ô nhiễm có thể ñược nhận biết dễ dàng khi xuất hiện các màu sắc hoặc mùi hôi không bình thường hoặc chất rò rỉ khác lạ từ sinh khối do vi khuẩn và nấm gây ra. Trong bất kỳ trường hợp nào cũng nên ñược kiểm tra bằng cách gây nhiễm trên NBTA hoặc MacConkey agar. Ở thời ñiểm trước 2 tuần, bình tam giác nuôi cấy chứa tỷ lệ cao vi khuẩn thứ cấp là bình thường, tuy nhiên 1 ñiều rất quan trọng là các bình này phải ñược chủng vi khuẩn sơ cấp lúc ban ñầu. Mặc dù nhiệt ñộ nhân nuôi tối ưu khác nhau ở các loài tuyến trùng, nhưng nhiệt ñộ 25-280C là tốt nhất cho việc sản xuất hầu hết các chủng tuyến trùng. ðộ ẩm có thể ñược ñiều chỉnh bằng cách thêm vào hay bớt ñi một lượng chất lỏng nhất ñịnh trong các bước khác nhau của quy trình sản xuất. Nếu môi trường là quá lỏng hoặc quá nhiều chất lỏng cho vào khi nhiễm, tuyến trùng sẽ bị giữ lại ở chỗ nhiễm và chết. Nếu môi trường là quá khô, sự nhân nuôi sẽ mất ñộ ẩm dần dần trước khi một số lớn tuyến trùng ñược sản xuất ra. Duy trì ñộ ẩm cao ở nơi ñặt bình tam giác ñể nhân ủ là rất tốt. Việc sản suất và bảo quản IJs cần tính toán thời gian phù hợp ñể không làm giảm khả năng xâm nhiễm của IJs. Sản xuất in vitro chỉ nên ñược tiến hành 4-6 tháng trước khi sử dụng ñể tránh làm giảm ñộc tố và khả năng gây bệnh của tuyến trùng ñối với vật chủ của nó. Mặt khác cũng cần quan tâm thích ñáng ñể duy trì các ñiều kiện thích hợp cho sinh trưởng, phát triển và bảo quản ñể làm giảm nguy cơ về vấn ñề chất lượng tuyến trùng. Nhìn chung, người sản xuất tuyến trùng cần phải lường trước ñược các vấn ñề có thể xẩy ra. ðể làm ñược như vậy người nhân nuôi cần ñược trang bị kiến thức về hệ thống nhân nuôi ñể chủ ñộng theo dõi và phản ứng hợp lý ñối với các thay ñổi mang tính thủ tục. Cùng với một vài hiểu biết về sinh học tuyến trùng, các nguyên nhân và giải pháp khắc phục. Thậm chí như vậy sản Khoá luận tốt nghiệp SVTH: Lưu Văn Thuyết 44 xuất in vitro cũng không phải là dễ dàng, vì vậy, các thử thách và sự cố sẽ rất cần thiết cho người tập sự ñể làm hoàn thiện hệ thống sản xuất. 4.3.8. Bảo quản IJs Sau khi thu hoạch và làm sạch, tuyến trùng có thể ñược chứa trong nước cất với 1 giọt Triton X-100 (Tác nhân làm ẩm và ngăn chặn tuyến trùng dính vào bên trong cốc) hoặc 0.1% formalin (chỉ sử dụng khi sự ô nhiễm trở thành một vấn ñề quan trọng). Nếu bảo quản trong ñiều kiện không sục khí thì nồng ñộ IJs không nên quá 10-20.000 IJs/ml và ñộ sâu của nước nên duy trì ở mức 1cm hoặc ít hơn. Các bình tam giác hoặc bình nuôi cấy tế bào là dụng cụ lí tưởng bảo quản tuyến trùng. Trong ñiều kiện ñược thông khí (dùng bơm sủi hoặc bất kỳ thiết bị cung cấp khí nào) có thể bảo quản tuyến trùng ở nồng ñộ 100.000 IJs/ml. Các chủng Steinernema có thể ñược bảo quản tốt nhất ở nhiệt ñộ 4-100C trong 6- 12 tháng mà không mất hoạt tính. Các chủng Heterorhabditis thường không ñể lâu ñược như vậy, chỉ từ 2-4 tháng ở 4-100C. Nếu thấy có hiện tượng tạo búi ở Heterorhabditis cần bổ sung với nồng ñộ 1gr/50ml nước (hoặc nhiều hơn ) ñể làm tan các búi này mà không ảnh hưởng gì ñến tuyến trùng. Nhìn chung, các chủng tuyến trùng của việt nam có khả năng bảo quản lâu và có thể bảo quản ở nhiệt ñộ cao hơn. Kết quả thí nghiệm bảo quản IJs trong nước ở nhiệt ñộ 120C với mật ñộ 20.000 IJs/ml, thì 2 chủng S-TX1 và S-TX4 của loài Sterinerna sangi có thể giữ ñược 6-12 tháng và ñộng lực diệt sâu vẫn còn. Trong khi ñó, với ñiều kiện bảo quản tương tự, 2 chủng H-MF11 và H-TN3 của loài Herterohabditis indica có thể sống và giử ñược ñộng lực trong thời gian 4-8 tháng. Có thể bảo quản IJs bằng xốp Polyerher polyurethane. Dùng xốp ấm ñã hấp sạch ñể chứa IJs của Steinerma với số lượng tuyến trùng bằng 10 lần khối Khoá luận tốt nghiệp SVTH: Lưu Văn Thuyết 45 lượng của xốp. ñặc cốc vào trong bình vô trùng và xục khí qua một màng lọc vi khuẩn (0.45µm). Vắt xốp cho hết nước ñến khi tuyến trùng ra khỏi xốp. Việc tách lọc này thường tốn nhiều thời gian và không thích hợp cho việc thương mại nhưng rất thích hợp cho mục ñích nghiên cứu. Bảo quản IJs trong than hoạt tính và ñặc biệt bảo quản IJs ở trạng thái khô ñể IJS không hoạt ñộng là một trong những hướng mới khả thi ñang ñược nhiều người quan tâm nghiên cứu (Yukawa & Pitt 1985). Khoá luận tốt nghiệp SVTH: Lưu Văn Thuyết 46 CHƯƠNG 5: HIỆU LỰC PHÒNG TRỪ SÂU HẠI CỦA MỘT SỐ CHỦNG EPN 5.1. Cơ sở ñánh giá hiệu lực gây chết của các chủng EPN Mặc dù hầu hết các chủng /loài tuyến trùng EPN có thể ký sinh gây bệnh cho nhiều loài sâu hại khác nhau thuộc một số bộ côn trùng chính như Lepidoptera, Coleoptera, Diptera, Orthoptera, vv... nhưng khả năng kí sinh gây chết vật chủ của các chủng tuyến trùng trên từng ñối tượng sâu hại lại là rất khác nhau. Do vậy, ñể có cơ sở phòng trừ thành công ñối với mỗi loại sâu hại cần phải ñưa ra các quyết ñinh là : i) Sử dụng loại tuyến trùng nào ñể cho kết quả cao nhất ; ii) nồng ñộ và liều sử lí; iii) thời ñiểm nào của sâu hại xuất hiện trên ñồng ruộng cần xử lí; iv) cách phun rải tuyến trùng trên ñồng ruộng ,trong trường hợp phòng trừ các loại sâu hại các phần cây trồng trên mặt ñất, trong thân cây thì cần phối chế với những chất thích hợp ñể giữ ẩm và tăng khả năng bám dính của tuyến trùng. ðể có ñược các quyết ñịnh như trên cần thiết phải tiến hành thử nghiệm, ñánh giá khả năng ký sinh gây chết vật chủ sâu hại của từng chủng tuyến trùng ñối với mỗi loại sâu hại. Các chỉ tiêu cần ñánh giá bao gồm : i) chỉ số LC50 ( lethal concentraion) - tức là nồng ñộ tuyến trùng mà ở ñây ñược hiểu là số lượng tuyến trùng cảm nhiễm gây chết 50% sâu hại thử nghiệm (trong trường hợp thử nghiệm tuyến trùng EPN chỉ tiêu LC50 này cũng ñồng nghĩa với chỉ tiêu LD50 (Lethal does) hay liều lượng gây chết 50%). Một chủng tuyến trùng có LC50 càng thấp chứng tỏ có ñộc lực của tổ hợp tuyến trùng vi khuẩn càng mạnh, ñồng thời cũng chứng tỏ là loài sâu hại mẫn cảm với tuyến trùng. ii) chỉ số TL50 (Lethal time) là thời gian gây chết 50% sâu hại thử nghiệm. Thời gian này càng ngắn cũng có nghĩa hoạt tính gây chết của chủng EPN càng mạnh và cũng chứng tỏ là loài sâu hại mẫn cảm với tuyến trùng iii) một chỉ tiêu nữa cũng cho phép ñánh giá về hoạt tính của một chủng tuyến trùng ñối với một ñối tượng sâu Khoá luận tốt nghiệp SVTH: Lưu Văn Thuyết 47 hại là khả năng sinh sản của tuyến trùng trong cơ thể côn trùng. Sản lượng tuyến trùng cảm nhiễm ñược sinh ra trong xác chết của sâu hại càng lớn chứng tỏ ñối tượng sâu hại thử nghiệm là vật chủ thích hợp ñối với 1 chủng tuyến trùng ký sinh. Tuy nhiên, trong thực tế chỉ cần xác ñịnh LC50 cơ sở ñể kết luận về ñộc lực của một chủng EPN. ðể xác ñịnh LC50 cần thiết kế thí nghiệm với ít nhất 10 công thức thí nghiệm với nồng ñộ khác nhau từ thấp ñến cao và một công thức ñối chứng. ðối với ña số sâu hại nồng ñộ phơi nhiễm thường từ 10 – 100 IJs/sâu hại: Mỗi công thức thí nghiệm thường sử dụng 5 sâu hại cùng lứa tuổi, mỗi sâu ñược ñặt riêng lẻ trong 1 ñĩa petri (35 x 15mm) trên giấy lọc ẩm. Mỗi ñĩa sâu thí nghiệm cho một lượng chính xác IJs cần thiết. Thí nghiệm ñược theo dõi chính xác trong 5 ngày ở ñiều kiện phòng thí nghiệm. Sau 5 ngày tất cả các sâu chết ñược chuyển sang bẫy nước (White trap) và ủ 5 – 7 ngày ñể thu lại tuyến trùng ( Cabanillas & Raulston, 1994). ñể sử lý thống kê các thí nghiệm như vậy ít nhất phải ñược lập lại 3 – 5 lần, tuỳ thuộc khả năng cung cấp sâu thí nghiệm. 5.2. Hiệu lực gây chết của một số chủng EPN trong ñiều kiện phòng thí nghiệm 5.2.1. Hiệu lực gây chết sâu hại của chủng S-TK10 Khả năng kí sinh và hiệu lực gây chết của chủng tuyến trùng S-TK10 ñã ñược thử nghiệm với 5 ñối tượng sâu hại quan trọng và rất phổ biến ñối với các cây trồng ở việt nam. Khoá luận tốt nghiệp SVTH: Lưu Văn Thuyết 48 Bảng 5.1: Hiệu lực gây chết sâu khoang của chủng S-TK10 (nhiệt ñộ : 21,3-26,10C; ñộ ẩm: 80-86%) Số lượng IJs Số sâu TN Số sâu chết Tỷ lệ chết % 10 20 3 15.0 20 20 7 35.0 30 20 9 45.0 40 20 12 60.0 50 20 13 65.0 60 20 12 60.0 70 20 13 65.0 80 20 15 75.0 90 20 15 75.0 100 20 17 85.0 Bảng 5.2: Hiệu lực gây chết sâu xanh bướm trắng của chủng S-TK10 (nhiệt ñộ: 21,1-25,40C: ñộ ẩm: 77-90%) Số lượng IJs Số sâu TN Số sâu chết Tỷ lệ (%) 5 20 5 25.0 10 20 7 35.0 15 20 8 40.0 20 20 12 60.0 25 20 13 65.0 30 20 17 85.0 35 20 18 90.0 40 20 20 100 Khoá luận tốt nghiệp SVTH: Lưu Văn Thuyết 49 Kết quả thí nghiệm cho thấy S-TK10 có khả năng ký sinh gây chết sâu xanh bướm trắng rất cao, chỉ với những nồng ñộ phơi nhiễm ban ñầu rất thấp là 5 và 10 IJs thì tỷ lệ sâu chết ñã ñạt 25 và 35%. Ở công thức nồng ñộ phơi nhiễm 35 và 40 IJs thì tỷ lệ chết của sâu xanh bướm trẵng ñã ñạt tới 90 và 100%. Bảng 5.3: Hiệu lực gây chết bọ hung ñen của chủng S-TK10 (nhiệt ñộ: 25,2-28,30C: ñộ ẩm :71-87%) Số lượng IJs Số sâu TN Số sâu chết Tỷ lệ chết (%) 100 50 5 10.0 200 50 10 20.0 400 50 15 30.0 600 50 17 34.0 800 50 15 30.0 1000 50 20 40.0 1200 50 20 40.0 1600 50 22 44.0 2000 50 29 58.0 5000 50 40 80.0 Thí nghiệm trên bọ hung ñen trưởng thành ñược bố trí 10 công thức nồng ñộ cao từ 100 ñến 5000 IJs và mỗi công thức thí nghiệm sử dụng 10 bọ hung ñen, nhắc lại 5 lần. Tổng cộng có 500 bọ hung ñen ñược sử dụng cho thí nghiệm này. Sau 5 ngày phơi nhiễm, tỷ lệ bọ hung chết là 10% ở công thức nồng ñộ 100 IJs. Tỷ lệ chết tăng lên mức 30% trở lên ở các công thức nồng ñộ phơi nhiễm 400, 600, 800 IJs. Sau ñó tỷ lệ chết tăng chậm và ñến số lượng 2000 Khoá luận tốt nghiệp SVTH: Lưu Văn Thuyết 50 IJs thì mới gây chết ñược 58%. Ở công thức nồng ñộ cao nhất là 5000 IJs thì tỷ lệ bọ hung chết ñạt 80%. 5.2.2. Hiệu lực phòng trừ sâu của S-TX1 Chủng tuyến trùng S-TX1 cũng ñược thủ nghiệm trên 3 loài sâu hại là sâu xanh (Helicoverpa armigera Hubner), sâu tơ (Plutella xylostella Linnaeus) và bọ hung ñen (Alissonotum impressicolle Arrow). Thí nghiệm trên sâu xanh, ñược thiết kế với 10 công thức nồng ñộ, từ 1 ñến 100 IJs. Mỗi công thức 5 sâu xanh, lặp lại 4 lần và tất cả 255 sâu xanh ñược sử dụng cho thí nghiệm. Kết quả thí nghiệm cho thấy sau 5 ngày theo dõi, ở công thức nồng ñộ phơi nhiễm 1 IJs ñã không có sâu chết ñược ghi nhận, tỷ lệ sâu chết ñược ghi nhận là 10% ở công thức nồng ñộ phơi nhiễm IJs và tỷ lệ này tăng lên ñến 15% rồi 30% ở các công thức số lượng 10 và 20 IJs. ðến các công thức nồng ñộ phơi nhiễm 80 và 100 IJs thì tỷ lệ chết ñạt 100%. Bảng 5.4: Hiệu lực gây chết sâu xanh của chủng S-TX1 Số lượng IJs Số sâu TN Số sâu chết Tỷ lệ (%) 1 20 0 0 5 20 2 1 0.0 10 20 3 15.0 20 20 6 30.0 30 20 11 55.0 40 20 15 75.0 50 20 14 70.0 60 20 18 90.0 80 20 20 100 100 20 20 100 LC50 = 18 Khoá luận tốt nghiệp SVTH: Lưu Văn Thuyết 51 Giá trị LC50 của chủng S-TX1 là 18 IJs cho thấy sâu xanh khá mẫn cảm ñối với chủng tuyến trùng này, mặc dù ñây là ñồi tượng có khả năng kháng mạnh với các loài thuốc hoá học. Thí nghiệm hiệu quả diệt sâu của chủng S-TX1 ñược tiến hành trong 10 công thức từ 10- 50 IJS. Và với bốn lần lặp lại như thế thì tỷ lệ sâu chết là 95% và 100% ở nồng ñộ 50IJs. Kết quả trên cũng phù hợp với các kết quả nghiên cứu gần ñây sử dụng một số chủng EPN ñể phòng trừ sâu tơ hại rau ở Malaysia CHLBð và Anh cũng có kết quả khá tốt. Các thử nghiệm xác ñịnh hiệu lực gây chết của chủng S-TX1 ñối với bọ hung ñen trưởng thành ñược tiến hành với 10 công thức nồng ñộ từ 100-5000IJS mỗi công thức lập lại 5 lần. Kết quả cho thấy bọ hung bắt ñầu chết với tỷ lệ 10% ở nồng ñộ 100IJS và tỷ lệ chết 82% của bọ hung là ở nồng ñộ 5000IJS. Giá trị LC50 = 1286 IJS là thấp hơn so với chủng S-TK10; như vậy mặc dù cả hai ñiều diệt ñược bọ hung nhưng chủng tuyến trùng S-TX1 hiệu quả hơn so với tuyền trùng trưởng thành. 5.2.3. Hiệu lực gây chết của chủng H-MP11 Hiệu lưc gây chết của chủng H-MP11 ñược ñánh giá với bốn ñôi tượng sâu hại: sâu xanh (helicoverpa armigera huber), sâu keo da láng (Spodoteraexigua hubner), sâu tơ (plutella xylostella linnaeus), bọ hung ñen (Alissonotum impressicolle Arrow). Thử nghiện trên ñược tiến hành với 10 công thức từ 1-100IJS. kết quả như sau:15% sâu xanh chết với công thức 5IJS, ñến tỷ lệ 50IJS thì sâu xanh chết ở 50%, tỷ lệ chết này ñạt cao nhất là 75% ở nồng ñộ 100IJS. Bảng 5.5: Hiệu lực gây chết sâu xanh của H-MP11. (Nhiệt ñộ:24.3-27.90C: ñộ ẩm:80-90%) Khoá luận tốt nghiệp SVTH: Lưu Văn Thuyết 52 Số lượng IJs Số sâu TN Số sâu chết Tỷ lệ (%) 1 20 0 0 5 20 3 15.0 10 20 5 25.0 20 20 6 30.0 30 20 5 40.0 50 20 11 55.0 60 20 11 55.0 80 20 11 55.0 Giá trị LC50 của M-MP11 ñối với sâu xanh trong thí nghiệm này là 45IJS cao hơn nhiều so với LC50 của S-TX1 chứng tỏ khả năng ký sinh của H-MP11 thấp hơn so với S-TX1. Tuy nhiên trong thực tế cho thấy chủng H-MP11 chúng rất mẫn cảm với sâu xanh da láng chúng diệt khoảng 93-100% sâu. Bảng 5.6: Hiệu lực diệt sâu xanh da láng của H-MP11 Số lượng IJs Số sâu TN Số sâu chết Tỷ lệ chết (%) 10 16 10 62.5 20 16 9 56.3 30 16 13 81.3 40 16 12 75.0 50 16 13 81.3 60 16 13 81.3 70 16 14 87.5 80 16 16 100 90 16 15 93.8 100 16 16 100 LC50=12 Khoá luận tốt nghiệp SVTH: Lưu Văn Thuyết 53 Thử nghiệm với sâu tơ ñã ñược kiểm chứng với 10 công thức nồng ñộ phơi nhiễm từ 5 ñến 50 IJs. Mỗi công thức 5 sâu, nhắc lại 4 lần với nồng ñộ số là 225 sâu. Thí nghiệm cho thấy nồng ñộ phơi nhiễm IJs là 50%. Ở công thức cao nhất 50 IJs thì tỷ lệ sâu tơ ñạt cao nhất là 95%. 5.2.4. Hiệu lực gây chết của chủng H-NT3 Chủng tuyến trùng H-NT3 là một trong 2 chủng của loài tuyến trùng Heterorhabditis indica ở Việt Nam ñược coi là một trong những chủng tuyến trùng bản ñịa có rất nhiều ưu ñiểm nổi bật như khả năng di chuyển tốt và năng sinh sản cao trong cơ thể côn trùng vật chủ. Nghiên cứu khả năng gây chết sâu hại của chủng H-NT3 ñược tiến hành trên 5 ñối tượng sâu hại là sâu keo da láng, sâu xám, sâu khoang, sâu tơ, và bọ hung ñen. Thử nghiệm ñánh giá khả năng gây chết của sâu da láng của chủng H- NT3 ñược tiến hành với 9 công thức nồng ñộ gây nhiễm từ 10 ñến 100 IJs. Mỗi công thức gồm 8 sâu, Lặp lại 4 lần với tổng số 320 sâu trong thử nghiệm này. Bảng 5.7: Hiệu lực gây chết sâu keo da láng ở chủng H-NT3 (Nhiệt ñộ: 27,9-28,90C: ðộ ẩm: 79-84%) Số lượng IJs Số sâu TN Số sâu chết Tỷ lệ chết (%) 10 32 20 62.5 20 32 20 62.5 30 32 20 62.5 40 32 20 62.5 50 32 22 68.7 60 32 22 75.0 70 32 28 87.5 80 32 32 100 100 32 32 100 Khoá luận tốt nghiệp SVTH: Lưu Văn Thuyết 54 Trong thí nghiệm này sâu keo da láng bắt ñầu chết ở các công thức nồng ñộ 10, 20, 30, 40 IJs ñều với tỷ lệ khá cao là 62,5 % công thức 80 và 100 IJs thì tỷ lệ chết là 100%. Giá trị LC50=14 IJs ñối với sâu keo da láng cho thấy sự mẫn cảm của sâu này ñối với chủng tuyến trùng H-TN3. Giá trị này mặt dù cao hơn một chút so với chủng H-MP11 nhưng ñều là chủng có tiềm năng lớn trong ñề phòng sâu keo da láng. ðánh giá khả năng gây chết của H-NT3 trên sâu xám ñược tiến hành với 10 công thức nồng ñộ từ 20 ñến 200 IJs. Mỗi công thức sử dụng 10 sâu, lặp lại 3 lần với tổng số 300 sâu cho thử nghiệm. Kết quả thử nghiệm cho thấy, ở công thức nồng ñộ thấp nhất 10 IJs mới chỉ có 17,6% số lượng sâu xám chết và tỷ lệ chết tăng lên ở các công thức nồng ñộ cao hơn và ñạt giá trị cực ñại là 88,2% ở công thức nồng ñộ phơi nhiễm 200 IJs. Giá trị LC50 ñối với sâu xám là 80 IJs. Mặc dù giá trị này tương ñối cao so với một số sâu hại khác ñược thử nghiệm nhưng cũng thể hiện ñược ñộc lực của các chủng H-NT3 ñối với sâu xám khá cao, cũng có nghĩa là sâu xám là ñối tượng khá mẫn cảm với chủng H-NT3. Bảng 5.8: Hiệu lực gây nhiễm sâu xám của chủng H-NT3 (Nhiệt ñộ: 25,2-27,70C: ðộ ẩm:84-87%) Số lượng IJs Số sâu TN Số sâu chết Tỷ lệ chết (%) 20 34 6 17.6 40 34 10 29.4 60 34 12 35.3 80 34 14 41.2 100 34 17 50.0 120 34 20 58.8 140 34 23 67.6 LC50=80 Khoá luận tốt nghiệp SVTH: Lưu Văn Thuyết 55 ðối với bọ hung ñen, thử nghiệm xác ñịnh hiệu lực gây chết của chủng H-NT3 ñược tiến hành với 10 công thức nồng ñộ từ 100 ñến 5000 IJs. Mỗi công thức nồng ñộ gồm 10 bọ hung ñược sử dụng cho thử nghiệm. kết quả thí nghiệm ñã ghi nhận: Có 12% bọ hung ñen chết sau 5 ngày phơi nhiễm ở nồng ñộ phơi nhiễm 100 IJs và tỷ lệ này tăng lên 52% ở công thức nồng ñộ 1200 IJs. Tỷ lệ bọ hung chết cao nhất à 90% ở công thức nồng ñộ phơi nhiễm 5000 IJs. Bảng 5.9: Hiệu lực gây chết bọ hung ñen của chủng H-TN3 ( Nhiệt ñộ: 25,2-27,40C: ðộ ẩm: 79-92%) Số lượng IJs Số sâu TN Số sâu chết Tỷ lệ chết (%) 100 50 6 12.0 200 50 8 16.0 400 50 13 26.0 600 50 15 30.0 800 50 18 36.0 1000 50 21 42.0 1200 50 26 52.0 1600 50 29 58.0 2000 50 32 64.0 5000 50 45 90.0 LC50=1070 Giá trị LC50 của H-NT3 ñối với bọ hung ñen là 1070 IJs là tương ñương với LC50 của MP11 (1077IJs) là thấp hơn so với các chủng Steinernema ñã thử nghiệm. Các kết quả ñánh giá hiệu lực gây chết một số loài sâu hại của 4 chủng tuyến trùng bản ñịa Việt Nam ñều có chỉ số LC50 khá thấp. Thông thường một chủng tuyến trùng có chỉ số LC50 nhỏ hơn 100 IJs ñối với một loài sâu hại Khoá luận tốt nghiệp SVTH: Lưu Văn Thuyết 56 ñược coi là tiềm năng ñể trở thành tác nhân sinh học trong phòng trừ loài sâu hại. Các thử nghiệm trên ñây cho thấy cả 4 chủng tuyến trùng ở Việt Nam ñều là những chủng có tiềm năng phòng trừ một số loài sâu hại quan trọng ở Việt Nam. ðối với bọ hung ñen, mặc dù giá trị LC50 của cả 4 chủng EPN ñều cao hơn 1000 IJs, nhưng kết quả này cũng phù hợp với công bố của các tác giả ở Trung Quốc (Wang & Li, 1987). Mặc dù, nghiên cứu không chỉ ra ñược LC50 nhưng ñã cho biết kết quả thử nghiệm với nồng ñộ phơi nhiễm 2500 IJs trên một bọ hung ñen thì có 5 trong số 9 chủng EPN của trung quốc ñã gây chết bọ hung ñen với tỷ lệ 56,5-100% sau 7 ngày phơi nhiễm. So với kết quả này thì cả 4 chủng EPN của Việt Nam cũng ñều có tiềm năng trở thành tác nhân sinh học trong phòng trừ bọ hung ñen. Việc xác ñịnh LC50 cho mỗi chủng tuyến trùng ñối với loại sâu hại không những cho biết lực của mỗi EPN ñối với mỗi loại sâu hại mà còn chỉ ra liều xử lý thích hợp cho từng loại sâu. Trên cơ sở xác ñịnh LC50 của các chủng tuyến trùng thử nghiệm, cho phép thiết kế các thử nghiệm phòng trừ tiếp theo ở quy mô nhà kính trước khi tiến hành các thử nghiệm ngoài ñồng. Khoá luận tốt nghiệp SVTH: Lưu Văn Thuyết 57 CHƯƠNG 6: KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 6.1. Kết luận Khóa luận ñã tổng hợp ñược vai trò của biện pháp sinh học trong phòng trừ tổng hợp sâu hại cây trồng. Trong số các tác nhân sinh học ứng dụng trong phòng trừ sâu hại thì tuyến trùng có vị trí khá quan trọng vì phổ ký chủ rộng. Tuyến trùng ký sinh có thể sản xuất theo phương pháp in vivo và in vitro. Cả hai phương pháp này có thể thực hiện và phát triển ñược trong ñiều kiện của Việt Nam vì ñều dựa trên những nguyên vật liệu dễ tìm và trang thiết bị khá ñơn giản. Với vốn kiến thức về Công nghệ Sinh học ñã ñược trang bị, sinh viên có thể tự sản xuất hoặc tham gia sản xuất tuyến trùng ñể trừ sâu hại. 6.2. ðề nghị Mở rộng và khuyến khích các ñề tài nghiên cứu về tuyến trùng kí sinh gây bệnh con trùng. ðưa các chế phẩm sinh học từ tuyến trùng vào sử dụng rộng rải thay thế và giảm dần các biện pháp phòng trừ hoá học không tốt cho môi trường sinh thái và sức khoẻ con người. Khoá luận tốt nghiệp SVTH: Lưu Văn Thuyết 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng việt 1. Nguyễn Ngọc Châu, 2008. Tuyến trùng kí sinh gây bệnh côn trùng ở Việt Nam, NXB Khoa học Tự nhiên và Công nghệ. 2. Nguyễn văn Tuất, 2004. Nghiên cứu sử dụng thuốc sâu sinh học ña chức năng cho một loại cây trồng bằng kỹ thuật công nghệ sinh học. 3. Phạm Thị Mến, 2009. Nghiên cứu môi trường nhân nuôi tuyến trùng kí sinh gây bệnh con trùng và ñánh giá hiệu lực ứng dụng ngoài ñồng, luận văn ðH-NL,TP.HCM. 4. Phạm Thị Thuỳ, 2010. Công nghệ sinh học trong bảo vệ thực vật, NXB giáo dục Việt Nam. Trang 19 – 26 Tiếng nước ngoài 5. Norberto Chavarr´ia-Hernandez & Mayra de la Torre´. 2001. Population growth kinetics of the nematode, Steinernema feltiae, in submerged monoxenic culture. Biotechnology Letters, 23: 311 – 315 6. .Nuchanart Tangchitsomkid, Suebsak Sontirat and J. Chanpaisaeng. 1999. Monoxenic culture of a new Thai strain of entomopathogenic nematodes (Steinernema sp. KB Strain) on artificial media. Thammasat Int. J. Sc. Tech.,Vol.4, No.1: 49 – 53 7. Ralf - Udo Ehlers. 1996. Current and future use of nematodes in biocontrol: practice and commercial aspects with regard toregulatory policy issue. Biocontrol Science and Technology, 6: 303 - 316. 8. Simard L., G. Belair, M.-E. Gosselin and J. Dionne. 2006. Virulence of entomopathogenic nematodes (Rhabditida: Steinernematidae, Heterorhabditidae) against Tipula paludosa ( Diptera: Tipulidae), a turfgrass pest on golf courses. Biocontrol Science and Technology, 16: 789 – 801 Khoá luận tốt nghiệp SVTH: Lưu Văn Thuyết 59 Internet 9. 10. 11. Nematodes (Rhabditida: Steinernematidae & Heterorhabditidae) 12.