Khóa luận Tổng quan quy trình kiểm soát chất lượng sản xuất bia

trong dung dịch HgCl2 bảo hòa đã pha loãng (1+1000). Làm vỡ các vỏ trứng một cách vô trùng, tách riêng long trắng và lòng đỏ. Trộn lòng đỏ với dung dịch muối sinh lý theo tỷ lệ (3+7, tính theo thể tích), dùng bộ trộn tốc độ cao để trộn trong khoảng 5s. Cho vào 5ml nhũ tương lòng đỏ trứng 10ml dung dịch kali tellurit 1% đã lọc để khử trùng (khối lượng trên thể tích). Trộn đều và bảo quản ở nhiệt độ 40C ± 10C. A.4.3. Môi trường hoàn chỉnh Cho 5ml môi trường tăng sinh vào 95ml môi trường cơ bản đã được làm ấm đến nhiệt độ từ 450C đến 500C. Trộn kỹ, tránh tạo bọt và rót các lượng từ 15ml đến 18ml vào các đĩa petri vô trùng có kích thước 100mm × 15mm. Bào quản các đĩa này ở nhiệt độ phòng (250C) đến 5 ngày trước khi sử dụng. Môi trường này phải mờ đục đều, không sử dụng các đĩa không mờ đục. Làm khô các đĩa trước khi sử dụng theo một trong các phương pháp sau đây: Mở nắp đĩa, úp bề mặt thạch xuống, đặt vào tử thong gió hoặc tủ ấm 30 phút ở 500C. Đậy nắp đĩa và đặt vào tủ không khí cưỡng bức hoặc tủ ấm trong 2h ở 500C. Đậy nắp đĩa và đặt vào tủ ấm trong 4h ở 350C. Đậy nắp đĩa và để trên bàn của phòng thử nghiệm từ 16h đến 18h ở nhiệt độ phòng. A.4.4. Canh thang tim –não (BHI) Hòa tan dịch chiết từ khoảng 200g não bê và 250g tim bò, 10g pepton proteoza hoặc Gelysat, 5g NaCl, 2,5g Na2HPO4.12H2O và 20g glucoza trong 1000ml nước, đun nóng nhẹ, nếu cần. Phân phối các lượng 5ml vào các ống nghiệm có kích thước 16mm× 150mm và hấp áp lực 15 phút ở 1210C. Độ pH cuối cùng phải là 7,3 ± 0,2. A.4.5. Huyết tương coagulaza khô (thỏ) với EDTA Hoàn nguyên theo chỉ dẫn của nhà sản xuất. Nếu không sẵn có, thì hoàn nguyên huyết tương coagulaza khô (thỏ) và thêm Na2H2EDTA để có được nồng độ cuối cùng là 0,1% trong huyết tương đã hoàn nguyên. Hình 3.4. Kiểm tra S.aureus với coagulase A.4.6. Dịch nha loạng phosphate đệm Butterfield A.4.6.1. Dung dịch gốc. Hòa tan 34g KH2PO4 trong 500ml nước, dùng khoảng 175ml dung dịch NaOH 1M để chỉnh pH đến 7,2 và pha loãng đến 1000ml. Bảo quản trong tủ lạnh. A.4.6.2. Dịch pha loãng Pha loãng 1,25ml dung dịch gốc đến 1000ml bằng nước. Dùng dung dịch này để chuẩn bị các dung dịch trắng, phân phối các lượng đủ, có tính đến hao hụt trong khi hấp áp lực. Hấp áp lực 15 phút ở 1210C. Thiết bị, dụng cụ Pipet, dung dịch 1ml, 5ml, 10ml được chia vạch tương ứng là 0,1ml, 0,5ml, 1ml. Bộ trộn, vận hành với tốc độ cao từ 16000 r/min đến 18000 r/min, có trang bị các bình trộn bằng kim loại hoặc thủy tinh 1000ml, có nắp đậy. Một bình được dùng cho mỗi đơn vị phân tích. Máy trộn, Vortex Genie hoặc loại tương đương Nồi cách thủy, duy trì được ở nhiệt độ từ 350C đến 370C Tủ ấm, duy trì được ở nhiệt độ từ 350C đến 370C. Cách tiến hành: C.1. Chuẩn bị mẫu thử Cân một cách vô trùng khoảng 50g mẫu thử chưa rã đông cho vào bình trộn vô trùng. Thêm 450ml dịch pha loãng đệm phosphate và đồng hóa trong 2 phút ở tốc độ cao (từ 16000 r/min đến 18000 r/min). Sử dụng dịch pha loãng 1:10 này để chuẩn bị các dãy dịch pha loãng từ 10-1-10-6 bằng cách chuyển 10ml dịch pha loãng 1: 10 vào 90ml dịch pha loãng trắng, lắc mạnh để trộn kỹ và tiếp tục cho đến khi thu được dịch pha loãng 10-6. C.2. Kỹ thuật tính số có xác suất lớn nhất Cấy vào 3 ống đựng canh thang trypticaza đậu tương với NaCl 10% và Natri pyruvat 1% ở mỗi độ pha loãng với các lượng 1ml của dịch pha loãng thập phân. Cần có đủ độ pha loãng từ phần mẫu thử để có được điểm kết thúc âm tính. Ủ ấm trong 48h ở 350C. Sử dụng vòng cấy 3mm, chuyển một vòng cấy đầy từ mỗi ống phát triển dương tính sang đĩa đựng môi trường Baird- Parker khô. Trộn các ống nghiệm trên máy trộn Vortex trước khi ria cấy nếu chỉ thấy mọc ở trên đáy hoặc trên thành ống. Ria cấy sao cho thu được các khuẩn lạc mọc tách biệt. Ủ 48h ở 350C đến 370C. C.3. Khẳng định Đối với mỗi ống cho thấy có sự phát triển, lấy một hoặc nhiều hơn các khuẩn lạc nghi ngờ là S.aureus. Dùng kim cấy vô trùng chuyển các khuẩn lạc sang ống chức 0,2ml canh thang BHI và các mặt nghiêng của thạch chứa môi trường duy trì thích hợp bất kì. Giữ lại các chủng cấy trên ống thạch ở nhiệt độ phòng để dự phòng hoặc lặp lại phép thử trong trường hợp nghi ngờ. Cho 0,5ml huyết tương coagulaza có EDTA hoàn nguyên vào dịch cấy BHI và trộn kỹ. Ủ ấm ở nhiệt độ từ 350C đến 370C cứ sau 6h kiểm tra sự kết đông. Bất kỳ sự kết đông nào cũng coi là phản ứng dương tính. Các cục kết đông nhỉ hoặc thưa có thể quan sát được bằng cách gõ nhẹ ống sao cho phần chất lỏng của hỗn hợp phản ứng chạm tới miệng ống, các cục đông sẽ nhô ra phía trên bề mặt chất lỏng. Các chủng dương tính coagulaza được coi là S.aureus. Các phép kiểm chứng âm tính và dương tính phải được thực hiện đồng thời với các chủng cấy của khả năng phản ứng coagulaza chưa biết. Kiểm tra lại các kết quả thử nghiệm coagulaza nghi ngờ trên các chủng cấy BHI đã được ủ ấm ở 350C đến 370C từ 18h đến 48h. C.4. Diễn giải kết quả Các khuẩn lạc của S. aureus điển hình tròn, trơn nhẵn, lồi, ướt, có đường kính từ 2mm đến 3mm trên các đĩa mọc thưa, có màu đen xám đến đen nhánh, thường có viền sáng màu (không trắng), có quầng đục bao quanh (kết tủa) và thường có vùng trong phía ngoài, các khuẩn lạc dính khi tiếp xúc với kim cấy. Đôi khi có gặp phải các chủng không phân giải lipit có vẻ bề ngoài tương tự, ngoại trừ không có quầng đục bao quanh và các vùng sáng. Các khuẩn lạc được phân lập từ các loại thực phẩm khô hoặc đông lạnh đã được bảo quản trong khoảng thời gian dài thường ít đen hơn các khuẩn lạc điển hình và có thể có dạng bên ngoài thô nhám và cấu trúc khô. Biểu thị kết quả Tính số có xác suất lớn nhất (MPN) của S.aureus trên gam sảm phẩm từ bảng 3.9 Bảng 3.9- Các số có xác suất lớn nhất (MPN) trên gam phần mẫu thử, sử dụng 3 ống có các phần mẫu thử tương ứng là 0,1g, 0,01g, 0,001g Các ống dương tính Các ống dương tính Các ống dương tính Các ống dương tính 0,1 0,01 0,001 MPN 0,1 0,01 0,001 MPN 0,1 0,01 0,001 MPN 0,1 0,01 0,001 MPN 0 0 0 <3 1 0 0 3,6 2 0 0 9,1 3 0 0 23 0 0 1 3 1 0 1 7,2 2 0 1 14 3 0 1 39 0 0 2a 6 1 0 2 11 2 0 2 20 3 0 2 64 0 0 3a 9 1 0 3a 15 2 0 3a 26 3 0 3a 95 0 1 0 3 1 1 0 7,3 2 1 0 15 3 1 0 43 0 1 1 6,1 1 1 1 11 2 1 1 20 3 1 1 75 0 1 2a 9,2 1 1 2a 15 2 1 2 27 3 1 2 120 0 1 3a 12 1 1 3a 19 2 1 3a 34 3 1 3 160 0 2 0 6,2 1 2 0 11 2 2 0 21 3 2 0 93 0 2 1a 9,3 1 2 1 15 2 2 1 28 3 2 1 150 0 2 2a 12 1 2 2a 20 2 2 2 35 3 2 2 210 0 2 3a 16 1 2 3a 24 2 2 3a 42 3 2 3 290 0 3 0 9,4 1 3 0 16 2 3 0 29 3 3 0 240 0 3 1a 13 1 3 1 20 2 3 1 36 3 3 1 460 0 3 2a 16 1 3 2a 24 2 3 2 44 3 3 2 1100 0 3 3a 19 1 3 3a 29 2 3 3a 53 3 3 3 >1100 a Các kết quả không chắc chắn cao như thế muốn nói rằng có mặt các yếu tố làm ảnh hưởng đến độ thu hồi hoặc nhận dạng đối với các dịch pha loãng thấp hơn. Do đó, giá trị MPN có thể thấp hơn nhiều so với nồng độ thực. Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ: Mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử; Phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết; Phương pháp thử đã sử dụng và viện dẫn tiêu chuẩn này; Mọi chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, cùng với các chi tiết bất thường khác có thể ảnh hưởng tới kết quả; Các kết quả thử nghiệm thu được. 3.6.2.5. Xác định Clostridium perfringens- phương pháp định lượng clostridium perfringens trên đĩa thạch - kỹ thuật đếm khuẩn lạc (Theo TCVN 4991 : 2005) A. Định nghĩa: A.1. Clostridium perfringen: Vi khuẩn hình thành các khuẩn lạc điển hình (kết tủa đen, do khử sunfit thành sunfua, làm cho màu khuẩn lạc bị đen) trong môi trường chọn lọc và cho các phản ứng dương tính khi thử bằng một trong hai kỹ thuật quy định trong tiêu chuẩn này. A.2. Định lượng C. perfringens: Xác định số lượng vi khuẩn C. perfringens mọc trên đĩa thạch và được khẳng định có trong một gam hoặc một ml mẫu khi phép thử được thực hiện theo phương pháp quy định trong tiêu chuẩn này. B. Nguyên tắc Các đĩa Petri được cấy một lượng mẫu thử qui định, nếu sản phẩm ban đầu ở dạng lỏng, hoặc một lượng huyền phù ban đầu qui định nếu các sản phẩm ở dạng khác. Đối với các đĩa Petri khác, trong cùng một điều kiện, sử dụng các dung dịch pha loãng thập phân của mẫu thử hoặc của huyền phù ban đầu. Rót môi trường chọn lọc (kỹ thuật rót đĩa) và sau đó phủ lên trên bằng chính môi trường này. Ủ trong điều kiện kỵ khí các đĩa ở 370C trong 20± 2h. Định lượng các khuẩn lạc điển hình. Khẳng định số lượng các khuẩn lạc điển hình và tính số lượng C.perfringens có trong một gam hoặc một mililit mẫu. C. Dịch pha loãng, môi trường cấy và thuốc thử Xem TCVN 6404 (ISO 7218), ISO/TS 11133-1 và ISO/TS 11133-2 để chuẩn bị và kiểm tra tính năng môi trường cấy. C.1. Dịch pha loãng Xem phần tương ứng của TCVN 6570 (ISO 6887) hoặc TCVN 6263(ISO 8261). C.2. Môi trường thạch sunfit xycloserin(SC) CHÚ THÍCH: Loại thạch này được chỉ rõ từ đầu “TSC không chứa lòng đỏ trứng” C.2.1. Môi trường cơ bản Thành phần Pepton từ protein 15,0g Pepton từ đậu tương 5,0g Cao nấm men 5,0g Dinatri disunfit (Na2S2O5), dạng khan 1,0g Amoni sắt (III) xitrata 1,0g Thạch 9,0g đến 18,0gb Nước 1000ml aThuốc thử này phải chứa ít nhất 15% (phần khối lượng ) sắt bTùy thuộc vào sức đông của thạch Chuẩn bị Hòa tan các thành phần trong nước bằng cách đun sôi. Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng là 7,6 ± 0,2 ở 250C. Phân phối môi trường cơ bản vào các bình hoặc chai có dung tích thích hợp. Khử trùng 15 phút trong nồi hấp áp lực ở 1210C. Bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 50C ± 30C. Môi trường chỉ được sử dụng trong vòng hai tuần sau khi chuẩn bị. Trong một số trường hợp, có thể cần phải chuẩn bị các đĩa môi trường cơ bản thạch SC để khẳng định với môi trường nitrat để thử tính di động và môi trường lactoza- gelatin. Đối với mục đích này, chuyển các phần khoảng 15ml môi trường cơ bản [đã được làm tan chảy và được làm nguội đến khoảng 440C đến 470C trong nồi cách thủy] sang các đĩa Petrivà để cho đông đặc lại. Làm khô đĩa(Xem TCVN 6404 (ISO 7218)ngay trước khi sử dụng). C.2.2. Dung dịch D-Xycloxerin Thành phần D-Xycloxerina 4,0g Nước 100ml a Chỉ sử dụng bột tinh thể trắng Chuẩn bị Hòa tan D-Xycloxerin trong nước và lọc dung dịch để khử trùng. Bảo quản trong tủ lạnh ở 30C ± 20C. Môi trường chỉ được sử dụng trong vòng 4 tuần sau khi chuẩn bị. C.2.3. Môi trường hoàn chỉnh Ngay trước khi sử dụng trong phương pháp rót đĩa, cứ 100ml môi trường cơ bản tan chảy vô trùng đã được làm nguội đến 440C đến 470C thì thêm 1 ml dung dịch D-Xycloxerin C.2.4. Thử tính năng để đảm bảo chất lượng môi trường SC Để xác định tính chọn lọc và năng suất, xem ISO/TS 11133-1. Để kiểm tra tính năng, xem ISO/TS 11133-2:2003 C.3.Môi trường thioglycolat lỏng Thành phần Pepton từ casein 15,0g L-Xystin 0,5g D-glucoza 5,5g Cao nấm men 5,0g Natri clorua 2,5g Natri thioglycolat (mercaptoaxetat) 0,5g Thạch 0,5g đến 2,0ga Resazurin 0,001g Nước 1000ml a Tùy thuộc vào sức đông của thạch Chuẩn bị Hòa tan các thành phần trong nước bằng cách đun sôi. Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng là 7,1 ± 0,2 ở 250C. Phân phối các phần 10ml vào các ống nghiệm và khử trùng 15 phút trong nồi hấp áp lực ở 1210C. Trước khi sử dụng, môi trường này phải được khử khí. Thử tính năng để đảm bảo chất lượng môi trường thioglycolat Để xác định tính chọn lọc và năng suất, xem ISO/TS 11133-1. Để kiểm tra tính năng, xem ISO/TS 11133-2 : 2003, Bảng B.4 C.4. Môi trường lactoza sunfit (LS) (tùy chọn) C.4.1. Môi trường cơ bản Thành phần Pepton từ casein 5,0g Cao nấm men 2,5g Natri clorua 2,5g Lactoza 10g L-Xystin hydroclorua 0,3g Nước 1000ml Chuẩn bị Hòa tan các thành phần trong nước bằng cách đun sôi (nếu cần). Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng là 7,1 ± 0,2 ở 250C. Phân phối vào các ống nghiệm có ống Durham mỗi ống 8ml môi trường và khử trùng 15 phút trong nồi áp lực ở 1210C. Môi trường này có thể bảo quản đến 4 tuần ở 30C ± 20C. C.4.2. Dung dịch dinatri disunfit Thành phần Dinatri disunfit (Na2S2O3), dạng khan 1,2g Nước 100ml Chuẩn bị Hòa tan Dinatri disunfit trong nước và lọc để khử trùng. Sử dụng dung dịch trong ngày. C.4.3. Dung dịch Amoni sắt (III) xitrat Thành phần Amoni sắt (III) xitrat 1g Nước 100ml Chuẩn bị Hòa tan Amoni sắt (III) xitrat trong nước và lọc để khử trùng. Sử dụng dung dịch trong ngày. C.4.4. Môi trường hoàn chỉnh Nếu môi trường không sử dụng trong ngày chuẩn bị, thì ngay lập tức khi kết thúc chuẩn bị, khử khí môi trường bằng cách đun nóng và làm nguội nhanh. Nếu môi trường đựng trong các chai có nắp vặn thì nới lỏng nắp trước khi gia nhiệt và vặn chặt lại ngay trước khi làm nguội. Cứ 8ml môi trường cơ bản thì bổ sung 0,5ml dung dịch dinatri disunfit và 0,5 ml dung dịch Amoni sắt (III) xitrat. Sử dụng dung dịch hoàn chỉnh trong ngày. C.5. Môi trường nitrat để khử tính di động (tùy chọn) C.5.1. Thành phần Pepton từ casein 5,0g Cao thịt 3,0g Galactoza 5,0g Glyxerol 5,0g Kali nitrat(KNO3) 1,0g Dinatri hidro octophotphat (Na2HPO4) 2,5g Thạch 1,0g đến 5,0ga Nước 1000ml aTùy thuộc vào sức đông của thạch C.5.2. Chuẩn bị Hòa tan các thành phần trong nước bằng cách đun sôi. Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng là 7,3 ± 0,2, ở 250C. Chuyển môi trường vào các ống cấy, với các lượng 10ml và khử trùng 15 phút trong nồi hấp áp lực ở 1210C. Nếu không sử dụng trong ngày thì bảo quản trong tủ lạnh ở 50C ± 30C. Chỉ ngay trước khi sử dụng, làm nóng trên nồi cách thủy hoặc bằng hơi nước trong 15 phút và làm nguội nhanh đến nhiệt độ ủ. Môi trường chỉ được sử dụng trong vòng 4 tuần sau khi chuẩn bị. C.6. Thuốc thử để phát hiện nitrit (tùy chọn) C.6.1. Dung dịch axit 5-Amino-2-naphthalenesunfonic(5-2-ANSA) Hòa tan 0,1g 5-2-ANSA trong 100ml dung dịch axit acetic 15% (phần khối lượng). Lọc qua giấy lọc. Bảo quản trong chai màu nâu có nắp đậy kín (tốt nhất là loại ống nhỏ giọt quả bóp) ở 50C ± 30C. C.6.2. Dung dịch axit sunfanilic Hòa tan 0,4g axit sunfanilic trong 100ml dung dịch axit axetic 15% (phần khối lượng). Lọc qua giấy lọc. Bảo quản trong chai màu nâu có nắp đậy kín (tốt nhất là loại ống nhỏ giọt quả bóp) ở 50C ± 30C. C.6.3. Chuẩn bị thuốc thử hoàn chỉnh Trước khi sử dụng, trộn lẫn 2 dung dịch C.6.2 và C.6.1 với các lượng bằng nhau. Loại bỏ ngay thuốc thử không sử dụng. C.7. Bụi kẽm (tùy chọn) C.8. Môi trường lactoza-gelain (tùy chọn) C.8.1. Thành phần Pepton từ casein 15,0g Cao thịt 10,0g Galactoza 10,0g Gelain 120,0g Phenol đỏ 0,05g Nước 1000ml C.8.2. Chuẩn bị Hòa tan các thành phần trong nước, trừ lactoza và phenol đỏ. Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng là 7,5±0,2 ở 250C. Bổ sung tiếp lactoza và phenol đỏ, phân phối vào các ống nghiệm các lượng 10ml và khử trùng 15 phút trong nồi hấp áp lực ở 1210C. Nếu không sử dụng trong ngày thì bảo quản trong tủ lạnh ở 50C ±30C. Ngay trước khi sử dụng, đun nóng trong nồi cách thủy hoặc thổi bằng hơi nước trong 15 phút và làm nguội nhanh đến nhiệt độ ủ. Môi trường chỉ được sử dụng trong vòng 3 tuần sau khi chuẩn bị. D. Thiết bị và dụng cụ thủy tinh Sử dụng các thiết bị của phòng thử nghiệm vi sinh thông thường [xem TCVN 6404(ISO 7218)] và cụ thể là: Thiết bị để khử trùng khô(tủ sấy) hoặc để khử trùng ướt (nồi hấp áp lực) Xem TCVN 6404 (ISO 7218). Tủ ấm, có khả năng hoạt động ở 370C ± 10C. Bình không khí cải tiến, hoặc các dụng cụ thích hợp khác để cấy kỵ khí. pH mét, có thể đọc chính xác đến ±0,001 đơn vị pH ở 250C, có thể cho phép đo chính xác đến 0,1 đơn vị pH. Que cấy vòng, bằng platin-iridi hoặc niken-crôm, đường kính khoảng 3mm, và các kim cấy sâu bằng cùng vật liệu hoặc các que cấy vòng và kim cấy vô trùng sử dụng một lần có chất lượng tương đương. Dụng cụ lọc, để khử trùng các dung dịch. Ống nghiệm, bình hoặc chai có dung tích thích hợp, cụ thể là các ống nghiệm 16mm x 160mm có các ống Durham lộn ngược, ví dụ: dài 35mm và đường kính 7mm. Pipet hoặc micropipet chia độ xả hết, có dung tích danh định 1ml và 10ml, được chia vạch 0,1ml và 0,5ml tương ứng. Đĩa Petri, bằng thủy tinh hoặc chất dẻo có đường kính 90mm đến 100mm. Nồi cách thủy, hoặc thiết bị tương tự có thể hoạt động ở 440C đến 470C và ở 460C ± 0,50C. Bầu cao su, để sử dụng với pipet chia độ khi phân phối các thành phần của thuốc thử phát hiện nitrit (nếu cần). E. Lấy mẫu Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này. Xem tiêu chuẩn riêng về lấy mẫu cho sản phẩm tương ứng. Nếu chưa có tiêu chuẩn riêng thì các bên liên quan tự thỏa thuận với nhau về vấn đề này. Điều quan trọng là phòng thử nghiệm nhận được đúng mẫu đại diện và không bị hư hỏng hoặc biến đổi trong suốt quá trình vận chuyển và bảo quản. F. Chuẩn bị mẫu thử Chuẩn bị mẫu thử theo TCVN 6507-2(ISO 6887-2), TCVN 6507-3(ISO 6887-3), TCVN 6507-4(ISO 6887-4) hoặc TCVN 6263 (ISO 8261) G. Cách tiến hành G.1. Phần mẫu thử, huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng Xem các phần tương ứng của TCVN 6507 (ISO 6887) và tiêu chuẩn riêng liên quan tới sản phẩm. G.2. Cấy và ủ (kỹ thuật rót đĩa) Dùng pipet vô trùng cho vào một đĩa 1ml mẫu thử nếu sản phẩm ở dạng lỏng hoặc 1 ml huyền phù ban đầu cho vào chính giữa hai đĩa petri trống. Rót vào mỗi đĩa 10ml đến 15ml thạch SC, được duy trì ở 440C đến 470C trong nồi cách thủy và trộn đều chất cấy bằng cách xoay nhẹ từng đĩa. Khi mội trường đã đông đặc lại thì phủ kín thêm một lớp dày 10ml của cùng loại thạch SC. Để cho đông đặc lại. Đặt các đĩa vào các bình môi trường cải biến hoặc các vật đựng thích hợp khác và ủ trong các điều kiện kỵ khí ở 370C trong 20h ± 2h. Thời gian ủ kéo dài có thể làm cho các đĩa bị quá đen. Tiến hành quy trình tương tự đối với các dung dịch pha loãng đã chuẩn bị. G.3. Đếm và chọn các khuẩn lạc Sau giai đoạn ủ quy định, chọn tất cả các đĩa chứa ít hơn 150 khuẩn lạc. Từ các đĩa này, chọn các đĩa đại diện cho các bộ pha loãng liên tiếp, nếu có thể. Đếm các khuẩn lạc điển hình của C.perfringens trên mỗi đĩa. Chọn năm khuẩn lạc điển hình chúng sử dụng một trong các kỹ thuật mô tả trong G.4.2 và G.4.3 Hình 3.5. C. perfringens trên môi trường thạch TSC (tương tự SC) G.4. Khẳng định sinh hóa G.4.1. Yêu cầu chung Chọn một trong hai kỹ thuật khử khẳng định như mô tả trong G.4.2 và G.4.3 Có thể sử dụng loại có bán sẵn nếu phù hợp với TCVN 6404 (ISO 7218) G.4.2. Kỹ thuật khẳng định sử dụng môi trường LS CHÚ THÍCH: phản ứng thu được trong mội trường lactoxa sunfit khi ủ ở 460C là rất đặc trưng cho C.perfringens và C.absonum. Do đó, không cần phải khẳng định sự thuần khiết của các khuẩn lạc màu đen được lấy từ môi trường thạch trước khi cấy vào môi trường thioglycolat và cấy vào môi trường thạch lactoza sunfit nữa. Cấy và ủ Cấy từng khuẩn lạc đã chọn vào môi trường thioglycollat lỏng. Ủ trong điều kiện kỵ khí ở 370C trong 18h đến 24h. Sau khi ủ, dùng pipet vô trùng chuyển ngay 5 giọt dịch cấy trong môi trường thioglycollat sang môi trường LS. Ủ trong điều kiện hiếu khí ở 460C trong 18h đến 24h trong nồi cấy thủy. Giải thích kết quả Kiểm tra các ống nghiệm đựng môi trường LS về việc sinh khí và có xuất hiện màu đen (kết tủa của sắt sunfit). Các ống Durham có phần bọt khí chiếm hơn một phần tư chiều dài ống và các ống có kết tủa màu đen được coi là dương tính. Trong trường hợp có nghi ngờ, khi ống durham trong môi trường bị đen có phần bọt khí chiếm ít hơn một phần tư chiều dài ống thì dùng pipet vô trùng chuyển ngay 5 giọt đã được phát triển trước trong môi trường LS vào ống khác đựng môi trường LS. Ủ trong nồi cách thủy đến 460C trong 18h đến 24h. Kiểm tra ống này như mô tả ở trên. Vi khuẩn hình thành các khuẩn lạc điển hình trên môi trường thạch SC và được khẳng định dương tính với môi trường LS được coi là C.perfringens. Trong các trường hợp khác, các ống được coi là âm tính. Hình 3.6. C. perfringens trên môi trường LS G.4.3. Kỹ thuật khẳng định sử dụng môi trường nitrat để thử tính di động và môi trường lactoza-gelain Yêu cầu chung Kỹ thuật khẳng định này đòi hỏi các khuẩn lạc điển hình phân lập tốt. Nếu không phải như thế (nghĩa là bề mặt của các đĩa bị mọc quá dày và không thể chọn các khuẩn lạc điển hình phân lập tốt), thì cấy năm khuẩn lạc điển hình vào môi trường thioglycollat lỏng đã khử khí trước. Ủ trong các điều kiện kỵ khí ở 370C trong 24h. Cấy ria các khuẩn lạc lên các đĩa thạch cơ bản SC và phủ kín thêm 10ml thạch cơ bản SC. Để cho đông đặc và ủ kỵ khí ở 370C trong 18h đến 24h. Chọn từ mỗi đĩa ít nhất một khuẩn lạc điển hình và phân lập tốt. Nếu cần lập lại quá trình cấy ria và cấy trên các đĩa môi trường thạch cơ bản SC cho đến khi thu được các khuẩn lạc đen điển hình phân lập tốt. Khẳng định khuẩn lạc này như mô tả dưới đây. Cấy và đọc trên môi trường nitrat để thử tính di động Cấy đâm sâu từng khuẩn lạc chọn lọc sang môi trường nitrat để thử tính di động mới khử khí. Ủ trong các điều kiện kỵ khí ở 370C trong 24h. Kiểm tra ống môi trường nitrat để thử tính di động đối với loại mọc dọc theo đường cấy đâm sâu. Tính di động là bằng chứng phát triển lan rộng vào môi trường cách xa đường cấy đâm sâu. Kiểm tra sự có mặt của nitrit bằng cách dùng pipet chia độ và bầu bóp cao su lấy từ 0,2ml đến 0,5ml thuốc thử phát hiện nitrit cho vào từng ống môi trường nitrat để thử tính di động. CẢNH BÁO- Vì các lý do sức khỏe, phép thử này phải tiến hành trong tủ hút. Sự hình thành màu đỏ khẳng định sự khử nitrat về nitrit. Nếu màu không hình thành màu đỏ trong 15 phút, thì thêm một lượng nhỏ bụi kẽm và để yên 10 phút. Nếu màu đỏ hình thành sau khi thêm bụi kẽm thì đã không xảy ra sự khử nitrat về nitrit. Cấy và đọc trên môi trường lactozo-gelain Cấy từng khuẩn lạc đã chọn vào môi trường lactozo-gelain vừ mới khử khí. Ủ trong các điều kiện kỵ khí ở 370C trong 24 h. Kiểm tra các ống nghiệm đựng môi trường lactozo-gelain về việc sinh khí và có xuất hiện màu vàng (do hình thành axit) cho thấy sự lên men lactoza. Làm lạnh các ống 1h ở 50C và kiểm tra sự hóa lỏng gelain. Nếu môi trường đã đông đặc, thì ủ lại thêm 24h và kiểm tra lại sự hóa lỏng gelain. Giải thích kết quả Các vi khuẩn sinh ra các khuẩn lạc màu đen trong môi trường SC mà không di động, thường khử nitrat thành nitrit, sinh axit và sinh khí từ lactoza và hóa lỏng gelain trong vòng 48h được coi là C.perfringens. Các chủng cho phản ứng yếu đối với nitrit (tức là có màu hồng) phải được loại bỏ, vì C.perfringens luôn luôn phản ứng mạnh và phản ứng tức thì. Biểu thị kết quả H.1. Phương pháp tính: Xem TCVN 6404 (ISO 7218) H.2. Độ chụm H.2.1. Phép thử liên phòng thí nghiệm Các dữ liệu về phương pháp được mô tả trong tiêu chuẩn này dựa trên các kết quả của phép thử liên phòng thử nghiệm (xem[2]). Chi tiết về phép thử này được nêu trong phụ lục A. Các giá trị giới hạn lặp lại và tái lặp được xác định sử dụng ba vật liệu chuẩn và ba loại thực phẩm ở các mức độ nhiễm bẩn khác nhau. Các giá trị thu được từ phép thử liên phòng thử nghiệm này có thể không áp dụng được cho các dải nồng độ và các chất nền khác với quy định ở trên. H.2.2. Độ lặp lại Chênh lệch tuyệt đối giữa các kết quả của hai phép thử đơn lẻ (được chuyển về log10) (Số lượng C.perfringens trong một gram hoặc một mililit) hoặc tỷ số của giá trị cao và giá trị thấp của hai kết quả thử nghiệm trên thang danh định, thu được khi sử dụng cùng phương pháp trên vật liệu thử giống hệt nhau trong cùng một phòng thử nghiệm, do một người thực hiện, sử dụng cùng thiết bị, thực hiện trong một khoảng thời gian ngắn, không quá 5% các trường hợp vượt quá giới hạn lặp lại (r). Như biểu thị chung của giới hạn lặp lại (r), các giá trị sau đây có thể được sử dụng khi kiểm tra các mẫu thực phẩm nói chung. Các giá trị này đối với r là trung bình chung đối với tất cả các chất nền được xem xét trong phép thử liên phòng thử nghiệm: r=0,21 để khẳng định môi trường LS hoặc 0,25 để khẳng định MN/LG (được biểu thị theo sự chênh lệch giữa các kết quả thử nghiệm được chuyển thành log10 ) hoặc r=1,67 để khẳng định môi trường LS hoặc 1,8 để khẳng định MN/LG (được biểu thị theo tỷ số giữa hai kết quả thử nghiệm cao hơn và thấp hơn). Đối với các vật liệu chuẩn (xem bảng A.4), các giá trị sau đây có thể được sử dụng r=0,13 để khẳng định môi trường LS hoặc 0,12 để khẳng định MN/LG (được biểu thị theo sự chênh lệch giữa các kết quả thử nghiệm được chuyển thành log10 ) hoặc r=1,3 để khẳng định môi trường LS hoặc để khẳng định MN/LG (được biểu thị theo tỷ số giữa hai kết quả thử nghiệm cao hơn và thấp hơn). VÍ DỤ: kết quả thử nghiệm thứ nhất là 10000 hoặc 1,0 x 104 C.perfringens giả định quan sát được, có trong một gam thực phẩm. Dưới các điều kiện lặp lại, thì tỷ số giữa kết quả thử cao hơn và kết quả thử thấp hơn không được quá 1,9. Nên kết quả thử thứ hai phải nằm trong khoảng từ 5 đến 19000 (10000 x 19) C.perfringens giả định trong một gam. H.2.3. Độ tái lập Chênh lệch tuyệt đối giữa các kết quả của hai phép thử đơn lẻ (được chuyển về log10 )(Số lượng C.perfringens trong một gram hoặc một mililit) hoặc tỷ số tuyệt đối của hai kết quả thử nghiệm trên thang danh định, thu được khi sử dụng cùng phương pháp trên vật liệu thử giống hệt nhau trong các phòng thử nghiệm khác nhau, do những người khác nhau thực hiện, sử dụng các thiết bị khác nhau, không quá 5% các trường hợp vượt quá giới hạn tái lập (R). Như một chỉ thị của giới hạn tái lập (R), các giá trị trong bảng 3.10 có thể được sử dụng đối với các loại thực phẩm khác nhau và các loại vật liệu chuẩn cần thử nghiệm. Các giá trị này là các trung bình của các giá trị thu được trong thử liên phòng thử nghiệm ở các mức khác nhau. Bảng3.10- các ví dụ về các giá trị R Loại mẫu Khẳng định LS Khẳng định MN và LG R(log)a Rb R(log)a Rb Phomat 0,26 1,8 0,31 2,1 Thịt 0,55 3,5 0,52 3,3 Thức ăn chăn nuôi dạng khô 0,65 4,5 0,72 5,3 Vật liệu chuẩn 0,27 1,9 0,29 1,9 a R(log) là giới hạn tái lập được biểu thị theo sự chênh lệch giữa các kết quả thử nghiệm được chuyển thành log10 b R(log) là giới hạn tái lập được biểu thị theo tỷ số các kết quả thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ: Mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử; Phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết; Phương pháp thử đã sử dụng và viện dẫn tiêu chuẩn này; Mọi chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, cùng với các chi tiết bất thường khác có thể ảnh hưởng tới kết quả; Các kết quả thử nghiệm thu được 3.6.2.6. Xác định tổng số nấm men, mấm mốc - Phương pháp định lượng nấm men và nấm mốc - Kỹ thuật đếm khuẩn lạc trong các sản phẩm có hoạt độ nước lớn hơn 0,95 Theo TCVN 8275-1 : 2010) A. Định nghĩa: A.1. Nấm men: Vi sinh vật hiếu khí ưu ấm, ở nhiệt độ 250C dưới các điều kiện qui định trong tiêu chuẩn này, phát triển thành các khuẩn lạc tròn, bong hoặc mờ trên bề mặt môi trường thạch nấm, thường có mép viền đều và bề mặt lồi ít hoặc lồi nhiều. A.2. Nấm mốc: Vi sinh vật dạng sợi nhỏ hiếu khí ưa ấm, ở nhiệt độ 250C dưới các điều kiện qui định trong tiêu chuẩn này, phát triển thành các mầm/ chồi mọc lan như lông tơ hoặc dẹt hoặc thành các khuẩn lạc trên bề mặt môi trường thạch nấm, thường có màu trái cây hoặc có cấu trúc mang bào tử. A.3. Khuẩn lạc: Khối vi sinh vật tích tụ tại một vị trí mà vó thể nhìn thấy, phát triển trên hoặc trong môi trường dinh dưỡng từ một phần tử sống. Hình 3.7. Khuẩn lạc nấm men, mấm mốc B. Nguyên tắc Chuẩn bị các đĩa nuôi cấy bề mặt, sử dụng môi trường nuôi cấy chọn lọc quy định. Tùy thuộc vào số lượng khuẩn lạc dự kiến, sử dụng lượng xác định của mẫu (nếu sản phẩm dạng lỏng) hoặc huyền phù ban đầu (nếu sản phẩm ở dạng khác), hoặc các dung dịch pha loãng thập phân của mẫu/huyền phù. Có thể chuẩn bị các đĩa bổ sung trong cùng điều kiện, sử dụng các dung dịch thập phân của mẫu thử hoặc của huyền phù ban đầu. Ủ các đĩa đã cấy tong điều kiện hiếu khí ở 250C ± 10C trong 5 ngày. Các đĩa thạch có thể được để trong ánh sáng khuếch tán từ 1 ngày đến 2 ngày, nếu cần. Đếm các khuẩn lạc/ các chồi, khẳng định việc nhận dạng các khuẩn lạc nghi ngờ bằng kính phóng đại hoặc kính hiển vi( để phân biệt các khuẩn lạc của nấm men với các khuẩn lạc của vi khuẩn), nếu cần. Số lượng nấm men và nấm mốc trong một gam hoặc một mililit mẫu được tính từ số lượng khuẩn lạc/chồi/mầm thu được trên các đĩa đã chọn ở các mức pha loãng tạo ra các khuẩn lạc có thể đếm được. nấm men và nấm mốc được đếm riêng, nếu cần. C. Dịch pha loãng và môi trường nuôi cấy Về thực hành phòng thí nghiệm hiện hành, xem TCVN 6507 (ISO 6887) và TCVN 6263 (ISO 8261). C.1. Dịch pha loãng C.1.1. Yêu cầu chung Xem TCVN 6507(ISO 6887) (tất cả các phần), TCVN 6263 (ISO 8261) và tiêu chuẩn cụ thể có liên quan đến sản phẩm. CHÚ THÍCH: Có thể bổ sung các tác nhân hoạt động bề mặt như natri poly(oxyetylen) sorbatitanmonooleat [0,05% nồng độ khối lượng] vào dịch pha loãng để giảm các mảng bào tử nấm mốc và bào tử dính[2]. Khuyến cáo sử dụng canh thang nước pepton 0,1% (nồng độ khối lượng) làm dịch pha loãng, trừ khi để chuẩn bị mẫu thử cụ thể. C.1.2. Thành phần của canh thang nước pepton 0,1% (nồng độ khối lượng) Dịch thủy phân mô động vật hoặc thực vật bằng enzym 1,0g Nước 1000ml C.1.3. Chuẩn bị canh thang nước pepton 0,1 %(nồng độ khối lượng) Hòa tan các thành phần trên trong nước, đun nóng nếu cần. Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng pH là 7,0 ± 0,2 ở 250C, nếu cần. C.2. Môi trường nuôi cấy C.2.1. Thạch dichloran-rose bengal chloramphenicol (DRBC)[3],[4] Thành phần Sản phẩm thủy phân mô động vật hoặc thực vật bằng enzym 5,0g D-Glucoza(C6H12O6) 10,0g Kali dihydro phosphat (KH2PO4) 1,0g Magie sulfat (MgSO4.H2O) 0,5g Dichloran (2,6-diclora-4-nitroanilin) 0,002g Rose bengal 0,025g Thạch Từ 12g đến 15ga Chloramphenicol 0,1g Nước cất hoặc nước đã loại ion 1000ml aTùy vào sức đông của thạch Chuẩn bị Yêu cầu chung Hòa các thành phần trên vào nước bằng cách đun sôi để hòa tan, trừ chloramphenicol. Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng pH là 5,6 ± 0,2 ở 250C, nếu cần. Cho thêm 10ml dung dịch chloramphenocol 1% (nồng độ khối lượng) trong etanol và trộn. Phân phối môi trường này vào các vật chứa có dung dịch thích hợp. Khử trùng 15 phút bằng hấp áp lực ở 1210C. Làm nguội ngay môi trường trong nồi cách thủy được duy trì ở nhiệt độ từ 440C – 470C. Làm nguội ngay đến dưới 500C và phân phối các lượng 15ml vào các đĩa petri vô trùng. Để yên cho môi trường đông đặc và làm khô bề mặt thạch theo TCVN 6404 và TCVN 8128, nếu cần. Cảnh báo- không để môi trường tiếp xúc với ánh sáng, vì khi tiếp xúc với ánh sáng có thể sinh ra các sản phẩm gây độc cho tế bào mà có thể làm ảnh hưởng đến kết quả định lượng. Phương án bổ sung chlortetracycline clohydric Việc phát triển quá mức vi khuẩn có thể là một vấn đề, do đó khuyến cáo sử dụng chloramphenicol (50mg/l) và chlortetracycline 950mg/l). Trong trường hợp này, chuẩn bị môi trường cơ bản như trên nhưng chỉ sử dụng 50mg chloramphenicol rồi phân phối các lượng 100ml và khử trùng. Đồng thời chuẩn bị dung dịch chlortetracycline clohydric 0,1% (khối lượng) trong nước (vì dung dịch này không ổn định nên phải chuẩn bị ngay trước khi sử dụng) và lọc để khử trùng, thêm 5ml dung dịch này một cách vô trùng vào 100ml môi trường cơ bản và đổ ra đĩa. Không khuyến cáo sử dụng gentamicin vì việc sử dụng gentamicin cho thấy ức chế một số loài nấm men. Phương án bổ sung các nguyên tố với lượng vết Để cho nấm mốc thể hiện hoàn toàn hình thái, cụ thể là sắc thái của chúng, thì cần đến nguyên tố với lượng vết mà có thể không có trong DRBC. Để nhận biết các nấm mốc trên môi trường này, thì thêm dung dịch nguyên tố với lượng vết sau đây với 1ml/1l môi trường, trước đó đã được hấp áp lực: 1g ZnSO4.7H2O; 0,5g CuSO4.5H2O; 100ml nước cất hoặc nước đã loại ion. Phương án bổ sung Tergitol Để tránh Mucoraceare mọc quá dày trên các đĩa thạch, thì nên bổ sung tergitol (1ml/l) vào môi trường nuôi cấy. Thử nghiệm hiệu năng đảm bảo chất lượng môi trường cấy Yêu cầu chung DRBC là môi trường đặc. Năng suất và tính chọn lọc của môi trường cần được thử nghiệm theo TCVN 8128. Năng suất Ủ: 5 ngày ở 250C ± 10C Chủng: Sacchromyces cerevisiae ATCC 9763 Candida albicans ATCC 10231 Aspergilluus niger ATCC 16404 Hoặc các chủng tương đương trong các bộ sưu tập nấm khác Môi trường chuẩn: Mẻ môi trường SDA đã được đánh giá hiệu lực Phương pháp kiểm tra: định lượng Phản ứng đặc trưng: khuẩn lạc đặc trưng/ chồi/ mầm theo từng loài. Tính chọn lọc Ủ: 5 ngày ở 250C ± 10C Chủng: Escherichia coli ATCC 25922 hoặc Bacliius subtilis ATCC 6633 hoặc các chủng tương đương trong các bộ sưu tập nấm khác Phương pháp kiểm tra: định tính. D. Thiết bị và dụng cụ thủy tinh Có thể dùng dụng cụ sử dụng một lần để thay thế cho các dụng cụ thủy tinh sử dụng nhiều lần nếu nó có các đặc tính kỹ thuật phù hợp. Sử dụng các thiết bị, dụng cụ phòng thử nghiệm vi sinh thông thường [Xem TCVN 6404 (ISO 7218)] Tủ ấm, có thể duy trì nhiệt độ ở 250C ± 10C Pipet xả hết, vô trùng, dung tích danh nghĩa 1ml, được chia vach,1ml Nồi cách thủy, hoặc dụng cụ tương đương, có khả năng duy trì nhiệt độ ở 440C đến 470C Máy đo pH, có độ chính xác đến 0,01 đơn vị pH ở 250C. Chai, bình và ống nghiệm, để đun sôi và bảo quản môi trường nuôi cấy và pha loãng dung dịch. Đĩa Petri vô trùng, bằng thủy tinh hoặc chất dẻo, đường kính từ 90mm đến 100mm. Kính hiển vi, để phân biệt nấm men với các tế bào vi khuẩn (có trường sáng, độ khuếch đại từ 250 lần đến 1000 lần). Que dàn mẫu, bằng thủy tinh hoặc chất dẻo (đường kính nhỏ hơn 2mm và dài 80mm). Đường kính không vượt quá 2mm để giảm thiểu lượng mẫu dính vào que khi kết thúc dàn mẫu. Kính khuếch đại hai thị kính, để phân biệt các khuẩn lạc/tế bào nấm men và nấm mốc (khuếch đại từ 6,5 lần đến 50 lần). E. Lấy mẫu Điều quan trọng là phòng thử nghiệm phải nhận được đúng mẫu đại diện và không bị hư hỏng hoặc giảm chất lượng trong suốt quá trình vận chuyển hoặc bảo quản. Mẫu phòng thử nghiệm không được làm đông lạnh. Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này. Nên lấy mẫu theo tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm. Nếu không có tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm thì các bên có liên quansẽ thỏa thuận về vấn đề này. F. Chuẩn bị mẫu thử Chuẩn bị mẫu thử theo TCVN 6507 (ISO 6887) (tất cả các phầm), TCVN 6404 (ISO 7218), TCVN 6263 (ISO 8261) và tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm. Nếu không có tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm thì các bên có liên quansẽ thỏa thuận về vấn đề này. G. Cách tiến hành G.1. Phần mẫu thử, huyền phù ban đầu và dung dịch pha loãng Chuẩn bị phần mẫu thử, huyền phù ban đầu (dung dịch pha loãng ban đầu) và các dung dịch pha loãng theo TCVN 6507 (ISO 6887) (tất cả các phầm), TCVN 6404 (ISO 7218), TCVN 6263 (ISO 8261) và tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm. Khuyến cáo sử dụng canh thang nước pepton 0,1 % làm dịch pha loãng, trừ việc chuẩn bị mẫu thử cụ thể. Tốt nhất nên dùng bộ trộn kiểu nhu động để trộn mẫu hoặc dùng máy lắc, Do các phần tử lắng xuống nhanh trong pipet, nên để pipet ở tư thế nằm ngang (không để đứng) khi được làm đầy bằng một thể tích của huyền phù hoặc dung dịch pha loãng thích hợp. Lắc huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng để tránh các phần tử có chứa vi sinh vật lắng xuống. G.2. Cấy và ủ G.2.1. Dùng pipet vô trùng chuyển 0,1ml mẫu thử dạng lỏng hoặc 0,1 ml huyền phù ban đầu đối với sản phẩm ở dạng khác (Điều 8) cho vào một đĩa thạch DRBC (5.2.1). Dùng pipet vô trùng mới để chuyển 0,1ml dung dịch pha loãng thập phân thứ nhất (10-1) (sản phẩm dạng lỏng) hoặc 0,1 ml dung dịch pha loãng thập phân 10-2 (sản phẩm ở dạng khác) cho vào đĩa thạch DRBC (5.2.1) thứ hai. Để thuận tiện cho việc định lượng các lượng nhỏ nấm men và nấm mốc, lấy các lượng đến 0,3 ml dung dịch pha loãng 10-1 của mẫu hoặc của mẫu thử dạng lỏng, dàn đều trên ba đĩa. Lặp lại các thao tác này với các dung dịch pha loãng tiếp theo, sử dụng pipet vô trùng mới cho mỗi dung dịch pha loãng. CHÚ THÍCH Nếu nghi ngờ có mặt nấm mốc phát triển nhanh, thì sử dụng TCVN 8275 -2(ISO 21527-2)[6]. G.2.2. Dàn đều dịch lỏng lên khắp bề mặt đĩa thạch bằng que dàn mẫu vô trùng cho đến khi dịch lỏng hấp thụ hết vào môi trường. Có thể sử dụng kỹ thuật cấy bằng phương pháp đổ đĩa, nhưng trong trường hợp này sự tương đương của các kết quả phải được đánh giá bằng cách so sánh với kết quả được cấy trên bề mặt đĩa và có thể không phân biệt sự khác nhau của nấm men và nấm mốc. Phương pháp cấy bề mặt có thể cho kết quả định lượng cao hơn. Kỹ thuật dàn đĩa tạo điềi kiện cho các tế bào tiếp xúc tối đa với oxi của không khí và tránh mọi nguy cơ mất hoạt tính do nhiệt của các chồi mầm. Các kết qủa có thể phụ thuộc vào từng loại nấm. G.2.3. Ủ các đĩa đã chuẩn bị trong môi trường hiếu khí, nắp hướng lên trên, tư thế thẳng đứng trong tủ ấm ở 250C ± 10C trong 5 ngày. Để yên các đĩa thạch trong ánh sáng khuếch tán tứ 1 ngày đến 2 ngày, nếu cần. Nên ủ các đĩa trong túi chất dẻo để không làm nhiễm bẩn tủ ấm trong trường hợp nấm mốc lan ra ngoài đĩa. G.3. Đếm và chọn các khuẩn lạc để khẳng định Đếm các đĩa trong khoảng thời gian ủ từ 2 ngày đến 5 ngày. Chọn các đĩa chứa ít hơn 150 khuẩn lạc/ chồi/mầm và đếm chúng. Nếu trên các đĩa có nấm mốc mọc quá nhanh thì có thể đếm các khuẩn lạc/chồi /mầm sau khi ủ 2 ngày và đếm lại sau khi ủ 5 ngày. CHÚ THÍCH 1: Các phương pháp định lượng nấm men và đặc biệt là nấm mốc là không chính xác, vì chúng là một hỗn hợp của hệ sợi nấm và các bào tử vô tính và hữu tính. Số lượng lượng đơn vị hình thành khuẩn lạc phụ thuộc vào mức độ phân đoạn của sợi nấm và tỷ lệ các bào tử có thể mọc trên môi trường đồ đĩa. CHÚ THÍCH 2: Thường xuất hiện sự không tuyến tính của các số đếm từ các đĩa dung dịch pha loãng, nghĩa là các dung dịch pha loãng 10 lần của mẫu thường không cho các kết quả nhỏ hơn 10 lần về số đếm khuẩn lạc thu được trên các môi trường đồ đĩa. Điều này là do sự phân đoạn của hệ sợi nấm và việc tách các cụm bào tử trong quá trình pha loãng làm ức chế cạnh tranh khi các lượng lớn khuẩn lạc có mặt trên các đĩa. CẢNH BÁO- Các báo tử nấm mốc phân bố trong không khí rất mạnh, nên cần thao tác với các đĩa Petri cẩn thận để tránh làm phát triển các khuẩn lạc vệ tinh mà có thể cho ước tính kết quả quá cao. Tiến hành kiểm tra bằng kính khuếch đại hai thị kính hoặc bằng kính hiển vi để phân biệt giữa các tế bào nấm men hoặc nấm mốc và vi khuẩn từ các khuẩn lạc, nếu cần. Đếm các khuẩn lạc nấm men và các khuẩn lạc /chồi nấm mốc riêng rẽ, nếu cần. Để nhận biết nấm men và nấm mốc, chọn các vùng phát triển nấm và lấy ra để kiểm tra bằng kính hiển vi hoặc cấy trên môi trường phân lập hoặc nhận dạng thích hợp. Biểu thị kết quả và giới hạn tin cậy Xem TCVN 6404 (ISO 7218). Ghi lại các khuẩn lạc nếm men và các khuẩn lạc/ chối nấm mốc riêng rẽ, nếu cần. Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ: Mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử; Phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết; Phương pháp thử đã sử dụng và viện dẫn tiêu chuẩn này; Mọi chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, cùng với các chi tiết bất thường khác có thể ảnh hưởng tới kết quả; Các kết quả thử nghiệm thu được. Thông số kỹ thuật chỉ tiêu vi sinh vật: (Theo quy định hiện hành QĐ-BYT 1021) Bảng 3.11. Chỉ tiêu vi sinh vật cùa bia thành phẩm Loại vi sinh vật Giới hạn VSV trong 1ml bia Phương pháp xác định Tổng số VSV hiếu khí 100 TCVN 4884:2005 E. coli Không có TCVN 6848: 2007 Staphylococus aureus Không có TCVN 7927: 2008 Clostridium perfringens Không có TCVN 4991:2005 Nấm men, nấm mốc Không có TCVN 8275-2:2010 3.6.3. Phương pháp phân tích cảm quan: (theo TCVN 6063: 1995) A. Phạm vi áp dụng: Tiêu chuẩn này quy định phương pháp đánh giá chỉ tiêu cảm quan của bia. B. Dụng cụ thử: Cốc thủy tinh không màu, trong suốt, hình trụ, khô, sạch, không mùi, có dung tích 200cm3, chiều cao từ 10 đến 12cm. Đũa thủy tinh sạch Thìa sứ Các chỉ tiêu cảm quan: Để xác định chất lượng bia, tiến hành kiểm tra các chỉ tiêu sau: Độ trong và màu sắc Trạng thái và độ bền của bọt Mùi Vị Các chỉ tiêu cảm quan được đánh giá khi nhiệt độ của bia khoảng 100C Chuẩn bị mẫu thử: D.1. Chuẩn bị mẫu thử độ trong và màu sắc: Từ từ rót bia vào cốc, tránh hiện tượng bọt trào cho đến khi bia chiếm ¾ thể tích cốc (không kể lớp bọt) để yên cho bọt từ từ tan ra, sau đó dùng đãu thủy tinh khuấy nhẹ để bọt thoát nhanh, cho đến khi không còn bọt bám trên thành cốc cũng như trong lòng cốc bia. Đặt cốc bia trên nền trắng và quan sát dung dịch trong cốc từ mọi phía trong ánh sáng tự nhiên hoặc đèn huỳnh quang. Ghi nhận xét về độ trong và màu sắc của bia. D.2. Chuẩn bị mẫu thử trạng thái và độ bền bọt: Giữ nghiêng cốc và từ từ rót bia vào, sau đó đặt cốc thẳng đứng trên bàn và tiếp tục rót cho tới khi lớp bọt vừa bằng miệng cốc. Quan sát sự thoát bọt trong lòng dung dịch bia, sự bám bọt trên thành cốc, thời gian tồn tại của lớp bọt trên mặt dung dịch bia, kích thước của bọt. D.3. Chuẩn bị mẫu thử mùi và vị của bia: Làm như phần chuẩn bị mẫu thử trạng thái và độ bền của bọt. Trong quá trình nếm vừa có nhận xét về mùi và vị của bia. Mức độ ảnh hưởng của từng chỉ tiêu tới chất lượng chung của bia được đánh giá qua hệ số quan trọng và được trình bày như sau: Tên chỉ tiêu Hệ số quan trọng Theo % Bằng số 1.Độ trong, màu sắc 2.Độ bền của bọt 3.Mùi 4.Vị 15 15 30 40 0,6 0,6 1,2 1,6 Bảng3.12. Chỉ tiêu cảm quan: ( Theo TCVN 6057:2009) Tên chỉ tiêu Yêu cầu Hệ số theo % (TCVN 6063: 1995) Màu sắc Đặc trưng cho từng loại sản phẩm 15 Mùi Đặc trưng của bia sản xuất từ hoa houblon và malt đại mạch, không có mùi lạ 30 Vị Đặc trưng của bia sản xuất từ hoa houblon và malt đại mạch, không có vị lạ 40 Bọt Khi rót ra cốc cho bọt mịn, đặc trưng cho từng loại sản phẩm 15 Trạng thái Dạng lỏng, trong 15 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận: Bia là đồ uống lên men từ nguyên liệu chính là malt đại mạch nhập khẩu từ Châu Âu. Tại các nhà máy bia của Việt Nam thì có sử dụng thêm thế liệu phổ biến là gạo (25% trên tổng số nguyên liệu). Quy trình công nghệ sản xuất bia đã được du nhập và triển khai ở Việt Nam từ hơn 100 năm nay. Các quy trình công nghệ chủ yếu như: đường hóa, nấu hoa, lên men chính, lên men phụ, luôn đòi hỏi phải tối ưu hóa nhằm đạt đươc chất lượng cao và chi phí thấp. Để kiểm soát chất lượng bia về cả ba khía cạnh: cảm quan, dinh dưỡng và vệ sinh an toàn thực phẩm, việc lấy mẫu, phân tích kiểm nghiệm phải tuân theo một quy trình đã được nghiên cứu kỹ. Bao gồm: Kiểm soát chất lượng nguyên liệu, bán thành phẩm bia, thành phẩm bia. Các phương pháp lấy mẫu phân tích kiểm nghiệm chỉ tiêu hóa lý, vi sinh và cảm quan đều phải tuân thủ tiêu chuẩn ngành bia và tiêu chuẩn quốc gia (TCVN). 4.2. Kiến nghị: Phổ biến rộng rãi tiêu chuẩn đánh giá chất lượng để người tiêu dùng yên tâm hơn khi sử dụng sản phẩm. Các nhà máy sản xuất bia nên nâng cấp thiết bị, phòng thí nghiệm, đội ngũ KCS, quan tâm nhiều hơn đến khâu kiểm tra chất lượng để luôn khẳng định được khẩu hiệu “Hàng Việt Nam chất lượng cao”. Nghiên cứu triển khai các phương pháp phân tích hóa lý và vi sinh hiện đại nhằm rút ngắn thời gian phân tích. TÀI LIỆU THAM KHẢO GS.TS. Nguyễn Thị Hiền (chủ biên). Khoa học công nghệ Malt và Bia, nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật, Hà Nội. PGS. TS. Lê Thanh Mai (chủ biên). Các phương pháp phân tích ngành công nghệ lên men, nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật, Hà Nội. Trần Linh Phước. Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mĩ phẩm, nhà xuất bản giáo dục. Đặng Thị Hồng Thắm (2010), tổng quan các phương pháp kiểm nghiệm bia, khóa luận tốt nghiệp, trường Đại học Kỹ Thuật Công Nghệ thành phố Hồ Chí Minh. Tài liệu hướng dẫn của công ty bia Sài Gòn- Hoàng Quỳnh. Công văn tiêu chuẩn Việt Nam Tài liệu internet: www.tcvn.gov.vn new.tcvninfo.org.vn Phụ lục A (Tổng số vi sinh vật hiếu khí- TCVN 4884: 2005) (tham khảo) Cách sử dụng sai lệch tới hạn (CD) để gỉai thích kết quả Trong các ví dụ dưới đây đã xem xét đến dữ liệu về độ chụm trung bình, mức xác suất là 95% và phân tích một mẫu. Trong thực tế thì thường sử dụng trung bình của vài mẫu. Các con số được tính bằng số vi sinh vật trong một lít. Các điều kiện tái lập Các kết quả thu được trong phòng thử nghiệm thứ nhất (trung bình của phép xác định kép): 105 = 100000. Chênh lệch giữa kết quả này và kết quả thu được bởi phòng thử nghiệm thứ hai (trung bình của n phép xác định; trong ví dụ này n=2) có thể được chấp nhận nếu không vượt quá sai lệch tới hạn (CD), theo log10 các đơn vị CD= R2- r2(1-1n) = R-r22= 0,45-0,2522= 0,41 Trong đó r là giới hạn lặp lại; R là giới hạn tái lập. Chênh lệch giữa kết quả này và kết quả thu được bởi phòng thử nghiệm thứ nhất và thứ hai có thể chấp nhận được nếu phòng thử nghiệm thứ hai thu được kết quả không thấp hơn 104,59 = 39000 hoặc không cao hơn 105,41 = 257000 So sánh với giới hạn (thử một phía) Giới hạn: 105=100000 Chênh lệch giữa giới hạn và kết quả của phòng thí nghiệm (trung bình của n phép xác định, trong ví dụ naỳ n=2) được so sánh với giới hạn sai lệch tới hạn (CDL): CDL= 0,842*R2- r2(1-1n) = 0,842*R-r22= 0,24 Các kết quả thử nghiệm đến 105,24 = 174000 không chỉ ra được sự không phù hợp với giới hạn. Phụ lục B (Xác định E.coli TCVN 6846:2007) Bảng MPN (quy định) B.1 Tính MPN sử dụng ba ống nghiệm : Xem TCVN 6404 (ISO 7218) B.2 Tính MPN sử dụng năm ống nghiệm: Xem bảng B.1 Bảng B.1- Bảng MPN đối với 5 x 1 g(ml), 5 x 0,1 g(ml) và 5 x 0,01 g(ml) Số kết quả dương tính Chỉ số MPN Cấp hạnga khi số lượng mẫu (đối với lô) được thử nghiệm là Giới hạn tin cậy 1 2 3 5 10 ≥ 95% ≥ 95% ≥ 99% ≥ 99% 0 0 0 <0,18 0,00 0,65 0,00 0,93 0 0 1 0,18 2 2 2 1 1 0,00 0,65 0,00 0,93 0 1 0 0,18 2 2 2 1 1 0.01 0,65 0,00 0,93 0 1 1 0,36 3 3 3 2 2 0,07 0,99 0,02 1,40 0 2 0 0,37 3 2 2 2 1 0,07 0,99 0,02 1,40 0 2 1 0,55 0 0 0 3 3 0,17 1,40 0,09 2,10 0 3 0 0,56 0 3 3 3 3 0,17 1,40 0,09 2,10 1 0 0 0,20 1 1 1 1 1 0,02 0,99 0,01 1,40 1 0 1 0,40 2 1 1 1 1 0,07 1,00 0,02 1,40 1 0 2 0,60 0 0 3 3 3 0,17 1,40 0,09 2,10 1 1 0 0,40 1 1 1 1 1 0,07 1,10 0,03 1,40 1 1 1 0,61 3 2 2 2 1 0,17 1,40 0,09 2,10 1 1 2 0,81 0 0 0 0 3 0,33 2,20 0,20 2,80 1 2 0 0,61 3 2 2 2 1 0,18 1,40 0,09 2,10 1 2 1 0,82 3 3 3 3 2 0,33 2,20 0,20 2,80 1 3 0 0,83 3 3 3 3 2 0,33 2,20 0,20 2,80 1 3 1 1,0 0 0 0 0 3 0,3 2,2 0,2 2,8 1 4 0 1,1 0 0 0 0 3 0,3 2,2 0,2 2,8 2 0 0 0,45 1 1 1 1 1 0,08 1,4 0,04 2,10 2 0 1 0,68 2 1 1 1 1 0,18 1,50 0,09 2,10 2 0 2 0,91 0 3 3 3 3 0,33 2,20 0,20 2,80 2 1 0 0,68 1 1 1 1 1 0,19 1,70 0,10 2,30 2 1 1 0,92 2 2 1 1 1 0,33 2,20 0,20 2,80 2 1 2 1,2 0 0 3 3 3 0,4 2,5 0,2 3,4 2 2 0 0,93 1 1 1 1 1 0,34 2,20 0,20 2,80 2 2 1 1,2 3 3 2 2 2 0,4 2,5 0,2 3,4 2 2 2 1,4 0 0 0 0 3 0.6 3,4 0,4 4,4 2 3 0 1,2 3 2 2 2 1 0,4 2,5 0,2 3,4 2 3 1 1,4 0 3 3 3 3 0,6 3,4 0,4 4,4 2 4 0 1,5 0 3 3 3 3 0,6 3,4 0,4 4,4 3 0 0 0,78 1 1 1 1 1 0,21 2,20 0,12 2,80 3 0 1 1,1 1 1 1 1 1 0,4 2,2 0,2 2,9 3 0 2 1,3 3 3 3 2 2 0,6 3,4 0,4 4,4 3 1 0 1,1 1 1 1 1 1 0,4 2,5 0,2 3,4 3 1 1 1,4 2 1 1 1 1 0,6 3,4 0,4 4,4 3 1 2 1,7 3 3 3 3 0 0,6 3,4 0,4 4,4 3 2 0 1,4 1 1 1 1 1 0,6 3,4 0,4 4,4 3 2 1 1,7 2 2 2 1 1 0,7 3,9 0,5 5,1 3 2 2 2,0 0 3 3 3 3 0,7 3,9 0,5 5,2 3 3 0 1,7 2 2 1 1 1 0,7 3,9 0,5 5,2 3 3 1 2,1 3 3 3 2 2 0,7 3,9 0,5 5,2 3 3 2 2,4 0 0 0 3 3 1,0 6,6 0,7 9,4 3 4 0 2,1 3 3 2 2 2 0,7 4,0 0,5 5,2 3 4 1 2,4 0 3 3 3 3 1,0 6,6 0,7 9,4 3 5 0 2,5 0 0 0 3 3 1,0 6,6 0,7 9,4 4 0 0 1,3 1 1 1 1 1 0,4 3,4 0,3 4,4 4 0 1 1,7 1 1 1 1 1 0,5 3,4 0,4 4,4 4 0 2 2,1 3 2 2 2 2 0,7 3,9 0,5 5,2 4 0 3 2,5 0 0 0 0 3 1,0 6,6 0,7 9,4 4 1 0 1,7 1 1 1 1 1 0,6 3,9 0,4 5,1 4 1 1 2,1 1 1 1 1 1 0,7 4,1 0,5 5,3 4 1 2 2,6 3 3 2 2 2 1,0 6,6 0,7 9,4 4 1 3 3,1 0 0 0 0 3 1,0 6,6 0,7 9,4 4 2 0 2,2 1 1 1 1 1 0,7 4,8 0,5 6,1 4 2 1 2,6 2 1 1 1 1 1,0 6,6 0,7 9,4 4 2 2 3,2 3 3 3 2 2 1,0 6,6 0,7 9,4 4 2 3 3,8 0 0 0 0 3 1,3 10,0 0,9 14,7 4 3 0 2,7 1 1 1 1 1 1,0 6,6 0,7 9,4 4 3 1 3,3 2 2 1 1 1 1,0 6,6 0,7 9,4 4 3 2 3,9 3 3 3 3 2 1,3 10,0 0,9 14,7 4 4 0 3,4 2 2 1 1 1 1,3 10,0 0,9 14,7 4 4 1 4,0 3 3 2 2 2 1,3 10,0 0,9 14,7 4 4 2 4,7 0 0 3 3 3 1,4 11,3 0,9 14,7 4 5 0 4,1 3 3 3 3 2 1,3 10,0 0,9 14,7 4 5 1 4,8 0 0 3 3 3 1,4 11,3 0,9 14,7 5 0 0 2,3 1 1 1 1 1 0,7 6,6 0,5 9,4 5 0 1 3,1 1 1 1 1 1 1,0 6,6 0,7 9,4 5 0 2 4,3 3 2 2 2 1 0,3 10,0 0,9 14,7 5 0 3 5,8 0 0 0 3 3 2,1 14,9 1,4 20,0 5 1 0 3,3 1 1 1 1 1 1,0 10,0 0,7 14,7 5 1 1 4,6 1 1 1 1 1 1,4 11,3 0,9 14,7 5 1 2 6,3 2 2 1 1 1 2,1 14,9 1,4 20,0 5 1 3 8,4 3 3 3 3 2 3,4 11,0 2,1 27,0 5 2 0 4,9 1 1 1 1 1 1,5 14,9 0,9 20,0 5 2 1 7,0 1 1 1 1 1 2,2 16,8 1,4 23,0 5 2 2 9,4 2 2 1 1 1 3,4 22,0 2,1 28,0 5 2 3 12 3 3 2 2 2 3 24 2 32 5 2 4 15 0 0 0 0 3 6 35 4 45 5 3 0 7,9 1 1 1 1 1 2,3 22,0 1,5 27,0 5 3 1 11 1 1 1 1 1 3 24 2 32 5 3 2 14 1 1 1 1 1 5 35 3 45 5 3 3 17 3 2 2 2 1 7 39 4 51 5 3 4 21 3 3 3 3 2 7 39 4 51 5 4 0 13 1 1 1 1 1 3 35 3 45 5 4 1 17 1 1 1 1 1 6 39 4 51 5 4 2 22 1 1 1 1 1 7 44 4 57 5 4 3 28 2 1 1 1 1 10 70 6 92 5 4 4 35 2 2 2 1 1 10 70 6 92 5 4 5 43 0 0 3 3 3 15 106 9 150 5 5 0 24 1 1 1 1 1 7 70 4 92 5 5 1 35 1 1 1 1 1 10 106 6 150 5 5 2 54 1 1 1 1 1 15 166 10 223 5 5 3 92 1 1 1 1 1 23 253 15 338 5 5 4 160 1 1 1 1 1 40 460 20 620 5 5 5 >160