Khóa luận Tổng quan về Clostridium botulinum và độc tố botulin

h: Firmicutes. Lớp: Clostridia. Bộ: Clostridiales. Họ: Clostridiaceae . Chi: Clostridium Clostridium botulinum gồm có 7 chủng tùy thuộc vào loại độc tố A, B, C, D, E, F, G. Khi phát triển trên thực phẩm, Clostridium botulinum tiết các loại độc tố gây ngộ độc và nguy hiểm, gây chết người do tác động lên hệ thống thần kinh. Trong số này các loại A, B, E và F gây bệnh ở người.Types C and D cause disease in animals. Các loại C và D gây bệnh ở động vật.Type G has not yet been confirmed to cause illness in humans or animals.8, 4 Type A is the most potent toxin known and an estimated dose of this toxin required to cause death in humans vary between 0.1 to 1.0 micrograms. Loại G chưa được xác nhận để gây bệnh ở người hay động vật. 2.2.3. Đặc điểm 2.2.3.1. Đặc điểm chung Clostridium botulinum là vi khuẩn kỵ khí có thể di động da dạng, tồn tại ở trong đất, phân động vật, ruột cá. Chúng là vi khuẩn sinh độc tố botulin là nguyên nhân gây tê liệt cơ, phát triển thuận lợi ở nhiệt độ 26-280C, sinh khí hydro sulfur (H2S) và sinh hơi. Có đặc điểm chung về kiểu hình là hình thành những nội bào tử nhiệt và kháng cự hóa học, sự hiện diện của gram dương trong cơ cấu các tế bào sinh dưỡng, có sự trao đổi chất kỵ khí làm lên men. Nhóm vi khuẩn Clostridium botulinum chủ yếu là đặc trưng bởi khả năng sản xuất độc tố ngoại bào protein nhiều hơn bất kỳ nhóm vi khuẩn nào khác. 2.2.3.2 Đặc điểm nuôi cấy/sinh hóa Nhóm vi khuẩn Clostridium botulinum không thể phát triển ở pH acid thấp hơn 4,5. Nồng độ muối trên 1% có thể ngăn cản sự phát triển của vi khuẩn. Clostridium botulinum không thể sử dụng lactose như một nguồn carbon chính. Clostridium botulinum cũng có thể được chia thành bốn nhóm khác nhau dựa trên đặc điểm sinh hóa và sinh lý. Những nhóm này bao gồm: Nhóm I – nhóm này bao gồm: - Chủng độc tố loại A. - Những biến dạng thủy phân protein của độc tố loại B và F. - Những kiểu độc tố kép AB, AF, BF Đặc điểm chính của nhóm này bao gồm: những thanh hơi cong với lông roi có lông rung rải rác, nhiệt độ sinh trưởng tối ưu là 35 - 400C, sản xuất những bào tử với khả năng chịu nhiệt cao, độ pH tối thiểu có thể ức chế hoạt động của vi khuẩn trong nước là 0,94 - 4,6. Nhóm II – nhóm này bao gồm: - Chủng độc tố loại E. - Những biến dạng không thủy phân protein nhưng phân giải đường của độc tố loại B và F. Đặc điểm chính của nhóm này bao gồm: những thanh thẳng với lông roi có lông rung rải rác, là nhóm ưa lạnh nhiệt độ sinh trưởng tối ưu là 18 – 250C, sản xuất bào tử với khả năng chịu nhiệt thấp, độ pH tối thiểu có thể ức chế hoạt động của vi khuẩn trong nước là 0,97 - 5. Nhóm III – nhóm này bao gồm: - Chủng độc tố loại C và D. - Những sự biến dạng nói chung là không có thủy phân protein. Đặc điểm chính của nhóm này bao gồm: những thanh thẳng với lông roi có lông rung rải rác, nhiệt độ sinh trưởng tối ưu là 35 - 400C, sản xuất những bào tử với khả năng chịu nhiệt trung gian, độ pH tối thiểu có thể ức chế hoạt động của vi khuẩn trong nước vẫn chưa biết. Nhóm VI – nhóm này bao gồm: thủy phân protein của chủng độc tố loại G. Đặc điểm chính của nhóm này bao gồm: những thanh thẳng với lông roi có lông rung rải rác, nhiệt độ sinh trưởng tối ưu là 35 - 400C, sản xuất những bào tử với khả năng chịu nhiệt trung gian, độ pH tối thiểu có thể ức chế hoạt động của vi khuẩn trong nước vẫn chưa biết. 2.2.4. Cấu trúc của Clostridium botulinum 2.2.4.1. Cấu trúc tế bào Clostridium botulinum là vi khuẩn Gram dương (+),kích thước khoảng 0,3 – 0,7µm × 3,5 – 7,0 µm, không có có roi. Sinh bào tử, bào tử thường to hơn chiều ngang của tế bào. a. Thành tế bào  Thành tế bào giúp duy trì hình thái của tế bào, giúp tế bào đề kháng với áp suất thẩm thấu, hỗ trợ quá trình phân cắt tế bào, cản trở sự xâm nhập của một số chất có phân tử lớn, liên quan đến tính kháng nguyên, tính gây bệnh, tính mẫn cảm với Thực khuẩn thể. Bảng 2.1: Thành phần của vi khuẩn gam (+). Thành phần Tỷ lệ % đối với khối lượng khô của tế bào Peptidoglycan 30-95 Acid teicoic (Teichoic acid) Cao Lipid Hầu như không có Protein Không có hoặc có ít b. Màng sinh chất Màng sinh chất vi khuẩn cũng tương tự như ở các sinh vật khác. Chúng cấu tạo bởi 2 lớp phospholipid, chiếm 30-40% khối lượng của màng, và các protein (nằm trong, ngoài hay xen giữa màng), chiếm 60-70% khối lượng của màng. Đầu phosphat của PL tích điện, phân cực, ưa nước ; đuôi hydrocarbon không tích điện, không phân cực, kỵ nước. Có các chức năng chủ yếu sau đây: - Khống chế sự qua lại của các chất dinh dưỡng, các sản phẩm trao đổi chất - Duy trì áp suất thẩm thấu bình thường trong tế bào. - Là nơi sinh tổng hợp các thành phần của thành tế bào và các polyme của bao nhày (capsule). - Là nơi tiến hành quá trình phosphoryl oxy hoá và quá trình phosphoryl quang hợp (ở vi khuẩn quang tự dưỡng) - Là nơi tổng hợp nhiều enzym, các protein của chuỗi hô hấp. Hình 2.14: Cấu trúc của đầu và đuôi của phospholipid. c. Tế bào chất Là phần vật chất dạng keo nằm bên trong màng sinh chất, chứa tới 80% là nước. Trong tế bào chất có protein, acid nucleic, hydrat carbon, lipid, các ion vô cơ và nhiều nhiều chất khác có khối lượng phân tử thấp. Bào quan đáng lưu ý trong tế bào chất là ribosom. Ribosom nằm tự do trong tế bào chất và chiếm tới 70% trọng lượng khô của tế bào chất, gồm 2 tiểu phần (50S và 30S) kết hợp với nhau tạo thành ribosom 70S (S là đơn vị Svedberg- đại lượng đo tốc độ lắng khi ly tâm cao tốc). Hình 2.15: Ribosom ở vi khuẩn. Trong tế bào chất của vi khuẩn còn có thể gặp các chất dự trữ như các hạt glycogen, hạt PHB (Poly-ß-hydroxybutyrat), Cyanophycin, Phycocyanin, các hạt dị nhiễm sắc (metachromatic body), các giọt lưu huỳnh... d. Thể nhân Thể nhân ở vi khuẩn là dạng nhân nguyên thuỷ, chưa có màng nhân nên không có hình dạng cố định, và vì vậy còn được gọi là vùng nhân. Khi nhuộm màu tế bào bằng thuốc nhuộm Feulgen có thể thấy thể nhân hiện màu tím. Đó là 1 nhiễm sắc thể duy nhất dạng vòng chứa 1 sợi ADN xoắn kép e. Bao nhầy Thành phần chủ yếu của bao nhầy là polysaccarid, ngoài ra cũng có polypeptid và protein. Trong thành phần polysaccarid ngoài glucose còn có glucozamin, ramnose, acid 2-keto-3-deoxygalacturonic, acid uronic, acid pyruvic, acid axetic... Ý nghĩa sinh học của bao nhầy là: - Bảo vệ vi khuẩn trong điều kiện khô hạn. - Cung cấp chất dinh dưỡng cho vi khuẩn khi thiếu thức ăn. - Là nơi tích luỹ một số sản phẩm trao đổi chất (dextran, xantan...). - Giúp vi khuẩn bám vào giá thể. 2.2.5. Cơ chế gây bệnh của Clostridium botulinum Clostridium botulinum sẽ tiết ra một độc tố sinh học mạnh ức chế sự phóng thích hoạt động của các bó cơ, tác động đến nơi tiếp hợp cholinergic qua trung gian Calcium vào khe synape làm mất khả năng chi phối hóa học tại chổ và mất hoạt động thần kinh của sợi nơron vận động trong thoi cơ. Hoạt chất này tác động tại nơi tiếp hợp thần kinh cơ nên ngăn cản sự phóng thích acetylcholine và gây ra liệt. Độc tố của Clostridium botulinum tác dụng qua 3 giai đoạn: Kết nối, thâm nhập, ức chế sự phóng thích chất dẫn truyền thần kinh. Độc tố này không ảnh hưởng vào sự tổng hợp hay dự trữ acetylcholine nhưng ảnh hưởng vào sự phóng thích chất này ở sợi tận cùng tiền tiếp hợp. Hình 2.16: Cơ chế gây bệnh của Clostridium botulinum. 2.2.6. Bệnh và các triệu chứng Nguồn lây bệnh: Các thực phẩm dễ bị nhiễm Clostridium botulinum thường là rau quả ướp muối, hoặc chế biến mứt tại gia đình, các bán thành phẩm từ thịt, cá hoặc một vài đồ hộp không đảm bảo yêu cầu vệ sinh khi chế biến và khử khuẩn. Biểu hiện bệnh: Thời kỳ ủ bệnh thường là 12 - 36 giờ nhưng cũng có thể từ 2 giờ đến 8 ngày với các triệu chứng đau bụng, buồn nôn, đau đầu, chóng mặt, hoa mắt, khó nuốt, khó thở... nếu bệnh kéo dài từ 4 - 8 ngày tỷ lệ tử vong tới 60%-70%. Ngộ độc Clostridium botulinum còn phụ thuộc vào rất nhiều điều kiện như yếu tố môi trường, đặc tính thực phẩm, biện pháp bảo quản, tập quán sinh hoạt và ăn uống của cá nhân mà nguồn thực phẩm gây ngộ độc cũng khác nhau. Ở Nga, ngộ độc chủ yếu do cá, ở Mỹ do đồ hộp rau quả, ở Đức do ăn các thức ăn làm bằng thịt chế biến sẵn, ăn nguội, dăm bông, xúc xích... Các triệu chứng: bệnh xuất hiện với các dấu hiệu lâm sàng chủ yếu là liệt thần kinh do tổn thương thần kinh trung ương và hành tủy. Triệu chứng sớm nhất là liệt mắt, cơ mắt, có biểu hiện song thị như nhìn một hóa hai; bị liệt vòm họng, lưỡi, yết hầu biểu hiện rối loạn lời nói rồi mất tiếng, mất phản xạ nuốt; bị liệt dạ dày, ruột dẫn đến táo bón, chướng bụng, giảm sự tiết dịch,... Bệnh nhân có thể không sốt nhưng mạch nhanh, mạch có thể tăng nhanh nhưng nhiệt độ cơ thể vẫn bình thường, có hiện tượng mạch-nhiệt phân ly. Các loại thực phẩm nhiễm Clostidium botulinum: phát hiện trong đồ hộp (thịt, cá, patê, xúc xích, rau quả...), lạp xưởng, thịt đùi lợn, cá ướp muối hoặc phơi khô rồi xông khói... thức ăn chế biến sẵn và mật ong. Thực phẩm nhiễm Clostridium botulinum rất khó nhận biết bằng cảm quan, chỉ nhận biết được sau khi sử dụng qua những dấu hiệu lâm sàng. 2.3. Độc tố botulin (BT) của vi khuẩn Clostridium botulinum 2.2.7.1. Cấu trúc độc tố botulin Độc tố botulin là một hỗn hợp phức tạp của các protein có chứa phân nữa chất độc thần kinh botulin gắn với phân nữa các protein khác không độc hại. Độc tố thần kinh botulin tồn tại trong bảy típ huyết thanh khác nhau A, B, C, D, E, F, G. Nó được tổng hợp ở dạng không hoạt động như là một chuỗi polypeptide duy nhất với trọng lượng phân tử của khoảng 150 kiloDalton (KD). Cơ chế hoạt động là phân cắt thủy phân protein để tạo thành một cấu trúc dichain, một hình thức hoạt động của độc tố. Cấu trúc dichain bao gồm một chuỗi nặng 100 KD và một chuỗi nhẹ 50 KD được liên kết bởi một liên kết disulfua có gắn với 1 phân tử Zn. Chuỗi nặng gồm một đầu chứa amino – 50 KD (miền này được gọi là miền di dời (HN) ) và một đầu chứa carboxy – 50 KD (miền này được gọi là miền ràng buộc (HC) ). Chuỗi nhẹ gồm một miền tiếp xúc (LC) 50KD hoạt động phân hủy enzyem trên chất nền tế bào thần kinh. Chuỗi nhẹ Chuỗi nặng Vi trí mối nối Hình 2.17: Cấu trúc độc tố botulin. 2.2.7.2. Yếu tố tạo nên độc tố botulin của Clostridium botulinum Các yếu tố chính ảnh hưởng đến sự tăng trưởng của Clostidium botulinum trong thực phẩm là: nhiệt độ, độ chua, hoạt động nước, thế cộng hưởng, thành phần dinh dưỡng, chất bảo quản thực phẩm, và vi sinh vật cạnh tranh. a. Nhiệt độ Clostidium botulinum chủng nhóm I đòi hỏi nhiệt độ tăng trưởng tối thiểu là 10oC, trong khi chủng nhóm II có thể phát triển ở nhiệt độ thấp tới 3,3oC, các giới hạn nhiệt độ cho nhóm I và nhóm II là 45 đến 50oC và 40 đến 45oC nhưng nếu làm lạnh ở nhiệt độ trên thì có thể ức chế tối thiểu vi khuẩn Clostidium botulinum gây bệnh trong thực phẩm. Tuy nhiên, Clostidium botulinum phát triển và hình thành độc tố có thể xảy ra do lạm dụng nhiệt độ trong các cửa hàng lương thực, cơ sở dịch vụ thực phẩm, trong quá trình phân phối, hoặc bởi người tiêu dùng. Chính vì vậy, việc xử lý nhiệt độ thấp để ngăn cản sự tăng trưởng Clostidium botulinum gây bệnh trong thực phẩm đã được khuyến cáo. b. Độ chua Clostidium botulinum đòi hỏi pH tối thiểu là 4,6 cho sự tăng trưởng, nếu dưới thì bào tử của các tế bào sinh dưỡng sẽ không xảy ra nảy mầm. Nếu thực phẩm có giá trị pH nhỏ hơn 4,6 (thực phẩm acid cao) được coi là an toàn. Tuy nhiên, một số protein thực phẩm, chẳng hạn như đậu nành và thịt bò có thể có tác dụng bảo vệ Clostidium botulinum tại hoặc dưới pH 4,6. Ngược lại, những sản phẩm có giá trị pH cao hơn 4,6 sẽ tạo điều khiện thuận lợi cho sự phát triển mầm bệnh và tiết độc tố. Do đó, những thực phẩm này yêu cầu các phương pháp bảo quản chế biến phù hợp để ngăn chặn sự tồn tại hoặc tăng trưởng của Clostidium botulinum. c. Hoạt độ nước (aw) Clostidium botulinum yêu cầu phải có tối thiểu là 0,94 aw cho sự phát triển và tiết độc tố. Aw thấp ức chế sự tăng trưởng của mầm bệnh và chủ yếu đạt được bằng việc bổ sung các muối clorua natri (NaCl). Các giá trị mước muối thường được sử dụng để ngâm vi khuẩn ở nhóm I và II tương ứng là 5 – 10%, nồng độ sucrose cao từ 15 – 30% cũng có thể ngăn chặn hai nhóm này. Tương tự như vậy, những chất tan khác như glycerol, polyme hữu cơ và các ion kali có thể liên kết với nước tự do giúp giảm bớt aw, nhưng hiệu quả của chúng trên tổng thể aw cần phải được trình bày rõ ràng và điều tra cẩn thận trước khi thực hiện bất kỳ sự thay đổi nào trong thực phẩm. d. Thế cộng hưởng (Eh) Clostidium botulinum là một vi khuẩn kỵ khí chính vì vậy việc kiểm soát Eh là cần thiết cho các bào tử của các tế bào sinh dưỡng nảy mầm và phát triển. Các Eh tối ưu cho sự tăng trưởng thấp của vi khuẩn là khoảng -350 millivolts (mV). Tuy nhiên, bào tử nảy mầm và tiết chất độc đã được quan sát ở mức Eh cao hơn khoảng 200 - 250 mV. Điều này cho phép sự phát triển mầm bệnh và tiết độc tố ngay cả trong các sản phẩm đó được xem là có mức độ oxy cao. Sự có mặt của khí carbon dioxide có thể tăng cường sự nảy mầm của bào tử. Tuy nhiên, nguy cơ an toàn phụ thuộc không chỉ trên môi trường khí mà còn trên những đặc tính sản phẩm, nhiệt độ lưu trữ, loại bào bì đóng gói, những vi khuẩn cạnh tranh. e. Thành phần dinh dưỡng Clostidium botulinum có những yêu cầu tối thiểu về chất dinh dưỡng. Một số chất dinh dưỡng được yêu cầu với số lượng cao cho sự tăng trưởng của mầm bệnh, chẳng hạn như arginine cho chủng nhóm I và tryptophan cho các chủng loại E, tất cả các nhóm ngoại trừ nhóm IV sử dụng glucose như một nguồn carbon chính. Khả năng lên men carbohydrates (fructose, maltose, sucrose, và sorbitol) và khả năng phân hủy protein khác nhau giữa các nhóm. Ví dụ như các chủng thuộc nhóm I là protelytic, chúng thủy phân protein sữa và thịt trong khi các chủng nhóm II thì không thủy phân protein trong sữa và thịt. g. Chất bảo quản thực phẩm (kháng sinh) Clostidium botulinum phát triển và sản xuất độc tố có thể bị ức chế hoặc hạn chế bởi các chất bảo quản thực phẩm. Các chất đó bao gồm: Nitrite, sorbic acid, parabens, chất chống oxy hóa phenolic, polyphosphates, ascorbates. Những nhân tố (hệ số) riêng lẽ có tác động tích lũy hay kiểm soát tác nhân gây bệnh. Ví dụ, một sự kết hợp xử lý nhiệt và bổ sung các nitrit natri giúp thực phẩm thực sự an toàn. Tương tự như vậy, trong chế biến pho mát tiệt trùng, xử lý nhiệt dưới liều gây chết vi khuẩn kết hợp với mức độ phù hợp của độ ẩm, NaCl, acid, các muối phosphate giúp ức chế sự tăng trưởng của Clostidium botulinum. h. Vi sinh vật cạnh tranh Clostidium botulinum phát triển và hình thành một số độc tố trong thực phẩm được ức chế bởi sự hiện diện của vi sinh vật cạnh tranh. Vi khuẩn axit lactic như Lactobacillus, Pediococcus và Lactococcus, các loại nấm men lên men đường, nhiều chất khác sản xuất acid hữu cơ, cồn và thuốc kháng sinh làm bằng vi khuẩn cũng ngăn chặn Clostidium botulinum. 2.2.7.3. Khả năng nhiễm độc tố botulin a. Thực phẩm bị ô nhiễm Bào tử Clostridium botulinum thường được tìm thấy trong đất và nước, do đó dễ gây nhiễm khuẩn thực phẩm được thu hoạch từ đất và môi trường nước. Ví dụ, các loại thực phẩm thu hoạch từ đất như trái cây và rau quả thường chứa các bào tử loại A và B. Fishes harvested from marine and freshwater coastal environments are commonly contaminated with type E spores. Cá thu hoạch từ các môi trường biển và nước ngọt ven biển thường bị nhiễm các bào tử loại E. Ngoài ra, nhiễm khuẩn cũng có thể xảy ra thông qua việc bổ sung các thực phẩm khác với cá, rau, và các rau gia vị. Các bào tử có thể nảy mầm trong điều kiện thuận lợi sản xuất độc tố rất mạnh. Mầm bệnh lây truyền chủ yếu xảy ra thông qua việc tiêu thụ các thực phẩm có chứa các bào tử hình thành độc tố. b. Mật ong Đây là một thực phẩm nổi tiếng chứa bào tử Clostridium botulinum và có liên quan đến ngộ độc cho trẻ sơ sinh. Trong các nghiên cứu của mật ong, mẫu thử có chứa bào tử In addition, cross-contamination can also occur through supplementation of other foods with fish, vegetables, and spices.20, 22 The spores may germinate under favorable conditions producing highly potent toxin.lên đến 13 phần trăm các mẫu khác, mật ong chỉ bị nhiễm đối với trẻ sơ sinh mà không nhiễm với người lớn vì vậy thực phẩm đã được đề nghị không sử dụng cho trẻ sơ sinh dưới một tuổi. c. Bụi khí và thuốc trừ sâu Bào tử Clostridium botulinum phân tán nhanh trong bụi khí và thuốc trừ sâu, vì vậy thường xuyên gây ô nhiễm môi trường và một số loại thực phẩm. Sự truyền có thể xảy ra thông qua việc hít thở phải bụi ô nhiễm hoặc thuốc trừ sâu và thông qua việc tiêu thụ thực phẩm bị ô nhiễm chứa độc tố. 2.3. Cơ chế tác dụng của độc tố Botulin 2.3.1. Cơ chế hoạt động phân tử của BT Khi có sự hoạt động của dây thần kinh vận động tạo nên sự khử cực ở đầu cuối của sợi trục (axon), acetylcholine sẽ được phóng thích từ tế bào chất vào khe synapse. Sự phóng thích acetylcholine được thực hiện bởi một chuỗi protein vận chuyển, phức hợp soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor (SNARE). Khi BT được xâm nhập vào mô, chuỗi nặng của độc tố thần kinh botulin gắn chuyên biệt với cấu trúc glycoprotein được tìm thấy ở đầu thần kinh dẫn truyền actylcholine. Sự gắn chuyên biệt này là nguyên nhân độc tố botulin có tính chọn lọc cao đối với synapse dẫn truyền acetylcholine. Sau khi xâm nhập, chuỗi nhẹ của độc tố thần kinh botulin gắn chuyên biệt lên trên phức hợp SNARE. Tùy các loại BT khác nhau sẽ có các protein đích khác nhau. BT-A được tách thành SNAP-25, BT-B được tách thành VAMP. Sự phân cắt chuỗi nhẹ của phức hợp protein SNARE ngăn cản quá trình sự chuyển acetylcholine vào các lỗ trên bề mặt bên trong trong màng tế bào và kết quả là dẫn đến sự khóa chặt các lỗ hổng. Khi mô đích là phần cơ, xảy ra sự liệt nhẹ do xảy ra sự cắt bỏ dây thần kinh hóa học. Khi mô đích là tuyến ngoại tiết thì sự tiết các chất ở các tuyến này bị khóa chặt. Sự ức chế quá trình xuất bào của acetylcholine bị loại bỏ bằng cách khôi phục lại sự thay thế của phức hợp protein SNARE. 2.3.2. Hoạt dộng của BT trên cơ vân 2.3.2.1. Khoảng thời gian hoạt động Khi BT được nhiễm vào một cơ vân, sự tê liệt nhẹ sẽ xảy ra sau 2 - 5 ngày và kéo dài từ hai đến ba tháng trước khi nó dần dần yếu đi. Khi kháng thể chống lại BT được hình thành như trong trường hợp này, thời gian hoạt động và mức độ ảnh hưởng của các liệu pháp chữa bệnh tối đa thường bị giảm sau khi có sự hiện diện của BT. 2.3.2.2. Liều lượng Có một sự tương quan giữa lượng BT nhiễm vào mô và mức độ gây tê liệt. Tuy nhiên, liều lượng BT thấp vừa phải cũng tạo nên sự tê liệt đáng kể. Đường cong tương quan ảnh hưởng theo liều có thể được sử dụng để tối ưu hóa liều lượng BT trên mô cơ. 2.3.2.3. Chứng teo cơ Khi BT xâm nhiễm vào một mô cơ hoạt động mạnh thì sự tê liệt diễn ra làm giảm đường kính của các mô cơ. Khi cơ đích phình to trong thời gian dài thì siêu hoạt tính của BT gây tê liệt có thể làm cho kích cỡ trở lại bình thường. Khi BT hiện diện trong cơ trong thời gian dài thì sự teo cơ có thể xảy ra. Tuy nhiên, sự teo cơ không là sự tác động bắt buộc của BT 2.3.2.4. Hiệu ứng pha loãng Cho đến nay, không có nghiên cứu nào ước tính pha loãng tối ưu cho các tình huống khác nhau trong điều trị. Xác định một tỷ lệ chuyển đổi giữa độc tố và các đơn vị trong chuột Dysport để so sánh hiệu lực điều trị đã không khả thi và vẫn được nghiên cứu trong nhiều năm qua. 2.3.3. Hoạt động của BT trên sự phản xạ của xương sống Cơ vân của người chứa các chỗ nối thần kinh – cơ không chỉ giữa tế bào thần kinh vận động alpha và sợi cơ mà còn giữa tế bào thần kinh vận động và sợi cơ xương để hình thành nên trục cơ. Khi một sự căng cơ xảy ra hướng tâm từ trục cơ đến sợi Ia và II sẽ kích thích tế bào thần kinh vận động alpha của cơ bị căng cũng như tế bào thần kinh liên kết ức chế tế bào thần kinh vận động alpha của các cơ đối kháng. Sau đó, tế bào thần kinh vận động gamma của cơ bị căng được hoạt hóa bởi phần bổ trợ cho tế bào thần kinh vận động alpha (Hình ...). Các dấu hiệu từ các trục cơ hướng tâm cũng được truyền xung đến cấu trúc trên cột sống và liên quan đến đáp ứng phản xạ căng cơ sau này. Hình 2.18: Hoạt động của BT trên sự phản xạ của xương sống. 2.3.4. Hoạt động của BT trên hệ thần kinh tự chủ BT có thể được dùng để điều trị cơ trơn thường hoạt động như là cơ vòng thuộc về thực quản ngoại biên trong chứng thắt thực quản, cơ vòng Oddii trong rối loạn chức năng của cơ vòng oddis, cơ vòng hậu môn trong nứt hậu môn,... Tác động bất lợi đối với cơ thể của BT – B cũng thể hiện ảnh hưởng lên cơ trơn của độc tố khi tim dập mạnh và hiện tượng táo bón xảy ra. Khi BT được sử dụng để điều trị tăng tiết mồ hôi, sự tăng tiết nước bọt, sự tiết nước mắt, hay khi những tác động đối lập của độc tố loại B như là khô mắt hay sự khô niêm mạc xuất hiện, mô tuyến ngoại tiết cũng bị ảnh hưởng bởi BT. Do đó, BT cũng ảnh hưởng đến các sợi thần kinh ly tâm của hệ thần kinh tự chủ. 2.3.5. Hoạt động của BT trên hệ thần kinh trung ương 2.3.5.1. Ảnh hưởng trực tiếp Khi BT được tiêm vào mô đích thì gần như bị gắn hoàn toàn vào các sợi trục cuối. Tuy nhiên, khi độc tố loại A được áp dụng để điều trị trương lực cơ ở cổ tử cung, những phần nhỏ của BT phân bố trong cơ thể và có thể được phát hiện bằng tăng biến động thần kinh cơ trong cơ bắp không được tiêm. Khi độc tố loại B được sử dụng để điều trị trương lực cơ viêm mạch bạch huyết ở cổ tử cung, chất chống tiết cholin tác dụng phụ có thể được phát hiện lâm sàng. Mặc dù phân bố khắp cơ thể nhưng tác động trực tiếp của BT trên hệ thần kinh trung ương không rõ vì độc tố thần kinh botulin với trọng lương phân tử là 150 kDa không thể vượt qua hàng rào bảo vệ trên não. 2.3.5.2. Ảnh hưởng gián tiếp Ảnh hưởng của BT trên khớp thần kinh thần kinh cơ và trên những cơ quan thoi cơ có thể là kết quả của những ảnh hưởng gián tiếp khác nhau trên hệ thần kinh trung ương. Tại xương sống, BT tạo ra những phản xạ kiềm chế các tế bào thần kinh vận động alpha bằng cách phong tỏa các tế bào thần kinh vận động gamma và lần lượt là những tín hiệu hướng tâm ở Ia và II. 2.3.6. Hoạt hộng gây đau đớn của BT Khi BT được sử dụng để điều trị các rối loạn hoạt động của cơ dẫn đến sự đau đớn đáng kể. Cho đến nay, cách giảm đau đớn này là giảm sự tăng hoạt động của cơ. Tuy nhiên, sự đau đớn do formalin gây ra có thể giảm trực tiếp bằng BT. Có lẽ như vậy ảnh hưởng của BT là dựa vào một hoạt động trên dẫn truyền thần kinh khác ngoài acetylcholine. Cơ chất P (SP), một chất có khả năng gây bệnh thần kinh dẫn đến đau đớn, giãn mạch và viêm thần kinh có thể bị chặn bởi BT cùng với acetylcholine trong cơ mắt cũng như tế bào thần kinh ở xống lưng. Việc kết hợp kiềm chế này với giảm SNAP 25 cho thấy một hiệu ứng trực tiếp của BT. 2.3.7. Sự phân bố của Clostridium botulinum Clostridium botulinum và bào tử của nó được phổ biến rộng rãi trong môi trường xảy ra chủ yếu trong đất và trầm tích biển. Chúng bao gồm: - Đất trồng trọt và đất rừng. - Cặn dưới đáy suối, hồ và ven biển nước. Tỷ lệ Clostridium botulinum trên toàn thế giới thay đổi tùy theo khu vực địa lý, mà nhiều khả năng có liên quan đến thành phần vật lý và hoá học của đất và các vi sinh vật tại nơi đó. Ví dụ các loại ưa lạnh và loại không thủy phân protein của nhóm B và E được tìm thấy phổ biến trong đất có độ lạnh hơn thông thường và cặn dưới đáy trong khi những loại thủy phân protein ưa nhiệt độ trung bình của nhóm A va B đã được tìm thấy phổ biến trong đất ẩm. Ngoài ra, mầm bệnh và bào tử của nó có một số nơi khác như: Trong đường tiêu hóa của loài cá, chim và dạ dày động vật có vú. Mang và nội tạng của động vật có vỏ như cua và loài sò hến. Trong mật ong của loài ong. Bào tử Clostridium botulinum kháng cự đối với những sự căng thẳng môi trường và (thì) cũng được tìm thấy trong vài thức ăn, bụi, những chất xịt (bình xịt), chất thải và những môi trường khác. 2.3.8.Tình hình nhiễm Clostridium botulinum trong thực phẩm trên thế giới và Việt Nam hiện nay Tai Việt Nam: Hiện nay trong sinh hoạt hàng ngày, các loại thực phẩm đóng hộp có mặt khá phổ biến trên thị trường và được rất nhiều người tiêu dùng sử dụng. Vào mùa mưa bão, ngập lụt, người nội trợ gia đình thường lại càng quan tâm đến vấn đề dự trữ các loại thực phẩm trong nhà để đối phó với những khó khăn có thể xảy ra. Một trong những thực phẩm thường được dự trữ là các loại thực phẩm đóng hộp. Nếu khi mua và sử dụng các loại đồ hộp không cẩn thận, con người có thể bị ngộ độc do ăn phải mầm bệnh phát triển ở trong loại thực phẩm này. Ngộ độc thường được ghi nhận là do bị nhiễm độc tố vi khuẩn Clostridium botulinum có trong đồ hộp, có thể gây tử vong. Tại một số nơi trên thế giới: 161 dân làng ở tỉnh Nan (miền Bắc Thái Lan) đã phát bệnh sau khi ăn măng tre muối muối chua ở một lễ hội. Nhân viên y tế Thái Lan cho rằng dịch bệnh ở tỉnh Nan là do bảo quản măng tre không tốt đã tạo ra vi khuẩn Clostridium botulium có độc tố chết người. Độc tố trong vi khuẩn Clostridium botulinum là một trong những độc tố mạnh nhất và có thể sử dụng làm vũ khí sinh học. Độc tố này gây tử vong do nó làm tê liệt các cơ hô hấp làm người bệnh không thở được. Hình 2.19: Đội cứu hộ đi cùng bệnh nhân lên máy bay tới. Người bệnh phải được hỗ trợ thở để sống sót cho đến khi các dây thần kinh phục hồi. Do các bệnh viện chính ở tỉnh Nan quá tải bệnh nhân, 17 bệnh nhân nặng nhất được đưa bằng máy bay lên Bangkok điều trị vào ngày 23/03.Về cơ bản, 17 bệnh nhân này vẫn chưa qua cơn nguy hiểm. Mặc dù huyết áp và mạch bình thường, những bệnh nhân này vẫn chưa hồi phục. Thậm chí một số người còn không cử động được cơ thể. Các bác sỹ nhận định tình trạng bệnh nhân phụ thuộc vào lượng chất độc họ ăn phải. Một số bệnh nhân còn bị chứng nhiễm trùng phổi, một trong những biến chứng do dùng máy thở. Nhiều người bị nhiễm trùng bàng quang. Một bệnh nhân nữ 14 tuổi, một trong 3 bệnh nhân nặng nhất được điều trị tại bệnh viện Ramathibodi, bị hôn mê sâu. Cô bé không thể nhúc nhích được người. Để giảm biến chứng do dùng máy thở quá lâu, các bác sỹ đang cân nhắc thực hiện phẫu thuật mở khí quản, dùng khí quản nhân tạo đặt trong cổ cô bé. Tiến sỹ Prat Boonyawongvirot, Phó Thư ký Thường trực của Bộ Y tế Công cộng Thái Lan, cho biết nếu không bị biến chứng, những bệnh nhân này cũng phải mất hai tháng mới hồi phục được. Trước tình hình trên, các quan chức y tế ở Thái Lan đã phải cầu viện sự giúp đỡ của chuyên gia quốc tế để điều trị các bệnh nhân. Các chuyên gia vũ khí sinh học quân đội và chuyên gia của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) đã đến tỉnh Nan điều tra bệnh. Đến nay, Bộ trưởng Y tế Công cộng Thái Lan, Pinij Jarusombat, đã ra lệnh cho nhân viên y tế ở tỉnh Nan và các tỉnh lân cận kiểm tra măng tre tại các chợ xem những sản phẩm này có nhiễm vi khuẩn Clostridium botulinum hay không. Huyện Ban Luang (tỉnh Nan), tâm điểm dịch bệnh, đã cấm bán và vận chuyển mang tre đóng hộp. Bộ Y tế Công cộng Thái Lan khuyên dân chúng không nên hoảng sợ và nên ăn thức ăn nấu chín, phải luộc măng tre trong 30 phút. Theo Christopher Braden, chuyên gia Trung tâm Atlanta của Trung tâm Kiểm soát và Phòng bệnh của Mỹ (CDC), đây là một trong những đợt ngộ độc thức ăn lớn nhất trong nhiều thập kỷ nay trên thế giới. Vào đợt bùng phát năm 1991, 90 người ở Ai Cập đã phát bệnh sau khi ăn thức ăn chứa vi khuẩn Clostridium botulinum. 2.3.9. Các phương pháp phát hiện Clostridium botulinum 2.3.9.1. Phương pháp truyền thống Thử nghiệm độc tố Clostridium botulinum trong chuột Trong tất cả những phương pháp pháp hiện và xác định độc tố botulinum trong thực phẩm thì trong phương pháp phát hiện trên cơ thể chuột là tiêu chuẩn duy nhất để xác định độc tố. Sự hiện diện của chất độc được phát hiện bằng cách tiêm vào chuột trích xuất từ thực phẩm rồi sau đó quan sát cho đặc tính triệu chứng của bệnh ngộ độc khi chuột chết sau khoảng thời gian 48 giờ. A. Thiết bị và vật liệu 1. Tủ lạnh. 2. Khăn khô sạch. 3. Đèn Bunsen. 4. Gạc thấm vô khuẩn có thể mở. 5. Cối và chày vô trùng. 6. Chiếc kẹp vô trùng. 7. Những ống hút được nút bởi bông vô trùng. 8. Thiết bị pipet cơ khí (không bao giờ được hút pipet bằng miệng). 9. Những ống nghiệm nuôi cấy. 10. Bình kỵ khí. 11. Dây cấy vòng. 12. Vườn ươm 35 - 280C. 13. Bình mẫu vô trùng. 14. Những cái giá treo đồ ống nghiệm nuôi cấy. 15. Những tiêu bản hiển vi. 16. Kính hiển vi. 17. Đĩa petri vô trùng 100 mm. 18. Máy ly tâm ống. 19. Máy ly tâm, làm lạnh, tốc độ cao. 20. Tripsin. 21. Những ống tiêm 1 và 3 ml, gạc thấm vô khuẩn,với 25 số đo, 5/ 8 cái kim inch để tiêm thuốc chuột. 22. Chuột nặng 16-24 G. 23. Những cái lồng chuột, thức ăn, những bình lấy mẫu nước,… 24. Lọc Millipore kích thước lỗ 0,45 μm. B. Môi trường và thuốc thử 1. Dung dịch cồn iốt (4% iốt trong 70% ethanol). 2. Canh gan thịt. 3. Dung dịch Trypticase trích xuất từ peptone-men glucose, canh thịt (TPGY) hoặc với trypsin (TPGYT). 4. Lagg volk hoặc lagg volk agar kỵ khí. 5. Gạc thấm vô khuẩn, bộ đệm phốt phát chất gien, độ pH 6.2. 6. Ethanol tuyệt đối. 7. Chất phản ứng nhuộm gam tím crystal violet hoặc dung dịch methylene blue. 8. Nước muối sinh lý học vô khuẩn. 9. Chế phẩm thuốc kháng độc các loại AF (lấy từ CDC). 10. Dung dịch Trysin. 11. Dung dịch Sodium hydroxide 1 N. 12. Dung dịch Axít clohiđric 1 N. C. Chuẩn bị mẫu - Kiểm tra sơ bộ: Mẫu được giữ lạnh cho đến khi thử nghiệm, trừ các loại thực phẩm đóng hộp chưa mở, mà không cần phải được làm lạnh. Trước khi thử nghiệm, ghi tên sản phẩm, tên nhà sản xuất hoặc chủ sản xuất, nguồn gốc của mẫu, loại container và kích cỡ, nhãn mác, lô hàng sản xuất, mã sản xuất, và tình trạng của container. Làm sạch container đánh dấu với mã số nhận dạng của phòng thí nghiệm. - Thực phẩm rắn và lỏng: Chuyển giao các loại thực phẩm vô trùng lỏng. Ngoài ra, cấy miếng nhỏ các sản phẩm trực tiếp vào canh môi trường với chiếc kẹp vô trùng. Cấy các loại thực phẩm lỏng trực tiếp vào canh môi trường với pipet vô trùng. Dự trữ mẫu sau khi nuôi cấy cho vào ống nghiệm để dành sau này có thể sử dụng lại. - Mở các loại thực phẩm đóng hộp: Kiểm tra bề ngoài các sản phẩm và mùi. Ghi nhớ bất kỳ bằng chứng nào về sự phân hủy. Đừng nếm các sản phẩm dưới bất kỳ trường hợp nào. D. Phát hiện Clostridium botulinum Tăng sinh Loại oxy ra khỏi môi trường bằng cách đun sôi môi trường 10 – 15 phút và làm lạnh nhanh và không cần lắc đều. cấy 2 ống môi trường thịt được đun với 1 – 2 g thực phầm rắn hoặc 1 – 2 ml thực phẩm lỏng trong 15ml moi trường tăng sinh, ủ ở 350C. Cấy 2 ống TPGY như trên,Incubate at 28°C. ủ ở 280C. Use TPGYT as alternative only when organism involved is strongly suspected of being a nonproteolytic strain of types B, E, or F. Sử dụng TPGYT thay thế khi sinh vật phân hủy thuộc nhóm không phân giải protein của các loại B, E, hoặc F. Tiêm thêm chất dẫn truyền độc tố từ dưới bề mặt canh môi trường. Sau 5 ngày ủ bệnh kiểm tra các canh môi trường gồm kiểm tra độ đục, sinh hơi và phân hủy các hạt thịt, mùi. Kiểm tra môi trường nuôi cấy dưới kinh hiển vi, nhuộm gram bằng crystal violet hoặc dung dịch methylene blue. Quan sát hình thái học của sinh vật và lưu ý sự tồn tại của các tế bào Clostridium botulinum điển hình, phạm vi hình thành bào tử và vị trí của các bào tử trong các tế bào. Vào thời điểm quan sát nếu thấy có độc tố thi ta làm theo mục F bên dưới. Thông thường, sau khi ủ 5 ngày là thời kỳ thích hợp cho sự hình thành độc tố botulin. Nếu sau 5 ngày mà không phát hiện thấy độc tố thì ta nên ủ thêm 10 ngày nữa để phát hiện những bào tử nảy mầm trễ trước khi đem bỏ mẫu thử. Phân lập Clostridium botulinum được phân lập từ dịch tăng sinh hoặc mẫu gốc nếu sự hình thành bào tử được tốt. Tiền xử lý mẫu trước khi cấy ria Thêm 1 thể tích cồn tuyệt đối, 1 hay 2 ml vào môi trường tăng sinh, trộn đều và ủ trong 1h ở nhiệt độ phòng. Xử lý bề mặt môi trường nuôi cấy Sử dụng dây cấy vòng khử trùng cấy lên môi trường phân lập để thu được khuẩn lac riêng lẽ. Nếu cần thiết, để có khuẩn lạc riêng lẽ có thể pha loãng môi trường. Ủ 35OC trong khoảng 48 h trong điều kiện kỵ khí. E. Lựa chọn các vùng C. botulinum colonies botulinum điển hình Selection .Chọn lọc Select about 10 well-separated typical colonies, which may be raised or flat, smooth or rough. Lựa chọn khoảng 10 khuẩn lạc đặc trưng có đặc điểm là lồi hoặc. On egg yolk medium, they usually exhibit surface iridescence when examined by oblique light.Trên môi trường lagg vokl, chúng thường có sáng ở bề mặt khi quan sát dưới ánh sáng. This luster zone, often referred to as a pearly layer, usually extends beyond and follows the irregular contour of the colony.Vùng sang thường kéo dài ra rộng và đường viền bất định là các vùng Clostridium botulinum. Besides the pearly zone, colonies of C.Vùng sáng khuẩn lạc của Clostridium botulinum loại C, D, và E bình thường bao quanh bởi một khu vực rộng (2-4 mm) kết tủa màu vàng. Colonies of types A and B generally show a smaller zone of precipitation.Khuẩn lạc của loại A và B nói chung có vùng phát triển nhỏ hơn. Considerable difficulty may be experienced in picking toxic colonies since certain other members of the genus Clostridium produce colonies with similar morphological characteristics but do not produce toxins. Khó khăn nhất là khi chọn các vùng chứa độc tố thì cũng có những vùng khác của chi Clostridium botulinum với đặc điểm hình thái tượng tự nhưng không sản sinh độc tố. Inoculation .Tiêm chủng Use sterile transfer loop to inoculate each selected colony into tube of sterile broth.Sử dụng dây cấy vòng chuyển cấy chuyển vô trùng để cấy chuyển mỗi vùng được chọn vào ống nuôi cấy vô trùng. Inoculate C. Cấy Clostridium botulinum loại E vào canh môi trường TPGY. Inoculate other toxin types of C. Cấy các loại độc tố khác Clostridium botulinum vào canh trường gan xắt nhỏ hoặc môi trường thịt. Incubate as described in D-1, above, for 5 days.Ủ như mô tả trong phần ở trên trong 5 ngày. Test for toxin production as described in F, below. Sau đó xác định sự sản xuất độc tố như mô tả trong phần F phía dưới. To determine toxin type, see F-3, below. Phân lậpIsolation of pure culture .PHANÂN LAPÂẬP Cấy chuyển các chủng sinh độc tố trên 3 đĩa Restreak toxic culture in duplicate on egg yolk agar mediummôi trường thạch lagg vokl. Incubate one plate anaerobically at 35°C.Ủ đĩa thứ nhất kỵ khí ở 35 ° C. Incubate second plate aerobically at 35°C. Ủ đĩa thứ 2 hiếu khí tại 35 ° C. If colonies typical of C. Nếu vùng điển hình của Clostridium botulinum được tìm thấy chỉ trên đĩa kỵ khí (không có sự tăng trưởng trên đĩa hiếu khí) thì các khuẩn lạc trên môi trường là thuần khiết. Việc phân lập Clostridium botulinum thất bại do việc chọn khuẩn lạc đặc trưng. Repeated serial transfer through additional enrichment steps may increase the numbers sufficiently to permit isolation.Lặp đi lặp lại qua các bước tăng sinh có thể làm tăng số lượng đủ để quá trình phân lập.Store pure culture in sporulated state either under refrigeration, on glass beads, or lyophilized. F.Detection and identification of botulinal toxin Phát hiện và xác định các độc tố botulin Preparation of food sample .Chuẩn bị các mẫu thực phẩm. Culture one portion of sample for detection of viable C. Mẫu môi trường phát hiện có độc tố C. botulinum ; remove another portion for toxicity testing, and store remainder in refrigerator. botulinum, lấy một phần để thử nghiệm độc tính, và phần còn lại lưu trữ trong tủ lạnh. Centrifuge samples containing suspended solids under refrigeration and use supernatant fluid for toxin assay.Ly tâm các mẫu có chứa chất rắn lơ lửng trong điều kiện lạnh và sử dụng chất lỏng nổi trên mặt cho thử nghiệm độc tố. Extract solid foods with equal volume of gel-phosphate buffer, pH 6.2, by macerating food and buffer with pre-chilled mortar and pestle. Determination of toxicity in food samples or cXác định tính độc tố trong các mẫu thực phẩm hoặc môi trường - Xử lý bằng trypsin: Độc tố của các loại không phân hủy protein, nếu có hiện diện, có thể cần hoạt tính của trypsin để phát hiện. Do đó, việc xử lý dịch của thực phẩm, thực phẩm lỏng hoặc nuôi cấy trên môi trường TPGY với trypsin trước khi kiểm tra độc tố. Không xử lý môi trường nuôi cấy TPGYT bằng trypsin vì trong môi trường này đã có chứa sẵn trypsin và việc xử lý nhiều có thể làm phân hủy hoàn toàn độc tố. Điều chỉnh lại pH của dịch mẫu đến 6,2 bằng cách sử dụng NaOH hoặc HCl 1N. Thêm 0,2 ml dung dịch trypsin vào 1,8 ml mỗi dịch mẫu cần kiểm tra độc tố. Ủ ở 35 – 370C trong 1 h và thỉnh thoảng lắc nhẹ. - Kiểm tra độc tố: Toxicity testing .Conduct parallel tests with trypsin-treated materials and untreated duplicaTiến hành thử nghiệm song song mẫu không xử lý trypsin với mẫu được xử lý trypsisn. Dilute a portion of untreated sample fluid or culture to 1:5, 1:10, and 1:100 in gel-phosphate buffer. Pha loãng một phần của mẫu chất lỏng không được xử lý trypsin với nồng độ 1:5, 1:10 và 1:100 trong gel-phosphate buffer. Thực hiện tương tự đối với mẫu được xử lý trypsinMake the same dilutions of each trypsinized sample fluid or culture.. Mỗi độ pha loãng tiến hành Inject each of separate pairs of mice intraperitoneally (ip) with 0.5 ml untreated undiluted fluid and 0.5 ml of each dilution of untreated test sample, using a 1 or 3 ml syringe with 5/8 inch, 25 gauge needle.tiêm vào mỗi cặp chuột ở bụng với 0,5 ml dung dịch không pha loãng và không được xử lý và 0,5 ml của mỗi độ pha loãng của mẫu thử nghiệm không được xử lý. Repeat this procedure with trypsin-treated duplicate samples. Lặp lại thao tác này với mẫu được xử lý với trypsin. Heat 1.5 ml of untreated supernatant fluid or culture for 10 min at 100°C.Đun nóng 1,5 ml dịch nổi không được xử lý trong 10 phút ở 100°C. Làm lạnh mẫu đã gia nhiệt và tiêm vào một đôi chuột Cool heated sample and inject each of a pair of mice with 0.5 ml undiluted fluid.0,5 ml dung dịch không pha loãng. These mice should not die, because botulinal toxin, if present, will be inactivated by heating.Những con chuột này không chết, bởi vì nếu có độc tố botulin, sẽ được bất hoạt bởi nhiệt. - Observe all mice periodically for 48 h for symptoms of botulism.Quan sát tất cả các con chuột định kỳ trong 48 h cho các triệu chứng của bệnh ngộ độc. Record symptoms and deaths. Ghi lại các triệu chứng và tử vong. Typical botulism signs in mice begin usually in the first 24 h with ruffling of fur, followed in sequence by labored breathing, weakness of limbs, and finally total paralysis with gasping for breath, followed by death due to respiratory failure. Dấu hiệu ngộ độc điển hình ở chuột bắt đầu xuất hiện trong 24 h đầu tiên ở lông, tiếp theo khó thở, yếu chân tay, và cuối cùng tê liệt với thở nhanh, sau đó là tử vong do suy hô hấp. Death of mice without clinical symptoms of botulism is not sufficient evidence that injected material contained botulinal toxin. Cái chết của con chuột mà không có triệu chứng lâm sàng của bệnh ngộ độc là không đủ bằng chứng cho thấy chứa độc tố tiêm botulin. On occasion, death occurs from other chemicals present in injected fluid, or from trauma. Đôi khi, cái chết xảy ra từ các hóa chất khác có trong dung dịch tiêm, hoặc từ chấn thương. If after 48 h of observation, all mice except those receiving the heated preparation have died, repeat the toxicity test, using higher dilutions of supernatant fluids or cultures. It is necessary to have dilutions that kill and dilutions that do not kill in order to establish an endpoint or the minimum lethal dose (MLD) as an estimate of the amount of toxin preseNếu sau 48h quan sát, ngoại trừ tất cả những con chuột đã chết, lặp lại các thử nghiệm độc tính bằng cách sử dụng dịch nổi được pha loãng ở nồng độ cao hơn. Cần phải pha loãng dung dịch từ không giết chết con chuột đến giết chết con chuột để thiết lập một liều tối thiểu gây chết người (MLD) trước khi ước tính số lượng độc tố có mặt. The MLD is contained in the highest dilution killing both mice (or all mice inoculated). Các MLD có độ pha loãng cao nhất giết chết cả hai con chuột (hoặc tất cả các con chuột được tiêm),From these data, the number of MLD/ml can be calculated. từ những dữ liệu này số ml / MLD có thể được tính toán. Store pure culture in sporulated state either under refrigeration, on glass beads, or lyophilized.To determine toxin type, see F-3, below.2.3.9.2. Phương pháp hiện đại Phương pháp Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) Đựợc sử dụng để phát hiện độc tố hoạt tính sinh học và sự dò tìm độc tố không tích cực.Những tiến bộ kỹ thuật trong vài thập niên vừa qua thúc đẩy sự phát triển của nhiều kỹ thuật chuẩn đoán huyết thanh nhanh nhạy, chính xác các bệnh truyền nhiễm. Mặt khác, sự phát triển của những kỹ thuật tự động cho phép đơn giản hóa thao tác thực hiện. Nguyên tắc của phương pháp miễn dịch là phản ứng kết hợp giữa một tế bào (kháng nguyên) với một kháng thể đặc hiệu. Tín hiệu của phản ứng miễn dịch có thể nhận biết thông qua sự ngưng tủa hay kết dính của kháng nguyên – kháng thể hoặc bằng cách sử dụng những kháng thể đã được đánh dấu (bằng chất nhuộm huỳnh quang, đồng vị phóng xạ hay enzyme). Trong số các phương pháp phân tích miễn dịch, phương pháp hấp phụ miễn dịch dùng enzyme (Enzyme – Linked Immunosorbent Assay: ELISA) được quan tâm nhiều nhất do có tính đơn giản và hiệu quả cao. Phương pháp này có thể sử dụng cho hầu hết các loại kháng nguyên với độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Nguyên tắc của kỹ thuật ELISA là sử dụng kháng thể đơn dòng phủ bên ngoài những đĩa giếng. Nếu có sự hiện diện của kháng nguyên mục tiêu trong mẫu, kháng nguyên này sẽ giữ lại trên bề mặt giếng. các kháng nguyên này sẽ được phát hiện bằng cách sử dụng kháng thể thứ cấp có gắn với enzyme như horseradish peroxydase hay alkaline phosphate. Khi bổ sung một cơ chất đặc hiệu của enzyme vào giếng, enzyme xúc tác phản ứng thủy phân cơ chất để tạo ra các sản phẩm có màu hay phát sáng. Bằng cách theo dõi sự đổi màu có thể phát hiện sự hiện diện và định lượng kháng nguyên. ELISA đã được sử dụng rộng rãi dưới dạng các bộ kit thương mại và có thể được cải tiến để tự động hóa. ELISA có thể sử dụng phát hiện và định lượng vi sinh vật trong thực phẩm trong thời gian vài giờ sau khi tăng sinh. b. Phương pháp lai phân tử Hiện nay nhiều hệ thống đã được thiết lập dựa trên DNA để định lượng vi sinh vật và độc tố. Tuy nhiên, chỉ có phương pháp lai phân tử (hay còn gọi là phương pháp mẫu dò, probes) và phương pháp PCR là được thương mại hóa dưới dạng các bộ kit phát hiện vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm. Phương pháp sử dụng mẫu dò để phát hiện vi sinh vật trong thực phẩm được dựa trên sự phát hiện một đoạn gen đặc trưng của vi sinh vật. Cơ sở của việc sử dụng mẫu dò là phương pháp lai phân tử. Quá trình này bao gồm sự tách rời hai mạch đôi của chuỗi xoắn kép DNA khi nhiệt độ vượt quá nhiệt độ nóng chảy (Tm) của phân tử DNA và sự tái bắt cặp các trình tự nucleotide bổ sung khi nhiệt độ trở lại bình thường. Sự lai phân tử xảy ra khi đoạn mồi có trình tự nucleotide bổ sung với một vùng trình tự trên DNA mục tiêu gặp nhau do chuyển động nhiệt và khi nhiệt độ môi trường thấp hơn Tm ít nhất vài độ. Quá trình lai phân tử chiu ảnh hưởng bởi rất nhiều yếu tố: nồng độ DNA trong môi trường, nhiệt độ và thời gian phản ứng, kích thước các trình tự lai và lực ion của môi trường. Ví dụ: Ở hệ thống dò Gen – trak (Framingham, USA), hệ thống này sử dụng que thử với mẫu dò để phát hiện Listeria trong mẫu bơ sữa và mẫu môi trường. mẫu dò là những đoạn oligomer AND đánh dấu bằng hóa chất phát quang. Quy trình phân tích có thể chia làm 6 bước: Phá vỡ tế bào thu nhận rRNA Mẫu dò phát hiện chứa fluorescein isothiocyanate ở đầu 5` và 3` của phân tử được đặt vào phản ứng. Que thử được bao bọc bởi polydeoxythymidine (dT) để gắn được với oligodA của mẫu dò. Que thử được đặt trong ống đo chứa mẫu dò phát hiện được đánh dấu bằng enzyme Sau khi rửa loại phần enzyme thừa, que thử được đặt vào ống đo chứa cơ chất tạo màu. Sau khi ủ để hiện màu, màu được phát hiện ở bước sóng 450nm. c. Phương pháp PCR Phương pháp PCR (polymerase chain reaction) là phương pháp invitro để tổng hợp DNA dựa trên khuôn là một trình tự DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng bản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme polymerase và một cặp mồi (primer) đặc hiệu cho đoạn DNA này. Kỹ thuật này do Karl Mullis mà cộng sự phát minh vào năm 1985. Hiện nay, kỹ thuật này được sử dụng rộng rãi để phát hiện, tạo ra các đột biến gen, chẩn đoán bệnh, phát hiện các mầm bệnh vi sinh vật có trong thực phẩm… Tất cả các DNA polymerase đều cần những mồi chuyên biệt để tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn. Mạch khuôn thường là một trình tự DNA của gen (gọi là trình tự DNA mục tiêu) đặc trưng cho loài vi sinh vật mục tiêu hoặc là gen quy định việc tổng hợp một loại độc tố chuyên biệt của vi sinh vật này. Mồi là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của đoạn mạch khuôn và nhờ hoạt động của DNA polymerase đoạn mồi này được nối dài để hình thành mạch mới. Phương pháp PCR được hình thành dựa trên đặc tính này của DNA polymerase. Khi có sự hiện diện của hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu của một trình tự DNA trong phản ứng PCR, ở điều kiện đảm bảo hoạt động của DNA polymerase, đoạn DNA nằm giữa hai mồi sẽ được khuếch đại thành số lượng lớn bản sao đến mức có thể thấy được sau khi nhuộm bằng ethidium bromide và có thể thu nhận được đoạn DNA này cho các mục đích thao tác trên gen. Như vậy, để khuếch đại một trình tự DNA xác định, cần phải có những thông tin tối thiểu về trình tự của DNA, đặc biệt là trình tự base ở hai đầu đoạn đủ để tạo các mồi bổ sung chuyên biệt. Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lặp lại nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm 3 bước: - Bước 1: Biến tính Trong một dung dịch phản ứng bao gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn Tm của phân tử, thường là 94 – 95oC trong 30 – 60 giây. Mạch đôi DNA tách ra thành dạng mạch đơn. - Bước 2: Bước lai Nhiệt độ được hạ thấp hơn Tm của các mồi cho phép các mồi bắt cặp với mạch khuôn, nhiệt độ này khoảng 40 – 70oC, trong khoảng 30 – 60 giây. Bước 3: Tổng hợp Nhiệt độ được tăng lên đến 72oC giúp cho DNA polymerase hoạt động tổng hợp tốt nhất. Thời gian của bước này tùy thuộc độ dài trình tự DNA cần khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút. Trong phản ứng PCR, một chu kỳ gồm 3 bước như trên sẽ lặp lại nhiều lần, mỗi lần lặp lại làm tăng gấp đôi lượng mẫu của lần trước. đây là sự khuếch đại theo cấp số nhân. Theo tính toán sau 30 đến 40 chu kỳ sự khuếch đại sẽ tạo ra 106 bản sao. Sau phản ứng PCR, các DNA được nhuộm bởi ethidium bromide và có thể quan sát thấy thông qua việc điện di sản phẩm PCR trong gel agarose và quan sát dưới tia UV (bước sóng 320nm). Quy trình chung cho việc phát hiện vi khuẩn gây bệnh trong mẫu thực phẩm bằng phương pháp PCR như sau: - Bước 1: Tăng sinh trên môi trường không hoặc ít chọn lọc trong thời gian từ 10 – 20 giờ. - Bước 2: Thu dịch nuôi cấy, ly tâm bỏ mảnh vụn, ly tâm gộp sinh khối tế bào vi khuẩn, huyền phù tế bào trong dung dịch TE (10mM Tris – HCl pH= 8,0, 1mM EDTA) với thể tích bằng 1/10 thể tích dịch nuôi cấy ban đầu, xử lý nhiệt ở 100oC trong 10 phút, ly tâm loại bỏ tạp chất không tan ức chế phản ứng PCR. - Bước 3: Thực hiện phản ứng PCR - Bước 4: Điện di trên gel agarose 1,5% xem kết quả trên đèn UV. 2..4. Biện pháp kiểm soát Clostridium botulinum trong thực phẩm Không dùng đồ conserve đựng trong lon mà nắp đã phồng lên, hoặc chảy nước. Cẩn thận với những món rau cải, tỏi ngâm dầu và được vô keo vô hũ tại nhà. Nếu trường hợp tự làm conserve thì nguyên liệu tươi cần phải cất trong tủ lạnh và phải quăng đi sau 10 ngày. Không dùng thực phẩm hư, nổi bọt, thúi hoặc bốc mùi lạ lúc nấu. Không nên ăn, nếu nghi ngờ đồ conserve không được vô keo vô lọ cẩn thận đúng phép vệ sinh. Không nên cho các cháu dưới một tuổi ăn mật ong kể cả loại sản phẩm đã có ghi chú trên nhãn hiệu như…đã được hấp khử trùng pasteurized… Giữ vệ sinh tối đa trong các giai đoạn làm đồ conserve tại nhà. Nếu có máy autoclave để hấp khử thì lý tưởng nhất. Nếu ở nhà không có máy hấp autoclave chúng ta tạm áp dụng phương pháp nước nóng mỗi khi cần vô keo làm đồ conserve. Keo và nắp cần được nấu trong nước sôi để diệt trùng. Sau khi bỏ nguyên vật liệu vào keo, đậy nắp lại cho thật kỹ rồi sau đó đem bỏ vào một nồi nước thật sôi để khử trùng một lần chót. Chương 3: KẾT LUẬN Clostridium botulinum là một vi khuẩn nguy hiểm vi chúng tiết độc tố botulin tác động ảnh hưởng đến hệ thần kinh trung ương gây tê liệt từng phần trên cơ thể rồi dần toàn bộ cơ thể con người và động vật. Tuy nguy hiểm như vậy nhưng độc tố botulin cũng có được vài ứng dụng ích lợi trong y khoa trị liệu: Độc tố A được sử dụng để trị những xáo trộn thần kinh gây sự co thắt cơ, bệnh chứng gây ngứa ngái ngoài da, đau cơ vùng mặt (douleur myofaciale), tiết quá nhiều mồ hôi (hyperhidrose), nhức đầu (migraine)... Tuy bệnh nhiễm vi khuẩn Clostridium botulinum rất ít khi xảy ra nhưng không phải vì thế mà chúng ta quên đi sự phòng tránh, mà phải tuân thủ những biện pháp kiểm soát chúng vì độc tố của vi khuẩn này rất mạnh khi bi nhiễm tỷ lệ tử vong rất cao. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1. Phùng Quốc Chướng: “Tình hình nhiễm Salmonella ở lợn vùng Tây Nguyên và khả năng phòng trị ” Luận án PTS khoa học nông nghiệp, HN 1995. 2. Hồ Văn Nam, Nguyễn Thị Đào Nguyên, Trương Quang, Phùng Quốc Chướng, Chu Đức Thắng, Phạm Ngọc Thạch: “Bệnh viêm ruột ỉa chảy ở lợn”, KHKT thú y - tập I, hội thú y VN 1997. 3. Đại cương về phương pháp kiểm tra vi sinh thực phẩm - Trung tâm kỹ thuật tiêu chuẩn đo lường chất lượng 3 - năm 1997. Kiểm tra vệ sinh chất lượng sản phẩm - Tô Minh Châu - năm1999. Tiếng Anh 4. CDC . Botulism.5. ACIA. Botulisme (Clostridium botulinum).6. FDA. C.botulinum.7. Dr Philippe Abimelec. Traitement des rides par la toxine botulique de type A. 8. Binz, T., H. Kuranzono, M. Wille, J. Frevert, K. Wernars, and H. Niemann. (1990) J. Biol. Chem. 265, 9153-9158. Craven, K. E., J.L. Ferreira, M.A. Harrison, and P. Edmonds. (2002) JOAC 85 (5), 1025-1028. East, A.K., P.T. Richardson, D. Allaway, M. D. Collins, T. A. Roberts, and D.E. Thompson. (1992) FEMS Microbiol. Lett. 75, 225-230. Ferreira, J.L., M.K. Hamdy, S.G. McCay, and B.R. Baumstark. (1992) J. Rapid Methods and Automation in Microbio. 1,29-39. Ferreira, J.L., and R.G. Crawford. (1998) J. Rapid Methods and Automation in Microbio. 6,289-296.