Khóa luận Tổng quan về độc tố Mycotoxin trong thực phẩm

toxin Mycotoxin gây hội chứng nhiễm độc tim: axit penicilic Mycotoxin gây nhiễm độc thần kinh: clavanin Mycotoxin gây sảy thai, động đực: zearalenon Mycotoxin gây xuất huyết Phân loại mycotoxin theo bệnh lý thường không chính xác do một độc tố có thể gây nhiều hội chứng khác nhau, ngược lại, một hội chứng có thể do nhiều độc tố cùng gây nên. 2.2.4. Điều kiện phát triển và tổng hợp mycotoxin của nấm mốc Sự phát triển nấm mốc trên nông sản thực phẩm bao gồm: Hoạt độ nước Nồng độ ion hydro Nhiệt độ Hàm lượng các khí trong khí quyển bảo quản – CO2 và O2 Trạng thái nông sản thực phẩm rắn, lỏng Bản chất môi trường dinh dưỡng – nông sản thực phẩm Ảnh hường của một số chất tan đặc biệt Chất bảo quản Trong quá trình bảo quản nông sản thực phẩm, một vài yếu tố trên có thể được cố định hoặc ổn định. Thông thường các sản phẩm ở trạng thái rắn, pH gần trung tính là môi trường thích hợp cho nấm mốc phát triển. Do vậy, các yếu tố còn lại như hoạt độ của nước, nhiệt độ, khí, chất bảo quản là các yếu tố quyết định sự phát triển của nấm mốc trong nông sản thực phẩm. Hoạt độ của nước Hoạt độ nước (aw) là yếu tố quan trọng định lượng quan hệ giữa hàm lượng nước trong thực phẩm và vi sinh vật phát triển trên chúng. Về mặt giá trị, aw bằng độ ẩm tương đối ở trạng thái cân bằng của một sản phẩm biểu diễn ở dạng thập phân (ví dụ 0,30). Nếu như một thực phẩm được giữ tại một nhiệt độ ổn định trong một bao bì kín, sau một thời gian, hàm lượng nước trong thực phẩm sẽ đạt tới cân bằng với hơi nước trong môi trường khí bao quanh, khí ấy: aw = HRkk/100 Trong rất nhiều trường hợp, aw là nhân tố môi trường chủ yếu kiểm soát sự phát triển của nấm mốc và xác định độ ổn định của sản phẩm bảo quản. Như mọi sinh vật khác, nấm mốc cần có nước để tồn tại và sinh sản. Khả năng chịu đựng môi trường có hoạt độ nước thấp của nấm mốc thường cao hơn các vi sinh vật khác. Trong số các nấm mốc, có nhóm nấm mốc thuộc vào nhóm sinh vật ưa khô. Một vài loài nấm mốc có khả năng phát triển ở aw = 0,75 hoặc thấp hơn trong vòng sáu tháng. Như vậy các thực phẩm nông sản nếu được bảo quản trong không khí 75% hoặc 85% ẩm có thể bị nấm mốc ưa khô tấn công trong điều kiện bảo quản bình thường. Nhiệt độ Nhiệt độ là tác động chủ yếu tới sự sinh sản và nảy mầm của bào tử nấm mốc. Theo nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển của nấm mốc được chia thành 5 loại: Nấm mốc ưa nhiệt đến 600C Nấm mốc chịu nhiệt 20 – 500C Nấm mốc ưa nhiệt 10 – 500C Nấm mốc ưa lạnh 5 – 100C Nấm mốc ưa băng giá (dưới 100C) Hầu hết các nông sản đặc biệt là ngũ cốc đều được bảo quản ở nhiệt dộ thích hợp cho sự phát triển của các nhóm nấm mốc. Nông sản thực phẩm bảo quản của các nước nhiệt đới thường bị các Aspergillus tấn công vì các Aspergillus phát triển thích hợp trong điều kiện nhiệt độ ấm (300C) và không khắc khe về độ ẩm (85%). Môi trường khí điều tiết Giảm hàm lượng oxy hoặc tăng hàm lượng cacbonic trong khí quyển bảo quản nông sản thực phẩm đều có tác dụng hạn chế sự đáng kể sự phát triển của nấm mốc. Chất bảo quản Thông thường các chất chống mốc, chống sâu hại thường có tác dụng hạn chế sự phát triển của nấm mốc. Tuy nhiên không được phép áp dụng các dạng chế phẩm này cho các sản phẩm dùng cho người. Đôi khi trong thức ăn gia súc, người ta có thể sử dụng các chất bảo quản gốc axit như propionat. Phối hợp các yếu tố Thường thì các yếu tố không tác động riêng rẽ tới sản phẩm, mà ảnh hưởng của các yếu tố là đồng thời. thông thường nếu phối hợp các yếu tố hạn chế đồng thời bảo quản sản phẩm thì các sản phẩm có thể được bảo quản trong một thời gian dài hơn. Ví dụ, bảo quản ở aw thấp, nhiệt độ thấp, khí quyển điều tiết sẽ kéo dài thời gian bảo quản sản phẩm. Trong điều kiện bảo quản tự nhiên, aw là yếu tố chủ đạo xác định thời gian bảo quản của một sản phẩm “nhanh chóng sấy khô sản phẩm và bảo quản sản phẩm khô ráo” trở thành phương pháp hiệu quả nhất đảm bảo sản phẩm không bị nấm mốc tấn công, vì vậy khả năng không bị nhiễm mycotoxin cũng được đảm bảo. Trong nhiều trường hợp, điều kiện phát triển của nấm mốc trên nông sản thực phẩm không trùng với điều kiện tối ưu cho tổng hợp mycotoxin của chúng. 2.2.5. Độc tính Mycotoxin Những bệnh do mycotoxin gây nên trước tiên biểu hiện ở tổn thương gan và thận. Có thể quan sát được sự xuất hiện các u gan, thoái hoá tế bào nhu mô gan, xơ hoá và tăng sinh ống dẫn mật của các tác động vật hấp thu các độc tố. Ngoài ra, có thể nhận thấy có triệu chứng tăng ure huyết, albumin niệu và viêm cầu thận. Một số mycotoxin gây hội chứng chảy máu, triệu chứng ngưng kết hồng cầu hoặc hiện tượng tiêu máu rất nguy hiểm thường gặp ở động vật và người bị nhiễm độc tố nấm mốc. Mycotoxin còn có thể làm suy yếu hệ thống miễn dịch của cơ thể. Nhiều mycotoxin như aflatoxin, ochratoxin, funomisin có thể là các chất gây biến dị, gây hội chứng ung thư, quái thai. Ngoài ra, mycotoxin còn có thể gây mất cân bằng trong chuyển hoá thức ăn và giảm tỉ lệ sinh sản của vật nuôi. Bên cạnh đó, các dẫn xuất của mycotoxin thường độc đối với hệ thần kinh và do vậy gây tổn hại hệ thống cơ và gây rất nhiều hội chứng khác như: bện ngoài da, chứng tăng sừng hoá, tác động gây động đực sẩy thai. Ngoài các tác động trực tiếp, mycotoxin còn có khả năng gây các hội chứng gián tiếp như ức chế vitamin, ăn không miệng, hoặc biến đổi các chất khác thành các chất độc. Tuy nhiên, bệnh do mycotoxin gây nên không có tính di truyền, không lây nhiễm, không gây nhiễm trùng. 2.2.6. Các biện pháp kiểm soát mycotoxin Nếu điều kiện môi trường thuận lợi thì nấm sẽ phát triển, và rất khó tránh khỏi tình trạng thực liệu bị nhiễm độc tố. Tuy nhiên nếu ngăn chặn sự phát triển của nấm có hiệu quả thì tất nhiên sẽ hạn chế được sự tác động của độc tố. Việc ngăn chặn có thể được thực hiện trước khi thu hoạch, luân canh hợp lý, lựa chọn hạt giống tốt (chất lượng hạt giống, thích nghi trong nhiều điều kiện trồng trọt), mật độ trồng thích hợp, bón phân đúng cách, tất nhiên ta sẽ ngăn chặn được côn trùng và nấm. Thu hoạch đúng thời gian và trong điều kiện tốt thì sẽ tránh làm hư hại sản phẩm, sau đó loại các hạt bị hư và bị ẩm, sau đó dự trữ các hạt còn lại càng sớm càng tốt. Cuối cùng, trong suốt quá trình dự trữ, cần điều chỉnh đúng nhiệt độ, độ ẩm, côn trùng, các loài gặm nhấm, và sử dụng hiệu quả chất ức chế nấm mốc sẽ ngăn chặn được độc tố có trong thức ăn như: Aureofugin, thiramtan, Orthophenyl phenat, Bordeaux mixture. Các acid hữu cơ như: Propionic, Sorbic, Lactic, acetic và Benzoic. Nhưng nên lưu ý rằng, ngăn chặn không có nghĩa là loại bỏ được độc tố có trong thức ăn. Có rất nhiều phương pháp được thử nghiệm nhằm để loại bỏ độc tố nấm mốc như: xử lý với ammonia, cùng với nhiệt và áp suất, xử lý bằng ozone, khí chlorine, ammonium hydroxide, hydrogen peroxide, acid hydrochloric và khí sulphur dioxide, formaldehyde, sấy nhiệt, xử lý bằng tia UV. Các phương pháp như tách vỏ, đánh bóng, sàng lọc cũng được áp dụng. 2.3. CÁC MYCOTOXIN ĐIỂN HÌNH 2.3.1. Aflatoxin Aflatoxin là độc tố được nghiên cứu kỹ nhất trong số tất cả các độc tố nấm mốc. Là hợp chất trao đổi thứ cấp của một số nấm mốc điển hình như Aspergillus flavus và A. parasiticus, aflatoxin nhiễm rất phổ biến trên các nông sản nông nghiệp trước và sau thu hoạch. Mặc dù được phát hiện chỉ từ đầu những năm 1960, nhưng tác hại do aflatoxin gây ra đã được biến đến từ trước đó. Aflatoxin thường có trong các loại hạt có dầu như lạc đậu nành, hạt điều, hạt hướng dương, vừng, kẹo lạc, kẹo hạt điều, lạc muối, lạc rang¼hay trên các loại hạt ngũ cốc, bột dinh dưỡng, thức ăn gia súc có nguồn gốc từ hạt ngũ cốc. 2.3.1.1. Nguồn gốc Aflatoxin Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus thuộc họ nấm cúc, là loại nấm sản sinh ra aflatoxin trong tự nhiên và trong môi trường nuôi cấy nhân tạo. Đây là loài nấm khá phổ biến. Hai loài nấm mốc này có thể phát triển trên nhiều loại cơ chất, trên các lọai hạt có dầu, thậm chí có trên cả bột cá và thịt giàu protein. Nguyên liệu làm thức ăn chăn nuôi là những đối tượng thích hợp nhất cho sự phát triển và sản sinh độc tố. Các chủng nấm mốc tổng hợp aflatoxin chủ yếu thuộc loài Aspergillus, tập trung chủ yếu vào 3 chủng A. flavus, A. parasiticus và A. nomius. Người ta xác định được rằng sự tổng hợp các aflatoxin là sự tác động qua lại của genotip của chủng nấm mốc và điều kiện môi trường ngoài. A. flavus là chủng nấm mốc điển hình của hệ nấm mốc không khí và đất, được tìm thấy hầu hết các nông sản bảo quản như ngô, lúa gạo, lúa mì, hạt bông, lạc, đậu tương, ớt…. Chủng nấm mốc này rất thích hợp với điều kiện khí hậu ẩm và nóng như Việt Nam và các nước nhiệt đới. Chúng thậm chí có thể phát triển ở điều kiện độ ẩm thấp hơn 75 – 80%. Ở điều kiện nhiệt độ và độ ẩm cao khả năng tổng hợp aflatoxin của A. flavus rất cao. Hình 2.7: Nấm mốc A. flavus Hình 2.8: Nấm mốc A. parasiticus Việc chuyển hoá aflatoxin trong cơ thể bị nhiễm độc khá nhanh. Chỉ sau 48h, phát hiện thấy 85% lượng aflatoxin được chuyển hoá trong sữa và bài tiết trong nước tiểu của động vật được cho ăn một liều duy nhất 0.05 mg/kg aflatoxin (aflatoxin B1: 44%, aflatoxin G1: 44% và aflatoxin B2: 2%). Không phát hiện thấy aflatoxin sau 4 ngày trong sữa, sau 6 ngày trong phân và nước tiểu. Việc nhiễm aflatoxin không chỉ gây nhiễm độc chuỗi thực phẩm và những hậu quả trầm trọng trong sức khoẻ người tiêu dùng mà còn gây ra tổn thất về kinh tế và thương mại. Hình 2.9: Ngô bị nhiễm mốc Aflatoxin 2.3.1.2. Cấu trúc của Aflatoxin Năm 1962, người ta phát hiện cấu trúc đa dạng khác nhau của aflatoxin bao gồm 18 dạng hợp chất đa vòng bifuran như B1, B2, G1, G2, GM1, M1, M2, P1, Q1,… và các dẫn xuất methoxy, ethoxy và acethoxy. Tuy vậy chỉ có một số ít trong aflatoxin, đặc biệt là aflatoxin B1, được nấm mốc tổng hợp trên nông sản, là các hợp chất tự nhiên. Các chất còn lại là chất trao đổi chất hoặc là dẫn xuất. Các aflatoxin có khả năng phát huỳnh quang và hấp thụ mạnh tia tử ngoại (365 nm) ở các mức độ khác nhau. Aflatoxin B1, và B2 phát tia huỳnh quang xanh da trời trong khí G1 và G2 phát huỳnh quang màu xanh nước biển. Aflatoxin M1, M2 là một dẫn xuất từ aflatoxin B1 và B2 được tìm thấy trong sữa, các sản phẩm từ sữa hoặc thịt. Chúng được hình thành do quá trình trao đổi chất của B1 và B2 trong cơ thể động vật sau khi chúng ăn phải thức ăn bị nhiễm nấm mốc. Hình 2.10: Cấu trúc hoá học của một số loại Aflatoxin 2.3.1.3. Độc tính của Aflatoxin Ở người Ø Ngộ độc cấp tính Xảy ra khi aflatoxin xâm nhập vào cơ thể qua đường ăn uống ở liều lượng cao trong thời gian ngắn. Những triệu chứng cấp tính chuyên biệt của bệnh này bao gồm sự xuất huyết, hủy hoại gan cấp tính, phù, thay đổi trong đường tiêu hóa, hấp thu các sản phẩm trao đổi chất và chết. Ø Ngộ độc mãn tính Khi hấp thụ aflatoxin ở liều lượng tự thấp đến trung bình qua đường ăn uống trong thời gian kéo dài. Những ảnh hưởng này có thể là cận lâm sàng và khó có thể nhận biết. Một số triệu chứng như sự chuyển hóa thức ăn yếu, tỷ lệ tăng trưởng thấp hơn và có thể có xảy ra một số triệu chứng giống như ngộ độc aflatoxin cấp tính. Những triệu chứng này gây ngộ độc mãn tính trên gan có thể dẫn đến ung thư gan. Ở động vật Các triệu chứng nhiễm độc aflatoxin được nghiên cứu thông qua các vụ nhiễm độc tự nhiên và qua thử nghiệm phòng thí nghiệm trên động vật. Sự nhiễm độc aflatoxin được thể hiện qua hàng loạt các triệu chứng cấp tính hay mãn tính. Sự nhiễm độc mãn tính aflatoxin có tính di truyền theo ba kiểu: gây ung thư, quái thai, gây đột biến. Hậu quả của việc nhiễm aflatoxin phụ thuộc rất nhiều vào tuổi, giới tính, loài, tình trạng dinh dưỡng, mức và tần suất tiếp xúc. Nhiễm độc cấp tính aflatoxin có thể làm chết vật bị nhiễm. Mức độ nhiễm độc aflatoxin thay đổi theo thời gian tuỳ vào tính mẫn cảm của vật thử nghiệm. Gan của vật bị nhiễm độc aflatoxin có màu nhợt và sưng to. Có thể có hoại tử ở mô gan, chảy máu ở một số gia cầm. Ở mức độ nhẹ hơn, có thể quan sát thấy hiện tượng tụ máu ở phổi hoặc sự tăng sinh tế bào của tế bào biểu mô của ống dẫn mật, những rối loạn do nhiễm độc mãn tính aflatoxin thể hiện đầu tiên ở sự chán ăn, chậm lớn, sụt cân, nhưng rối loạn lớn nhất xảy ra ở gan. Người ta đã tìm thấy các bằng chứng về mối liên quan giữa việc nhiễm aflatoxin và ung thư gan tiên phát, một trong những bệnh gây tử vong cao ở khu vực Châu Á và Châu Phi. Ngoài u ở gan, aflatoxin có thể gây tổn thương ở mọi cơ quan khác. Mức độ nhạy cảm với aflatoxin tuỳ vào tình trạng sinh lý của cơ thể nhiễm aflatoxin. Con vật càng non thì khả năng mẫn cảm với tác nhân ung thư càng cao, chỉ cần cho tiếp xúc 2 – 3 tuần với liều lượng 0,2 – 0,5 mg aflatoxin, khả năng hình thành các khối u nhỏ ở gan kéo dài 12 – 18 tháng. Afatoxin B1 là độc tố quan trọng nhất và là chất gây ung thư nguy hiểm nhất trong số các aflatoxin. Aflatoxin B1 có thể cảm ứng tạo các khối u ở gan, thận, dạ dày và hệ thống thần kinh. 2.3.1.4. Sự chuyển hoá của Aflatoxin trong cơ thể Aflatoxin B1 là phân tử ái mỡ, có trọng lượng phân tử thấp, dễ dàng được hấp thu sau khi ăn. Khi đến ruột non, aflatoxin B1 sẽ được nhanh chóng hấp thu và máu tĩnh mạch mạc treo, sự hấp thu ở ruột non và tá tràng là nhiều nhất. Niêm mạc ống tiêu hóa có khả năng chuyển dạng sinh học aflatoxin B1 nhờ sự gắn kết với protein – đây là con đường chính để giải độc aflatoxin B1 cho gan. Từ ống tiêu hóa, theo tĩnh mạch cửa, aflatoxin được tập trung vào gan nhiều nhất ( chiếm khoảng 17% lượng aflatoxin của cơ thể ) tiếp theo là ở thận, cơ, mô mỡ, tụy, lách… Trong vòng 24h có khoảng 80% bị đào thải theo đường tiêu hóa qua mật, đường tiết niệu qua thận.  Cơ chế tác động của aflatoxin gây ung thư gan ở người là do sự gắn kết của aflatoxin B1 với DNA của tế bào gan ở những bệnh nhân bị ung thư gan nguyên phát Ø Cơ chế gây đột biến của aflatoxin như sau: Aflatoxin B1 khi xâm nhập vào cơ thể được chuyển hóa nhờ hệ thống cytochrome P450 hình thành nên một số lượng lớn chất chuyển hóa được hydroxyl hóa và sau đó được glutathione tạo phức hợp trong quá trình chuyển hóa tạo nên dạng ưa nước hơn cần thiết cho quá trình bài tiết qua nước tiểu. Không may, một trong những sản phẩm chuyển hóa là aflatoxin – 8,9 – epoxide được hình thành ở 2 dạng là endo và exo. Glutathione – S – transferase (GST) có thể tiếp hợp và giải độc (detoxify) phản ứng này ngay lập tức. Các loài khác nhau có thể mẫn cảm với tác động của AFB1 liên quan đến sự chuyên biệt của GST để có thể gắn kết epoxide vào glutathione. Exo epoxide có thể chen vào chính giữa phân tử DNA do phản ứng giữa vị trí C8 của epoxide với vị trí N7 của guanine. Giữa các phức oligonuclotide có chứa adduct và adduct này được chứng minh là nằm xen giữa vòng thơm ở đầu 5’ trên phần dư của guanine. Tuy nhiên, dạng kép cộng hóa trị này không ổn định do mang vòng ribose. Kết quả là guanine có thể bị rớt ra khỏi phân tử DNA tạo nên vị trí apurinic (là vị trí mà DNA bị khuyết mất một purine). Guanine adduct được giải phóng này có thể tìm thấy trong nước tiểu à có thể được sử dụng như một marker sinh học để dò tìm AFB1. Thay vào đó, vòng ribose mở hình thành nên foramidopyrimidine (FAPY) adduct ổn định và cấu trúc này ổn định trong phân tử dạng kép của DNA. Nghiên cứu cho thấy rằng N7 adduct bị loại bỏ nhanh hơn bởi vì nó làm xiêu vẹo cấu trúc dạng xoắn ốc trong khi FAPY adduct bền hơn. Tất cả các kiểu hư hỏng DNA là đột biến do sự chuyển G thành T nhưng cũng có một số trường hợp do sự chuyển G thành A hay G thành C. Các đột biến gần kề bên vị trí hình thành adduct cũng có thể xảy ra do sự kềnh càng của AFB1 adduct. Nghiên cứu trên động vật chứng minh rằng có sự tương quan tuyến tính liều - đáp ứng giữa AFB1 – DNA adduct và ung thư gan. Các nghiên cứu trên vi khuẩn chứng minh rằng FAPY adduct gây đột biến cao hơn so với AFB1 – Gua. Ở vi khuẩn FAPY – adduct gây trở ngại mạnh nhất đối với quá trình tái bản thậm chí có sự hiện diện của các polymerase bổ sung bên ngoài và từ đó làm tăng độc tính của AFB. Con đường sửa chữa cắt nucleotide là con đường chủ yếu để loại bỏ sự hư hỏng DNA do quá trình oxy hóa và vị trí apurinic. Sự biểu hiện của AFB1 thường liên quan đến đột biến một codon chuyên biệt là 249 AGG (arginine) thành AGT (serine) trong gene đàn áp ung thư p53 làm bất hoạt protein. Đột biến này chỉ được tìm thấy ở tế bào ung thư gan nguyên phát (HCC – hepatocellular carcinoma). 2.3.1.5. Biện pháp hạn chế nhiễm Aflatoxin Để hạn chế và kiểm soát aflatoxin trong công nghê sau thu hoạch nhiều biện pháp hạn chế hoặc giảm hàm lượng aflatoxin cho nông sản bảo quản được áp dụng như xử lý nhiệt với muối amoni, monomethylamin, natri hydroxyt, natri hypoclorit. Các nghiên cứu chưng minh rằng sử dụng khí quyển biện đổi có khả năng kiểm soát được hàm lượng aflatoxin: CO2 tăng tử 0,5% (không khí) tới 100%, O2 giảm tử 5% xuống 1% làm giảm sự tạo thành aflatoxin. Khả năng ức chế tạo thành aflatoxin của CO2 thể hiện ở 150C rõ hơn so với ở 300C. Việc giảm aw từ 0,99 tới 0,85 cũng làm giảm sự tổng hợp aflatoxin. Trong công nghệ trước và sau thu hoạch việc hạn chế aflatoxin rất khó khăn, nhiễm aflatoxin được xem là nguy cơ trường diễn. Vì thế việc quản lý, đánh giá thường xuyên các nguy cơ do nhiễm aflatoxin trong thực phẩm và thức ăn gia súc mang lại rất quan trọng. Hiện nay, aflatoxin B1 trong thực phẩm và thức ăn gia súc được quy định ở mức 20 ppb. Trong một vài trường hợp đặc biệt và cho một số thức ăn gia súc trong những điều kiện xác định, quy đinh này được mở rộng tới 300 ppb. Aflatoxin M1 trong sữa được quy định dưới 0,5 ppb. 2.3.2. Ochratoxin Có thể tìm thấy ochatoxin trong ngô, lúa mỳ, lúa mạch, bột mỳ, gạo, đậu đỗ… Và các thức ăn gia súc hỗn hợp khác nhau các nghiên cứu của Pháp và Châu Âu mới đây cho thấy rằng các mẫu thực phẩm chứa OTA ở nồng độ ít nhất vượt quá 10 ppb, lớn hơn 10 lần ngưỡng an toàn. Từ 1996 nhiều tác giả đã công bố phát hiện OTA trong nhiều sản phẩm khác nhau như nho, một số ngũ cốc, café… Mới đây nghiên cứu của các nhà khoa học Pháp cho thấy rằng trong số 450 mẫu rượu nho của Châu Âu, vang đỏ được phát hiện nhiễm OTA nhiều hơn so với vang trắng hay vang hồng. Ngoài ra sự nhiễm OTA phụ thuộc vào xuất xứ địa lý của nguyên liệu. 2.3.2.1. Cấu trúc Ochratoxin Là một độc tố rất phổ biến bên cạnh các mycotoxin khác như aflatoxin là các ochratoxin A, B và C và các dẫn xuất của chúng. Về cấu tạo hoá học OTA là hợp chất của izocoumarin liên kết với một nhóm N – phenylalanyl. Độc tính của các ochratoxin khác nhau liên quan tới nhóm hydroxyl, phenol được tách ra khó hay dễ. Hình 2.11: Cấu trúc hoá học của OTA 2.3.2.2 Nấm mốc tổng hợp OTA Các chủng nấm mốc có khả năng tổng hợp OTA còn chưa được xác định. Nhưng các nghiên cứu về OTA cho tới nay cho thấy rằng các chủng nấm mốc có thể khác nhau trên các đối tượng khác nhau, và thuộc vào các giống nấm mốc phổ biến Aspergillus và Penicillin, ví dụ: các chủng gặp rất phổ biến trên lương thực và thực phẩm như Aspergillus carbonarius và Aspergillus ochraceus. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng sự phát triển của các nấm mốc sinh OTA khác nhau và việc hình thành OTA từ chúng phụ thuộc rất khác nhau vào nhiệt dộ, độ ẩm, hoạt độ nước của sản phẩm, bản chất sản phẩm. Các chủng sinh OTA rất khác nhau theo khu vực địa lý, khí hậu và bản chất của sản phẩm bị nhiễm. Hơn thế nữa các chủng tổng hợp OTA cũng có thể tổng hợp đồng thời nhiều loại mycotoxin như acid penicilic hoặc citrinin. 2.3.2.3. Độc tính OTA Trong số các ochratoxin, ochratoxin (OTA) có tính độc cao nhất. Đây là hợp chất không mùi, kết tinh, hoà tan trong dung môi phân cực và trong dung dịch bicacbonat, hoà tan hạn chế trong nước. OTA là độc tố nấm mốc liện quan tới bệnh thận cấp tính của lợn, gây quái thai cho chuột và phôi gà. LD50 của OTA là 20 mg/kg đối với chuột và 3,6 mg/kg đối với gà con 10 ngày tuổi. Đối với người OTA gây chứng bênh suy thận vùng Bancang ở người. Những trường hợp nhiễm độc OTA cấp tính có thể bị tử vong. Từ năm 1993, cơ quan nghiên cứu quốc tế về ung thư đã xếp OTA vào các hợp chất nhóm 2B là nhóm các hợp chất có thể gây ung thư. OTA còn bị nghi ngờ là chất có thể gây nhiễm độc thần kinh. 2.3.2.4. Cơ chế gây đột biến của OTA OTA độc tố gây đột biến, ức chế miễn dịch và quái thai ởseveral species of animals. một số loài động vật và con người, Its target organs are the kidneys (nephropathy) and the develcác cơ quan mục tiêu của nó là những quả thận, gan. Độc tố OTA gây ức chế miễn dịch thông qua sự tác động processes of cell metabolism (see mitochondria below) irrespective of lymphocyte population orquá trình chuyển hóa tế bào và gây tác hại cho ti thể. OTA làm thay đổi bệnh lý trong cấu trúc của các ty lạp thể trong proximal convoluted tubules and glomeruli of kidneys and livertiểu cầu của thận và gan. These changes includeNhững thay đổi này là các tế bào có hình dạng bất thường, mạng ti thể phòng ra và tăng lipid trong tế bào. OTA là nguyên nhân gây ra sự oxy hóa và sản sinh các gốc tự do trong tế bào gan và đầutubules of the kidneys. ống của thận. Lipid peroxidation preceded cell death in cells of the proximal tubules.OTA là một chất ức chế không cạnh tranh của cả hai sắc tố tế bào reductase-succinat và succinat dehydrogenase.dehydrogenase.It impairs mitochondrial respiration and oxidative phorphorylation throug OTA làm suy yếu hô hấp của ti thể và phorphorylation oxy hóa thông qua impairment of the mitochondrial membrane and by inhibition of succinate-supported electromàng ti thể bằng cách ức chế hỗ trợ điện tử succinat trong transfer activities of the respiratory chain.trcác hoạt động của chuỗi hô hấp. Ngoài ra độc tố OTA 31It also inhibits glutamate/malate substrate respirationđcũng ức chế hô hấp chất nền malate/glutamate of Site I and causes lipid peroxidation leading to cell deat,và lipid là nguyên nhân dẫn đến tế bào bị chết. 3Another mechanism appears to beCơ chế khác được xuất hiệnthe activation of mitochondrial NHE interfering with Ca2+ homeostasis.This induces là kích hoạt của ti thể với Ca2+ gây raextracellular acidification leading to cell death in renal proximal tubules. acid hóa ngoại bào làm chết các tế bào gần ống thận. Độc tố OTA gây đột biến DNA sợi đơn và một số hợp chất phá vỡ DNA trong the DNA of spleen, liver and kidney in OTA treated mice.DNA của lá lách, gan và thận. It also inhibOTA cũng ức chếphenylalanine hydroxylase and lowers the concentration of phosphoenolpyruvate carboxykinase. phenylalanine hydroxylase và làm giảm nồng độ của phosphoenol pyruvate cacboxykinaza. Đây là sự ức chế tổng hợp protein và RNA các chất độc hại effec3.Inhibition of protein and RNA synthesis is considered one of the toxic effects of OTA.1 Sự ức chế tổng hợp protein và RNA được xem là một trong những hiệu ứng độc hại của OTA. 2.3.2.5 Hạn chế sự nhiễm Ochratoxin Các hiểu biết hiện tại về OTA còn rất hạn chế so với aflatoxin. Các nghiên cứu cho rằng có thể dùng khí quyển điều hoà 30% CO2 ức chế hoàn toàn sự tạo thành OTA. OTA rất bền với các sử lý nhiệt và hoá chất. Các thử nghiệm cho thấy chỉ 76% hàm lượng OTA giảm đi khi gia nhiệt ở 2500C trong 40 phút. So với Afltoxin, OTA rất bền vững trong môi trường ẩm. Dung dịch OTA trong methanol cũng không bị phân huỷ khi bị chiếu xạ. Cho tới nay, chưa có một biện pháp hiệu quả để phân huỷ độc tố nấm mốc loại này. Vì vậy, mọi biện pháp góp phần làm giảm và hạn chế việc hình thành OTA trong các sản phẩm đều cần được quan tâm và áp dụng. 2.3.3. Patulin 2.3.3.1. Cấu trúc Patulin Patulin có tên gọi khác là (clavaxin) là sản phẩm trao đổi chất bậc hai của nấm mốc được biết trước tiên như là một thuốc có thể chữa bệnh cảm lạnh. Trong quá trình sử dụng, người ta mới nhận biết độc tính của patulin. Patulin là hợp chất không màu, kết tinh được, tan trong nước và các dung môi phân cực. Patulin có thể tổng hợp trên rất nhiều nông sản thực phẩm cũng như trên thức ăn gia súc. Người ta đã phân lập được patulin trên ngũ cốc, trên các sản phẩm dạng hạt, trên hoa quả. Thực phẩm có khả năng nhiễm patulin cao nhất là táo và các sản phẩm táo. Hình 2.12: Cấu trúc hoá học Patulin 2.3.3.2. Độc tính Patulin Patulin được coi như một độc tố có khả năng gây ung thư cho người và động vật. Gây ra hoạt tính suy giảm miễn dịch liên quan tới các chứng xung huyết, gây loét niêm mạc, đặc biệt là niêm mạc ruột, nghiên cứu đã cho thấy rằng patulin là genotoxic, độc tố này còn gây thiệt hại cho DNA hoặc nhiễm sắc thể ở người. 2.3.3.3. Cơ chế gây độc của Patulin Patulin là một độc tố gây tổn hại cho DNA và các nhiễm sắc thể trong một thời gian ngắn. độc tính patulin ngăn cản sự hô hấp hiếu khí, làm giảm sự hoạt động của triphosphatase adenosine. Patulin kích thích các sợi DNA, gây vỡ các tế bào Hela và làm nhiễm sắc thể bị sai lệch dẫn đến DNA, protein và sự tổng hợp RNA đều bị ảnh hưởng. Nghiên cứu cơ chế của các tế bào liên kết với độc tính đường ruột của patulin, người ta nhận thấy 2 tế bào biểu mô ruột ở người (HT-29-D4 và CaCO-2-14) đã tiếp xúc với patulin, dẫn đến các chịu trứng viêm ruột do patulin gây ra. 2.3.3.4. Nấm mốc tổng hợp Patulin Patulin là hợp chất trao đổi bậc hai do các nấm mốc Penicillinum, Aspergillus và Bysscochlamys tạo nên. Các chủng tổng hợp patulin chủ yếu là các loài thuộc Aspergillus như A. clavatus và A. giganteus. Trong số các Penicillinum, các loài tổng hợp patulin nhiều nhất là P. exppansum, P. urticae, P. griceofulvum. Các loài nấm mốc này thường gặp trong đất, trên bề mặt hoa quả như táo… Tuy nhiên tuỳ thuộc vào điều kiện luân canh và khí hậu, các hệ vi sinh vật này có thể bị thay đổi. Đặt biệt A. clavatus thường ưa thích các môi trường có hàm lượng đạm cao. Trên các chất đang thối rửa. Vì vậy, rất hay gặp A. clavatus ở các trại chăn nuôi trên phân gia súc và gia cầm. Hình 2.13: Nấm mốc A. clavatus 2.3.3.5. Hạn chế sự nhiễm Patulin Một xu hướng kiểm soát patulin là ức chế và loại bỏ các nấm mốc trên các sản phẩm có khả năng bị nhiễm. Trong công nghệ, sự lựa chọn nguyên liệu sạch nấm mốc hoặc loại bỏ phần nhiễm nấm mốc là biện pháp hiệu quả nhất để hạn chế sự lây lan của nấm mốc trên khối nguyên liệu và loại trừ patulin. Có thể bổ sung hỗn hợp ascorbic vào nước ép táo, tiến hành lên men dịch táo và sử dụng SO2 sát trùng nước quả để hạn chế sự phát triển nấm mốc và hạn chế sự tổng hợp patulin. Ngoài ra một trong những biện pháp rất hiệu quả được thử nghiệm là lợi dụng khả năng hoạt động của patulin, có khả năng tạo liên kết các nhóm – SH như cystein, thioglycolic và gluthion. Khi kết hợp với nhóm chất này, patulin trở nên không có hoạt tính sinh học và mất khả năng gây độc. 2.3.4. Fumonisin Trong các mycotoxin, mối quan tâm về các fumonisin ngày càng tăng cao. Fumonisin là độc tố mới được phát hiện gần đây do Fumonisin moniliorme tổng hợp nên. Đây là nhóm độc tính cao với động vật và con người. Việc nhiễm fumonisin trong thức ăn cho người và gia súc ở quy mô trên toàn thế giới. Riêng tại mỹ, các báo cáo cho thấy 80 – 100% ngô bảo quản bị nhiễm fumonisin. Hình 2.14: Nấm mốc Fumonisin nhiễm trên ngô 2.3.4.1. Cấu trúc Fumonisin Fumonisin là nhóm hợp chất diester của acid tricarxylic với các rượu bậc cao khác nhau. Fumonisin chứa nhóm amin bậc nhất, tan trong nước và bền vững với nhiệt. Trong số các fumonisin, chỉ fumonisin B1, B2 và B3 được phát hiện với hàm lượng đáng kể cả trong điều kiện tự nhiên và điều kiện phòng thí nghiệm. Hình 2.15: Cấu trúc hoá học phân tử Fumonisin 2.3.4.2. Độc tính Fumonisin B1 là độc tố có độc tính mạnh nhất trong số các fumonisin. Fumonisin B1 có thể gây các triệu chứng nhũng não, suy gan, gây mù, gây các triệu chứng bất bình thường cho tới tử vong ở ngựa (ELEM), ung thư gan ở chuột, bệnh gan ở gà, suy tim cấp ở khỉ.. Chỉ ở liều lượng 10 mg/kg thức ăn trong vòng 40-50 ngày, fumonisin đã có thể gây hội chứng ELEM. Fumonisin B1 có liên quan tới bệnh ung thư thực quản ở gà. Mới đây, Cơ quan Nguyên cứu Quốc tế về ung thư đã xếp fumonisin B1 vào nhóm 2B, nhóm các hợp chất gây ung thư cho người. Nguyên cứu ảnh hưởng của các fumonisin tới người, người ta thấy có sự liên quan của bệnh ung thư thực quản và việc sử dụng các lương thực nhiễm các fumonisin. Độc tính của fumonisin B1 liên quan mật thiết tới các hiệu ứng lên sự trao đổi chất các sphingolipid, bao gồm quá trình tổng hợp mới, tích luỹ các sphingolipid tự do, quá trình thải loại các sphingoid tự do, tăng hàm lượng các sản phẩm lipid và sphingosin. Các hiệu ứng dẫn tới hàng loạt các phản ứng sinh hoá gây ra các sự nhiễm độc khác nhau. Các nhà khoa học Mỹ đã tiến hành thí nghiệm cho chuột ăn thức ăn nhiễm fumonisin và phát hiện rằng các cơ quan đích của độc tố này là gan và thận. Cơ chế hoạt động của Fumonisin Cấu trúc của fumonisin gần giống với cấu trúc của sphingosine, điều này cho phép giả định là fumonisin có thể ảnh hưởng tới trao đổi chất của sphingosin trong cơ thể. Sphingosin là các tiền chất của mọi sphingolipid, bao gồm sphingomyelin, ceramid và gangliosid. Cơ chế hoạt động của fumonisin không dựa trên hoạt tính biến dưỡng và cũng không có bằng chứng nó và các sản phẩm thủy phân của nó bị biến dưỡng bởi enzyme phase I và II. Fumonisin có một nhóm amino đầu tiên ở vị trí C2 ức chế ceramide synthase, kết quả là ngăn cản sự sinh tổng hợp de novo của ceramide và biến dưỡng sphingolipid. Kết quả của sự ức chế ceramide synthase là sự tích lũy của sphinganine (Sa) và ở mức độ thấp hơn là sphingosine (So) trong mô, huyết thanh và nước tiểu. Sự tích lũy sphingoid base và cùng với sự tăng tỷ lệ Sa:So trong mô dẫn đến sự biểu hiện của fumonisin ở động vật có vú, chim và cá. Độc tính của fumonisin B1 liên quan mật thiết tới các hiệu ứng lên sự trao đổi chất các sphingolipid, bao gồm các quá trình sinh tổng hợp mới, tích lũy các sphingolipid tự do, quá trình thải loại các sphingolipid phức tạp, tăng cường phân giải các sphingoid tự do, tăng hàm lượng các lipid và sphingosin. Các hiệu ứng này dẫn đến hàng loạt các phản ưng sinh hóa gây ra các sự nhiễm độc khác nhau. Hình 2.16: Tóm tắt sơ đồ biến dưỡng sphingolipid thể hiện sự ức chế của enzyme ceramide synthase (X) bởi fumonisin Các fumonisin có tính đặc hiệu tới sự tổng hợp các sphingosine, thể hiện ở sự ức chế serin. Không phát hiện các hiệu ứng tương tự của fumonisin đến sự tổng hợp các phosphatidylserin, phosphatidylcholin và các acid béo. Vị trí hoạt động của fumonisin là sphingosine và sphingosine N. transacetylase trong phản ứng kết hợp của thiolase với sphingosin và sphingosin để tạo thành dihydroceramid và ceramid. Do sự ức chế của fumonisin, số lượng tế bào gan giảm xuống 25% sau 24 giờ và 50% sau 4 ngày, các hoạt động của fumonisin nhạy cảm với tế bào gan hơn so với tế bào thận. Sự nhiễm fumonisin lâu dài ở nồng độ cao có thể gây ra các ảnh hưởng ở mức tế bào hoàn toàn khác với sự ảnh hưởng của sphingolipid. Do các tế bào não rất giàu sphingolipid nên các tổn thương thần kinh có thể do sự nhiễm độc fumonisin B1 gây nên. Hoạt tính gây ung thư của fumonisin B1cũng có thể do cơ chế ức chế tổng hợp sphingolipid gây nên vì các độc tố này kìm hãm các hoạt động của sphingosin thể hiện vai trò của tác nhân chống khối u nội bào. 2.3.4.4. Nấm mốc tổng hợp Fumonisin Fumonisin chủ yếu do các nấm mốc thuộc giống Fusarium tổng hợp nên. Loài điển hình nhất trong số này là Fusarium moniliforme. Các chủng nấm mốc của loài này, do Sheldon xác định vào năm 1904 khá phổ biến trong môi trường và thường nhiễm trong lương thực, đặt biệt là ngô. Vào năm 1988, các đặc tính của fumonisin lần đầu tiên được xác định và các sản phẩm trao đổi chất của nó lần đầu tiên được phát hiện trong canh trường F. moniliforme. Trong số đó, một hợp chất được phát hiện thường xuyên nhất và ở nồng độ cao nhất trong các canh trường của loài này hoặc thực phẩm mà đặc biệt là ngô nhiễm F. moniliforme. Hợp chất này sau đó được đặt tên “fumonisin B1”. Các nguyên cứu về sau này cho thấy rằng không chỉ có F. moniliforme tổng hợp nên fumonisin mà các chủng khác thuộc Fusarium cũng tham gia tổng hợp nên độc tố loại này bao gồm F. proliferatum, F. subglutinans, F. anthophilum, F. annulatum, F. succisae, F. beomiforme, F. dlamini, F. napiforme và F. nygamai. 2.3.4.5 Hạn chế nhiễm Fumonisin Fumonisin B1 bền với nhiệt, xử lý canh trường F. moniliforme ở 1000C, và sau đó để khô ở 600C trong 24h, nồng độ fumonisin B1 hầu như không bị thay đổi. cấu trúc fumonisin B1 có thể bị phá huỷ ở nhiệt độ trên 2200C. Vì thế các giải pháp thuỷ phân hoặc các biện pháp khác áp dụng cho aflatoxin là không hiệu quả đối với fumonisin, thậm chí còn làm tăng cường độc tính của độc tố này. Các nghiên cứu hiện đang tiến hành để xác định ảnh hưởng của các kỹ thuật chế biến tới độc tố này trong thực phẩm, con đường lây nhiễm và các khả năng khử độc tố có thể áp dụng cho các sản phẩm thực phẩm cho người hoặc thức ăn gia súc. 2.3.5. Tình hình nhiễm mycotoxin trong thực phẩm trên thế giới và Việt Nam Sự nhiễm độc tố nấm mốc trong nông sản đã trở thành vấn đề toàn cầu. Ví dụ: Ở Đức có 84% trên 1000 mẫu nông sản thực phẩm kiểm tra có nhiễm Tricothecene, 13% số mẫu lương thực như lúa mì, lúa mạch, yến mạch bị nhiễm ochratoxin. Ở Đan mạch 19 trên 33 mẫu ngũ cốc kiểm tra có nhiễm ochratoxin. Ở Ấn Độ có 8% số mẫu bánh dầu hướng dương kiểm tra có nhiễm đồng thời cả hai loại độc tố T-2 và ochratoxin. Ở Mỹ có rất nhiều mẫu bắp kiểm tra cho thấy có sự nhiễm vomitoxin (DON) ở mức 1000ppb. Ở Úc kiểm tra trên bắp thấy có cả 3 loại mycotoxin như: aflatoxin, fumonisin và zearalenon. Theo Tiến sĩ Bangalore (Ấn Độ) thì các loại mycotoxin khác nhau có ưu thế ở những vùng khác nhau trên thế giới: Ở Bắc Âu thì Ochratoxin và Vomitoxin (DON) là vấn đề đang được quan tâm nhất. Còn ở Nam Mỹ thì mycotoxin có ưu thế lại là Aflatoxin và Fumonisin. Ở Việt Nam nhiều nơi ép dầu phọng bằng bọng thủ công, độ ẩm còn cao, sau đó xếp thành chồng. Giữa các lớp bánh dầu có độ ẩm cao là môi trường thích hợp cho nấm phát triển. Nếu kho trữ thức ăn lâu ngày không làm vệ sinh, diệt nấm thì trong không khí sẽ có rất nhiều bào tử nấm tấn công nhanh các nguyên liệu này sinh ra nhiều độc tố trong thức ăn. Nấm sinh ra trong kho dự trữ phổ biến nhất là Aspergillus và Penicillium. Độc tố của chúng sinh ra chủ yếu là aflatoxin, sau đó là ochratoxin, rubratoxin và citrinin. Nó gây tổn hại nặng trên động vật, làm hư gan, thận, tạo ra màng bọc ống tiêu hóa do tế bào niêm mạc bị chết bong ra giảm hấp thu dưỡng chất, có thể gây tử vong trên số lớn gia cầm con và heo con. Riêng ở các trại gà giống, độc tố nấm còn gây ra chết phôi hàng loạt, tỷ lệ ấp nở giảm rất thấp. Theo kết quả kiểm tra 29 mẫu bánh dầu phọng và 25 mẫu bắp thì mức aflatoxin trong bánh dầu phọng 1.200 ppb (tối đa 5.000 ppb), trong bắp 205ppb (tối đa 600 ppb). Các nguyên liệu còn lại như đậu nành hạt khô và bánh dầu công nghiệp của nó, bánh dầu mè công nghiệp, khô dầu dừa công nghiệp, cám 50ppb. Chương 3: PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỘC TỐ MYCOTOXIN Việc kiểm tra mycotoxin trong thực phẩm dựa trên các phương pháp phân tích vi sinh vật thực phẩm, các phương pháp phân tích sinh hoá, hoặc các phương pháp xét nghiệm bệnh lý động vật. Phương pháp phân tích vi sinh vật Các phương pháp vi sinh vật chủ yếu để phân tách các chủng nấm mốc sinh độc tố. Để phân lập các nấm mốc nhiễm trên thực phẩm, phương pháp phân lập trực tiếp hiệu quả hơn phương pháp gián tiếp đối với các sản phẩm dạng hạt. Hạt ngũ cốc được đặt trực tiếp lên môi trường thạch sau khi đã được làm sạch trong dung dịch tẩy clo 0,4% để loại bỏ chất bẩn trên bề mặt mà không ảnh hưởng tới nấm mốc. Đối với các sản phẩm dạng bột, có thể tiến hành đồng hoá hoặc lắc mẫu trong các dung môi thích hợp và sử dụng kỹ thuật pha loãng để xác định nấm mốc nhiễm trên sản phẩm Vấn đề cơ bản khi phân tách nấm mốc nhiễm trên sản phẩm là sự phát triển rất nhanh chóng của một số loài nấm như Mucor, Rhizopus và các loài Zygomycetes làm cho việc phát hiện hoặc định lượng các nấm mốc khác sẽ khó khăn. Có thể sử dụng các môi trường nghèo như Potato Dextro agar hoặc môi trường có chứa chất ức chế một số nấm mốc như dicloran, hoặc sử dụng các môi trường chọn lọc để ức chế một số nấm mốc có khả năng sinh sợi nhanh chóng như Rhizopus. Phương pháp phân tích lý hoá 3.2.1. Phương pháp phát hiện nấm dưới đèn UV Việc xác định AF được phán đoán bằng sự phát sáng của khuẩn lạc là rất khó khăn, không dễ phân biệt với các chủng không sinh aflatoxin à nhẫm lẫn. Thí nghiệm chẩn đoán sự hiện diện của AF trong khuẩn lạc nấm mốc là sự phát lân quang của AF ở nhiệt độ phòng sau khi tắt đèn UV. Các chủng Aspergillus không sinh aflatoxin không phát lân quang trong khi các chủng sinh AF có phát lân quang. Sự phát huỳnh quang và lân quang của AF dưới tia UV không phải là điều duy nhất để xác định AF. Ở bước sóng 365 nm, AFB1 và AFB2 được hoạt hóa và tạo thành AFB – 8,9 – epoxide. Sau đó gắn vào vị trí N7 trên phân tử guanine tạo thành 8,9 – dihydro – 2 – (N7 guanyl) – 3 – hydroxyaflatoxin B2. Cấu trúc của AF-DNA photoadduct tương đồng với AF-DNA adduct được hình thành trong điều kiện in vivo ở AFB2 đường tiêu hóa bởi cytochrome P450 ở gan. Sự hình thành dạng kép AF-DNA được xem như là bước đầu tiên hình thành ung thư được kích thích bởi AF. Hình 3.1: Các dòng nấm mốc sinh độc tố và không sinh độc tố, (a): quan sát dưới ánh sáng bình thường; (b) tia UV 365 nm, vòng bao xung quanh chủng sinh độc tố (dưới); (c) phát lân quang ở nhiệt độ phòng ở 2,5 giây sau khi tắt đèn UV. 3.2.2. Xác định các nấm mốc sinh mycotoxin bằng PCR Aflatoxin có ít nhất có 25 gene liên quan đến quá trình tổng hợp aflatoxin và sự điều hòa của nó. Các primer liên quan đến các trình tự afl-2, aflD, aflM và aflP được sử dụng để dò tìm và phát hiện các dòng Aspergillus sinh độc tố aflatoxin như A. flavus và A. parasiticus trong số các khuẩn lạc được phân lập hoặc trong quá trình ly trích DNA từ thực phẩm và thức ăn gia súc. Trong thời gian ngắn, DNA của Aspergillus được sử dụng như một khuôn để khuếch đại các gene liên quan đến quá trình sinh tổng hợp AF. Trình tự của các đoạn được được khuếch đại nhận dạng các gene sinh tổng hợp AF. Tuy nhiên, sự hiện diện của các gene này chỉ phản ánh khả năng hiện diện của nấm mốc sản sinh ra aflatoxin. Sự sản xuất AF phụ thuộc vào nhiệt độ, ẩm độ, thành phần của môi trường dinh dưỡng, phase tăng trưởng và thời gian nuôi cấy. Gần đây, việc ứng dụng kỹ thuật RT-PCR để xác định các chủng Aspergillus sinh aflatoxin dựa vào sự hiện diện của mRNA liên quan đến các gene sinh tổng hợp AF. RT-PCR biểu thị sự hiện diện của nấm mốc sinh aflatoxin và của các enzyme sinh tổng hợp AF. Kỹ thuật Multiplex RT-PCR sử dụng 4 – 5 cặp mồi để phát hiện aflD, aflO, aflP, aflQ, aflR và aflS (aflJ) nhằm xác định các nấm mốc sinh độc tố. 3.2.3. Phương pháp ELISA Nguyên lý của ELISA chính là dựa vào tính đặc hiệu kháng nguyên - kháng thể và gồm các bước cơ bản như sau: 1. Kháng nguyên - antigen (KN) chưa biết được gắn trên một bề mặt 2. Kháng thể - antibody (KT) biết trước được "rửa" qua bề mặt đó. Kháng thể này được gắn kết với enzyme. 3. Thêm vào một cơ chất (substance); enzyme sẽ biến đổi cơ chất này và tạo tín hiệu có thể xác định được. Đối với các ELISA phát quang, ánh sáng sẽ được phát ra từ mẫu chứa kháng nguyên – kháng thể. Sự hiện diện của phức hợp kháng nguyên – kháng thể sẽ quyết định cường độ sáng phát ra. Với nguyên lý trên, ELISA giúp xác định sự có mặt hay không có mặt cũng như lượng kháng nguyên trong mẫu nghiên cứu. Để tiến hành ELISA cần phải có ít nhất một kháng thể đặc hiệu cho kháng nguyên chưa biết. Thông thường kháng nguyên được cố định tại các giếng của vi phiếm (polystyrene microtiter plate). - Phương thức cố đinh không đặc hiệu: kháng nguyên gắn trực tiếp vào bề mặt của đĩa - Phương thức gắn đặc hiệu ("sandwich" ELISA): kháng nguyên được gắn với một kháng thể đặc hiệu cho cùng kháng nguyên cần kiểm tra Kháng thể đặc hiệu sẽ được thêm vào, phản ứng tạo phức hợp kháng thể - kháng nguyên có thể sảy ra. Nếu kháng thể được gắn trực tiếp với enzyme, tín hiệu quang học do enzyme làm biến đổi cơ chất sẽ giúp phát hiện kháng nguyên cần kiểm tra. Trong trường hợp sử dụng kháng thể thứ cấp (secondary antibody) được gắn với enzyme thông qua các liên kết cộng hóa trị giữa các phân tử sinh học (bioconjugation), kháng nguyên cần xác định sẽ được nhận biết qua kháng thể thứ cấp này. Giữa các bước của ELISA, các protein và các kháng thể không đặc hiệu, kháng thể không gắn với kháng nguyên sẽ được lấy đi nhờ các loại dịch có tác dụng "rửa". Sau bước "rửa" cuối cùng, chỉ còn kháng thể liên kết với kháng nguyên được giữ lại. Sau khi được thêm vào, cơ chất sẽ chịu tác dụng của enzyme liên kết với kháng thể trong phức hợp kháng thể - kháng nguyên. Phản ứng phát quang (biến đổi cơ chất) sẽ sảy ra. Trước đây các cơ chất tạo màu sắc được sử dụng trong ELISA nhưng ngày nay các chất phát quang được dùng rộng rãi làm tăng tính đặc hiệu và độ chính xác của ELISA. Phương pháp ELISA gián tiếp (indirect ELISA) gồm các bước chính: Chuyển kháng nguyên đã biết lên bề mặt cứng ( được gọi chung là các đĩa). Kháng nguyên sẽ được cố định trên bề mặt. Nồng độ của các mẫu kháng nguyên này dùng để thiết lập đường chuẩn cho việc tính nồng độ của kháng nguyên trong các mẫu chưa biết. Chuyển các mẫu kháng nguyên chưa biết vào các giếng khác. Kháng nguyên chưa biết được hòa tan trong cùng một loại dung dịch đệm giống các mẫu kháng nguyên chuẩn. Hình 3.2: Phương pháp ELISA gián tiếp Thêm dung dịch protein không tương tác (non-interacting protein) như albumin huyết thanh bê (bovine serum albumin) hay casein vào tất cả các mẫu (kể cả mẫu chuẩn). Bước này được gọi là "blockin" do protein huyết thanh có tác dụng ngăn cản sự hấp phụ của các protein khác lên bề mặt của đĩa. Rửa bề mặt đĩa sau đó chuyển kháng thể (biết trước) vào tất cả các giếng của đĩa. Kháng thể sẽ kết hợp với các kháng nguyên đã được cố định mà không kết hợp với protein của huyết thanh. Thêm kháng thể thứ cấp (secondary antibody), kháng thể thứ cấp sẽ kết hợp với bất kỳ một kháng thể còn dư (bước này có thể được bỏ qua nếu kháng thể dùng để phát hiện kháng nguyên đã gắn với enzyme). Rửa đĩa, các kháng nguyên gắn enzyme còn dư sẽ được loại bỏ. Thêm cơ chất enzyme sẽ làm biến đổi cơ chất làm sản sinh tín hiệu huỳnh quang hay tín hiệu điện hóa học (enzyme có tác dụng như yếu tố khuyếch đại). Nhược điểm cơ bản: Bước cố định kháng nguyên không có tính đặc hiệu nên bất kỳ protein nào cũng gắn với bề mặt đĩa vì vậy kháng thể (có nồng độ thấp) phải cạnh tranh với các protein khác trong huyết thanh khi gắn kết với bề mặt của điwax. Sandwich ELISA hạn chế được nhược điểm này. Sandwich ELISA Phương pháp được sử dụng để phát hiện kháng nguyên trong mẫu nghiên cứu và bao gồm các bước cơ bản sau: (1) Chuẩn bị bề mặt (microtiter) có gắn kháng thể (2) Khóa tất cả những vị trí gắn kết không đặc hiệu trên bề mặt. (3) Phủ mẫu chứa kháng kháng nguyên cần xác định (4) Rửa đĩa, kháng kháng nguyên không được gắn kết sẽ bị rửa trôi (5) Thêm các kháng thể đặc hiệu cho kháng nguyên cần chẩn đoán (6) Thêm kháng thể thứ cấp đã được gắn với enzym (kháng thể thứ cấp đặc hiệu cho kháng thể sơ cấp ở bước 5) (7) Rửa đĩa, phần không gắn kết sẽ bị rửa trôi. (8) Thêm cơ chất. Enzym sẽ biến đổi cơ chất tạo màu, phát quang hay tín hiệu hóa điện. (9) Đo cường độ ánh sáng, tín hiệu huỳng quang, tín hiệu điện hóa... qua đó xác định sự có mặt và hàm lượng kháng thể. Hình 3.3: Kháng nguyên gắn với kháng thể ELISA cạnh tranh Việc xác định và định lượng mycotoxin được xác định bằng kỹ thuật ELISA cạnh tranh. Các giếng trong kỹ thuật ELISA được gắn một kháng thể sơ cấp chống lại mycotoxin. Các tác nhân phát hiện là một phức hợp đồng hóa trị của mycotoxin này và một enzyme thường sử dụng là horseradish peroxidase và alkaline phosphatase. Các tác nhân này được trộn chung với mẫu dịch chiết của mycotoxin và phức hợp này được cho vào trong giếng. Trong giếng đối chứng (không chứa mycotoxin trong mẫu), phức hợp mycotoxin – enzyme có thể gắn lên các kháng thể sơ cấp và sau đó thêm các cơ chất tạo màu, kết quả là hiện màu trong mẫu. Trong các giếng kiểm tra, các phân tử mycotoxin tự do trong dịch chiết cạnh tranh với các phức hợp gắn trên các kháng thể sơ cấp. Nồng độ mycotoxin càng cao, phức hợp gắn trên kháng thể sơ cấp càng tí dẫn đến màu trong giếng càng nhạt. Hình 3.4: Phương pháp ELISA cạnh tranh 3.2.4. Phương pháp sắc kí lớp mỏng (Thin layer chromato graphi-TLC) Phương pháp sắc kí lớp mỏng được sử dụng rộng rãi để xác định hàm lượng aflatoxin lần đầu tiên vào những năm 1960. Người ta sử dụng các bản mỏng được tráng bởi silicagel, để xác định aflatoxin. Dung môi sử dụng cho dung dịch chạy bản mỏng là chloroforin: methnol và choloroform : aceton. Việc thêm nước vào hệ thống dung môi sẽ làm tăng khả năng hòa tan aflatoxin. Hệ dung môi gồm nước: aceton : chloroform( 1:5;12:88) được đánh giá có khả năng hòa tan aflatoxin tốt nhất. Các bản mỏng đã được chảy qua các dung môi chạy được đưa vào bởi đèn tử ngoại (UV) 365 nm. Các vết mẫu phân tích tạo màu huỳnh quang xanh da trời hay xanh lá cây. Và có độ dài Rf được so sánh với các vết mẫu phân tích chuẩn. Phương pháp này có thể được xác định lượng từ 3-4.10-4micromet(0.3-0.4mg). Nhược điểm của phương pháp là phụ thuộc vào người phân tích. Khi so sánh giữa mẫu và các vết của độc tố chuẩn có thể có sự sai lệch kết quả từ 20-30% 3.2.5. Phương pháp sắc kí lỏng cao áp (High ferformane liquid chromatorgaphy-HPLC) HPLC là một sắc ký cột (column chromatograph ) đi kèm với một detector nhạy để có thể phát hiện được các chất tách ra trong quá trình chạy sắc ký. Với những tiến bộ kỹ thuật về cột, detector đã chuyển sắc ký cột thành phương pháp phân tích có tốc độ nhanh và hiệu suất cao. Loại này cần phải có hệ thống bơm cao áp để đẩy pha động với áp suất cao đến khoảng 30Mpa (300 atm) nhằm tạo dòng chảy với lưu lương vài ml/ phút. Số lượng mẩu phân tích bằng HPLC chỉ cần khoảng 20microlit. Phương pháp HPLC sử dụng cả hai pha: Pha bình thường và pha phản. Hệ thống này dựa trên sự hấp thụ tia tím (uv) và xác định cường độ huỳnh quang. Mẫu phân tích được tác bằng chloroform: nước. Ly tâm chất tác dụng làm sạch qua silicagel pha bình thường sử dụng cột nhối silicagel 0.5mm và pha động sử dụng bezen: acetonitrit: acid formic. Giới hạn xác định là 0.5 micromet/kg. Hình 3.5: Phương pháp sắc kí lỏng cao áp 3.2.6. Phương pháp sắc ký miễn dịch dòng chảy bên (Lateral Flow Immunochromatography) Phương pháp này còn được gọi là thử nghiệm một bước nhanh (ROSA) để xác định mycotoxin. Đây là một phương pháp rất phổ biển để xác định nhanh mycotoxin và ước lượng nồng độ của chúng. Một phương pháp sắc ký miễn dịch dòng chảy bên điển hình gồm các bước như sau: một miếng đệm để đưa mẫu vào; một vùng chứa những hạt màu (latex, vàng …) được phủ với kháng thể đơn dòng chống lại mycotoxin; một vùng của màng nitrocellulose cho phép sự di chuyển của những hạt cùng với mẫu mycotoxin; một đường kiểm tra giữ cố định mycotoxin; một đường đối chứng dương chứa kháng thể thứ cấp và một miếng đệm hấp phụ. Một mẫu chứa mycotoxin được cho vào và di chuyển theo chuỗi. Khi đến vị trí tiếp hợp, mycotoxin gắn vào phức hợp hạt – kháng thể đối kháng mycotoxin. Bây giờ, những hạt chứa mycotoxin và những hạt tự do di chuyển vào vùng test – line. Những mycotoxin cố định bị bắt giữ nên chỉ có những hạt tự do hình thành nên màu trong khi những hạt mang mycotoxin tiếp tục di chuyển. Sự hiện diện của mycotoxin trong mẫu càng cao thì các hạt chứa mycotoxin sẽ không thể gắn vào test line. Do đó, cường độ màu của test line càng nhạt chứng tỏ nồng độ mycotoxin trong mẫu càng cao. Hình 3.6: Phương pháp sắc ký miễn dịch dòng chảy bên (LTF) Chương 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. KẾT LUẬN Các độc tố nấm mốc phát triển mạnh trên các loại thực phẩm nông sản, thức ăn gia súc, gia cầm như ngô, lạc, đậu… Trong quá trình phát triển, các nấm mốc sản sinh ra các độc tố gây bệnh cho con người và động vật tiêu thụ. Những độc tố do nấm mốc sinh ra có khả năng gây độc cấp tính và mãn tính đến các cơ quan gan, thận. Nhưng nguy hiểm nhất là gây ra các triệu chứng xơ gan, ung thư tế bào gan nguyên phát và gây ra các đột biến DNA. Ø Độc tố aflatoxin xâm nhập vào cơ thể qua đường ăn uống ở liều lượng cao trong thời gian ngắn. Gây ra triệu chứng cấp tính chuyên biệt của bệnh này bao gồm sự xuất huyết, hủy hoại gan cấp tính, phù, thay đổi trong đường tiêu hóa, hấp thu các sản phẩm trao đổi chất và chết. Khi hấp thụ aflatoxin ở liều lượng tự thấp đến trung bình qua đường ăn uống trong thời gian kéo dài. Những ảnh hưởng này có thể là cận lâm sàng và khó có thể nhận biết. Một số triệu chứng như sự chuyển hóa thức ăn yếu, tỷ lệ tăng trưởng thấp hơn và có thể có xảy ra một số triệu chứng giống như ngộ độc aflatoxin cấp tính. Những triệu chứng này gây ngộ độc mãn tính trên gan có thể dẫn đến ung thư gan. Ø Độc tố OTA gây đột biến, ức chế miễn dịch và quái thai ởseveral species of animals. một số loài động vật và con người, Its target organs are the kidneys (nephropathy) and the develcác cơ quan mục tiêu của nó là những quả thận, gan. Độc tố OTA gây ức chế miễn dịch thông qua sự tác động processes of cell metabolism (see mitochondria below) irrespective of lymphocyte population orquá trình chuyển hóa tế bào và gây tác hại cho ti thể. Ø Patulin là độc tố có khả năng gây ung thư cho người và động vật. Gây ra hoạt tính suy giảm miễn dịch liên quan tới các chứng xung huyết, gây loét niêm mạc, đặc biệt là niêm mạc ruột, độc tố này còn gây thiệt hại cho DNA hoặc nhiễm sắc thể ở người. Ø Fumonisin là độc tố có độc tính mạnh có thể gây các triệu chứng nhũng não, suy gan, gây mù, gây các triệu chứng bất bình thường cho tới tử vong ở ngựa (ELEM), ung thư gan ở chuột, bệnh gan ở gà, suy tim cấp ở khỉ.. Do vậy vấn đề bảo quản lương thực thực phẩm là vấn đề hết sức quan trọng góp phần làm giảm tỉ lệ các bệnh mà các độc tố nấm mốc gây ra cho con người và vật nuôi. 4.2. KIẾN NGHỊ Không nên sử dụng các thực phẩm đã bị hư hỏng, bị nhiễm nấm mốc, chúng ta nên có các biện pháp ngăn chặn nấm mốc phát triển trong quá trình thu hoạch nông sản. Trong quá trình lưu giữ các nông sản cần thường xuyên kiểm tra độ ẩm, nhiệt độ, sâu mọt và khử côn trùng trong kho để hạn chế sự nhiễm mốc. Chúng ta cần áp dụng các phương pháp phân tích hiện đại, để phân tích các độc tố mycotoxin nhiễm trên nông sản, kịp thời ngăn chặn sự lây nhiễm của chúng để tránh sự thiệt hại nguồn nguyên liệu sản xuất thức ăn gia súc, gia cầm. Góp phần thúc đẩy nền kinh tế phát triển.