Khóa luận Tổng quan về kefir và các ứng dụng của kefir trong thực phẩm

nhu cầu peptone đối với vi khuẩn rất cao do đó cần bổ sung peptone từ bên ngoài vào môi trường sữa để đảm bảo lượng peptone đủ để làm tăng tốc độ lên men. Acid amin: Vi khuẩn lactic hấp thụ dễ dàng. Theo các nghiên cứu, vi khuẩn lactic phát triển tốt nhất trong môi trường có đầy đủ 16 loại acid amin. Đối với các vi khuẩn sinh hương, acid amin ngoài sự cần thiết cho sự phát triển của vi khuẩn mà nó còn kích thích sự tạo hương thơm. Trong acid amin, senin có tác dụng ức chế sự phát triển của nhiều loài Streptococcus. c. Vitamin Vi khuẩn lactic không có khả năng sinh tổng hợp vitamin và do môi trường sữa có đầy đủ các loại vitamin cần thiết cho sự phát triển của vi khuẩn lactic nên không cần bổ sung thêm từ bên ngoài. Bảng 2.5: Các vitamin được các loài vi khuẩn sử dụng Loài vi khuẩn Vitamin Riboflavin Piridoxin Acid fomic B12 Tiamin Lc. Jugurti + + − − − Lc. Lulveticum + + − − − Lc. Bulgaricum + − +/− − − Lc. Lactic + − − +/− − Lc. acidepphilus + − + +/− − d. Muối khoáng và các nguyên tố vi lượng Nhu cầu này không lớn do đó không cần bổ sung thêm từ ngoài vào mà chỉ cần sử dụng những chất có sẵn trong môi trường sữa. Trong các loai muối khoáng P chiếm tỉ lệ cao nhất. ­Chú ý: Nồng độ NaCl trong môi trường không được quá 6,5% nó sẽ tiêu diệt hết tất cả các loại vi khuẩn lactic. e. Nhu cầu oxy Vi khuẩn lactic vừa có khả năng sống được trong môi trường có oxy và vừa sống được trong môi trường không có oxy. Theo nghiên cứu cho rằng vi khuẩn lactic phát triển tốt nhất trong môi trường có oxy thấp. f. Nhiệt độ Tùy từng loại vi khẩn khác nhau mà nhiệt độ thích hợp cho nó sẽ khác nhau: VSV ưa lạnh: VSV ưu ấm: VSV ưu nóng: tmin = 00C tmax = 20 – 300C top = 5 – 100C tmin = 30C tmax = 45 – 500C top = 20 – 350C tmin = 300C tmax = 800C top = 50 – 600C Nhiệt độ không những ảnh hưởng đến cường độ phát triển mà còn ảnh hưởng đến khả năng phát triển của chúng nữa. Điều chỉnh nhiệt độ thích hợp sẽ: + Rút ngắn thời gian lên men. + Hạn chế sự nhiễm các vi sinh vật lạ khác. + Sản phẩm thu được đạt kết quả như mong muốn. g. pH môi trường pH của môi trường ảnh hưởng đến hoạt động phát triển của vi sinh vật, sự có mặt của ion H+ sẽ tác động lên tế bào của vi sinh vật theo nhiều cách: + Ảnh hưởng trực tiếp lên bề mặt của tế bào làm thay đổi sự tích điện trên bề mặt của màng từ đó dẫn đến hoạt độ của các loại enzyme bị giảm. + Nồng độ ion H+ ảnh hưởng đến độ phân ly của các chất dinh dưỡng trong môi trường. + pH môi trường khác còn làm độ phân tán chất keo và độ xốp của thành tế bào không đồng đều cho nên việc chống lại các tác động bên ngoài sẽ khác nhau dẫn đến làm thay đổi hình dạng của tế bào. Với vi khuẩn lactic thì các loại cầu khuẩn chịu pH kém hơn so với các trực khuẩn. Bảng 2.6: Các giá trị pH mà vi sinh vật phát triển được Loài vi khuẩn pHmin pHop pHmax Trực khuẩn ưu nhiệt 3,5 – 4,25 5,5 – 6,5 7 – 8 S. Lactic 4,75 6 – 6,5 8,5 S. thermophilus 4,75 6 – 7 8,5 S. Faecalis 4,5 6 – 7 10 Đối với các vi khuẩn lên men lactic đồng hình, pH môi trường thường không ảnh hưởng đến các sản phẩm đặc trưng của quá trình lên men còn đối với các vi khuẩn lên men lactic dị hình thì ngược lại. + Khi pH môi trường cao thì sản phẩm tạo thành chủ yếu là acid lactic. + Khi pH môi trường thấp thì sản phẩm tạo thành ngoài acid lactic còn có thêm acid acetic và nhiều sản phẩm khác. Qua nhiều nghiên cứu người ta nhận thấy rằng lượng di-acetyl tạo ra nhiều nhất tại pH = 4.6-5,2. Đây chính là yếu tố làm tăng mùi hương cho sản phẩm. Tác dụng của chất kháng sinh do các vi khuẩn lactic sinh ra cũng bị ảnh hưởng bởi pH môi trường. h. Các chất kháng sinh Các chất kháng sinh ảnh hưởng rất lớn đến vi khuẩn lactic + Penicilin: chỉ một lượng rất nhỏ cũng đủ làm ức chế nhiều loài vi khuẩn lactic. + Streptomycin: có tính kháng sinh rất mạnh, có khả năng tiêu diệt cả vi khuẩn gram dương và vi khuẩn gram âm. Trong quá trình lên men, hàm lượng chất kháng sinh tạo ra trong môi trường đủ lớn sẽ làm giảm hiệu xuất lên men. Bảng 2.7: Biến đổi các thành phần từ sữa tạo thành Kefir Thành phần Chú thích Chất béo Phụ thuộc nguồn sữa ban đầu (bò, dê...) và lượng béo của sữa được dùng (nguyên béo, tách béo một phần hay không béo) Lactose Tiêu thụ một phần lactose, bởi vi khuẩn lactic và nấm men. Lactose trên 100 g sản phẩm sữa Kefir: 2÷2,5 g. Acid lactic Hình thành bởi vi khuẩn lactic. Trên 100 g sản phẩm sữa Kefir có 0,6÷1 g Potein Chiếm 3÷3,4 g/100g sản phẩm sữa Kefir Ethanol Sản sinh bởi nấm men nếu dùng men: lượng cồn là 0,01÷0,1g/100g sữa, nếu dùng hạt Kefir lượng cồn là 0,02÷1,8 g/100g sữa. Các acid hữu cơ khác Axetic, fomic, propionic, Succinic, pyruvic, iso butyric, caproic, acid lauric…góp phần tạo hương cho Kefir hay được tiêu thụ bởi chính loài vi khuẩn trong suốt quá trình lên men. CO2 Sinh ra nhờ nấm men và vi khuẩn lactic lên men dị thể sinh CO2 tạo tính đặc trưng cho Kefir. Hợp chất thơm Acetaldehyde, diacetyl, acetone góp phần vào hương của sản phẩm Vitamin Tăng vitamin B (đối với sữa cừu), pyridoxine (từ sữa cừu, dê, ngựa), acid folic (trừ sữa ngựa), orotic, nicotinic, acid pantothenic: không đổi hay giảm khi cô đặc (Nguyễn Tú Thanh, 2003) CHƯƠNG III: CÁC ỨNG DỤNG CỦA KEFIR 3.1. Qui trình chế biến Kefir 3.1.1. Qui trình sản xuất men giống Kefir a. Quy trình Sữa tươi tiệt trùng Cấy giống Lên men Lọc thô Xử lý Dịch men giống cho sản xuất Hạt Kefir Hạt Kefir (5%) Hạt Kefir Hình 3.1: Sơ đồ quy trình tạo men giống trong sản xuất sữa chua Kefir b. Giải thích qui trình sản xuất men giống § Môi trường chuẩn bị giống Môi trường sử dụng có thể là sữa tươi, sữa gầy hoặc sữa hoàn nguyên. Hàm lượng chất khô trong môi trường khoảng 11÷12%. Sữa được thanh trùng ở 90÷950C trong thời gian 30÷45 phút (thời gian thanh trùng kéo dài nhằm vô hoạt enzyme và ức chế đến mức tối thiểu sự có mặt của vi sinh vật lạ trong môi trường để giúp cho giống phát triển tốt và không bị tạp nhiễm), sau đó đưa về 22÷240C để chuẩn bị cấy giống. Ở đây ta sử dụng sữa tươi tiệt trùng của Vinamilk . § Cấy giống sử dụng hạt Kefir với lượng ban đầu 5% theo khối lượng, quá trình nhân giống cũng được thực hiện ở nhiệt độ phòng (23÷250C) . Do hạt Kefir có kích thước lớn nên chúng thường bị chìm xuống dưới đáy nên cần phải khuấy trộn môi trường trong thời gian 10÷15 phút sau mỗi 2÷5 giờ. Quá trình nhân giống kết thúc khi pH môi trường giảm xuống còn 4,5. § Lọc thô Khi đạt pH yêu cầu, canh trường được lọc. Hạt kefir được xử lý bằng cách rửa trong nước vô khuẩn ở nhiệt độ thấp (6÷100C) để loại bỏ tạp chất bám trên bề mặt hạt (có thể sử dụng sữa gầy vô trùng để rửa hạt, Hạt Kefir đã qua rửa sạch và bảo quản trong nước vô khuẩn hoặc dung dịch muối NaCl 0,9%. Khi cần nhân giống cho mẻ tiếp theo, sử dụng tiếp hạt Kefir trên để nhân giống . Dịch thu được sau quá trình lọc thô chứa các vi khuẩn lactic và nấm men có thể sử dụng để cấy giống vào môi trường sữa nguyên liệu để sản xuất Kefir. Quá trình sản xuất giống cũng được thực hiện ở 25÷300C thời gian nuôi trung bình là 20 giờ (cần kiểm tra giá trị pH của canh trường là 4,5 để xác định thời điểm kết thúc quá trình nuôi 3.1.2. Qui trình chế biến sữa chua Kefir a. Quy trình Sữa tiệt trùng không đường Phối chế Cấy giống Lên men (18 giờ,25 0C) Phối chế, điều vị Vô bao bì Ủ chín (12 giờ, 14-16 0C) Sản phẩm Kefir (bảo quản lạnh) 6% dịch men giống Kefir 10% sirô đường saccharose nồng độ 40%, 10% gelatine 10% sirô đường saccharose nồng độ 60% Hình 3.2: Sơ đồ quy trình sản xuất sữa Kefir b. Giải thích qui trình sản xuất Kefir § Nguyên liệu Sữa có chất lượng cao, không chứa kháng sinh và đạt các mức chỉ tiêu về vi sinh. Hàm lượng chất béo có thể thay đổi tuỳ thị hiếu người tiêu dùng, sản phẩm Kefir thường có hàm lượng chất béo từ 2,5÷3,5%. Trong các thí nghiệm này, sử dụng nguyên liệu là sữa tươi tiệt trùng của Vinamilk. § Phối chế Bổ sung thêm sirô đường saccharose vào sữa nguyên liệu nhằm tạo điều kiện tối ưu cho vi khuẩn lactic phát triển và tạo hương vị đa dạng cho sản phẩm. Dung dịch gelatin được cho vào tỷ lệ 10%(v/v) so với thể tích dịch lên men. § Cấy giống Sữa sau khi đã được điều phối tạo điều kiện tối ưu cho nấm Kefir hoạt động, tiến hành cấy dịch men giống (đã được chuẩn bị ở phần sản xuất dịch men giống (mục 1.6.1) vào để lên men § Lên men Trong quá trình lên men Kefir, vi khuẩn lactic sẽ chuyển đường lactose thành acid lactic, một số loại nấm men sử dụng đường lactose sẽ chuyển hoá lactose thành ethanol và khí CO2. Ngoài ra, trong dịch lên men chứa hàng trăm sản phẩm phụ từ hai quá trình lên men lactic và ethanol nói trên. Chúng đóng vai trò quan trọng trong việc hình thành nên hương vị của sản phẩm, đáng chú ý nhất là các acid hữu cơ như acid propiomic, acid formic, acid succinic, các hợp chất bay hơi thuộc nhóm aldehyde (aldehyde acetic, diacetyl) và rượu cao phân tử, nhiệt độ lên men 25÷300C. § Phối chế Sản phẩm sau lên men sẽ có độ nhớt tương đối cao nên cần bổ sung thêm nước và sirô đường saccharose nồng độ 60% để sản phẩm đạt cấu trúc và hương vị mong muốn § Vô bao bì Bao bì sử dụng là hũ thủy tinh hay hũ nhựa 50ml, được rửa sạch, vô trùng và rót sản phẩm trong điều kiện vô trùng để hạn chế các vi sinh vật từ môi trường xung quanh nhiễm vào sản phẩm. § Ủ chín Sau khi phối chế và vô bao bì tiến hành ủ chín sản phẩm bằng cách đưa sản phẩm về nhiệt độ 14-16 0C. Ở nhiệt độ này tốc độ trao đổi chất của vi khuẩn lactic và nấm men bị chậm lại. Công đoạn ủ chín giúp ổn định cấu trúc của sản phẩm sau quá trình phối chế và vô bao bì, vi khuẩn lactic và nấm men tiếp tục quá trình tạo sản phẩm phụ. Mùi vị sản phẩm Kefir được cải thiện rõ nét. Thời gian ủ chín là 12-14 giờ. § Bảo quản Sản phẩm hoàn thành được bảo quản ở 4÷60C. Trong quá trình bảo quản hệ vi sinh vật Kefir vẫn tiếp tục trao đổi chất với môi trường và làm biến đổi dần các chỉ tiêu hoá lý (độ chua, hàm lượng ethanol) và chỉ tiêu cảm quan (mùi vị...) của sản phẩm. Hình 3.3: Các sản phẩm sữa Kefir 3.2. Hạt Kefir trong môi trường nước đường a. Quy trình chuẩn bị giống Kefir Hạt Kefir Rửa sạch Môi trường nước đường (saccharose, glucose, fructose) Rửa sạch Rửa sạch Rửa sạch Men giống Kefir Hình 3.4: Quy trình chuẩn bị men giống Kefir b. Thuyết minh quy trình trên (Hình 2.12) Hạt Kefir sau khi vớt ra từ sữa, rửa thật sạch bằng nước vô trùng, sau đó thả vào môi trường nước đường đã được chuẩn bị sẵn. Ban đầu lấy khoảng 100ml nước đun sôi để nguội, pha khoảng 10% tương ứng với 10g đường ( loại đường nào cũng được glucose, fructose, saccharose,…) tuy nhiên ở đây chọn loại đường saccharose (đường trắng hoặc vàng tinh luyện của nhà máy đường Biên Hòa) để nuôi hạt Kefir. Sau 2–3 lần nuôi trong môi trường nước đường, hạt Kefir đã có vẻ thích nghi, ta tăng khối lượng đường lên (20g, 30g, 40g va 50g). Sau vài lần nuôi Kefir trong môi trường nước đường, hạt có khả năng phát triển và sinh sản mới cho kefir vao môi trường thí nghiệm. 3.3. Cơ sở khoa học của quá trình lên men Kefir trong môi trường nước đường Nhiều vi khuẩn và nấm men có trong hạt Kefir khi sống trong môi trường dinh dưỡng (như nước đường) sẽ sản sinh ra enzyme invertase thủy phân đường saccharose giải phóng giải phóng glucose và fructose. Đây là nguồn chất dinh dưỡng cơ bản cho các loài vi sinh vật khác có trong hạt Kefir. Cũng có những loài sử dụng nguồn năng lượng chính từ nguồn đường saccharose làm nguồn năng lượng và trao đổi cấu trúc. 3.3.1. Lên men lactic. Tác nhân gây lên men hay là tác nhân cung cấp hệ enzyme là các vi khuẩn họ Lactobacteriaccae (vi khuẩn này là vi khuẩn yếm khí hoặc vi khuẩn hiếu khí). Phụ thuộc vào hệ enzyme của từng nòi vi khuẩn mà trong môi trường lên men hoặc chỉ có acid lactic (lên men đồng hình) hoặc ngoài acid lactic còn có sản phẩm khác và CO2 (lên men dị hình). Tuy hệ vi khuẩn trong hạt Kefir rất phong phú nên trong sản phẩm lên men thường có chứa rất nhiều chất khác ngoài acid lactic. Có hai cơ chế tạo acid lactic: Acid lactic được tạo thành theo sơ đồ Embden-meyerhoff. Hydro đã được tách ra khi dehydro hóa triosephosphat, được chuyển đến pyruvat. Acid lactic tạo thành chiếm hơn 90% tổng sản phẩm lên men. Chỉ một phần nhỏ pyruvat bị khử cacbonxyl để chuyển thành acid acetic, ethanol, CO2 và acetoin. Lượng phẩm vật phụ tạo phụ thuộc vào sự có mặt của O2. Cơ chế thứ hai, xảy ra khi các vi khuẩn lactic không có enzyme cơ bản của sơ đồ Embden-meyerhoff là aldose và triosephosphatizomerase. Nói khác ra, acid lactic tạo thành ở đây theo chu trình pentosephosphat: nghĩa là qua glucose, 6-phosphogluconat và ribulose-5-phosphat. Xilulose-5-phosphat dưới tác dụng của enzyme pentosephosphocetolase (trong phản ứng phụ thuộc tiaminpirophosphat), bị phân ly để tạo thành aldehyd phosphoglycerinic va acetylphosphat. Acetylphosphat hoặc bị phân ly dưới tác dụng của acetatkinase (có phosphoryl hóa ADP) sẽ tạo thành acetate (L.brevis), hoặc bị khử để tạo thành acetaldehyde rồi thành rượu ethanol (L.mesenteroides). Còn aldehyd phosphoglycerinc thì bị ôxy hóa thành lactat theo con đường thông thường của sơ đồ Embden-meyerhoff. 3.3.2. Lên men ethanol. Nấm men chính cung cấp hệ enzyme đặc thù đề tạo thành ethanol trong giai đoạn lên men Saccharosemyces Cerevisiae. Nấm men có đặc điểm là trong điều kiện sinh hoạt yếm khí, chúng có khả năng chuyển đường thành ethanol và CO2 một cách hợp thức. Diễn biến của quá trình lên men như sau: Đường cùng các chất dinh dưỡng khác của môi trường lên men, trước tiên được hấp phụ vào trên bề mặt của tế bào nấm men, sau đó khuyếch tán qua màng bề mặt bán thấm đó mà vào bên trong tế bào. Trong khi nước được vào ra tế bào một cách tự do thì đường và các chất dinh dưỡng khác chỉ được màng tế bào cho đi vào mà không cho đi ra. Vì vậy, đường được chuyển hóa qua một chuỗi phản ứng để tạo thành sản phẩm cuối cùng của sự lên men là rượu ethylic và CO2. Phương trình phản ứng tổng quát của quá trình lên men: C6H12O6 + 2ADP + 2H3PO4 = 2C2H5OH + 2CO2 + 2ATP + 2H2O Trong điều kiện sản xuất, sự lên men rượu sẽ tiến hành một cách thuận lợi khi nhiệt độ từ 29÷320C. Người ta thấy, nấm men có thể làm lên men được mặc dù chậm chạp những dung dịch đường có nồng độ 25÷30%. Tuy nhiên môi trường thuận lợi cho lên men là 10÷18% đường. Dung dịch đường có nồng độ rất cao sẽ tạo ra áp suất thẩm thấu lớn gây phá hủy trạng thái sinh lý bình thường của nấm men. Thời gian lên men sẽ kéo dài, sử dụng không triệt dể hết đường, đồng thời lượng rượu tạo thành lớn sẽ ức chế hoạt động của nấm men. Giới thiệu sản phẩm nước quả lên men truyền thống. 3.4.1. Khái quát Nước giải khát lên men đó là sản phẩm của quá trình lên men rượu chưa kết thúc. Tùy theo nguồn nguyên liệu dùng để pha chế dịch lên men, người ta chia nước giải khát lên men thành nhiều nhóm khác nhau. Ở nước ta chưa sản xuất nước giải khát này nhưng có thể chia làm hai nhóm chính: nước giải khát lên men từ nguyên liệu chứa tinh bột và nước giải khát lên men từ nước quả. Dựa vào nguồn nguyên liệu mà ta có các sản phẩm như: nước giải khát lên men dứa, cam, chanh…Và tùy yêu cầu mà ta có hoặc không bổ sung CO2 vào trong nước giải khát. Thông thường thì người ta có bổ sung CO2 vào để tạo nước giải khát có ga. So với các loại siro quả mà hiện nay thường bán trên thị trường thì nước giải khát lên men (nước quả lên men) ngon và có tác dụng giải nhiệt hơn nhiều. Ngon hơn vì CO2 thoát ra do phản ứng lên men sẽ hòa tan với nước giải khát, sau đó tác dụng với các chất hoặc nguyên tố có trong thành phần của nước giải khát, tạo ra các este đơn giản và phức tạp nên có mùi thơm và vị dịu hơn. Mặt khác, do trong dịch còn chứa các chất giữ bọt như peptit, acid amin, melanoidin, các sản phẩm thủy phân…nên CO2 khi tới mặt nước sẽ không tan ngay mà được giữ lại và bám vào nhau tạo thành lớp bọt dày. Sản phẩm này giải nhiệt tốt hơn vì khi uống nước giải khát có ga thì CO2 sẽ bay hơi và thu nhiệt do đó gây cho ta cảm giac mát và khoan khoái. Sản xuất nước giải khát lên men từ nước quả có ưu điểm là đơn giản, và đòi hỏi ít trang bị, có thể tổ chức ở quy mô xí nghiệp, hợp tác xã và gia đình. Nhưng nhược điểm là giá thành cao và nếu điều kiện kỹ thuật không đảm bảo thì nước quả lên men dễ bị hỏng. Đặc điểm: -Nồng độ chất hòa tan trong sản phẩm: 5÷8% khối lượng -Độ chua: 2÷4 độ -Nồng độ rượu: 0,5÷1,5% thể tích -Thời gian tàng trữ để ổn định chất lượng: 5÷6 giờ -Thời gian bảo quan: 2 ngày Đặc điểm của nước giải khát lên men là trong thành phần các quá trình sinh học còn tiếp diễn, do đó không thể bảo quản lâu quá 2 ngày dù ở nhiệt độ thấp. Khi đã rót ra cốc mà để lâu thì chất lượng nước giải khát cũng bị giảm rõ rệt sau 2÷3 giờ. Vì vậy, nước giải khát lên men nói chung thường chỉ sản xuất đủ tiêu dùng trong ngày và lên uống khi còn tươi. Tuy nhiên đối với một số nước giải khát lên men cao cấp, người ta loại bớt tế bào nấm men rót vào chai đậy nút rồi đem thanh trùng ở nhiệt độ thích hợp và vì thế thời gian bảo quản cho phép tăng 2÷3 tháng, tương tự như bia. 3.4.2. Quy trình sản xuất chung a. Quy trình Nước vô trùng Bã Đường Nước Acid thực phẩm Làm lạnh Nguyên liệu Diệt khuẩn CO2 bão hòa Bã Men giống 5%V 65 0C, 35 – 45 phút T0 = 5 – 6 0C T0 lm = 28 - 30 0C pH = 5,4 - 5,8 Chai Sản phẩm Xử lý nguyên liệu Ép lấy nước cốt Bổ sung Pha loãng Lên men Làm lạnh Phối chế Lọc Chiết rót Thanh trùng Kiểm tra Dán nhãn Lọc Đun nóng Hình 3.5: Quy trình sản xuất nước quả lên men b. Thuyết minh quy trình §Nguyên liệu Dứa, cam, chanh, quýt, vải, nhãn, xoài, chôm chôm, mơ… §Xử lý nguyên liệu Đầu tiên là chọn lựa các trái có thể dùng để sản xuất (còn nguyên hay có chút hư hỏng), độ chín kỹ thuật, đạt màu sắc, tươi ngon. Sau đó tiến hành rửa, vừa để làm sạch vừa để phân loại quả dùng được hay bỏ đi… Bóc vỏ quả, có thể dùng nhiệt hoặc hóa chất. §Ép lấy nước cốt Dùng máy ép lọc lấy nước cốt qua sang, đường kính lỗ sang 0,3÷0,8 mm. §Diệt khuẩn Đem nước ép trái cây vào nước nóng 70÷750C để diệt khuẩn bằng độ ấm cao trong 5 phút để tránh ảnh hưởng khi lên men sau này. §Bổ sung Giai đoạn này ta bổ sung sirô đường và CO2 bão hòa vào. Đây là yêu cầu đối với nước giải khát lên men. § Pha loãng Trước khi lên men cần pha loãng dịch để giảm hàm lượng chất khô đến 5÷8% và yêu cầu là sử dụng nước vô khuẩn. §Lên men Men giống ta sử dụng là Saccharomyces minor. Có thể sử dụng kết hợp nấm men này với vi khuẩn lactic để có độ chua ổn định và tăng hương vị của sản phẩm. Tuyệt đối không sử dụng các giống trong sản xuất rượu etylic vì cá giống này có khả năng lên men mạnh, không phù hợp cho yêu cầu nước giải khát. Quá trình lên men tiến hành trong thùng lên men, nhiệt độ khống chế ở 28÷300C, pH = 5,4÷5,8. §Làm lạnh Sau 10h lên men, ta lấy mẫu kiểm tra, nếu nồng độ dịch lên men giảm 1,0÷ 1,2% thì ta làm dịch lên men xuống 100C. Khi đó áp suất trong thùng giảm từ 1,0÷ 1,2at đến 0,4÷0,5at và do lạnh lên CO2 hòa tan vào nước giải khát. Tế bào nấm men lắng xuống, nhờ đó giảm bớt cường độ lên men. Sau 2 giờ khi nhiệt độ giảm xuống 100C, quan sát tháo bớt dịch lên men và tháo sản phẩm ra. Chú ý: rằng tốc độ và nhiệt độ làm lạnh ảnh hưởng rất lớn đến chất lượng nước giải khát Làm lạnh nhanh và ở nhiệt độ thấp thì nấm men sẽ lắng nhanh, hạn chế cường độ lên men, do đó thành phần nước giải khát ổn định hơn trong thời gian bảo quản, nhất là ở mạng lưới thương nghiệp. Vì vậy, nếu xí nghiệp có điều kiện thì lên làm lạnh ở 5÷60C và có thể sử dụng nước muối để làm lạnh tốt. Nồng độ tế bào nấm men trong nước giải khát phụ thuộc vào tốc độ và nhiệt độ làm lạnh, có thể 15÷25 triệu tế bào/ml. Ngoài ra nhiệt độ bảo quản cũng ảnh hưởng nhiều đến chất lượng nước giải khát. §Điều phối Tùy theo chất lượng của nước giải khát quy định mà ta có thể bổ sung thêm dịch đường, màu, mùi, acid thực phẩm…rồi dùng CO2 sục đều. Hương màu và hương mùi ở đây có thể tự nhiên hay tổng hợp. §Lọc Sau khi điều phối ta lọc lại để cho dịch trong suốt. §Chiết rót Chiết rót vào chai. Chai đựng nước giải khát yêu cầu phải có kích thước xác định, thường dung tích là 650, 500, 330ml. Đậy chai bằng nút sắt tây lót cao su hoặc giấy caton yêu cầu phải kín. Chai phải trong suốt và có màu xanh tối hoặc sẫm vàng. Điều này sẽ hạn chế tác dụng trực tiếp của ánh sáng mặt trời, tránh cho nước giải khát bị đục. Ngoài ra chai phải chịu được áp suất và sự thay đổi nhiệt độ đột ngột. Yêu cầu chung đối với tất cả nước có ga là trước khi chiết rót phải làm lạnh tới nhiệt độ 8÷100C. §Thanh trùng Do trong nước giải khát lên men vẫn còn chứa tế bào nấm men, đó là nguyên nhân làm mất ổn định chất lượng sản phẩm khi bảo quản. Bảo quản lạnh chỉ hạn chế được hoạt động của nấm men nhưng không làm ngừng hoàn toàn được quá trình sinh học xảy ra trong thành phẩm. Vì vậy thanh trùng là biện pháp chung nhất nhằm giữ cho sản phẩm lâu hư hỏng. Tuy nhiên, để vừa tiêu diệt được tế bào nấm men vừa không ảnh hưởng đến mùi vị và chất lượng sản phẩm. Quá trình thực hiện: đầu tiên đun đến 450C, duy trì nhiệt độ này trong 15 phút, sau đó tiếp tục tăng nhiệt độ lên 650C trong 35÷40 phút, sau đó làm lạnh xuống 450C trong 10 phút và làm lạnh dần đến 100C. Đối với nước giải khát đóng chai và thanh trùng như vậy sẽ bảo quản được từ 2÷3 tháng. §Kiểm tra, dán nhãn Đây là khâu loại bỏ các chai không đạt yêu cầu và hoàn chỉnh sản phẩm để có thể tiêu thụ buôn bán trên thị trường. §Chuẩn bị sirô đường Nước, đường và acid thực phẩm ta đem đun nóng. Sử dụng phương pháp đun nóng để tiêu diệt các vi sinh vật có trong đường và trong nước, mặt khác tạo điều kiện tốt để biến saccharose thành glucose. Đường chuyển hóa này sẽ có vị ngọt và dịu hơn làm nước giải khát có chất lượng tốt hơn. §Lọc Nhằn mục đích loại hết các tạp chất cơ học, như rác, đất, cát lẫn vào đường trong quy trình vận chuyển và bảo quản. §Làm lạnh Đến nhiệt độ thấp 4÷100C để hạn chế tổn thất và giữ được hương thơm. Hình 3.6: Nước gừng và nước chanh lên men kefir ( 3.5. Giới thiệu về sản phẩm Kefir d’Uva hay Grape Juice Kefir (nước nho lên men Kefir) 3.5.1. Giới thiệu về nguyên liệu chính: trái nho a. Nguồn gốc và phân bố của cây nho Nho là một trong những cây có nguồn gốc sớm nhất trên trái đất, qua những mẫu hóa thạch của cây và lá nho trong các trầm tích đá phẩn, các nhà khoa học đã đi đến kết luận rằng cây nho có cùng tuổi phát sinh với loài người. Cây nho dại có nguồn gốc ở vùng bắc bán cầu, đặc biệt là vùng có khí hậu ôn đới thuộc Châu Âu, Bắc Mỹ, Trung Mỹ và Tây bắc của Nam Mỹ. Nho được trồng trọt chủ yếu như một cây trồng vào thế kỷ thứ 11-12 sau Công nguyên. Cho đến nay, cây nho đã được trồng trên cả 5 châu lục, ở những vùng có khí hậu phù hợp, đối với vùng có khí hậu ôn đới, cây nho chỉ cho thu hoạch mỗi năm một vụ, trong khi ở các nước có khí hậu nhiệt đới và bán nhiệt đới cây nho có khả năng sinh trưởng liên tục và cho thu hoạch 2,5-3 vụ mỗi năm. Hình 3.7: Một số loại nho. Ở Việt Nam, Hà Nội trồng nho làm cảnh, che bóng mát, quả khá sai có giá trị trang trí nhưng giá trị thực phẩm thấp vì ăn được nhưng vỏ dày, dư vị chát, ít đường, hương vị kém, không sản xuất kinh doanh được. Chỉ có miền Nam mới trồng được nho với quy mô sản xuất kinh doanh, chất lượng tuy chưa phải lý tưởng so với nho ngon ở Bồ Đào Nha, Carlifornia nhưng không thua các trái cây khác. Nho trồng chủ yếu ở Ninh Thuận và Bắc Bình Thuận với diện tích 2.500 - 7.000 ha. Đặc biệt ở vùng Ninh Thuận, cây nho rất có tiền năng, năng suất khá cao, trên một hecta có thể thu được 30 – 40 tấn mỗi năm. b. Đặc điểm và tính chất của trái nho Trái nho mọc thành chùm từ 6 đến 300 quả. Trái nho cấu tạo hình ô van. Trái có màu sắc khác nhau. Khi còn non có màu xanh. Khi lớn và chín, trái có màu xanh, đỏ đậm, tím, tùy thuộc vào đặc điểm của giống. Hình 3.8: Cấu tạo trái nho. Vỏ: thành phần hóa học vỏ nho: nước, cellulose, polyphenol, acid hữu cơ… Pectin: protopectin và pectin Polyphenol: Chất màu: flavoniodes gồm có anthocyanes (đỏ, xanh,…), flavones (vàng)… Chất không màu: phenol monomer (acid phenolic), polyphenol ngưng tụ, tannin. Hạt: chứa vài chất, một vài chất có hại nếu có mặt trong rượu: dầu, acid bay hơi, chất nhựa…,do đó cần thiết là khi nghiền nho không làm vỡ hạt. Thịt trái: nước 75-85%, đường 12-20%, các chất khác (acid, chất chứa N, pectin, vitamin): 5-6%. + Đường: đường lên men (glucose, fructose, sucrose…), không lên men (xylose, arabinose, methylpentose…) + Acid hữu cơ: 90% là acid tartaric và malic, 10% còn lại là acid khác như acid citric, fumaric, oxalic, a.cetonic (puryvic, glutaric, oxaloacetic…), acid phenolic… Các acid này có trong nho dưới dạng tự do hoặc dạng muối: bitartrat kali, tartrat kali, malat kali. Tỷ lệ giữa acid tự do và dạng muối phụ thuộc vào pH. Do đó pH quan trọng trong việc làm rượu vang. + Enzyme: hydrolase, oxydase. + Hợp chất chứa N: 0,3-1 g/l dịch nho, một phần là nitơ ammoniac (10-20%) được đồng hóa bởi nấm men. Phần khác dưới dạng nitơ hữu cơ (acid amin, amid, protein) sẽ tủa một phần khi lên men dưới tác dụng của polyphenol và rượu. + Chất chứa pectin: tồn tại dưới dạng keo và khá bền trong dung dịch nho. + Vitamin: Chứa vitamin C, B1, B2, PP và các chất thơm khác. + Chất khoáng:K là quan trọng nhất, dao động khoảng 0,7-2 g/l dich nho. Trong rượu, hàm lượng K bao giờ cũng nhỏ hơn trong dịch nho, do bị tủa bởi bitartrat kali khi len men kết thúc và khi bảo quản lạnh. Trong nho còn có nhiều chất khoáng khác được thể hiện ở bảng 2.8. Bảng 3.1: Thành phần chất khoáng trong nho. Các chất khoáng g/l Ca 0,075-0,250 Mg 0,05-0,15 Na 0,03-0,3 Fe 0,005-0,012 Bảng 3.2: Thành phần polyphenol trong nho. Thành phần polyphenol mg/kg Anthocyanin 100-400 Flavonol (chủ yếu là rutin). 5-285 Flavanol 0-25 Hydroxycinnamate 2-25 Thành phần hóa học trong nho Bảng 3.3: Thành phần hóa học trong 100g nho. % không ăn được so với cả vỏ 0 Nhiệt lượng (calo) 50 Nước (g) 86 Protein (g) 0,5 Lipit (g) 0,3 Glucid cộng cả cellulose (g) 12,8 Cellulose (g) 0,9 Ca (mg) 9 P (mg) 20 Fe (mg) 0,6 Na (mg) 6 K (mg) 111 Tương đương với carotene Vitamin A (mg) 50 Thiamin B1 (mg) 0,10 Riboflavin B2 (mg) 0,06 Niacin (mg) P 0,2 Acid acosbic (mg) 4 c. Những lợi ích của trái nho: tác dụng chữa bệnh của polyphenol Trước đây, một số nhà khoa học cho rằng sở dĩ rượu vang đỏ có lợi ích cho sức khỏe là do tính chống ôxy hóa của flavonoid. Cũng có ý kiến cho rằng rượu vang có những chất polyphenol nên có lợi ích với tim mạch… Nhưng hiện nay, người ta đã biết chính xác rằng chính hợp chất resveratrol trong lớp vỏ của nho đỏ ( nho xanh không có chất này) đã đem lại những lợi ích nói trên. Resveratrol có tác dụng ngăn hồng cầu kết dính vào nhau, làm giảm nguy cơ hình thành các cục máu đông, tăng cholesterol tốt (HDL) và giảm cholesterol xấu (LDL). Gần đây, các nhà khoa học còn phát hiện thấy ăn nhiều nho đỏ có thể chống được ung thư vì trong quả nho đỏ có chất quercetin bình thường vẫn tiền ẩn không hoạt động, nhưng khi tiếp xúc và bị tác động bởi vi khuẩn trong bộ máy tiêu hóa sẽ biến thành một chất có khả năng chống ung thư. Nhà y học người Mỹ Stoner cũng cho rằng một số hợp chất chiết xuất từ một số loại quả trong đó có nho, có khả năng ngăn chặn tác hại của nhiều loại hóa chất gây ung thư và aflatoxin (loại độc tố do nấm mốc aspergillus flavus tiết ra thường có trong lạc mốc bị coi là có thể gây ung thư gan). Theo dược điền Mỹ, nho có công dụng chữa chứng ăn khó tiêu, sốt, trĩ, táo bón, các bệnh gan, thận. Nước ép nho đỏ vừa ảnh hưởng trực tiếp lên phản ứng đông máu, vừa làm tăng nồng độ các chất chống ôxy hóa và làm giảm các gốc tự do. Resveratrol có khả năng chống ôxy hóa mạnh gấp 7 lần vitamin E. Một nghiên cứu khác cho thấy, nước ép nho đỏ có hoạt tính chống ôxy hóa mạnh gấp 3 lần so với nước ép cà chua, cam, bưởi. Ngoài ra, trong quả nho còn có boron, một chất làm chậm lại hoặc ngăn chặn chứng loãng xương ở phụ nữ mãn kinh, người cao tuổi. d. Một số sản phẩm từ nho Nho là nguồn nguyên liệu sản xuất các thực phẩm có giá trị như rượu nho, nước nho, nho khô, mứt nho,… Đặc biệt nho chế biến rượu vang có giá trị dinh dưỡng cao, có hương thơm và mùi vi đặc trưng. Một só sản phẩm đặc trưng từ nho là: rượu vang nho, rượu cognac, mứt nho, nho compot (hay đồ hộp nho nước đường), nước nho đóng hộp. 3.5.2. Sản phẩm nước nho lên men Kefir a. Nguồn gốc Sản phẩm được bắt nguồn từ nước Pháp. Ở Pháp có truyền thống sản xuất rượu vang rất nổi tiếng, vì ở Pháp nho được trồng ở rất nhiều nơi. Người ta cho lên men nước nho trong thời gian ngắn ( từ 1÷2 tuần) nên sản phẩm có độ cồn rất nhẹ và vị hơi chua (thích hợp cho phụ nữ và người già). Một thương nhân người Nga cũng đem sản phẩm này về nước và pha chế thành một kiểu thức uống khác nhưng hương vị cũng gần giống với sản phẩm ban đầu. Ở Nga, người ta không cấy men vào thức uống thay vào đó, lại cấy hạt Kefir vào. Và thế là cho ra đời một sản phẩm mới, độc đáo hơn vì nó có hương vị khác biệt (đặc biệt là nó có ga nhiều hơn, tạo cảm giác sản khoái khi uống và đã khát hơn). b. Thành phần nguyên liệu gồm: 500ml nước ép nho nguyên chất (có thể chọn các giống tùy thích nhưng với mỗi sản phẩm nên chọn nho cho một màu như: nho tím, nho xanh, nho đỏ…). Đường: có thể chọn đường saccharose, glucose hay fructose… Ở đồ án này chọn đường saccharose tinh luyện màu trắng do nhà máy đường Biên Hòa sản xuất. Hạt giống Kefir: đã được nuôi trong môi trường nước đường để có thể lên men tốt. Acid citric hoặc nước cốt chanh: có tác dụng điều vị, tăng thên vị chua cho sản phẩm. c. Quy trình chế biến (Hình 2.21) Trái nho Bóc vỏ Rửa Bỏ hạt Xay nhuyễn Trộn với nước Lọc Rót vào chai có nắp đậy kín Lên men (ở nhiệt độ phòng, thời gian là 48 giờ) Lọc Kefir Phối chế (điều vị) Men giống Kefir Sản phẩm Hình 3.9: Quy trình chế biến nước nho lên men d. Thuyết minh quy trình Quy trình chế biến sản phẩm gồm 3 quá trình sau: v Quá trình chuẩn bị (sơ chế): Nguyên liệu chính là trái nho: có thể sử dung một hay nhiều loại nho phối hợp với nhau (nho đỏ, nho xanh, nho đen tùy theo mùa). Tuy nhiên để cho sản phẩm có màu đặc trưng thì nên sử dụng một loại nho có màu đặc trưng. Trái nho phải được lựa chọn kỹ: trái chín không bị sâu, không bị dập, cuống nho không héo, trên trái nho không bị nứt vỏ. Sau đó đem nho rửa sạch những cặn bã, bụi bẩn bám trên vỏ, để ráo nước, rồi tiến hành lột vỏ, bỏ hột. Ở công đoạn này cần tuân thủ những quy định vệ sinh nghiêm ngặt vì sản phẩm này sẽ không qua xử lý nhiệt nên có thể nhiễm vi sinh vật có hại. Có hai cách để lấy nước nho: một là có thể ép trực tiếp từ trái nho, hai là xay nhuyễn trái nho. Sau đó lọc ta được nước nho trong (không lẫn thịt nho), cho vào bình có nắp. Thể tích nước nho lấy khoảng 500ml. Phối chế khoảng 100g đường (tương đương 20%). Cho hạt giống Kefir vào bình và đậy nắp kím. v Quá trình lên men Kefir trong môi trường nước nho: Trong quả nho ngoài thành phần đường còn có chứa các acid hữu cơ (như acid tartaric, malic, citric, fumaric, oxalic, a.cetonic…), các polyphenol, các chất màu và các chất thơm. Tất cả những chất đó là nguồn dinh dưỡng rất thích hợp để hệ vi sinh vật có tự nhiên trong hạt Kefir sử dụng để lên men. Dựa vào cơ chế tác dụng, có thể chia quá trình lên men nước nho thành hai giai đoạn: - Giai đoạn lên men rượu được tiến hành bởi nấm men: Nấm men chính thực hiện quá trình lên men rượu này là Saccharomyces và Kloeckera (là hai loài nấm men có mặt tự nhiên trong quả nho), chúng có tính kỵ khí không bắt buộc, có khả năng lên men và hô hấp khác nhau, tạo ra các sản phẩm khác nhau (có ý nghĩa đối với sản phẩm này). Lên men glycerin do saccharose là sự biến dạng của quá trình lên men rượu, và được tạo thành như một sản phẩm phụ với số lượng rất ít. Glycerin sẽ gây ra vị đặc biệt của sản phẩm này. Lên men 2,3-butadiol: là một biến thể của lên men formic điển hình đối với các vi khuẩn đường ruột kỵ khí không bắt buộc.Đó là sự lên men cho nhiều sản phẩm, trong đó có acid formic là sản phẩm phụ điển hình, là một trong những chất thơm trong rượu vang. Lên men lactic. Có hai kiểu lên men lactic: điển hình và dị hình. Trong kiểu lên men lactic điển hình chỉ sinh ra acid lactic (tạo vị chua cho sản phẩm), còn kiểu lên men dị hình hoặc không điển hình thì các sản phẩm cuối cùng là acid lactic, ethanol, acid axetic và CO2 (tạo ra hương vị đặc trưng cho sản phẩm này). Aceton và diacetyl: đều có ảnh hưởng đến chất lượng của rượu vang, mặc dù số lượng của chúng được tạo ra trong rượu vang không lớn lắm: acetoin từ 2,0÷84 mg/l và diacetyl từ 0,1÷1,8 mg/l. Sự có mặt của chúng ảnh hưởng rất lớn đến hương vị của rượu vang nếu ở nồng độ thấp, còn ngược lại ở nồng độ cao sẽ làm biến đổi hóa sinh trong rượu, gây ra mùi vị không tốt cho rượu. Aldehyd và ester: là những hợp chất quan trọng hình thành nên hương vị của loại vang này. Aldehyd gồm: aldehyd acetic, propionic, butyric, valeric… Ester gồm: etylbytyrat, ester của các rượu bậc cao… - Giai đoạn lên men malolactic được thực hiện bởi vi sinh vật lactic. Ở giai đoạn lên men malolactic hay còn gọi là giai đoạn lên men phụ được thực hiện bởi một số vi khuẩn như: Lactobacillus, Pediococcus và Leuconostoc, nhằn tạo ra cho rượu vang những tính chất cảm vị đặc thù. Điểm đặc trưng nhất cùa giai đoạn này là các acid hữu cơ, dưới tác dụng của phức hệ enzyme của vi khuẩn lactic, đã bị biến đổi rất sâu góp phần tạo lên rượu vang. Ví dụ như: acid malic có trong quả nho là thành tố quan trọng nhất, sẽ được chuyển hóa bởi phức hệ enzyme của vi khuẩn thành acid lactic và khí cacbonic theo những đường hướng khác nhau. Trong đó, đường hướng tiêu biểu nhất là đường hướng acid L-malic dưới xúc tác của enzyme malolactic đã được chuyển hóa theo phương trình phản ứng sau: HOOCCH2CHOHCOOH Enzyme malolactic CH3CHOHCOOH + CO2 Cuối giai đoạn này, rượu vang được hình thành, CO2 được bão hòa, các hạt lơ lửng trong rượu vang, các tanat và muối tartrat được lắng xuống làm rượu vang trở lên trong. v Quá trình phối chế thành phẩm sau khi lên men: Có thể thêm đường hoặc không (tùy thuộc độ ngọt của sản phẩm), cho thêm vài giọt acid citric hoặc nước cốt chanh (có tác dụng điều hòa vị chua cho sản phẩm). e. Thành phần dinh dưỡng và lợi ích của sản phẩm: Bảng 3.4: Thành phần dinh dưỡng của sản phẩm nước nho lên men Kefir (khối lượng là 253g) cho năng lượng khoảng 155kcal. Thành phần các chất Khối lượng Nước 84% Protein 0,55% Béo 0,08% Tổng cacbonhydrat 15 Ca 8,69mg% Mg 9,48mg% Na 2,76mg% Fe 0,237mg% P 10,67mg% Vitamin A 20(IU) Vitamin C 0,079mg% Riboflavin 0,039mg% Thiamin 0,027mg% Niacin 0,276mg% 3.6. Nghiên cứu khả năng trung hòa tính gây độc tế bào của các yếu tố ngoại bào B. cereus của kefiran Dòng vi khuẩn và điều kiện nuôi cấy B. cereus được phân lập từ các vụ ngộ độc thực phẩm được cung cấp bởi Laboratorio Central de Salud Pública, Buenos Aires, Argentina. Dịch gốc được bảo quản ở - 800C trong glycerol như một chất chống đông lạnh. Vi khuẩn được tái hoạt hóa trong 16 h ở 320C trong môi trường BHI broth được bổ sung 0,1% glucose. Sau đó, cấy chuyển dịch vi khuẩn này vào 5 ml môi trường BHI broth có bổ sung 0,1% glucose và ủ ở nhiệt độ 320C trong 16h trong điều kiện lắc. Các tế bào tự do được sử dụng trong nuôi cấy đã thu được sau khi tiến hành ly tâm (900 v/p) và lọc (màng lọc 0,45 μm). pH của dịch được điều chỉnh lên 7,0 bằng NaOH 5N để tránh sự hư hại của tế bào trong môi trường acid. Tiến hành pha loãng dịch nuôi cấy trong PBS. Môi trường BHI broth được sử dụng làm đối chứng. Độ chuẩn của hoạt tính sinh học được xác định ở mỗi thử nghiệm. Phân lập và định lượng kefiran Hạt kefir được xử lý trong nước sôi (tỷ lệ hạt kefir : nước = 1 : 10) trong 3 h bằng cách khuấy gián đoạn. Hỗn hợp này được ly tâm ở 10000 v/p trong 20 phút ở 200C. Polysaccharide trong dịch huyền phù được kết tủa bằng cách thêm 2 thể tích cồn lạnh và được bảo quản ở nhiệt độ - 200C qua đêm. Sau đó, hỗn hợp này được ly tâm ở 10000 v/p trong 20 phút ở nhiệt độ 40C. Các chất kết tủa bị phân hủy trong nước nóng và quy trình kết tủa này được lặp lại hai lần. Chất kết tủa cuối cùng được hòa tan trong nước nóng vô trùng (dung dịch kefiran). Nồng độ polysaccharide được xác định bằng phương pháp anthrone, đo độ hấp thụ ở bước sóng 620 nm và sử dụng dung dịch glucose làm chất chuẩn. Kefiran được pha loãng để sử dụng cho các thử nghiệm tiếp theo Nuôi cấy các tế bào biểu bì ruột ở người Tế bào Caco – 2 được nuôi cấy trong môi trường Dulbecco's modified Eagle's minimum essential (DMEM) chứa glucose với nồng độ 25 mM, bổ sung thêm 15% huyết thanh bào thai bê bị bất hoạt bởi nhiệt, 1% các acid amin không thiết yếu, penicillin (12 UI/ml), streptomycin (12 μg/ml), gentamycin (50 μg/ml) và fungizone (1,25 μg/ml). Để duy trì, các tế bào được cấy chuyển hằng tuần, sử dụng 0,02% trypsin trong Ca2+ và PBS không có Mg2+. Các tế bào một lớp được chuẩn bị trong các đĩa nuôi cấy mô 24 giếng bằng cách cấy 7.104 tế bào/giếng. Thí nghiệm và giữ tế bào được ủ ở nhiệt độ 370C trong điều kiện 5% CO2 – 95% không khí. Môi trường nuôi cấy được thay đổi mỗi 2 ngày. Sự tách rời tế bào Sự tách rời tế bào Caco-2 được đo lường theo nghiên cứu của Minnaard và ctv (2001). Tóm lại, các tế bào được biệt hóa được ủ với các dịch lọc có nồng độ pha loãng khác nhau ở 370C trong 2 h có sự hiện diện của nồng độ kefiran từ 0 – 1000 mg/l. Sau khi ủ, tế bào được rửa với PBS, cố định trong 1 phút với formaldehyde 2% trong PBS và rửa lại. Tiến hành nhuộm bằng cách ủ trong 20 phút ở nhiệt độ phòng với 500 μl crystal violet. Sau khi rửa bằng PBS để loại bỏ thuốc nhuộm, mẫu được xử lý khoảng 1 h với cồn 50% trong PBS ở nhiệt độ phòng. Đo độ hấp thụ ở bước sóng 650 nm. Phần trăm tế bào gắn kết được tính toán theo công thức: 100 x (A/Ac), trong đó A là độ hấp thụ của tế bào được xử lý; Ac là độ hấp thụ của tế bào đối chứng không xử lý. Hoạt tính dehydrogenase ở ty thể Tế bào đơn Caco – 2 được ủ với độ pha loãng dịch huyền phù không có sự hiện diện của tế bào B. cereus và không có sự hiện diện kefiran (800 mg/l). Sau khi ủ ở 370C trong 1h, các tế bào được tách rời bằng cách cạo cơ học và ủ với 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5 diphenyl tetrazolium (MTT) trong 4h ở 370C. Thử nghiệm MTT dựa vào khả năng chuyển hóa của MTT thành formazan màu tím, không tan nhờ sự hoạt động của dehydrogenase ty thể. Mẫu được ly tâm ở 14000 v/p và vết màu được chiết với HCl 0,1N trong isopropanol. Sau khi ly tâm, độ hấp thu được đo ở bước sóng 550 nm trong đĩa đọc. Phần trăm hoạt tính duy trì được tính theo công thức: 100 x (A/Ac), trong đó A là độ hấp thụ của tế bào được xử lý; Ac là độ hấp thụ của tế bào đối chứng không xử lý. Đánh dấu với FITC annexin V và propidium iodine Phương pháp này đã được sử dụng bởi van Engeland (1999). Theo đó, sau 1h ủ với dịch nuôi cấy B. cereus và nồng độ kefiran khác nhau, tế bào được rửa 2 lần với buffer gắn. Sau đó, thêm 5 μl FITC – annexin V, 1 μg propidium iodine và 100 μg Rnase trong 100 μl buffer gắn. Tế bào được ủ ở nhiệt độ phòng trong 15 phút, rửa 3 lần với buffer gắn và được làm tiêu bản trong glycerol 50% trong buffer gắn. Chụp ảnh bằng kính hiển vi huỳnh quang Quét dưới kính hiển vi điện tử Tế bào Caco – 2 được nuôi cấy trên mặt kính phẳng. Sau khi cùng ủ trong 2h với dịch huyền phù không có tế bào B. cereus, có (800 mg/l) hoặc không có kefiran, mẫu được rửa 3 lần bằng PBS và cố định với glutaraldehyde 2,5%. Vết bẩn được khử nước trong các dung dịch ethanol được pha loãng. Cuối cùng, mẫu được làm khô tới hạn bằng cách sử dụng CO2, phủ lớp vàng và được xác định bằng kính hiển vi electron. Thử nghiệm phân giải hemoglobin Khả năng phân giải hồng cầu được quyết định theo Promdonkoy và Ellar (2003). Theo đó, tiến hành pha loãng dịch huyền phù không có tế bào B. cereus và bổ sung tế bào hồng cầu người trong PBS. Dịch này được ủ ở 370C và tiến hành đo độ hấp thu ở bước sóng 600 nm ở các thời điểm khác nhau. Ảnh hưởng của kefiran được thử nghiệm ở các nồng độ 0, 500, 800 và 1000 mg/l. Phần trăm hồng cầu không bị ly giải được tính theo công thức % = (A600 mẫu/A600 đối chứng)x100. Độ hấp thu được đo ở bước sóng 600 nm Kết quả Sử dụng dịch huyền phù được thử nghiệm trên tế bào Caco-2 dẫn đến đáp ứng theo liều được chỉ định. Hình 3.10A, hoạt tính sinh học bao gồm tổng sự tách rời tế bào khi nồng độ các yếu tố ngoại bào cao. Không có sự tách rời khi ủ với môi trường BHI hoặc BHI và kefiran. Từ đó nhận thấy rằng kefiran (800 mg/l) có khả năng bảo vệ tế bào hồng cầu khỏi hoạt tính tách rời của dịch huyền phù B. cereus. Hình 3.10B chứng tỏ rằng ảnh hưởng của các nồng độ kefiran khác nhau đến hoạt tính sinh học của các yếu tố ngoại bào B. cereus được pha loãng 1/32. Sự bảo vệ chống lại các hoạt tính sinh học của dịch chiết tương đương với nồng độ kefiran từ 300-1000 mg/l. Thật ra chỉ có 55% tế bào duy trì sự gắn kết khi không có kefiran trong khi giá trị này khoảng 80% khi thử nghiệm tất cả các nồng độ của kefiran. Hình 3.10: Ảnh hưởng của dịch huyền phù B. cereus đối với tế bào biểu bì ruột ở người (Caco – 2) Ảnh hưởng sinh học của các yếu tố ngoại bào B. cereus bao gồm sự suy yếu của hoạt tính dehydrogenase ty thể (hình 3.11). Kefiran cũng bảo vệ chống lại hoạt tính phá hủy tế bào. Thật ra, độ pha loãng dịch huyền phù nuôi cấy sử dụng B. cereus ở nồng độ 1/16 duy trì 50% hoạt tính dehydrogenase ty thể trong khi đến 70% hoạt tính được duy trì khi có sự hiện diện của kefiran. Hình 3.11: Ảnh hưởng của việc sử dụng dịch huyền phù B. cereus B10502 đến hoạt tính dehydrogenase ty thể trên tế bào Caco-2 khi có và không có sự hiên diện của kefiran Tế bào đơn bào Caco – 2 được ủ 1 h với dịch huyền phù B. cereus có tỷ lệ hoại tử cao (hình 3.12A). Trái lại, khi có sự hiện diện của kefiran trong khi ủ, ảnh hưởng hoại tử giảm đi đáng kể và chỉ có một vài tế bào tự hủy (hình 3.12B,C). Nghiên cứu sử dụng kính hiển vi điện tử để quan sát. Bề mặt tế bào hấp thu ở ruột bị thay đổi đáng kể khi ủ với dịch huyền phù B. cereus gồm có sự mất đi và ngắn bớt các lông nhỏ (hình 3.13A). Trái lại, với sự hiện diện của kefiran được duy trì giống như thực nghiệm đối chứng (hình 3.13B,C). Hình 3.12: Đánh giá số lượng tế bào hoại tử và tự chết bằng cách đánh dấu với Annexin V – FITC và propiduin Iodine Kết quả hoạt tính thủy phân hồng cầu của dịch huyền phù có liên quan đến tính độc tế bào. Quá trình thủy phân này thể hiện khi có sự hiện diện hay không có sự hiện diện của kefiran được thể hiện ở hình 3.14. Độ pha loãng dịch huyền phù nuôi cấy có B. cereus cao (1/192) có sự ly giải hồng cầu ở người. Hoạt tính ly giải hầu như biến mất khi bổ sung kefiran ở nồng độ 800 mg/l. Hình 3.13: Kết quả quét dưới kính vi điện tử của tế bào Caco – 2 khi ủ với dịch huyền phù B. cereus khi có (A), không có (B) kefiran, (C) đối chứng Hình 3.14: Kết quả ly giải tế bào hồng cầu ở người theo thời gian của dịch nuôi cấy B. cereus khi có và không có sự hiện diện cửa kefiranChương IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận Sữa kefir có giá trị dinh dưỡng cao và tốt cho sức khỏe. Ngoài việc cung cấp các vi sinh vật có lợi, kefir còn có tác dụng chống lão hóa và tăng cường khả năng tiêu hóa, giảm căng thẳng thần kinh, điều hoà huyết áp… Khác với sữa chua thông thường, kefir là sản phẩm vừa lên men lactic nhờ nhóm vi khuẩn lactic ưa ấm, vừa lên men rượu nhờ nấm men. Hệ vi sinh trong hạt kefir gồm : - Nhóm vi khuẩn lactic: Streptococcus lactic gây đông tụ sữa, Streptococcus diacetylatic tạo mùi hương cho sản phẩm, Lactobaccillus casein phân hủy casein của sữa thành acid amin, Lactobacillus helveticus tạo độ chua cho sữa… - Nhóm nấm men: Saccharomyces cerevisiae, Candida pseudotropicalis, Kluyveroyces…giúp thúc đẩy quá trình lên men. - Nhóm vi khuẩn Acetobacter: đặc trưng nhất là Acetobacter aceti có khả năng đồng hóa đạm hữu cơ và nguồn cacbon như ethanol, glucose, fructose, saccharose, maltose, glycerin, lactose… Trong thành phần của kefir có kefiran, là một thành phần có nhiều ứng dụng và một trong những ứng dụng của kefiran là khả năng trung hòa khả năng gây độc tế bào của B. cereus. 4.2. Kiến nghị Kefir là món quà cuộc sống đươc ban tặng cho con người. Từ xa xưa nó đã được sử dụng và lưu truyền đên bây giờ. Sản phẩm sẽ bổ sung một số lượng lớn vi sinh vật cho cơ thể, giúp cơ thể khỏe mạnh và sống lâu hơn. Vì vậy kefir nên được sử dụng rộng rãi và tìm hiểu kỹ hơn. Vì vậy để nâng cao giá trị dinh dưỡng, đa dạng hóa sản phẩm, cúng như được người tiêu dùng chấp nhận, sản phẩm cần được nghiên cứu thêm: - Nghiên cứu sự phát triển của kefir trên các môi trường khác: dịch quả nguyên chất, sữa đậu nành, sữa dừa,... - Khảo sát thời gian thời gian khuấy trộn, nồng độ oxy cung cấp cho quá trình lên men. - Khảo sát thời gian và nhiệt độ ủ lạnh sản phẩm sau lên men để sản phẩm có hương vị đặc trưng và hấp dẫn. - Nghiên cứu bổ sung chất bảo quản thích hợp cho sản phẩm để sử dụng được lâu mà vẫn đảm bảo chất lượng và không độc hại với con người PHỤ LỤC Bảng 4.1: Bảng điểm đánh giá cảm quan sản phẩm sữa Kefir Điểm Mô tả Mùi 5 Sản phẩm có mùi thơm đặc trưng của sữa chua, mùi thơm dịu của dâu Tây hòa hợp với mùi của rượu etylic, dễ chịu. 4 Sản phẩm có mùi thơm nhẹ của sữa chua, mùi thơm dịu của dâu Tây và thoảng mùi rượu etylic, nhưng ít đặc trưng hơn. 3 Mùi thơm của sữa chua và dâu Tây không thể hiện rõ, mùi rượu quá nhẹ hoặc quá nồng, kém hài hòa. 2 Sản phẩm có mùi kém, không có mùi tự nhiên của sữa chua, không có mùi dâu hoặc mùi dâu đã bị biến đổi, mùi acid acetic quá mạnh. 1 Sản phẩm có mùi lạ, không thể nhận biết được mùi của sữa và dâu. 0 Sản phẩm có mùi của quả thối, mùi của sữa hư hỏng, khó ngửi Vị 5 Sản phẩm hài hòa giữa vị ngọt và vị chua dịu của acid lactic, vị nồng nhẹ của cồn và CO2 khá hấp dẫn. 4 Sản phẩm có vị chua ngọt hài hòa nhưng độ cồn hơi cao hoặc hơi thấp, tương đối hấp dẫn. 3 Vị chua ngọt của sản phẩm kém hài hòa, hơi chua hoặc hơi ngọt, cồn quá nhiều hoặc quá ít, không hấp dẫn lắm. 2 Sản phẩm quá chua hoặc không chua, vị ngọt kém, không hòahợp, không phát hiện cồn hoặc cồn quá mạnh, hơi đắng. 1 Sản phẩm có vị lạ, nhạt nhẽo. 0 Vị rất khó chấp nhận, đắng chát, biểu hiện của hư hỏng. Hình thái 5 Sản phẩm đồng nhất, không phân lớp, độ nhớt vừa phải 4 Sản phẩm tương đối đồng nhất, ít lợn cợn 3 Sản phẩm có dấu hiệu tách nước, hoặc độ nhớt hơi cao. 2 Sản phẩm bị phân lớp (lớp nước bên trên, dịch sữa bên dưới đồng nhất) hoặc độ nhớt quá cao. 1 Sản phẩm bị phân 2 lớp rõ rệt, dịch sữa bên dưới không đồng nhất, (có lợn cợn lớn) 0 Sản phẩm bị phân làm nhiều lớp Bảng 4.2: Bảng điểm đánh giá cảm quan sản phẩm nước nho lên men Kefir Điểm Mô tả Độ trong và màu sắc 5 Chất lỏng trong suốt, không vẫn đục và không có vật thể lạ nhỏ. Có màu sắc đặc trưng của nho ( như màu: xanh, đỏ, tím, đen…). 4 Chất lỏng trong suốt, ít có vật thể lạ nhỏ (xác nho còn sót lại). Vẫn còn màu đặc trưng của sản phẩm. 3 Chất lỏng tương đối trong, có xác cặn nhiều hơn, màu hơi khác một ít so với màu đặc trưng của sản phẩm. 2 Chất lỏng hơi đục, có khá nhiều xác cặn nhìn thấy rõ. Mùi khác nhiều so với mùi đặc trưng. 1 Chất lỏng đục, nhiều lắng cặn, có nhiều xác quả to hơn, màu không đặc trưng (chuyển từ màu tươi sang màu ngả thâm đen). 0 Vẫn đục, màu tối xác cặn nổi nhiều trên mặt chất lỏng, sản phẩm bị hư hỏng Mùi 5 Sản phẩm có mùi thơn nồng của rượu vang nhẹ, dễ chịu hoàn toàn đặc trưng cho sản phẩm. 4 Chưa hoàn toàn hòa hợp (mùi rượu etylic cay nồng hơn hoặc ít hơn nên khó nhận rõ). 3 Mùi cay hơi gắt, thoảng mùi phụ khác, ít đặc trưng cho sản phẩm. 2 Mùi rượu quá nồng gắt, thoảng mùi lạ, rất ít đặc trưng cho sản phẩm. 1 Nồng hăng hoặc nồng cay quá gắt, khó ngửi không đặc trưng cho sản phẩm. 0 Có mùi lạ của sản phẩm bị hư hỏng, không ngửi được. Vị 5 Hòa hợp, êm dịu của vị chua của nho lẫn vị cay nồng của rượu etylic, để lại dư vị tốt. Ngoài ra, CO2 tạo cảm giác rất mát, đã khát và khoan khoái sau khi uống. 4 Chưa hòa hợp giữa các vị, dư vị vừa phải, ít đặc trưng. Cảm giác đã khát chưa có do lượng CO2 còn ít. 3 Chưa hòa hợp, hơi gắt và sốc, dư vị yếu, ít đặc trưng. 2 Vị cay quá gắt, xen lẫn vị đắng, thoảng vị lạ, rất ít đặc trưng cho sản phẩm. 1 Sốc, có vị lạ khó chịu của sản phẩm bị hư hỏng Bảng 4.3: Một số vi khuẩn lên men lactic (môi trường nước đường) Streptococcus lactic Trực khuẩn rất ngắn, gây lên men chua sữa tự nhiên, yếm khí tùy tiện. Lên men tốt glucose, maltose, lactose, tạo trong môi trường đường 0,8÷1% acid lactic. Nguồn nitơ cho vi khuẩn nay là peptone. Nhiệt độ tối thiểu cho chúng phát triển là 100C, tối ưu là 350C và cao nhất là 450C. Streptococcus cremoris Thường tạo thành một chuỗi dài. Tế bào có kích thước là 0,6÷0,7µ. Lên men glucose và galactose. Phát triển nhiệt độ thấp hơn Streptococcus lactic: tối ưu là 25÷300C, tối đa là 35÷380C. Lactobacterium Vulgaricum Đây là trực khuẩn rất dài, có khả năng lên men glucose và lactose. Nhiệt độ phát triển tối đa là 40÷450C, tối ưu là 200C, có khả năng tạo acid cao (có khả năng tạo 3,7% acid lactic). Bảng 4.4: Một số nấm men (môi trường nước đường) Saccharomyces cerevisae Tế bào hình cầu, hình ôvan hay elip. Khi già chúng thường kết thành vòng và có thể tạo thành màng nổi lên trên dịch men. Lên men đường tốt, tạo thành 18% cồn etylic. Hansenula Giống này tạo thành màng trên các dịch chứa đường. Trên bề mặt nước nho chúng phát triển khá nhanh tạo màng sau 2÷3 ngày và lắng cặn, đồng thời lên men rượu, tích tụ được 2÷3% cồn. Trong dịch Hansenula phát triển và lên men nhẹ, nhưng đồng thời acid hóa đường và rượu (khi môi trường có nồng độ rượu dưới 13%) và đủ oxy. Nó còn oxy hóa đường rượu, acid hữu cơ làm cho pH môi trường chuyển từ acid thành kiềm. Trong quá trình phát triển, Hansenula có thể chuyển hóa đường thành rượu etylic, butyric, amylic, thành các acid acetic, succinic, butyric, các ester bay hơi (đặc biệt là etyl acetate) làm cho dịch lên men có mùi thơm riêng biệt. Kloeckera apiculata Giống men này khi trưởng thành có các hình dáng ovan, elip và dài.Kích thước tế bào không lớn: 3÷4,5*5÷11µm. Loài nấm men này thường có trên quả có đường (trong đó có nho). Nó có đặc điểm sinh sản rất nhanh so với các loài khác (so với men rượu vang nhanh gấp 2 lần) và ở 350C ngừng sinh sản, ở 450C chúng bị chết. Điều này giải thích được ở giai đoạn đầu lên men, nó đóng vai trò chủ yếu.