Khóa luận Tổng quan về Staphylococcus aureus và đề xuất biện pháp phòng ngừa lây nhiễm trên thực phẩm

úp vi khuẩn lan tràn vào mô. Các nghiên cứu cho thấy các protein từ Staphylococcus aureus UAMS-1thể hiện dạng đột biến do 2 protein sarA và sarA agar gây ra, và sự tham gia của protein sarA là điều quan trọng của độc tính trong quá trình hoạt động của hyaluronidase. Vai trò chính của S.aureus hyaluronidase vẫn chưa được tìm hiểu rõ ràng, chỉ biết sự tham gia của sarA là 1 yếu tố quan trọng đối với 1 số độc tính được thể hiện bởi S.aureus hyaluronidase. Các coagulase có thể cô lập được hyaluronidase trong 1 số trường hợp, các phản ứng DNAse là 1 trong những yếu tố giúp cho hyaluronidase hoạt động. d. Coagulase Coagulase là một protein ngoại bào liên kết với prothrombin trong vật chủ để hình thành 1 phức hệ gọi là staphylothrombin. Prothrombin bị biến đổi thành enzyme thrombin nhờ enzyme prothrombinase. Các protease hoạt đông đặc trưng của thrombin đã có các quá trình hoạt hóa trong phức hệ dẫn đến việc chuyển đổi fibrin (dạng không hòa tan) thành fibrinogen (dạng hòa tan). Còn theo các nghiên cứu của Soulier, Tager và Zajden thì coagulase và prothrombin không có hoạt tính enzyme, sự tham gia của chúng tạo nên các phức hợp bền với các hoạt động ly giải đặc hiệu gọi là Staphylothrombin, staphylocoagulase không có hoạt tính ly giải, chúng phản ứng một cách chuyên biệt với các prothrombin và hoạt hóa các hợp chất này để đưa đến sự kết hợp các fibrinogen thành khối fibrin. Sơ đồ hoạt động như sau: Staphylocoagulase Staphylothrombin Prothrombin Fibrinogen Fibrin Coagulase là dấu hiệu để nhận biết S.aureus trong phòng thí nghiệm. Tuy nhiên chưa có bằng chứng nào cho thấy coagulase là một yếu tố gây độc. Một số ý kiến cho rằng các vi khuẩn đã tự bảo vệ mình khỏi thực bào và miễn dịch bằng cách gây đông máu Có một vài nhầm lẫn cho rằng coagulase chính là yếu tố đông kết (clumping). nhưng một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng khi thiếu coagulase thì vẫn duy trì sự hoạt động của yếu tố đông kết, trong khi yếu tố đông kết vẫn thể hiện coagulase 1 cách bình thường. e. Staphylokinase Staphylokinase (Sak) là 1 protein tạo ra bởi 136 amino acid và được sản xuất bởi các chủng S.aureus Sak kích hoạt plasminogen, tiền thân của protease plasmin phân giải fibrin. Về mặt cấu trúc, Sak có cấu trúc tương đồng với các chất kích hoạt plasminogen khác, chứa một vị trí gắn plasminogen và 1 vùng serine protease. Tuy nhiên, Sak không phải là 1 enzyme. Nó tạo thành 1 phức hợp với plasminogen có thể chuyển đổi các phân tử plasminogen khác thành plasmin, 1 enzyme mạnh phân hủy protein ngoại bào. Ái lực cao của phức hợp Sak – plasminogen với fibrin hình thành nên một tác nhân gây tan huyết. Sak có thể tạo điều kiện cho S.aureus để plasminogen gắn với thụ thể trên bề mặt tế bào vi khuẩn và qua đó đẩy mạnh quá trình xâm nhập vào các mô chủ Đây là một enzyme đặc trưng cho các chủng gây bệnh ở người, giúp tụ cầu phát triển trong các cục máu và gây vỡ các cục máu này, tạo nên tắt mạch. f. b-lactamase Sự kháng lại kháng sinh của tụ cầu vàng là một đặc điểm rất đáng lưu ý. Đa số tụ cầu vàng kháng lại penicillin G do vi khuẩn này sản xuất được men penicillinase nhờ gen trên R-plasmid Sự đề kháng penicillin của tụ cầu vàng là do đa số tụ cầu vàng sản xuất được enzym b-lactamase Một số còn kháng lại được methicillin gọi là methicillin resistance S. aureus (viết tắt là MRSA), do đó tạo ra được các protein gắn vào vi trí tác động của kháng sinh Hiện nay, một số rất ít tụ cầu còn đề kháng được với cephalosporin, các thế hệ. kháng sinh được dùng trong các trường hợp này là vancomycin. g. Một số enzyme khác S.aureus còn có thể có sự hiện diện của protease, lipase, deoxyribonuclease và các acid béo. Đây là những yếu tố để cung cấp các chất dinh dưỡng cho các vi khuẩn và có thể nó còn gắn vai trò trong quá trình gây bệnh. Các enzyme này giúp kéo dài sự sống của các vi khuẩn. 2.2.6.3, Các yếu tố chống lại sự tự vệ của tế bào chủ a. Capsular polysacharide Phần lớn các chủng lâm sàng của Staphylococcus aureus đều hiện diện một polysacharide bề mặt của một trong hai serotype (kiểu huyết thanh) 5 hoặc 8. Nó được gọi là microcapsule bởi vì nó chỉ có thể xác định được bằng kính hiển vi điện tử không giống như một số các vi khuẩn khác được nhìn thấy dễ dàng bằng kính hiển vi ánh sáng Capsular polysaccharide (CP) chống lại các cơ chế phòng vệ của cơ thể cũng như đề kháng kháng sinh. Các CP bảo vệ vi khuẩn chống lại sự thực bào bằng cách không cho các kháng thể tạo hiện tượng opsonin hóa trên vách vi khuẩn Do không có hiện tượng opsonin hóa nên các đại thực bào và bạch cầu trung tính tiếp cận kém hoặc không thể tiếp cận được vi khuẩn Các thực bào không tiêu diệt được vi khuẩn thì càng cố gắng tiết nhiều cytokine hơn nữa nhằm làm sạch vi khuẩn xâm nhập, nhưng chính điều này lại thu hút các bạch cầu đa nhân và đại thực bào khác đến ổ viêm. Phần lớn các CP chống lại được thực bào là do ngăn cản các tế bào thực bào bám, ức chế sinh C3 convertase và C3b của bổ thể, hoặc che phủ C3b làm cho thực bào không nhận ra. Các chủng S.aureus phân lập từ bệnh nhiễm trùng thể hiện một mức độ cao polysaccharide nhưng nhanh chóng bị mất khả năng khi nuôi cấy trong phòng thí nghiệm. Chức năng của các capsular polysacharide không phải hoàn toàn là độc tính. b. Protein A Protein A là một protein bề mặt của S.aureus mà IgG gắn kết các phân tử theo vùng Fc. Các mảnh Fc này là của globulin miễn dịch. Chính nhờ hiện tượng gắn kết này mà số lượng mảnh Fc giảm xuống. mảnh Fc của globulin miễn dịch có vai trò quan trọng trong hiện tượng opsonin hóa .Trong huyết thanh vi khuẩn làm cho IgG phá vỡ opsonization và phagocytosis Các mảnh Fc chính là các receptor cho các đại thực bào, quá trình gắn kết trên giúp cho tụ cầu vàng tránh không bị thực bào bởi các đại thực bào Đột biến của S.aureus thiếu protein A có hiệu quả hơn phagocytosed trong ống nghiệm, các đột biến trong các trường hợp bị lây nhiễm thí nghiệm có hiện tượng giảm độc tính. c. Exofoliative exotoxins Đây là một ngoại độc tố, gây nên hội chứng phỏng rộp và chốc lở da (scaded skin syndrome) ở trẻ em, gồm 2 loại là ETA và ETB. F Cơ chế gây bệnh: ET gây ra sự phân ly bên trong lớp biểu bì giữa các lớp tế bào sống và chết làm da phồng phồng lên, làm mất dần đi những lớp biểu bì da mất nước và cứ thế tiếp tục nhiễm trùng Những độc tố này có khả năng esterase và proterase và nó tấn công những protein có chức năng duy trì sự nguyên vẹn của các tế bào biểu bì Bệnh thường bắt đầu với sự nhiễm trùng da tại những vị trí xác định nhưng sau đó vi khuẩn bắt đầu sản sinh độc tố ảnh hưởng đến da trên toàn bộ cơ thể Trẻ phát sốt, phát ban và phồng da. Phát ban bắt đầu từ miệng lan rộng đến bụng, tay, chân. Khi vết phồng bị bể ra thì phát ban kết thúc. Lớp da ngoài cũng bị choc ra và bề mặt trở nên đỏ. Đau giống như một vết bỏng. 2.2.6.4. Các siêu kháng nguyên a. Toxic shock syndrome toxin-1 (TSST-1 ) Độc tố shock nhiễm độc thường gặp ở những người phụ nữ có kinh dùng bông băng dày bẩn hoặc những người bị nhiễm trùng vết thương, hay còn gọi là nhiễm trùng huyết. Độc tố này khó phân biệt với enterotoxin F của tụ cầu vàng Trong một số trường hợp nhiễm khuẩn gram âm, các nội độc tố bản chất là polysaccharide kích thích hoạt hóa đại thực bào giải phóng TNF (Tumor necrosis factor, yếu tố hoại tử u) và các interleukin 1, 2. Các cytokine này tham gia vào cơ chế sốc do nhiễm khuẩn huyết, cách thức gây độc y như nội độc tố LPS cơ chế như sau: - Cấu trúc của LPS gồm 3 phần: phần lõi, chuỗi bên đặc hiêu O mang tính kháng nguyên đặc hiệu và lipid A chịu trách nhiệm về độc tính. - Phân tử LPS nằm trong màng ngoài và phần lipid A của phân tử có tác dụng gắn LPS vào vách vi khuẩn. - LPS được giải phóng từ màng ngoài của vách vi khuẩn gram âm, vào máu gắn với protein (LPS binding protein) tạo thành phức hợp. LPS bám vào thụ thể (phân tử CD14) hoặc trực tiếp với TLR-4 (toll like receptors-4) trên monocyt và đại thực bào. - Chúng kích thích tế bào tiết ra TNF-a (tumor necrosis factor alpha), IL-1 (interleukin-1), IL-6, IL-8 và PAF (platelet activating factor) dẫn đến sốt, giãn mạch và tăng tính thấm huyết tương gây giảm huyết áp, giảm máu đến cơ quan, giảm chức năng gan, thận và hô hấp. Trong các trường hợp nhiễm độc thức ăn do S.aureus và hội chứng sốc do nhiễm độc lượng cytokine cao cũng gây ra những triệu chứng nhất định. Trong hội chứng sốc nhiễm độc cũng xuất hiện các triệu chứng như của nhiễm độc do độc tố ruột như: - Các độc tố ruột hoạt động như những chất kích thích phân bào hoạt hóa tất cả các tế bào T biểu hiện 1 họ gene Vb (thụ thể của tế bào T). - Các cytokine do các tế bào T giải phóng ra khi được hoạt hóa bởi các siêu kháng nguyên SE sẽ gây nên nhiều triệu chứng sốt, ỉa chảy, sốc trong nhiễm độc thức ăn do S.aureus. Trong trường hợp này ngoại độc tố của tụ cầu được gọi là độc tố 1 gây hội chứng sốc, hoạt động như 1 siêu kháng nguyên kích thích các tế bào T hoạt hóa đại thực bào tiết ra nhiều TNF. Các vi khuẩn sống bên trong tế bào thực bào có khả năng hoạt hóa tế bào T dẫn tới phá hủy các mô. Các cytokine do các tế bào T hoạt hóa tiết ra sẽ tập trung các đại thực bào và hoạt hóa chúng để hình thành các khối u. Các enzyme lysosom được giải phóng từ các khối u này sẽ gây ra hoại tử đáng kể các mô. b. Enterotoxin F Cấu trúc: Là những chuỗi protein đơn tương đối chịu nhiệt, mỗi chuỗi có vị trí kháng nguyên riêng biệt. Không bị hủy bởi sự đun nấu, trọng lượng phân tử từ 28000-30000 dalton, bao gồm 6 type ký hiệu từ A-F. Đặc điểm chính là có vòng cystein ở giữa giúp ổn định cấu trúc phân tử và kháng sự phân giải protein. Có các chuỗi amino acid, trong đó nhiều nhất là aspartic, glutamic, lysin, tyrosine. F Phân loại: Số loại SE khác nhau ở nhiều tài liệu khác nhau tùy thuộc vào năm phát hiện và vai trò của các SE trong các vụ ngộ độc thực phẩm do tụ cầu. Do số lượng SE khá lớn nên rất cần thiết phải phân loại và sắp xếp chúng. Năm 1962, người ta đưa ra hệ thống sắp xếp các độc tố theo bảng chữ cái. Đầu tiên 5 loại SE được tìm thấy và phân loại dựa vào tính chất kháng nguyên của chúng, đó là độc tố A (SEA), độc tố B (SEB), độc tố C (SEC), độc tố D (SED) và độc tố E (SEE). Trong đó SEC được chia thành SEC1, SEC2, SEC3. Sau đó, các SE mới cùng với các gen tương ứng được tìm thấy và đánh dấu từ SEG đến SER và SEU. Không có độc tố SEF, vì F là ký tự để chỉ TSST-1. Tuy nhiên sự liên quan giữa các SE mới này đến các vụ ngộ độc thì chưa rõ, hiện nay hầu hết các bộ test thương mại chỉ thích hợp để xác định các độc tố từ SEA đến SEE là các độc tố thường gặp nhất trong các vụ ngộ độc, khoảng 5% các vụ ngộ độc do các độc tố enterotoxin mà ta chưa biết gây ra. Trong các loại độc tố trên thì SEA thường gặp nhất trong các vụ ngộ độc do tụ cầu. Các dòng S.aureus tạo độc tố SEA có tần số cao nhất trong các mẫu thực phẩm (61.5%) và trên những người khỏe mạnh (53,6%). SEA là nguyên nhân của 75% các vụ ngộ độc do tụ cầu, tiếp đến là SED, SEC và SEB, các vụ dịch do SEE thường rất ít gặp. F Tính chất: SE là những protein đơn giản, hút ẩm, dễ tan trong nước và nước muối, là những protein cơ bản, độ đẳng điện pI là 7-8,6, trừ SEG và SEH có độ đẳng điện pI tuần tự là 5,6 và 5,7. Độ ẩm cao nhất là 277 nm, cao hơn so với những protein thông thường. Dù có 1 mức độ tương đồng giữa các SE, nhưng vẫn có sự khác nhau giữa các trình tự amino acid làm cho các độc tố có các vị trí kháng nguyên khác nhau. SE giàu lysine, acid aspartic, acid glutamid và tyrosine. Hầu hết có vòng cystein tạo cấu trúc thích hợp có thể liên quan đến hoạt tính gây nôn. Chúng có tính ổn định cao, kháng với hầu hết các enzyme phân hủy protein và vì thế chúng giữ được hoạt tính trong ống tiêu hóa sau khi được ăn vào bụng. Chúng còn kháng với chymotrypsine, rennin và papain. Đặc biệt, tính bền nhiệt là một trong những tính chất quan trọng nhất của các SE trong lĩnh vực an toàn thực phẩm. Chúng không bị phân hủy ở 1000C trong 30 phút, thậm chí ở 1210C trong 28 phút thì những SE vẫn giữ được hoạt tính sinh học (khi thí nghiệm trên mèo). Tính kháng nhiệt của SE trong thực phẩm cao hơn so với môi trường nuôi cấy. F Cơ chế độc lực: Hoạt tính siêu kháng nguyên tác động trực tiếp của SE với thụ thể kháng nguyên tế bào T và phức hợp của tế bào hòa màng của tế bào nhận diện kháng nguyên Sự nhận diện kháng nguyên là bước đầu tiên trong đáp ứng miễn dịch tế bào và đó cũng là vấn đề then chốt quyết định mức độ chuyên biệt của đáp ứng miễn dịch. Một kháng nguyên thông thường nhận diện được thụ thể tế bào T bằng cách hình thành những peptide gắn kết với phức hợp hòa màng MHC ở lớp I hoặc II. Chỉ 1 vài tế bào T có thể nhận biết được một kháng nguyên chuyên biệt trên phức hợp hòa màng của tế bào nhận diện kháng nguyên Trong khi đó, các độc tố siêu kháng nguyên tác động trực tiếp lên nhiều tế bào T bằng cách nhận diện các chuỗi Vb chuyên biệt của thụ thể kháng nguyên tế bào T. Các độc tố này có thể lien kết chéo với thụ thể kháng nguyên tế bào T và phức hợp tương đồng lớp 2 của tế bào nhận diện kháng nguyên Chính sự liên kết chéo này dẫn đến việc hoạt hóa không chuyên biệt làm tăng nhanh lượng tế bào T và lượng interleukin khổng lồ là những yếu tố có tể liên quan đến cơ chế gây độc của SE. Do đó, SE có thể hoạt hóa 10% tế bào T của chuột, trong khi những kháng nguyên thông thường kích hoạt ít hơn 1% tế bào T. Hình 2.11: Hoạt tính siêu kháng nguyên SE Theo hình 2.11 thì các siêu kháng nguyên kích thích tế bào T. Siêu kháng nguyên ràng buộc trực tiếp lớp II của tế bào nhận diện (MHC II) và các rãnh bên ngoài kháng nguyên, sinh ra 1 lượng lớn cytokines gây ra các triệu chứng sốc độc hại. Ngoài ra SE còn có hoạt tính gây nôn khi đi vào cơ thể. SE tác động trực tiếp lên biểu mô ruột và kích thích trung khu gây nôn dẫn đến những triệu chứng của ngộ độc thực phẩm. Đặc điểm chung nhất của các SE là vòng cystine, đây là yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến hoạt tính gây nôn. 2.2.7. Tình hình nhiễm Staphylococcus aueus trên thế giới và tại Việt Nam hiện nay 2.2.7.1. Tình hình nhiễm S.aureus trên thế giới Trên thế giới các vụ ngộ độc thực phẩm do vi sinh vật chiếm khoảng 70% tổng số ca ngộ độc thực phẩm. Tại các nước châu Á S.aureus là nguyên nhân hàng đầu gây ra các vụ ngộ độc. Ở châu Mỹ điển hình là Hoa Kỳ những vụ ngộ độc thực phẩm chủ yếu đều do S.aureus gây ra, theo thống kê cho thấy từ 1972-1976 ngộ độc S.aureus chiếm 21,4% trong tổng số các vụ ngộ độc. Từ năm 1983-1987 con số này thấp hơn với chỉ 5,2%. Theo một thống kê mới nhất thì đến tháng 9 năm 2009 Hoa Kỳ có 32 vụ ngộ độc thực phẩm liên quan đến S.aureus chiếm 10,3% trong tổng số các vụ ngộ độc. Những phân tích gần đây cho thấy tại Hoa Kỳ hàng năm có khoảng 48000 người tử vong vì MRSA (Methicillin resistant Staphylococcus aureus). Ước tính có khoảng 19000 người Mỹ tử vong vì MRSA trong năm 2005. Ở châu Á các vụ nhiễm S.aureus chủ yếu ở các nước Nhật Bản, Trung Quốc và trong khu vực Đông Nam Á. Ở Trung Quốc trong năm 2008 đã xảy ra 1 vụ ngộ độc S.aureus ở trẻ em vì uống sữa bị nhiễm S.aureus. Còn ở Nhật cũng đã có 2 vụ ngộ độc S.aureus lớn vào tháng 8 năm 1955 làm ngộ độc hơn 1936 em học sinh tại 5 trường tiểu học ở Tokyo và tháng 6 năm 2006 làm 14780 người bị ngộ độc ở vùng Kansai. Nguyên nhân của 2 vụ ngộ độc này đều do họ đã uống sữa có nhiễm S.aureus của tập đoàn Snow. Trong khu vực Đông Nam Á 2 quốc gia có tỷ lệ ngộ độc S.aureus cao là Indonesia và Philippines. Việt Nam cũng là một trong những nước có tỷ lệ nhiễm S.aureus cao ở trong khu vực châu Á. Còn ở châu Âu thường nhiễm S.aureus từ các bệnh viện, tỷ lệ nhiễm S.aureus chiếm 7% trong các vụ nhiễm khuẩn huyết tại bệnh viện. Ở các vụ nhiễm khuẩn huyết ở Anh thì nhiễm khuẩn do MRSA chiếm đến 96%. 2.2.7.2. Tình hình nhiễm S.aureus tại Việt Nam Tại Việt Nam tình hình nhiễm S.aureus là rất đáng báo động. Năm 1974 tỷ lệ nhiễm S.aureus là 2% trong tổng số các vụ ngộ độc thực phẩm thì đến năm 1995 con số này đã tăng lên 22%, năm 2004 lên đến 63%. Theo báo cáo của bộ y tế năm 2006 xảy ra 35 vụ ngộ độc thức ăn trong cả nước. trong 25 vụ ngộ độc tập thể thì có 11 vụ xảy ra trong các trường học, trong đó có đến 9 vụ là do nhiễm S.aureus. Đặc biệt cũng trong năm 2006 đã xảy ra 1 vụ nhiễm S.aureus ở trẻ em, điều tra cho thấy 2/6 trẻ bị sốc vacxin có nhiễm S.aureus, khi xét nghiệm 5 người trong đội tiêm chủng thì có 3 người bị nhiễm S.aureus. Trong năm 2007 nước ta có 2 vụ ngộ độc thực phẩm tập thể do nhiễm S.aureus. Vào tháng 9 năm 2007 ở tỉnh Phú Thọ xảy ra 1 vụ ngộ độc tập thể, gần 100 học sinh tại trường mầm non Vĩnh Lại bị ngộ độc thực phẩm do nhiễm S.aureus. Vào tháng 12 năm 2007 tại thành phố Hồ Chí Minh xảy ra 2 vụ ngộ độc thực phẩm tập thể, đáng chú ý là cả 2 vụ ngộ độc này đều xảy ra trong trường học do nhiễm S.aureus. Trong đó, có 31 em tại trường tiểu học Âu Cơ và 44 em tại trường mầm non Vườn Hồng. Trong năm 2009 cả nước có 116 vụ ngộ độc thực phẩm trong đó có 6 vụ do nhiễm S.aureus. Đáng chú ý vào tháng 7 năm 2009 tại tỉnh Hải Dương đã xảy ra 1 vụ ngộ độc tập thể do nhiễm S.aureus, số người bị ngộ độc trong vụ này lên tới 258 người. Từ đầu năm 2010 đến nay cả nước có 67 vụ ngộ độc thực phẩm, trong đó có 5 vụ là do S.aureus gây nên. Chương III: Các phương pháp phát hiện và đề xuất biện pháp phòng ngừa lây nhiễm trên thực phẩm 3.1. Tổng quan Staphylococcus aureus là vi khuẩn hiếu khí hay kị khí tùy ý, hình cầu, gram dương, có thử nghiệm coagulase, phản ứng DNAse, phosphatease (+), có khả năng lên men và sinh acid từ mannitol, trehalose, sucrose. Một số dòng có khả năng làm tan máu trên môi trường thạch máu, đường kính vòng tan máu phụ thuộc vào từng chủng nhưng đều nhỏ hơn đường kính của khuẩn lạc. Sự hiện diện với mật độ cao của S.aureus trong thực phẩm chỉ thị điều kiện vệ sinh và kiểm soát nhiệt độ kém của quá trình chế biến. S.aureus được xác định trên cơ sở các đặc điểm tăng trưởng và phản ứng đông huyết tương của các dòng thuần từ các khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường phân lập. 3.2. Các phương pháp truyền thống 3.2.1. Môi trường và hóa chất sử dụng - Môi trường MSB: môi trường này dùng để phân tích định tính S.aureus, hoặc định lương bằng phương pháp MPN. - Môi trường thạch BP: bổ sung egg yolk vào môi trường sau khi đã hấp khử trùng và làm nguội đến khoảng 50-600 C. - Môi trường thạch TSA - Môi trường thạch nghiêng BHI - Huyết tương thỏ: được cố định bằng 0,1% EDTA hay sodium oxalate và được phân phối 0,3ml vào các ống nghiệm nhỏ. 3.2.2. Phân tích định tính Staphylococcus aureus 3.2.2.1. Phương pháp - Cấy 2ml dung dịch mẫu vào ống nghiệm chứa 8ml môi trường MSB. Trộn đều và ủ ở 370 C trong 24h. - Dùng que cấy vòng cấy ria dịch mẫu từ ống (+) (môi trường từ màu đỏ sang màu vàng) lên môi trường phân lập là thạch TGA hay BP, tiếp tục ử ở 370 C trong 24h. - Tìm khuẩn lạc đặc trưng của S.aureus trên môi trường phân lập có màu đen nhánh, sáng, tròn, lồi, đường kính 1-1,5mm có vòng sáng chung quanh khuẩn lạc. chọn khuẩn lạc đặc trứng cấy vào môi trường BHI, tiếp tục ủ ở 370C trong 24h. - Cấy vào các ống nghiệm nhỏ chứa khoảng 0,3ml huyết tương và ủ ở 370C trong 24 giờ để thử phản ứng đông kết, làm 1 ống đối chứng không được cấy dịch vi sinh vật. 3.2.2.2. Kết quả - Mẫu có S.aureus khi thử nghiệm coagulase (+).Mẫu có sự xuất hiện khối đông trong khi ống đối chứng không có. 3.2.3. Định lượng Staphylococcus aureus bằng phương pháp đếm khuẩn lạc 3.2.3.1. Đồng nhất mẫu - Cân 10g mẫu cho vào túi PE vô trùng, thêm 90ml dung dịch pha loãng, đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu khoảng 30 giây. - Chuẩn bị dãy pha loãng mẫu thích hợp tùy theo mức nhiễm của từng loại mẫu, sau khi cấy bằng một thể tích xác định trên môi trường BP sẽ xuất hiện 20-200 khuẩn lạc/đĩa. 3.2.3.2. Phân lập trên môi trường chọn lọc - Cấy 0,1ml mẫu đã pha loãng vào môi trường BP. Dùng que cấy tam giác trải đều mẫu trên bề mặt môi trường cho đến khi khô (khoảng 10 phút). Giữ nguyên đĩa trong khoảng 1 giờ sau đó lật úp lại. Mỗi độ pha loãng làm 3 đĩa môi trường thạch BP. Đem ủ ở 350C- 370 C trong 45- 48 giờ. Chọn đĩa chứa 20-200 khuẩn lạc, hoặc các đĩa có độ pha loãng thấp hơn nhưng có sự xuất hiện điển hình các khuẩn lạc đặc trưng của S. aureus. Khuẩn lạc đặc trưng của S.aureus có hình dạng tròn, lồi, ẩm ướt, đường kính khoảng từ 2-3mm, có vầng sáng đục bao quanh. - Đối với môi trường thạch máu làm tương tự như các bước trên môi trường thạch BP. Nhưng chỉ ủ ở 370 C trong 24 giờ. - Sau 24 giờ khuẩn lạc trên môi trường thạch BP có đường kính khoảng 0,5-1mm, lồi, đen bóng có vòng sáng rộng khoảng 1-2mm bao quanh. Sau 48 giờ thì khuẩn lạc S.aureus có đường kính khoảng 1-1,5mm, màu đen bóng, lồi, có vòng trắng đục hẹp và vòng sáng rộng khoảng 2-4mm quanh khuẩn lạc. - Khuẩn lạc của một số chủng S.aureus có thể không tạo vòng sáng quanh khuẩn lạc như trên. Cần đếm và đánh dấu cả hai dạng khuẩn lạc. - Trên môi trường thạch máu sau 24 giờ ủ thì S.aureus cho khuẩn lạc bóng loáng, đục, lồi có màu xám hay vàng nhạt, đường kính khoảng 1-2mm. Hầu hết S.aureus có vùng tan máu, tuy nhiên một số dòng không tạo vùng tan máu này. - Các chủng phân lập từ thực phẩm đông lạnh hoặc khô đã được lưu trữ trong thời gian dài thì phát xuất hiện các khuẩn lạc đặc trưng ít hơn. Hình 3.1: Khuẩn lạc đặc trưng của S.aureus trên môi trường BP 3.2.3.3. Khẳng định - Dùng que cấy vòng cấy 5 khuẩn lạc đặc trưng và không đặc trưng từ môi trường thạch BP sang môi trường thạch TSA, đem ủ ở 37 0C trong 24 giờ. - Cấy sinh khối vi khuẩn từ môi trường TSA vào các mẫu ống nghiệm chứa huyết tương thỏ và ủ ở 370C. theo dõi kết quả phản ứng đông huyết tương sau các khoảng thời gian 2, 4, 6, 8 và 24 giờ. - Tỷ lệ khẳng định dựa trên số khuẩn lạc đặc trưng hoặc không đặc trưng. Thực hiện tương tự với các khuẩn lạ đặc trưng trên môi trường thạch máu. - Kết quả thử nghiệm là (+) khi khối đông huyết tương hình thành, kết quả là (-) khi không có hình thành khối đông, hỗn dịch vẫn đồng nhất như ống không cấy. - Ngoài ra ta có thể lấy sinh khối vi khuẩn cho vào những ống nghiệm nhỏ chứa 0,2 - 0,3ml môi trường BHI. Để nghiêng môi trường thạch BHI và đem đi ủ ở 18-240C trong 35 giờ. - Thêm 0,5ml huyết tương cho vào môi trường thạch nghiêng BHI, trộn kỹ và đem ủ ở 350C, kiểm tra định kì qua 6 giai đoạn hình thành khối đông huyết tương. Kết quả dương tính khi khối đông vẫn nằm trên mặt thạch nghiêng ngay cả khi đảo ngược ống nghiệm. Hinh 3.2: Kết quả thử nghiệm coagulase 3.2.3.4. Kết quả Mật độ S.aureus trong mẫu được tính như sau: Mật độ (CFU/g hay CFU/ml) = Trong đó: F: độ pha loãng Nt: tổng số khuẩn lạc đặc trưng Na: tổng số khuẩn lạc không đặc trưng Ht: tỉ số giữa số khuẩn lạc đặc trưng cho thử nghiệm khẳng định (+) so với số khuẩn lạc đặc trưng Ha: tỉ số giữa khuẩn lạc không đặc trưng cho thử nghiệm khẳng định (+) so với số khuẩn lạc không đặc trưng. 3.2.4. Định lượng S.aureus bằng phương pháp MPN Phương pháp này được dùng để định lượng S.aureus trong mẫu có mật độ S.aureus thấp nhưng mật độ vi sinh vật cạnh tranh cao, khó có thể xác định bằng phương pháp đếm khuẩn lạc. 3.2.4.1. Phương pháp - Dung dịch mẫu được pha loãng với 3 độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3. Tùy theo yêu cầu về độ chính xác của kết quả phân tích mà có thể sử dụng phương pháp MPN với 9 hay 15 ống nghiệm ( 3 độ pha loãng lặp lai 3 hoặc 5 lần ). - Môi trường được sử dụng là canh MSB. Cấy 1ml dịch mẫu có độ pha loãng khác nhau vào ống nghiệm chứ 10ml môi trường, ủ ở 370C trong 48 giờ. - Các ống nghiệm có vi sinh vật phát triển sẽ làm đục môi trường và cho kết quả (+). Tiếp tục phân lập khuẩn lạc đơn trên môi trường thạch BP, đem ủ ở 370C trong 48 giờ. - Chọn các khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường BP để thực hiện thử nghiệm khẳng định S.aureus tương tự như phương pháp đếm khuẩn lạc. - Các đĩa cho kết quả khẳng định S.aureus (+) được đối chiếu với các ống nghiệm trong hệ thống các dãy ống nghiệm ban đầu và ghi lại số ống nghiệm (+) tương ứng với mỗi độ pha loãng. 3.2.4.2. Kết quả Tra bảng MPN để suy ra mật độ vi khuẩn S.aureus trong mẫu (số MPN/g hay MPN/ml) 3.3. Các phương pháp hiện đại 3.3.1. Xác định S. aureus đề kháng methicillin (chế tạo bộ thử nghiệm multiplex PCR) 3.3.1.1. Vật liệu Các chủng vi khuẩn S. aureus ATCC 25923 (MSSA), chủng S. aureus ATCC 43300 (MRSA) và một số chủng khác. Các đoạn mồi dùng trong nghiên cứu này tham khảo theo Mehrotra và do Sigma Aldrich cung cấp. Bộ kit PCR và một số hóa chất sinh học phân tử khác. Bảng 3.1: Các mồi dùng trong nghiên cứu (a kích thước sản phẩm khuếch đại) Tên Trình tự Gen vị trí Nucleotic Kích thướca (pp) FEMA-1 AAAAAAGCACAT AACAAGCG femA 1444-1463 132 FEMA-2 GATAAAGAAGAA ACCAGCAG femA 1575-1556 132 MECA-1 ACTGCTATCCAC CCTCAAAC mecA 1182-1201 163 MECA-2 CTGGTGAAGTT GTAATCTGG mecA 1344-1325 163 3.3.1.2. Phương pháp Chuẩn bị DNA vi khuẩn được thực hiện theo Feriera. Đun cách thủy ở nhiệt độ sôi huyên phù vi khuẩn (5 khóm/500ml TE 1X) trong 10 phút. Ly tâm 14000 vòng trong 5 phút. Bỏ cặn, thu phần dịch nổi. Pha loãng 10 lần bằng TE 1X. Multiplex PCR dùng 2ml DNA chiết nhanh trực tiếp huyền phù vi khuẩn mô tả ở trên, thêm vào 48ml hỗn hợp PCR 1X (16mM (NH4)2SO4, 67mM Tris HCl (pH 8,8)), 0,2mM cho mỗi thứ trong 4 loại dNTP, 1,5mM đến 2,5mM MgCl2, 5pM đến 20pM của mỗi femA, 25 pM của mỗi mecA và 1,25 U của Taq DNA polymerase. Chu kỳ luân nhiệt là 950C trong 10 phút, các bước (940C trong 30 giây, 50-650C trong 30 giây, 720C trong 1 phút) lặp lại 35 lần, 720C trong 10 phút (iCycler, BioRad). Sau khi xác định điều kiện tối ưu của multilex PCR, một phản ứng được tiến hành với mồi femA để nhận định các chủng S. aureus, với mồi mecA để phát hiện dấu hiệu đề kháng, với cả hai mồi cho mỗi chủng vi khuẩn. Sau khi khuếch đại bằng PCR, lấy 5ml sản phẩm phân tích điện di gel agarose 2% để ước tính kích thước của sản phẩm bằng cách so sánh với thang chuẩn 100bp. Gel được nhuộn với ethidium bromide và quan sát dưới tia UV (GelDoc, BioRad). Xây dựng chứng nội tại dùng chung mồi của mecA nhưng cho sản phẩm khuếch đại có chiều dài lớn hơn (khoảng 240bp) để kiểm soát sự ức chế phản ứng PCR với mỗi mecA. Tiến hành qua các bước: - PCR khuếch đại mecA, tinh chế và cắt với enzyme cắt giới hạn thích hợp. - Cắt đoạn DNA tổng hợp hóa học, có mang trình tự ở 2 đầu nhận biết - Lai và biến nạp vào E.coli. Chọn lọc dòng tái tồ hợp, nuôi và chiết plasmid dùng làm DNA chứng nội tại. - Khảo sát độ pha loãng thích hợp của chứng nội tại để cho vào PCR mix. Thiết kế bộ thử nghiệm gồm các thành phần: - Lọ dung dịch lưu mẫu chứa môi trường tăng sinh chọn lọc cho MRSA. - Que bông để quẹt mũi. - Ống dung dịch đệm ly trích mẫu: chứa các chất phá màng tế bào vi khuẩn (Triton-X-100, Tween 20, Tris HCl pH 8, EDTA). - Tube chứa hỗn hợp thực hiện phản ứng PCR, dung dịch đệm PCR, MgCl2, dNTP, các mồi Taq DNA polymerase. - Ống chứa chứng nội tại. 3.3.1.3. Kết quả và thảo luận Gen mecA dùng để xác định các chủng MRSA và gen femA đặc trưng cho S.aureus và không phản ứng chéo với các vi khuẩn khác. Tham khảo các nghiên cứu trước đây, nồng độ 25pM mỗi mecA trong một phản ứng được chọn cố định và khảo sát tìm nồng độ tối ưu cho mỗi femA. Ở các nồng độ của femA 5pM và 10pM (hình 3.3), chỉ cho một băng tương ứng mecA tại các giếng khuôn MRSA, trong khi MRSA không cho băng. Ở nồng độ 15pM của femA, MRSA trong giếng 12 cho một băng mecA nhưng trong giếng 13 và 14 đã cho hai băng femA và mecA. Giếng 15 không xuất hiện băng nào (hình 3.3). Ở nồng độ 20pM của femA, các khuôn MRSA (các giếng 16-19, hình 3.3) cho 2 băng femA và mecA, khuôn MRSA chỉ cho băng femA đặc trưng của S.aureus (giếng 20, hình 3.3). Chọn các nồng độ của các cặp mồi mecA và femA trong M-PCR lần lượt là 25pM và 20pM cho các thử nghiệm tiếp theo. Hình 3.3: Gel agarose phân tích M-PCR với cặp mồi femA ở các nồng độ khác nhau Nồng độ cặp mồi mecA giữ cố định 25pM và lần lượt bốn mức nồng độ femA: 5pM (giếng 1-5), 10pM (giếng 6-10), 15pM (giếng 11-15) và 20pM (giếng 16-20) trên DNA các chủng vi khuẩn, thang chuẩn DNA là 100bp. Chửng S. aureus ATCC 25923 (MSSA) là giếng 5, 10, 15 và 20. Chủng S. aureus ATCC 43300 (MRSA) là giếng 1, 6, 11 và 16. Các giếng còn lại là của các chủng khác. Thực hiện khảo sát năm mức độ MgCl2 và tám mức nhiệt độ lai (hình 3.4) cho thấy mức 1,75mM MgCl2 và nhiệt độ lai 55,70C cho hai băng rõ và đẹp (hình 3.4B, giếng 5). Để loại trừ sự hiện diện của các chất ức chế phản ứng PCR trong mẫu chứng nội tại dùng mỗi mecA được thiết kế và đưa vào hỗn hợp phản ứng. Hình 3.4: Gel agarose phân tích M-PCR gradient nồng độ MgCl2 và nhiệt độ lai trên chủng S. aureus ATCC 43300 (MRSA) Nồng độ MgCl2 lần lượt là 1,5mM (A), 1,75mM (B), 2mM (C), 2,25mM (D) và 2,5mM (E). Nhiệt độ là 500C, 50,10C, 530C, 55,70C, 59,50C, 62,30C, 640C và 650C tương ứng với các giếng từ 1-8. Kết quả xác định độ pha loãng tối đa của chứng nội tại được trình bày trong hình 3.5, nồng độ pha loãng nhất có cho băng chứng nội tại là 10-6 (hình 3.5A, giếng 5), còn trong multiplex PCR, ba băng 132bp (femA), 163bp (mecA) và 243bp (chứng nội tại) xuất hiện đủ ở 3 độ pha loãng của chứng nội tại (hình 3.5B), chỉ có băng số 6 hiển thị rõ ràng nhất. do đó, nồng độ pha loãng 10-6 được chọn để cho vào multiplex PCR. Hình 3.5: PCR kiểm tra độ pha loãng chứng nội tại Hình A là độ pha loãng chứng nội tại lần lượt từ giếng 1-9 là 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7, 10-8, 10-9 và 10-10. Hình B là độ pha loãng của chứng nội tại trong multiplex PCR trên khuôn MRSA lần lượt từ các giếng 2 đến giếng 10 là từ 10-2-10-10, giếng 1 không cho chứng nội tại. Hình 3.6: Bộ kít M-PCR phát hiện MRSA 3.3.2. Phương pháp hấp phụ miễn dịch dung enzyme-ELISA (Enzyne Linked Immunosorbent Assay) Phương pháp ELISA được ứng dụng để phát hiện S.aureus trong thực phẩm khá phổ biến, đây là phương pháp đơn giản, nhanh, nhạy, có thể phát hiện cũng như định lượng độc tố, có nhiều bộ kít phát hiện độc tố đang được bán trên thị trường. Kiểu ELISA thường gặp nhất là phương pháp sandwish. Trong phương pháp này kháng thể được gắn với mẫu chưa được biết, sau đó phức hợp kháng thể - độc tố được gắn với cộng hợp enzyme – kháng thể. Qui trình này được sử dụng nhiều vì lượng enzyme và màu được tạo ra từ phản ứng enzyme – cơ chất tỷ lệ thuận với lượng độc tố có trong mẫu chưa biết. Hai enzyme alkaline photphatase và horseradish peroxidase đều được dùng trong phương pháp này, nhưng alkaline photphatase dễ gắn với kháng thể hơn. Tuy nhiên horseradish peroxidase cho phản ứng nhạy hơn, khi kết hợp với cơ chất cho màu xanh lá, xanh dương hay cam, còn màu được tạo ra với cơ chất khi sử dụng với alkaline photphatase, r-nitrophenyl photphatase (pNPP) là màu vàng. Hầu hết các phương pháp ELISA nhạy ở ít nhất là 0,5 ng độc tố/ml. Nhiều nhà khoa học sử dụng phương pháp ELISA để phát hiện độc tố S. aureus trong phòng thí nghiệm với nhiều qui trình khác nhau. Phương pháp ELISA chủ yếu sử dụng đĩa giếng (microtitre plate hay strip) để kháng thể gắn vào. Mẫu được cho vào giếng, nếu như trong mẫu có kháng nguyên mục tiêu, kháng nguyên sẽ gắn với kháng thể. Sau đó, lấy mẫu ra và rửa đĩa. Cộng hợp enzyme – kháng thể (kháng thể có gắn với enzyme horseradish peroxidase hoặc alkaline photphatase) được thêm vào và cho phép phản ứng với phức hợp độc tố - kháng thể. Rửa đĩa, thêm cơ chất đặc hiệu của enzyme vào. Enzyme xúc tác phản ứng thủy phân cơ chất tạo ra sản phẩm có màu. Đối chứng dương và đối chứng âm cũng được đưa vào thí nghiệm. Phản ứng dương tính được ghi nhận nếu như màu đọc được đậm hơn màu ở đối chứng âm. Bằng cách theo dõi sự đổi màu, có thể phát hiện sự hiện diện và định lượng lượng kháng nguyên (độc tố). Ngoài ra người ta con sử dụng hạt polystyrene được gắn kháng thể. Phương pháp này nhạy hơn vì chỉ dùng 20 ml dịch trích thực phẩm. Những hạt mã màu được lấy ra khỏi dịch trích và đem rửa, mỗi hạt được cho vào đúng tube màu mật mã. Cho cộng hợp enzyme - kháng thể vào mỗi tube và có thể phản ứng với phức hợp độc tố-kháng thể. Rửa hạt trong tube nhiều lần, cho vào 1 ml cơ chất. Màu được tạo ra có thể đọc bằng mắt thường vì lượng độc tố không cần xác định trong việc xác định phản ứng dương tính. Nếu sử dụng máy đọc màu thì phản ứng tạo màu sẽ được dừng lại sau 30 phút bằng acid sulfuric. Hiện nay trên thị trường đã có nhiều bộ kit phát hiện SE. Trong đó phải kể đến TECRA, bộ kit phát hiện và định danh độc tố ruột enterotoxin (loại A đến E). Qui trình này có thời gian ngắn (4 giờ), nhạy (1ng/ml hay mg) và có thể phát hiện đồng thời sự hiện diện nhiều loại độc tố của tụ cầu, nhưng không thể phân biệt các loại độc tố. Bộ kit này dùng microtitre plate với các giếng đã được phủ hỗn hợp các kháng thể chuyên biệt của các độc tố từ A đến E; enzyme horseradish peroxidise, EDTA và NaH2PO4 là cơ chất. Phản ứng ELISA được thực hiện dựa trên kĩ thuật “sandwich”, và có tên thương mại là TECRATM. Đây là sản phẩm đầu tiên được chứng nhận bởi AOAC và được sử dụng khá rộng rãi để phát hiện các độc tố SE. Hình 3.7: Một số bộ kít ELISA 3.3.3. Phương pháp RPLA (Reversed Passive Latex Aggulutination) Kỹ thuật RPLA được ứng dụng để phát hiện độc tố trong thực phẩm cũng như xác định Staphylococcus có độc tố dương tính. Trong kỹ thuật này, hạt nhựa được phủ kháng thể của độc tố trước khi cho vào giếng. Sau đó, cho mẫu vào để tạo phản ứng. Nếu có độc tố trong mẫu thì phản ứng giữa độc tố và kháng thể sẽ tạo ra sự ngưng kết, tùy mức dộ ngưng kết mà xác định được lượng độc tố. Phương pháp này đủ nhạy để phát hiện độc tố trong hầu hết thực phẩm của các vụ ngộ độc, cũng như trong việc phát hiện những dòng Staphylococcus tạo ra lượng độc tố thấp mà các phương pháp khác không phát hiện được. Hinh 3.8: Bộ kít RPLA Ngoài ra còn có 1 số phương pháp khác để phát hiện S.aureus được sử dụng rộng rãi như phương pháp miễn dịch phóng xạ RIA (Radio Immunoassay) và phương pháp khuếch tán trên gel (gel diffusion) 3.4. Đề xuất biện pháp phòng ngừa lây nhiễm trên thực phẩm Muốn đề phòng ngộ độc thức ăn do tụ cầu, cần phải khống chế sự phát triển của vi khuẩn và sự hình thành độc tố ruột. Ở động vật S.aureus lây truyền chủ yếu là do uống sữa bò, nguyên nhân là do bò bị viêm vú nên trong sữa có tụ cầu sinh độc tố ruột. Vì thế, khi bò bị viêm vú thì phải vắt hết sữa và không được dùng để ăn. Quá trình vắt sữa phải tuân theo yêu cầu vệ sinh 1 cách nghiêm ngặt, tránh tình trạng bị nhiễm tụ cầu lan rộng. Giảm nguy cơ lây nhiễm từ các loại thực phẩm tươi là vấn đề rất quan trọng, phải đảm bảo các quy trình chế biến, dự trữ, phân phối, đóng gói thức ăn, theo dõi tình hình sức khỏe của người làm thức ăn, vệ sinh nơi chế biến và dự trữ thức ăn. Trước khi chế biến thức ăn phải rửa tay thật sạch. Các thức ăn từ khâu chế biến đến khi tiêu thụ phải được bảo quản lạnh hoặc để chỗ mát để đảm bảo vệ sinh. Các thức ăn đã được nấu chin nên dung ngay khi còn nóng và không nên để quá 2 giờ. Các thức ăn thừa phải cất giữ trong tủ lạnh, khi dùng lại phải nấu lại trước khi ăn vì vi khuẩn có thể xâm nhập vào thức ăn trong lúc thức ăn nguội và trong lúa chúng ta đang ăn. Đối với những người ăn ở hàng, quán, nhà ăn tập thể phải quan tâm đến độ an toàn của thực phẩm, chú ý nhiều ở khâu chế biến và dự trữ phải đảm bảo vệ sinh. Có thể thay thế những thức ăn khó bảo quản thành những thức ăn pha chế sẵn hợp vệ sinh cho người tiêu dùng. Trong quá trình dự trữ thức ăn cần đặc biệt quan tâm đến nhiệt độ, nếu không sẽ gây đến các trường hợp ngộ độc với độc tố tụ cầu. Những người lành mang trùng được khuyến cáo không nên làm việc ở phòng sinh, phòng trẻ sơ sinh, phòng mổ và các công ty chế biến thực phẩm. Khi phát hiện người bị nhiễm độc tố tụ cầu cần cách ly ngay tránh tình trạng lây nhiễm sang những người khác. Tóm lại vấn đề phòng ngừa luôn được đặt ra, tuy nhiên phải trên cơ sở theo dõi từng trường hợp cụ thể, từng vụ dịch bị nhiễm độc tố do tụ cầu, phân tích các loại thực phẩm có liên quan, các yếu tố lây nhiễm, các tác động đến sự phát triển dịch bệnh rồi mới có những biện pháp can thiệp thích hợp. Chương IV: Nội dung và phương pháp nghiên cứu 4.1. Địa điểm và thời gian Thời gian: Từ ngày 31/05/2010 đến ngày 12/06/2010. Địa điểm thực hiện: Phòng thí nghiệm khoa Môi trường và Công nghệ sinh học trường đại học Kỹ thuật công nghệ thành phố Hồ Chí Minh. Địa chỉ: 144/24 Điện Biên Phủ, P25, Q Bình Thạnh, TP Hồ Chí Minh. 4.2. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu Nghiên cứu và phát hiện Staphylococcus aureus trên một số mẫu thịt gà tươi sống tại một số chợ nhỏ trên địa bàn hai quận Phú Nhuận và Bình Thạnh thành phố Hồ Chí Minh. 4.3. Vật liệu tiến hành thí nghiệm 4.3.1. Các dụng cụ và hóa chất tiến hành thí nghiệm - Mẫu: 15 mẫu thịt, mỗi mẫu lấy 25g. - Kéo cắt mẫu. - Pipet 10ml. - Đĩa petri. - Que cấy trang thủy tinh. - Micropipet 10ml-200ml, đầu típ dung cho micropipet - Túi pe vô trùng. - Cân điện tử. - Ống nghiệm rỗng. - Ống đong 100ml. - Tủ sấy 370C, nồi hấp khử trùng 500C - Đèn cồn. - Quả bóp. - Chai chịu nhiệt dung tích 250ml. - Gía ống nghiệm inox. - Tủ cấy. - Bông không thấm. - Que cấy. - Cồn 960. - Dung dịch egg yolk (Tây Ban Nha) - Huyết tương thỏ, nước muối sinh lý 4.3.2. Các môi trường sử dụng - Môi trường SPW (Ấn Độ) - Môi trường BP (Ấn Độ) - Môi trường TSA (Ấn Độ) 4.4. Bố trí thí nghiệm Mẫu thịt Gà Thu mẫu tại các địa điểm khảo sát Đánh giá các chỉ tiêu Staphylococcus aureus Cảm quan Nhận xét, Kết luận Hinh 4.1: Bố trí thí nghiệm 4.5. Phương pháp nghiên cứu 4.5.1. Quy trình phân tích 25g mẫu + 225ml SPW đồng nhất trong 10 phút độ pha loãng là 10-1 Cho 0,1 ml mẫu ở độ pha loãng 10-1 cho vào đĩa môi trường BP có bổ sung egg yolk cấy trang Ủ ở 370C trong 48 giờ Khuẩn lạc đặc trưng của S.aureus trên BP: tròn, lồi, tâm đen, có quầng sang bao quanh Chọn 5 khuẩn lạc đặc trưng cấy chuyển trên môi trường TSA ủ ở 370C, trong 24 giờ Cấy chuyển vào ống nghiệm chứa 0,2 ml huyết tương thỏ Ủ ở 370C và theo dõi sau 2, 4, 6, 8 giờ. Nếu không có biểu hiện ngưng kết sẽ ủ tiếp tục đến 24 giờ Tổng số S.aureus (cfu/g): S= Hình 4.2: Quy trình phân tích Staphylococcus aureus 4.5.2. Thuyết minh quy trình 4.5.2.1. Phương pháp tăng sinh vi khuẩn: Phương pháp này nhằm tăng sinh vi khuẩn kết hợp với pha loãng mẫu Cân 25g mẫu cho vào túi PE vô trùng, thêm 225ml môi trường SPW (pepton water), buộc kín và bắt đầu đồng nhất mẫu bằng tay trong khoảng 10 phút, độ pha loãng sử dụng là 10-1. 4.5.2.2. Phương pháp phân lập mẫu Sau khi tiến hành đồng nhất mẫu và tăng sinh vi khuẩn trên môi trường SPW ta tiếp tục giai đoạn phân lập vi sinh vật trên môi trường BP. Chuẩn bị 10 đĩa môi trường thạch BP trước đó một ngày và bảo quản trong tủ lạnh. Sử dụng micropipet 10ml-200ml hút 100ml mỗi mẫu ở độ pha loãng 10-1 và dùng que cấy tam giác trải đều mẫu trên bề mặt môi trường BP. Thực hiện cấy trang mỗi mẫu từ 5-10 phút cho đến khi khô hẳn mới lật úp đĩa lại. Mỗi mẫu thực hiện lặp lại 2 lần trên 2 đĩa môi trường BP, sau đó đem đi ủ ở 370C trong 48 giờ. 4.5.2.3. Phương pháp cấy chuyển khuẩn lạc đặc trưng: Sau khi ủ ở 370C trong 48 giờ ta tiến hành đếm và xác định các khuẩn lạc đặc trưng xuất hiện trên môi trường thạch BP. Chuẩn bị 10 đĩa môi trường thạch TSA trước đó một ngày và bảo quản trong tủ lạnh. Khuẩn lạc đặc trưng là khuẩn lạc có dạng tròn, lồi, ẩm ướt, có vầng sáng bao quanh, đánh dấu các khuẩn lạc đặc trưng chuẩn bị cấy chuyển sang môi trường thạch TSA. Dùng que cấy vòng cấy các khuẩn lạc đặc trưng từ môi trường thạch BP sang môi trường thạch TSA. Tiếp tục đem ủ ở 370C trong 24 giờ. 4.5.2.4. Phương pháp thực hiện đông tụ huyết tương Dùng micropipet 10ml-200ml hút 200ml huyết tương thỏ vào mỗi ống nghiệm rỗng đã được hấp khử trùng. Dùng que cấy vòng tiến hành cấy sinh khối vi khuẩn từ môi trường thạch TSA vào các mẫu ống nghiệm chứa huyết tương thỏ và đem ủ ở 370C. Theo dõi kết quả phản ứng đông huyết tương trong các khoảng thời gian 2, 4, 6, 8 và 24 giờ. 4.5.2.5. Phương pháp tính toán kết quả Kết quả thử nghiệm là (+) khi khối đông huyết tương hình thành, kết quả là (-) khi không có hình thành khối đông. Mật độ S.aureus trong mẫu được tính như sau: S(cfu/g)= Trong đó: N: tổng số khuẩn lạc đặc trưng n: số đĩa thực hiện V: thể tích f: độ pha loãng R: hệ số ngưng tụ 4.6. Kết quả 4.6.1. Kết quả cảm quan Hình 4.3: Cảm quan thịt gà Về màu sắc, thịt gà phải có màu đặc trưng của thịt, phần thịt có màu hồng, phần mỡ và da có màu vàng tươi hoặc trắng. Về mùi thì thịt gà phải có mùi đặc trưng của thịt, không có mùi lạ. Về tính chất, thì bề mặt của thịt có nước, thịt có độ đàn hồi tốt Về cảm quan về thịt nhìn chung là tốt, thịt nhìn còn tươi, tính chất, màu sắc và mùi vị của thịt không có gì lạ. Những đánh giá cảm quan không đù để xem xét mức độ sạch của thịt. 4.6.2. Kết quả đánh giá mức độ nhiễm Staphylococcus aureus Theo TCVN 4830-89 (ISO 6888:1983) với quy định mật độ nhiễm Staphylococcus aureus là 102 CFU/1g Hình 4.4: Tỷ lệ nhiễm S.aureus trên các mẫu thực nghiệm Theo TCVN 4830-89 (ISO 6888:1983) mẫu 1, 2, 3 và 5 đã nhiễm Staphylococcus aureus với quy định 1.102 CFU/1g. (chiếm 4/5 mẫu thực nghiệm). 2 mẫu số 1và số 5 nhiễm với tỷ lệ 33,33% (chiếm 2/5 mẫu thực nghiệm). Còn 2 mẫu số 2 và số 3 nhiễm với tỷ lệ 66,67% (chiếm 2/5 mẫu thực nghiệm). Ở 2 mẫu số 1 và số 5 trong 3 lần kiểm tra thì chỉ có 1 lần nhiễm điều này có thể là do bị nhiễm từ người bán hoặc do khách mua hàng chọn lựa thịt. Mặc dù bị nhiễm nhưng tỉ lệ nhiễm của 2 mẫu này không cao hơn nhiều so với tiêu chuẩn. Khả năng nhiễm cũng có thể là do người bán không đeo bao tay khi phân phối thịt hoặc do chỗ bán không hợp vệ sinh. Ở 2 mẫu số 2 và số 3 thì có đến 2 lần nhiễm thậm chí tỉ lệ nhiễm là rất cao, riêng mẫu số 2 thì chỉ có 1 lần kiểm nghiệm là vừa đúng tiêu chuẩn. Điều này chứng tỏ 2 cơ sở bán mẫu này không đảm bảo vệ sinh hoặc do thao tác của người bán không hợp vệ sinh. Vệ sinh ở 2 địa điểm này là không tốt điều này chứng tỏ bị ảnh hưởng của môi trường xung quanh như: tạp nhiễm trong không khí, do nơi bán hàng không đảm bảo vệ sinh hoặc có thể do nơi bán hàng nằm gần khu vực chứa rác, cống nước thải. Tóm lại, mẫu số 4 là mẫu vệ sinh và đảm bảo an toàn nhất, 2 mẫu số 1 và số 5 thì có thể sử dụng được nhưng phải đảm bảo các quy trình vệ sinh thực phẩm, còn 2 mẫu số 2 và số 3 thì nếu đảm bảo vệ sinh tốt hơn nữa thì mới có thể bảo đảm an toàn cho người sử dụng. Chương V: Kết luận và kiến nghị 5.1. Kết luận Qua quá trình làm bài khóa luận này chúng tôi nhận ra rằng Staphylococcus aureus là 1 loài vi khuẩn nguy hiển cho cả con người và động vật. Vi khuẩn này rất nguy hiểm đặc biệt là các độc tố đường ruột của nó. Nó gây ra các vụ nhiễm khuẩn đường ruột còn được coi là 1 siêu kháng nguyên rất nguy hiểm và là sự bắt đầu của các triệu chứng sốc độc hại. Ngoài ra vi khuẩn này còn lây nhiễm trong các bệnh viện, đây là 1 điều đáng báo động vì hầu hết những vụ nhiễm trùng này ảnh hưởng đến các bệnh nhân mới mổ xong và đặc biệt là trẻ sơ sinh. S.aureus còn gây các triệu chứng sốc độc hại rất nguy hiểm đi kèm với nhiễm trùng huyết. Người khỏe mạnh hầu hết đều có S.aureus nhưng chỉ khi có điều kiện thích hợp thì vi khuẩn này mới sản sinh ra các độc tố. Tóm lại, trên thế giới hiện nay có rất nhiều loại vi khuẩn nguy hiểm không chỉ là S.aureus mà còn là Clostridium botulinum, E.coli, Salmonella. Đây đều là những vi khuẩn nguy hiểm đến sức khỏe của con người. Việc tìm hiểu và nghiên cứu về chúng là rất cần thiết để đề ra các biện pháp phòng ngừa thích hợp nhưng có lẽ ý thức của mỗi con người là biện pháp phòng ngừa hiệu quả nhất. 5.2. Kiến nghị Trong thực nghiệm trên, có một số phần do thời gian quá gấp mà tôi chưa thể thực hiện được đó là: - Khảo sát tình trạng vi sinh của khu buôn bán - Khảo sát qua tình hình giết mổ gia cầm trên địa bàn thành phố Hồ Chí Minh Lập các trung tâm kiểm dịch trên địa bàn các quận và yêu cầu thịt trước khi bán cần phải qua kiểm dịch và sử dụng các dụng cụ phân phối hợp vệ sinh Nên lập các địa điểm bán thực phẩm tập trung để dễ dàng kiểm tra vệ sinh khu buôn bán. Thường xuyên tổ chức các đợt kiểm tra khu chăn nuôi và giết mổ để đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT: Bộ môn vi sinh vật trường đại học y Hà Nội (2001), vi sinh vật y học, Nxb y học, Hà Nội. Bộ môn vi sinh vật trường đại học y Hà Nội (2007), vi sinh vật y học, Nxb y học, Hà Nội. Bộ môn vi sinh vật trường đại học y khoa Huế (2004), bài giảng vi sinh y học. Bộ y tế (2008), vi sinh vật y học, Nxb y học, Hà Nội. Trần Thu Hoa, Đỗ Thị Lan Hương, Nguyễn Thị Ngọc Lan, Hoàng Hiếu Ngọc và Phạm Hùng Vân (2009), nghiên cứu chế tạo bộ thử nghiện multiplex PCR phát hiện Staphylococcus aureus đề kháng methicilin, y học TP. Hồ Chí Minh, tập 13, phụ bản số 2. Trần Linh Phước (2009), phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mỹ phẩm, Nxb Giáo Dục, Hà Nội TÀI LIỆU TIẾNG ANH: Anne-Laure Genestier, Marie-Cécile Michallet, Gilles Prévost, Gregory Bellot, Lara Chalabreysse, Simone Peyrol, Françoise Thivolet, Jerome Etienne, Gérard Lina, François M, Vallette François, Vandenesch and Laurent Genestier (2009), Staphylococcus aureus Panton-Valentine leukocidin directly targets mitochondria and induces Bax-independent apoptosis of human neutrophils, INSERM, Lyon, France. Bibek Ray (2009), FUNDAMENTAL FOOD MICROBIOLOGY, ,Boca Raton London New York Washington, D.C, USA. Bradley G. Stiles, Teresa Krakauer, and Peter F. Bonventre (1994, 1995), Biological Activity of Toxic Shock Syndrome Toxin 1 and a Site-Directed Mutant, H135A, in a Lipopolysaccharide- Potentiated Mouse Lethality Model, Divisions of Toxinology1 and Applied Research, U.S. Army Medical Research Institute of Infectious Diseases, Frederick, Maryland 21702-5011, and Department of Molecular Genetics, Biochemistry and Microbiology, University of Cincinnati, Cincinnati, Ohio 45267-0524, USA. K.A. Voss, G.W. Smith, W.M. Haschek (2001), Fumonisins: Toxicokinetics, mechanism of action and toxicity, Toxicology and Mycotoxin Research Unit, USDA Agricultural Research Service, P.O. Box 5677, Athens, GA 30605-5677, USA. Department of Population Health and Pathobiology, College of Veterinary Medicine. North Carolina State University, Raleigh, NC 27695, USA. Department of Pathobiology, University of Illinois, 2001 South Lincoln Avenue, Urbana, IL 61802, USA. K. M. Cunnion, J. C. Lee, and M. M. Frank (2001), Capsule Production and Growth Phase Influence Binding of Complement to Staphylococcus aureus, Department of Pediatrics, Duke University Medical Center, Durham, North Carolina 27710,1 and Channing Laboratory, Department of Medicine, Brigham and Women’s Hospital, Harvard Medical School, Boston, Massachusetts 02115-58042 Mark E. Hart, Morgan J. Hart, and Anna J. Roop (1998), Genotypic and Phenotypic Assessment of Hyaluronidase among Type Strains of a Select Group of Staphylococcal Species, Division of Microbiology, National Center for Toxicological Research, U.S. Food and Drug Administration, Jefferson, AR 72079, USA Department of Microbiology and Immunology, University of Arkansas for Medical Sciences, Little Rock, AR 72205, USA Department of Biology, Ouachita Baptist University, Arkadelphia, AR 71998, USA. Michael Palmer, Renate Jursch, Ulrich Weller, Angela Valeva, Karin Hilgert, MiKcheaheole Q, and Sucharit Bhakdi (1992), Staphylococcus aureus &-Toxin, From the Institute of Medical Microbiology, University of Mainz, Augustwplutz, W-6500 Germany and the Department of Microbiology, Medical School, University of Newcastle upon Tyne, Newcastle upon Tyne NE2 4HH, United Kingdom. Nathalie Gaebler Vasconcelos and Maria de Lourdes Ribeiro de Souza da Cunha (2010), Staphylococcal enterotoxins: Molecular aspects and detection methods, Biosciences Institute, UNESP – Univ Estadual Paulista, Department of Microbiology and Immunology, Bacteriology Laboratory, Botucatu-SP, Brazil Regina LaRocque, M.D. (2001), Staphylococcal Toxic Shock Syndrome: A Superantigen-Mediated Disease, Joint Infectious Disease Conference, USA. Taishi Tanabe, Hisaaki Sato, Kengo udea, Hiroko Chihara, Takao Watanabe, Katsushige Nakano, Hiroshi Saito, and Nobutoshi Maehara (1994), Possible Receptor for Exfoliative Toxins Produced by Staphylococus hyicus and Staphylococcus aureus, Department of Veterinary Microbiology, School of Veterinary Medicine and Animal Sciences, Kitasato University, Towada, Aomori 034, Japan. Tao Jin, Maria Bokarewa, Timothy Foster, Jennifer Mitchell, Judy Higgins and Andrej Tarkowski (2004), Staphylococcus aureus Resists Human Defensins by Production of Staphylokinase, a Novel Bacterial Evasion Mechanism, J. Immunol. 2004;172;1169-1176. TÀI LIỆU WEBSITE: ụ_cầu_khuẩn ơ_chế_độc_lực_của_vi_khuẩn www.bacsidakhoa.com ễn_dịch_bệnh_sinh_của_nhiễm_trùng_huyết PHỤ LỤC Số liệu khuẩn lạc đặc trưng của S.aureus trên môi trường BP Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 3 Mẫu 4 Mẫu 5 Đợt TN 1 3 3 21 10 4 Đợt TN 2 2 80 9 2 3 Đợt TN 3 2 9 1 2 1 Số liệu đông tụ huyết tương: Số liệu đông tụ huyết tương đợt thí nghiêm 1 Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 3 Mẫu 4 Mẫu 5 2 giờ 3 (-) 3 (-) 5 (-) 5 (-) 4 (-) 4 giờ 3 (-) 3 (-) 5 (-) 5 (-) 4 (-) 6 giờ 3 (-) 3 (-) 5 (-) 5 (-) 4 (-) 8 giờ 3 (-) 3 (-) 5 (-) 5 (-) 4 (-) 24 giờ 3 (+) 2 (+) 1 (-) 2 (+) 3 (-) 1 (+) 4 (-) 3 (+) 1 (-) Số liệu động tụ huyết tương trong đợt thí nghiệm 2 Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 3 Mẫu 4 Mẫu 5 2 giờ 2 (-) 5 (-) 5 (-) 2 (-) 3 (-) 4 giờ 2 (-) 5 (-) 5 (-) 2 (-) 3 (-) 6 giờ 2 (-) 5 (-) 5 (-) 2 (-) 3 (-) 8 giờ 2 (-) 5 (-) 5 (-) 2 (-) 3 (-) 24 giờ 1 (+) 1 (-) 2 (+) 3 (-) 2 (+) 3 (-) 1 (+) 1 (-) 2 (+) 1 (-) Số liệu đông tụ huyết tương trong đợt thí nghiệm 3 Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 3 Mẫu 4 Mẫu 5 2 giờ 2 (-) 4 (-) 1 (-) 2 (-) 1 (-) 4 giờ 2 (-) 4 (-) 1 (-) 2 (-) 1 (-) 6 giờ 2 (-) 4 (-) 1 (-) 2 (-) 1 (-) 8 giờ 2 (-) 4 (-) 1 (-) 2 (-) 1 (-) 24 giờ 1 (+) 1 (-) 2 (+) 2 (-) 1 (+) 1 (+) 1 (-) 1 (+) Số liệu mật độ S.aureus trong 5 mẫu thịt Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 3 Mẫu 4 Mẫu 5 Đợt TN 1 1,5.102 102 4,2.102 102 1,5.102 Đợt TN 2 50 16.102 1,8.102 50 102 Đơt TN 3 50 2,25.102 50 50 50