Khóa luận Tổng quan về thực phẩm probiotic

Được sản xuất và chế biến để bổ sung năng lượng, vitamin, khoáng chất cho cơ thể khi vận động thể lực, thể dục thể thao... 2.2.2.5. Nhóm thực phẩm giàu chất xơ tiêu hóa Ở nhóm thực phẩm này sử dụng chất sơ là các polysaccharide không phải là tinh bột, là bộ khung, giá đỡ cho các mô, tế bào thực vật và có sức chống đỡ các men tiêu hóa của người. Chất xơ có tác dụng làm nhuận tràng, tăng khối lượng phân do đó chóng được táo bón và ung thư đại tràng. Ngoài ra chất xơ còn có vai trò đối với chuyển hóa cholesterol, phòng ngừa nguy cơ suy vành mạch, sỏi mật, tăng cảm giác no, giảm bớt cảm giác đói do hỗ trợ việc giảm cân, hỗ trợ đái tháo đường. 2.2.2.6. Nhóm các chất tăng cường chức năng đường ruột Nhóm thực phẩm này bao gồm tiêu hóa sinh học (Probiotic) và tiền sinh học (Prebiotic) đối với hệ vi khuẩn cộng sinh ở ruột già. Các vi khuẩn cộng sinh (Probiotics) là các vi khuẩn sống trong cơ thể, ảnh hưởng có lợi cho vật chủ nhờ cải thiện hệ vi khuẩn đường ruột. Các vi khuẩn này kích thích chức phẩn miễn dịch bảo vệ của cơ thể. Thực phẩm chức năng loại này thường được chế biến từ các sản phẩm của sữa, tạo sự cân bằng trong hệ vi sinh trong ruột. Ví dụ Lactobacillus casei là một loại vi khuẩn gram (+), không gây bệnh, sử dụng rộng rải trong chế biến sữa và đã thấy cải tạo hệ miễn dịch tế bào của người. Bifidobacteria có hoạt tính tăng cường miễn dịch và khả năng tạo phân bào cao. 2.2.2.7. Nhóm thực phẩm chứ năng đặc biệt Nhóm thực phẩm chức năng đặc biệt này gồm có: + Thức ăn cho phụ nữ có thai. + Thức ăn cho người cao tuổi. + Thức ăn cho trẻ ăn dặm. + Thức ăn cho vận động viên, phi hành gia. + Thức ăn qua ống thông dạ dày. + Thức ăn cho người có rối loạn chuyển hóa bẩm sinh: người bị Phenylketonuri, Galactosemie... + Thức ăn cho người bệnh tiểu đường. + Thức ăn cho người cao huyết áp. + Thức ăn thiên nhiên: tỏi, trà xanh, các chất sinh học thực vật... Bảng 2.2.2. Hệ thống phân loại thực phẩm probiotic trên thị trường theo hệ thống phân loại FOSHU ( Food for Specific Health Use). Tuyên bố về sức khỏe Yếu tố chức năng Số sản phẩm Loại thực phẩm trên thị trường Thực phẩm cải thiện đường tiêu hóa Prebiotics: oligosaccharides, rafftinose, lactulose, arabinose. Probiotics: lactocillus, bifidobacterium. 336 Nước giải khát, yaourt, bánh biscuit, đường viên, đậu nành đông, dấm, chocolate, soup bột, sữa lên men, miso soup, ngũ cốc Thực phẩm cho người có cholesterol trong máu cao Đạm đậu nành, alginate, chitosan, sitosterol ester 28 Nước giải khát, thịt viên, xúc xích, ,bánh biscuit, magarin. Thực phẩm cho người có huyết áp cao Chuỗi acid amin 42 Nước giải khát, soup, acid lactic, nước uống lên ,men, đậu nành Thực phẩm cho người có triacyglycerol huyết thanh cao Diaglycerol và sitosterol 9 Dầu ăn Thực phẩm liên quan đến chuyên chở và hấp thụ chất khoáng Casein, calcium citrate isoflavone 17 Nước giải khát, đậu nành lên men(natto), mứt Thực phẩm Non-caloriogenic Manitol, polyphenols, paltinose, xylytol 6 Chocolate, chewing gum. Thực phẩm cho người liên quan đến đường huyết Bột mì albumin, tiêu hóa globin, polyphenol 4 Kẹo , soup, nước giải khát. 2.2.3. BỔ SUNG VI SINH VẬT PROBIOTICS VÀO THỰC PHẨM Ngày nay có rất nhiều loại thực phẩm chứa một chủng hay nhiều chủng vi sinh vật probiotics có mặt khắp nơi trên thế giới. Các vi sinh vật này được bổ sung vào các loại thực phẩm như: sữa, kẹo cao su, kẹo, bánh ngọt, bia và sữa đậu nành... Vi sinh vật probiotics được sử dụng để bổ sung vào thực phẩm nhiều nhất đó là các loài vi khuẩn Lactobacillus: L.bulgaricus, L. lactis, L. salavarius, L. plantarium. L. thermophilus, Enterococcus facecium, E. faecalis và Bifidobacterium sp. Bảng 2.2.3. Một số thực phẩm probiotics bổ sung vi khuẩn Lactobacillus hoặc kết hợp với một số vi khuẩn lactis khác. Tên sản phẩm Nguồn gốc Chủng vi sinh vật sử dụng Probio Việt nam Lactobacillus casei Yakult Nhật bản Lactobacillus casei shirota, Bifidobacterium Acidophilus bifidus yogurt Đức L. dalbrucekii subsp. Bulgaricus, S. Thermophilus, B. bifidum hoặc B. longum Biogarde Đức L. acidophilus, S. Thermophilus, B. bifidum Biomild Đức L. acidophilus, Bifidobacterium sp Cultura Đan Mạch L. acidophilus, B. bifidum Diphilus milk Pháp L. acidophilus, B. bifidum Progurt Chile Lactococcus lactis biovar diacetilactis, B. bifidum, Lactococcus lactis spp. ceremoris, L. acidophilus 2.2.4. CÁC DẠNG THỰC PHẨM PROBIOTIC TRÊN THẾ GIỚI Các loại thực phẩm lên men đã có lịch sử lâu đời về độ an toàn và được sử dụng phổ biến trên khắp thế giới, việc sản xuất và tiêu thụ các sản phẩm lên men đã có cách nay hàng ngàn năm. Quá trình lên men lúa mạch để tạo bia và lên men nho tạo rượu là những bằng chứng sớm nhất cho việc sử dụng quá trình lên men, cách đây khoảng 5000 năm. Ở Trung Đông và tiểu lục địa Ấn Độ sữa được lên men thành yogurt và những sản phẩm khác. Đặc biệt hơn 1000 loại phomát khác nhau đã được tạo ra ở Trung Đông và Châu Âu. Các loại rau củ lên men là thực phẩm truyền thống ở vùng Đông Á cách đây hàng ngàn năm. Kim chi là thực phẩm lên men truyền thống của Hàn Quốc và ngày nay vẫn là món ăn hàng ngày của họ. Ở Indonexia đậu nành được lên men thành tempe. Các thực phẩm lên men tiếp tục góp phần đáng kể vào thành phần bữa ăn trên khắp thế giới. Ngoài ra những sản phẩm dược phẩm làm từ sữa bò và chứa những tế bào Bifidobacteria là Bifider (Nhật Bản), Bifidogene (Pháp) và Omiflora một sản phẩn từ Đức chứa Lb. acidophilus và Bifidobacterium longum. Tại Canada probiotic có mặt trong yogurt, nước trái cây, Activia, Yoptimal, Lait Natrel PRO. Đối với thực phẩm probiotics phải đáp ứng được các yêu cầu về hàm lượng vi sinh vật probiotic trong thực phẩm chức năng là107- 108 cfu/g và độ an toàn khi sử dụng sản phẩm. Bảng 2.2.4 Các dạng thực phẩm lên men trên thế giới sử dụng Lactobacillus hoặc kết hợp với các vi khuẩn khác. Tên sản phẩm Nguồn gốc Chủng vi khuẩn sử dụng Acidophilus milk USA Lb. acidophilus Baolao balao Indonesia Lactobacillus sp Bulgarium buttermilk Bulgaria Lb. delbrueckii spp. bulgaricus Burong dalag Đông Nam Á Lc. mesenteroides, P. Pentosesaceus, Lb. plantarum Dahi Ấn Độ S. thermophilus, Lb. bulgaricus, Lc. diacetylactuis Izushi Nhật Bản Lactobacillus sp Kisra Trung Đông Lactobacillus sp Koumiss Mongolia Lb. delbrueckii spp. bulgaricus, delbrueckii spp. lactic Magon Tunisia Lactobacillus sp Pulque Mexico Lb. plantarum, Leuconostoc sp Shoyu Indonesia Lactobacillus sp Sour bread Pháp Lb. sanfancisco, Lb. brevis Nước mắm Đông Nam Á Lb. delbrueckii spp. delbrueckii Yogurt Châu Á, Balkans Lb. delbrueckii spp. bulgaricus, S. thermophilus 2.2.5. THỊ TRƯỜNG PROBIOTICS VÀ TRIỂN VỌNG PHÁT TRIỂN Trong những năm gần đây doanh thu bán lẻ các sản phẩm bio-milk, bio-yogurt và những sản phẩm probiotics tiếp tục tăng lên nhanh chóng trên thị trường Châu Âu, Bắc Mỹ và nhiều nước phát triển khác trong đó có cả thị trường Việt Nam. Những sản phẩm đó sử dụng một giống hoặc kết hợp nhiều giống vi khuẩn lactic khác nhau.Sự ủng hộ tích cực của Metchnikoff (1907) đối với các sản phẩm sữa lên men như là loại sản phẩm có ích cho sức khỏe con người đã khởi đầu cho sự phát triển của probiotics. Ở Nhật Bản, thực phẩm chức năng là một thuật ngữ quảng cáo đầu tiên xuất hiện vào những năm cuối của Thế kỷ 20, được sử dụng để mô tả những thực phẩm được bổ sung những thành phần có khả năng tạo ảnh hưởng tốt cho sức khỏe. Thuật ngữ này đã được chấp nhận và nhanh chóng phổ biến với người tiêu dùng nhờ việc tăng cường sự hiểu biết về mối liên hệ giữa sức khỏe với dinh dưỡng và chế độ ăn uống. Các nhà sản xuất rất quan tâm phát triển các loại thực phẩm dạng này vì việc thêm thành phần vi sinh probiotic sẽ làm tăng giá trị thực phẩm. Ngày nay probiotic và thực phẩm chức năng đều được tiêu thụ một số lượng lớn trên thị trường Nhật và Mỹ. Vi khuẩn probiotic được bán dưới dạng thực phẩm và dạng bổ sung vào khẩu phần ăn trên thị trường các nước. Trước đây các thực phẩm chứa vi khuẩn probiotic hầu hết là các sản phẩm từ sữa như: sữa lỏng, yogurt... Những loài Lb. acidophilus và Bifidobacterium là những loài thông dụng trong sản xuất thực phẩm probiotic ở Mỹ. Khoảng 0.6% sản phẩm sữa dạng lỏng ở Mỹ chứa vi khuẩn probiotic. Hiện nay trên thị trường toàn cầu ước tính có hàng ngàn sản phẩm probiotic khác nhau ở dạng viên nén, mềm, dạng viên con nhộng gelatine cứng, dạng bột, dạng lỏng và dạng bột nhão. Tại thị trường Việt Nam, chế phẩm probiotic dạng dược phẩm cho người chưa được phổ biến, dạng sản phẩm này chỉ dùng để điều trị một số bệnh về đường tiêu hóa hoặc cho những bệnh nhân sau quá trình điều trị rối loạn tiêu hóa bằng kháng sinh. Nhưng các dạng sữa chua và yogurt đã trở nên phổ biến với nhiều loại sản phẩm đa dạng, ngoài các thương hiệu trong nước như Vinamilk đã có hàng loạt sản phẩm probiotic như dạng lỏng( sữa uống lên men Probi)và bán lỏng (sữa chua ăn Probi) và các thương hiệu ngoài nước như Betagen dạng sữa uống lên men nhập khẩu từ Thái Lan, sữa uống lên men Yakult của Nhật Bản sản xuất tại Việt Nam... Cho thấy khả năng phát triển của loại thực phẩm chức năng này trên thị trường Việt Nam và đã đem lại sự đa dạng trong việc lựa chọn sản phẩm cho người tiêu dùng. 2.3. PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP TUYỂN CHỌN VI SINH VẬT PROBIOTIC Nguồn vi khuẩn lactic Tăng sinh trong MRS broth Cấy truyền sang MRS agar Nhuộm bào tử Phân lập chủng thuần khiết Nhuộm kháng acid Nuôi cấy kị khí Vi khuẩn lên men lactic Thử nghiệm Catalase Lên men đường Định tích acid lactic Lên men đồng hình Nhuộm Gram Lên men dị hình Kiểm tra khả năng di động Hinh 2.3. Sơ đồ phân lập và định danh vi khuẩn lên men lactic đến cấp giống bằng phương pháp cổ điển (theo Bergey,s Manual, 1957.) 2.3.1. PHÂN LẬP CHỦNG THUẦN KHIẾT BẰNG PHƯƠNG PHÁP TRẢI Bước 1: Pha loãng mẫu: cho một lượng nhỏ mẫu vào ống nghiệm chứa nước muối sinh lý (NaCl 0,85%). Vortex đều rồi pha loãng bậc 10 liên tiếp để đạt tới nồng độ thích hợp. Bước 2: Hút 0,1 ml dịch pha loãng cho vào các đĩa môi trường MRS agar, dùng que trải để trải mẫu nhằm thu được các khuẩn lạc rời. Các đĩa được ủ ở 370C trong 48h. Bước 3: Làm thuần: dùng que cấy vòng cấy ria các khuẩn lạc riêng rẽ phân lập được sang các đĩa MRS mới, ủ ở370C trong 48h. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần, sau khi kiểm tra độ thuần bằng kính hiển vi, giống được giữ trong ống thạch nghiêng hoặc trong glycerol . 2.3.2. CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH DANH VI KHUẨN LACTIC 2.3.2.1. Định tính nhuộm Gram Nguyên tắc: Nhuộm gram hay còn gọi là định tính gram dựa trên khả năng bắt màu của tế bào chất và màng tế bào với thuốc tím kết tinh và Lugol. Dựa vào phản ứng này vi khuẩn được chia thành 2 nhóm lớn: Nhóm thứ nhất vẫn giữ nguyên màu tím của thuốc nhuộm, không bị rửa trôi khi sử lí bằng cồn do lớp vỏ tế bào có nhiều peptidoglycan và ít chất béo. Vi sinh vật thuộc nhóm này là Gram dương. Nhóm thứ hai vỏ tế bào có ít peptidoglycan và nhiều chất béo hơn dễ bị trôi khi sử lý bằng cồn, làm mất màu khi nhuộm bổ sung sẽ có màu hồng. Vi sinh vật nhóm này là Gram âm [49-50]. Cách tiến hành - Tạo một giọt huyền phú tế bào lên lame. - Cố định nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn. - Nhuộm tím kết tinh tronh một phút. - Nhuộm Lugol trong một phút - Rửa nước - Nhuộm bổ sung bằng safranin - Rửa nước - Làm khô và soi tiêu bản với độ phóng đại 100X. Vi khuẩn gram dương có màu tím, gram âm có màu hồng. 2.3.2.3. Phương pháp nhuộm bào tử Nguyên tắc: Khác với nấm sợi hay nấm mốc, bào tử vi khuẩn (nha bào) không phải là cơ quan sinh sản và thường có hai dạng: hình cầu và hình bầu dục. Khi tế bào vi khuẩn sống trong môi trường không thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển, do thiếu các chất dinh dưỡng hay độ ẩm thấp thì bào tử được hình thành. Nhưng khi môi trường thuận lợi thì bào tử lại nãy mầm trở lại thành và tế bào lại có thể phân chia. - Bào tử rất khó nhuộm do màng bào tử dày, chắc, khó bắt màu và chứa nhiều lipid. Trước tiên xử lý bằng nhiệt hay acid để bào tử dễ bắt màu. Sau đó nhuộm cả tế bào chất và bào tử của vi khuẩn bằng thuốc nhuộm có hoạt tính mạnh (Lục malachite). Tẩy màu tế bào chất bằng nước cất, sau đó nhuộm bổ sung bằng Safranin để phân biệt. Bào tử bắt màu xanh, tế bào dinh dưỡng bắt màu hồng. Tiến hành: Lấy một vòng sinh khối vi khuẩn phết lên phiến kính, cố định trên ngọn lửa đèn cồn. Thêm một ít nước cho vào cốc becse và đun sôi. Đặt giá nhuộm lên cốc becse và đặt phiến kính lên. Đặt nhẹ mẫu giấy thấm lên phiến kính nơi có vi khuẩn đã được cố định. Nhỏ thuốc nhuộm Lục malachite lên miếng giấy lọc và hơ hơi nước nóng trong vòng 5 phút. Tiếp tục thêm thuốc nhuộm để tránh tình trang thuốc nhuộm bị khô. Khử màu với nước trong 30 giây bằng cách cho nước chảy lên phiến kính. Các tế bào dinh dưỡng sẽ mất màu còn bào tữ vẫn giữ được màu. Nhuộm lại với Safranin trong 30 giây rồi rửa nước trong 30 giây nữa, thấm khô. Quan sát dưới kính hiển vi với độ phóng đại X 100. Bào tử có màu xanh, tế bào dinh dưỡng có màu hồng. 2.3.2.4. Phương pháp thử Catalase Nguyên tắc: Các vi sinh vật hiếu khí và kị khí tùy ý chứa chuỗi truyền điện tử có cytochrome đều có catalase. Enzyne này đóng vai trò bảo vệ tế bào khởi bị tổn thương bởi các dẫn xuất độc tính cao của oxi phân tử trong tế bào hiếu khí và kị khí. Catalase thủy phân hydrogen peroxide (H2O2) thành nước và phóng thích oxi phân tử, ngăn cản sự tích tụ của phân tử có tính độc cao này trong tế bào. Cách tiến hành: Bổ sung vài giọt hydrogen peroxide lên khuẩn lạc hay một giọt huyền phù trên lame và theo dõi sự sủi bọt do oxi phân tử được phóng thích [50]. 2.3.2.5. Phương pháp khảo sát đặc tính sinh acid Phương pháp thử đặc tính trên môi trường Calcium carbonate (CaCO3). Nguyên tắc: Trong môi trường acid CaCO3 sẽ chuyển từ dạng trắng đục sang trắng trong. Do vậy khi tế bào vi khuẩn tạo acid và khuếch tán ra môi trường, acid sẽ tạo vòng tan xung quanh khuẩn lạc. Đường kính vòng tan càng lớn càng chứng tỏ vi khuẩn càng tạo và tiết ra môi trường càng nhiều acid. Cách tiến hành: - Cấy điểm các chủng vào môi trường CaCO3. - Ủ ở 370C trong 48 - 72h. - Ghi nhận sự xuất hiện vòng tan CaCO3 [31]. Phương pháp khảo sát đặc tính sinh acid lactic bằng thuốc thử Ufphemen. Nguyên tắc: Acid lactic + thuốc thử Uphemen (màu xanh tím) sẽ chuyển sang màu vàng rơm. + Thuốc thử Ufphemen: - Phenol 5% 10ml - FeCl3 2 – 5ml - Nước cất đủ 25ml Cách thực hiện: - Các chủng vi sinh vật probiotics được nuôi trong môi trường MRS lỏng ở370C trong 48h. - Ly tâm 6000 vòng/ phút trong 5 phút để loại bỏ tế bào và thu dịch nỗi. Sử dụng dịch nuôi cấy này để thử với thuốc thử Uphemen. + Ống đối chứng âm: 0,5ml môi trường nuôi cấy + 3ml thuốc thử. + Ống đối chứng dương: 0,5ml acid lactic 2% + 3ml thuốc thử. + Ống thử: 0,5ml dịch nuôi cấy + 3ml thuốc thử Kết quả: Quan sát và ghi nhận sự chuyển màu của thuốc thử [51-52]. 2.3.2.6. Phương pháp kiểm tra khả năng di động Mục đích : Phân biệt vi khuẩn di động (có tiên mao) và không di động (không có tiên mao). Tiến hành: Dùng que cấy có đầu nhọn cấy vi khuẩn theo kiểu chích sâu xuống môi trường thạch bán lỏng. Đặt ống nghiệm thẳng đứng, ủ ở mhiệt độ thích hợp và quan sát sau 1- 3 ngày. Kết quả : Vi khuẩn mọc lan rộng quanh vết cấy tức là chúng có khả năn di động. Vi khuẩn chỉ mọc theo vết cấy tức là chúng không có khả năng di động. 2.3.2.7. Thử nghiệm khả năng lên men đường Mục đích: Kiểm tra vi sinh vật có khả năng lên men loại đường nào. Các loại đường sử dụng là: glucose, lactose, mannitol, maltose, saccharose. Tiến hành: Môi trường MRS broth với lượng đường glucose lần lượt được thay thế các loại đường được kiểm tra. Phân môi trường vào các ống nghiệm, mỗi ống 10 ml. Đặt vào mỗi ống một nghiệm nhỏ (ống Durham) lộn ngược đầu để hứng khí CO2 sinh ra nếu vi khuẩn có khả năng lên men đường. Khử trùng trong 15 phút ở 1210C. Đường arabinose, xylose, và các đường kép cần được khử trùng riêng bằng màng lọc rồi mới bổ sung vào môi trường. Cấy vi khuẩn mới hoạt hóa vào các ống nghiệm, đặt ở 370C, theo dõi hiện tượng sinh acid sau 1– 3 ngày. Có trường hợp cần dùng paraffin để bịt kín nút bông và theo dõi trong 14- 30 ngày. Kết quả: Nếu vi khuẩn có khả năng lên men đường (sinh acid) chất chỉ thị BPB (Bromophenol Blue) sẽ chuyển màu vàng lục. 2.3.2.8. Phương pháp khảo sát khả năng kháng khuẩn Nguyên tắc: Dựa trên sự đối kháng trực tiếp của vi khuẩn lên men lactic với vi khuẩn chỉ thị ngay tại vị trí nhỏ vi khuẩn lên men lactic. Chuẩn bị: Dịch nuôi cấy E. coli qua 21h. Pha loãng 10-2 được nồng độ sử dụng là 105 tế bào/ ml. Dịch nuôi cấy LAB trong MRS lỏng 18- 24h, ở 370C. Đĩa môi trường BHI agar, sấy khô ở 600C. Tiến hành: Trải 0.1ml dịch chứa105 tế bào/ ml E. coli lên môi trường BHI agar (2%). Nhỏ 10 µl dịch nuôi cấy LAB lên bề mặt đĩa. Ủ hiếu khí, ở 370C trong 18- 24h. Kiểm tra sự tạo thành vòng kháng khuẩn, đo vòng kháng khuẩn. Đối chứng: nhỏ giọt môi trường MRS lỏng lên đĩa thạch, đánh dấu vị trí. So sánh với các vị trí giọt chứa LAB [31-32]. 2.3.2.9. Phương pháp khảo sát khả năng sinh bacteriocin Nguyên tắc: Dựa theo nguyên tắc khuếch tán qua giếng thạch được mô tả bởi Tag và cộng sự (1976). Phương pháp này dựa trên khả ăng đối kháng của các chất do vi khuẩn kiểm định tạo ra trong môi trường nuôi cấy đối với vi khuẩn chỉ thị. Nếu các chất do vi khuẩn kiểm định tạo ra có khả năng kháng vi khuẩn chỉ thị nó sẽ tạo vòng vô khuẩn sung quanh giếng thạch. Cách tiến hành: Các chủng vi khuẩn kiểm định được nuôi cấy ở 370C – 48h trong môi trường MRS lỏng 1% glucose. Li tâm 13000 vòng/ phút để loại bỏ sinh khối. Điều chỉnh pH dịch nỗi đến pH 6,5 bằng NaOH 1M, lọc vô trùng. Sử dụng dịch nỗi này như dung dịch bacteriocin thô và đem kiểm tra khả năng đối kháng như sau: + Đổ 15 ml môi trường MRS agar 1,5% vào đĩa petri vô trùng. + Bổ sung 200 µl chủng chỉ thị nuôi cấy qua đêm vào 7 ml môi trường agar 0,75% rồi phủ lên đĩa agar đã chuẩn bị. + Khi thạch đông, tiến hành đục lỗ tạo các giếng thạch có đường kính 9 mm. + Bơm 100 µl dịch bacteriocin thô vào giếng. + Ủ đĩa ở 370C trong 24 giờ. + Kiểm tra sự tạo thành vòng vô khuẩn. Đo đường kính vòng vô khuẩn. Nếu đường kính vòng vô khuẩn càng lớn chứng tỏ vi khuẩn chị thỉ càng nhạy với bacteriocin do vi khuẩn kiểm định tạo ra [68]. 2.3.2.10. Phương pháp xác định nhanh vi sinh vật probiotics bằng PCR (Polymerase Chain Reaction). A. Tách chiết DNA Tách chiết bằng EZNA Bacterial DNA kit Nguyên tắc: Phương pháp này cho phép tách DNA bộ gen vi khuẩn từ 3ml dịch nuôi cấy khi vi khuẩn được nuôi đến giai đoạn log phase (trong nhiều trường hợp có thể sử dụng dịch tế bào nuôi cấy qua đêm). Mối quan tâm hàng đầu trong quá trình tách chiết và thu nhận là làm thế nào để thu nhận nucleic acid nguyên vẹn không bị thủy phân bằng cơ học (lắc mạnh, nghiền...) hay thủy phân bằng enzyme. Các phương pháp tách chiết gồm 3 bước sau: Bước 1: Phá màng tế bào hoặc mô. Bước 2: Loại bỏ các thành phần không mong muốn. Bước 3: Thu nhận DNA. Chuẩn bị các dung dịch trước khi tiến hành tách chiết. Dung dịch proteinase: proteinase K hòa tan với 1,30ml đệm TE 1X pH 8. Bảo quản dung dịch ở -200C. Dung dịch lysozyme 50mg/ml: 50mg lysozyme hòa tan trong 1ml đệm TE 1X và bảo quản ở -200C. Đệm rửa DNA: Pha loãng đệm rửa DNA với ethanol bằng cách thêm 60ml ethanol (100%) vào dung dịch đệm cho sẵn. Cách tiến hành: Phá màng tế bào: Thu nhận tế bào vi khuẩn tối đa từ 3ml dịch nuôi cấy bằng cách li tâm 5000 vóng/ phút trong 5 phút ở nhiệt độ phòng. Loại bỏ dịch môi trường và huyền phù tế bào lại trong 180 µl TE. Thêm 20 µl dung dịch lysozyme 50mg/ml và ủ ở nhiệt độ phòng trong 10 phút. Lưu ý: Lượng enzyme cần và thời gian ủ có thể điều chỉnh tùy thuộc loài, chủng vi khuẩn. Sự thủy phân hoàn toàn vách tế bào thì cần thiết cho sự ly trích DNA hiệu quả. Ly tâm dịch tế bào đã thủy phân vách ở 6000 vòng/ phút trong 5 phút ở nhiệt độ phòng. Loại bỏ các thành phần không mong muốn: Huyền phù lại trong 200 µl đệm BTL. Thêm 25 µl dung dịch proteinase K. Vortex và ở 550C trong bể nước để đạt hiệu quả li trích hoàn toàn. Thông thường cần không quá 1h để li trích từ vi khuẩn. Nếu không có bể nước khuấy trộn, vortex mẫu sau mỗi 20 – 30 phút. Thêm 20 µl Rnase A (20 mg/ml) và ủ ở nhiệt độ phòng trong 2 phút. Thêm 220 µl đệm BDLvà trộn bằng vortex. Ủ ở 700C trong 10 phút. Một ít cặn có thể hình thành trong đệm BDL nhưng không ảnh hưởng đến sự thu hồi DNA. Thu nhận DNA: Thêm 220 µl ethanol tinh khiết và trộn bằng vortex. Lắp ráp một cột lọc DNA HiBind trong một ống thu nhận 2ml. Chuyển toàn bộ mẫu ở bước trên vào cột bao gồm bất kỳ chút cặn nào có thể hình thành. Li tâm 8000 vòng/ phút trong 1 phút. Loại bỏ ống thu nhận. Đặt cột vào ống 2 ml thứ 2 và rửa bằng pipet 650 µl đệm rửa DNA đã được pha loãng trong ethenol. Li tâm 8000 vòng/ phút trong 1 phút và sử dụng lại ống 2 ml. Rửa cột với 650 µl đệm rửa thứ 2 và li tâm như trên. Loại bỏ dịch và sử dụng lại ống 2ml. Sử dụng cùng ống 2 ml trống. Li tâm cột ở tốc độ lớn nhất 10000 vòng/ phút trong 2 phút để làm khô cột. Đặt cột vào ống li tâm nhỏ vô trùng loại 1,5 ml và thêm 100 µl nước vô trùng đã được làm nóng tới 700C hoặc đệm Tris 10 mM pH 8,5. Để ống ở nhiệt độ phòng trong 1 phút. Để hòa tan DNA từ cột lọc, li tâm 8000 vòng/ phút trong 1 phút. Lặp lại bước hòa tan với 100 µl nước nếu cần thiết. Bảo quản DNA thu được ở -200C. Lưu ý: Ủ cột DNA với 100 µl nước hoặc Tris đã được làm nóng ở 700C thì tốt hơn ở nhiệt độ phòng. B. Phản ứng PCR Nguyên tắc: DNA polymerase có thể tổng hợp mạch mới từ khuôn mẫu DNA. Khi enzyme này hoạt động chúng sẽ tổng hợp mạch mới theo khuôn mẫu bắt đầu từ một đoạn oligonucleotid mồi theo chiều 3’- 5’. Mồi là một đoạn oligonucleotid có khả năng bắt cặp với mạch khuôn. Như vậy nếu được cung cấp 2 mồi (mồi xuôi và mồi ngược) có khả năng bắt cặp chuyên biệt với 2 đầu của một trình tự DNA, phản ứng PCR có thể nhân bản trình tự của 2 mồi đó. Phản ứng PCR gồm 3 bước: + Bước 1: Biến tính (tách DNA mạch đôi thành mạch đơn) + Bước 2: Bắt cặp (mồi bắt cặp với bản mẫu) + Bước 3: Kéo dài (mạch mới được kéo dài từ mồi) Cứ 3 bước như vậy là một chu kì. Để tạo một lượng lớn DNA cần lặp lại nhiều chu kì và kết quả cuối cùng tạo được một lượng lớn bản sao trình tự cần. Thành phần phản ứng PCR: Khuôn mẫu DNA 5 µl dNTP 2,5 µl Mồi xuôi 0,25 µl Mồi ngược 0,25 µl Đệm (MgCl2) 5 µl Tag polymerase 0,5 µl Nước cất 11,5 µl Bổ sung thêm 20 µl dầu khoáng ở phía trên. Chu trình phản ứng PCR: Bước 1: 950C trong 5 phút. Bước 2: lặp lại 30 lần. + 950C trong 1 phút. + 550C trong 1 phút. + 720C trong 1 phút. Bước 3: 720C trong 1 phút. C. Phân tích sản phẩm trên Gel Nguyên tắc: Trong điện trường, các phân tử tích điện nằm trong pha lõng sẽ duy chuyển về các cực. Vận tốc di chuyển của các phân tử sẽ tùy thuộc vào tỉ lệ giữa điện tích và khối lượng của phân tử đó. Nếu các phân có cùng khối lượng, phân tử nào có điện tích lớn sẽ di chuyển về phía điện cựu trái dấu nhanh hơn. DNA là đại phân tử tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt nên khi chịu tác động của điện trường nó sẽ di chuyển về phía cực dương của điện trường. Điện di DNA thường được tiến hành trên giá thể bán rắn là gel. Môi trường này xốp có các lỗ nhỏ cho phép các phân tử DNA di qua, kích thước phân tử DNA càng lớn thì vận tốc di chuyển trong gel càng chậm. Vị trí của DNA trên bản gel sẽ được phát hiện bằng thuốc nhuộm ethidium bromide, chất này có khả năng gắn xen vào giữa các base của nucleic acid và dưới tác dụng của tia thử ngoại sẽ phát huỳnh quang. Để biết kích thước các trình tự DNA người ta sử dụng thang chuẩn, đó là tập hợp nhiều trình tự DNA có kích thước đã biết. Cách tiến hành: Chuẩn bị gel agarose 1,2%: Cân 0,3g agarose hòa tan trong 25ml dung dịch TAE 1X. Làm tan agarose. Để nguội đến khoảng 50 – 550C, bổ sung 1 µl ethidium bromide (10mg/ ml). Chuẩn bị bản điện di: Đỗ hỗn hợp agarose vào khay của bồn điện di. Để yên trong 45 phút, tháo lược và đỗ dung dịch điện di đầy bồn điện di. Nạp mẫu: 20 µl mẫu (sản phẩm PCR) + 1 µl dung dịch nạp mẫu (Loading Dye 6x), trộn đều. Bơm mẫu và thang chuẩn vào các giếng. Điện di với hiệu số điện thế 90 volt trong 45 phút. Quan sát kết quả với máy soi UV. Đối chiếu với thang chuẩn để xác đĩnh kích thước của sản phẩm PCR [52-57]. 2.4. QUY TRÌNH SẢN XUẤT SỮA UỐNG PROBIOTIC CỦA CÔNG TY YAKULT. 2.4.1. Nguyên liệu lên men Chủng vi sinh vật Hình 2.4.1.2. Giới thiệu chủng vi khuẩn sử dụng trong quá trình sản xuất - Lactobacillus casei Shirota: có tác động chủ yếu trên ruột non. - Bifidobacterium breve: tác động chủ yếu trên ruột già. Hình 2.4.1.2. Sữa bột gầy Hình 2.4.1.3. Đường Glusose Hình 2.4.1.4. Đường cát trắng 2.4.2. Nguyên liệu đóng gói Nguyên liệu chính: sản xuất chai bằng nhựa Polystyrene. Hình 2.4.2.1. Nhựa polystyren Hình 2.4.2.2. Phôi nhựa Hình 2.4.2.3. Nắp nhôm Hình 2.4.2.4. Phôi nhôm Hình 2.4.2.5. Bao bì (nhựa Opp) 2.4.3. QUY TRÌNH SẢN XUẤT Hình 2.4.3. Quy trình sản xuất sữa uống lên men Yakult (Nguồn: Công ty TNHH Yakult). Chú thích: Chuẩn bị nguyên liệu: Sữa bột, đường Glucose/ đường cát trắng. Bồn hòa tan: Làm tan bột sữa và đường Glucose/ đường cát trắng bằng nước nóng Thiết bị khử trùng: Khử trùng ở nhiệt độ cao để có nguồn sữa/ nước đường tiệt trùng. Bồn lên men: Cấy men Yakult vào bồn tiệt trùng khi đã làm nguội đến nhiệt độ thích hợp. Ủ 7 ngày lên men. Bồn nuôi cấy men: Khuẩn Lactobacillus Strain Shirota cấy vào bồn, ủ lên men tạo men Yakult. Men Yakult được cấy vào bồn lên men . Thiết bị đồng hóa: Sữa lên men được bơm qua thiết bị đồng hóa để thành sữa lên men đồng hóa. Bồn chứa nước đường tiệt trùng: Sữa lên men đồng hóa được bơm vào bồn và khuấy đều với nước đường tạo thành sữa đặc. Hệ thống xử lý nước. Bồn chứa nước tiệt trùng. Thiết bị trộn: sữa đặc trộn với nước để pha loãng thành sữa bán thành phẩm. Bồn chứa sữa bán thành phẩm. Máy ép nhựa: sản xuất vỏ chai Bồn chứa chai. Máy xếp chai. Máy in hạn sử dụng. Máy rót sữa, đóng nắp nhôm. Máy đóng gói 5 chai. Máy đóng gói hoàn chỉnh: đóng gói thành 50 chai. Kho lạnh. Xe đông lạnh, vận chuyển hàng. THUYẾT MINH QUY TRÌNH SẢN XUẤT Nước Sữa bột gầy Đường glucose Hòa tan Hòa tan Hạ nhiệt ( 250C ) Gia nhiệt Vi khuẩn lactic Đồng hóa Làm nguội Phối trộn Hoạt hóa Cấy men Lên men ( ủ 43 -450C / 7 ngày) Rót hộp Thành phẩm Hình 2.4.3.1. Sơ đồ thuyết trình quy trình sản xuất sữa uống lên men Yakult. Phòng quản lý chất lượng Phòng lên men Phòng lên men và pha trộn Phòng lựa chọn chai Phòng rót sữa Kiểm tra sản phẩm Hình 2.4.3.3. Giới thiệu một số hình ảnh trong quy trình sản xuất sữa uống lên men Yakult ( Nguồn Công ty TNHH Yakult). Bồn hòa tan : Trước tiên cho nước ở nhiệt độ 40 – 450C vào các nồi nấu, sau đó lần lượt cho sữa bột gầy, đường glucose vào các nồi riêng biệt khuấy đều cho tan, tạo dung dịch đồng nhất, đồng thời làm sữa bột không bị vón cục. Gia nhiệt: Nâng nhiệt độ dịch sữa, dịch đường ở các nồi nấu lên và giữ nhiệt trong 60 phút tạo điều kiện thuận lợi để casein bột sữa thủy phân, tăng khả năng giữ nước tốt, hạn chế sự tách nước, quện sữa mịn. Đồng thời làm đường glucose được hòa tan hết. + Tiếp tục nâng nhiệt độ lên 900C trong 5 phút để thanh trùng dịch sữa nhằm tiêu diệt vi sinh vật có hại có trong sữa. Ngoài ra thanh trùng còn có ý nghĩa tăng khả năng hydrate hóa của casein tạo cho sản phẩm có độ quện tốt, bền và không bị tách nước. Làm nguội: Dịch sữa sau khi gia nhiệt sẽ được làm nguội khi chuyển qua nồi lên men đến nhiệt độ cấy men 43 – 450C, tạo điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn lên men lactic hoạt động. Ngoài ra dịch đường cũng được làm nguội và chuyển qua bồn chứa để phối trộn với dịch sữa lên men. Cấy men: Men chứa vi khuẩn lactic sẽ được hoạt hóa và cấy vào bồn ủ với tỷ lệ 5% khuấy đều trong 10 phút, nhằm đảo trộn đều men lactic và dịch sữa để quá trình lên men diễn ra tốt và đồng đều. Sau đó để yên tạo điều kiện cho quá trình lên men. Quá trình ủ lên men kết thúc khi pH của dịch sữa đạt 4.65 – 4.75, kết hợp với khuấy nhẹ để phá vỡ thể đông tụ của sữa tạo thành dịch sữa lên men. Hạ nhiệt: Từ nhiệt độ 43 – 450C giảm đột ngột xuống 250C sẽ kìm hãm quá trình lên men tiếp tục của vi khuẩn lactic. Đồng hóa: Sữa lên men sẽ được bơm qua máy đồng hóa tạo thành sữa lên men đồng hóa . Tại đây với áp suất 200 bar sẽ giảm kích thước các cầu mỡ, phân bố chúng đồng đều trong dịch sữa, tránh hiện tượng nỗi lên của các cầu mỡ. Đồng thời tăng độ nhớt, độ quánh, sữa mịn và đồng nhất hơn, làm tăng chất lượng sản phẩm. Phối trộn: Dịch sữa lên men đồng hóa sẽ được phối trộn với dịch đường ở trên tạo thành sữa đặc, tùy theo nhà sản xuất thì dịch sữa đặc sẽ được pha loãng với nước ở các tỷ lệ khác nhau, tạo thành sữa bán thành phẩm. Rót hộp: Quá trình rót sản phẩm được thực hiện trên dây truyền thiết bị tự động và rót vào các hộp sữa, đóng nắp nhôm và dán nhãn tạo, cứ 5 chai thành một lốc. Sau đó đóng gói hoàn chỉnh thành một khối 50 chai và bảo quản trong kho lạnh nhiệt độ 0 – 50C trước khi xuất xưởng. 2.5. PHƯƠNG PHÁP KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG SẢN PHẨM 2.5.1. KỸ THUẬT PHÂN TÍCH CẢM QUAN THỰC PHẨM Thực phẩm đúng như tên gọi của nó là sản phẩm dùng để ăn, uống. Những việc liên quan đến ăn uống thì việc đánh giá, lựa chọn và sử dụng nó trước hết được xác định thông qua các cơ quan cảm giác. Các tính chất nhận biết bằng cơ quan cảm giác được gọi là các tính chất cảm quan. Các tính chất đó bao gồm: Tính chất về màu sắc: tính chất này được nhận biết bằng mắt. Tính chất này cảm nhận ngay khi tiếp xúc với sản phẩm. Tính chất này khá quan trọng trong việc lựa chọn thực phẩm. Tính chất về cấu trúc sản phẩm: tính chất này được nhận biết bằng xúc giác hay thính giác khi ta sơ,ø nắn hoặc nhai sản phẩm. Đây chính là các tính chất như rắn, mềm, nhớt, giòn, độ đồng đều... Tính chất về mùi: được nhận biết bằng các khứu giác khi tiếp xúc với thực phẩm khi ăn uống. Tính chất mùi đóng vai trò trong việc xác định các tính chất đặc trưng của sản phẩm, tác động đến việc có sử dụng đến sản phẩm hay không. Tính chất về vị, mùi vị: là tính chất nhận biết được trong miệng khi ăn hoặc uống sản phẩm. Tính chất này khá quan trọng vì nó biểu thị bản chất của sản phẩm, cho ta biết được thành phần hóa học của sản phẩm. Bảng 2.5.1. Tiêu chuẩn cảm quan đối với sản phẩm sữa chua Yoghurt ( TCVN 7030:2002). TÊN CHỈ TIÊU YÊU CẦU Sữa chua bán lỏng Sữa chua lỏng MÀU SẮC Màu trắng sữa hoặc màu đặc trưng của phụ liệu bổ sung Màu trắng đục hoặc màu đặc trưng của phụ liệu bổ sung MÙI VỊ Vị chua và mùi vị đặc trưng cho từng loại sản phẩm Vị chua và mùi vịđđặc trưng cho từng loại sản phẩm TRẠNG THÁI Dạng bán lỏng Dạng lỏng 2.5.2. TIÊU CHUẨN HÓA LÝ Bảng 2.5.2. Tiêu chuẩn hóa lý đối với sản phẩm sữa chua Yoghurt(TCVN 7030:2002) TÊN CHỈ TIÊU MỨC YÊU CẦU Sữa chua Sữa chua đã tách béo một phần Sữa chua gầy 1. Hàm lượng chất khô không chứa chất béo, % khối lượng không nhỏ hơn 8,2 8,2 8,2 2. Hàm lượng chất béo, % khối lượng > 2,0 0,5 – 2 < 0,5 3.  Độ axit, 0T 75 - 140 2.5.3. PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CHỈ TIÊU VI SINH Bảng 2.5.3. TIÊU CHUẨN VI SINH TÊN CHỈ TIÊU MỨC CHO PHÉP Không xử lí nhiệt Xử lí nhiệt 1.  Tổng số vi sinh vật hiếu khí, số khuẩn lạc /1 g 104 10 2.  Nhóm coliform, số vi khuẩn /1 g 10 0 3. Staphylococcus aureus, số vi khuẩn / 1 g 0 0 4.  E.Coli, số vi khuẩn / 1 g 0 0 5.  Salmonella, số vi khuẩn / 25 g 0 0 6.  Nấm men và nấm mốc, số khuẩn lạc / 1 g 10 0 2.5.3.1. Phương pháp xác định vi sinh vật tổng số hiếu khí Nguyên tắc: Vi khuẩn hiếu khí là những vi khuẩn tăng trưởng và hình thành khuẩn lạc trong điều kiện có sự hiện diện của oxy phân tử. Tổng số vi khuẩn hiếu khí hiện diện trong mẫu chỉ thị mức độ vệ sinh của thực phẩm. Chỉ số này được xác định bằng phương pháp xác định bằng phương pháp đếm khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch dinh dưỡng từ một lượng mẫu xác định trên cơ sở xem một khuẩn lạc là sinh khối phát triển từ một tế bào hiện diện trong mẫu và được biểu hiện dưới dạng số đơn vị hình thành khuẩn lạc (colony forming unit, CFU) trong một đơn vị khối lượng thực phẩm. Chỉ tiêu tổng số vi sinh vật hiếu khí được dùng để đánh giá chất lượng của mẫu hoặc sản phẩm về vi sinh vật, nguy cơ hư hỏng, mức độ vệ sinh trong quá trình chế biến và bảo quản sản phẩm. Cách tiến hành: Chuẩn bị môi trường: + Môi trường sử dụng là Phate Count Agar (PCA) có pH = 7,0. Hấp khử trùng ở 1210C trong 15 phút. + Dung dịch nước muối pepton SPW (Saline Pepton Water): dùng để pha loãng mẫu chứa 8,5g NaCl và 1g pepton trong 100ml nước. Hấp khử trùng ở 1210C trong 15 phút. Chuẩn bị mẫu: + Đối với mẫu dạng rắn: Dùng các dụng cụ như kéo, kẹp đã được khử trùng và cân chính xác 25g mẫu vào bao PE. Tất cả các thao tác cần được tiến hành trong điều kiện vô trùng. Thêm vào lượng mẫu này 225ml dung dịch pha loãng SPW. Thực hiện đồng nất mẫu bằng máy dập mẫu (stomacher), thời gian dập mẫu không quá 2 phút. + Đối với mẫu dạng lỏng: hút 25ml cho vào bình tam giác chứa 225ml dung dịch SPW đã hấp khử trùng, lắc đều. Đồng nhất mẫu trong 30 giây, thu được dung dịch mẫu có độ pha loãng 10-1. Pha loãng mẫu: Pha loãng trong nước muối sinh lí để đạt các nồng độ pha loãng 10-2, 10-3, 10-4. Cấy mẫu: Từ mỗi độ pha loãng cấy 1ml trên 2 đĩa petri vô trùng, sau đó đổ môi trường PCA đã được làm nguội đến 450C. Lắc đều và chờ đĩa thạch nguội, úp ngược và đem ủ ở 300C trong 72h. A = N/ n1 * V1 * f1 +...+ ni * Vi * fi Đọc kết quả: Bằng cách đếm tất cả các khuẩn lạc xuất hiện trên các đĩa sau khi ủ. Chọn các đĩa có số đếm từ 25 – 250 khuẩn lạc để tính kết quả. Mật độ tổng số vi khuẩn hiếu khí được tính như sau: Trong đó: A (cfu/g hay cfu/ml): Số tế bào vi khuẩn trong 1g hay 1ml mẫu. N: Tổng số khuẩn lạc đếm được. ni: Số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i. V: Thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào trong mỗi đĩa. fi: Độ pha loãng tương ứng. 2.5.3.2. Phương pháp xác định tổng số Coliforms Môi trường sử dụng: Môi trường Tryptone Soya Agar (TSA). Violet Red Bile Agar (VRB) Brilliant Green Bile Lactose broth (BGBL) Quy trình phân tích: Đồng nhất mẫu: Cân 25g mẫu + 225ml SPW( Saline Peptone Water) tiến hành đồng nhất mẫu trong 30 giây, với độ pha loãng 10-1. Pha loãng mẫu: Pha loãng trong nước muối sinh lí để đạt các nồng độ pha loãng 10-2, 10-3, 10-4. Cấy mẫu: Từ mỗi độ pha loãng cấy 1ml trên 2 đĩa petri vô trùng, sau đó đổ môi trường TSA đã được làm nguội đến 450C và chờ trong 30 phút. Sau đó đỗ môi trường VRB lên môi trường TSA. Ủ ở 370C trong 24h. Đọc kết quả: Chọn và đếm các khuẩn lạc có màu đỏ đến đỏ sậm, có quầng tủa muối mật, đường kính > 0.5 mm. Ở mỗi đĩa chọn 3 – 5 khuẩn lạc đặc trưng cấy sang môi rường BGBL . Ủ ở 370C trong 24h, sau đó ghi nhận kết quả. Tỷ lệ xác nhận R: A = N* R/ nvf R = số khuẩn lạc sinh hơi trong BGBL/ Số khuẩn lạc đã cấy. Tính toán số lượng: Trong đó: A (cfu/g hay cfu/ml): Số tế bào vi khuẩn trong 1g hay 1ml mẫu. N: Tổng số khuẩn lạc đếm được. n: Số lượng đĩa cấy. V: Thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào trong mỗi đĩa. f: Độ pha loãng tương ứng. R: Hệ số khẳng định 2.5.3.3. Phương pháp định tính E. coli Môi trường sử dụng: Môi trường Tryptone Soya Agar (TSA). Môi trường EMB. Canh (BGBL). Canh Trypton. Canh MR- VP. Thạch Simmon Citrate. Thuốc thử Kovac’s. Thuốc thử Methyl Red. Thuốc thử α- naphol 5% KOH 40%. Quy trình phân tích mẫu: Đồng nhất mẫu: Cân 25g mẫu + 225ml SPW( Saline Peptone Water) tiến hành đồng nhất mẫu trong 30 giây, với độ pha loãng 10-1. Cấy mẫu: Lấy 1ml mẫu ở độ pha loãng 10-1 cho vào môi trường BGBL. Ủ ở 440C trong 24h. Chọn các ống sinh hơi cấy truyền sang môi trường EMB. Mẫu không sinh hơi được gọi là âm tính E. coli .Ủ ở 370C trong 24h. Chọn khuẩn lạc đặc trưng E. coli trên EMB: tròn lồi, đường kính < 0,5 mm, có ánh kim tím. Cấy truyền sang TSA, ủ ở 370C trong 24h. Sau đó cấy vào môi trường 1 trypton, 2 MR- VP, 1 Simmons Citrate. Ủ ở 370C trong 24h. Sử dụng các loại thuốc thử để test thử nghiệm IMVIC. Phản ứng sinh Indol: Kết quả (+) có màu đỏ cánh sen, (-) không màu. Thử nghiệm Methyl Red: Kết quả (+) có màu đỏ do có sự tạo thành acid và duy trì sản phẩm acid, (-) không màu do không duy trì sản phẩm acid. Thử nghiệm Voges – Proskauer: Kết quả (+) có màu nâu đỏ. Thử nghiệm Citrate: Kết quả (+) khi chuyển màu từ xanh lá qua xanh dương. Kết luận: không có sự hiện diện của E. coli khi các test thử nghiệm - Indol (+) - Methyl Red (+) - Voges – Proskauer (-) - Citrate (-) 2.5.3.4. Định lượng Starphilococcus aureus Môi trường sử dụng: - Môi trường Baird Parker (BP). - Môi trường TSA . - Huyết tương thỏ. Quy trình thực hiện: Đồng nhất mẫu: Cân 25g mẫu + 225ml SPW( Saline Peptone Water) tiến hành đồng nhất mẫu trong 30 giây, với độ pha loãng 10-1. Cấy mẫu: Lấy 1ml mẫu ở độ pha loãng 10-1 cho vào môi trường BP có bổ sung egg yolk. Tiến hành cấy trang và ủ ở 370C trong 48h. Chọn khuẩn lạc đặc trưng của St. Aureus: tròn lồi, có tâm đen và có quầng sáng bao quanh. Chọn 5 khuẩn lạc cấy chuyển trên môi trường TSA. Sau đó cấy chuyển vào ống nghiệm chứa 0,2 ml huyết tương thỏ. Ủ ở 370C và theo dõi sau 2, 4, 6, 8 giờ. Nếu không có biểu hiện ngưng kết tiếp tục ủ đến 24 giờ. Xác định tỷ lệ ngưng kết R. Kết quả: Dương tính (+): làm môi trường huyết tương thỏ đông tụ. S = N* R/ nvf Âm tính (-): làm môi trường huyết tương thỏ đông tụ. Tính toán kết quả: S (cfu/g hay cfu/ml): Số tế bào vi khuẩn trong 1g hay 1ml mẫu. N: Tổng số khuẩn lạc đếm được. n: Số lượng đĩa cấy. V: Thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào trong mỗi đĩa. f: Độ pha loãng tương ứng 2.5.3.5. Xác định Salmonella Môi trường sử dụng: - Môi trường canh RV (Rappaport Vassiliadis) - Môi trường XLD . - Môi trường TSA. - Môi trường TSI. - Môi trường Mannitol Phenol Red broth. - Môi trường Urea broth. - Môi trường LCD. Quy trình thực hiện: Đồng nhất mẫu: Cân 25g mẫu + 225ml SPW( Saline Peptone Water) tiến hành đồng nhất mẫu trong 30 giây, với độ pha loãng 10-1. Đem ủ ở 370C trong 24 giờ. Lấy 0,1ml canh trường cho vào 10 ml môi trường RV. Ủ ở 420C trong 24h. Sau đó cấy chuyển trên môi trường XLD và ủ ở 370C trong 24h. Khuẩn lạc đặc trưng của Salmonnella trên XLD: tròn, lồi, trong suốt, có tâm đen đôi khi tâm đen quá lớn bao trùm khuẩn lạc, môi trường xung quanh chuyển sang màu đỏ. Cấy chuyển sang môi trường TSA, ủ ở 370C trong 24h. Sau đó cấy truyền sang môi trường thử nghiệm sinh hóa: môi trường TSI, Mannitol Phenol Red broth, Urea broth, LCD broth.Ủ ở 370C trong 24h. Kết quả: Nếu có sự hiên diện của Salmonnella. Trên môi trường TSI: đỏ/ vàng/ H2S / sinh ga (+). Mannitol : dương tính (+) Urea : âm tính LDC: dương tính. 2.5.3. PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG ACID LACTIC Nguyên tắc: Định lượng acid lactic bằng cách xác định độ chua Therner và tính hàm lượng mg acid lactic có trong 100ml (hay 100g) mẫu. Độ Therner: là số ml dung dịch NaOH 0,1N dùng để chuẩn độ 100ml mẫu. Cách tiến hành: Hút 20 ml mẫu định mức đến 100ml bằng nước cất, lắc đều. Nhỏ 2 – 3 giọt chất chỉ thị màu phenolphtalein 1%, sau đó lắc đều và đem đi chuẩn độ. Chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0,1N cho đến khi xuất hiện màu hồng nhạt và bền trong 30 giây. Tính toán kết quả: X = N × 0,009 × 100/ P X: Lượng acid lactic có trong 100ml mẫu. N: Số ml NaOH đã chuẩn. P: Trong lượng mẫu. 2.5.4. PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH BACTERIOCIN AU/ml = Dfi x (1/ Vbacteriocin) Xác định hoạt tính bacteriocin (AU/ ml ) theo phương pháp pha loãng hai lần liên tiếp (Schilliner và Rest). Xác định độ pha loãng cao nhất cho thấy vòng vô khuẩn và xác định hoạt tính bacteriocin (AU/ml ) của dịch lên men: AU: đơn vị hoạt tính. DfI: độ pha loãng cao nhất có vòng ức chế. Nguyên tắc: Xác định khả năng kháng khuẩn của dịch bacteriocin: bằng phương pháp khuếch tán trên thạch. Phương pháp này dựa trên sự đối kháng giữa vi sinh vật kiểm định và vi sinh vật chỉ thị. Thực hiện: Chủng vi khuẩn kiểm định được nuôi cấy trong môi trường MT1 ở 300C, kỵ khí, 24 giờ. Ly tâm 13000 vòng/ phút trong 20 phút ở 40C, thu nhận dịch nỗi. Điều chỉnh pH dịch nỗi đến pH 6,5 bằng NaOH 1M. Sử dụng dịch nỗi này như bacteriocin thô, đem kiểm tra khả năng đối kháng như sau: + Đổ 15 ml môi trường vào đĩa petri vô trùng. Để thạch đông. + Trải 10 µl dịch nuôi cấy qua đêm chủng chỉ thị. + Đục lỗ có đường kính 5 mm trên thạch. + Bơm 70 µl dịch bacteriocin thô vào lỗ thạch. + Ủ đĩa ở 370C , 12 giờ. + Kiểm tra sự tạo thành vòng vô khuẩn. Đo đường kính vòng vô khuẩn [101] CHƯƠNG III: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Trong cuộc sống hiện đại, con người luôn phải đối mặt với các tác nhân từ môi trường sống, việc lạm dụng thuốc kháng sinh, chế độ ăn uống không hợp lý, uống nhiều rượu bia, hút thuốc lá, mất ngủ, trầm cảm... Đây chính là các yếu tố làm dẫn đến mất sự cân bằng các hoạt động sống vốn có của cơ thể, như việc làm suy giảm hệ miễn dịch, rối loạn chức năng đường ruột. Nếu sự mất cân bằng này kéo dài sẽ dẫn đến các hệ lụy của nó như xuất hiện các chứng bệnh mãn tính về tim mạch, tiêu hóa, miễn dịch, đặc biệt là xuất hiện các khối ung thư... Vì vây việc nghiên cứu và tìm hiểu về thực phẩm probiotic cần được quan tâm nhiều hơn, góp phần giúp ích cho con người trong việc điều trị và phòng ngừa bệnh tật bằng cách bổ sung các sản phẩm probiotic vào thực phẩm hay dược phẩm thay thế cho các liệu pháp kháng sinh và xạ trị nhằm giảm chi phí và làm tăng hiệu quả trong việc chữa trị hay phòng ngừa bệnh tật. KIẾN NGHỊ Cần tìm hiểu sâu hơn về các cơ chế hoạt động miễn dịch và các yếu tố ảnh hưởng như sự ảnh hưởng của pH thấp, dịch mật, dịch vị và khả năng kháng một số vi khuẩn gây bệnh... Dựa vào sự các kết quả nghiên cứu thực nghiệm từ đó sẽ có cơ sở khoa học cho việc phân lập và định danh một số chủng vi sinh vật probiotics tiềm năng và khi đó sản phẩm tạo ra sẽ có độ tin cậy cao. Có thể phối hợp vi khuẩn probiotics tiềm năng với một loại vi khuẩn khác như Bacillus subtilis để tạo sản phẩm yaout đậu nành hay thức uống lên men có hoạt tính chức năng và bổ trợ tiêu hóa. Bằng cách dựa vào hoạt tính phân giải mạnh của hệ enzyme amylase và protease của vi khuẩn Bacillus subtilis phân giải cơ chất đậu nành Việc sử dụng nguyên liệu đậu nành làm nguồn cung cấp nguồn protêin và khoáng chất đang rất được quan tâm, trong đậu nành có chứa đầy đủ các acid amin thiết yếu cần thiết cho sự phát triển của cơ thể. Vi khuẩn lactis trong sản phẩm này gồm có hai mục đích chính: thứ nhất là tạo sản phẩm có hoạt tính Probiotics và thứ hai là dùng vi khuẩn lactic để tăng thời gian bảo quản sản phẩm. Khi tiêu thụ sản phẩm vào cơ thể, Bacillus subtilis có nhiệm vụ trong hệ tiêu hóa là tiết các enyme Protease và Amylase phân hủy protein và tinh bột. Đồng thời vi khuẩn lactis sẽ hoạt động tạo acid lactic làm pH môi trường giảm xuông nhằm ức chế và tiêu diệt vi khuẩn có hại giúp cân bằng hệ vi sinh hiện diện trong đường ruột. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt [1] Hoàng Thị Diễm, 2005. Phân lập - xác định và khảo sát một số đặc điểm Probiotics của Lactobacillus trong điều kiện invitro. Luận văn thạc sĩ ngành sinh học, Chuyên ngành vi sinh. Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên. TPHCM. Trang 11-19, 49-52. [2] Nguyễn Thúy Hương, Trần Thị Tưởng An. Thu nhận bacteriocin bằng phương pháp lên men bởi tế bào Lactococcus lactic cố định trên chất mang celulose vi khuẩn (BC) và ứng dụng trong bảo quản thịt tươi xơ chế tối thiểu. Báo cáo khoa học. Trường Đại Học Bách Khoa, ĐHQG. TPHCM. Tạp chí phát triển KH&CN, TẬP 11, SỐ 09 – 2008. Trang 101. [3] TS. Nguyễn Hoài Hương và nhóm cộng sự, 2009. Báo cáo đề tài nghiên cứu khoa học cấp trường Phân lập và tuyển chon vi khuẩn lên men lactic làm chế phẩm probiotic. Trang 7-8, 31-32. [4] PGS. TS Nguyễn Tiến Thắng. Giáo trình Công nghệ enzyme. Lưu hành nội bộ trường Đại Học Kỹ Thuật Công Nghệ. TPHCM. Trang 63. [5] Phạm Thị Aùnh Hồng, 2003. Kỹ thuật sinh hóa. Nhà xuất bản Đại Học Quốc Gia TP.HCM. [6] Trần Linh Thước, 2003. Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mỹ phẩm, NXB Giaó Dục. [7] Công ty TNHH YAKULT. Đường số 5- Đại lộ Tự Do- Khu Công Nghiệp Việt Nam Singapore (VSIP)- Huyện Dĩ An- Tỉnh Bình Dương. [8] http:/www.spsvietnam.gov.vn/pages/thucpham-suavasanphamsua.aspx. [8] http:/wwwvinamilk.com.vn/?vnm=newdetai&id=1360. Tài liệu Tiếng Anh [10] Arici M, Bilgin B, Sagdic O. And Ozdermir C. (2004). “Some characteristics of Lactobacillus isolates from infant faceces” Food Microbiology 21.