Khóa luận Tuyển non dòng vô tính cao su (Hevea brasiliensis Muell. Arg.) kháng bệnh rụng lá Corynespora (Corynespora Leaf Fall Disease)

trên (mặt trên của lá tiếp xúc với tấm lưới sắt). Dùng micropipette hút dịch bào tử đã qua lưới lọc, nhỏ lên hai bên gân chính của lá, mỗi bên 4 giọt (1 giọt = 20 µl). Sau khi lây nhiễm, đặt các hộp plastic dưới ánh sáng đèn huỳnh quang 12 giờ/ngày. Nhiệt độ phòng 26 ± 2ºC. 24 c. Các chỉ tiêu, chu kỳ theo dõi và cách phân cấp mức độ bệnh.  Chỉ tiêu theo dõi Ghi nhận cấp bệnh (gồm 4 cấp từ 0 – 3) trên mỗi mẫu lá dựa vào số lượng và diện tích vết bệnh như Hình 3.1. Hình 3.1: Minh họa phân cấp bệnh trên mẫu lá nguyên (Nguồn: Bộ môn BVTV – VNCCSVN). Theo dõi 3 lần vào các thời điểm 5, 7 và 10 ngày sau khi lây nhiễm. Cấp bệnh dựa theo bảng phân cấp bệnh đang sử dụng tại Bộ môn BVTV – VNCCSVN (Bảng 3.1). Bảng 3.1: Bảng phân cấp bệnh gây bệnh nhân tạo trên mẫu lá nguyên Cấp bệnh Triệu chứng Cấp 0 Cấp 1 Cấp 2 Cấp 3 Không bệnh Lá có màu hơi ngăm đen ngay bên dưới giọt dung dịch bào tử Vết bệnh lan rộng và rõ nhưng chưa có sợi nấm Vết bệnh lan rộng và rõ, xuất hiện nhiều sợi nấm (Nguồn: Bộ môn BVTV – VNCCSVN).  Phân hạng thống kê mức độ bệnh sau 10 ngày lây nhiễm theo cách tính sau: Rất nặng: X ≥ + 25 Nặng: ≤ X < + Trung bình: – ≤ X < Nhẹ: X ≤ – Trong đó: X: cấp bệnh của mỗi dvt. : cấp bệnh trung bình của 60 dvt. : độ lệch chuẩn quần thể. d. Xử lý số liệu: sử dụng phần mềm MS – Excel. 3.2.3.3. Thời gian và địa điểm thực hiện Thời gian thực hiện: từ 15/03 – 30/05/2007. Địa điểm thực hiện: Phòng Thí nghiệm Bộ môn BVTV – VNCCSVN. 3.2.4. Phƣơng pháp đo hoạt tính peroxidase (POD) từ lá của một số dvt cao su Thưc̣ hiêṇ theo phương pháp của Thankamony và Philip (2006). 3.2.4.1. Mục đích Khảo sát mối quan hệ giữa hoạt tính peroxidase và tính kháng CFLD trên một số dvt cao. 3.2.4.2. Vật liệu, dụng cụ và hoá chất a. Vật liệu và dụng cụ Mẫu lá cao su bị bệnh rụng lá Corynespora và mẫu lá sạch bệnh lấy tại Vườn Sơ tuyển 03 – VNNCSVN. Máy đo quang phổ DR 5000, cối, chày, đá lạnh, micropipette các loại, eppendorf, cân điện tử, kéo, nước cất 2 lần, máy ly tâm lạnh, autoclave, tủ sấy, tủ lạnh. b. Hoá chất:Phosphate buffer 0,1 M (pH = 7,0), dung dịch guaiacol 20 mM, dung dịch H2O2 4,2%. 3.2.4.3. Phƣơng pháp  Bố trí thí nghiệm Từ 60 dvt sau khi gây bệnh nhân tạo, chia thành 4 cấp bệnh, từ mỗi cấp bệnh chọn ngâũ nhiên 3 dvt để xác định hoạt tính POD. 26 Kiểu thí nghiệm: hoàn toàn ngẫu nhiên (CRD). Số nghiệm thức: 12 (12 dvt), trong mỗi nghiệm thức gồm 2 yếu tố: hoạt tính POD trên mẫu lá bệnh và mẫu lá không bệnh (đối chứng), mỗi yếu tố lặp lại 3 lần. Tổng số mẫu: 72.  Điều kiện thí thiệm: ly trích enzyme ở điều kiện lạnh (khoảng 4ºC), bảo quản enzyme ở 0 – 4ºC, đo hoạt tính enzyme ở 25ºC.  Phương pháp ly trích peroxidase từ lá cao su.  Phương pháp đo hoạt tính peroxidase Phương pháp Cho 3 ml dung dịch buffer + 0,05 ml dung dịch guaiacol + 0,1 ml dung dịch enzyme + 0,03 ml dung dịch hydrogen peroxide (H2O2) vào trong cuvette. Trộn đều và đặt cuvette vào trong máy đo quang phổ kế. Đo ở bước sóng 436 nm. Thêm 3ml phosphate buffer Cân 1 gam mẫu lá, cắt nhỏ, cho vào cối Cho dịch nghiền vào eppendorf Ly tâm 18.000 vòng/15 phút ở 5ºC. Thu dịch nổi, cất giữ enzyme ở 0 – 4ºC. Nghiền trong điều kiện lạnh Mẫu lá bệnh (hoặc mẫu đối chứng), rửa 2 lần với nước cất 2 lần 27 Chỉ tiêu quan sát Sau khi đặt cuvette vào máy đo quang phổ. Ghi nhận thời gian cần để sự hấp thu tăng thêm 0,05 ( t). Họat tính enzyme được tính theo công thức sau: Trong đó: 3,18: thể tích cuối (ml). 0,1: lượng enzyme đem đo (ml). 1000: đổi đơn vị ml sang lít. 6.39: tương đương với 1 đơn vị enzyme tạo thành ở bước sóng 436 nm. 1: độ dài ánh sáng đi qua cuvette (cm2).  Xử lý số liệu: sử dụng phần mềm MS – Excel và Statgraphics Ver. 7.0. 3.2.4.4. Thời gian và địa điểm tiến hành thí nghiệm Thời gian thực hiện: 01/06 – 10/07/2007. Địa điểm thực hiện: Phòng Thí nghiệm Công Nghệ Sinh Học, Phòng Thí nghiệm của Trung Tâm Công Nghệ Cao Su – VNCCSVN. 3.2.5. Phƣơng pháp đếm số lƣợng khí khổng trên lá của một số dvt cao su Thực hiện theo phương pháp của Nguyễn Thị Kim Linh (2005). 3.2.5.1. Mục đích Khảo sát mối quan hệ giữa mật độ khí khổng và tính mẫn cảm đối với CLFD của một số dvt cao su. 3.2.5.2. Hoá chất và dụng cụ Hoá chất collodium, đũa thuỷ tinh, lame, lamelle, kính hiển vi quang học. Mẫu lá sạch bệnh của 12 dvt được chọn ra từ 4 cấp bệnh, mỗi cấp bệnh 3 dvt sau khi đánh giá khả năng kháng bệnh rụng lá Corynespora. 3.2.5.3. Phƣơng pháp  Bố trí thí nghiệm: Từ 60 dvt cao su sau khi gây bệnh nhân tạo in vivo, phân về 4 cấp bệnh, mỗi Hoạt tính enzyme (đơn vị / lít) 28 cấp bệnh chọn ra 3 dvt để tiến hành đếm mật độ khí khổng. Kiểu thí nghiệm: hoàn toàn ngẫu nhiên (CRD). Số nghiệm thức: 12 (12 dvt), đơn yếu tố (số lượng khí khổng trên mẫu lá sạch bệnh), số lần lặp lại 3 (1 lần lặp lại là một vị trí đếm trên 1 lá/1 dvt). Tổng số mẫu: 36.  Phương pháp tiến hành Thoa một lớp mỏng collodium (khoảng 1cm2) ở mặt dưới của lá cao su. Đợi cho collodium khô, bóc ra đem quan sát dưới kính hiển vi giữa hai lớp lam và lamelle. Đếm số khí khổng thấy được trong diện tích thị trường vật kính X40.  Xử lý số liệu: sử dụng phần mềm MS – Excel và Statgraphics Ver. 7.0. 3.2.5.4. Thời gian và địa điểm tiến hành thí nghiệm Thời gian thực hiện: 10/07 – 30/07/2007. Địa điểm thực hiện: Phòng Thí nghiệm Bộ môn BVTV – VNCCSVN. 29 Chƣơng 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Tình hình bệnh rụng lá Corynespora tại Lai Khê Bệnh rụng lá Corynespora do nấm Corynespora cassiicola (Berk. and Curt.) Wei., họ Moniliales gây ra, xuất hiện lần đầu tiên ở nước ta vào năm 1999 tại Lai Khê, Lai Hưng, Bến Cát, Bình Dương. Triệu chứng bệnh ban đầu khá đặc trưng như trên lá già là dạng xương cá dọc theo gân chính và gân phụ, lá chuyển dần sang màu đỏ cam, trên lá non là những vết tròn có tâm mỏng như giấy, bao quanh vết bệnh là vòng màu nâu hoặc đen có quầng vàng ở ngoài, đôi khi hình thành lỗ thủng tại tâm vết bệnh... Nước ta nằm trong vùng nhiệt đới, khí hậu nóng ẩm và lượng mưa nhiều đó là điều kiện rất thuận lợi cho nấm gây CLFD phát triển cả về mức độ lẫn quy mô, đồng thời cũng có những biến đổi lớn về triệu chứng bệnh, kích thước vết bệnh và vị trí gây bệnh. Mặt khác, cũng tùy theo tính mẫn cảm của từng dvt, tuổi lá, thời điểm nấm xâm nhiễm hoặc yếu tố môi trường đối với mầm bệnh mà chúng hình thành những triệu chứng không đặc trưng làm cho chúng ta khó xác định trực tiếp ngoài đồng ruộng mà phải đem về phòng thí nghiệm quan sát hình thái bào tử qua kính hiển vi. Có một số triệu chứng không đăc̣ trưng của bệnh rụng lá Corynespora dễ gây nhầm lẫn với một số bệnh khác nhưng nếu quan sát kỹ vẫn có thể phân biệt được. Ví dụ, triệu chứng quăn đầu lá gần giống như bệnh héo đầu lá do nấm Colletotricum gloeosporioides (Penz) gây ra, điểm khác biệt lớn là bề mặt các đốm bệnh bằng phẳng, không có u lồi và có những viền màu nâu được bao quanh bởi quầng vàng. Một số triệu chứng CLFD tại Vườn Dư ̣án giống cao su Quốc gia – Lai Khê, Lai Hưng, Bến Cát, Bình Dương (Hình 4.1a và Hình 4.1b). 30 Hình 4.1a: Một số triệu chứng bêṇh ruṇg lá Corynespora trên lá non Hình 4.1b: Một số triệu chứng bêṇh ruṇg lá Corynespora trên lá già Qua các đợt điều tra của Bộ môn BVTV tại các Vườn Sơ tuyển của VNCCSVN (Bảng 4.1) cho thấy hầu hết các vườn này đều bị nấm C. cassiicola tấn công và không một dvt nào có được tính kháng hoàn toàn với bệnh, 100% dvt trên Vết tròn có viền nâu được bao quanh bởi quầng vàng Cháy phiến lá Quăn đầu lá Dạng xương cá Lá biến dạng tạo lỗ trên vết bệnh 31 vườn đều nhiễm bệnh Corynespora ở mức độ mẫn cảm khác nhau. Tuy nhiên, trên cuống và chồi rất ít gặp, bệnh gây trên lá là chủ yếu. Bảng 4.1: Kết quả điều tra CLFD ở vƣờn sơ tuyển 03 và 04 tại Lai Khê Tên vƣờn Ngày điều tra Số dvt Số dvt nhiễm bệnh Vườn sơ tuyển 2003 Từ ngày 18/04/2006 đến 08/08/2006 72 72 Vườn sơ tuyển 2004 76 76 (Nguồn: Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật – VNCCSVN). Thực tế cho thấy, bệnh đã phát triển rất mạnh và hình thành nhiều triệu chứng khác nhau nếu không có biện pháp quản lý chặt chẽ thì bệnh sẽ có khả năng tích lũy và có cơ hội gây hại trên diện tích lớn cao su trong nước. 4.2. Kết quả phân lập Sau 2 – 3 ngày đặt mẫu bệnh (5 mm x 5 mm) trên môi trường PDA, từ mẫu bệnh sẽ xuất hiện sợi nấm mọc lan ra môi trường. Tiến hành tách một phần môi trường có sợi nấm sang đĩa môi trường khác, tiếp tục nuôi cấy ở điều kiện nhiệt độ phòng. Sau 3 – 4 ngày có thể xác định được sơ bộ nấm đó có phải là C. Cassiicola hay không nhờ những đặc điểm đó là khuẩn lạc có màu xám, mặt dưới đĩa petri có màu đen (màu của độc tố được tiết ra môi trường). Làm tiêu bản bào tử và quan sát dưới kính hiển vi quang học, so sánh với những mô tả của Ellis và Holiday (1971) để có thể khẳng định chắc chắn rằng mẫu nấm thu được là C. cassiicola. Khi đã có nguồn nấm thuần chủng, tiến hành nhân số lượng bào tử C. cassiicola để thực hiện thí nghiệm lây bệnh nhân tạo. Trên môi trường nhân tạo nấm C. cassiicola rất khó tạo bào tử. Do vậy, để thu được số lượng lớn bào tử C. cassiicola phục vụ cho việc lây bệnh nhân tạo cần tiến hành kích thích sợi nấm sinh bào tử theo phương pháp của Chee (1988) và các tác giả khác được mô tả như sau: Đặt các đĩa petri này trong tối 5 ngày liên tiếp để sợi nấm phát triển, dùng lamelle cạo nhẹ trên bề mặt của khuẩn lạc để kích thích sợi nấm tạo bào tử. Tiếp tục đặt dưới ánh sáng đèn huỳnh quang liên tục trong 3 ngày. Sau 8 ngày nhân số lượng bào tử nấm C. cassiicola trên môi trường nhân tạo. 32 tiến hành tách bào tử từ các đĩa nấm nguồn (cho vào mỗi đĩa 10 ml nước cất, cạo nhẹ trên bề mặt thạch để nấm tách ra khỏi môi trường nuôi cấy và hoà lẫn vào trong nước, thu dịch nấm trên đĩa thạch vào bình tam giác có lưới lọc). Hình 4.2a: Khuẩn lạc C. cassiicola sau 5 ngày nuôi cấy trên môi trƣờng PSA Hình 4.2b: Khuẩn lạc C. cassiicola sau 8 ngày nuôi cấy trên môi trƣờng PSA Kết quả: Phân lập được nguồn nấm C. cassiicola thuần chủng. Số lượng bào tử trung bình: 8 bào tử/giọt (1 giọt = 20 µl). Hình 4.3: Bào tử C. cassiicola trên môi trƣờng nhân tạo PSA 4.3. Kết quả đánh giá tính kháng bệnh rụng lá Corynespora bằng cách lây bệnh nhân tạo trên mẫu lá nguyên Đánh giá tính kháng CLFD bằng phương pháp in vivo hiện có hai cách đang được sử dụng tại Bộ môn BVTV – VNCCSVN là: lây bệnh nhân lá nguyên và lá tròn. 33 Tuy nhiên, qua nhiều đợt làm thí nghiệm của Bộ môn BVTV cho thấy mặc dù phương pháp gây bệnh trên mẫu lá tròn đem lại kết quả không sai lệch lớn so với kết quả gây bệnh trên mẫu lá nguyên. Nhưng khi so sánh kết quả của hai phương pháp trên với kết quả điều tra ngoài đồng ruộng cho thấy phương pháp thực hiện trên mẫu lá tròn cho kết quả không chính xác bằng phương pháp lây bệnh nhân tạo trên mẫu lá nguyên. Do một số nguyên nhân sau: Thứ nhất, lây bệnh trên mẫu lá tròn sử dụng mẫu lá không còn nguyên vẹn làm cho mẫu lá dễ bị úng nước. Thứ hai, đối tượng của phương pháp gây bệnh nhân tạo trên mẫu lá tròn là mẫu lá bánh tẻ nên độ mẫn cảm không cao bằng trên lá non (mẫu lá 10 ngày tuổi, đối với phương pháp gây bệnh trên mẫu lá nguyên). Vì vậy, tôi chỉ tiến hành phương pháp đánh giá tính kháng bệnh rụng lá Corynespora bằng cách lây bệnh nhân tạo trên mẫu lá nguyên. Sau 5, 7 và 10 ngày lây nhiễm nhân tạo bệnh rụng lá Corynespora, thu được kết quả về mức độ nhiễm bệnh (Phụ lục 1) và phân hạng mức độ nhiễm bệnh (Bảng 4.2) của 60 dvt cao su. Bảng 4.2: Phân hạng mức độ nhiễm CLFD của 60 dvt cao su Mức nhiễm bệnh Dòng vô tính* Nhẹ LH 94/481, LH 94/342, LH 94/592, LH 97/542, PB 235, PB 260, LH 94/286, LH 97/697, LH 94/337, LH 94/501, LH 97/563 Trung bình LH 91/999, LH 94/62, LH 98/1366, LH 94/475, LH 95/395, LH 97/267, LH 91/1119, LH 94/626, LH 95/115, LH 96/305, LH 94/374, LH 94/544, LH 95/113, LH 98/444, LH 97/165, LH 94/105, LH 94/267, LH 95/88, LH 91/489, LH 96/133, LH 97/80, LH 97/647 Nặng LH 96/345, LH 91/579, LH 94/133, LH 96/115, LH 98/274, LH 91/1111, LH 97/196, LH 88/185, LH 96/128, LH 94/359, LH 95/206, LH 98/241 Rất nặng LH 94/612, LH95/345, LH 96/308, LH 97/646, LH 97/657, LH 95/174, LH 98/239, LH 97/117, LH 82/182, LH 95/109, LH 95/208, LH 98/807, LH 98/42, LH 98/377, LH 95/228 Ghi chú: Trong cùng một mức độ nhiễm, dvt nào đứng trước bị nhiễm bệnh nhẹ hơn dvt đứng sau. 34 Qua bảng 4.2 cho thấy, không một dvt nào có được tính kháng hoàn toàn với bệnh, 100% dvt nhiễm bệnh Corynespora ở mức độ mẫn cảm khác nhau. Trong đó, 15/60 dvt nhiễm rất nặng chiếm tỷ lệ 25%, 12/60 dvt nhiễm nặng chiếm tỷ lệ 20%, 22/60 dvt nhiễm trung bình chiếm tỷ lệ 36,67%, 11/60 dvt nhiễm nhẹ chiếm tỷ lệ 18,33%. Sau khi phân hạng mức độ nhiễm bệnh, dựa trên phổ hệ của 60 dvt để xác định đặc tính di truyền (DT) con lai. Trong 60 dvt thì có tới 58/60 dvt (chiếm tỷ lệ 96,7%) được lai tạo trong nước bằng phương pháp lai hoa hữu tính. Bảng 4.3: Phân bố phổ hệ ảnh hƣởng đến mức độ mẫn cảm của con lai DT từ mẹ Mức nhiễm bệnh Dòng vô tính sử dụng làm mẹ Nhẹ PB, LH, VQ, RRIC Trung bình RRIC, PB, LH, IAN, FX, RRIV, IRCA, RO, GT 1 Nặng PB, RRIM, RRIC, GU Rất nặng HK, LH, IRCA, RRIC, TU, PB Qua Bảng 4.3 cho thấy, nhóm PB và RRIC dùng làm nguồn mẹ cho thế hệ con lai có mức độ mẫn cảm từ nhẹ đến rất nặng. Nhóm VQ được đánh giá là nhóm dùng làm nguồn mẹ cho thế hệ con lai ít mẫm cảm nhất. Trong khi đó, nhóm HK và TU dùng làm nguồn mẹ lại cho thế hệ con lai rất dễ mẫm cảm với bệnh. Qua Bảng 4.4 cho thấy, nhóm RRIC và FX dùng làm nguồn bố cho thế hệ con lai có mức độ mẫm cảm từ nhẹ đến rất nặng. Nhóm TU cho thế hệ con lai mẫn cảm nhẹ đến trung bình. Nhóm LH và RO cho thế hệ con lai có độ mẫm cảm trung bình đến rất nặng. Nhóm VM dùng làm nguồn bố cho thế hệ con lai ít mẫn cảm với bệnh nhất. Bảng 4.4: Phân bố phổ hệ ảnh hƣởng đến mức độ mẫn cảm của con lai DT từ bố Mức nhiễm bệnh Dòng vô tính sử dụng làm bố Nhẹ RRIC, VM, RRIV, FX, IAN, PB, TU Trung bình IAN, LH, RRIM, RRIC, RRIV, TU, FX, GU, RO, AC Nặng LH, RRIC, FX, AC, GU, RO Rất nặng RRIV, RRIC, LH, FX, IAN, PB, RO Phân tích phổ hệ từ Bảng 4.3 và Bảng 4.4 cho thấy nhóm RRIC dùng làm nguồn bố hay mẹ đều cho thế hệ con lai có độ mẫn cảm từ nhẹ đến rất nặng, RRIC 35 là dvt mẫn cảm với bệnh đã được biết rõ không những ở trong nước mà còn ở các nước trồng cao su khác. Nhóm TU dùng làm nguồn mẹ cho thế hệ con lai mẫn cảm rất nặng nhưng dùng làm nguồn bố lại cho thế hệ con lai mẫn cảm nhẹ đến trung bình. Nhóm VM dùng làm nguồn mẹ và nhóm VQ dùng làm nguồn bố cho thế hệ con lai ít mẫn cảm với bệnh nhất. Nhóm PB trước đây được xem là dvt ít mẫn cảm nhưng gần đây nhóm PB, đặc biệt là PB 260, nhiễm bệnh nhiều hơn với các triệu chứng rất biến thiên và không đặc trưng cũng xuất hiện trong nhóm bị nặng. Cũng tương tự như nhóm PB, nhóm RRIV cũng có những biến đổi đáng kể về khả năng mẫn cảm. Hiện nay, số lượng dvt nhiễm bệnh đã gia tăng đáng kể (kết quả gây bệnh nhân tạo trên mẫu lá nguyên của 60 dvt đã cho thấy 100% dvt đều nhiễm bệnh), so với năm 1999, khi bệnh mới xuất hiện tại Việt Nam thì chỉ có 6 dvt bị nhiễm bệnh. Theo Bộ môn BVTV (2006), nấm có khả năng vượt qua tính kháng của dvt cao su theo thời gian, cũng như bệnh đang tích lũy và có khả năng bùng phát khi gặp điều kiện thuận lợi. Cần được theo dõi chặt chẽ để có biện pháp hạn chế đến mức thấp nhất những thiệt hại do nấm gây ra. Hình 4.4: Dvt cao su sau 5, 7 và 10 ngày lây bệnh nhân tạo CLFD (a) Dvt LH 94/612 sau 5 ngày lây bệnh nhân tạo CLFD (b) Dvt LH 95/208 sau 7 ngày lây bệnh nhân tạo CLFD (c) Dvt LH 95/88 sau 10 ngày lây bệnh nhân tạo CLFD (c) (b) (a) 36 4.4. Kết quả thí nghiệm khảo sát mối quan hệ giữa hoạt tính peroxidase và tính kháng CFLD trên một số dvt cao su POD là một trong những PR proteins và có rất nhiều phương pháp để xác định hoạt tính của POD. Phương pháp quang phổ là một trong những phương pháp thường được sử dụng để xác định hoạt tính POD vì đây là một trong những phương pháp tốn ít thời gian, rẻ tiền và có độ tin cậy cao. Theo Johann Putter (1974), khi tiến hành xác định hoạt tính POD cần phải chú ý một số yếu tố sau:  Điều kiện tối ưu để xác định hoạt tính pH thích hợp 7,0, nhiệt độ 25ºC, độ bão hoà của enzyme với H2O2 hoặc với cơ chất không đạt được dưới điều kiện thường. Sự phân huỷ GDHP (guaiacol dehydrogenation product) tối đa ở 418 nm. Ở 436 nm sự phân huỷ về cơ bản không khác nhau; đo ở bước sóng này có thuận lợi là nó có thể được đưa ra ngoài với đầu lọc quang kế thường. GDHP có màu nâu thì độ ổn định không lâu; trong 10 phút đầu, sau đó giảm 4 – 5 . Để đo chính xác, người ta đề nghị thêm vừa đủ enzyme do đó thời gian cần cho phản ứng không được vượt quá 5 phút.  Sự ổn định của dung dịch Dung dịch guaiacol có khả năng ổn định ở phòng lạnh khoảng 24 giờ và có thể ổn định nhiều tháng trong tủ lạnh.  Sự ổn định của enzyme trong mẫu Trong quá trình làm hoặc cất trữ thì enzyme nên được giữ ở 0 – 4ºC. 4.4.1. Kết quả khảo sát hoạt tính POD trên mẫu bệnh và mẫu đối chứng Theo Joseph (2006), để hạn chế sự phát triển của các mầm bệnh do nấm gây ra thì các loại thực vật cũng tạo ra nhiều cơ chế để chống lại các mầm bệnh đó bằng cách gia tăng tổng hợp lignin hoặc tạo ra các hợp chất kháng khuẩn… Tăng cường tạo các enzyme và hoạt tính của chúng đóng vai trò quan trọng trong cơ chế kháng của thực vật. Sau khi ly trích, đo hoạt tính POD bằng máy quang phổ DR 5000 ở bước sóng 436 nm. Ghi nhận thời gian hấp thụ từ khi đặt cuvette vào máy quang phổ cho đến khi độ hấp thụ tăng thêm 0,05. 37 Xử lý kết quả bằng phần mềm Excel và Statgraphics Ver. 7.0. Thu được kết quả hoạt tính POD (Bảng 4.5) như sau: Bảng 4.5: Bảng kết quả đo hoạt tính POD trên mẫu bệnh và mẫu đối chứng DVT POD trên mẫu đối chứng (đơn vị/lít) POD trên mẫu bệnh (đơn vị/lít) LH 94/481 54,33 e 317,67 ab LH 94/592 36,00 abc 657,33 bc LH 94/286 51,67 de 897,33 c LH 94/475 38,67 abcd 273,33 ab LH 95/395 46,67 bcde 743,33 c LH 97/267 41,00 abcde 197,33 a LH 94/359 39,33 abcd 827,33 c LH 95/206 48,00 cde 233,33 a LH 98/241 33,33 ab 658,00 bc LH 98/377 39,33 abcd 179,33 a LH 98/42 29,33 a 668,67 bc LH 98/807 41,00 abcde 242,67 a Ghi chú: o Tương ứng với mỗi nghiệm thức là một dvt cao su. o Trong cùng một cột, các giá trị trung bình có kí tự theo sau giống nhau không có sự khác biệt về mặt thống kê (P > 0,05). Qua Biểu đồ 4.1 cho thấy, hoạt tính POD của 12 dvt khảo sát đều tăng lên khi bị nhiễm bệnh. Dvt LH 94/286 khi bị nhiễm bệnh có hoạt tính POD cao nhất (897,33 đơn vị/lít), dvt LH 98/377 khi bị nhiễm bệnh có hoạt tính POD thấp nhất (179,33 đơn vị/lít). Trên cùng một dvt, hoạt tính POD trên mẫu đối chứng thấp hơn trên mẫu bệnh. Điều này có thể được giải thích do sau khi tiếp xúc lên bề mặt cây ký chủ, nấm bệnh tiết ra một số chất như pectic enzymes, hemicellulases, cellulolytic enzymes… hỗ trợ cho nấm xâm nhập vào bên trong cây. Chính những chất đó đã cảm ứng tiết POD ở phần mô bị bệnh tham gia vào quá trình tổng hợp lignin giúp cây ký chủ chống lại sự tấn công của mầm bệnh. Kết quả này phù hợp với kết quả nghiên cứu sự ảnh hưởng của PR proteins đến tính kháng bệnh CLFD của Joseph (2006), tức là PR proteins có thể chỉ xuất hiện sau khi đã phát sinh bệnh. 38 0.00 100.00 200.00 300.00 400.00 500.00 600.00 700.00 800.00 900.00 1000.00 LH 94/481 LH 94/592 LH 94/286 LH 94/475 LH 95/395 LH 97/267 LH 94/359 LH 95/206 LH 98/241 LH 98/377 LH 98/42 LH 98/807 Dòng vô tính Ho ạt tín h P OD (đ ơn vị /lít ) Hoạt tính POD ĐC Họat tính POD bệnh Biểu đồ 4.1: Hoạt tính POD trên mẫu đối chứng và mẫu bệnh của 12 dvt cao su 4.4.2. Kết quả khảo sát hoạt tính POD giữa các dvt Qua Bảng 4.6 cho thấy, trong cùng phân hạng mức độ nhiễm bệnh, các dvt khác nhau có hoạt tính POD khác nhau. Sự khác biệt này có ý nghĩa về mặt thống kê. Vì vậy có thể kết luận hoạt tính POD thay đổi tùy thuộc vào dvt. Bảng 4.6: Bảng kết quả đo POD trên mẫu lá bệnh NT DVT Hoạt tính POD (đơn vị/lít) Cấp bệnh TB Phân hạng mức độ nhiễm bệnh NT1 LH 94/481 317,67 ab 0,25 Nhẹ NT2 LH 94/592 657,33 bc 0,50 NT3 LH94/286 897,33 c 0,67 NT4 LH 94/475 273,33 ab 1,42 Trung bình NT5 LH 95/395 743,33 c 1,42 NT6 LH 97/267 197,33 a 1,42 NT7 LH 94/359 827,33 c 2,17 Nặng NT8 LH 95/206 233,33 a 2,42 NT9 LH 98/241 658,00 bc 2,50 NT10 LH 98/377 179,33 a 3,00 Rất nặng NT11 LH 98/42 668,67 bc 3,00 NT12 LH 98/807 242,67 a 3,00 Ghi chú: o Tương ứng với mỗi nghiệm thức là một dvt cao su. o Trong cùng một cột, các giá trị trung bình có kí tự theo sau giống nhau không có sự khác biệt về mặt thống kê (P > 0,05). 39 Tuy nhiên, khi thiết lập mối tương quan tuyến tính giữa mức độ nhiễm bệnh và hoạt tính enzyme của 12 dvt cao su (Biểu đồ 4.2) cho thấy không có mối tương quan tuyến tính giữa hoạt tính POD và tính kháng. R 2 = 0.0477 0.00 100.00 200.00 300.00 400.00 500.00 600.00 700.00 800.00 900.00 1000.00 0.25 0.50 0.67 1.42 1.42 1.42 2.17 2.42 2.50 3.00 3.00 3.00 Mức nhiễm bệnh của 12 dvt H oạ t t ín h PO D (đ ơn v ị/l ít) Họat tính POD bệnh Linear (Họat tính POD bệnh) Biểu đồ 4.2: Mối tƣơng quan giữa hoạt tính POD và mức nhiễm bệnh CLFD Kết quả này không phù hợp với một số nghiên cứu trước đây của Berton và ctv (1996), nhận thấy hoạt tính peroxidase trong dòng kháng GT 1 cao hơn dòng mẫn cảm PB 235 và PB 260 khi lây nhiễm nhân tạo bệnh Corynespora. Điều này có thể giải thích như sau: Berton và ctv (1996) đã sử dụng mẫu lá lây bệnh nhân tạo để đo hoạt tính POD nên có thể kiểm soát được thời gian nhiễm bệnh. Còn trong thí nghiệm này, mẫu lá được lấy tại Vườn Sơ tuyển 03 (địa điểm lấy mẫu lây bệnh nhân tạo in vivo) nên không kiểm soát được thời gian bị nhiễm bệnh của các dvt. Theo Joseph và ctv (2006), khi lây bệnh nhân tạo CLFD trong nhà lưới, hoạt tính PR protiens tăng dần theo thời gian bị nhiễm bệnh. Điều này cho thấy, lấy mẫu ở thời điểm cây bị nhiễm bệnh khác nhau sẽ cho kết quả khác nhau. Đây là một trong những nguyên nhân làm ảnh hưởng đến kết quả đo hoạt tính POD của các dvt. POD chỉ là một enzyme thuộc nhóm PR proteins nên POD chưa đủ quyết 40 định tính kháng hay mẫn cảm của các dvt. Do đó, phải kết hợp khảo sát POD với các enzyme khác thuộc nhóm PR proteins mới có thể khẳng định được tính kháng bệnh của các dvt. Ngoài ra, yếu tố pH của buffer và nhiệt độ phản ứng cũng ảnh hưởng rất lớn đến hoạt tính của enzyme. Vì vậy, chưa thể kết luận được mức độ nhiễm bệnh và hoạt tính POD có mối tương quan với nhau. 4.5. Kết quả thí nghiệm khảo sát mối quan hệ giữa mật độ khí khổng và tính mẫn cảm đối với CLFD của một số dvt cao su Vi sinh vật xâm nhập vào cây trồng qua 3 con đường chủ yếu: qua "lỗ mở" tự nhiên, qua vết thương, vết trầy xước trên cây và do chính vi sinh vật tự có cơ chế để xuyên thủng tầng cutin, cellulose vào tế bào thực vật. Rất nhiều vi sinh vật xâm nhập vào cây chủ qua lỗ khí, khí khổng, qua các lỗ mở trên hoa hay xâm nhập vào hạt phấn (Nguồn: Theo Phan Thành Dũng (2004), nấm C. cassiicola xâm nhập chủ yếu ở mặt dưới lá qua biểu bì và khí khổng. Từ các nghiên cứu trên tôi đặt ra giả thiết: dvt cao su có số lượng khí khổng nhiều sẽ tạo nhiều cơ hội cho nấm xâm nhập nên dễ bị bệnh hơn các dvt cao su có mật độ khí khổng ít. Để khẳng định giả thiết trên đây tôi thực hiện thí nghiệm khảo sát mối quan hệ giữa mật độ khí khổng và tính mẫn cảm đối với bệnh rụng lá Corynespora của một số dvt cao su. Theo Nguyễn Ngọc Trì (2005), số lượng và sự phân bố khí khổng tùy thuộc rất nhiều vào loài, vào vị trí lá, vị trí trên từng bản lá, bội thể và điều kiện sống. Mẫu lá của các dvt được sử dụng để khảo sát mật độ khí khổng trong thí nghiệm này có cùng tuổi lá (khoảng 10 ngày tuổi), trồng tại cùng một địa điểm (Vườn Sơ tuyển 03), vị trí đếm khí khổng (giữa phiến lá). Do đó có thể loại trừ được một số yếu tố ảnh hưởng đến mật độ khí khổng của các dvt. Sau khi tiến hành đếm số lượng khí khổng trên toàn diện tích thị trường vật kính X40, xử lý thống kê đã thu được kết quả (Bảng 4.7) như sau: 41 Hình 4.5: Khí khổng của một số dvt cao su Trong cùng một phân hạng mức độ nhiễm bệnh, các dvt khác nhau có số lượng khí khổng khác nhau, sự khác biệt này không có ý nghĩa về mặt thống kê. Nhưng giữa các mức độ nhiễm bệnh thì sự khác biệt về số lượng khí khổng của các dvt lại có ý nghĩa về mặt thống kê. Bảng 4.7: Bảng kết quả đếm số lƣợng khí khổng NT DVT Số khí khổng TB/diện tích thị trƣờng vật kính X40) Cấp bệnh TB Phân hạng mức độ nhiễm bệnh NT1 LH 94/481 57,00 a 0,25 Nhẹ NT2 LH 94/592 58,00 a 0,50 NT3 LH 94/286 58,33 a 0,67 NT4 LH 94/475 59,67 a 1,42 Trung bình NT5 LH 95/395 59,33 a 1,42 NT6 LH 97/267 60,67 ab 1,42 NT7 LH 94/359 67,67 c 2,17 Nặng NT8 LH 95/206 66,67 c 2,42 NT9 LH 98/241 66,63 bc 2,50 NT10 LH 98/377 75,00 d 3,00 Rất nặng NT11 LH 98/42 78.33 d 3,00 NT12 LH 98/807 74,67 d 3,00 Ghi chú: o Tương ứng với mỗi nghiệm thức là một dvt cao su. o Trong cùng một cột, các giá trị trung bình có kí tự theo sau giống nhau không có sự khác biệt về mặt thống kê (P > 0,05). LH 98/42 LH 97/267 Khí khổng 42 Qua Biểu đồ 4.3 cũng cho thấy, dvt cao su có mật độ khí khổng càng nhiều thì càng dễ bị nhiễm bệnh. 0.00 10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00 70.00 80.00 90.00 0.25 0.50 0.67 1.42 1.42 1.42 2.17 2.42 2.50 3.00 3.00 3.00 Mức nhiễm bệnh của 12 dvt Số k hí k hổ ng /th ị t rư ờn g vậ t k ín h X4 0 Số khí khổng Biểu đồ 4.3: Mối quan hệ giữa số lƣợng khí khổng và tính mẫn cảm với CLFD của 12 dvt cao su Từ kết quả trên cho thấy các dòng vô tính cao su có số lượng khí khổng nhiều dễ bị nhiễm bệnh hơn các dòng vô tính cao su có số lượng khí khổng ít. Kết quả này hoàn toàn phù hợp với giả thiết ban đầu đặt ra. Kết luận: Dvt khác nhau có mật độ khí khổng khác nhau. Dvt cao su có mật độ khí khổng càng nhiều thì càng dễ bị nhiễm bệnh. 43 Chƣơng 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận Đánh giá tính kháng CLFD trên mẫu lá nguyên của 60 dvt cao su bằng cách lây bệnh nhân tạo. Là phương pháp tin cậy. 100% dvt nhiễm bệnh Corynespora ở mức độ mẫn cảm khác nhau. Trong đó, 15/60 dvt nhiễm rất nặng, 12/60 dvt nhiễm nặng, 22/60 dvt nhiễm trung bình, 11/60 dvt nhiễm nhẹ. Hầu hết các dvt bị nhiễm bệnh nặng đều có nguồn gốc di truyền từ các dvt mẫn cảm. Tuy nhiên, di truyền là yếu tố cần nhưng không phải là quyết định đối với tính nhiễm bệnh của các dvt. Thí nghiệm khảo sát mối quan hệ giữa hoạt tính peroxidase và tính kháng CFLD trên một số dvt cao su. Dvt khác nhau có hoạt tính POD khác nhau. Trên cùng một dvt, hoạt tính POD trên mẫu đối chứng thấp hơn trên mẫu bệnh. Không có mối tương quan tuyến tính giữa hoạt tính POD và tính mẫn cảm với CLFD của các dvt. Thí nghiệm khảo sát mối quan hệ giữa mật độ khí khổng và tính mẫn cảm đối với CLFD của một số dvt cao su. Dvt khác nhau có mật độ khí khổng khác nhau. Dvt cao su có mật độ khí khổng càng nhiều thì càng dễ bị nhiễm bệnh. 5.2. Đề nghị Mở rộng phương pháp thực hiện trong phòng bệnh Corynespora với các 44 dvt mới. Tiếp tục đánh giá tính nhiễm bệnh của các dvt bằng phương pháp in vivo (trong phòng) kết hợp với theo dõi trên vườn kiểm định bệnh trong thời gian dài để có kết luận chắc chắn hơn. Nên kết hợp thêm việc khảo sát các đặc tính sinh học của nấm bệnh. Thí nghiệm khảo sát mối quan hệ giữa hoạt tính POD và khả năng kháng bệnh CLFD mới là bước đầu nghiên cứu nên có những hạn chế nhất định. Để tăng thêm độ tin cậy nên tiếp tục khảo sát hoạt tính POD trên mẫu lá được lây bệnh nhân tạo để có thể kiểm soát được thời gian nhiễm bệnh, từ đó sẽ xác định được hoạt tính POD chính xác hơn, đồng thời kết hợp với các yếu tố khác liên quan đến khả năng kháng bệnh của các dvt cao su để có được phương pháp quản lý bệnh chặt chẽ hơn. Đối với phương pháp khảo sát mối quan hệ mật độ khí khổng và tính cảm nhiễm với bệnh. Là phương pháp hoàn toàn mới nên có những hạn chế nhất định, để tăng thêm độ tin cậy nên tiếp tục khảo sát trên nhiều dvt hơn nữa. 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt 1. Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật, 2006. Báo cáo công trình tuyển non dvt cao su kháng bệnh rụng lá Corynespora. Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam. 2. Lê Ngọc Thông và Huỳnh Tiến Dũng, 2003. Sinh học đại cương. Tủ sách Đại học Nông Lâm. 199 trang. 3. Nguyễn Đức Lượng, 2001. Công Nghệ Sinh Học. Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia Thành phố Hồ Chí Minh. 344 trang. 4. Nguyễn Ngọc Trì, 2005. Bài giảng Sinh lý Thực vật. Tủ sách Trường Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Trang 28 – 33. 5. Nguyễn Thị Kim Linh, 2005. Đề cương thực hành môn Sinh lý thực vật. Tủ sách Trường Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. 6. Nguyễn Văn Bình, Vũ Đình Chính, Nguyễn Thế Côn, Lê Song Dự, Đoàn Thị Thanh Nhàn (chủ biên) và Bùi Xuân Sửu, 1996. Giáo trình cây công nghiệp. Nhà xuất bản Nông nghiệp. 7. Nguyễn Văn Trương và Trịnh Văn Thịnh, 1991. Từ điển Bách khoa Nông nghiệp. Trung tâm quốc gia biên soạn từ điển Bách khoa Việt Nam. 8. Phạm Thị Lộc, 2002. Bài giảng Sinh học thực vật. Tủ sách Trường Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Trang 12 – 14. 9. Phạm Thị Trân Châu và Phan Tuấn Nghĩa, 2006. Công nghệ sinh học Enzyme và Ứng dụng. Tập ba. Nhà xuất bản Giáo Dục. 195 trang. 10. Phan Thành Dũng, 2000. Bệnh rụng lá Corynespora, đối tượng nguy hiểm lần đầu tiên trên cây cao su tại Việt Nam. Kết quả hoạt động khoa học công nghệ năm 2000. Nhà xuất bản Nông Nghiệp. Trang 135 – 149. 11. Phan Thành Dũng, 2004. Kỹ thuật bảo vệ thực vật cây cao su. Nhà xuất bản Nông nghiệp. 124 trang. 12. Phan Thành Dũng, 2006. Báo cáo kết quả công trình tuyển non dòng vô tính cao su kháng bệnh rụng lá Corynespora. Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam. 46 13. Tổng Công Ty Cao su Việt nam, 2005. 30 năm Tổng Công Ty Cao Su Việt nam. NXB Giao Thông Vận Tải. 14. Vũ Triệu Mân và Lê Lương Tề, 1998. Giáo trình Bệnh Cây Nông Nghiệp. Nhà xuất bản Nông nghiệp. 295 trang. Tài liệu tiếng nƣớc ngoài 15. Breton, F., d’ Auzac, J., Garcia, D., Sanier, C and Eschbach, J.m., 1996. Recent researches on Corynespora cassiicola/Hevea brasiliensis Interaction. Proceeding of Workshop on Corynespora Leaf Fall Diseases of Hevea Rubber. (Eds. Asril Darussamin, Sowkirman Pawirosoemardjo, Basuki, Rasidin Azwar, Sadaruddin). Medan, Indonesia, 16 – 17 December 1996. Indonesia Rubber Reseach Institute. pp 49 –78. 16. Chatchamon Daengkanit and Wallie Suvachittanont., 2005. Peroxidase from Hevea brasiliensis (B.H.K) Mull. Arg. Leaves and its Applications. Science Asia 31 : 55 – 63. . 17. Chee, K. H., 1988. Studies on sporulation, pathogenicity and epidemiology of Corynespora. Journal of Natural Rubber research 3(1): 21 – 29. 18. Dung P.T., 1995. Studies on C. cassiicola (Berk. & Curt) Wei. on rubber. M. Agr. Sc. Thesis, Universiti Pertanian Malaysia. 19. Dung, P.T. and Hoan, N.T., 2000. Current Status of Corynespora Leaf Fall in Vietnam. IRRDB Workshop on Corynespora Leaf Fall Disease of rubber. Kuala Lumpur, Malaysia and Medan, Indonesia, 5 – 16 June 2000. International Rubber Research and Development Board. 20. Dung, P.T., Pha, T.A. and Son, M.V., 2006. Current Status of diseases on rubber tree and their control in Vietnam. Preprints of Papers International Natural rubber Conference. (Eds. Mai Van Son, Nguyen Ngoc Bich, Tong Viet Thinh). Ho Chi Minh City, Vietnam, 13 – 14 November 2006. International Rubber Research and Development Board and Rubber Research Institute of Vietnam. 21. Geiger J. P., Rio B., Nandris D. and Nicole M., 1989. Peroxidase production in tissues of the rubber tree following infection by root rot fungi. Physiological and Molecular Plant Pathology 34: 241 – 256. < fdi_51-52/010015911.pdf>. 47 22. Jacob K.C., 2006. Symptoms of Corynespora leaf disease on rubber (Hevea brasiliensis). Corynespora leaf disease of Hevea brasiliensis Strategies for management. (Ed. Jacob K.C.). Rubber Reseach Institute of India, Kottayam, Kerala, India. pp. 17 – 24. 23. Jayasinghe, C.K., 2000. Corynespora Leaf Fall Disease of rubber in Sri Lanka: Diversity of the pathogen and pathogenesis. IRRDB Workshop on Corynespora Leaf Fall Disease of rubber. Kuala Lumpur, Malaysia and Medan, Indonesia, 5 – 16 June 2000. International Rubber Research and Development Board. 24. Jinji P., Xin Z., Yangxian Q., Yixian X., Huiqiang Z. and He Z., 2007. First record of Corynespora leaf fall disease of Hevea rubber tree in China. Australian Plant Disease Notes 2(1): 35 – 36. < 8&f=DN07017>. 25. Joseph A., 2006. Enzymes in host – pathogen interactions. Corynespora leaf disease of Hevea brasiliensis Strategies for management. (Ed. C. Kuruvilla Jacob). Rubber Reseach Institute of India, Kottayam, Kerala, India. p. 54 – 62. 26. Miranda M.V., Magri M.L., Cabrera R.B., Fernández Lahore H.M. and Cascone O., 2003. Optimisation of peroxidase adsorption on concanavalin A – Agarose. Latin American Applied Research 33: 67–71. . 27. Mushrif S.K., 2006. Morphology, physiology and survival of Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei.. Corynespora leaf disease of Hevea brasiliensis Strategies for management. (Ed. C. Kuruvilla Jacob). Rubber Reseach Institute of India, Kottayam, Kerala, India. pp. 26 – 31. 28. Onesirosan, P.T., Arny, D.C. and Durbin, R.D., (1974). Host specificity of Nigerian and North Amarican isolates of Corynespora cassiicola. Phytopathology 64: 1364 –1367. 29. Philip, S., Joseph, A., Kumar, A., Jacob, C.K. and Kothandaraman, R., 2001. Detection of –1,3–glucanase isoforms against Corynespora Leaf Fall Diseases of Rubber (Hevea brasiliensis). Indian Journal of Natural Rubber Research 14 (1): 1 – 6. 48 30. Putter J., 1974. Peroxidases. Methods of enzymatic analysis 2. (Ed. Bergmeyer). Academic Press, New York. p. 685. 31. Rajalakshmy, V.K. and Kothandaraman, R., 1996. Current Status of Corynespora Leaf Fall in India the occurrence and management. Prosiding of Workshop on Corynespora Leaf Fall Disease of Hevea Rubber. (Eds. Asril Darussamin, Sowkirman Pawirosoemardjo, Basuki, Rasidin Azwar and Sadaruddin). Medan, Indonesia, 16 – 17 December 1996. Indonesia Rubber Reseach Institute. p. 38. 32. Sarma, Y.R. and Nayudu, M.V., 1971. New host of Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei.. Current Sciences 74(2): 92 – 97. 33. Spencer, J.A. and Walters, H.J., 1969. Variation in certain isolates of Corynespora cassiicola. Phytopathology 59: 58 – 60. 34. Suresh Kumar, K.K. and Kuruvilla Jacob, C., 2006. Post – infectional change of enzymes and proteins in Hevea brasiliensis and their role in resistance to Corynespora cassiicola. Preprints of Papers International Natural rubber Conference. (Eds. Mai Van Son, Nguyen Ngoc Bich, Tong Viet Thinh). Ho Chi Minh City, Vietnam, 13 – 14 November 2006. International Rubber Research and Development Board and Rubber Research Institute of Vietnam. Pp 440 – 449. 35. Thankamony S. and Shaji Philip., 2006. Enzyme and PR Proteins. A Laboratory Manual for International Training on Strategies for Management of Corynespora Leaf Fall Disease of Hevea brasiliensis. (Eds. C. Kuruvilla Jacob, P. Srinivas, C. Bindu Roy). Rubber Reseach Institute of India, Kottayam 686 009, India. p 17 – 18. Tài liệu Internet 36. 37. 38. _plant_pathogen_collections_vietnamese.pdf. 39. 40. 49 41. 42. 43. 44. PHỤ LỤC PHỤ LỤC 1: Số liệu thô Mức độ nhiễm bệnh của 60 dvt cao su sau 5, 7 và 10 ngày lây nhiễm STT DVT TB Phân hạng STT DVT TB Phân hạng 1 LH 94/481 0,25 Nhẹ 31 LH 96/133 1,75 Trung bình 2 LH 94/342 0,42 Nhẹ 32 LH 97/80 1,75 Trung bình 3 LH 94/592 0,50 Nhẹ 33 LH 97/647 1,75 Trung bình 4 LH 97/542 0,50 Nhẹ 34 LH 96/345 1,83 Nặng 5 PB 235 0,58 Nhẹ 35 LH 91/579 1,83 Nặng 6 PB 260 0,58 Nhẹ 36 LH 94/133 1,83 Nặng 7 LH 94/286 0,67 Nhẹ 37 LH 96/115 1,83 Nặng 8 LH 97/697 0,67 Nhẹ 38 LH 98/274 1,83 Nặng 9 LH 94/337 0,75 Nhẹ 39 LH 91/1111 1,92 Nặng 10 LH 94/501 0,83 Nhẹ 40 LH 97/196 1,92 Nặng 11 LH 97/563 0,83 Nhẹ 41 LH 88/185 1,92 Nặng 12 LH 91/999 1,33 Trung bình 42 LH 96/128 1,92 Nặng 13 LH 94/62 1,33 Trung bình 43 LH 94/359 2,17 Nặng 14 LH 98/1366 1,33 Trung bình 44 LH 95/206 2,42 Nặng 15 LH 94/475 1,42 Trung bình 45 LH 98/241 2,50 Nặng 16 LH 95/395 1,42 Trung bình 46 LH 94/612 2,75 Rất nặng 17 LH 97/267 1,42 Trung bình 47 LH95/345 2,75 Rất nặng 18 LH 91/1119 1,58 Trung bình 48 LH 96/308 2,83 Rất nặng 19 LH 94/626 1,58 Trung bình 49 LH 97/646 2,83 Rất nặng 20 LH 95/115 1,58 Trung bình 50 LH 97/657 2,92 Rất nặng 21 LH 96/305 1,58 Trung bình 51 LH 95/174 2,92 Rất nặng 22 LH 94/374 1,67 Trung bình 52 LH 98/239 2,92 Rất nặng 23 LH 94/544 1,67 Trung bình 53 LH 97/117 3,00 Rất nặng 24 LH 95/113 1,67 Trung bình 54 LH 82/182 3,00 Rất nặng 25 LH 98/444 1,67 Trung bình 55 LH 95/109 3,00 Rất nặng 26 LH 97/165 1,67 Trung bình 56 LH 95/208 3,00 Rất nặng 27 LH 94/105 1,75 Trung bình 57 LH 98/807 3,00 Rất nặng 28 LH 94/267 1,75 Trung bình 58 LH 98/42 3,00 Rất nặng 29 LH 95/88 1,75 Trung bình 59 LH 98/377 3,00 Rất nặng 30 LH 91/489 1,75 Trung bình 60 LH 95//228 3,00 Rất nặng Ghi chú: Độ lệch chuẩn = 0,8; Cấp bệnh trung bình: = 1,83. PHỤ LỤC 2: Phƣơng pháp pha chế một số môi trƣờng  Môi trƣờng PDA (tổng hợp) – hãng sản xuất: Merck. Pha 39 g môi trường PDA tổng hợp vào 1 lít nước, dùng đũa thuỷ tinh khuấy đều, phân phối vào 4 bình tam giác. Sau đó đem hấp khử trùng ở 121ºC/15 phút. Để nguội (khoảng 40 – 45ºC), phân vào mỗi đĩa petri vô trùng khoảng 10 ml.  Môi trƣờng PSA Tư ̣pha chế theo công thức của Chee (1988). Bảng: Thành phần môi trƣờng PSA Thành phần g/lít Khoai tây Đường sucrose Thạch agar Nước cất 100 10 15 Nước cất vừa đủ 1 lít Khoai tây gọt vỏ, rửa sạch, cân đủ 100 gam, thái nhỏ hạt lựu, thêm 500 ml nước cất 2 lần, đun sôi. Lọc lấy nước trong. Thêm 15 g agar và bổ sung nước cất 2 lần vào dung dịch đã lọc cho tới khi đạt 1.000 ml, đun sôi trong 30 phút, khuấy đều. Chia môi trường vào các bình tam giác (khoảng 250 ml/bình), đem hấp khử trùng ở 121ºC trong 15 phút. Sau đó để cho nhiệt độ môi trường xuống khoảng 40 – 45ºC, rót vào mỗi đĩa petri vô trùng khoảng 10 ml. PHỤ LỤC 3: Xử lý số liệu thống kê POD bệnh One-Way Analysis of Variance -------------------------------------------------------------------------------- Data: PODBENH.HTINHPOD Level codes: PODBENH.DVT Labels: Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- Between groups 2453640.3 11 223058.21 3.811 .0030 Within groups 1404573.3 24 58523.89 -------------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) 3858213.6 35 0 missing value(s) have been excluded. Table of means for PODBENH.HTINHPOD by PODBENH.DVT -------------------------------------------------------------------------------- Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean -------------------------------------------------------------------------------- LH94/286 3 897.33333 45.66667 139.67091 693.44951 1101.2172 LH94/481 3 317.66667 65.70726 139.67091 113.78284 521.5505 LH94/592 3 657.33333 124.48873 139.67091 453.44951 861.2172 LH94/475 3 273.33333 26.07894 139.67091 69.44951 477.2172 LH95/395 3 743.33333 342.85387 139.67091 539.44951 947.2172 LH97/267 3 197.33333 15.34420 139.67091 -6.55049 401.2172 LH94/359 3 827.33333 270.77071 139.67091 623.44951 1031.2172 LH95/206 3 233.33333 7.83865 139.67091 29.44951 437.2172 LH98/241 3 658.00000 120.50035 139.67091 454.11618 861.8838 LH98/377 3 179.33333 18.12304 139.67091 -24.55049 383.2172 LH98/42 3 668.66667 50.03443 139.67091 464.78284 872.5505 LH98/807 3 242.66667 54.77631 139.67091 38.78284 446.5505 -------------------------------------------------------------------------------- Total 36 491.30556 40.31952 40.31952 432.44936 550.1617 Multiple range analysis for PODBENH.HTINHPOD by PODBENH.DVT -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- LH98/377 3 179.33333 X LH97/267 3 197.33333 X LH95/206 3 233.33333 X LH98/807 3 242.66667 X LH94/475 3 273.33333 XX LH94/481 3 317.66667 XX LH94/592 3 657.33333 XX LH98/241 3 658.00000 XX LH98/42 3 668.66667 XX LH95/395 3 743.33333 X LH94/359 3 827.33333 X LH94/286 3 897.33333 X -------------------------------------------------------------------------------- contrast difference limits LH94/286 - LH94/481 579.667 407.768 * LH94/286 - LH94/592 240.000 407.768 LH94/286 - LH94/475 624.000 407.768 * LH94/286 - LH95/395 154.000 407.768 LH94/286 - LH97/267 700.000 407.768 * LH94/286 - LH94/359 70.0000 407.768 LH94/286 - LH95/206 664.000 407.768 * LH94/286 - LH98/241 239.333 407.768 LH94/286 - LH98/377 718.000 407.768 * LH94/286 - LH98/42 228.667 407.768 LH94/286 - LH98/807 654.667 407.768 * LH94/481 - LH94/592 -339.667 407.768 LH94/481 - LH94/475 44.3333 407.768 LH94/481 - LH95/395 -425.667 407.768 * LH94/481 - LH97/267 120.333 407.768 LH94/481 - LH94/359 -509.667 407.768 * LH94/481 - LH95/206 84.3333 407.768 LH94/481 - LH98/241 -340.333 407.768 LH94/481 - LH98/377 138.333 407.768 LH94/481 - LH98/42 -351.000 407.768 LH94/481 - LH98/807 75.0000 407.768 LH94/592 - LH94/475 384.000 407.768 LH94/592 - LH95/395 -86.0000 407.768 LH94/592 - LH97/267 460.000 407.768 * LH94/592 - LH94/359 -170.000 407.768 LH94/592 - LH95/206 424.000 407.768 * LH94/592 - LH98/241 -0.66667 407.768 LH94/592 - LH98/377 478.000 407.768 * LH94/592 - LH98/42 -11.3333 407.768 LH94/592 - LH98/807 414.667 407.768 * LH94/475 - LH95/395 -470.000 407.768 * LH94/475 - LH97/267 76.0000 407.768 LH94/475 - LH94/359 -554.000 407.768 * LH94/475 - LH95/206 40.0000 407.768 LH94/475 - LH98/241 -384.667 407.768 LH94/475 - LH98/377 94.0000 407.768 LH94/475 - LH98/42 -395.333 407.768 LH94/475 - LH98/807 30.6667 407.768 * denotes a statistically significant difference. Multiple range analysis for PODBENH.HTINHPOD by PODBENH.DVT -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- LH95/395 - LH97/267 546.000 407.768 * LH95/395 - LH94/359 -84.0000 407.768 LH95/395 - LH95/206 510.000 407.768 * LH95/395 - LH98/241 85.3333 407.768 LH95/395 - LH98/377 564.000 407.768 * LH95/395 - LH98/42 74.6667 407.768 LH95/395 - LH98/807 500.667 407.768 * LH97/267 - LH94/359 -630.000 407.768 * LH97/267 - LH95/206 -36.0000 407.768 LH97/267 - LH98/241 -460.667 407.768 * LH97/267 - LH98/377 18.0000 407.768 LH97/267 - LH98/42 -471.333 407.768 * LH97/267 - LH98/807 -45.3333 407.768 LH94/359 - LH95/206 594.000 407.768 * LH94/359 - LH98/241 169.333 407.768 LH94/359 - LH98/377 648.000 407.768 * LH94/359 - LH98/42 158.667 407.768 LH94/359 - LH98/807 584.667 407.768 * LH95/206 - LH98/241 -424.667 407.768 * LH95/206 - LH98/377 54.0000 407.768 LH95/206 - LH98/42 -435.333 407.768 * LH95/206 - LH98/807 -9.33333 407.768 LH98/241 - LH98/377 478.667 407.768 * LH98/241 - LH98/42 -10.6667 407.768 LH98/241 - LH98/807 415.333 407.768 * LH98/377 - LH98/42 -489.333 407.768 * LH98/377 - LH98/807 -63.3333 407.768 LH98/42 - LH98/807 426.000 407.768 * -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. POD đối chứng One-Way Analysis of Variance -------------------------------------------------------------------------------- Data: PODDC.HTINHPODDC Level codes: PODDC.DVT Labels: Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- Between groups 1799.5556 11 163.59596 2.544 .0270 Within groups 1543.3333 24 64.30556 -------------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) 3342.8889 35 0 missing value(s) have been excluded. Table of means for PODDC.HTINHPODDC by PODDC.DVT -------------------------------------------------------------------------------- Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean -------------------------------------------------------------------------------- LH94/286 3 51.666667 5.3333333 4.6298148 44.908321 58.425013 LH94/481 3 54.333333 2.6034166 4.6298148 47.574987 61.091679 LH94/592 3 36.000000 1.0000000 4.6298148 29.241654 42.758346 LH94/475 3 38.666667 4.0551750 4.6298148 31.908321 45.425013 LH95/395 3 46.666667 2.7284509 4.6298148 39.908321 53.425013 LH97/267 3 41.000000 2.0816660 4.6298148 34.241654 47.758346 LH94/359 3 39.333333 2.6666667 4.6298148 32.574987 46.091679 LH95/206 3 48.000000 9.1651514 4.6298148 41.241654 54.758346 LH98/241 3 33.333333 5.8972687 4.6298148 26.574987 40.091679 LH98/377 3 39.333333 5.4569018 4.6298148 32.574987 46.091679 LH98/42 3 29.333333 .3333333 4.6298148 22.574987 36.091679 LH98/807 3 41.000000 6.0827625 4.6298148 34.241654 47.758346 -------------------------------------------------------------------------------- Total 36 41.555556 1.3365124 1.3365124 39.604589 43.506522 Multiple range analysis for PODDC.HTINHPODDC by PODDC.DVT -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- LH98/42 3 29.333333 X LH98/241 3 33.333333 XX LH94/592 3 36.000000 XXX LH94/475 3 38.666667 XXXX LH94/359 3 39.333333 XXXX LH98/377 3 39.333333 XXXX LH97/267 3 41.000000 XXXXX LH98/807 3 41.000000 XXXXX LH95/395 3 46.666667 XXXX LH95/206 3 48.000000 XXX LH94/286 3 51.666667 XX LH94/481 3 54.333333 X -------------------------------------------------------------------------------- contrast difference limits LH94/286 - LH94/481 -2.66667 13.5167 * denotes a statistically significant difference. Số khí khổng One-Way Analysis of Variance -------------------------------------------------------------------------------- Data: KHIKHONG.SOKHIKHONG Level codes: KHIKHONG.DVT Labels: Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- Between groups 1858.3056 11 168.93687 14.797 .0000 Within groups 274.0000 24 11.41667 -------------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) 2132.3056 35 0 missing value(s) have been excluded. Table of means for KHIKHONG.SOKHIKHONG by KHIKHONG.DVT -------------------------------------------------------------------------------- Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean -------------------------------------------------------------------------------- LH94/286 3 58.333333 4.1766547 1.9507833 55.485688 61.180978 LH94/481 3 57.000000 .5773503 1.9507833 54.152355 59.847645 LH94/592 3 58.000000 .5773503 1.9507833 55.152355 60.847645 LH94/475 3 59.666667 3.8441875 1.9507833 56.819022 62.514312 LH95/395 3 59.333333 .6666667 1.9507833 56.485688 62.180978 LH97/267 3 60.666667 .8819171 1.9507833 57.819022 63.514312 LH94/359 3 67.666667 .8819171 1.9507833 64.819022 70.514312 LH95/206 3 66.666667 .8819171 1.9507833 63.819022 69.514312 LH98/241 3 66.333333 .6666667 1.9507833 63.485688 69.180978 LH98/377 3 75.000000 2.0816660 1.9507833 72.152355 77.847645 LH98/42 3 78.333333 1.7638342 1.9507833 75.485688 81.180978 LH98/807 3 74.666667 1.4529663 1.9507833 71.819022 77.514312 -------------------------------------------------------------------------------- Total 36 65.138889 .5631426 .5631426 64.316845 65.960933 Multiple range analysis for KHIKHONG.SOKHIKHONG by KHIKHONG.DVT -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- LH94/481 3 57.000000 X LH94/592 3 58.000000 X LH94/286 3 58.333333 X LH95/395 3 59.333333 X LH94/475 3 59.666667 X LH97/267 3 60.666667 XX LH98/241 3 66.333333 XX LH95/206 3 66.666667 X LH94/359 3 67.666667 X LH98/807 3 74.666667 X LH98/377 3 75.000000 X LH98/42 3 78.333333 X -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference.