Khóa luận Ứng dụng khóa phân loại hình thái và vùng 16S rRNA trên DNA ty thể trong định danh cá bột thuộc họ Pangasiidae

00 H5 -------------------------------------------------- 400 H6 -------------------------------------------------- 400 H7 --------------------------------------c----------- 400 H8 -------------------------------------------------- 400 H9 -------------------------------------------------- 400 Hình 4.7b Hình 4.7. : Sự tƣơng đồng trình tự vùng 16S rRNA trên mtDNA của 9 mẫu cá P. hypophthalmus phân tích (từ H1 đến H9) với tám trình tự chuẩn trên ngân hàng gene P. hypophthalmus haplotype: Ph01 đến Ph08 (DQ334282 – DQ334289). Hình 4.7a: tƣơng đồng trình tự mẫu H1, H4, H5, H6 với kểu gen P. hypophthalmus haplotype Ph04 (DQ334285). Hình 4.7b: tƣơng đồng trình tự mẫu H2, H7 với kểu gen P. hypophthalmus haplotype Ph06 (DQ334287). Theo kết quả so sánh từ hình 4.7, trong số chín cá thể đƣợc phân tích thì có hai cá thể: H2, H7 tƣơng đồng chính xác với kiểu gene P. hypophthalmus haplotype Ph6 (DQ334287) (Hình 4.7b), ba cá thể H3, H8, H9 tƣơng đồng hoàn toàn với với kiểu gen P. hypophthalmus haplotype Ph01 (DQ334282) (xem phần phụ lục). Bốn cá thể cuối cùng (H1, H4, H5, H6 ) đƣợc xác định tƣơng đồng với kiểu gene P. hypophthalmus haplotype Ph04 (DQ334285) (hình 4.7a). Trong đó, duy nhất chỉ có mẫu H1 là mang một đột biến thay thế nucleotide, với Guanidin thứ 26 đƣợc thay bằng Adenine, so với tám kiểu gene tham khảo trên ngân hàng gene. Nhƣ vậy, theo kết quả phân tích này kiểu gene ở mẫu cá H1 có thể là một kiểu gen mới. 42 Tóm lại, kết quả so sánh trình tự của chín mẫu cá phân tích so với dữ liệu chuẩn trên ngân hàng gene bằng chƣơng trình Blast và DNAMAN đã khẳng định chín mẫu cá này là loài P. hypophthamus. 4.3.2.3. Định danh 8 mẫu thuộc loài P. larnaudii. Tám mẫu cá bột thuộc loài P. larnaudii sau khi đã định danh, có kích thƣớc từ 20 mm - 30 mm (bảng 4.1). Kết quả sau khi giải trình tự vùng 16S rRNA trên mtDNA, các trình tự này đƣợc so sánh trên ngân hàng genbank tất cả đều có độ tƣơng đồng 100% với các trình tự mẫu cá thuộc loài P. larnaudii (ký hiệu các trình tự mẫu: Pl01 đến Pl13 tƣơng ứng với các trình tự gen có mã số truy cập DQ334303 - DQ334313) DQ334303 GTTAAACGGCCGCGGTATTTTGACCGTGCGAAGGTAGCGCAATCACTTGT 100 DQ334304 -------------------------------------------------- 100 DQ334305 -------------------------------------------------- 100 DQ334306 -------------------------------------------------- 100 DQ334307 --------------------------------------------c----- 100 DQ334308 -------------------------------------------------- 100 DQ334309 -------------------------------------------------- 100 DQ334310 ----------------------t--------------------------- 100 DQ334311 -------------------------------------------------- 100 DQ334312 ------------------c------------------------------- 100 DQ334313 -------------------------------------------------- 100 l1 -------------------------------------------------- 100 L2 -------------------------------------------------- 100 L3 -------------------------------------------------- 100 L4 -------------------------------------------------- 100 L5 ------------------c------------------------------- 100 L6 -------------------------------------------------- 100 L7 -------------------------------------------------- 100 L8 -------------------------------------------------- 100 Hình 4.8a DQ334303 CGATGTTGGATCAGGACATCCTAATGGTGCAGCCGCTATTAAGGGTTCGT 550 DQ334304 -------------------------------------------------- 550 DQ334305 -------------------------------------------------- 550 DQ334306 -------------------------------------------------- 550 DQ334307 -------------------------------------------------- 550 DQ334308 -------------------------------------------------- 550 DQ334309 -------------------------------------------------- 550 DQ334310 -------------------------------------------------- 550 DQ334311 -------------------------------------------------- 550 DQ334312 -------------------------------------------------- 550 DQ334313 ---------------g-------------------g-------------- 550 l1 -------------------------------------------------- 550 L2 -------------------------------------------------- 550 L3 -------------------------------------------------- 550 43 L4 ---------------g-------------------g-------------- 550 L5 -------------------------------------------------- 550 L6 ---------------g-------------------g-------------- 550 L7 ---------------g-------------------g-------------- 550 L8 -------------------------------------------------- 550 Hình 4.8b Hình 4.8. : Sự tƣơng đồng trình tự vùng 16S rRNA trên mtDNA của 8 mẫu cá P. larnaudii phân tích (từ L1 đến L8) với 11 trình tự chuẩn trên ngân hàng gene P. larnaudii haplotype: Pl01 đến Pl11 (DQ334303 – DQ334313). Hình 4.8a: tƣơng đồng trình tự mẫu L5 với kểu gen P. larnaudii haplotype Pl10 (DQ334312). Hình 4.8b: tƣơng đồng trình tự mẫu L4, L6, L7 với kểu gen P. larnaudii haplotype Pl11 (DQ334313). Quan sát trình tự trên ngân hàng genbank loài P. larnaudii có 11 kiểu gen. Tất cả 8 mẫu phân tích chỉ tƣơng đồng với 3 kiểu gen của P. larnaudii (DQ334303, DQ334312 và DQ334313) (xem phần phụ lục). Trong đó, có 4 mẫu: L1, L2, L3, L8 tƣơng đồng 100% với loài P. larnaudii haplotype Pl01 (DQ334303); mẫu L5 tƣơng đồng 100% với loài P. larnaudii haplotype Pl10 (DQ334312) (hình 4.8a) và 3 mẫu cuối cùng: L4, L6, L7 tƣơng đồng 100% với loài P. larnaudii haplotype Pl11 (DQ334313) (hình 4.8b). Nhƣ vậy, kết quả sau khi so sánh trình tự 8 mẫu cá P. larnaudii sau khi định danh bằng hình thái với trình tự chuẩn trên ngân hàng gene đã xác định đƣợc các mẫu phân tích đúng là loài P. larnaudii. Đồng thời ở đây chúng tôi cũng chƣa phát hiện một haplotype mới. 44 Chƣơng 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận Qua phƣơng pháp phân tích hình thái kết quả số lƣợng các loài cần phân tích (P. hypophthalmus, P. larnaudii, P. macronema) chiếm tỷ lệ khá lớn 132 mẫu/357 mẫu có Pangasiidae. Kết quả phân tích từ ba loài thu đƣợc 132 mẫu có 365 cá thể thì P. macronema chiếm số lƣợng nhiều nhất 317 cá thể, P. larnaudii chỉ có 36 cá thể, P. hypophthalmus ít nhất 12 cá thể. Giải trình tự 26 sản phẩm PCR, đem so sánh từng trình tự sau khi giải với các trình tự trong ngân hàng Genbank ở chƣơng trình BLAST cho kết quả nhƣ sau: 9 mẫu P. macronema đều giống 99% với P. macronema có mã số truy cập DQ334314, chỉ khác với trình tự này từ 3 – 4 nucleotide; 8/9 mẫu P. hypophthalmus thì giống 100% với ba kiểu gen của P. hypophthalmus có mã số truy cập là DQ334282, DQ334285 và DQ334287, mẫu H1 còn lại chỉ có một điểm đột biến tại vị trí thứ nucleotide 26 với kiểu gen của P. hypophthalmus (DQ334285); 8 mẫu P. larnaudii cuối cùng tƣơng đồng 100% với 3/11 trình tự P. larnaudii có trên ngân hàng gene (DQ334303, DQ334312, DQ334313). Từ kết quả trên có thể khẳng định: sử dụng vùng 16S rRNA trên mtDNA để xác định cá bột loài P. hypophthalmus, P. larnaudii, P. macronema thuộc họ Pangasiidae cho kết quả phù hợp với phƣơng pháp định danh hình thái. Phƣơng pháp phân tích hình thái có thể áp dụng định danh ở mức độ loài từ kích thƣớc rất nhỏ là 15 mm ở 3 loài cá P. hypophthalmus, P. larnaudii, P. macronema thuộc họ Pangasiidae. 45 5.2. Tồn tại Tất cả mẫu cá thuộc họ Pangasiidae năm 2006 không phân tích đƣợc DNA. Số lƣợng các loài P. larnaudii và P. hypophthalmus quá ít, số lƣợng mẫu phân tích hạn chế nên độ tin cậy chƣa cao. 5.3. Đề xuất Trong nghiên cứu này, chúng tôi đƣa ra mục tiêu phân tích 3 loài: P. larnaudii, P. macronema và P. hypophthalmus. Tuy nhiên, số lƣợng các loài này quá ít. Vì vậy chúng tôi có một số đề xuất để các nghiên cứu sau này thực hiện tốt và đầy đủ hơn: Bên cạnh ngƣ cụ Bongo net bổ sung thêm ngƣ cụ đáy để thu đƣợc nhiều cá hơn. Tần số thu mẫu có thể tiến hành nhiều hơn, có thể 12 lần thu mỗi ngày nhƣng mỗi lần 60 đến 90 phút. Các mẫu cá thuộc họ Pangasiidae năm 2006 sau khi cố định bằng formol 5% đƣợc bảo quản trong cồn 20% đã không phân tích đƣợc DNA. Vì vậy, nên bảo quản mẫu bằng cồn 95% khi phân tích DNA. Số lƣợng cá thể các loài phân tích đƣợc bổ sung tháng 6/2007 ít nên chúng tôi chỉ thực hiện thí nghiệm trên 26 cá thể ở ba loài: P. macronema, P. larnaudii và P. hypophthalmus. Do vậy cho độ chính xác chƣa cao. Vì vậy nên nâng độ lặp lại trên 30 lần mỗi loài để tính thống kê sinh học sẽ cho độ chính xác cao và tin cậy hơn. 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài Liệu Tiếng Việt 1. Bộ Thủy Sản Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II, 2005. Tuyển Tập Nghề Cá Sông Cửu Long, 2005. NXB Nông Nghiệp 2. Mai đình Yên và cộng sự, 1962. Một số dẫn liệu về hình thái và phân loại học cá bột (ấu trùng) và cá con vớt được trên sông Hồng. NXB Khoa Học và Kỹ Thuật, Hà Nội. 3. Mai Đình Yên, Vũ Trung Tạng, Bùi Lai, Trần Mai Thiên, 1979. Ngư loại học. NXB Đại Học và Trung Học Chuyên Nghiệp, Hà Nội. 4. Mai Đình Yên, Nguyễn Văn Thiện, Lê Hoàng Yến, Nguyễn Văn Trọng, 1985. Định loại các loài cá nước ngọt Nam Bộ. NXB Khoa Học và Kỹ Thuật Hà Nội. 5. Nguyễn Bạch Loan, 1998. Đặc điểm phân loại và sinh học của một số loài cá họ cá tra Pangasiidae ở hạ lưu sông MeKong, Việt Nam. Luận án thạc sĩ ngàng nuôi trồng thủy sản. 6. Nguyễn Hửu Phụng và Nguyễn Bạch Loan, 1999. Thành phần lòai và phân bố của họ cá tra Pangasiidae ở lƣu vực sông MeKong, Việt Nam 7. Nguyễn Văn Hảo, 2005. Cá Nước Ngọt Việt Nam Tập II. NXB Nông Nghiệp Hà Nội. 8. Nguyễn Nhƣ Hiền – Trịnh Xuân Hậu, 2000. Tế Bào Học. NXB Khoa Học và Kỹ Thuật. 9. Nguyễn Văn Trọng, 1997. Trứng cá và cá con các thuỷ vực thuộc tỉnh Tiền Giang. Báo cáo Khoa Học. Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thuỷ Sản II. 10. Lê Đức Trình, 2001. Sinh Học Phân Tử Của tế Bào. NXB Khoa Học và Kỹ Thuật. 11. Hồ Hùynh Thùy Dƣơng, 2003. Sinh Học Phân Tử. Tái bản lần 3, NXB Giáo Dục, Thành Phố Hồ Chí Minh. 47 12. Trƣơng Thủ Khoa và Trần Thị Thu Hƣơng, 1993. Định loại các loài cá. NXB khoa học và Kỹ Thuật, Hà Nội. Tài Liệu Nƣớc Ngòai 13. Apichart TermvidChakorn, 2003. Freshweter Fish Larvae. Inland Fisheries Resources Research and development Instute, Inland Fisheries Research and Development Bureau Deparment of Fisheries, Thailand , pp 135. 14. Avise, J.C., Helfman, G.S., Saunders, N.C., Hales, L.S., 1996. Mitochondrial DNA differentiation in North Atlanticeel: population genetic consequences of an unusual life history pattern. 83: 4355 – 4354. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 15. Alberts, Bruce; et.al. (1994). Molecular Biology of the Cell, Third Edition, New York: Garland Publishing Inc. 16. Birky, C.W.,Fuerst, P., Maruyama, T., 1989. Organelle gene diversity under migration, mutation and drift. Genetics 121: p613 – 617. 17. Chang, Y.S., Huang, F.L. and Lo, T.B., 1994. The complete nucleotide sequence and gene organization of carp (Cyprinus carpio) mitochondrial genome. Journal of Molecular Evolution 38: p138 – 155. 18. Dodgson,. J.B., Cheng, H.H., Okimoto, R., 1997. DNA markers technology: a revolution in animal genetics. Poult. Sci 17: p1108 – 1114. 19. Douzery E., F. M. Catzeflis, 1995. Molecular evolution of the mitochondrial 12S rRNA in Ungulata (Mammalia) J. Mol. Evol 41: p622-636 20. Gehrke, P.C., 1991. Diel abundance, migration and feeding of fish larvea (Eleotridae) in a floodplain billabong. The fisheries society of the British isles. 21. Gold, J.R., Richardson, L.R., Furman, C., King, T.L., 1993. Mitochondrial DNA differentiation and population structure in red drum (Sciaenops ocellatus) from the Gulf of Mexico and Atlantic Ocean. Mar. biol 116: p175 – 185. 48 22. Graves, J.E., McDowell, J.R., Jones, M.L., 1992. A genetic analysis of weakfish Cynoscion regalis stock structure along the mid – Alantic coast. Fish. Bull 90: p469 – 475. 23. Heist, E.J., Gold, J.R., 1999. Microsetellite DNA variation in sandbar sharks (Carcharhinus plumbeus) from the Gulf of Mexico and mid-Atlantic bight. Copeia 1: p182 – 186. 24. Hurng-Yi Wang and Sin-Chi Lee, 2002. Secondary Structure of Mitochondrial 12S rRNA Among Fish and Its Phylogenetic Applications. Molecular Biology and Evolution 19: p138-148. 25. Klinbunga, S., Ampayup, P., Tassanakajon, A., Jarayabhand, P., Yoosukh, W., 2000. Development of species-specific markers of the tropical oyster (Crassostrea belcheri) in Thailand. Mar. Biotechnol 2: p476 – 484. 26. Palumbi, S.R., Martin, A.P., Romano, S., McMillan, W.O., Stice, L. and Grabowski, G., 1991. The simple fool’s guide to PCR. Honolulu: Deparment of Zoology, University of Hawaii. 27. Partis, L., Wells, R.J., 1996. Indentification of fish species using random amplfied polymorphic DNA (RAPD). Mol. Cell. Probes 10: p435 – 441. 28. Pouyaud, L., Teugels, G.G., Gustinano, R. and Legendre, M., 2000. Contribution to the pholygeny og pangasiid catfishes (Siluriformes, Pangasiidae). Cybium 23: p247 – 258. 29. Roberts, T.R. and Vidthayanon, C., 1991. Systematic revision of the Asian catfish family Pangasiidae with biological observations and description of three new species. Proceedings of the Academy of Natural Sciences of Philadelphia 143: p406 – 252. 30. Smith, J.L.B., 1953. The Sea Fishes of Southern Africa. Central News Agency, LTD, South Africa. 31. Springer M. S., E. Douzery, 1996. Secondary structure and patterns of evolution among mammalian mitochondrial 12S rRNA molecules J. Mol. Evol 43: p357-373. 49 32. Sutovsky, P., et. al. Ubiquitin tag for sperm mitochondria. Nov. 25, 1999 > 33. Waiter J. Rainboth, 1996. Fishes of The Cambodian MeKong. Food And Argriculture Organization (FAO) of The United Nations. pp 265 34. Wheeler W. C., R. L. Honeycutt, 1988. Paired sequence difference in ribosomal RNAs: evolution and phylogenetic implications. Mol. Biol. Evol 5: p90-96 35. Young, W.P., Ostberg, C.O., Keim, P., Thorgaard, G.H., 2001. Genetic characterization of hybridixation and introgression between anadromous rainbow trout (Oncorhynchus mykiss irideus) and coastal cutthroat trout (O. clarki clarki). Mol. Ecol 10: p921 – 930. 36. R. Gustiano; G. G. Teugels and L. Pouyaud, 2003. Revision of The Pangasiidae kunyit catfish complex, with description of two new species from South- East Asia (Siluriformes; Pangasiidae). Journal of Natural Histary 37: 357 – 376. 37. Laurent Pouyaud; Rudhy Gustiano and Guy G. Teugels, 2002. Systematic revision of Pangasius Polyuranodon (Siluriformes, Pangasiidae) with description of two new species. Cybium 26: 243 – 252. 38. Z.J. Liu; J.F. Cordes, 2004. DNA marker technologies and their applications in aquaculture genetics. Aquaculture 238: 1 – 37. 39. U. Na-Nakorn, S. Sukmanomon, M. Nakajima, N. Taniguchi, W. Kamonrat, S. Poompuang and T. T. T. Nguyen, 2006. MtDNA diversity of the critically endangered MeKong giant catfish (Pangasianodon gigas Chevey,1993) and closely related species: implications for conservation. Animal Conservation 9: 483 – 494. The Zoological Society of London. 40. Sake R. K., Scharf S., Faloona F., Mullis K. B., Horn Mullis K.B., Horn G., Erlich H.A., Amheim N., 1985. Enzymatic amplification of globin genomic sequences and restriction site.analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science 230,1350 – 1355 41. Haase A., Retzel E. F., Stakus K. A., 1990. Amplification arid detection of lentiviral DNA inside cells. Proc Natl Acad SC! USA 87: p4971 – 4975. 50 PHỤ LỤC FILE: Multiple_Sequence_Alignment PROJECT: NUMBER: 11 MAXLENGTH: 572 NAMES: DQ334314 DQ334315 M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 M9 MAXNAMELEN: 9 ORIGIN DQ334314 CGCCTCCTGCAAAAATCAACGTATAGGAGGTCTTGCCTGCCCAGTGACAA 50 DQ334315 -------------------------------------------------- 50 M1 ....---------------------------------------------- 46 M2 ....---------------------------------------------- 46 M3 ....---------------------------------------------- 46 M4 ....---------------------------------------------t 46 M5 ....---------------------------------------------t 46 M6 ....---------------------------------------------- 46 M7 ....---------------------------------------------t 46 M8 ....---------------------------------------------- 46 M9 ....---------------------------------------------- 46 DQ334314 GTTAAACGGCCGCGGTATTTTGACCGTGCGAAGGTAGCGCAATCACTTGT 100 DQ334315 -------------------------------------------------- 100 M1 -------------------------------------------------- 96 M2 -------------------------------------------------- 96 M3 -------------------------------------------------- 96 M4 -------------------------------------------------- 96 M5 -------------------------------------------------- 96 M6 -------------------------------------------------- 96 M7 -------------------------------------------------- 96 M8 -------------------------------------------------- 96 M9 -------------------------------------------------- 96 DQ334314 CTTTTAAATGAAGACCTGTATGAATGGTGGAACGAGGGCTTAACTGTCTC 150 DQ334315 -------------------------------------------------- 150 M1 -------------------------------------------------- 146 M2 -------------------------------------------------- 146 M3 -------------------------------------------------- 146 M4 -------------------------------------------------- 146 M5 -------------------------------------------------- 146 M6 -------------------------------------------------- 146 M7 -------------------------------------------------- 146 M8 -------------------------------------------------- 146 M9 -------------------------------------------------- 146 DQ334314 CCTTTTCAAGTCAATGAAATTGATCTGCCCGTGCAGAAGCGGACATAAAA 200 DQ334315 -------------------------------------------------- 200 M1 -------------------------------------------------- 196 M2 -------------------------------------------------- 196 M3 -------------------------------------------------- 196 M4 -------------------------------------------------- 196 M5 -------------------------------------------------- 196 M6 -------------------------------------------------- 196 M7 -------------------------------------------------- 196 51 M8 -------------------------------------------------- 196 M9 -------------------------------------------------- 196 DQ334314 ATACAAGACGAGAAGACCCTTTGGAGCTTAAGATACAAGATCAACTATGT 250 DQ334315 -------------------------------------------------- 250 M1 -------------------------------------------------- 246 M2 -------------------------------------------------- 246 M3 -------------------------------------------------- 246 M4 -------------------------------------------------- 246 M5 -------------------------------------------------- 246 M6 -------------------------------------------------- 246 M7 -------------------------------------------------- 246 M8 -------------------------------------------------- 246 M9 -------------------------------------------------- 246 DQ334314 CAAGAATCCCCAAACTAGATTAAACTAAATAGCTAACTGATCCCTATCTT 300 DQ334315 --------------------c----------------------------- 300 M1 -------------------------------------------------- 296 M2 t------------------------------------------------- 296 M3 -------------------------------------------------- 296 M4 -------------------------------------------------- 296 M5 -------------------------------------------------- 296 M6 -------------------------------------------------- 296 M7 -------------------------------------------------- 296 M8 -------------------------------------------------- 296 M9 -------------------------------------------------- 296 DQ334314 CGGTTGGGGCGACCGCGGGAGAAAACAAAGCTCCCACGCAGACTGGGGTT 350 DQ334315 -------------------------------------------------- 350 M1 -------------------------------------------------- 346 M2 -------------------------------------------------- 346 M3 -------------------------------------------------- 346 M4 -------------------------------------------------- 346 M5 -------------------------------------------------- 346 M6 -------------------------------------------------- 346 M7 -------------------------------------------------- 346 M8 -------------------------t------------------------ 346 M9 -------------------------------------------------- 346 DQ334314 ACATCCCTAAAACCAAGAAAGACATCTCTAAGTCACAGAACATCTGACCA 400 DQ334315 -------------------------------------------------- 400 M1 -------------------------------------------------- 396 M2 -------------------------------------------------- 396 M3 -------------------------------------------------- 396 M4 -------------------------------------------------- 396 M5 -------------------------------------------------- 396 M6 -------------------------------------------------- 396 M7 -------------------------------------------------- 396 M8 -------------------------------------------------- 396 M9 -------------------------------------------------- 396 DQ334314 CAAAGATCCGGCCTAACCCGCCGACCAACGGACCAAGTTACCCTAGGGAT 450 DQ334315 -------------------------------------------------- 450 M1 -------------------------------------------------- 446 M2 -------------------------------------------------- 446 M3 -------------------------------------------------- 446 M4 -------------------------------------------------- 446 52 M5 -------------------------------------------------- 446 M6 -------------------------------------------------- 446 M7 -------------------------------------------------- 446 M8 -------------------------------------------------- 446 M9 -------------------------------------------------- 446 DQ334314 AACAGCGCAATCCCCTTCCAGAGTCCATATCGACAAGGGGGTTTACGACC 500 DQ334315 -------------------------------------------------- 500 M1 -------------------------------------------------- 496 M2 -------------------------------------------------- 496 M3 -------------------------------------------------- 496 M4 -------------------------------------------------- 496 M5 -------------------------------------------------- 496 M6 -------------------------------------------------- 496 M7 -------------------------------------------------- 496 M8 -------------------------------------------------- 496 M9 -------------------------------------------------- 496 DQ334314 TCGATGTTGGATCAGGACATCCTAATGGTGCAGCCGCTATTAAGGGTTCG 550 DQ334315 -------------------------------------------------- 550 M1 -------------------------------------------------- 546 M2 -------------------------------------------------- 546 M3 -------------------------------------------------- 546 M4 -------------------------------------------------- 546 M5 -------------------------------------------------- 546 M6 -------------------------------------------------- 546 M7 -------------------------------------------------- 546 M8 -------------------------------------------------- 546 M9 -------------------------------------------------- 546 DQ334314 TTTGTTCAACGATTAAAGTCCT 572 DQ334315 ---------------------- 572 M1 ---- 550 M2 -----a---------t------ 568 M3 -----a---------t----- 567 M4 -----a---------t------ 568 M5 -----a---------t------ 568 M6 -----a---------t------ 568 M7 -----a---------t------ 568 M8 -----a---------t------ 568 M9 -----a---------t------ 568 FILE: Multiple_Sequence_Alignment 53 PROJECT: NUMBER: 17 MAXLENGTH: 568 NAMES: DQ334282 DQ334283 DQ334284 DQ334285 DQ334286 DQ334287 DQ334288 DQ334289 H1 H2 H3 H4 H5 H6 H7 H8 H9 MAXNAMELEN: 9 ORIGIN DQ334282 CGCCTCCTGCAAAAATCAACGTATAGGAGGTCTTGCCTGCCCAGTGACAA 50 DQ334283 -------------------------------------------------- 50 DQ334284 -------------------------------------------------- 50 DQ334285 -------------------------------------------------- 50 DQ334286 -------------------------------------------------- 50 DQ334287 -------------------------------------------------- 50 DQ334288 -------------------------------------------------- 50 DQ334289 -------------------------------------------------- 50 H1 .......------------------a------------------------ 43 H2 ..................-------------------------------- 32 H3 -------------------------------------------------- 50 H4 -------------------------------------------------- 50 H5 -------------------------------------------------- 50 H6 -------------------------------------------------- 50 H7 -------------------------------------------------- 50 H8 -------------------------------------------------- 50 H9 -------------------------------------------------- 50 DQ334282 GTTAAACGGCCGCGGTATTTTGACCGTGCGAAGGTAGCGCAATCACTTGT 100 DQ334283 -------------------------------------------------- 100 DQ334284 -------------------------------------------------- 100 DQ334285 -------------------------------------------------- 100 DQ334286 -------------------------------------------------- 100 DQ334287 -------------------------------------------------- 100 DQ334288 -------------------------------------------------- 100 DQ334289 -------------------------------------------------- 100 H1 -------------------------------------------------- 93 H2 -------------------------------------------------- 82 H3 -------------------------------------------------- 100 H4 -------------------------------------------------- 100 H5 -------------------------------------------------- 100 H6 -------------------------------------------------- 100 H7 -------------------------------------------------- 100 H8 -------------------------------------------------- 100 H9 -------------------------------------------------- 100 DQ334282 CTTTTAAATGAAGACCTGTATGAATGGTGGAACGAGGGCTTAACTGTCTC 150 DQ334283 -------------------------------------------------- 150 DQ334284 -------------------------------------------------- 150 DQ334285 -------------------------------------------------- 150 DQ334286 -------------------------------------------------- 150 DQ334287 -------------------------------------------------- 150 DQ334288 -------------------------------------------------- 150 DQ334289 -------------------------------------------------- 150 H1 -------------------------------------------------- 143 H2 -------------------------------------------------- 132 H3 -------------------------------------------------- 150 H4 -------------------------------------------------- 150 H5 -------------------------------------------------- 150 H6 -------------------------------------------------- 150 54 H7 -------------------------------------------------- 150 H8 -------------------------------------------------- 150 H9 -------------------------------------------------- 150 DQ334282 CCCTTTCAAGTCAATGAAATTGATCTGCCCGTGCAGAAGCGGGCATACAA 200 DQ334283 -------------------------------------------------- 200 DQ334284 -----------------------------------a-------------- 200 DQ334285 -------------------------------------------------- 200 DQ334286 -------------------------------------------------- 200 DQ334287 -------------------------------------------------- 200 DQ334288 -------------------------------------------------- 200 DQ334289 -------------------------------------------------- 200 H1 -------------------------------------------------- 193 H2 -------------------------------------------------- 182 H3 -------------------------------------------------- 200 H4 -------------------------------------------------- 200 H5 -------------------------------------------------- 200 H6 -------------------------------------------------- 200 H7 -------------------------------------------------- 200 H8 -------------------------------------------------- 200 H9 -------------------------------------------------- 200 DQ334282 ATACAAGACGAGAAGACCCTTTGGAGCTTAAGATACAAGATCAACTATGT 250 DQ334283 -------------------------------------------------- 250 DQ334284 -------------------------------------------------- 250 DQ334285 -----------------------------------t-------------- 250 DQ334286 -------------------------------------------------- 250 DQ334287 -------------------------------------------------- 250 DQ334288 -------------------------a------------------------ 250 DQ334289 -------------------------------------------------- 250 H1 -----------------------------------t-------------- 243 H2 -------------------------------------------------- 232 H3 -------------------------------------------------- 250 H4 -----------------------------------t-------------- 250 H5 -----------------------------------t-------------- 250 H6 -----------------------------------t-------------- 250 H7 -------------------------------------------------- 250 H8 -------------------------------------------------- 250 H9 -------------------------------------------------- 250 DQ334282 CAAGAACCCTAAAAGTTAAACTAAATAGCAACTGATCCTTATCTTCGGTT 300 DQ334283 -------------------------------------------------- 300 DQ334284 -------------------------------------------------- 300 DQ334285 -------------------------------------------------- 300 DQ334286 -------------------------------------------------- 300 DQ334287 -------------------------------------------------- 300 DQ334288 -------------------------------------------------- 300 DQ334289 -------------------------------------------------- 300 H1 -------------------------------------------------- 293 H2 -------------------------------------------------- 282 H3 -------------------------------------------------- 300 H4 -------------------------------------------------- 300 H5 -------------------------------------------------- 300 H6 -------------------------------------------------- 300 H7 -------------------------------------------------- 300 H8 -------------------------------------------------- 300 H9 -------------------------------------------------- 300 55 DQ334282 GGGGCGACCGCGGGAGAAAATAAAGCTCCCACGCGGACTGGGGTTAATCC 350 DQ334283 -------------------------------------------------- 350 DQ334284 -------------------------------------------------- 350 DQ334285 -------------------------------------------------- 350 DQ334286 -------------a------------------------------------ 350 DQ334287 -------------------------------------------------- 350 DQ334288 -------------------------------------------------- 350 DQ334289 ----t--------------------------------------------- 350 H1 -------------------------------------------------- 343 H2 -------------------------------------------------- 332 H3 -------------------------------------------------- 350 H4 -------------------------------------------------- 350 H5 -------------------------------------------------- 350 H6 -------------------------------------------------- 350 H7 -------------------------------------------------- 350 H8 -------------------------------------------------- 350 H9 -------------------------------------------------- 350 DQ334282 CCTAAAACCAAGAAAGACATTTCTAAGTCACAGAATATTTGACCACAAAG 400 DQ334283 ---------------a---------------------------------- 400 DQ334284 -------------------------------------------------- 400 DQ334285 -------------------------------------------------- 400 DQ334286 -------------------------------------------------- 400 DQ334287 --------------------------------------c----------- 400 DQ334288 -------------------------------------------------- 400 DQ334289 -------------------------------------------------- 400 H1 -------------------------------------------------- 393 H2 --------------------------------------c----------- 382 H3 -------------------------------------------------- 400 H4 -------------------------------------------------- 400 H5 -------------------------------------------------- 400 H6 -------------------------------------------------- 400 H7 --------------------------------------c----------- 400 H8 -------------------------------------------------- 400 H9 -------------------------------------------------- 400 DQ334282 ATCCGGCTTACAACTGCCGACCAACGGACCAAGTTACCCTAGGGATAACA 450 DQ334283 -------------------------------------------------- 450 DQ334284 -------------------------------------------------- 450 DQ334285 -------------------------------------------------- 450 DQ334286 -------------------------------------------------- 450 DQ334287 -------------------------------------------------- 450 DQ334288 -------------------------------------------------- 450 DQ334289 -------------------------------------------------- 450 H1 -------------------------------------------------- 443 H2 -------------------------------------------------- 432 H3 -------------------------------------------------- 450 H4 -------------------------------------------------- 450 H5 -------------------------------------------------- 450 H6 -------------------------------------------------- 450 H7 -------------------------------------------------- 450 H8 -------------------------------------------------- 450 H9 -------------------------------------------------- 450 DQ334282 GCGCAATCCCCTTCCAGAGTCCATATCGACAAGGGGGTTTACGACCTCGA 500 DQ334283 -------------------------------------------------- 500 DQ334284 -------------------------------------------------- 500 DQ334285 -------------------------------------------------- 500 56 DQ334286 -------------------------------------------------- 500 DQ334287 -------------------------------------------------- 500 DQ334288 -------------------------------------------------- 500 DQ334289 -------------------------------------------------- 500 H1 -------------------------------------------------- 493 H2 -------------------------------------------------- 482 H3 -------------------------------------------------- 500 H4 -------------------------------------------------- 500 H5 -------------------------------------------------- 500 H6 -------------------------------------------------- 500 H7 -------------------------------------------------- 500 H8 -------------------------------------------------- 500 H9 -------------------------------------------------- 500 DQ334282 TGTTGGATCAGGACATCCTAATGGTGCAGCCGCTATTAAGGGTTCGTTTG 550 DQ334283 -------------------------------------------------- 550 DQ334284 -------------------------------------------------- 550 DQ334285 -------------------------------------------------- 550 DQ334286 -------------------------------------------------- 550 DQ334287 -------------------------------------------------- 550 DQ334288 -------------------------------------------------- 550 DQ334289 -------------------------------------------------- 550 H1 ------------------------------------------- 536 H2 -------------------------------------------------- 532 H3 -------------------------------------------------- 550 H4 -------------------------------------------------- 550 H5 -------------------------------------------------- 550 H6 -------------------------------------------------- 550 H7 -------------------------------------------------- 550 H8 -------------------------------------------------- 550 H9 -------------------------------------------------- 550 DQ334282 TTCAACGATTAAAGTCCT 568 DQ334283 ------------------ 568 DQ334284 ------------------ 568 DQ334285 ------------------ 568 DQ334286 ------------------ 568 DQ334287 ------------------ 568 DQ334288 ------------------ 568 DQ334289 ------------------ 568 H2 --------- 541 H3 ------------------ 568 H4 ------------------ 568 H5 ------------------ 568 H6 ------------------ 568 H7 ------------------ 568 H8 ------------------ 568 H9 ------------------ 568 FILE: Multiple_Sequence_Alignment 57 PROJECT: NUMBER: 19 MAXLENGTH: 571 NAMES: DQ334303 DQ334304 DQ334305 DQ334306 DQ334307 DQ334308 DQ334309 DQ334310 DQ334311 DQ334312 DQ334313 l1 L2 L3 L4 L5 L6 L7 L8 MAXNAMELEN: 8 ORIGIN DQ334303 CGCCTCCTGCAAAAACCAATGTATAGGAGGTCTTGCCTGCCCAGTGACAA 50 DQ334304 -------------------------------------------------- 50 DQ334305 -------------------------------------------------- 50 DQ334306 -------------------------------------------------- 50 DQ334307 -------------------------------------------------- 50 DQ334308 -------------------------------------------------- 50 DQ334309 -------------------------------------------------- 50 DQ334310 -------------------------------------------------- 50 DQ334311 -------------------------------------------------- 50 DQ334312 -------------------------------------------------- 50 DQ334313 -------------------------------------------------- 50 l1 -------------------------------------------------- 50 L2 -------------------------------------------------- 50 L3 -------------------------------------------------- 50 L4 -------------------------------------------------- 50 L5 -------------------------------------------------- 50 L6 -------------------------------------------------- 50 L7 -------------------------------------------------- 50 L8 -------------------------------------------------- 50 DQ334303 GTTAAACGGCCGCGGTATTTTGACCGTGCGAAGGTAGCGCAATCACTTGT 100 DQ334304 -------------------------------------------------- 100 DQ334305 -------------------------------------------------- 100 DQ334306 -------------------------------------------------- 100 DQ334307 --------------------------------------------c----- 100 DQ334308 -------------------------------------------------- 100 DQ334309 -------------------------------------------------- 100 DQ334310 ----------------------t--------------------------- 100 DQ334311 -------------------------------------------------- 100 DQ334312 ------------------c------------------------------- 100 DQ334313 -------------------------------------------------- 100 l1 -------------------------------------------------- 100 L2 -------------------------------------------------- 100 L3 -------------------------------------------------- 100 L4 -------------------------------------------------- 100 L5 ------------------c------------------------------- 100 L6 -------------------------------------------------- 100 L7 -------------------------------------------------- 100 L8 -------------------------------------------------- 100 DQ334303 CTTTTAAATGAAGACCTGTATGAATGGTGGAACGAGGGCTTAACTGTCTC 150 DQ334304 -------------------------------------------------- 150 DQ334305 -------------------------------------------------- 150 DQ334306 -------------------------------------------------- 150 DQ334307 -------------------------------------------------- 150 DQ334308 -------------------------------------------------- 150 DQ334309 -------------------------------------------------- 150 DQ334310 -------------------------------------------------- 150 DQ334311 -------------------------------------------------- 150 58 DQ334312 -------------------------------------------------- 150 DQ334313 -------------------------------------------------- 150 l1 -------------------------------------------------- 150 L2 -------------------------------------------------- 150 L3 -------------------------------------------------- 150 L4 -------------------------------------------------- 150 L5 -------------------------------------------------- 150 L6 -------------------------------------------------- 150 L7 -------------------------------------------------- 150 L8 -------------------------------------------------- 150 DQ334303 CCCTTTCAAGTCAATGAAATTGATCTGCCCGTGCAGAAGCGGACATACAA 200 DQ334304 -------------------------------------------------- 200 DQ334305 -------------------------------------------------- 200 DQ334306 -------------------------------------------------- 200 DQ334307 -------------------------------------------------- 200 DQ334308 -------------------------------------------------- 200 DQ334309 -------------------------------------------------- 200 DQ334310 --------------------------t----------------------- 200 DQ334311 -------------------------------------------------- 200 DQ334312 -------------------------------------------------- 200 DQ334313 -------------------------------------------------- 200 l1 -------------------------------------------------- 200 L2 -------------------------------------------------- 200 L3 -------------------------------------------------- 200 L4 -------------------------------------------------- 200 L5 -------------------------------------------------- 200 L6 -------------------------------------------------- 200 L7 -------------------------------------------------- 200 L8 -------------------------------------------------- 200 DQ334303 ATACAAGACGAGAAGACCCTTTGGAGCTTAAGATACAAGATCAACTATGT 250 DQ334304 -------------------------------------------------- 250 DQ334305 -------------------------------------------------- 250 DQ334306 -------------------------------------------------- 250 DQ334307 -------------------------------------------------- 250 DQ334308 --------------------------------------------t----- 250 DQ334309 -------------------------------------------------- 250 DQ334310 -------------------------------------------------- 250 DQ334311 -------------------------------------------------- 250 DQ334312 -------------------------------------------------- 250 DQ334313 -------------------------------------------------- 250 l1 -------------------------------------------------- 250 L2 -------------------------------------------------- 250 L3 -------------------------------------------------- 250 L4 -------------------------------------------------- 250 L5 -------------------------------------------------- 250 L6 -------------------------------------------------- 250 L7 -------------------------------------------------- 250 L8 -------------------------------------------------- 250 DQ334303 CAAGAACCCCAAAATTAAGTTAAACTAAATAGCCAATTGATCCCTATCTT 300 DQ334304 -------------------------------------------------- 300 DQ334305 -------------------------------------------------- 300 DQ334306 -------------------------------------------------- 300 DQ334307 -------------------------------------------------- 300 DQ334308 -------------------------------------------------- 300 DQ334309 -------------------------------------------------- 300 59 DQ334310 -------------------------------------------------- 300 DQ334311 -------------------------------------------------- 300 DQ334312 -------------------------------------------------- 300 DQ334313 -------------------------------------------------- 300 l1 -------------------------------------------------- 300 L2 -------------------------------------------------- 300 L3 -------------------------------------------------- 300 L4 -------------------------------------------------- 300 L5 -------------------------------------------------- 300 L6 -------------------------------------------------- 300 L7 -------------------------------------------------- 300 L8 -------------------------------------------------- 300 DQ334303 CGGTTGGGGCGACCGCGGGAGAAAATAAAGCTCCCATGCGGACTGGGGTT 350 DQ334304 -------------------------------------------------- 350 DQ334305 -------------------------------------------------- 350 DQ334306 -------------------------------------------------- 350 DQ334307 -------------------------------------------------- 350 DQ334308 -------------------------------------------------- 350 DQ334309 -------------------------------------------------- 350 DQ334310 -------------------------------------------------- 350 DQ334311 ---------------g---------------------------------- 350 DQ334312 -------------------------------------------------- 350 DQ334313 -------------------------------------------------- 350 l1 -------------------------------------------------- 350 L2 -------------------------------------------------- 350 L3 -------------------------------------------------- 350 L4 -------------------------------------------------- 350 L5 -------------------------------------------------- 350 L6 -------------------------------------------------- 350 L7 -------------------------------------------------- 350 L8 -------------------------------------------------- 350 DQ334303 AAACCCTAAAACCAAGAGAGACATCTCTAAGTCACAGAACATCTGACCAC 400 DQ334304 -----------------a-------------------------------- 400 DQ334305 ---------------------------------------t---------- 400 DQ334306 -------------------------------------------------- 400 DQ334307 -------------------------------------------------- 400 DQ334308 --------------------------t----------------------- 400 DQ334309 --------------------------t----------------------- 400 DQ334310 --------------------------t----------------------- 400 DQ334311 -------------------------------------------------- 400 DQ334312 -------------------------------------------------- 400 DQ334313 -------------------------------------------------- 400 l1 -------------------------------------------------- 400 L2 -------------------------------------------------- 400 L3 -------------------------------------------------- 400 L4 -------------------------------------------------- 400 L5 -------------------------------------------------- 400 L6 -------------------------------------------------- 400 L7 -------------------------------------------------- 400 L8 -------------------------------------------------- 400 DQ334303 AAAGATCCGGCCTGACCCGCCGATCAACGGACCAAGTTACCCTAGGGATA 450 DQ334304 -------------------------------------------------- 450 DQ334305 -------------------------------------------------- 450 DQ334306 -------------------------------------------------- 450 DQ334307 --------------t----------------------------------- 450 60 DQ334308 -------------------------------------------------- 450 DQ334309 -------------------------------------------------- 450 DQ334310 -------------------------------------------------- 450 DQ334311 -------------------------------------------------- 450 DQ334312 -------------------------------------------------- 450 DQ334313 -------------------------------------------------- 450 l1 -------------------------------------------------- 450 L2 -------------------------------------------------- 450 L3 -------------------------------------------------- 450 L4 -------------------------------------------------- 450 L5 -------------------------------------------------- 450 L6 -------------------------------------------------- 450 L7 -------------------------------------------------- 450 L8 -------------------------------------------------- 450 DQ334303 ACAGCGCAATCCCCTTTCAGAGTCCATATCGACAAGGGGGTTTACGACCT 500 DQ334304 -------------------------------------------------- 500 DQ334305 -------------------------------------------------- 500 DQ334306 -------------------------------g------------------ 500 DQ334307 -------------------------------------------------- 500 DQ334308 -------------------------------------------------- 500 DQ334309 -------------------------------------------------- 500 DQ334310 -------------------------------------------------- 500 DQ334311 -------------------------------------------------- 500 DQ334312 -------------------------------------------------- 500 DQ334313 -------------------------------------------------- 500 l1 -------------------------------------------------- 500 L2 -------------------------------------------------- 500 L3 -------------------------------------------------- 500 L4 -------------------------------------------------- 500 L5 -------------------------------------------------- 500 L6 -------------------------------------------------- 500 L7 -------------------------------------------------- 500 L8 -------------------------------------------------- 500 DQ334303 CGATGTTGGATCAGGACATCCTAATGGTGCAGCCGCTATTAAGGGTTCGT 550 DQ334304 -------------------------------------------------- 550 DQ334305 -------------------------------------------------- 550 DQ334306 -------------------------------------------------- 550 DQ334307 -------------------------------------------------- 550 DQ334308 -------------------------------------------------- 550 DQ334309 -------------------------------------------------- 550 DQ334310 -------------------------------------------------- 550 DQ334311 -------------------------------------------------- 550 DQ334312 -------------------------------------------------- 550 DQ334313 ---------------g-------------------g-------------- 550 l1 -------------------------------------------------- 550 L2 -------------------------------------------------- 550 L3 -------------------------------------------------- 550 L4 ---------------g-------------------g-------------- 550 L5 -------------------------------------------------- 550 L6 ---------------g-------------------g-------------- 550 L7 ---------------g-------------------g-------------- 550 L8 -------------------------------------------------- 550 DQ334303 TTGTTCAACGATTAAAGTCCT 571 DQ334304 --------------------- 571 DQ334305 --------------------- 571 61 DQ334306 --------------------- 571 DQ334307 --------------------- 571 DQ334308 --------------------- 571 DQ334309 --------------------- 571 DQ334310 --------------------- 571 DQ334311 --------------------- 571 DQ334312 --------------------- 571 DQ334313 --------------------- 571 l1 --------------------- 571 L2 --------------------- 571 L3 --------------------- 571 L4 --------------------- 571 L5 --------------------- 571 L6 --------------------- 571 L7 --------------------- 571 L8 --------------------- 571