Khóa luận Ứng dụng kỹ thuật hóa mô miễn dịch (Immunohistochemistry) trong chẩn đoán mầm bệnh virus đốm trắng (White Spot Syndrome Virus – WSSV) trên tôm sú (Penaeus monodon)

10x, 40x, 100x. Tế bào nhiễm WSSV có thể vùi dạng Crowdry A đặc trưng với nhân trương to, sau đó hạch nhân trương to hơn, chiếm hết nhân, bắt màu nâu.  Các kết quả được khảo sát dựa trên: + Tỷ lệ cảm nhiễm là số tôm bệnh trên tổng số tôm kiểm tra. + Cường độ cảm nhiễm là % tế bào nhiễm virus. + Cường độ bắt màu là % tế bào nhiễm bắt màu nâu (vì ngoài màu nâu, tế bào nhiễm còn có thể bắt màu nâu nhạt hay vàng). + Độ sắc nét là % tế bào nhiễm bắt màu sắc nét.  Kết quả xét nghiệm được mã hoá thành kí hiệu và giá trị có ý nghĩa về mặt toán học (Bảng 3.1). Bảng 3.5. Bảng mã hoá kết quả Nội du g Số liệu Cường độ Kí hiệu mã hoá cảm nhiễm - 0 0% 0% 0% +/- 1 0 - 25% 0 - 25% 0 - 25% + 2 25 - 50% 25 - 50% 25 - 50% ++ 3 50 - 75% 50 - 75% 50 - 75% +++ 4 75 - 100% 75 - 100% 75 - 100% Cường độ bắt màu Độ sắc nét  Sau khi đọc kết quả, các lam chứa mẫu và các thông số đều được lưu lại. Trong suốt quá trình thực hiện cần đánh dấu mẫu cẩn thận để tránh nhầm lẫn 41 PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả nội dung hoàn thiện quy trình nhuộm IHC Tất cả các thí nghiệm so sánh trên cùng một mẫu được ghi nhận kết quả trên các lát cắt liên tiếp nhau. 4.1.1. Thử nghiệm quy trình nhuộm IHC với 3 nồng độ DAB khác nhau Bảng 4.1. Kết quả so sánh chi tiết 3 quy trình nhuộm IHC với 3 nồng độ DAB khác nhau trên 5 mẫu thử nghiệm Kí hiệu Cường độ cảm nhiễm Cường độ bắt màu Độ sắc nét 1X 1,5X 2X 1X 1,5X 2X 1X 1,5X 2X 45P + + + - - +/- - - +/- 45D +/- + + - + ++ - +/- +/- 101 +/- + + - + + - + + 53 +/- + + - + ++ - + ++ 103 +/- + + - + + - + + - Nồng độ 1X: Tất cả các tế bào bắt màu DAB đều có màu vàng nhạt hay nâu rất nhạt, một số tế bào bắt màu DAB rất mờ không thể xác định rõ có phải là tế bào nhiễm virus hay không, vì vậy mà cường độ cảm nhiễm của 4/5 mẫu thấp hơn 2 nồng độ còn lại. Nhân tế bào bắt màu DAB không có hình dạng đặc trưng của tế bào nhiễm virus.  Ở vật kính 10x: Phải quan sát rất kĩ mới nhận ra màu nhuộm.  Ở vật kính 40x: Có thể nhận thấy màu vàng nhạt ở một số tế bào nhưng tất cả các tế bào bắt màu đều không có hình dạng đặc trưng của tế bào nhiễm virus (nhân không tròn và trương to), không sắc nét.  Ở vật kính 100x: Một số tế bào có nhân trương to và khá tròn nhưng không sắc nét. Hình dạng nhân tạo thành bởi những chấm màu vàng hay nâu nhạt khá rời rạc. 42 - Nồng độ 1,5X: Lượng tế bào bắt màu DAB có màu nâu tăng lên đáng kể so với nồng độ 1X, một số tế bào còn có màu nâu đậm. Hình dạng đặc trưng của nhân tế bào nhiễm virus thể hiện rõ ở nhiều tế bào. Vì vậy có thể xác định thêm một số tế bào nhiễm.  Ở vật kính 10x: Có thể nhận thấy rõ màu nhuộm khác biệt so với màu nền.  Ở vật kính 40x: Phần lớn tế bào bắt màu DAB đều có màu nâu hay nâu nhạt. Hình dạng nhân khá rõ ràng và sắc nét.  Ở vật kính 100x: Nhân tế bào trương to, tròn, rõ nét. - Nồng độ 2X: Gần như tất cả các tế bào bắt màu DAB đều có màu nâu hay nâu đậm, một số tế bào có màu nâu rất đậm, gần như đen, phần lớn tế bào có nhân rất đặc trưng của tế bào nhiễm WSSV, trương to và tròn.  Ở vật kính 10x: Màu nhuộm thể hiện rất rõ, có thể xác định ngay tế bào nhiễm.  Ở vật kính 40x: Nhân tế bào bắt màu nâu rõ nét. Nhiều tế bào có hình dạng đặc trưng của tế bào nhiễm WSSV  Ở vật kính 100: Màu nâu thể hiện rất đậm ở một số mẫu, ngay cả ở những tế bào không có hình dạng đặc trưng vẫn rất sắc nét. Nhìn chung, kết quả quan sát dưới kính hiển vi cho thấy có sự khác biệt đáng kể về cường độ cảm nhiễm của mẫu, cường độ bắt màu, và độ sắc nét của tế bào nhiễm khi nhuộm với DAB 1X so với nồng độ 1,5X và 2X. Nồng độ 1X có khả năng nhuộm rất kém, không thể nhận biết rõ tế bào nhiễm WSSV với nồng độ này. Nồng độ 1,5X và 2X thể hiện kết quả nhuộm tốt, nồng độ 2X có ưu thế hơn về cường độ bắt màu và độ sắc nét nhưng nhiều tế bào lại bắt màu quá đậm, không cần thiết. Ở nồng độ 1,5X chỉ có mẫu 45P bắt màu kém và không sắc nét. Điều này có thể do nhiều nguyên nhân như không đủ lượng DAB, lượng virus nhiễm ít, mẫu nhuộm không tốt làm trôi màu, không đủ lượng kháng thể ... Nhưng khi so sánh kết quả nhuộm với DAB 2X, cường độ cảm nhiễm và độ sắc nét được cải thiện không đáng kể. Do đó mẫu 45P bắt màu không tốt chắc chắn không phải vì nồng độ DAB không đủ để cho phản ứng. 43 Như vậy, nồng độ 1,5X biểu hiện tốt nhất với quy trình nhuộm này vì không mất nhiều DAB một cách không cần thiết như nồng độ 2X nhưng vẫn cho kết quả nhuộm tốt. Hình 4.1. Kết quả nhuộm IHC với 3 nồng độ DAB khác nhau trên mẫu 45D (tất cả hình ảnh được chụp trên cùng một vị trí mang). A1, A2, A3: Mẫu mô sau khi nhuộm IHC với DAB 1X (100x), (400x), (1000x). - Hình A1: Tế bào nhiễm bắt màu nâu nhạt, lẫn với màu nền, rất khó nhận ra. - Hình A2: Có thể nhận thấy sự khác biệt giữa màu DAB và màu nền nhưng không rõ, hình dạng tế bào nhiễm không sắc nét. Một số tế bào (mũi tên) không thể xác định được có nhiễm virus hay không. - Hình A3: Màu DAB nhạt, không rõ nhân tế bào nhiễm A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3 44 B1, B2, B3: Mẫu mô sau khi nhuộm IHC với DAB 1,5X (100x), (400x), (1000x). - Hình B1: Có thể nhận thấy rõ vị trí tế bào nhiễm, màu DAB thể hiện rõ. - Hình B2: Tế bào nhiễm (mũi tên) thể hiện màu sắc và hình dạng đặc trưng. - Hình B3: Vị trí X - nhân tế bào nhiễm WSSV điển hình. Vị trí Y: hạch nhân trương to, có thể thấy rõ mép nhân. Vị trí Z: tế bào nhiễm phóng thích virus. C1, C2, C3: Mẫu mô sau khi nhuộm IHC với DAB 2X (100x), (400x), (1000x). - Hình C1:Dễ dàng nhìn thấy tế bào nhiễm do màu DAB quá đậm, gần như đen. - Hình C2, C3: Nhận thấy tế bào nhiễm rất rõ và sắc nét. 4.1.2. Thử nghiệm quy trình nhuộm IHC với 4 nồng độ mAb khác nhau Bảng 4.2. Kết quả so sánh chi tiết 4 quy trình nhuộm IHC với 4 nồng độ mAb khác nhau trên 10 mẫu thử nghiệm 0,5X 1X 1,5X 2X 0,5X 1X 1,5X 2X 0,5X 1X 1,5X 2X 45P Sóc Trăng +/- + + + +/- - + ++ - - + + 45D Sóc Trăng + + + + + + ++ ++ - - - + 101 Cà Mau + + + +/- +/- + + + - + - + 53 Sóc Trăng + + + + +/- + ++ +++ + + + ++ 103 Cà Mau +/- + + + + + + +++ +/- - - + 97 Cà Mau + + + + + ++ + +++ +/- ++ + +++ 50 Sóc Trăng - - - - - - - - - - - - 98 Cà Mau + ++ ++ ++ + ++ ++ +++ + ++ ++ ++ 453 Cà Mau - - - - - - - - - - - - 99 Cà Mau +/- + + + + + ++ +++ +/- + + ++ Kí hiệu Nơi thu Cường độ bắt màuCường độ cảm nhiễm Độ sắc nét 45 Bảng 4.3. Kết quả thống kê so sánh quy trình nhuộm IHC với 4 nồng độ mAb. Nồng độ kháng thể Lượng mẫu Trung bình có ý nghĩa nhỏ nhất Nhóm giống nhau Cường độ cảm nhiễm Cường độ bắt màu Độ sắc nét Cường độ cảm nhiễm Cường độ bắt màu Độ sắc nét 0,5X 1X 1,5X 2X 10 10 10 10 1,3 1,7 1,7 1,6 1,3 1,6 2 2,8 0,7 1,2 1,1 2,1 X X X X X XX X X X X X X So sánh đối chiếu Giới hạn +/- khác biệt Cường độ cảm nhiễm Cường độ bắt màu Độ sắc nét 0,5X – 1X 0,5X – 1,5X 0,5X – 2X 1X – 1,5X 1X – 2X 1,5X – 2X -0,4 0,28889 * -0,4 0,28889 * -0,3 0,28889 * 0 0,28889 0,1 0,28889 0,1 0,28889 -0,3 0,54657 -0,7 0,54657 * -1,5 0,54657 * -0,4 0,54657 -1,2 0,54657 * -0,8 0,54657 * -0,5 0,60612 -0,4 0,60612 -1,4 0,60612 * 0,1 0,60612 -0,9 0,60612 * -1,0 0,60612 * Dấu * chỉ sự khác biệt có ý nghĩa thống kê A. Về cường độ cảm nhiễm Dựa trên kết quả sau khi xử lý số liệu (Bảng 4.1), có thể kết luận được là về khả năng phát hiện tế bào nhiễm, nồng độ mAb 0,5X kém hơn so với 3 nồng độ còn lại. Khi đọc mẫu, ở nồng độ 0,5X, có thể nhận thấy nhiều tế bào có biểu hiện nhiễm WSSV nhưng lại bắt màu nền (tím) hoặc có màu tím pha nâu rất khó nhận ra, vì vậy có thể đã xác định không đúng về cường độ cảm nhiễm. Ở 3 nồng độ còn lại không có hiện tượng này không có hoặc có rất ít. Nguyên nhân: Độ đặc hiệu của mAb cao, chất lượng tốt nên ngay ở nồng độ đề nghị của Đại học Gent đã có thể phát hiện tốt những tế bào nhiễm virus. 46 Nồng độ mAb càng giảm, lượng kháng thể bắt cặp với kháng nguyên trên tế bào nhiễm càng giảm, kết quả là không đủ kháng thể để kết hợp với kháng nguyên (nồng độ 0,5X) nên một số nhân tế bào nhiễm không có màu nâu (âm tính giả). Nồng độ mAb càng cao, lượng kháng thể đủ để kết hợp hết với kháng nguyên nên nhân tế bào nhiễm có màu nâu rõ nét. Nhưng nếu lượng kháng thể quá cao mà lượng kháng nguyên không thay đổi thì kháng thể cũng sẽ bị rửa trôi khi thao tác do không có kháng nguyên để kết hợp. Chính vì vậy mà không có sự khác biệt về khả năng phát hiện tế bào nhiễm của nồng độ 1X, 1,5X và 2X. B. Về cường độ bắt màu: Không có sự khác biệt giữa hai nồng độ 0,5X và 1X, giữa 1X và 1,5 X, nhưng lại có sự khác biệt giữa nồng độ 2X với ba nồng độ còn lại (Bảng 4.3, Hình 4.2.). - Nồng độ 0,5X: Một số tế bào nhiễm bắt màu không rõ ràng, lẫn với màu nền hoặc có màu nâu nhạt.  Ở vật kính 10x: Khó nhận ra tế bào nhiễm.  Ở vật kính 40x, 100x: Tế bào nhiễm có màu nâu rõ ràng hơn, nhân trương to nhưng một số tế bào lại có nhân màu tím, xuất hiện những vết màu nâu nhạt ở trong nhân hoặc nhân có màu nâu pha tím. - Nồng độ 1X và 1,5X: Khả năng bắt màu của tế bào nhiễm đều rất tốt. Phần lớn tế bào nhiễm có màu nâu đặc trưng. Người đọc dễ dàng nhận ra tế bào nhiễm ngay cả ở vật kính 10x. - Nồng độ 2X: Gần như toàn bộ các tế bào nhiễm đều bắt màu nâu, nhiều tế bào còn bắt màu nâu rất đậm (gần như đen), thể hiện rõ ở cả 3 vật kính. Tuy nhiên ở ba nồng độ này vẫn có những tế bào bắt màu vàng hoặc nâu nhạt nhưng chiếm tỉ lệ thấp. Nguyên nhân: Do sự khác biệt về nồng độ kháng thể sơ cấp. Nồng độ kháng thể cao, tất cả kháng nguyên đều kết hợp với kháng thể thì tín hiệu khuyếch đại sẽ lớn, cho màu đậm và ngược lại. 47 Tuy nhiên sự khác biệt về màu sắc của tế bào nhiễm virus còn phụ thuộc vào trạng thái nhiễm WSSV của tế bào. Có 4 pha nhiễm của tế bào ứng với 4 pha của virus: Pha sớm (tế bào mới nhiễm virus), pha tăng sinh (lượng virus trong hạch nhân tăng nhanh chiếm hết nhân, dùng cơ chất trong nhân để sao chép vật liệu di truyền), pha cấp (virus phá vỡ màng nhân xâm nhiễm vào tế bào chất, sử dụng cơ chất trong tế bào chất để hoàn chỉnh cấu trúc), pha phóng thích (tế bào vỡ và phóng thích virus). Nếu tế bào ở pha sớm, hạch nhân sẽ có màu vàng đến nâu nhạt. Nếu tế bào ở pha tăng sinh, hạch nhân trương to chiếm hết nhân và bắt màu nâu. Nếu tế bào ở pha cấp sẽ nhận thấy tế bào trương to và nâu sậm. Nếu tế bào ở pha phóng thích sẽ thấy có màu vàng, lan ra. Vì vậy ở bất kì nồng độ kháng thể nào cũng có những tế bào bắt màu vàng hay nâu nhạt, chỉ tuỳ vào lượng mAb nhiều hay ít, kết hợp đủ với kháng nguyên thì tín hiệu khuyếch đại sẽ nhiều, có thể giảm lượng tế bào có màu vàng hay nâu nhạt. C. Về độ sắc nét: Ở các nồng độ 0,5X, 1X và 1,5X, độ sắc nét của màu nhuộm thể hiện trên tế bào nhiễm không cao. Nồng độ 2X khác hẳn 3 nồng độ còn lại, trên tất cả các mẫu dương tính (8/10), phần lớn nhân tế bào trương to và tròn, có thể nhận thấy rõ mép nhân (25 - 75% tế bào có trên mẫu), những tế bào không có hình dạng đặc trưng là tròn to thì vẫn sắc nét (Bảng 4.4, Hình 4.2). - Nồng độ 0,5X; 1X và 1,5X: Kết quả được ghi nhận chủ yếu ở vật kính 40x và 100x vì ở vật kính 10x gần như tất cả các tế bào nhiễm đều không thể hiện được độ sắc nét. - Nồng độ 2X: Nhiều tế bào thể hiện sự sắc nét ngay ở vật kính 10x. Nguyên nhân: Thời gian giữ mẫu sau khi đúc trong nến và điều kiện lưu giữ ảnh hưởng lớn đến độ sắc nét. Những mẫu thí nghiệm do được thu, cố định và vùi trong nến cách đây khá lâu nên hình dạng tế bào và nhân tế bào không còn rõ nét. Tuy nhiên ở nồng độ 2X do lượng mAb quá cao, có thể đã kết hợp với toàn bộ kháng nguyên nên hình ảnh tế bào nhiễm sắc nét hơn. Ngoài ra độ sắc nét cũng phụ thuộc vào giai đoạn nhiễm WSSV của tế bào. Nếu tế bào ở pha sớm, hạch nhân trương lên nhưng chưa to. Ở pha tăng sinh và pha cấp thì 48 nhân sẽ có hình dạng đặc trưng. Ở pha phóng thích, hình dạng tế bào không rõ do có sự vỡ tế bào. A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3 D1 D2 D3 E1 E2 E3 49 Hình 4.2. Kết quả nhuộm IHC với 4 nồng độ mAb khác nhau và không có mAb trên mẫu 103 (tất cả hình ảnh được chụp trên cùng một mang). A1, A2, A3: Mẫu mô sau khi nhuộm IHC với mAb 0X (100x), (400x), (1000x). - Hình A1: Không thể nhận ra tế bào nhiễm - Hình A2: Vị trí mũi tên có thể là tế bào nhiễm - Hình A3: Tế bào nhiễm có nhân trương to và bắt màu hematoxylin. B1, B2, B3: Mẫu mô sau khi nhuộm IHC với mAb 0,5X (100x), (400x), (1000x). - Hình B1: Nhận thấy những vị trí bắt màu vàng đến nâu nhạt trên mẫu - Hình B2, B3: Tế bào nhiễm có màu sắc khá rõ ràng, chỉ có tế bào ở vị trí mũi tên mới có hình dạng đặc trưng. C1, C2, C3: Mẫu mô sau khi nhuộm IHC với mAb 1X (100x), (400x), (1000x). - Hình C1: Có thể nhận thấy rõ vi trí tế bào nhiễm có màu nâu. - Hình C2, C3: Tế bào nhiễm bắt màu đẹp, sắc nét. D1, D2, D3: Mẫu mô sau khi nhuộm IHC với mAb 1,5X (100x), (400x), (1000x). Tế bào nhiễm biểu hiện rõ ràng, dễ nhận biết E1, E2, E3: Mẫu mô sau khi nhuộm IHC với mAb 2X (100x), (400x), (1000x). - Hình E1: Các tế bào nhiễm bắt màu nâu rất đậm, gần như đen. - Hình E2, E3: Màu DAB quá đậm, hình dạng nhân sắc nét 4.2. Kết quả nội dung so sánh phƣơng pháp IHC với phƣơng pháp Mô học truyền thống và kỹ thuật PCR về độ chính xác, độ nhạy, tính ổn định và tính hiệu quả. 4.2.1. So sánh độ chính xác và độ nhạy của 3 phƣơng pháp PCR, mô học và IHC. 50 Bảng 4.4. Kết quả so sánh khả năng phát hiện mầm bệnh WSSV của ba phƣơng pháp PCR, Mô học và IHC trên tôm sú post-larvae và tôm thƣơng phẩm. Tôm post-larvae Tôm thương phẩm Kí hiệu PCR Mô học IHC Kí hiệu PCR Mô học IHC 7683 - - - 101 + + 7787 - - - 97 + + 7661 + - - 98 ++ ++ 7781 - - - 99 + + 7536 + - - 336 ++ + 7786 - - - 341 ++ + 7718 - - - 342 ++ + 7769 - - - 340 + + 7768 - - - 339 ++ + 7764 - - - 338 + + 7684 - - - 103 + + + 7691 - - - 44 ++ + ++ 7650 + - - 55 +++ ++ + 7722 - - - 57 - - - 7725 - - - 49 - - - 2682 + - - 94 + + + 2741 + - - 136 - - - 2708 + - - 134 - - - 3122 - - - 137 - - - 2752 + - - 135 - - - 2745 + - - 159 +++ ++ +++ 12964 - 5%(+) 20%(++) 161 - - - 2794 - 10%(++) 10%(+++) 152 + ++ ++ 2746 + - - 153 ++ + + 7755 ++ - - 156 + + + 178 - - - 179 - - - 181 - - - 182 - - - 185 - - - 51 Bảng 4.5. Kết quả thống kê so sánh khả năng phát hiện mầm bệnh virus đốm trắng của ba phƣơng pháp PCR, Mô học truyền thống và IHC Loại xét nghiệm Lượng mẫu Trung bình có ý nghĩa nhỏ nhất Nhóm giống nhau Tôm post- larvae Tôm thương phẩm Tôm post- larvae Tôm thương phẩm Tôm post- larvae Tôm thương phẩm PCR Mô học IHC 25 25 25 20 30 30 0,84 0,2 0,28 1,59167 1,46667 1,36667 X X X X X X So sánh đối chiếu Khác biệt +/- Giới hạn Tôm post-larvae Tôm thương phẩm PCR – Mô học PCR – IHC Mô học - IHC 0,64 0,50112 * 0,56 0,50112 * -0,08 0,50112 * 0,125 0,25026 0,225 0,25026 0,1 0,25026 Dấu * chỉ sự khác biệt có ý nghĩa thống kê A. Trên đối tượng tôm post-larvae: Bảng kết quả (Bảng 4.2) cho thấy không có sự khác biệt về khả năng phát hiện tế bào nhiễm virus giữa phương pháp IHC và phương pháp mô học nhưng sự khác biệt này lại rất rõ nét giữa phương pháp PCR và 2 phương pháp còn lại. Như vậy, độ nhạy của PCR là khá cao và độ nhạy của IHC và mô học khác nhau không đáng kể. Theo quan sát dưới kính hiển vi, các mẫu nhuộm IHC biểu hiện nhân nhiễm WSSV rất rõ ràng, có thể nhận biết ngay ở vật kính 10x, nhưng với phương pháp Mô học cần phải tập trung và tìm thật kĩ mới nhận biết được những tế bào nhiễm. Trên 2 mẫu 12964 và 2794, IHC và mô học đều cho kết quả dương tính với tỷ lệ cảm nhiễm thấp và cường độ cảm nhiễm khá cao nhưng PCR lại cho kết quả âm tính. Khi xét nghiệm bằng IHC, cường độ cảm nhiễm và tỉ lệ cảm nhiễm của 2 mẫu này cao hơn xét nghiệm bằng Mô học. Có 10 mẫu (7661, 7536, 7650, 2682, 2741, 2708, 2752, 2745, 52 2746, 7755) PCR cho kết quả dương tính nhưng IHC và Mô học đều cho kết quả âm tính. Nguyên nhân: - Phương pháp PCR: Tôm post-larvae do chưa phải tuổi mẫn cảm nên thường nhiễm WSSV ở dạng tiềm ẩn, lượng virus trong mẫu rất ít, chỉ có phương pháp PCR với khả năng khuyếch đại một lượng rất nhỏ DNA của virus mới nhận biết được. Hơn nữa, trong quá trình xét nghiệm bằng PCR mẫu được đồng nhất nên tất các các bộ phận của cá thể tôm trong mẫu đều được kiểm tra, lượng tôm trong mẫu xét nghiệm có thể nhiều nên khả năng phát hiện mầm bệnh cao hơn. Vì vậy trên đối tượng tôm post-larvae phương pháp PCR có độ nhạy cao nhất (phát hiện ra 10 mẫu dương tính trong khi Mô học và IHC không thể phát hiện được). Tuy nhiên, tính chính xác của phương pháp PCR lại phụ thuộc rất nhiều vào tính đặc hiệu của primer và nhiều yếu tố khách quan và chủ quan khác như chất lượng hoá chất, thao tác của người làm thí nghiệm … Độ nhạy và tính chuyên biệt cao của phương pháp PCR vừa là ưu điểm vừa là trở ngại của phương pháp này vì có thể cho kết quả âm tính giả do chất lượng hoá chất, primer giảm trong quá trình bảo quản …hay do mầm bệnh mới xuất hiện, lượng tôm nhiễm ít, ngẫu nhiên không có cá thể bệnh trong số tôm làm xét nghiệm. - Phương pháp mô học và IHC: Khả năng phát hiện tế bào nhiễm phụ thuộc rất nhiều vào quá trình đúc mẫu (lượng tôm được vùi trong nến nhiều hay ít, các cá thể được đúc có nhiễm virus hay không, cơ quan đích của virus có nằm gần mặt cắt hay không), chất lượng lát cắt (cắt có đúng vị trí có nhiều mẫu hay không, cơ quan đích của virus có nằm trên lát cắt hay không). Phương pháp IHC (kỹ thuật avidin-biotin complex – ABC) không bằng PCR về độ nhạy (vì không thể khuyếch đại DNA virus) nên không phát hiện mầm bệnh trên 10 mẫu tôm post-larvae. Tuy nhiên, IHC nhờ khả năng hoạt động tốt của kháng thể sơ cấp, kháng thể thứ cấp và HRP nên nếu có mầm bệnh virus với một lượng có ý nghĩa thì chắc chắn sẽ có tín hiệu màu (kháng thể thứ cấp là kháng thể đa dòng sẽ phản ứng với lượng lớn epitope trên kháng thể sơ cấp, từ đó khuyếch đại tín hiệu virus vì nhiều 53 phân tử enzyme được gắn trên một vị trí đích). Với IHC người đọc mẫu dễ dàng nhận biết tế bào nhiễm trên mang và cả trên những cơ quan khác như các phụ bộ gần mang, dạ dày, ruột, biểu mô, cơ quan lymphoid (Hình 4.3, 4.4) do đó phát hiện nhiều cá thể nhiễm và nhiều tế bào nhiễm hơn Mô học (mẫu 12964 và 2794). Phương pháp mô học truyền thống: Tất cả các tế bào nhiễm mầm bệnh đều có những biểu hiện khác biệt (với WSSV, tín hiệu đặc trưng là nhân trương to, tròn và bắt màu tím đậm) (Hình 4.4) nhưng nếu lượng virus nhiễm ít hay ở dạng tiềm ẩn (trên tôm post-larvae) và tế bào nhiễm chưa có biểu hiện đặc trưng rõ ràng thì rất khó xác định chính xác mầm bệnh (có thể nhầm lần với mầm bệnh khác). Ngoài mang là cơ quan đích chủ yếu của WSSV thì mô học truyền thống khó phát hiện được mầm bệnh ở những cơ quan khác. Vì vậy, mô học kém hơn PCR và IHC về độ nhạy. Độ nhạy của phương pháp này phụ thuộc rất nhiều vào khả năng và kinh nghiệm của người đọc mẫu. B.Trên đối tượng tôm thương phẩm: Bảng kết quả (Bảng 4.2) cho thấy trên đối tượng tôm thương phẩm, khả năng phát hiện mầm bệnh WSSV của cả 3 phương pháp là như nhau. Biểu hiện của tế bào nhiễm khi kiểm nghiệm bằng mô học truyền thống và IHC khá rõ ràng. Với IHC, người đọc mẫu có thể dễ dàng phát hiện tế bào nhiễm ngay cả ở vật kính 10x nhờ biểu hiện màu sắc (nâu) khác biệt rõ với màu nền (tím). Với Mô học truyền thống, phải tập trung hơn mới nhận ra tế bào nhiễm nhưng nhờ lượng tế bào nhiễm nhiều, hình dạng đặc trưng nên cũng không quá khó để nhận ra. Nguyên nhân: Tôm sú thương phẩm khi nhiễm WSSV thường mang một lượng lớn virus do ở tuổi mẫn cảm. Vì vậy lượng tế bào nhiễm nhiều và biểu hiện rất rõ trên mang tôm lớn nên rất dễ nhận biết với PCR, mô học và IHC, khó có sự khác biệt do yếu tố con người. Với tôm sú thương phẩm, mẫu được lấy chủ yếu ở mang và gan tụy. Mang và gan tụy của mỗi cá thể được chia làm hai, mỗi phần được cho vào cồn (PCR) hoặc Davidson (mô học và IHC) để thực hiện xét nghiệm nên không có sự khác biệt do cá thể. 54 Hình 4.3. Tế bào nhiễm WSSV trên các cơ quan khác nhau của tôm sau khi nhuộm IHC Hình A1, A2: Tế bào nhiễm WSSV trên biểu mô tôm thương phẩm (100x), (400x). Hình B1, B2: Tế bào nhiễm WSSV trên phụ bộ tôm post-larvae (100x), (400x). Hình C1, C2: Tế bào nhiễm WSSV trên dạ dày tôm thương phẩm (100x), (400x). A1 A2 B1 B2 C1 C2 55 Hình 4.4. Tế bào nhiễm WSSV sau khi nhuộm bằng IHC và Mô học truyền thống (Hình A và hình B chụp cùng một vị trí trên mẫu 98. Hình C và hình D chụp cùng một vị trí trên mẫu 12964) A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3 D1 D2 D3 56 A1, A2, A3: Mô học–Tế bào nhiễm WSSV trên mang tôm thương phẩm. - Hình A1(100x): Nhân tế bào nhiễm bắt màu hồng tím đậm, nhưng hơi lẫn với màu nền. - Hình A2, A3 (400x, 1000x): Có thể nhận thấy rõ nhân tế bào nhiễm trương to, tròn, màu sắc rõ, đẹp. B1, B2, B3: IHC–Tế bào nhiễm WSSV trên mang tôm thương phẩm. - Hình B1(100x): Tế bào bắt màu nâu đậm, khác biệt rất rõ với màu nền. - Hình B2, B3 (400x, 1000x): Nhìn rõ hình dạng tế bào nhiễm. C1, C2, C3: Mô học–Tế bào nhiễm WSSV trên mang tôm post-larvae. - Hình C1 (100x): Màu nền khá đậm nên khá khó nhận thấy tế bào nhiễm. - Hình C2, C3 (400x, 1000x): Tế bào nhiễm bắt màu rất đẹp, hình dạng đặc trưng và điển hình. Các tế bào nền rõ ràng D1, D2: IHC–Tế bào nhiễm WSSV trên mang tôm post-larvae (100x), (400x). - Hình D1: Màu nền khá đậm, tế bào nhiễm có màu nâu nên dễ lẫn với màu nền. - Hình D2, D3: Nhân tế bào nhiễm bắt màu rất đẹp, sắc nét. 57 4.2.2. So sánh về tính ổn định và hiệu quả của 3 phƣơng pháp PCR, Mô học và IHC. Bảng 4.6. So sánh ƣu khuyết điểm của 3 phƣơng pháp PCR, Mô học truyền thống và IHC Phƣơng pháp Yếu tố PCR Mô học truyền thống IHC Ƣ u đ iể m - Độ nhạy và tính chuyên biệt cao. - Ổn định. - Kiểm tra được nhiều cá thể trong mẫu và trên toàn bộ cá thể. - Thời gian thực hiện ngắn (vài giờ). - Quy trình thực hiện đơn giản - Độ tinh sạch và chất lượng của mẫu thí nghiệm không cần cao. - Độ chính xác khá cao. - Ổn định - Ít bị tạp nhiễm, không yêu cầu khắt khe trong thao tác - Ít tiếp xúc với hoá chất độc hại. - Quy trình thực hiện đơn giản - Có khả năng định lượng. - Giá xét nghiệm thấp (30.000 đ/mẫu) - Hoá chất rẻ tiền, bảo quản dễ dàng, ít bị biến tính - Có thể xét nghiệm nhiều bệnh trên cùng một mẫu - Độ chính xác và tính đặc hiệu cao, độ nhạy khá cao. - Ổn định. - Ít bị tạp nhiễm, không yêu cầu khắt khe trong thao tác. - Ít tiếp xúc với hoá chất độc hại. - Quy trình thực hiện đơn giản. - Có khả năng định lượng. - Giá xét nghiệm vừa phải (60.000đ/mẫu) - Vật liệu nhuộm dễ bảo quản, ít biến tính. - Kết quả rất rõ ràng nên không phụ thuộc nhiều vào yếu tố con người (khả năng của người đọc mẫu). 58 Phƣơng pháp Yếu tố PCR Mô học truyền thống IHC K h u y ết đ iể m - Tính chính xác và độ tin cậy không cao vì rất dễ bị tạp nhiễm. - Hoá chất và thiết bị đắt tiền. - Giá xét nghiệm cao (140000đ/mẫu) - Hoá chất dễ biến tính nên yêu cầu bảo quản khắt khe. - Đòi hỏi cẩn thận tuyệt đối trong thao tác. - Phải tiếp xúc với hoá chất độc. - Phụ thuộc rất nhiều vào chất lượng hoá chất. - Chỉ kiểm tra được một lượng nhỏ cá thể trong mẫu và trên một số cơ quan nhất định. - Thời gian thực hiện dài (khoảng 15 giờ). - Không chuyên biệt. - Phụ thuộc rất nhiều vào yếu tố con người (khả năng đọc mẫu). - Chỉ kiểm tra được một lượng nhỏ cá thể trong mẫu và trên một số cơ quan nhất định. - Thời gian thực hiện dài (khoảng 19 giờ). - Chỉ xét nghiệm được một bệnh. 59 PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận  So sánh qui trình nhuộm IHC với 4 nồng độ mAb và 3 nồng độ DAB cho thấy: - Có sự khác biệt giữa 3 nồng độ mAb 1X; 1,5X; 2X với nồng độ 0,5 X nhưng lại không có sự khác biệt lớn giữa 3 nồng độ 1X; 1,5X và 2X về cường độ cảm nhiễm, cường độ bắt màu và độ sắc nét. Như vậy khả năng phát hiện tế bào nhiễm WSSV cao với nồng độ kháng thể 1X; 1,5X và 2X. - Với nồng độ DAB 1X, cường độ bắt màu và độ sắc nét của tế bào nhiễm rất kém. Với nồng độ 1,5X và 2X, tế bào nhiễm bắt màu nâu đặc trưng, rõ nét.  So sánh phương pháp IHC với phương pháp mô học truyền thống và kỹ thuật PCR về độ chính xác, độ nhạy, tính ổn định và tính hiệu quả cho thấy: - Trên đối tượng tôm post-larvae, phương pháp PCR tỏ ra có ưu thế hơn phương pháp IHC và Mô học về khả năng phát hiện mầm bệnh. Như vậy PCR có độ nhạy cao hơn (vì trên tôm post-larvae nhiễm virus, lượng virus thường thấp). - Trên đối tượng tôm thương phẩm, khả năng phát hiện mầm bệnh là như nhau giữa 3 phương pháp (vì trên tôm thương phẩm nhiễm virus, lượng virus thường cao). - Tính ổn định của IHC khá cao. - Tuỳ đối tượng, yêu cầu và mục tiêu xét nghiệm mà mỗi loại xét nghiệm có những ưu điểm và khuyết điểm riêng. 5.2. Đề nghị  Cải thiện quy trình nhuộm IHC của Đại học Gent như sau: - Chuyển nồng độ DAB từ 0.5 mg/l sang 0.75 mg/l, lượng H2O2 là 9H2O2: 10 Tris buffer. - Ngâm lam trong DAB trong 4 phút. 60 - Ở giai đoạn nhuộm Hematoxylin, nên nhúng lame và dung dịch 2 lần, mỗi lần 3 giây. Sau đó rửa lại bằng cách nhúng vào nước cất 3 lần. Điều này rất quan trọng vì nếu màu hematoxylin quá đậm thì khó có thể nhìn thấy màu nâu của DAB dẫn đến dễ nhầm lẫn tế bào nhiễm thành không nhiễm.  Ứng dụng phương pháp IHC trong các xét nghiệm phục vụ nghiên cứu khoa học và phục vụ người nuôi tôm.  Tiếp tục nghiên cứu quá trình phát sinh bệnh đốm trắng bằng phương pháp IHC.  Bổ sung một số thiết bị nhằm tăng hiệu quả phương pháp IHC như: Thiết bị giúp trải đều một lượng nhỏ dung dịch (mAb, HRP…) lên mẫu, bàn ấm có độ phẳng và độ cân bằng cao.  Tiếp tục nghiên cứu tự động hoá quy trình nhằm nâng cao hiệu quả, cải thiện giá thành để có thể ứng dụng phương pháp IHC rộng rãi phục vụ người nuôi tôm.  Kết hợp xét nghiệm IHC và PCR trên cùng một mẫu để tăng độ chính xác và độ nhạy của xét nghiệm. 61 PHẦN 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 1. Trần Minh Anh, 1989. Đặc điểm sinh học và kỹ thuật nuôi tôm he. Nhà xuất bản TP HCM; 394 trang. 2. Trần Thị Hoàng Dung, 2001. Ứng dụng phương pháp Nested PCR điều tra bệnh đốm trắng trên tôm sú ở một số tỉnh phía nam. Khoá luận tốt nghiệp. Trường Đai Học Nông Lâm TP HCM; 56 trang. 3. Kim Oanh, 2005. Ứng dụng khoa học công nghệ vào nuôi trồng thuỷ sản-Phỏng vấn ông Nguyễn việt Thắng, Thứ trưởng Bộ Thuỷ Sản. Vietnam economy, Nông nghiệp và phát triển nông thôn, 6/1/2005. 106095231 4. Nguyễn Thanh Phương, 2002. Chuyên đề 2: Nuôi tôm biển. Giáo trình kĩ thuật nuôi thủy sản ven biển nhiệt đới (tropical coastal aquaculture). ĐH Cần Thơ coastal/chuong2.htm#2-1 5. Nguyễn Văn Hảo, Đỗ Quang Tiền Vương, Trình Trung Phi, 1998. Mô hình nuôi tôm sú công nghiệp quy mô nông hộ và trang trại ở ĐBSCL. Báo Cáo Khoa Học, Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thuỷ Sản II. 6. Phan Lương Tâm, 1994. Khảo sát nguyên nhân gây chết tôm khu vực phía Nam. Báo Cáo Khoa Học, Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thuỷ Sản II. 7. Vũ Thế Trụ, 1995. Thiết lập và điều hành trại sản xuất tôm giống tại Việt Nam. NXB Nông Nghiệp, TP Hồ Chí Minh. Tr 23 – 25. 8. Lê Xân, 1996. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học và cơ sở khoa học của công nghệ nuôi tôm sú ở một số tỉnh miền Bắc Việt Nam. Luận án phó tiến sĩ khoa học, Viện Nghiên Cứu Hải Sản thuộc bộ thủy sản Hải Phòng; trang: 14 – 30. TÀI LIỆU TIẾNG ANH 9. Adams A., and Thompson K., 1990. Development of an ELISA for the detection of Aeromonas salmonicida in fish tissue. Journal of Aquatic Animal Health 2: 281-288. 10. Adams A., Thompson K.D., Morris D, Farias C. and Chen S.C., 1995. Development and use of monoclonal antibody probes for immunohistochemistry, ELISA and IFAT to detect bacterial and parasitic fish pathogens. Journal of Fish and Shellfish Immunology 5: 537-547. 62 11. Adams A., Thompson K.D., Ewan H.M., Chen S.-C. and Richards R.H., 1996. Development of monoclonal antibodies to Mycobacterium spp. isolated from Chevron snakehead and Siamese fighting fish. Journal of Aquatic Animal Health 8: 208-215. 12. Alday-Sanz V., Rodger H., Turnbull T., Adams A. and Richards R.H., 1994. Immunohistochemical identification of Pickirickettsia salmonis in Atlantic salmon, Salmo salar L. Journal of Fish Diseases 17: 189-192. 13. Anil T.M., Shankar K.M., Mohan C.V., 2002. Monoclonal antibodies developed for sensitive detection and comparison of white spot syndrome virus isolates in India. Disease of Aquatic Organisms 51:67-75. 14. Apud E.D., 1984. Extesive and semi-extensive of Sugpo (Penaeus monodon). In: Prawn Industry Development in the Philippines Proceed of the National P.I.D and Workshop, 10 – 13 April SEAFDEC, Aquaculture Depaterment, Iloilo City, 55 – 73. 15. Bakopoulos V., Adams A. and Richards R.H., 1997. The production and characterisation of monoclonal antibodies against the fish pathogen Pasteurella piscicida. Journal of Fish Diseases 20: 307-315. 16. Barnes R., 1987. Invertebrate Zoology. Orlando, Florida: Dryden Press. 17. Bauman R.H., Jamandro D.R., 1990. A practicle method for determining quality of Penaeus monodon Fabricus fry for stocking in grow out ponds. Technical and economic aspect of shrimp farming. Proceeding of Aquatic 90 Conference, INFORFISH Pub. Kualalumpure, Malaysia. p. 124 – 137. 18. Boenisch T., Farmilo A.J., Stead R.H., Key M., Welcher R., Harvey R., and Atwood K.N., 2002. Handbook of Immunochemical Staining Methods. 3 rd edition, Carpinteria, California, USA. 65p. 19. Caleb M.C, 2004. White Spot Syndrome Virus – The economic, environmental and technical implications on the development of Latin America shrimp farming. Master of Art and Law thesis. The Fletcher School, Tufts University. 20. Chaivisuchangkura P. Tangkhabuanbutra J., Longyang S., Sithigorngul W., Rukpartanporn S., Menasveta P., Sithigorngul P., 2004. Monoclonal antibodies against a truncated viral envelope protein (VP28) can detect white spot syndrom virus (WSSV) infections in shrimp. Science Asia 30: 359-363. 21. Chamberlain G.W., 1994. Taura syndrome and China collapse chaused by new shrimp viruses. World Aquaculture 25: 22 – 25. 63 22. Chang P.S., Lo C.F., Wang Y.C. and Kou G.H., 1996. Identificaion of white spot syndrom associated baculovirus (WSBV) target organs in the shrimp Penaeus monodon by in-situ hybrilization. Disease of Aquatic Organisms 27: 131 – 139. 23. Chanratchakool P., Turnbull J.F., Funge-Smith S.J., MacRae I.H., and Limsuwan C., 1995. Health management in shrimp pond. 3 rd edition, Aquatic Animal Health Research Insitute, Department of Fisheries, Kasetsart University Campus, Bangkok. 80p. 24. Chen L.L., Lo C.F., Chiu Y.L., Chang C.F., Kou G.H., 2000. Natural and experimental infection of white spot syndrome virus (WSSV) in benthic larvae of mud crab Scylla serrata. Disease of Aquatic Organisms 40: 157 – 161 25. Chen L.L., Leu J.H., Huang C.J., Chou C.M., Chen S.M., Wang C.H., Lo C.F. and Kou G.H., 2002. Identification of a nucleocapsid protein (VP35) gene of shrimp white spot syndrome virus and characterization of the motif important for targeting VP35 to the nuclei of transfected insect cells. Virology 293: 44-53. 26. Chiu Y.N., 1992. Water quality management for intensive prawn ponds. Technical consideration for the management and operation of intensive prawn farms (Chiu Y.N., Santos L.M. and Juillano R.O.). CIS Aquaculture Soc. Iloilo, Philippines. p. 122 – 128. 27. CSIRO, 2002. Impact of Infectious Agents on Farming and Food Production: Global Impact of Newly Emergent Pathogens on Shrimp Farm Production. 28. Coons A.H., Creech H.J. and Jones R.N., 1941. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 47: 200 – 202. 29. Dieu B.T.M., Marks H., Siebenga J.J., Goldbach R.W., Zuidema D., Duong T.P. and Vlak J.M., 2004. Molecular epidemiology of white spot syndrome virus within Vietnam. Journal of General Virology 85: 3607-3618. 30. Durand S., Lightner D. V., Redman R. M. and Bonami J. R., 1997. Ultrastructure and morphogenesis of white spot syndrome baculovirus (WSSV). Disease of Aquatic Organisms 29: 205–211. 31. Faulk W.P., Taylor G.M., 1971. An immunocolloid method for the electron microscope. Immunochemistry 8: 1081 – 1083 32. Flegel T.W., 1997. Major viral diseases of the black tiger prawn (Penaeus monodon) in Thailand. World Journal of Microbiology and Biotechnology 13: 433 – 442. 33. 34. 64 35. Flegel T.W., 2000. Overview of PCR probes for shrimp diseases of Penaeus monodon. Molecular Diagnosis Training Workshop for Detection of WSSV in Vietnam, 2000. 36. Francki R.I. B., Fauquet C. M., Knudson D.L. and Brown F., 1991. Classification and nomenclature of viruses. Fifth report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. Arch. Virol. 1991(Suppl. 2):1-450. 37. Hall D.N.F., 1962. Observation on the taxonnomy and biology of some Indo – West Pacific Penaeidae (Crustacea, Decapoda). Colo. Off. Fish. Pub. Lond 17: 1 – 229. 38. Hayat M.A., 2004. Handbook of Immunohistochemistry and in Situ Hybridization of Human Carcinomas: Molecular Genetics; Lung and Breast Carcinomas. Elsevier Science and Technology. 400 p. 39. Hiney, M.P. and Smith, P.R., 1998. Validation of polymerase chain reaction- based techniques for proxy detection of bacterial fish pathogens: framework, problems and possible solutions for environmental applications. Aquaculture 162, 41-68. 40. Holthuis L. B., 1980. FAO species catalogue. Shrimps and prawns of the world: an annotated catalogue of species of interest to fisheries. FAO Fish. Synop. 125(1): 1–261. 41. Hőstein T., 2000. Diagnostic Manual for Aquatic Animal Diseases. Office international des Epizooties. p. 257 - 260 42. Huang J., Song X.L., Yu J. and Yang C.H., 1994. Baculoviral hypodermal and hematopoietic necrosis-pathology of the shrimp explosive epidemic disease. Yellow Sea Fishery Research Insitute, Quingdao, PR China. 43. Inouye K., Miwa S., Oseko N., Nakano H., Kimura T., Momoyama K. and Hikaora M., 1994. Mass mortality of cultured kuruma shrimp Penaeus japonicus in Japan in 1993 – electron-microcospic evidence of the causative virus. Fish Pathology 29: 149 – 158. 44. Inouye K., 1996. Occurence of fish diseases associated with seed improtant – A new virus infection (RV-PJ) of Kuruma shrimp. Nippon Suisan Gakkaishi 62: 831 – 832. 45. Kou G.H., Peng S.E., Chiu Y.L. and Lo L.F., 1998. Tissue ditribution of white spot syndrom virus (WSSV) in shrimp and crab. Advanced in Shrimp Biotechnology 1998: 267 – 276. 46. Kungvankji P. and Chua T.E., 1986. Shrimp culture: pond design operation and management FAO/ NACA. Training manual 2: 56 – 57. 65 47. Lavilla-Pitogo C.R., 1996. Shrimp health research in the Asia-Pacific: present status and future directives. In Health Management in Asian Aquaculture. Proceedings of the Regional Expert Consultation on Aquaculture Health Management in Asia and the Pacific. R.P. Subasinghe, J.R.Arthur & M. Shariff (eds.), p. 41–50. FAO Fisheries Technical Paper 360. Rome, FAO. 142 p. 48. Leu J.H., Tsai J.M., Wang H.C., Wang A.H.J., Wang C.H., Kou G.H., and Lo C.F., 2005. The Unique Stacked Rings in the Nucleocapsid of the White Spot Syndrome Virus Virion Are Formed by the Major Structural Protein VP664, the Largest Viral Structural Protein Ever Found. Journal of Virology 79: 140-149. 49. Lightner D.V., 1996 (Ed.). A handbook of shrimp pathology ang diagnostic procedures for diseases of cultured penaeid shrimp. World aquaculture society, Baton rouge, LA, USA 50. Lightner D.V., Redman R.M., Poulos B.T., Nunan L.M., Mari J.L. and Hasson K.W., 1997. Risk of spread of penaeid shrimp viruses in the Americas by the international movement of live and frozen shrimp. Revue Scientifique et Technique de I’Office International des Epizooties 16: 146 – 160. 51. Lightner D.V. and Redman R.M., 1998. Shrimp diseases and current diagnostic methods.Aquaculture, 164: 201-220. 52. Limsuwan C., 1997. Reducing the effects of White - Spot Baculovirus using PCR Screening and Stressors. The AAHRI Newsletter, Volume 6 Number 1, July 1997. 53. Liu W, Wang YT, Tian DS, Yin ZC, Kwang J., 2002. Detection of white spot syndrome virus (WSSV) of shrimp by means of monoclonal antibodies (MAbs) specific to an envelope protein (28 kDa). Disease of Aquatic Organisms 49:11-8 54. Lo C.F., Leu J.H., Ho C.H.,Chen C.H., Peng S.E., Chen Y.T., Chou C.M., Yeh Y.P., Huang C.J., Chou Y.H., Wang C.H. and Kou G.H., 1996. Detection of baculovirus associated with white spot syndrome (WSBV) in penaeid shrimp using polymerase chain reaction. Diseases of Aquatic Organisms 25: 133 – 141. 55. Lo C.F., Kou G.H., 1998. Virus-associated white spot syndrome of shrimp in Taiwan: a review. Fish Pathology 33: 365 – 371. 56. Lo C.F., Chang Y.S., Chenm C.T. and Kou, G.H., 1998. PCR Monitoring Cultured Shrimp for White Spot Syndrom Virus (WSSV) Infection, Growout Pond In Proceeding to the Special Session on Shrimp Biotechnology 5 th Asian Fisheries Forum (Flegel, T., ed., phương pháp. 281 – 286 BIOTEC, Chiengmai, Thailand) 57. Marks H., Goldbach R.W., Vlak J. M. and van Hulten M.C.W. , 2003. Genetic variation among isolates of White spot syndrome virus. Archives of Virology. Springer Verlag Wien 149: 673 – 697. 66 58. Mason D.Y., Sammons R., 1978. Alkaline phosphatase and peroxidase for double immunoenzymatic labelling of cellular constituents. J. Clin. Pathol. 31: 454 – 460. 59. Mayo M.A., 2002. A summary of taxonomy changes recently approved by ICTV. Arch Virol 147/8. 60. Morris D., Adams A. and Richards R.H., 1997. Studies on the PKX myxosporean in rainbow trout via immunohistochemistry and immunogold microscopy. Journal of Aquatic Animal Health 8: 219-235. 61. Murthy H. S., 1997. The collapse of shrimp farming in India: an analysis. INFOFISH International 1/1997. 62. Nadala E.C., Jr., Tapay L.M., Cao S.R. and Loh P.C., 1997. Detection of yellowhead virus and Chinese baculovirus in penaeid shrimp by the Western blot technique. Journal of Virology Methods 69: 39 – 44. 63. Nadala E.C.B. and Loh P.C., 2000. Dot-blot nitrocellulose enzyme immunoassays for the detection of white-spot virus and yellowhead virus of penaeid shrimp. Journal of Virology Methods 84: 175 – 179. 64. Nakane P.K., Pierce G.B., 1966. Enzyme-labelled antibodies: preparation and application to the localization of antigens. J. Histochem. Cytochem. 14: 929 – 931. 65. Nakano H., Koube H., Umezawa S., Momoyama K., Hiraoka M., Inouye K. and Oseko N., 1994. Mass mortalities of cultured kuruma shrimp, Penaeus japonicus, in Japan in 1993 – epizootiological survey and infection trials. Fish pathology 29: 135 – 139. 66. OIE, 2003. Taura Syndrome. Manual of Diagnostic Tests for Aquatic Animals 2003 67. Owens L., 1993. Description of the first haemocytic rod-shaped virus from a penaeid prawn. Disease of Aquatic Organisms 16: 217–221. 68. Phianphak W, Rengpipat S, Rukpratanporn S, Longyant S, Chaivisuthangkura P, Sithigorngul W, Sithigorngul P., 2005. Production of monoclonal antibodies for detection of Vibrio harveyi. Disease of Aquatic Organisms. 63(2-3):161-8. 69. Poulos B.T., Pantoja C.R., Bradley-Dunlop D., Aguilar J., Lightner D.V., 2001. Development and application of monoclonal antibodies for the detection of white spot syndrome virus of penaeid shrimp.Disease of Aquatic Organisms. 47:13-23 70. Rajendran K.V., Vijayan K.K., Santiago T.C., and Krol R.M., 1999. Experimental host range and Histopthology of White Spot Syndrome Virus 67 (WSSV) infection in shrimp, prawns, crabs and lobsters from India. Journal of Fish Disease 22: 183 – 191. 71. Sahul Hameed A.S., 1997. Studies on pathogenicity of systemic ectodermal and mesodermal baculovirus and its detection in shrimp by immunological methods. Aquaculture 160. 72. Sitja-Bobadilla A, Redondo MJ, Macias MA, Ferreiro I, Riaza A, Alvarez- Pellitero P., 2005. Development of immunohistochemistry and enzyme-linked immunosorbent assays for the detection of circulating antibodies against Enteromyxum scophthalmi (Myxozoa) in turbot (Scophthalmus maximus L.). Fish Shellfish Immunol. 18:449-50. 73. Solis N.B., 1988. Biology and Ecology Penaeus monodon Fabricius 1780. In: The Biology and culture of Penaeus monodon. SEAFDEC Aquaculture Department Tigbanan Iloilo, Philippines. p. 4 – 36 74. Soowannayan C., Flegel T.W., Sithigorngul P., Slater J., Hyatt A., Cramerri S., Wise T., Crane M.S., Cowley J.A., McCulloch R.J., Walker P.J.., 2003. Detection and differentiation of yellow head complex viruses using monoclonal antibodies. Disease of Aquatic Organisms 57(3):193-200 75. Stites P.D., Stobo D.J., Wells V.J., 1987. Basic and clinical Immunology. 6th edition, Appleton and Lange, USA, p20 – 23. 76. Takahashi Y., Itami T., Maeda M. and Kondo M., Fujii R., Tomonaga S., Supamattaya K. and Boonyyarattalin S., 1994. Electron-microscopic evidence of bacciliform virus infection in kuruma shrimp (Penaeus japonicus). Fish Pathology 29: 121- 125. 77. Tapay L.M., Lu Y., Gose R.B., Brock G.A. and Loh P.C., 1996. Infection of yellow-head virus (YHV) and Chinese baculo-like virus (CBV) in two species of penaeid shrimp, Penaeus styliotris (Rtimpson) and P. vannamei (Boone). In World Aquaculture. Bangkok. 78. Tookwinas S., 1998. Disease diagnosis of P. monodon broostock. Workshop on development of Penaeus monodon broodstock disease-free in asian country, 1998. Indonesia. 79. Valencia M.C., 1977. The effect of salinity and temperature on the growth and survival of Penaeus post-larvae. A research paper submitted to SEAFDEC-1 st Southeast Aisa Reagional Training on Aquaculture Research in Tigbauan, Iloilo, Philippines 1996 – 1997, 22p. 80. van Hulten M.C.W., Goldbach R.W. and Vlak J.M., 2000a. Three functionally diverged major structural proteins of White Spot Syndrome Virus evolved by gene duplication. Journal of General Virology 81: 2525 - 2529 68 81. van Hulten M.C.W., Tsai M.F., Schipper C.A., Lo C.F., Kou G.H. and Vlak J.M., 2000b. Analysis of a genomic segment of White Spot Syndrome Virus of shrimp containing ribonucleotide reductase genes and repeat reagions. Journal of General Virology 81: 307 – 316. 82. van Hulten M.C.W., Westenberg M., Goodal S.D. and Vlak J.M., 2000c. Identification of two major virion protein gene od White Spot Syndrome Virus of shrimp. Journal of General Virology 266: 227 – 236. 83. van Hulten M. C. W., Witteveldt J., Peters S., Kloosterboer N., Tarchini R., Fiers M., Sandbrink H., Klein Lankhorst R. and Vlak J. M., 2001. The white spot syndrome virus DNA genome sequence. Virology 286: 7–22. 84. van Hulten, Martin Reijns, Angela M. G. Vermeesch, Fokko Zandbergen and Vlak J.M., 2002. Identification of VP19 and VP15 of white spot syndrome virus (WSSV) and glycosylation status of the WSSV major structural proteins. Journal of General Virology 83: 257 – 265. 85. Vlak J.M., Bonami J.R., Flegel T.W., Kou G.H., Lightner D.V., Lo C.F., Loh P.C. and Walker P.J., 2002. Nimaviridae - A new virus family infecting aquatic invertebrates. XII Congress of Virology. 2002, Paris 86. Viladolid, D.V. and Villaluz, D.V., 1981. Cultivation of Sugpo (Penaeus monodon Fabricius) in Philippines. Philipp. J. Fish. I 1: 68 – 78. 87. Walker J.P., 2000. White spot syndrome virus: emergene, history and epidemiology of disease. Molecular Diagnostics Training Workshop for Detection of WSSV in Vietnam. 2000. 88. Wang C.H., Yang H.N, Tang C.Y., Lu C.H., Kou G.H. and Lo C.F., 2000. Ultrastructure of white spot syndrome virus development in primary lymphoid organ cell cultures. Disease of Aquatic Organisms 41: 91 – 104. 89. Wang C.S., Tang K.F.J., Kou G.H. and Chen S.N., 1996a. Yellow head disease- like virus infection in the kuruma shrimp Penaeus japonicus cultured in Taiwan. Fish Pathology 31: 177 – 182 90. Wang X., Hu C., Li C. and Chen H., 1996b. Preliminary studies on the developing mechanism of pathologic white spots on the shell of Penaeus monodon. Tropical Oceanol. Redai Haiyang 15: 24 – 29. 91. Wang Y.C., Lo C.F., Chang P.S. and Kou G.H., 1998. Experimental infection of white spot baculovirus in some cultured and wild decapods in Taiwan. Aquaculture 164: 221 – 131. 92. Wang Y.G., 1995. Managing White Spot Disease in Shrimp. INFFISH International 3/1998. 69 93. Wang Y.G., Shariff M., Suda P.M., Rao P.S.S., Hassan M.D., and Tan L.T., 1998. Managing whitespot disease in shrimp. INFOFISH International 3: 30-36 94. Wang Y.G., Hassan M.D., Shariff M., Zamri S.M. and Chen X., 1999. Histopathology and cytopathology of white spot syndrome virus (WSSV) in cultured Penaeus monodon from peninsular Malaysia with emphasis on pathogenesis and the mechanism of white spot formation. Disease of Aquatic Organisms 39: 1 – 11. 95. Woongteerasupaya C., Vuckers J.E., Sriurairatana S., Nash G.L.,Akarajamorn A., Boonsaeng V., Panyim S., Tassanakajon A., Withyachumnarnkul B. and Flegel T.W., 1995. A non-occlided, systemic baculovirus that occurs in cells of ectodermal and mesodermal origin and causes high mortality in the black tiger prawn Penaeus monodon. Disease of Aquatic Organisms 21: 69 – 77 96. World Shrimp Farming, 1998. National Animal Health Programs' weekly activity report, 11 March 1999. 97. Yang F., Wang W., Chen R.Z. and Xu X., 1997. A simple and efficient method for purification of prawn baculovirus DNA. Journal of Virology Methods 67: 1 – 4. 98. Yang F., Jun He, Xionghui Lin, Qin Li, Deng Pan, Xiaobo Zhang, and Xun Xu, 2001. Complete Genome Sequence of the Shrimp White Spot Bacilliform Virus. Journal of Virology 75, p. 11811-11820. 99. Yoganandhan K., Syed Musthaq S., Narayanan R.B., Sahul Hameed A.S., 2004. Production of polyclonal antiserum against recombinant VP28 protein and its application for the detection of white spot syndrome virus in crustaceans. Journal of Fish Diseases 27:517 – 22. 100. Zhan W.B., Yu K.K. and Meng Q.X., 1995. Study of baculovirus diseases of Penaeus chinesis. Journal of Fisherise Science of China 2: 22 – 28. 101. IHC world: online information center for immunhistochemistry, 2005. 70 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Bảng số liệu mã hoá kết quả so sánh chi tiết 4 quy trình nhuộm IHC với 4 nồng độ mAb khác nhau trên 10 mẫu thử nghiệm 0,5X 1X 1,5X 2X 0,5X 1X 1,5X 2X 0,5X 1X 1,5X 2X 45P Sóc Trăng 1 2 2 2 1 0 2 3 0 0 2 2 4 5 D S ó c T r ă n g 2 2 2 2 2 2 3 3 0 0 0 2 1 0 1 Cà Mau 2 2 2 1 1 2 2 2 0 2 0 2 5 3 Sóc Trăng 2 2 2 2 1 2 3 4 2 2 2 3 1 0 3 Cà Mau 1 2 2 2 2 2 2 4 1 0 0 2 9 7 C à M a u 2 2 2 2 2 3 2 4 1 3 2 4 5 0 Sóc Trăng 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 9 8 Cà Mau 2 3 3 3 2 3 3 4 2 3 3 3 4 5 3 C à M a u 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 9 9 C à M a u 1 2 2 2 2 2 3 4 1 2 2 3 Độ sắc nétKí hiệu Nơi thu Cường độ bắt màuCường độ cảm nhiễm 71 Phụ lục 2: Bảng ANOVA của nội dung so sánh 4 quy trình nhuộm IHC với 4 nồng độ mAb 2.1. Cƣờng độ cảm nhiễm Nguồn biến lượng Tổng các bình Độ tự do Trung bình (SOV) phương (SS) (df) bình phương (MS) Nồng độ 1.075 3 0.3583333 3.617 0.0258 Mẫu 28.025 9 3.1138889 31.43 0 Sai lệch ngẫu nhiên 2.675 27 0.0990741 Tổng 31.775 39 F P 2.2. Cƣờng độ bắt màu Nguồn biến lượng Tổng các bình Độ tự do Trung bình (SOV) phương (SS) (df) bình phương (MS) Nồng độ 12.675 3 4.225 11.914 0 Mẫu 44.525 9 4.9472222 13.95 0 Sai lệch ngẫu nhiên 9.575 27 0.3546296 Tổng 66.775 39 F P 2.3. Độ sắc nét Nguồn biến lượng Tổng các bình Độ tự do Trung bình (SOV) phương (SS) (df) bình phương (MS) Nồng độ 10.475 3 3.4916667 8.006 0.0006 Mẫu 37.725 9 4.1916667 9.611 0 Sai lệch ngẫu nhiên 11.775 27 0.4361111 Tổng 59.975 39 F P 72 Phụ lục 3: Bảng số liệu mã hoá kết quả so sánh khả năng phát hiện mầm bệnh virus đốm trắng của ba phƣơng pháp PCR, Mô học và IHC trên tôm sú post- larvae và tôm thƣơng phẩm. Tôm post-larvae Tôm thƣơng phẩm Kí hiệu PCR Mô học IHC Kí hiệu PCR Mô học IHC 7683 0 0 0 101 2 2 7787 0 0 0 97 2 2 7661 2 0 0 98 3 3 7781 0 0 0 99 2 2 7536 2 0 0 336 3 2 7786 0 0 0 341 3 2 7718 0 0 0 342 3 2 7769 0 0 0 340 2 2 7768 0 0 0 339 3 2 7764 0 0 0 338 2 2 7684 0 0 0 103 2 2 2 7691 0 0 0 44 3 2 3 7650 2 0 0 55 4 3 2 7722 0 0 0 57 0 0 0 7725 0 0 0 49 0 0 0 2682 2 0 0 94 2 2 2 2741 2 0 0 136 0 0 0 2708 2 0 0 134 0 0 0 3122 0 0 0 137 0 0 0 2752 2 0 0 135 0 0 0 2745 2 0 0 159 4 3 4 12964 0 2 3 161 0 0 0 2794 0 3 4 152 2 3 3 2746 2 0 0 153 4 2 2 7755 3 0 0 156 2 2 2 178 0 0 0 179 0 0 0 181 0 0 0 182 0 0 0 185 0 0 0 73 Phụ lục 4: Bảng ANOVA của nội dung so sánh khả năng phát hiện mầm bệnh virus đốm trắng của ba phƣơng pháp PCR, Mô học và IHC 4.1. Trên tôm post-larvae Nguồ biế lượng Tổng các bình Độ tự do Trung bình (SOV) phương (SS) (df) bình phương (MS) Loại kiểm nghiệm 6.08 2 3.04 3.917 0.0266 Mẫu 25.146667 24 1.0477778 1.35 0.1854 Sai lệch ngẫu nhiên 37.253333 48 0.7761111 Tổng 68.48 74 F P 4.2. Trên tôm thƣơng phẩm Nguồn biến lượng Tổng các bình Độ tự do Trung bình (SOV) phương (SS) (df) bình phương (MS) Loại kiểm nghiệm 0.55833 2 0.2791667 1.653 0.2023 Mẫu 129.53333 29 4.4666667 26.442 0 Sai lệch ngẫu nhiên 8.1083333 48 0.1689236 Tổng 138.2 79 F P