Khóa luận Ứng dụng kỹ thuật RT-PCR xác định macrobrachium rosenbergii nodavirus (MrNV) vào extra small virus (XSV) trên tôm càng xanh (macrobrachium rosenbergii)

ot - blot Probe sử dụng trong phƣơng pháp lai Dot - blot là một đoạn DNA thu đƣợc từ RNA - 1 của MrNV. Đoạn DNA đƣợc đánh dấu bằng phƣơng pháp PCR với tác nhân digoxygenine. Probe này lai với đoạn RNA - 1 từ mô bị nhiễm hoặc từ dịch chiết virus. Mỗi mẫu (1 l) là mỗi điểm trên màng lai. Sau khi qua các công đoạn xử lý bằng dung dịch lai (hybridization) và tiền lai (prehybridization), mẫu dò đƣợc thêm vào để quá trình lai xảy ra, rửa phần mẫu dò không lai ra khỏi màng lai. Tiếp đó thêm vào phản ứng kháng thể kháng DIG (anti digoxygenine antibody) có gắn enzyme alkaline phosphatase, ở quá trình này nếu có sự hiện diện của mẫu dò thì kháng thể sẽ kết hợp với mẫu dò. Cuối cùng loại bỏ phần kháng thể không phản ứng và thêm cơ chất của enzyme alkaline phosphatase để thực hiện phản ứng tạo màu ngay trên màng lai. Phản ứng dƣơng tính (tạo màu) chỉ xảy ra khi có RNA của MrNV trên màng lai (Widada và cộng sự, 2003). 2.3.3. Phƣơng pháp lai tại chỗ (in situ hybridization) Mẫu tôm càng xanh đƣợc cố định Davidson và đƣa vào trong paraffin. Mẫu tôm đƣợc cắt khoảng 7 m và đƣợc đặt trên lam kính và đƣợc làm khô trong tủ sấy ở (60 0C). Lát cắt qua nhiều bƣớc xử lý, cho lai với mẫu dò DNA đƣợc đánh dấu digoxigenin có gắn Alkaline phosphatase (AP), Anti - Digoxigenin sẽ kết hợp với Digoxigenin theo nguyên tắc phản ứng kháng nguyên - kháng thể. Sau bƣớc này những phân tử lai đặc hiệu giữa DNA/RNA của mẫu đính trên lame và mẫu dò đƣợc gắn thêm Anti - DIG kết hợp với enzyme Alkaline phosphatase. Sau bƣớc rửa Anti - DIG thừa và nhuộm màu, quan sát dƣới kính hiển vi thấy những tế bào kết tủa màu tím đen, màu này cho biết sự hiện diện tƣơng ứng RNA của MrNV, mẫu âm tính có màu vàng cam sau quá trình lai. Việc kết tủa đã đƣợc quan sát trong tế bào chất, vài phản ứng dƣơng thì cũng đƣợc quan sát xung quanh vùng cơ hoại tử. Không có dấu hiệu của virus đƣợc quan sát trong mang, gan, tụy tạng hoặc biểu mô ống tiêu hoá và biểu bì cơ (Widada và cộng sự, 2003). 12 Hình 2.3: Lai tại chỗ bằng cách sử dụng probes MrNV (Widada và cộng sự, 2003). Hình a: tổng thể phần đầu ngực của tôm postlarvae bị nhiễm MrNV. Phần 1a: vùng mang không bị nhiễm có màu vàng cam. Phần 2a: vùng đầu ngực bị nhiễm MrNV có màu tím đen. Phần 3a: vùng tụy tạng không bị nhiễm có màu vàng cam Hình b: lai dƣơng tính với những sợi cơ. phần 1b: vùng cơ bị nhiễm MrNV có màu tím đen. 2.3.4. Phƣơng pháp Sandwich - ELISA (A sandwich enzyme linked immunosorbent assay) Kỹ thuật này phát triển bởi Romestand và Bonami (2003) để chẩn đoán bệnh trắng đuôi của tôm càng xanh, nguyên nhân gây ra bởi MrNV. Kháng thể đa dòng sản xuất bằng gây sự miễn dịch trên chuột Balb/C và sau đó tinh sạch dung dịch nổi của virus và kháng thể kháng MrNV, dịch nổi chứa kháng thể kháng MrNV đƣợc tinh sạch từ dịch tràng ở màng bụng của chuột. Kháng thể đầu tiên bắt kháng nguyên và kháng thể thứ hai có gắn cơ chất, dƣới tác dụng của enzym avidin - peroxidase conjugate phản ứng với cơ chất tạo màu, sự tạo màu này cho thấy phản ứng xảy ra. Đây là một phƣơng pháp chẩn đoán bệnh trắng đuôi nhanh, độ đặc hiệu và độ nhạy cao. 2.3.5. Phƣơng pháp PCR 2.3.5.1. Nguyên tắc của phƣơng pháp PCR 2a 3a 1a 1b 13 Phƣơng pháp PCR do Karl Mullis và cộng sự phát minh năm 1985 cho phép làm tăng bội DNA cần đƣợc nghiên cứu. PCR đƣợc thực hiện in vitro theo con đƣờng enzyme (Bùi Trang Việt, 2002). Tất cả các DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn đều cần hiện diện của những mồi chuyên biệt. Mồi là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn và DNA polymerase sẽ nối dài mồi để hình thành mạch mới. Phƣơng pháp PCR đã đƣợc hình thành dựa vào cấu trúc đặc tính đó của các DNA polymerase. Thực vậy, nếu ta cung cấp hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu của một trình tự DNA, ta sẽ chỉ tổng hợp đoạn DNA nằm giữa hai mồi. Điều đó có nghĩa là để khuếch đại một trình tự DNA xác định, ta phải có thông tin tối thiểu về trình tự đó đủ để tạo các mồi bổ sung chuyên biệt, các mồi này gồm mồi xuôi (sens primer), mồi ngƣợc (antisnes primer). 2.3.5.2. Phản ứng PCR Phản ứng PCR là một chuỗi những chu kỳ nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm ba bƣớc: Bƣớc 1: giai đoạn biến tính (denaturation), trong một dung dịch phản ứng bao gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA đƣợc biến tính cao hơn Tm của phân tử; thƣờng là 94 - 950C trong 30 - 60 giây. Mạch đôi DNA tách thành mạch đơn. Bƣớc 2: giai đoạn lai (anealation) nhiệt độ đƣợc hạ thấp hơn Tm của các mồi, cho phép các mồi bắt cặp với mạch khuôn. Trong thực nghiệm nhiệt độ này dao động trong khoảng 40 - 700C, tùy thuộc Tm của các mồi sử dụng và kéo dài từ 30 - 60 giây. Bƣớc 3: giai đoạn tổng hợp (elongation), nhiệt độ đƣợc tăng lên 720C giúp cho DNA polymerase (polymerase chịu nhiệt) hoạt động tổng hợp tốt nhất. Thời gian của bƣớc này tùy thuộc vào độ dài trình tự DNA cần khuếch đại, thƣờng kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút. Một phản ứng PCR không vƣợt quá 50 chu kỳ. Vì phản ứng PCR diễn tiến qua hai giai đoạn, trong giai đoạn đầu số lƣợng bản sao tăng theo cấp số nhân, tỷ lệ với lƣợng mẫu ban đầu, sau đó kết quả khuếch đại giảm hẳn nên số chu kỳ cho một phản ứng tuỳ thuộc vào số lƣợng bản mẫu ban đầu. 2.3.5.3. Các yếu tố ảnh hƣởng đến phản ứng PCR 14 DNA mẫu: Phản ứng khuếch đại tối ƣu xảy ra trên DNA thật tinh sạch, nhiều kỹ thuật chẩn đoán bằng PCR vẫn đạt kết quả tốt với DNA thu nhận trực tiếp từ dịch chiết tế bào. Ngoài ra phƣơng pháp PCR còn có một số ƣu điểm là có thể khuếch đại cả những mẫu DNA không đƣợc bảo quản tốt. Enzyme Taq - polymerase chịu nhiệt đƣợc tách chiết từ vi khuẩn suối nƣớc nóng Thermus aquaticus. Enzym này không bị phá huỷ bởi nhiệt biến tính và xúc tác sự tổng hợp từ đầu đến cuối quá trình phản ứng. Tth polymerase là một enzym tách chiết từ Thermus thermophilus, có khả năng hoạt động nhƣ một enzym phiên mã ngƣợc khi có mạch RNA khuôn và ion Mn++, nhƣng với sự hiện diện của của DNA khuôn và ion Mg ++ , Tth - polymerase lại xúc tác cho phản ứng khuếch đại DNA. Enzym này cho phép khuếch đại bản mẫu là RNA thông qua sự hình thành cDNA. Nồng độ enzyme tối ƣu trong khoảng 1 -> 5 đơn vị trên một phản ứng. Mồi và nhiệt độ lai: Mồi là chỉ tiêu quan trọng để đạt đƣợc sự khuếch đại đặc trƣng, chuyên biệt và có đặc hiệu cao. Việc chọn mồi phải tuân theo một số nguyên tắc:  Trình tự của mồi đƣợc chọn sao cho không thể có sự bắt cặp bổ sung giữa mồi “xuôi” và mồi “ngƣợc”, cũng không có những cấu trúc kẹp tóc do sự bắt cặp khác nhau của một mồi.  Nhiệt độ nóng chảy của mồi “xuôi” và mồi “ngƣợc”, không cách nhau quá xa. Thành phần nucleotide của các mồi cân bằng, tránh các cặp G - C lặp lại quá nhiều lần.  Các mồi chọn cần phải đặc trƣng cho trình tự DNA cần khuếch đại, không trùng với trình tự lặp lại trên gen.  Trình tự nằm giữa mồi “xuôi” và mồi “ngƣợc” không quá lớn, phản ứng PCR sẽ tối ƣu trên những trình tự nhỏ hơn 1kb. 2.3.5.4. Các thành phần khác của phản ứng PCR Bốn loại nucleotide thƣờng đƣợc sử dụng ở nồng độ 20 - 200 M/mỗi nucleotide. Nồng độ cao hơn dễ dẫn đến sự khuếch đại “ký sinh”. Sự mất cân bằng trong các thành phần trong thành phần các nucleotide lại làm tăng các lỗi sao chép của polymerase. 15 Mg 2+ là cofactor cho hầu hết các DNA polymerase, đặc biệt là các DNA polymerase chịu nhiệt. Nồng độ Mg2+ ảnh hƣởng mạnh tới quá trình chạy PCR. Nồng độ Mg2+ quá thấp (< 0,5 mM) sẽ làm giảm phản ứng kéo dài mạch DNA do hoạt động của Taq polymerase bị ức chế. Nồng độ Mg2+ quá cao tuy ổn định mạch kép DNA nhƣng lại hạn chế sự biến tính hoàn toàn sản phẩm trong mỗi chu kỳ dẫn đến giảm sản phẩm cuối cùng. Quá thừa Mg2+ dẫn đến sự bắt cặp sai giữa mồi và khuôn, kết quả là tạo ra nhiều sản phẩm không đặc hiệu. Nồng độ tối ƣu Mg2+ phải đƣợc xác định cho từng phản ứng qua nhiều thử nghiệm. 2.3.5.5. Số lƣợng chu kỳ phản ứng PCR. Trong thực tế sử dụng, số lƣợng chu kỳ phản ứng PCR không vƣợt quá 40 chu kỳ do sự phân hủy và cạn kiệt các thành phần của phản ứng, sự xuất hiện các sản phẩm phụ ức chế phản ứng, các bản sao vừa đƣợc tổng hợp thƣờng có khuynh hƣớng kết hợp với nhau, kết quả là hiệu quả khuếch đại càng về sau càng giảm vì những nguyên nhân sau:  Sự phân huỷ cạn kiệt các thành phần phản ứng.  Sự xuất hiện sản phẩm phụ ức chế phản ứng.  Các bản sao kết hợp với nhau. 2.3.6. Phƣơng pháp RT - PCR (Reverse Transcription Polymerase Reaction) Phƣơng pháp RT - PCR là sự kết hợp giữa phƣơng pháp phiên mã ngƣợc và phƣơng pháp PCR. Phƣơng pháp này có thể phát hiện các mRNA tồn tại với lƣợng rất thấp, mà không thể phát hiện bằng phƣơng pháp nhƣ Northern blot. Ngoài ra, RT-PCR kết hợp với kỹ thuật RFLP có thể dễ dàng phát hiện ra các đột biến và sự đa hình trong đoạn khuếch đại và xác định độ dài của gen biểu hiện khi một mRNA quan tâm biểu hiện ở mức độ rất thấp. Nhờ RT - PCR sẽ khuếch đại mRNA bình thƣờng và mRNA đột biến tạo thành các DNA, sau đó dùng cùng loại men cắt giới hạn, DNA bình thƣờng phân biệt với DNA đột biến qua sự sai biệt trọng lƣợng phân tử (Bùi Trang Việt, 2002). Do Taq polymerase sử dụng trong bƣớc PCR không hoạt động trên RNA nên trƣớc hết cần chuyển RNA thành cDNA nhờ enzym phiên mã ngƣợc (reverse transcriptase). Sau đó cDNA sẽ đƣợc nhân bản nhờ Taq polymerase (Walker, 2000). Dấu hiệu xác định bệnh là sản phẩm nhân bản một đoạn gene đặc hiệu của virus. Sự hiện diện của sản phẩm đƣợc nhận biết qua điện di trên gel agarose. 16 Các phương pháp khuếch đại RNA bằng PCR  Oligo (dT) bắt cặp với đuôi poly (A) trên mRNA của động vật hữu nhũ , có thể dùng nhƣ mồi ngƣợc không đặc hiệu để tổng hợp sợi cDNA đầu tiên. Sau đó, phản ứng khuếch đại bằng PCR sẽ rất có hiệu quả khi bổ sung thêm một hoặc nhiều mồi xuôi đặc hiệu cho vùng gen mong muốn (Frohman, 1995 ; Schaefer, 1995 ; Bespalova và cộng sự, 1998).  Sự tổng hợp sợi cDNA đầu tiên có thể đƣợc thực hiện bằng một đoạn mồi oligonucleotide bắt cặp đặc hiệu (gene - specific priming, GSP) với vùng đã đƣợc chọn trên sợi RNA hoặc mRNA đặc trƣng GSP đƣợc gọi là mồi ngƣợc, sự khuếch đại sau đó sẽ đƣợc bổ sung thêm một mồi xuôi tƣơng thích với trình tự đặc hiệu trên cDNA (Frohman, 1995 ; Schaefer, 1995 ; Bespalova và cộng sự, 1998).  Một đoạn gồm 6 nucleotide ngẫu nhiên có thể dùng làm mồi để tổng hợp cDNA tại nhiều điểm dọc theo sợi RNA mẫu, tạo ra nhiều đoạn bản sao khác nhau trên toàn bộ phân tử RNA. Phƣơng pháp này rất hữu dụng để khuếch đại sợi RNA quá dài hoặc chứa nhiều cấu trúc bậc hai không thể tổng hợp bằng oligo (T) hoặc GSP (Lee và Caskey, 1990). Trong việc chẩn đoán bệnh trắng đuôi, phƣơng pháp Single - Step RT - PCR dùng để khuếch đại RNA của hai virus ở trong cùng dung dịch tách chiết (Widada , 2003, 2004 ; Sahul Hameed, 2004a và cộng sự). Phƣơng pháp này đƣợc tiến hành bằng cách phiên mã ngƣợc và khuếch đại đoạn gen mong muốn trong một ống phản ứng đơn cho mỗi virus (single reaction tube) bằng một chu kỳ nhiệt không liên tục. Kỹ thuật này phát hiện MrNV bằng cách sử dụng một cặp mồi MrNV - RNA2 - F và MrNV - RNA2 - R đặc hiệu cho RNA - 2 của MrNV đƣợc thiết kế từ trình tự của bộ gen MrNV (Genbank accession no. AY222840) (Widada, 2003; Sahul Hameed và cộng sự, 2004a). Phát hiện XSV bằng cách cặp mồi XSV - F và XSV - R đƣợc công bố (Widada và cộng sự, 2004). Nguyên tắc phản ứng giống (hình 2.4) sử dụng hai mồi MrNV - RNA2 - R và XSV - R là hai mồi ngƣợc sẽ bắt cặp với tƣơng ứng với RNA của từng virus, sau đó sẽ tạo cDNA trong một thời gian, rồi gia nhiệt để bất hoạt enzym phiên mã ngƣợc, chu kỳ tiếp tục đƣợc thực hiện cùng với hai mồi MrNV - RNA2 - F và MrNV - RNA2 - R và XSV - F và XSV - R cho từng virus. Kích thƣớc sản phẩm khuếch đại 681 bp là MrNV và 500 bp là XSV. 17 18 Hình 2.4: Phƣơng pháp Single - Step RT - PCR để khuếch đại RNA bằng PCR ( Dieffenbach và Dveksler, 1995;Widada , 2003; Sahul Hameed và cộng sự, 2004a). RNA tách chiết Tổng hợp cDNA MrNV XSV Tạo cDNA Bất hoạt enzym RT Khuếch đại Tạo cDNA Bất hoạt enzym RT Khuếch đại Tiếp tục chu kỳ Tiếp tục chu kỳ 681 bp 500 bp 19 PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 NỘI DUNG, THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM 3.1.1. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU  Thử nghiệm qui trình Single - Step RT - PCR (Widada, 2003, 2004; Sahul Hameed và cộng sự, 2004a) trên mẫu tôm càng xanh bệnh trắng đuôi đƣợc cung cấp từ Ấn Độ.  Khảo sát một số điều kiện của qui trình Single - Step RT - PCR nhƣ phƣơng pháp tách chiết, nồng độ mồi, nhiệt độ lai của mồi.  Ứng dụng qui trình khảo sát đƣợc kiểm tra sự hiện diện MrNV, XSV ở một số mẫu tôm càng xanh thu thực địa. 3.1.2. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM THỰC HIỆN Thời gian nghiên cứu: từ 7/3-7/8/2005. Địa điểm thực hiện: Trung Tâm Quốc Gia Quan Trắc Cảnh Báo Môi Trƣờng và Phòng Ngừa Dịch Bệnh Thủy Sản Khu Vực Nam Bộ thuộc Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II. 3.2. VẬT LIỆU 3.2.1. Mẫu tôm Các mẫu tôm càng xanh gồm: 30 mẫu ấu trùng, 2 mẫu postlarvae và 10 mẫu tôm mẹ thu tại trại Thực Nghiệm Thủ Đức, 8 mẫu tôm mẹ thu ở khu vực ĐBSCL. Trong các mẫu chúng tôi thu đƣợc có 8 mẫu tôm mẹ thu ở khu vực ĐBSCL và 1 mẫu postlarvae có triệu chứng lâm sàng bệnh trắng đuôi . Các mẫu tôm càng xanh đƣợc bảo quản trong tủ âm - 700C. 3.2.2. Mồi sử dụng cho qui trình Mồi đƣợc thiết kế bởi tác giả Yoganandhan và cộng sự (2005) dựa trên trình tự của RNA virus (MrNV: Ac No. AY222840; XSV Ac No). Bảng 3.1: Các mồi sử dụng cho phản ứng Single - Step RT - PCR Virus Primer Trình tự GenBank AC Kích cỡ sản phẩm MrNV MrNV-RNA2-F 5’-GATACAGATCCACTAGATGACC-3’ AY222840 681 bp MrNV-RNA2-R 5’-GACGATAGCTCTGATAATCC-3’ XSV XSV-F 5’-GGAGAACCATGAGATCACG-3’ 500 bp XSV-R 5’-CTGCTCATTACTGTTCGGAGTC-3’ 20 3.2.3. Hạt bead RT - PCR: READY - TO - GO (Chế phẩm sử dụng ngay) Sản phẩm này do công ty Amersham pharmacia biotech, Mỹ sản xuất. Đây là chế phẩm có sẵn các thành phần để thực hiện phản ứng RT - PCR, khi sử dụng ta chỉ cần thêm bản mẫu và mồi sử dụng . Mỗi loại hạt Bead đƣợc thiết kế cho một phản ứng với thể tích cuối 50 µl. Thành phần của hạt bead gồm:  2 đơn vị Taq DNA polymerase  10 nM Tris - HCL (pH 9, nhiệt độ phòng)  60 nM KCl  1.5 mM MgCl2  20 M mỗi loại dNTP  M - MulV Reverse Transcriptase  RNA guard TM  Ribonuclease Inhibitor và chất ổn định không chứa Rnase/DNase 3.2.4. Bộ Kit AquaPure RNA Isolation Kit. Bộ Kit này do công ty Bio - Rad sản xuất, dùng để tinh sạch RNA từ những tế bào vi khuẩn và mô động vật. Thành phần của Bộ Kit gồm :  RNA Lysis Solution  Protein/DNA Precipitation Solution  RNA Hydration Solution 21 3.2.5. Thang DNA X174 RF Hae III Bảng 3.2: Thang DNA X174 RF Hae III STT vạch Kích thƣớc (bp) 1 1353 2 1078 3 872 4 603 5 310 6 281 7 271 8 234 9 194 10 118 11 72 3.2.6. Hoá chất khác Trizol Phenol (pH 4) Guanidine thiocyanate 0,8 M Ammonium thiocyanate 0,4 M Sodium acetate, pH 5, 0,1 M Glycerol 5%  Ethanol 75%  Isopropanol 100%  Chloroform  DEPC (Diethyl Prycacbonat)  Ethidium bromide  Dung dịch đặt mẫu (bromophenol blue 0,25%, glycerol 40%, Tris HCL 200 mM, EDTA 200 mM)  Agarose.  TBE 1X (Tris - boric acid 40 nM, EDTA 0,1 mM). 22  Nƣớc cất 2 lần có sử lý DEPC 1% (DEPC - H2O) 3.2.7. Dụng cụ và thiết bị  Tủ cấy vô trùng (Laminar-Box)  Tủ lạnh - 200C (Liebherr)  Tủ sấy dụng cụ 1500C (Gallenkamp)  Máy Vortex (Zx3 Velp)  Máy ly tâm lạnh 15000 vòng/ phút (certrifuge 5415 C)  Máy PCR (Thermocycle - Biorad)  Bộ điện di (Biorab Hybaid)  Bàn đọc UV (White/UV Transillminator)  Pipetteman các loại 0,5 - 1000 l  Eppendorf các loại 0,2 - 0,5 ml.  Cân phân tích  Kéo, đèn, cồn, chày nhựa sử dụng một lần. 3.3. PHƢƠNG PHÁP 3.3.1. Phƣơng pháp tách chiết RNA virus 3.3.1.1. Tách chiết RNA bằng Trizol Phƣơng pháp tách chiết RNA tổng số bằng Trizol theo Peter Walker và cộng sự (2000). Nghiền khoảng 100 mg mô trong 1ml Trizol. Ủ nhiệt độ phòng trong 5 phút. Thêm vào 200 l Chloroform. Vortex 20 giây. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 3 phút. Ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút. Thu dịch nổi có chứa RNA vào ống eppendorf 1,5 ml khác (hút khoảng 600 l cho mỗi ống).Thêm vào mỗi ống 600 l Isopropanol lạnh. Ủ nhiệt độ phòng trong 10 phút (qua đêm - 200C hay để - 700C trong 1 giờ). Ly tâm 12000 vòng trong 10 phút. Loại bỏ dung dịch nổi. Rửa cặn RNA bằng 1 ml Ethanol 70%. Vortex, ly tâm 7500 vòng trong 5 phút. Loại bỏ dung dịch nổi. Làm khô cặn RNA ở 550C. Hòa cặn RNA trong 50 l H20 - DEPC. Sau đó bảo quản - 20 0 C. 23 3.3.1.2. Tách chiết bằng AquaPure RNA Isolation kit (Bio - Rad) Lấy 5 - 10 mg mô tƣơi. Nghiền mẫu trong eppendorf với 300 l RNA Lysis. Thêm vào 100 l dung dịch Protein - DNA để phá vỡ tế bào. Đảo ngƣợc ống 10 lần và ủ trên nƣớc đá 5 phút. Ly tâm lạnh (40C) ở 13000 vòng trong 6 phút, kết tủa protein và DNA sẽ có màu trắng. Hút dung dịch nổi chứa RNA (loại bỏ lớp dƣới) vào eppendorf 1,5 ml sạch chứa 300 l 100% Isopropanol (trên đá). Đảo ngƣợc ống 20 - 25 lần. Ly tâm 13000 vòng trong 6 phút (40C) (RNA sẽ thấy dƣới dạng kết tủa sáng). Đổ bỏ dung dịch nổi và làm ráo nƣớc trên giấy thấm, cho vào 300 l 70% ethanol và đảo ống vài lần để rửa RNA. Ly tâm ở 13000 vòng trong máy ly tâm khoảng 2 phút (40C). Đảo và làm ráo nƣớc trên giấy thấm sạch và cho không khí làm khô 10 - 15 phút. Thêm 50 l dung dịch RNA Hydration. Ủ 30 phút trên nƣớc đá (hoặc trữ - 700C -> - 800C đến khi sử dụng). Trƣớc khi sử dụng vortex mạnh 5s và spin down hoặc trộn mẫu lên xuống vài lần. 3.3.2. Phƣơng pháp SINGLE - STEP RT - PCR trên RNA của MrNV, XSV Trƣớc khi tiến hành phiên mã ngƣợc, RNA bản mẫu phải biến tính ở 700C trong 10 phút nhằm phá vỡ toàn bộ cấu trúc bậc một và hai cho RNA của từng virus. Tiếp đó, quá trình phiên mã ngƣợc đƣợc tiến hành cho hai Mix riêng biệt của MrNV, XSV trong eppendorf có bổ sung hạt Bead ở điều kiện 520C trong 30 phút. Thành phần hai Mix sử dụng cho phản ứng Single - Step RT - PCR trên RNA của MrNV, XSV: Bảng 3.3: Thành phần hai Mix của phản ứng Single - Step RT - PCR Hai virus Thành phần của hai Mix Tổng Thể tích ( 50 l ) MrNV H20 – DEPC 43 l MrNV -RNA2-F (20 pmol/ l) 1 l MrNV-RNA2-R (20 pmol/ l) 1 l Bản mẫu 5 l XSV H20 – DEPC 43 l XSV - F (20 pmol/ l) 1 l XSV - R (20 pmol/ l) 1 l 24 Bản mẫu 5 l Kết thúc quá trình phiên mã ngƣợc, dung dịch phản ứng đƣợc biến tính ở 940C trong 2 phút nhằm ức chế enzym phiên mã ngƣợc. Sau đó thực hiện quá trình khuếch đại acid nucleic bằng phƣơng pháp PCR hai mồi MrNV - RNA2 - F và MrNV - RNA2 - R cho MrNV, XSV - F và XSV - R cho XSV trong 30 chu kỳ. Mỗi chu kỳ gồm:  Giai đoạn biến tính: 940C trong 40s  Giai đoạn bắt cặp: 550C trong 40s  Giai đoạn kéo dài mạch: 680C trong 1 phút  Hỗn hợp cuối của phản ứng đƣợc duy trì ở: 680C trong 10 phút Sản phẩm tạo thành có kích thƣớc 681 bp của MrNV và 500 bp của XSV. 3.3.3. PHƢƠNG PHÁP ĐIỆN DI ACID NUCLEIC TRÊN GEL AGAROSE Phƣơng pháp điện di dựa vào đặc tính cấu trúc của acid nucleic trong dung dịch. Đó là các đại phân tử tích điện âm nên khi chịu tác động của một điện trƣờng, chúng sẽ di chuyển về cực dƣơng của điện trƣờng. Tính linh động của acid nucleic phụ thuộc phần lớn vào hai chỉ tiêu: kích thƣớc của acid nucleic và nồng độ của chất cấu thành gel. Gel agarose thƣờng rất thông dụng để phân tách một đoạn có kích thƣớc khoảng 0.5 - 10 Kb. Ở các nồng độ agarose khác nhau cho phép tăng hiệu quả phân tách các nhóm phân tử có kích thƣớc khác nhau. Để đọc kết quả điện di ngƣời ta bổ sung một lƣợng ethium bromide. Ethidium bromide có khả năng gắn xen vào giữa các nucleotide của phân tử DNA. Do đó, các phân tử DNA sẽ gắn kết với ethium bromide và phát huỳnh quang khi kích thích bằng tia tử ngoại. Dựa vào vị trí các vết huỳnh quang này ngƣời ta biết đƣợc vị trí các đoạn DNA trên gel. Trong kỹ thuật điện di DNA, ngƣời ta thƣờng sử dụng các thang chuẩn với mục đích so sánh và ƣớc lƣợng kích thƣớc các phân tử điện di. Các thang chuẩn này là hỗn hợp gồm nhiều đoạn DNA (đối với thang DNA). Dựa vào kích thƣớc đã biết của các phân tử trên thang chuẩn và dựa vào sự so sánh vị trí của các phân tử trên gel với thang chuẩn để xác định kích thƣớc các phân tử mục tiêu. Cách tiến hành:  Đổ gel: 25 Cân 1g agarose cho vào bình tam giác 250 ml, thêm vừa đủ 100 ml TBE 1X vào, đun nóng cho tan agarose. Để nguội khoảng 50 - 550C, cho vào 2 l ethidium bromide (10 mg/ml). Trong thời gian chờ nguội ta lắp lƣợc vào khay, đổ gel vào khay, đợi 15 - 30 phút cho gel đông lại. Đổ TBE 1X vào bồn điện di cho ngập (cao hơn gel khoảng 5 mm). Khi gel đã khô, rút lƣợc ra khỏi giếng, đặt gel vào bồn điện di.  Nạp mẫu: Cho vào eppendorf (0,2 ml) 10 l mẫu và 2 l dung dịch nạp mẫu (bromophenol blue). Trộn đều, hút khoảng 10 - 12 l mẫu đặt vào giếng. Tƣơng tự đối với DNA chuẩn chạy điện di ở hiệu điện thế 100 V, cƣờng độ dòng điện 2 Ampe, trong thời gian 40 phút.  Phát hiện vạch DNA sản phẩm: Sau khi chạy điện di, các phân tử DNA (sản phẩm của PCR và của thang chuẩn) đƣợc nhuộm bởi ethidium bromide sẽ tập trung tại nơi có DNA, xen vào giữa hai sợi DNA xoắn kép. Gel đã nhuộm này đƣợc xem dƣới tia tử ngoại. Phức DNA - ethidium bromide hấp thụ tia tử ngoại ở 300 nm, còn lại một ít năng lƣợng và phát ra ở dạng tia sáng nhìn thấy đƣợc 590 nm. Dƣới tia tử ngoại, các đoạn DNA (sản phẩm của PCR) hiện ra có màu đỏ cam trên gel. 3.4. BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM 3.4.1. Thử nghiệm qui trình Single - Step RT - PCR phát hiện MrNV, XSV từ mẫu tôm bệnh (chứng dƣơng) đƣợc cung cấp từ Ấn Độ. Trong thử nghiệm này chúng tôi đã sử dụng đúng qui trình của tác giả đƣa ra. Thử nghiệm qui trình trên 1 mẫu tôm thịt đã xác định nhiễm MrNV và XSV cung cấp từ Ấn Độ, 1 mẫu tôm không bị bệnh đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp mô học, và 1 mẫu chứng âm (RNA bản mẫu đƣợc thay bằng H20 - DEPC). Các mẫu đƣợc tách chiết theo bộ Kit. Thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần. 3.4.2. Khảo sát một số điều kiện của qui trình Single - Step RT - PCR 3.4.2.1. So sánh hai qui trình tách chiết RNA bằng Trizol (Peter Walker) và AquaPure RNA Isolation Kit (Bio Rad). 26 Tách chiết RNA từ mẫu chứng dƣơng bằng hai phƣơng pháp Trizol và bộ Kit, chúng tôi thực hiện phản ứng RT - PCR cho cả hai virus MrNV, XSV. Thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần. 3.4.2.2. Khảo sát nồng độ mồi Theo qui trình của Widada, Sahul Hameed và cộng sự, nồng độ mồi sử dụng cho phản ứng là 20 mol. Tiến hành khảo sát với dãy nồng độ mồi cho cả hai virus nhƣ sau : 10 mol, 15 mol, 20 mol, 25 mol, 30 mol. Thử nghiệm đƣợc thực hiện trên mẫu chứng dƣơng. Thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần. 3.4.2.3. Khảo sát nhiệt độ lai của mồi Theo qui trình gốc nhiệt độ lai của mồi là 550C. Tiến hành phản ứng với dãy nhiệt độ từ 54 - 580C cho cả hai virus theo bảng sau: Bảng 3.4: Bảng khảo sát nhiệt độ lai của các mồi Thí Nghiệm 1 2 3 4 5 Tm (MrNV) 54 0 C 55 0 C 56 0 C 57 0 C 58 0 C Tm (XSV) 54 0 C 55 0 C 56 0 C 57 0 C 58 0 C Các thành phần trong mỗi phản ứng thí nghiệm là nhƣ nhau đối với RNA bản mẫu tách chiết từ mẫu chứng dƣơng đƣợc cung cấp tại Ấn Độ. Thí nghiệm lặp lại 3 lần. 3.4.3. Ứng dụng qui trình Single - Step RT - PCR khảo sát đƣợc kiểm tra một số mẫu tôm càng xanh thu thực địa. Áp dụng thử nghiệm qui trình khảo sát đƣợc trên 50 mẫu tôm càng xanh ở các giai đoạn khác nhau, số lƣợng mẫu đƣợc thử nghiệm theo bảng sau: Bảng 3.5: Các loại mẫu tôm càng xanh thu ở các giai đoạn khác nhau Giai đoạn Số lƣợng (mẫu) Địa điểm thu Ấu trùng 30 Trại Thực Nghiệm TĐ Postlarvae 2 Trại Thực Nghiệm TĐ 27 Tôm mẹ 10 Trại Thực Nghiệm TĐ Tôm mẹ 8 ĐBSCL PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM QUI TRÌNH SINGLE - STEP RT - PCR PHÁT HIỆN MrNV, XSV TỪ MẪU TÔM BỆNH ĐUÔI TRẮNG ĐƢỢC CUNG CẤP TỪ ẤN ĐỘ Thử nghiệm qui trình Single - Step RT - PCR phát hiện hai loài virus MrNV, XSV trên mẫu tôm thịt đƣợc cung cấp từ Ấn Độ. Chúng tôi tiến hành thực hiện đồng thời mẫu chứng âm (đầy đủ các thành phần trừ RNA bản mẫu) và 1 mẫu tôm bình thƣờng đƣợc xác định bằng phƣơng pháp mô học, để xác định mức độ đặc hiệu của mồi và kiểm tra mức độ ngoại nhiễm khi tiến hành trong phòng thí nghiệm của Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II. Sau 3 lần lặp lại thí nghiệm, kết quả tƣơng đối giống nhau cho mẫu chứng dƣơng, không có sự thay đổi. Hình 4.1 là hình đại diện cho lần lặp lại thứ 3. Hình 4.1: Kết quả điện di các sản phẩm khuếch đại từ mẫu tôm càng xanh nhiễm MrNV, XSV. Giếng 1: mẫu chứng âm. Giếng 2: sản phẩm RT - PCR từ mẫu tôm bình thƣờng không nhiễm XSV. Giếng 3: sản phẩm RT - PCR từ mẫu tôm nhiễm XSV. MrNV XSV 500 bp 681 bp 1 2 3 M 4 5 5 6 5 28 Giếng 4: sản phẩm từ RT - PCR từ mẫu tôm bệnh nhiễm MrNV. Giếng 5: sản phẩm RT - PCR từ mẫu tôm bình thƣờng không nhiễm MrNV. Giếng 6: mẫu chứng âm. Giếng M: Thang DNA X174 RF Hae III. Mẫu tôm thịt bệnh đƣợc cung cấp từ Ấn Độ đƣợc tách chiết bằng bộ Kit có 1 vạch sản phẩm có kích thƣớc 500 bp là XSV (giếng 3) và 1 vạch sản phẩm có kích thƣớc 681 bp là MrNV (giếng 4), các kết quả này đúng với Widada, Sahul Hameed và cộng sự. Để kiểm tra tính đặc hiệu của mồi chúng tôi thực hiện một mẫu tôm bình thƣờng. RNA của tôm không nhiễm MrNV, XSV (giếng 2, 5). Ở các giếng (2, 5) không thấy có sản phẩm khuếch đại chứng tỏ mồi sử dụng trong phản ứng Single - Step RT - PCR rất đặc hiệu. Để kiểm tra vấn đề ngoại nhiễm chúng tôi tiến hành làm hai mẫu chứng âm (giếng 1, 6), mẫu này có đầy đủ các thành phần của phản ứng chỉ trừ RNA bản mẫu. Mẫu này không cho sản phẩm khuếch đại nào chứng tỏ phản ứng Single - Step RT - PCR mà chúng tôi thực hiện không bị ngoại nhiễm. Kết luận: từ kết quả hình 4.1 cho thấy qui trình mà chúng tôi ứng dụng cho kết quả tốt phù hợp với những nghiên cứu từ trƣớc. 4.2. KẾT QUẢ KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN CỦA QUI TRÌNH SINGLE - STEP RT - PCR 4.2.1. Kết quả so sánh hai qui trình tách chiết Trong phản ứng RT - PCR công đoạn tách chiết RNA đƣợc xem là một trong những bƣớc quyết định. Do đó chúng tôi tiến hành hai phƣơng pháp tách chiết khác nhau trên 1 mẫu tôm thịt bệnh trắng đuôi đƣợc cung cấp từ Ấn Độ theo bộ Kit và theo phƣơng pháp Trizol để có thể đánh giá đƣợc hiệu quả của hai phƣơng pháp tách chiết này. Thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần. 29 Hình 4.2: Kết quả điện di các sản phẩm khuếch đại RT-PCR từ mẫu chứng dƣơng đƣợc tách chiết bộ Kit và Trizol. Phần A, C: sản phẩm khuếch đại RNA tách chiết bằng bộ Kit. Phần B, D: sản phẩm khuếch đại RNA tách chiết bằng Trizol. Giếng 1, 2, 3, 4, 5, 6: sản phẩm RT - PCR từ mẫu tôm nhiễm MrNV. Giếng 8, 9, 10, 11, 12, 13: sản phẩm RT - PCR từ mẫu tôm nhiễm XSV. Giếng 7, 14: mẫu chứng âm. Giếng M: Thang DNA X174 RF Hae III. Bảng 4.1: Kết quả điện di các sản phẩm RT - PCR đƣợc tách chiết bộ Kit và Trizol Tách chiết Virus Lần 1 Lần 2 Lần 3 Kết quả Bộ Kit MrNV giếng 1 giếng 2 giếng 3 ++++ XSV giếng 8 giếng 9 giếng 10 ++ Trizol MrNV giếng 4 giếng 5 giếng 6 +++ XSV giếng 11 giếng 12 giếng 13 + (+): biểu hiện mức độ sáng của sản phẩm. Qua 3 lần thử nghiệm trên mẫu chứng dƣơng, chúng tôi nhận thấy vạch sản phẩm từ RNA tách chiết bằng bộ Kit có độ sáng đậm hơn vạch sản phẩm của RNA tách chiết theo phƣơng pháp Trizol. Nhìn chung cả hai qui trình tách chiết đều đạt yêu cầu. Tuy nhiên mỗi phƣơng pháp có ƣu và nhƣợc điểm riêng: MrNV 1 2 3 M 4 5 6 7 XSV 8 9 10 M 11 12 13 14 A B C D 30  Phƣơng pháp Trizol là phƣơng pháp tách chiết RNA tổng số phƣơng pháp này đơn giản ít tốn thời gian, hoá chất có thể tƣ pha. Lƣợng RNA thu đƣợc dễ bị lẫn phenol và các tạp chất khác trong quá trình tách chiết nếu thao tác không cẩn thận, phƣơng pháp Trizol sử dụng phenol và chloroform, hai chất này rất độc đối với ngƣời tách chiết. Hoá chất Trizol có thể tự pha nên có thể sai sót trong quá trình pha, nhƣ việc hút phenol không đúng cách, không đủ thể tích, cân không đủ lƣợng, dễ nhiễm RNAase, các vi sinh vật. Các yếu tố đó ảnh hƣởng lớn đến quá trình tách chiết.  Phƣơng pháp tách chiết theo bộ Kit đòi hỏi theo điều kiện tách chiết của bộ Kit, hoá chất sử dụng trong bộ Kit tuân theo qui trình sản xuất nghiêm ngặt, không nhiễm RNAase, các vi sinh vật nên lƣợng RNA thu đƣợc sẽ rất nhiều và không gãy vụn, không có sử dụng phenol và chloroform nên không độc đối với ngƣời tách chiết. Trong quá trình tách chiết không bị lẫn tạp chất nhiều. Tuy nhiên tách chiết phải ủ trên đá trong suốt quá trình tách chiết. Nếu thực hiện trong thời gian dài thì lƣợng đá phải đƣợc bổ sung, công việc này làm ngắt quảng quá trình tách chiết và làm mất thời gian. Nhƣ vậy, qua hai quá trình tách chiết từ mẫu tôm bệnh đƣợc cung cấp từ Ấn Độ. Chúng tôi nhận thấy rằng trong dịch tách chiết của mẫu tôm thịt bị nhiễm bệnh luôn tồn tại hai virus MrNV và XSV. 4.2.2. Kết quả khảo sát nồng độ mồi Tiến hành pha loãng mồi từ ống gốc có nồng độ là 30 mol theo dãy sau: 10 mol, 15 mol, 20 mol, 25 mol, 30 mol. Sau 3 lần lặp lại thí nghiệm, kết quả tƣơng đối giống nhau, không có sự thay đổi đáng kể. Hình 4.3 là hình đại diện cho lần lặp lại thứ 3. Tiến hành 10 phản ứng Single - Step RT - PCR trên bản mẫu RNA của mẫu chứng dƣơng ở các nồng độ pha loãng khác nhau với kết quả nhƣ sau: 31 Hình 4.3: Kết quả điện di sản phẩm RT - PCR từ mẫu chứng dƣơng ở các nồng độ mồi khác nhau Hình A: dãy khảo sát nồng độ của MrNV. Hình B: dãy khảo sát nồng độ của XSV. (-): mẫu chứng âm. Giếng M: Thang DNA X174 RF Hae III. Ở Hình A, chúng tôi nhận thấy ở nồng độ 20 mol vạch sản phẩm có độ sáng rõ và khá đậm và gần tƣơng đồng với nồng độ 25 mol, ở nồng độ 30 mol các vạch sản phẩm này có hiện tƣợng smear khá nhiều chứng tỏ lƣợng mồi thừa cho nên để tiết kiệm mồi mà có thể phát hiện đƣợc MrNV nên chúng tôi chọn ở nồng độ 20 mol. Ở Hình B, nồng độ 20 mol có vạch sản phẩm gần bằng nồng 25 mol nhƣng yếu hơn 30 mol. Vậy để tiết kiệm lƣợng mồi mà vẫn có thể phát hiện đƣợc XSV nên chúng tôi chọn nồng độ 20 mol. 4.2.3. Kết quả khảo sát nhiệt lai của mồi Trƣớc khi tiến hành khảo sát hai dãy nhiệt độ của MrNV, XSV chúng tôi lựa chọn ra mẫu chứng dƣơng đã tách chiết theo bộ Kit để khảo sát. Kết quả thu đƣợc nhƣ sau: 10 15 20 25 30 M 9 10 10 15 20 25 30 M 11 12 A B 32 Hình 4.4: Kết quả điện di khảo sát nhiệt lai của mồi trên hai virus MrNV, XSV. Phần A: dãy khảo sát nhiệt độ của XSV. Phần B: dãy khảo sát nhiệt độ của MrNV. (-): mẫu chứng âm. (+): biểu hiện mức độ sáng của sản phẩm. Để dễ đánh giá mức độ sáng của sản phẩm, chúng tôi dùng ký hiệu dấu cộng, quan sát từ bản điện di ta thấy tín hiệu sản phẩm tối ƣu của MrNV ở nhiệt độ 550C có độ sáng cao hơn tín hiệu sản phẩm tối ƣu của XSV ở nhiệt độ 550C , nên chúng tôi cho ký hiệu năm dấu cộng để biểu hiện mức độ sáng tối ƣu của MrNV và bốn dấu cộng để biểu hiện mức độ sáng tối ƣu của XSV. Cứ lần lƣợt nhƣ thế, tùy theo mức độ sáng của sản phẩm mà ta ký hiệu dấu cộng nhiều hay ít. Ở đây chúng tôi chỉ dựa vào độ sáng tƣơng đồng để ký hiệu theo bảng trên. Dựa vào kết quả khảo sát dãy nhiệt độ của MrNV, chúng tôi nhận thấy không có sự thay đổi lớn về tín hiệu sáng của sản phẩm, từ nhiệt độ 540C -> 580C, ngoài nhiệt độ 550C là tối ƣu nhất, thì thấy ở nhiệt độ 560C là sáng nhất so với các nhiệt độ còn lại. Ngƣợc lại với dãy nhiệt độ của MrNV thì trong dãy nhiệt độ của XSV có sự thay đổi lớn về tín hiệu sáng của sản phẩm giữa các nhiệt độ, từ 540C -> 580C, ngoài nhiệt độ Nhiệt độ 540C 550C 560C 570C 580C Tín hiệu sản phẩm (MrNV) ++ +++++ +++ ++ ++ Tín hiệu sản phẩm (XSV) ++ ++++ + + +++ 54 0 55 0 56 0 57 0 58 0 M 54 0 55 0 56 0 57 0 58 0 XSV MrNV A B Bảng 4.2: Kết quả biểu hiện tín hiệu của sản phẩm của hai dãy nhiệt độ 33 55 0C là tối ƣu nhất, thì thấy ở nhiệt độ 580C sáng nhất so với các nhiệt độ còn lại. Từ những nhận xét đó, ta thấy từ nhiệt độ tối ƣu 550C chỉ tăng 10C (550C - 560C) trong dãy khảo sát của MrNV thì tín hiệu sản phẩm sáng nhất ở 560C so với các nhiệt độ còn lại , trong khi dãy nhiệt độ của XSV tăng lên đến 30C (550C - 580C) thì mới thấy ở 58 0C là sáng nhất so với các nhiệt độ còn lại trừ nhiệt độ 550C. Điều đó cho thấy hai dãy nhiệt độ của MrNV và XSV tỷ lệ nghịch nhau về tín hiệu sáng của sản phẩm. Điều này rất thuận lợi để phát triển kỹ thuật multiplex. So sánh hai dãy nhiệt độ của MrNV và XSV ở cặp nhiệt độ 560C, ta thấy có sự tƣơng quan ngƣợc rõ rệt của hai tín hiệu sản phẩm ở nhiệt độ 560C, tín hiệu sản phẩm của MrNV sáng hơn rất nhiều so tín hiệu sản phẩm của XSV. Ngoài trừ cặp nhiệt độ 55 0C là tối ƣu nhất thì tất cả các cặp nhiệt độ đều không cho sản phẩm tối ƣu. Điều này rất thuận lợi để phát triển kỹ thuật multiplex. Nhƣ vậy, ở nhiệt độ 550C theo qui trình Single - Step RT - PCR là tối ƣu nhất cho hai mồi MrNV và XSV. 4.3. KẾT QUẢ ỨNG DỤNG QUI TRÌNH SINGLE - STEP RT - PCR KHẢO SÁT ĐƢỢC PHÁT HIỆN MrNV, XSV TỪ NHỮNG MẪU TÔM THU THỰC ĐỊA. Dựa qui trình đã khảo sát đƣợc, chúng tôi tiến hành khảo sát 50 mẫu tôm càng xanh thu từ Trại Thực nghiệm Thủ Đức và các mẫu tôm mẹ thu tại ĐBSCL. Chúng tôi tiến hành khảo sát trên 8 mẫu tôm mẹ thu tại ĐBSCL và 1 mẫu tôm postlarvae nghi là bệnh trắng đuôi trƣớc. Kết quả ở hình 4.5. 34 4.5: Kết quả điện di phát hiện MrNV và XSV trên một số mẫu tôm càng xanh. Hình A: kết quả điện di phát hiện MrNV. Hình B: Kết quả điện di phát hiện XSV. Giếng 1, 2 , 4, 6, 7, 8: sản phẩm RT - PCR từ mẫu tôm mẹ nhiễm MrNV và XSV. Giếng 9: sản phẩm RT - PCR từ mẫu tôm postlarvae nhiễm MrNV và XSV. Giếng 5: âm tính. Giếng 3: sản phẩm RT - PCR từ mẫu tôm mẹ nhiễm MrNV. Giếng 10: mẫu chứng dƣơng. Giếng 11: mẫu chứng âm (H20 - DEPC). Giếng M: Thang DNA X174 RF Hae III. Kết quả thu đƣợc 7 mẫu tôm mẹ dƣơng tính thu ở ĐBSCL và 1 mẫu postlarvae dƣơng tính thu tại Trại Thực Nghiệm Thủ Đức. Trong đó có 5 mẫu bệnh rất nặng nhiễm đồng thời 2 virus MrNV và XSV ở các giếng 1, 2, 4, 7, 9. 2 mẫu bệnh ở mức độ trung bình nhiễm đồng thời MrNV và XSV ở các giếng 6, 8. 1 mẫu bệnh ở mức độ nhẹ nhiễm MrNV ở giếng 3. MrNV XSV 1 2 3 4 M 5 6 7 8 9 10 11 A B 1 2 3 4 M 5 6 7 8 9 10 11 35 Tiếp tục khảo sát 40 mẫu tôm càng xanh còn lại. Các mẫu này không thấy có biểu hiện của bệnh trắng đuôi. 4.6: Kết quả điện di mẫu tôm mẹ thu tại Trại Thực Nghiệm Thủ Đức (hình đại diện 10 mẫu). Giếng :1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 âm tính. Giếng 11: mẫu chứng dƣơng. Giếng 12: mẫu chứng âm (H20 - DEPC). Giếng M: Thang DNA X174 RF Hae III. Kết quả điện di 40 mẫu đều âm tính tuy nhiên trong 10 mẫu tôm mẹ mà chúng tôi thu không có mẫu tôm mẹ sinh ra đàn postlarvae bệnh trắng đuôi, nên chƣa thể xác định có sự lây bệnh từ tôm mẹ cho đàn ấu trùng hay không. Chúng tôi đã tiến hành phản ứng Single - Step PCR trên 50 mẫu tôm càng xanh ở các giai đoạn ấu trùng, tôm postlarvae, tôm mẹ có đƣợc kết quả nhƣ sau: 1 2 3 4 5 6 M 7 8 9 10 11 12 MrNV XSV 1 2 3 4 5 6 M 7 8 9 10 11 12 36 Bản g 4.3: Kết quả thực hiện phản ứng RT- PCR trên 50 mẫu tôm càng xanh (+) : biểu hiện mức độ nhiễm bệnh trắng đuôi Ký hiệu mẫu Giai đoạn Địa điểm thu Kết quả MrNV XSV 1 -> 30 Ấu trùng Trại Thực Nghiệm TĐ - - 31 Postlarvae Trại Thực Nghiệm TĐ - - 32 Postlarvae Trại Thực Nghiệm TĐ +++ +++ 33-> 42 Tôm mẹ Trại Thực Nghiệm TĐ - - 43 Tôm mẹ ĐBSCL +++ +++ 44 Tôm mẹ ĐBSCL +++ +++ 45 Tôm mẹ ĐBSCL + - 46 Tôm mẹ ĐBSCL +++ +++ 47 Tôm mẹ ĐBSCL - - 48 Tôm mẹ ĐBSCL ++ + 49 Tôm mẹ ĐBSCL +++ + 50 Tôm mẹ ĐBSCL ++ ++ 37 Tóm lại trong 50 mẫu mà chúng tôi thực hiện có 7 mẫu tôm nhiễm đồng thời MrNV, XSV và 1 mẫu tôm nhiễm MrNV (giếng 3, hình 4.5). Ở mẫu này ta thấy chỉ có sự hiện diện MrNV không có sự hiện diện của XSV. Ở đây chúng tôi đƣa ra hai lý do đƣợc cho là thích hợp để giải thích kết quả này, theo Widada và Bonami (2004), XSV sử dụng RNA Polymerase của MrNV nên sẽ phụ thuộc vào khả năng sao chép của MrNV rất nhiều, ở mẫu này ta thấy sản phẩm khuếch đại của MrNV là rất yếu chứng tỏ lƣợng RNA không đủ nhiều, điều này chứng tỏ sự hiện diện MrNV trong mẫu bệnh là không cao, trong khi XSV sử dụng RNA Polymerase của MrNV nên lƣợng RNA của XSV sẽ ít hơn lƣợng RNA của MrNV rất nhiều nên không đủ sản phẩm khuếch đại đủ để thấy trên bảng điện di. Hoặc do thao tác tách chiết không đƣợc tốt nên chỉ phát hiện MrNV trong mẫu bệnh. Tuy nhiên kết quả này chỉ giải thích cho một mẫu bệnh trong khi mối quan hệ của MrNV và XSV vẫn chƣa đƣợc biết nên cần phải có nhiều mẫu bệnh mới khẳng định đƣợc hai lý do trên có hợp lý hay không. 38 PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận Cả hai phƣơng pháp tách chiết bằng bộ Kit và Trizol đều cho kết quả tƣơng thích nhau. Phát hiện đƣợc sự hiện diện đồng thời MrNV, XSV nhiễm trên những mẫu tôm mẹ bệnh trắng đuôi thu tại ĐBSCL và một mẫu tôm postlarvae thu tại Trại Thực Nghiệm Thủ Đức. Thử nghiệm thành công kỹ thuật Single - Step RT - PCR của Widada, Sahul Hameed và cộng sự với điều kiện hoá chất tại Trung Tâm Quốc Gia Quan Cảnh Báo Môi Trƣờng và Phòng Ngừa Dịch Bệnh Thủy Sản Khu Vực Nam Bộ thuộc Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II:  Nồng độ Mg2+ là 1,5 mM.  Nồng độ mồi 20 mol cho MrNV và 20 mol cho XSV.  Nhiệt độ lai 550C. Ngoài ra chúng tôi có thử nhiệt độ lai tạo cDNA ở 460C và thử nồng độ Mg2+ là 2 mM. Thì thấy ở nồng độ Mg2+ 2 mM làm cho Taq - polymerase hoạt động mạnh tạo ra sản phẩm không chuyên biệt và sản phẩm chính không thấy rõ, còn ở nhiệt độ lai tạo cDNA 46 0C thì thấy sản phẩm không đặc hiệu, do nhiệt độ lai không đúng làm cho các mồi bắt cặp với RNA không chuyên biệt. Do đó nhiệt độ lai tạo cDNA và nồng độ Mg 2+ là một những nhân tố quan trọng cần đƣợc khảo sát thêm nếu phản ứng chƣa đạt tối ƣu. Trong quá trình thực hiện phản ứng RT - PCR chúng tôi phát hiện tần xuất hiện diện MrNV và XSV trong những mẫu tôm bệnh trắng đuôi là rất cao. Có thể khẳng định có sự hiện của hai virus gây bệnh trắng đuôi trên tôm càng đã xuất hiện tại Việt Nam. 5.2. Tồn tại Chƣa xác định đƣợc có hay không sự lây nhiễm từ tôm mẹ bị bệnh trắng đuôi cho đàn ấu trùng. Chƣa phát hiện đƣợc sự hiện diện của hai virus MrNV và XSV trên giai đoạn ấu trùng của tôm càng xanh. 39 Số lƣợng mẫu bệnh ít nên chƣa thể khẳng định tần xuất hiện diện MrNV và XSV trong những mẫu tôm bệnh trắng đuôi là cao hay không. 5.3. Đề xuất Trong phạm vi của đề tài, chúng tôi thu đƣợc một số kết quả nhất định và mở ra một số vấn đề nghiên cứu sâu hơn. Do đó chúng tôi có một số đề nghị:  Phát triển kỹ thuật multiplex để phát hiện đồng thời hai virus MrNV và XSV.  Ở nhiệt độ 550C là nhiệt độ lai tối ƣu cho cả hai virus, điều này rất thuận lợi phát triển kỹ thuật multiplex. Tuy nhiên khi sử dụng cùng một nhiệt độ tối ƣu cho cả hai virus sẽ có hiện tƣợng cạnh tranh mồi. Vì vậy tôi đề nghị cần khảo sát dãy nhiệt độ lai lớn hơn để tìm nhiệt độ lai tối ƣu riêng của từng virus, ở nhiệt độ lai tối ƣu của MrNV chỉ có mồi của MrNV bắt cặp, ở nhiệt độ lai tối ƣu của XSV chỉ có mồi của XSV bắt cặp. Sau đó đƣa thêm nhiệt độ lai tối ƣu của mồi MrNV là một chu kỳ, và nhiệt độ lai tối ƣu của mồi XSV là một chu kỳ. Mục đích của việc này là phát kỹ thuật multiplex và để tránh hiện tƣợng cạnh tranh giữa hai cặp mồi, nếu thành công thì so sánh giữa hai phƣơng pháp, phƣơng pháp sử dụng nhiệt độ tối ƣu chung cho cả hai virus là 550C và phƣơng pháp sử dụng nhiệt độ lai tối ƣu của từng mồi, để xác định phƣơng pháp nào tối ƣu nhất cho việc phát hiện đồng thời MrNV và XSV.  Cần phải có cảm nhiễm trên tôm càng xanh ở các giai đoạn khác nhau để xem sự hiện của virus xuất hiện nhiều ở giai đoạn nào.  Cảm nhiễm trên tôm mẹ, sau lấy chân bơi tôm mẹ để kiểm tra bằng qui trình Single - Step RT - PCR để xác định có sự hiện diện của virus hay không, nếu tôm mẹ bị nhiễm, ta cho tôm mẹ đẻ ra đàn ấu trùng, sau đó kiểm tra đàn ấu trùng xem có sự hiện diện của virus hay không.  Cần tách riêng hai virus MrNV và XSV, sau đó thực hai lô thí nghiệm, một lô cảm nhiễm MrNV và một lô cảm nhiễm đồng thời cả hai virus MrNV và XSV, các thí nghiệm này đƣợc tiến hành trên tôm thịt. Việc tiến hành thí nghiệm này với mục đích xác định vai trò của XSV nhƣ thế nào trong bệnh trắng đuôi.  Cần có bƣớc giải trình tự của hai virus MrNV và XSV từ sản phẩm PCR để so sánh với mẫu chứng dƣơng từ Ấn Độ, để xác định hai virus ở Việt Nam có sự đột biến hay giống hoàn toàn với sản phẩm PCR từ mẫu đối chứng dƣơng từ Ấn Độ. 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 1. Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 1998. Sinh học phân tử. NXB Giáo Dục. 2. Trần Ngọc Hải và ctv, 2000. Hiện trạng triển vọng và giải pháp phát triển sản xuất giống tôm càng xanh ở Đồng Bằng Sông Cửu Long. Viện Hải Sản, Đại Học Cần Thơ. 3. Trần Thanh Phục, 2001. Cải tiến công nghệ sản xuất, hạ giá thành con giống tôm càng xanh Macrobrachium rosenbergii de man ở Đồng Bằng Sông Cửu Long. BCKH. 50 trang. 4. Nguyễn Thị Thanh Thủy, 2000. Kỹ thuật sản xuất giống tôm càng xanh. NXB Nông nghiệp. 67 trang. 5. Nguyễn Việt Thắng, 1993. Một số đặc điểm sinh học và ứng dụng quy trình sản xuất giống tôm càng xanh Macrobrachium rosenbergii de man (1879) ở đồng bằng Nam Bộ. Luận án PTS khoa học Nông Nghiệp.Trƣờng Đại Học Thủy Sản Nha Trang. 175 trang. 6. Nguyễn Việt Thắng, 1997. Đặc điểm sinh học và kỹ thuật sản xuất giống tôm càng xanh ở Đồng Bằng Nam Bộ. BCKH. 7. Bùi Trang Việt, 2002. Sinh học phân tử. ĐH Quốc gia TPHCM. Khoa Sinh Học - Trƣờng ĐHKHTN.144 trang. 8. Báo Cáo Hội Thảo, 1999. Phát triển nuôi tôm càng xanh ở Đồng Bằng Nam Bộ. An Giang, 5/1999. 9. Bộ Thủy Sản, 2004. Tuyển tập hội Thảo toàn quốc Về Nghiên Cứu Và ứng Dụng Khoa Học Công Nghệ Trong Nuôi Trồng Thủy Sản. NXB Nông Nghiệp 41 TÀI LIỆU NƢỚC NGOÀI 10. Akiyama D.M ., Brock J.A. and Haley S.R ., 1982. Idiopathic Muscle Necrosis in the fresh prawn, Macrobrachium rosenbergii de man. Veterinary Medicine, Small Clinician: 1119 – 1121 11. Anderson I.G., Nash. and M. Shariff.,1990. Mass larval mortalities in giant freshwater prawn, Macrobrachium rosenbergii De Man, cultured in Malaysian modified static “green water” systems. Jounal of Fish Diseases 13: 127 – 134 12. Aquacop ., 1977. Macrobrachium rosenbergii De Man Culture Polynesia: progress in the developing a mass intensive larval rearing technique in clear water. Proceedings of the World Mariculture Society 8: 311 - 326. 13. Arcier J.M., Herman F., Lightner D.V., Redman R ., Mari J ., Bonami, J.R ., 1999. A viral disease associated with mortalities in the hatchery - reared postlarvae of the giant freshwater prawn Macrobrachium rosenbergii. Dis Aquat Org 38: 177 - 181. 14. Ban N ., Larson S. B. and McPherson A. (1995). Structural comparison of the plant satellite viruses. Virology 214: 571 - 583. 15. Bespalova I.N ., Adkins S. and Burmeidter M ., 1998. 3’- Race Skewed Ratio of specific to general PCR primers improves yield and specificity. Biotechniques 24: 375 - 577. 16. Bonami J.R ., Shi Z ., Qian D. and Widada J.S ., 2005. White tail disease of the giant freshwater prawn, Macrobrachium rosenbergii: separation of the associated virions and characterization of MrNV as a new of nodavirus. Journal of Fish Disease 28 (1): 23 – 32 17. Brock J.A ., 1983. Diseases (infectious and non-infectious), metazoan parasites, predators and public health considerations in Macrobrachium culture and fisheries. CRC Handbook of Mariculture. 42 18. Brock J.A ., 1988. Diseases and husbandry problems of cultured Macrobrachium rosenbergii. . Disease Diagnosis and Control in North American Marin Aquaculture (C.J Sidermann ., and D.U Lightner ). p .134 - 180. 19. Dieffenbach C.W. and Dveksler G.S ., 1995. PCR primer: A laboratory manual. Molecular cloning. (J Sambrookp. and D W. Russell). Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Habor, New York. p. 133 - 142 20. Forhman ., 1995. Rapid amplification of cDNA ends. In PCR primer: A Laboratory manual. Molecular cloning (J Sambrookp. and D W. Russell). Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.p.381- 409. 21. Johnson S.K ., 1982. Diseases of Macrobrachium. In:Giant Prawn Farming. Developments in Aquaculture and Fisheries Science (M.B New ),Vol.10. p.269 - 277. 22. Lee C.C. and Caskey C.T., 1990. cDNA cloning using degenerate primers. In PCR protocols: A guide to methods and applications ( M.A Innis . et al) . p. 46 - 53. Academic Press, SanDiego, California. 23. Lightner D.V ., 1993. Diseases of culture penaeid shrimp. Handbook of Marine culture, (J.P Mevei ), vol 1 , Crustacean Aquaculture. 24. Mori K.I ., Nakai T ., Muroga ., Arimoto M ., Musiake.K. and Furusawa. I ., 1992. Properties of a new virus belonging to Nodaviridae found in larval striped jack (Pseudocarnx dentex) with nervous necrosis. Virology 187: 368 - 371. 25. Nash G ., S.Chinabut. and Limsuwan C., 1987. Idiopathic Muscle Necrosis in the fresh prawn, Macrobrachium rosenbergii de man, Cultured in Thailand.Jounal of Fish Diseases 10: 109 - 120. 26. Qian D ., Shi Z ., Zhang S ., Cao Z ., Liu W ., Li L ., Xie Y ., Cambournac I. and Bonami J. R ., 2003. Extra small virus-like particles (XSV) and nodavirus associated with whitish muscle disease in the giant fresh water prawn Macrobrachium rosenbergii. Journal of Fish Disease 26:521 - 527. 27. Roegge M.A ., Rutle W.P. and Guest W.C ., 1979. Chemical control of Zoothamnium on larval Macrobrachium acanthurus. In: Proceedings of the Second 43 28. Biennial Crustacean Health Workshop (ed. D.H Lewis .and J.K Leong). p 295-299. TAMU - SG - 117, College Station, Texas. 29. Romestand B ., and Bonami J.R ., 2003. A sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (S - ELISA) for detection of MrNV in the giant freshwater prawn, Macrobrachium rosenbergii (de Man). Journal of fish Diseases 26: 71 - 75. 30. Sahul Hameed A.S ., 2003. Studies on white tail disease of Macrobrachium rosenbergii. In Freshwater Prawns 2003, International Symposium, Cochin, 20 - 23 August 2003. 31. Sahul Hameed A.S .,Yoganandhan K ., Widada J.S ., Bonami J.R ., 2004. Experimental transmission and tissue tropsim of Macrobrachium rosenbergii nodavirus (MrNV) and extra small virus like-particles in Macrobrachium rosenbergii. Dis Aquat Org 62: 191 - 196. 32. Salin K.R . and Nair C.M ., 2003. Emerging diseases of giant freshwater prawn in India - a potential threat to sustainability. In the In Freshwater Prawns 2003, International Symposium, Cochin , 20 - 23 August 2003. 33. Sahul Hameed A.S ., Yoganandhan K ., Widada J.S. and Bonami J.S ., 2004a. Studies on the occurrence of Macrobrachium rosenbergii nodavirus (MrNV) and extra small virus - like (XSV) associated with white tail disease (WTD) of Macrobrachium rosenbergii in India by RT - PCR detection. Aquaculture 238: 127 - 133. 34. Schaefer B.C ., 1995. Revolution in Rapid amplification of cDNA ends: New strategies for polymerase chain reaction cloning of full-length ends. Anal, Biochem 227: 255 - 273. 35. Tonguthai Kamonporn., 1997. Diseases of Fresh Prawn, Macrobrachium rosenbergii. The AAHRI Newsletter Article, Vol.4, No.2, December 1997 Bangkok 10900, Thailand. 36. Tung C. W ., Wang C. S. and Chen S. N ., 1999. Histological and electron microscopy study on Macrobrachium. 37. Muscle virus (MMV) infection in the giant freshwater prawn, Macrobrachium rosenbergii (de Man), cultured in Taiwan. Journal of Fish Disease 22 : 1 - 5. 44 42. Tung C.W., Wang CS. and Chen S.N ., 1999. Histologiacal and electron microscopic study on Macrobrachium muscle virus (MMV) infection in the giant freshwater prawn, Macrobrachium rosenbergii (de man), cultures in Taiwan. Jounal of Fish Diseases 22: 319 - 324. 43. Van Regenmortel M.H.V ., Fauquer C.M ., Bishop D.H.L ., Cartens E.B ., Estes M.K ., Lemon S.M ., Maniloff. J ., Mayo M.A ., McGeoch D.J ., Pringle C.R. and Wickner R.B ., 2000. Virus taxaonomy:Classifisstion and Nomenclature of Viruses. Seventh Report of International Committee on Taxonomy of Viruses. Academic Press, San Diego, CA. 44. Vijayan K.K ., Raj V.S ., Alavandi S.V ., Sekhar V.T ., Vaseeharan.B. and Santiago T.C ., 2003. Need of novel diagnotics in the health management of Macrobrachium rosenbergii, with special reference to an emerging epizootic in India, the white muscle syndrome (WMS). In Freshwater Prawns 2003. 45. Walker P.J ., 2003. Molecular characteristic of Yellow head Virus (YHV) and White Spot Syndrome Virus. CSIRO Tropical Agriculture, Private Bag 3, Indooroopilly, Qld 4068, Australia 46. Widada J.S ., Durand S ., Cambournac ., Qian D ., Shi Z ., Dejonghe E ., Richard V ., Bonami J.R ., 2003. Genome - based detection methods of Macrobrachium rosenbergii nodavirus, a pathogen of the giant freshwater prawn, Macrobrachium rosenbergii: dot - blot, in situ hybridization and RT - PCR. Jounal of Fish Diseases 26 : 583 - 590. 47. Widada J.S ., Richard V ., Shi Z ., Qian D. and Bonami J.R ., 2004. Dot - lot hybridization and RT - PCR detection of extra small virus (XSV) associated with white tail disease of prawn Macrobrachium rosenbergii. Disease of Aquatic Organism 58: 83 - 87. 48. Yoganandhan K ., Widada J.S ., Bonami J.R. and Sahul Hameed A.S ., 2005. Simultaneous detection of Macrobrachium rosenbergii nodavirus and extra small virus by a single tube, one - step multiplex RT - PCR assay. Journal of Fish Disease 28: 65 - 69.