Khóa luận Ứng dụng phương pháp in situ hybridization để chẩn đoán mầm bệnh WSSV (white spot syndrome virus) trên tôm sú (penaeus monodon) và TSV (taura syndrome virus) trên tôm thẻ chân trắng (penaeus vannamei)

13 phút 15 phút 17 phút 19 phút Mẫu 1 Mẫu âm tính, cấu trúc mô rất rõ. Mẫu âm tính, cấu trúc mô rất rõ. Có tín hiệu lai nhƣng ít, cấu trúc mô rõ. Có tín hiệu lai tốt, cấu trúc mô rất rõ Có tín hiệu lai rất ít, cấu trúc mô không còn rõ nhƣ lúc đầu. 2 Mẫu âm, cấu trúc mô rất rõ. Mẫu có tín hiệu lai nhƣng rất mờ. Mẫu dƣơng nhƣng rất ít, cấu trúc mô rõ. Mẫu dƣơng, cấu trúc mô rõ. Mẫu có tín hiệu lai nhƣng rất ít không thể kết luận đƣợc. 3 Mẫu có tín hiệu lai nhƣng rất ít. Mẫu không có tín hiệu lai, mô rõ. Mẫu có tín hiệu lai ít, cấu trúc mô rõ. Có tín hiệu lai rất tốt, cấu trúc mô rất rõ. Có tín hiệu lai nhƣng rất ít, cấu trúc mô không rõ. 4 Mẫu âm, cấu Mẫu có tín Mẫu có tín Mẫu dƣơng rất Mẫu dƣơng nhƣng 50 trúc mô rất rõ. hiệu lai nhƣng rất ít. hiệu lai nhƣng rất ít, không kết luận đƣợc. rõ và cấu trúc mô đẹp. rất ít không thể kết luận. 5 Không phát hiện tín hiệu lai. Không phát hiện tín hiệu lai. Mẫu có tín hiệu lai nhƣng không rõ. Mẫu có tín hiệu lai tốt, cấu trúc mô rõ, đẹp. Mẫu có tín hiệu lai rải rác, cấu trúc mô rất mờ. Đối chứng dƣơng Mẫu dƣơng, tín hiệu lai rất ít, cấu trúc mô rõ. Mẫu dƣơng, tín hiệu lai không rõ. Mẫu dƣơng nhƣng ít, cấu trúc mô rõ. Mẫu dƣơng rất tốt, cấu trúc mô rõ. Mẫu dƣơng nhƣng ít, cấu trúc mô không rõ. Đối chứng âm Mẫu âm Mẫu âm, không bị ngoại nhiễm. Mẫu âm, cấu trúc mô rõ. Mẫu âm, cấu trúc mô rõ, không bị ngoại nhiễm. Mẫu âm, cấu trúc mô rất mờ. Dựa vào bảng kết quả trên, chúng tôi nhận thấy rằng thời gian cắt tối ƣu cho tôm thƣơng phẩm là 17 phút. Sở dĩ thời gian cắt với Proteinase K khác nhau ở hai loại tôm là do cấu trúc mô ở tôm thƣơng phẩm đã hoàn chỉnh và cứng hơn cấu trúc mô của tôm postlarvae. Do đó, ở tôm thƣơng phẩm chúng ta cần kéo dài thời gian cắt với Proteinase K, đủ để enzyme này mềm hóa các cấu trúc mô, giúp probe xâm nhập vào tế bào dễ dàng hơn khi lai. Qua thí nghiệm này, chúng tôi nhận thấy rằng đối với mỗi đối tƣợng khác nhau thì đòi hỏi thời gian cắt khác nhau. Tùy theo đối tƣợng thí nghiệm mà ta có thể ƣớc lƣợng thời gian cắt thích hợp để thu đƣợc kết quả lai tốt nhất, phát huy hết tính ƣu việt của phƣơng pháp ISH. IV.1.2.3 Kết quả thí nghiệm tìm thể tích dung dịch lai thích hợp Thể tích dung dịch lai cũng là một trong những yếu tố khá quan trọng quyết định kết quả của quá trình lai. Sau khi thực hiện thí nghiệm nhƣ cách bố trí trên, chúng tôi thu đƣợc kết quả qua hai lần thực hiện nhƣ sau: 51 Kết quả trên postlarvae Bảng 4.6: Kết quả thí nghiệm tìm dung dịch lai thích hợp trên tôm postlarvae Nghiệm thức 100 l 75 l 50 l Mẫu 1 Mẫu có tín hiệu lai rõ nhƣng xuất hiện hiện tƣợng dƣơng tính giả và màu nền rất nhiều. Mẫu có tín hiệu lai rõ, cũng xuất hiện dƣơng tính giả nhƣng ít hơn trƣờng hợp dùng 100 l, mẫu đẹp và rõ. Tín hiệu lai rất ít hoặc không có tín hiệu lai trên mẫu, đa số chỉ bắt màu thuốc nhuộm bổ sung. 2 3 4 5 Đối chứng dƣơng Mẫu rõ, tín hiệu lai nhiều và dƣơng tính giả rất nhiều. Mẫu rất rõ, tín hiệu lai nhiều và dƣơng tính giả ít hơn. Mẫu rõ nhƣng tín hiệu lai rất ít, đa số nhuộm màu bổ sung. Đối chứng âm Mẫu chỉ nhuộm màu bổ sung, cấu trúc mô rõ. Mẫu chỉ nhuộm màu bổ sung, cấu trúc mô rõ. Mẫu chỉ nhuộm màu bổ sung, cấu trúc mô rõ. Kết quả trên tôm thƣơng phẩm Bảng 4.7: Kết quả thí nghiệm tìm dung dịch lai thích hợp trên tôm thƣơng phẩm Nghiệm thức 100 l 75 l 50 l Mẫu 1 Mẫu có tín hiệu lai rõ nhƣng có hiện tƣợng dƣơng tính giả và tín hiệu nền Mẫu có tín hiệu lai rõ nhƣng vẫn xuất hiện dƣơng tính giả, màu nền có giảm, mẫu rõ Mẫu có tín hiệu lai rải rác ở một hai mẫu đầu, ba mẫu còn lại hầu nhƣ không có tín hiệu lai, đa 2 3 4 52 Hình 4.4: Hiện tƣợng dƣơng tính giả trên phụ bộ tôm lớn, X10. 5 rất nhiều. và đẹp. số chỉ nhuộm màu bổ sung. Đối chứng dƣơng Mẫu rõ, tín hiệu lai nhiều, màu nền và dƣơng tính giả rất nhiều. Mẫu rất rõ, tín hiệu lai nhiều và dƣơng tính giả ít hơn. Mẫu rõ nhƣng tín hiệu lai rất ít, đa số nhuộm màu bổ sung. Đối chứng âm Mẫu chỉ nhuộm màu bổ sung, cấu trúc mô rõ. Mẫu chỉ nhuộm màu bổ sung, cấu trúc mô rõ. Mẫu chỉ nhuộm màu bổ sung, cấu trúc mô rõ. Sau khi thực hiện lai, chúng tôi đều thu đƣợc các tín hiệu lai ở cả ba nghiệm thức nhƣng ở nghiệm thức thứ ba thì tín hiệu lai thấp hơn và không thấy xuất hiện hiện tƣợng dƣơng tính giả. Ở trƣờng hợp này có thể dung dịch lai không đủ để bắt cặp hoàn toàn với lƣợng RNA có trong mẫu. Trong hai nghiệm thức đầu đều có hiện tƣợng dƣơng tính giả, và ở thể tích dung dịch lai 100 l lại xuất hiện thêm màu nền rất nhiều làm cho mẫu bị sậm màu, quan sát các cơ quan không rõ ràng. Hiện tƣợng dƣơng tính giả là do sự bắt cặp không đặc hiệu giữa probe với các cơ quan khác không phải là RNA đích, probe có thể bắt cặp với lớp cutin ngoài thành tế bào tạo thành một lớp kết tủa màu xanh dày đặc. Trong thí nghiệm này, chúng tôi nhận thấy rằng hiện tƣợng dƣơng tính giả tỷ lệ thuận với thể tích dung dịch lai sử dụng khi lai. Ở nghiệm thức sử dụng 100 l dung dịch lai có hiện tƣợng dƣơng tính giả nhiều nhất, giảm dần và không phát hiện dƣơng tính giả ở nghiệm thức cuối cùng. Vì vậy, chúng ta không nên sử dụng dung dịch lai quá nhiều hoặc quá ít khi lai, thể tích dung dịch lai là 75 l/mẫu nhƣ bộ kit khuyến cáo là thích hợp nhất. 53 IV.2 Kết quả trên tôm sú P. monodon IV.2.1 Kết quả thí nghiệm theo quy trình bộ kit để ổn định phƣơng pháp Quy trình lai tại chỗ ISH đã đƣợc thử nghiệm để kiểm tra virus WSSV trên tôm sú tại Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II. Ở đây, chúng tôi tiến hành thử nghiệm lại quy trình để xem xét tính ổn định và độ chính xác của phƣơng pháp trong chẩn đoán mầm bệnh do WSSV trên P. monodon, kết quả hai lần thí nghiệm nhƣ sau: Bảng 4.8: Kết quả thí nghiệm thực hiện theo quy trình và hóa chất của bộ kit Mẫu WSSV Mô học PCR ISH Lần 1 Lần 2 1 + + Mẫu dƣơng (+) và rất rõ khi quan sát dƣới KHV. Mẫu dƣơng (+) và rất rõ khi quan sát dƣới KHV. 2 ++ ++ Mẫu dƣơng (++), lát cắt mẫu trên lame không bị trôi và rất rõ khi quan sát dƣới KHV. Mẫu dƣơng (++), cấu trúc mô rõ khi quan sát dƣới KHV. 3 +++ +++ Mẫu dƣơng (+++), lát cắt không bị trôi và nhuộm màu rõ. Mẫu dƣơng (+++) nhƣng hơi mờ, cấu trúc không rõ khi quan sát dƣới KHV. Đối chứng dƣơng +++ +++ Mẫu dƣơng (+++), cấu trúc mô rất rõ và nhuộm màu tốt. Mẫu dƣơng (+++), cấu trúc mô rất rõ và lát cắt không bị trôi. Đối chứng âm - - Không phát hiện tín hiệu lai, mẫu không bị nhiễm bẩn và chỉ bắt màu thuốc Không phát hiện tín hiệu lai, mẫu không bị nhiễm bẩn và chỉ bắt màu thuốc 54 Hình 4.5: Đối chứng âm trên gan tụy tôm lớn, X40 Hình 4.6: Đối chứng dƣơng trên mang tôm lớn, X10 Hình 4.7: ISH phát hiện WSSV trên mẫu gan tụy tôm lớn, X10 Hình 4.8: ISH phát hiện WSSV trên mẫu mang tôm lớn, X40 nhuộm bổ sung. nhuộm bổ sung. Kết quả đƣợc đọc dƣới KHV quang học và cách đọc nhƣ sau: Mẫu dƣơng tính: có các thể vùi trong nhân tạo kết tủa màu xanh đến đen, những tế bào không bị nhiễm virus thì cấu trúc mô bình thƣờng, nhân không bị trƣơng to và bắt màu thuốc nhuộm bổ sung (màu cam). Mẫu âm tính không có màu xanh hoặc đen, chỉ bắt màu Bismark Brown Y (màu thuốc nhuộm bổ sung) và có màu cam sau quá trình lai. 55 Nhƣ vậy sau hai lần thực hiện thí nghiệm, chúng tôi nhận thấy rằng các mẫu 1, 2, 3 có kết quả mô học và PCR dƣơng tính đều cho kết quả ISH dƣơng tính khi đối chứng với mẫu đối chứng dƣơng và đối chứng âm, xác suất trùng hợp giữa ba phƣơng pháp 100% (3/3). Mẫu số 3 sau khi lai cho kết quả tƣơng đối mờ có thể do trong quá trình thao tác chúng tôi rửa mẫu chƣa đƣợc sạch lắm, lát cắt mẫu trên lame sau khi lai bị dơ. Điều này cũng có thể do quá trình bắt cặp không đặc hiệu giữa probe và trình tự không phải DNA đích trong mẫu mô, tạo ra các tín hiệu nền hoặc do thời gian cắt mẫu với Proteinase K quá lâu, cũng có thể do thao tác nhuộm màu bổ sung chƣa tốt. Trong quá trình thực hiện, ta thấy mẫu đối chứng âm sau hai lần thí nghiệm đều không xuất hiện những thể kết tủa màu xanh đậm trong nhân, không bị ngoại nhiễm và cũng không có hiện tƣợng dƣơng tính giả; trên đối chứng dƣơng thì cấu trúc mô rõ ràng, tín hiệu lai thu đƣợc rất nhiều và rõ khi quan sát dƣới KHV quang học chứng tỏ rằng quá trình lai đƣợc tiến hành rất tốt và không bị ngoại nhiễm. Trên cơ sở thử nghiệm lại quy trình In situ hybridization, chúng tôi nhận thấy rằng khả năng chẩn đoán bệnh đốm trắng trên tôm sú của phƣơng pháp này rất hiệu quả, với độ chính xác cao và kết quả thu đƣợc ổn định. Do đó, chúng tôi tiến hành ứng dụng phƣơng pháp này để chẩn đoán và phát hiện mầm bệnh đốm trắng trên tôm sú nuôi ở các giai đoạn postlarvae và thƣơng phẩm góp phần vào việc kiểm soát và hạn chế kịp thời những tác hại do WSSV mang lại. Chẩn đoán theo phƣơng pháp này sẽ khắc phục đƣợc tính kém đặc hiệu của mô học và tránh đƣợc hiện tƣợng dƣơng tính giả của PCR. IV.2.2 Kết quả ứng dụng bộ kit để tìm quy trình ISH tối ƣu cho WSSV áp dụng trong phòng thí nghiệm IV.2.2.1 Kết quả thí nghiệm theo đúng quy trình của bộ kit nhưng có thay đổi một số hóa chất thông dụng không có trong bộ kit Theo cách bố trí này chúng tôi cũng thực hiện lại thí nghiệm trên ba mẫu tôm 1, 2 và 3 trên, đối chứng dƣơng và đối chứng âm. Ở đây, chúng tôi dùng cồn tuyệt đối (Việt Nam), xylene và paraformaldehyde (Trung Quốc) trong quy trình lai. Sau khi thực hiện thí nghiệm, chúng tôi thu đƣợc kết quả sau: 56 Bảng 4.9: Kết quả thí nghiệm thực hiện theo quy trình và có thay đổi hoá chất Mẫu WSSV Mô học PCR ISH Lần 1 Lần 2 1 + + Mẫu dƣơng (+) và rất rõ khi quan sát dƣới KHV. Mẫu dƣơng (+) và rõ khi quan sát dƣới KHV. 2 ++ ++ Mẫu dƣơng (++), lát cắt mẫu trên lame không bị trôi và rất rõ khi quan sát dƣới KHV. Mẫu dƣơng (++), cấu trúc mô rõ khi quan sát dƣới KHV. 3 +++ +++ Mẫu dƣơng (+++), lát cắt không bị trôi và nhuộm màu rõ. Mẫu dƣơng (+++), cấu trúc mô rất rõ khi quan sát dƣới KHV. Đối chứng dƣơng +++ +++ Mẫu dƣơng (+++), cấu trúc mô rất rõ và nhuộm màu tốt. Mẫu dƣơng (+++), cấu trúc mô rất rõ và lát cắt không bị trôi. Đối chứng âm - - Không phát hiện tín hiệu lai, mẫu không bị nhiễm bẩn và chỉ bắt màu thuốc Không phát hiện tín hiệu lai, mẫu không bị nhiễm bẩn và chỉ bắt màu thuốc 57 nhuộm bổ sung. nhuộm bổ sung. Sau khi thực hiện thí nghiệm này, chúng tôi nhận thấy rằng tiến hành lai theo trƣờng hợp này cho kết quả lai tốt trên cả ba mẫu và hai đối chứng khi quan sát dƣới KHV quang học. Kết quả thí nghiệm dựa vào phƣơng pháp ISH cho kết quả trùng hợp hoàn toàn với mô học và PCR, xác suất trùng hợp đạt đến 100% (3/3). Nhìn chung kết quả mà chúng tôi thu đƣợc không có sự khác biệt nhiều giữa thí nghiệm theo quy trình và hóa chất của bộ kit với thí nghiệm theo quy trình bộ kit nhƣng có thay đổi một số hóa chất thông dụng rẻ tiền hơn. Đây là một bƣớc thành công mới, tạo tiền đề cho việc phát triển phƣơng pháp ISH phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm tại Viện. Do đó, chúng tôi sử dụng các hoá chất thay thế này trong các thí nghiệm tiếp theo sau để giảm bớt chi phí trong chẩn đoán và phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm tại Viện. IV.2.2.2 Trường hợp xử lý mẫu nhanh Mẫu sau khi thu về phòng thí nghiệm đƣợc tiến hành xử lý nhanh dùng chung cho kiểm tra mô học và ISH. Mẫu đƣợc xử lý, đúc và cắt và đính trên 4 lame, hai lame dùng để nhuộm kiểm tra mô học và hai lame còn lại dùng cho ISH. Sau khi thực hiện chẩn đoán bằng mô học truyền thống và PCR cho kết quả dƣơng tính, mẫu đó sẽ đƣợc dùng để lai theo quy trình của bộ kit. Chúng tôi tiến hành trên 5 mẫu tôm postlarvae và 5 mẫu tôm thƣơng phẩm và thu đƣợc kết quả nhƣ sau: Kết quả trên tôm postlarvae Bảng 4.10: Kết quả thí nghiệm xử lý mẫu nhanh trên tôm postlarvae Mẫu Mô học PCR ISH Nhận xét Lần 1 Lần 2 1 + + + + Cấu trúc mô của mẫu hơi mờ 2 + + + + Mẫu rõ, lát cắt mẫu không bị trôi 3 + + + + Mẫu rõ, nhuộm màu tốt 4 + + + + Mẫu lai bị mờ 5 + + + + Tốt nhƣng cấu tạo mô không rõ 58 Đối chứng dƣơng +++ +++ +++ +++ Mẫu rõ, cấu trúc mô rất rõ khi quan sát dƣới KHV. Đối chứng âm - - - - Mẫu rõ, không bị nhiễm tạp và mẫu chỉ nhuộm màu của thuốc nhuộm bổ sung. Kết quả trên tôm thƣơng phẩm Bảng 4.11: Kết quả thí nghiệm xử lý mẫu nhanh trên tôm thƣơng phẩm Mẫu Mô học PCR ISH Nhận xét Lần 1 Lần 2 1 + ++ ++ ++ Cấu trúc mô của mẫu rất rõ, nhuộm màu tốt. 2 + ++ ++ ++ Mẫu rõ, lát cắt mẫu không bị trôi. 3 + + + + Mẫu rõ, nhuộm màu tốt. 4 + + + + Tốt nhƣng cấu tạo mô không rõ. 5 + + + + Cấu trúc mô mờ, lát cắt không bị trôi. Đối chứng dƣơng +++ +++ +++ +++ Mẫu rõ, cấu trúc mô rất rõ khi quan sát dƣới KHV. Đối - - - - Mẫu rõ, không bị nhiễm tạp và mẫu 59 Hình 4.9: Mẫu mô học và ISH làm theo quy trình xử lý nhanh chứng âm chỉ nhuộm màu của thuốc nhuộm bổ sung. Qua hai bảng kết quả trên chúng tôi nhận thấy rằng kết quả chẩn đoán thu đƣợc từ ba phƣơng pháp trên trùng hợp hoàn toàn với nhau. Ở hai mẫu tôm postlarvae (mẫu 1 và 4) và một mẫu tôm thƣơng phẩm (mẫu 5) khi xử lý nhanh cho kết quả lai chƣa tốt có thể do một số khâu trong quy trình xử lý mẫu chƣa đƣợc thực hiện tốt. Mẫu số 5 trên postlarvae và mẫu số 4 trên tôm thƣơng phẩm cho kết quả lai tốt, nhƣng cấu tạo mô không rõ có thể do ta thực hiện xử lý mẫu chƣa tốt làm hƣ cấu tạo của mô. Điều này cũng có thể do trong quá trình lai, chúng ta cắt mẫu bằng Proteinase K quá lâu hoặc thao tác cắt mẫu chƣa đƣợc thực hiện tốt nên cấu trúc mẫu mô không còn rõ nhƣ ban đầu. Nhƣ vậy qua hai lần thực hiện thí nghiệm nhƣ trên, chúng tôi thu đƣợc kết quả lai đều dƣơng tính. Khi đối chiếu với kết quả lai trong trƣờng hợp mẫu xử lý theo quy trình bình thƣờng, chúng tôi nhận thấy rằng kết quả lai trong cả hai quy trình xử lý mẫu không khác nhau. Các mẫu làm theo quy trình xử lý nhanh, khi quan sát dƣới kính hiển vi đều cho kết quả tƣơng đối rõ và đẹp. Nếu làm theo quy trình xử lý mẫu nhanh thì cả quá trình xử lý mẫu chỉ mất khoảng 3 – 4 giờ thay vì trƣớc đây chúng tôi làm theo quy trình xử lý mẫu bình thƣờng mất khoảng 12,5 giờ, thời gian đƣợc rút ngắn rất nhiều nhƣng kết quả lai không khác nhau. Do đó, chúng ta có thể áp dụng quy trình xử lý nhanh này trong chẩn đoán bằng phƣơng pháp ISH, giúp rút ngắn đƣợc thời gian rất nhiều. 60 Quy trình xử lý mẫu nhanh có ƣu điểm là rút ngắn đƣợc thời gian xử lý mẫu rất nhiều, tuy nhiên nó có một số nhƣợc điểm so với phƣơng pháp xử lý mẫu bình thƣờng. Mẫu đƣợc xử lý theo phƣơng pháp này dễ bị hƣ cấu trúc của mô, nguyên nhân của sự cố này là do nƣớc trong mẫu mô chƣa đƣợc khử hoàn toàn làm cho mô và tế bào bị co lại hoặc làm thành phần cấu tạo trong mô bị thay đổi. Một lý do khác làm hƣ cấu trúc của mô là do cồn trong mô không đƣợc tẩy hoàn toàn, mẫu mô không trong suốt nên rất khó quan sát cấu tạo của mô dƣới kính hiển vi. Cả giai đoạn khử nƣớc và tẩy cồn ra khỏi mô nếu không đƣợc thực hiện tốt thì giai đoạn ngấm paraffin cũng bị thất bại. Do đó, khi áp dụng quy trình xử lý mẫu nhanh, ta phải thật cẩn thận khi thao tác, làm tốt các giai đoạn quyết định nhƣ giai đoạn chuyển từ cồn tuyệt đối qua xylene và từ xylene qua paraffin. Nếu tuân thủ đúng các bƣớc này, mẫu mô thu đƣợc sau xử lý sẽ giống với mẫu mô xử lý theo quy trình xử lý bình thƣờng. IV.2.2.3 Trường hợp biến tính mẫu và probe trước khi lai Nếu lai theo quy trình của bộ kit thì probe phải đƣợc biến tính ở 950C trong 10 phút, làm lạnh nhanh và giữ ở 40C cho đến khi cho lên mô lai. Khi lai, ta cho mẫu dò lên mẫu mô và thực hiện biến tính một lần nữa ở 950C trong 6 phút. Trong thí nghiệm này, chúng tôi thực hiện biến tính mẫu lai và probe đồng thời trên lame ở 950C trong 6 phút. Quy trình này đƣợc thực hiện trên bàn lai có điều chỉnh nhiệt độ. Mẫu thực hiện thí nghiệm này đƣợc xử lý theo quy trình xử lý bình thƣờng và đã đƣợc phƣơng pháp mô học và PCR xác nhận là dƣơng tính với WSSV. Thí nghiệm thực hiện nhƣ bố trí trên và thu đƣợc kết quả sau hai lần thực hiện nhƣ sau: Kết quả trên tôm postlarvae Bảng 4.12: Kết quả thí nghiệm biến tính mẫu và probe trƣớc khi lai trên postlarvae Mẫu Mô học PCR ISH Nhận xét Lần 1 Lần 2 1 + + + + Mẫu rõ, lát cắt trên lame 61 không bị trôi 2 + + + + Mẫu bị dơ 3 + + - - Không phát hiện 4 + + + + Mẫu rõ, lát cắt trên lame không bị trôi 5 + + + + Mẫu rõ Đối chứng dƣơng +++ +++ +++ +++ Mẫu rất rõ, cấu trúc mô giữ đƣợc hình dạng đầu. Đối chứng âm - - - - Mẫu không bị nhiễm tạp. Kết quả trên tôm thƣơng phẩm Bảng 4.13: Kết quả thí nghiệm biến tính mẫu và probe trƣớc khi lai trên tôm thƣơng phẩm Mẫu Mô học PCR ISH Nhận xét Lần 1 Lần 2 1 + + + + Mẫu rõ, lát cắt trên lame không bị trôi. 2 + + + + Mẫu hơi mờ. 3 + + + + Mẫu rõ nhƣng màu bổ sung nhuộm không rõ. 4 + + + + Mẫu rõ, lát cắt trên lame không bị trôi. 5 + + + + Mẫu rõ, lát cắt trên lame 62 không bị trôi. Đối chứng dƣơng +++ +++ +++ +++ Mẫu lai tốt, cấu trúc mô giữ đƣợc hình dạng đầu. Đối chứng âm - - - - Mẫu không bị nhiễm tạp, cấu trúc mô rõ và chỉ nhuộm màu bổ sung. Sau hai lần lặp lại thí nghiệm nhƣ trên, ta thấy kết quả thực hiện chẩn đoán bằng ISH theo cách biến tính mẫu và probe trên cùng một lame trƣớc khi lai nhƣ trên đa số cho kết quả trùng hợp với phƣơng pháp mô học và PCR. Chỉ có một trƣờng hợp mẫu số 3 trên tôm postlarvae cho kết quả lai ISH là âm trong khi đó kết quả mô học và PCR là dƣơng tính. Điều này có thể do mẫu dò của chúng ta đã bị bất hoạt nên không bắt cặp đƣợc với trình tự đích có trong mẫu, nhƣng khả năng này rất ít xảy ra vì trên đối chứng dƣơng chúng tôi vẫn nhận đƣợc tín hiệu lai rất tốt. Sự không phù hợp này cũng có thể do trong quá trình làm PCR bị ngoại nhiễm hoặc khi làm mô học có thể bị nhầm lẫn với một tác nhân gây bệnh khác nhƣng cũng có biểu hiện tƣơng tự nhƣ bệnh đốm trắng. Dựa vào kết quả trên, ta thấy tỷ lệ tƣơng thích của phƣơng pháp ISH thực hiện theo quy trình biến tính mẫu và probe đồng thời trên lame với mô học và PCR là 90% (9/10), tỷ lệ này khá cao và chính xác. Khi so sánh với trƣờng hợp lai bình thƣờng theo quy trình của bộ kit, thì hình dạng cấu trúc mô không khác nhau giữa hai trƣờng hợp khi chúng tôi quan sát dƣới kính hiển vi quang học. Do đó, chúng ta có thể áp dụng quy trình biến tính mẫu và probe đồng thời trên mẫu mô khi thực hiện lai. Cách làm này vừa đơn giản, dễ thực hiện lại vừa tránh đƣợc khả năng gây sốc probe khi lai, probe chỉ đƣợc biến tính một lần thay vì hai lần nhƣ trong quy trình của bộ kit. IV.2.2.4 Trường hợp kết hợp quy trình xử lý mẫu nhanh với biến tính mẫu và probe trước khi lai Sau khi thực hiện lai theo từng trƣờng hợp riêng rẽ, chúng tôi đều thu đƣợc kết quả rất tốt, nhƣng khi chúng tôi áp dụng đồng thời hai quy trình trên vào trong chẩn đoán thì sẽ cho kết quả ra sao? Do đó chúng tôi kết hợp cả hai quy trình trên để chẩn đoán bệnh đốm trắng, thực hiện trên 5 mẫu tôm thƣơng phẩm và 5 mẫu tôm postlarvae 63 có kết quả mô học và PCR dƣơng tính với WSSV. Kết quả sau hai lần thí nghiệm nhƣ sau: Kết quả trên tôm postlarvae Bảng 4.14: Kết quả thí nghiệm kết hợp xử lý nhanh với biến tính mẫu và probe trƣớc khi lai trên tôm postlarvae Mẫu Mô học PCR ISH Nhận xét Lần 1 Lần 2 1 + + + + Tín hiệu lai rõ, không có màu nền. 2 + + + + Cấu trúc mô rất rõ, màu bổ sung nhuộm rất tốt. 3 + + + + Mẫu rõ, lát cắt trên lame không bị trôi. 4 + + + + Mẫu bị dơ 5 + + + + Mẫu rõ Đối chứng dƣơng +++ +++ +++ +++ Kết quả lai rất tốt, cấu trúc mô rõ và đẹp, không có màu nền. Đối chứng âm - - - - Mẫu không bị nhiễm tạp, chỉ nhuộm màu bổ sung. Kết quả trên tôm thƣơng phẩm Bảng 4.15: Kết quả thí nghiệm kết hợp xử lý nhanh với biến tính mẫu và probe trƣớc khi lai trên tôm thƣơng phẩm Mẫu Mô học PCR ISH Nhận xét Lần 1 Lần 2 1 + + + + Mẫu rõ, lát cắt trên lame 64 Hình 4.10: Mẫu lai trên mang khi kết hợp xử lý nhanh với biến tính mẫu và probe đồng thời trên lame, quan sát ở X40. không bị trôi. 2 + + + + Mẫu hơi mờ 3 + + + + Mẫu rõ nhƣng màu bổ sung nhuộm không rõ 4 + + + + Mẫu lai tốt, tín hiệu lai rõ. 5 + + + + Mẫu rõ, không có màu nền. Đối chứng dƣơng +++ +++ +++ +++ Kết quả lai rất tốt, cấu trúc mô rõ và đẹp, không có màu nền. Đối chứng âm - - - - Mẫu không bị nhiễm tạp, chỉ nhuộm màu bổ sung. Qua kết quả trên chúng tôi nhận thấy rằng khi kết hợp quy trình xử lý mẫu nhanh và biến tính mẫu và probe trên cùng một lame khi thực hiện lai đều cho kết quả trùng hợp với kết quả của phƣơng pháp PCR và mô học. Mức độ trùng hợp giữa ba phƣơng pháp đạt 100% sau hai lần lặp lại thí nghiệm. Mẫu mô thu đƣợc sau khi lai đa số rõ nhƣng có một số trƣờng hợp mẫu mô không rõ do thao tác thực hiện chƣa tốt, hoặc do hóa chất rửa mẫu lai mất hoạt tính hay có thể do nhuộm màu bổ sung chƣa đạt yêu cầu…nhƣng những điều này không ảnh hƣởng nhiều đến kết quả lai và chúng tôi có thể khắc phục đƣợc. 65 Sau thí nghiệm này, chúng tôi có thể áp dụng cả quy trình xử lý mẫu nhanh với biến tính mẫu và probe đồng thời trên lame vào quy trình chẩn đoán chính thức khi thực hiện chẩn đoán mầm bệnh đốm trắng trên tôm sú. Nhờ hai quy trình biến đổi này mà chúng tôi có thể rút ngắn đƣợc thời gian chẩn đoán mầm bệnh rất nhiều, thao tác đơn giản hơn và giảm đƣợc khả năng gây sốc probe nhƣ quy trình của bộ kit đã khuyến cáo. 66 Sơ đồ 4.1: Quy trình ISH áp dụng trong điều kiện phòng thí nghiệm tại Viện. Xử lý mẫu Mẫu P. vannamei Cố định (R-F) Xử lý mẫu trƣớc khi lai Đúc, cắt và đính lên lame Lai, thực hiện biến tính probe ở 95 0C trong 6 phút, giữ lạnh ở 40C. khi lai cho dung dịch lai có probe đã biến tính lên mẫu và biến tính mẫu ở 700C trong 5 phút . Rửa và phát hiện tín hiệu lai Mẫu P. monodon Cố định (Davidson) Xử lý nhanh giảm thời gian Tẩm paraffin Đúc, cắt, đính mẫu Lai, thực hiện biến tính mẫu và probe đồng thời trên lame ở 950C trong 5 phút, ủ qua đêm ở 420C. Rửa và phát hiện tín hiệu lai Xử lý mẫu trƣớc khi lai Qua các kết quả thí nghiệm trên, chúng tôi đƣa ra đƣợc quy trình lai tối ƣu để phát hiện WSSV và TSV có thể áp dụng trong điều kiện phòng thí nghiệm ở Viện: Trong đó, các bƣớc chuẩn bị mẫu lai trên hai đối tƣợng hoàn toàn giống nhau và gồm các bƣớc nhƣ: cố định mẫu, xử lý mẫu, đúc mẫu, cắt mẫu và đính mẫu lên lame dƣơng. Giai đoạn xử lý mẫu trƣớc khi lai trên mẫu tôm sú và mẫu TCT là giống nhau là mềm hóa mẫu lai bằng proteinase K (15 phút trên postlarvae và 17 phút trên tôm thƣơng phẩm). Giai đoạn lai đƣợc thực hiện nhƣ mô tả trên sơ đồ, thể tích dung dịch lai tối ƣu trong hai trƣờng hợp là 75 µl. Giai đoạn rửa và phát hiện các tín hiệu lai cũng hoàn toàn giống nhau trên hai đối tƣợng và thực hiện các bƣớc nhƣ trong quy trình của bộ kit ở mục III.5. 67 IV.3 Kết quả thí nghiệm so sánh giữa phƣơng pháp ISH với phƣơng pháp mô học và PCR IV.3.1 Kết quả trên Penaeus vannamei: Các mẫu tôm postlarvae và tôm thƣơng phẩm có dấu hiệu bệnh đƣợc thu ngẫu nhiên từ các trại sản xuất giống và các ao nuôi thƣơng phẩm ở Phú Yên, sau khi thực hiện chẩn đoán theo quy trình của ba phƣơng pháp mô học, PCR và ISH nhƣ trên, chúng tôi thu đƣợc kết quả nhƣ sau: IV.3.1.1 Kết quả trên tôm postlarvae Bảng 4.16: Kết quả thí nghiệm so sánh ISH với mô học và PCR trên postlarvae Mẫu Mô học PCR ISH 1 - + - 2 - + - 3 - + - 4 - + - 5 - + - 6 - - - 7 - - - 8 - - - 9 - - - 10 - - - 11 - - - 12 - - - 13 - - - 14 - - - 15 - - - Đối chứng dƣơng +++ +++ +++ Đối chứng âm - - - 68 Sau khi thực hiện thí nghiệm so sánh trên, chúng tôi nhận thấy rằng tất cả các mẫu đem kiểm tra đều âm tính với TSV. Nhìn chung, kết quả chẩn đoán của ba phƣơng pháp đa số trùng hợp với nhau, kết quả giữa mô học và ISH trùng hợp nhau 100% (15/15). Trong số 15 mẫu trên thì có 5 mẫu đầu có kết quả PCR dƣơng nhƣng mô học và ISH đều âm tính. Hiện tƣợng không trùng hợp này có thể do hiện tƣợng dƣơng tính giả của PCR, hoặc có thể do chúng tôi thực hiện thu mẫu chƣa đảm bảo chính xác, mẫu thu đƣợc chƣa đại diện đƣợc cho cả quần thể tôm nuôi tại trại giống nên cùng một mẫu khi chia thành nhiều phần, mỗi phần thực hiện một phƣơng pháp chẩn đoán khác nhau thƣờng cho kết quả không trùng hợp với nhau. Hiện tƣợng này cũng có thể do probe bị bất hoạt nhƣng trƣờng hợp này rất ít xảy ra vì khi lai chúng tôi có thực hiện song song một đối chứng dƣơng và một đối chứng âm, kết quả vẫn phát hiện tín hiệu lai trên đối chứng dƣơng và đối chứng âm không bị nhiễm tạp; điều này một lần nữa khẳng định tính ổn định của phƣơng pháp ISH. Trong thí nghiệm này kết quả giữa mô học và ISH trùng hợp với nhau hoàn toàn nên ta có thể nói rằng hai phƣơng pháp này có tƣơng quan với nhau, trong đó ISH có độ ổn định và độ chính xác cao hơn mô học. IV.3.1.2 Kết quả trên tôm thương phẩm Bảng 4.17: Kết quả thí nghiệm so sánh ISH với mô học và PCR trên tôm thƣơng phẩm Mẫu Mô học PCR ISH 1 + + + 2 + + + 3 + + + 4 + - + 5 + - + 6 + ++ + 7 + ++ - 8 + - - 69 9 + - - 10 + - - 11 - - - 12 - - - 13 - - - 14 - - - 15 - - - Đối chứng dƣơng +++ +++ +++ Đối chứng âm - - - Trên tôm lớn sau khi thực hiện thí nghiệm trên, chúng tôi nhận thấy rằng mức độ tƣơng đồng giữa mô học và ISH là 73,33% (11/15), giữa mô học và PCR là 66,67% (10/15) và giữa PCR với ISH là 80% (12/15). Nhìn vào tỷ lệ này, chúng tôi nhận thấy độ tƣơng thích giữa PCR với ISH tƣơng đối cao và ổn định hơn so với mô học. Tuy nhiên, cả ba phƣơng pháp trên đều có thể dùng để chẩn đoán mầm bệnh trên tôm nuôi, trong đó PCR và ISH có độ chính xác, độ nhạy và ổn định hơn mô học truyền thống rất nhiều. Nhìn chung kết quả mà chúng tôi thu đƣợc không chênh lệch nhiều giữa ba phƣơng pháp, một số trƣờng hợp không trùng hợp giữa ba phƣơng pháp có thể đƣợc giải thích nhƣ sau: Trƣờng hợp mô dƣơng, ISH dƣơng và PCR âm nhƣ ở mẫu số 4 và 5. Trƣờng hợp này có thể do thao tác thực hiện RT – PCR không chính xác, cũng có thể là do lƣợng RNA tách chiết quá thấp, tạp nhiễm nhiều hay có thể do có sự hiện diện của một tác nhân ức chế phản ứng PCR nên không phát hiện đƣợc tác nhân gây bệnh trong mẫu. Ngoài ra hiện tƣợng này cũng có thể do tính đa hình của virus Taura, mặc dù tính đa hình này rất ít xảy ra nhƣng khi nó xuất hiện thì có thể gây ra hiện tƣợng âm tính giả. Trƣờng hợp mô dƣơng, PCR dƣơng nhƣng ISH âm ở mẫu số 7. Hiện tƣợng này có thể mẫu dò bị bất hoạt nhƣng điều này không thể xảy ra vì có tín hiệu lai trên đối chứng dƣơng. Vì vậy, nguyên nhân của hiện tƣợng này có thể do hiện tƣợng ngoại 70 A B C D E F Hình 4.11: Một số hình ảnh thu đƣợc khi chẩn đoán TSV đồng thời bằng ba phƣơng pháp trên tôm lớn. Hình A: ISH dƣơng tính trên chân bơi, X10; hình B: ISH dƣơng tính trên mang, X40; hình C: ISH dƣơng tính trên phụ bộ, X10; hình D: mô học dƣơng tính trên mang, X100; hình E: ISH dƣơng tính trên gan tụy, X40; hình F: ISH dƣơng tính trên biểu mô, X10. nhiễm khi thực hiện phản ứng PCR, tạo hiện tƣợng dƣơng tính giả; hoặc có thể do sự nhầm lẫn virus Taura với một loại virus khác khi quan sát trên tiêu bản mô học. Trƣờng hợp mô dƣơng nhƣng PCR và ISH đều âm nhƣ ở mẫu số 8, 9 và 10. Điều này có thể giải thích do sự nhầm lẫn giữa TSV với một tác nhân gây bệnh khác có biểu hiện tƣơng tự trên tiêu bản mô học. Ngoài ra, kết quả không tƣơng đồng giữa ba phƣơng pháp trên có thể do thao tác thu mẫu của chúng tôi không đại diện cho cả quần thể tôm mà chúng tôi khảo sát. Qua các thí nghiệm trên chúng tôi nhận thấy cả ba phƣơng pháp trên đều có thể ứng dụng vào chẩn đoán mầm bệnh TSV trên TCT, trong đó PCR và ISH có độ nhạy và độ chính xác cao hơn mô học truyền thống. Khi thực hiện chẩn đoán trên 15 mẫu postlarvae và 15 mẫu tôm lớn thì tỷ lệ dƣơng tính với TSV là 0% (0/15) đối với postlarvae và 40% (6/15) trên tôm lớn, các mẫu mà chúng tôi thu đƣợc có tỷ lệ nhiễm bệnh tƣơng đối thấp. IV.3.2 Kết quả trên Penaeus monodon 71 Để thực hiện bố trí này, chúng tôi tiến hành thí nghiệm trên 15 mẫu tôm postlarvae và 15 mẫu tôm thƣơng phẩm có biểu hiện nhiễm bệnh nhƣ ăn ít, rớt đáy… Các mẫu này đƣợc thu tại các trại sản xuất giống và các ao nuôi tôm thƣơng phẩm ở các tỉnh Sóc Trăng, Cà Mau, Bạc Liêu và thực hiện chẩn đoán đồng thời các phƣơng pháp mô học, PCR, ISH. Kết quả thu đƣợc nhƣ sau: IV.3.2.1 Đối tôm postlarvae Bảng 4.18: Kết quả thí nghiệm so sánh ISH với mô học và PCR trên postlarvae Mẫu Mô học PCR ISH 1 + ++ + 2 ++ - + 3 + - - 4 + + + 5 - + - 6 + + + 7 + - + 8 - + + 9 + + + 10 + + + 11 - + + 12 - - - 13 - - - 14 - - - 15 - - - Đối chứng dƣơng +++ +++ +++ Đối chứng âm - - - 72 IV.3.2.2 Đối với tôm thương phẩm Bảng 4.19: Kết quả thí nghiệm so sánh ISH với mô học và PCR trên tôm thƣơng phẩm Mẫu Mô học PCR ISH 1 +++ - +++ 2 + ++ ++ 3 + ++ ++ 4 + ++ + 5 + + + 6 + + + 7 - - - 8 - - - 9 - - - 10 - - - 11 + + - 12 + + + 13 - + + 14 - + + 15 + + + Đối chứng dƣơng +++ +++ +++ Đối chứng âm - - - Qua kết quả thực hiện chẩn đoán so sánh giữa các phƣơng pháp với nhau chúng tôi thu đƣợc một số kết quả nhất định nhƣ sau: 73 Ở tôm thƣơng phẩm thì đa số các kết quả thu đƣợc từ ba phƣơng pháp trên tƣơng đồng với nhau (mức độ tƣơng đồng giữa mô học với PCR là 80% (12/15), giữa mô học với ISH là 80% (12/15), giữa PCR với ISH là 87% (13/15) và giữa ba phƣơng pháp là 73% (11/15)); nhƣng ở tôm postlarvae thì kết quả giữa ba phƣơng pháp có chênh lệch nhau nhiều (mức độ tƣơng đồng giữa mô học với PCR là 60% (9/15), giữa mô học với ISH là 80% (12/15), giữa PCR với ISH là 80% (12/15) và giữa ba phƣơng pháp là 60% (9/15)). Mặc dù có sự khác biệt nhƣng nhìn chung, đa số kết quả chẩn đoán của ba phƣơng pháp trên đều trùng hợp với nhau, điều này giúp chúng ta thấy đƣợc độ ổn định của các phƣơng pháp này khi áp dụng trong chẩn đoán mầm bệnh trên tôm. Với kết quả phƣơng pháp PCR và ISH dƣơng nhƣng mô học âm ở mẫu số 8, 11 của tôm postlarvae và mẫu 13, 14 của tôm thƣơng phẩm. Hiện tƣợng này có khả năng do tỷ lệ và cƣờng độ nhiễm WSSV trên tôm thấp, bệnh chỉ biểu hiện ở một số tế bào. Trong quá trình nhuộm mô, lát cắt mô có kích thƣớc nhỏ nên không đi qua hết các tế bào bị nhiễm bệnh nên có khả năng không tìm thấy bệnh. Ngoài ra với phƣơng pháp mô học, ta chỉ xác định đƣợc bệnh khi bệnh đã biểu hiện ra các tế bào, còn ở giai đoạn bệnh mới phát dấu hiệu bệnh lý chƣa đƣợc biểu hiện ở các bào quan thì mô học không thể định dạng đƣợc bệnh. Trong khi đó, với phƣơng pháp PCR và ISH thì chỉ cần tôm có dấu hiệu bệnh dù là ở giai đoạn đầu của qua trình nhiễm bệnh thì PCR và ISH vẫn có thể xác định đƣợc bệnh. Qua đó ta có thể nói đƣợc là phƣơng pháp PCR và ISH có độ nhạy cao hơn mô học truyền thống. Trƣờng hợp PCR và ISH âm nhƣng mô học dƣơng nhƣ ở mẫu số 3 của tôm portlarvae. Hiện tƣợng này có thể do có một tác nhân gây bệnh khác có biểu hiện bệnh lý trên tế bào tƣơng tự nhƣ dấu hiệu bệnh lý của bệnh đốm trắng. Do đó, bằng phƣơng pháp mô học ta có thể dễ nhầm lẫn trong việc phát hiện mầm bệnh do WSSV trên tôm sú P. monodon. Điều này khẳng định một lần nữa phƣơng pháp mô học có độ chính xác kém hơn PCR và ISH. Trƣờng hợp PCR cho kết quả dƣơng tính nhƣng ISH và mô học cho kết quả âm tính ở mẫu số 5 của postlarvae. Điều này có thể do hai khả năng. Thứ nhất là do ngoại nhiễm trong quá trình làm PCR hoặc do primer bắt cặp không đặc hiệu với DNA của tác nhân gây bệnh. Thứ hai là do mẫu dò (probe) đã bị bất hoạt nên không phát hiện 74 đƣợc tác nhân gây bệnh và ở phƣơng pháp mô học do tôm bị nhiễm bệnh ở giai đoạn đầu, bệnh chƣa biểu hiện ra các bào quan nên mô học không phát hiện đƣợc bệnh. Cả hai khả năng trên đều có thể xảy ra nhƣng xác suất khả năng thứ nhất xảy ra cao hơn vì khi thực hiện PCR rất dễ bị ngoại nhiễm và khi thực hiện lai chúng tôi có làm đối chứng dƣơng kèm theo và thu đƣợc tín hiệu lai trên đối chứng dƣơng. Chúng tôi tiến hành kiểm tra lại mẫu trên bằng phƣơng pháp ISH một lần nữa, kết quả thu đƣợc vẫn trùng hợp với kết quả ban đầu, chứng tỏ phƣơng pháp PCR đã bị dƣơng tính giả. Trƣờng hợp PCR cho kết quả âm tính nhƣng mô học và ISH cho kết quả dƣơng tính nhƣ ở mẫu số 2, 6 của tôm postlarvae và mẫu 1 của tôm thƣơng phẩm. Điều này có thể trong quá trình tách chiết DNA, DNA tách chiết bị dơ và nồng độ quá thấp không đủ để thực hiện phản ứng khuếch đại. Hiện tƣợng này cũng có thể là do probe của bộ kit bắt cặp không đặc hiệu, tạo ra các tín hiệu dƣơng tính giả. Nhƣng khi chúng tôi lặp lại thí nghiệm này lần thứ hai thì ISH vẫn cho kết quả trùng hợp với kết quả ban đầu nhƣng PCR thì lại cho kết quả dƣơng tính. Điều này cho thấy phƣơng pháp ISH có độ đặc hiệu cao hơn PCR và mô học. 75 A B C D E F Hình 4.12: Một số hình ảnh thu đƣợc khi chẩn đoán mầm bệnh đốm trắng đồng thời bằng ba phƣơng pháp. Hình A: ISH dƣơng tính trên mang tôm postlarvae, X40; hình B: ISH âm tính trên mang tôm postlarvae, X40; hình C: ISH dƣơng tính trên mắt tôm poslarvae, X40; hình D: mô học dƣơng tính trên mang tôm lớn, X40; hình E: ISH dƣơng tính trên chân bơi tôm lớn, X40; hình F: ISH dƣơng tính trên gan tụy tôm lớn, X10. Qua thí nghiệm này chúng tôi thấy đƣợc virus đốm trắng có thể nhiễm vào bất kỳ tổ chức nào nhƣ mang, gan tụy, dạ dày, ruột, phụ bộ…của cơ thể khi tôm bị bệnh, nhƣng mang là cơ quan bị virus tấn công nhiều nhất. Đa số các mẫu lai thu đƣợc đều rõ, ít có các tín hiệu nền, các cơ quan của tôm đều thấy rõ nên đây là phƣơng pháp rất hữu hiệu dùng để chẩn đoán mầm bệnh đốm trắng trên tôm sú. IV.5 Nhận xét chung Sau khi thực hiện chẩn đoán mầm bệnh WSSV trên P. monodon và TSV trên P. vannamei, chúng tôi có một số nhận xét sau: Do probe mà bộ kit cung cấp có dạng DNA mạch đôi nên khi thực hiện chẩn đoán mầm bệnh WSSV dễ dàng hơn vì cả probe và WSSV đều có cấu trúc DNA mạch đôi. Do đó, chúng tôi có thể bỏ qua giai đoạn biến tính probe riêng mà thực hiện biến tính mẫu và probe đồng thời trên lame. Ở mầm bệnh do TSV thì hai thao tác này phải thực hiện tách riêng. 76 Tín hiệu lai mà chúng tôi nhận đƣợc ở tiêu bản WSSV rõ ràng hơn rất nhiều tín hiệu lai từ tiêu bản TSV. Sở dĩ nhƣ vậy vì là do virus đốm trắng có vật chất di truyền là DNA nên DNA của virus tập trung trong nhân và làm cho nhân trƣơng to; do đó tín hiệu lai tạp trung trong nhân và đậm hơn rất nhiều. Còn đối với TSV, là virus RNA nên RNA của virus tập trung trong tế bào chất, do đó các tín hiệu lai nhận đƣợc không tập trung, rải rác trong tế bào chất nên tín hiệu lai mờ, không rõ nhƣ ở WSSV. ISH khi thực hiện trên DNA đơn giản hơn rất nhiều khi thực hiện trên RNA. Quy trình ISH chuẩn dùng trong nghiên cứu này gồm năm bƣớc chính: chuẩn bị probe, chuẩn bị mẫu mô, xử lý mẫu trƣớc khi lai, lai và rửa mẫu và bƣớc sau cùng là phát hiện các tín hiệu sau khi lai. Trong thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng bộ kit do công ty Diagxotics của Mỹ cung cấp, nên không trải qua bƣớc chuẩn bị probe mà sử dụng probe là DNA mạch đôi đƣợc đánh dấu bằng Digoxigenin do công ty cung cấp. Vì probe là DNA mạch đôi nên khi biến tính probe thì hai mạch đôi luôn có xu hƣớng tái bắt cặp lại với nhau, độ nhạy của phƣơng pháp lai không cao. Ngoài ra, trong thí nghiệm này chúng tôi dùng dung dịch cố định mẫu là Davidson đối với tôm sú, đây là dung dịch cố định tạo kết tủa protein để bảo tồn DNA trong tế bào và duy trì hình dạng ban đầu của mẫu mô. Tuy nhiên, trong thành phần của dung dịch này có chứa acid nên khả năng bảo tồn lƣợng DNA và hình dạng mẫu ban đầu chƣa tốt lắm (Hasson và ctv, 1997) nên một số mẫu lai bị mờ và không giữ đƣợc hình dạng ban đầu. Trƣớc khi lai, chúng tôi thực hiện xử lý mẫu nhằm mục đích tăng khả năng bắt cặp của probe với trình tự đích trong mẫu và giảm các tín hiệu nền không mong muốn. Ở đây, chúng tôi sử dụng Proteinase K nồng độ 2 μg/ml để xử lý làm mềm mẫu, thời gian cắt mẫu với Proteinase K thích hợp nhất là 15 phút trên tôm postlarvae và 17 phút trên tôm thƣơng phẩm. Nếu thời gian cắt vƣợt quá mức này thì hình dạng ban đầu của mẫu không duy trì đƣợc thậm chí mất mẫu mô, nhƣng nếu thời gian cắt quá thấp thì probe xâm nhập vào mẫu và lai với trình tự đích không tốt nên các tín hiệu lai bị mờ (Baumgart E., Schad A. và ctv,1997). Quá trình lai thực hiện ở 420C và ủ qua đêm thuận lợi cho probe tìm và bắt cặp với trình tự DNA đích trên mẫu (Altar C.A. và ctv, 1989). Mẫu sau khi lai đƣợc rửa bằng dung dịch SSC với các nồng độ giảm dần và phát hiện các tín lai bằng cơ chất NBT/BCIP. IV.6 Những thuận lợi và khó khăn 77 Trong quá trình thực hiện thí nghiệm trên, chúng tôi gặp một số thuận lợi và khó khăn sau: IV.6.1 Thuận lợi Mẫu ít bị tạp nhiễm trong khi thao tác mẫu. Phƣơng pháp này rất đặc hiệu, không bị nhầm lẫn với các mầm bệnh khác. Có thể thực hiện chẩn đoán đồng thời nhiều mẫu. IV.6.2 Khó khăn Mẫu dễ bị trôi do thao tác bơm hóa chất lên mẫu với áp lực mạnh. Mẫu dễ bị khô trong quá trình làm, do thao tác chậm. Nhuộm màu chƣa làm nổi bậc đƣợc mẫu do hóa chất nhuộm đã bị mất hoạt tính. Proteinase K có thể bị mất hoạt tính do tan giá lặp lại nhiều lần. Probe là đoạn DNA mạch đôi nên độ nhạy kém hơn các loại probe khác. Đối với những mẫu có mức độ nhiễm bệnh thấp, tín hiệu lai phát ra rất yếu nên. gặp khó khăn khi phát hiện dƣới kính hiển vi quang học. IV.7 Ƣu nhƣợc điểm của phƣơng pháp In situ hybridization IV.7.1 Ƣu điểm Độ đặc hiệu của phƣơng pháp cao Phƣơng pháp này không bị tạp nhiễm nhƣ PCR Chúng ta có thể chẩn đoán đồng thời nhiều mẫu IV.7.2 Nhƣợc điểm Mẫu dễ bị hƣ trong quá trình làm. Đối với những mẫu nhiễm virus với nồng độ thấp, tín hiệu lai phát ra yếu nên rất khó khăn khi quan sát dƣới kính hiển vi quang học. 78 CHƢƠNG V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ V.1 Kết luận V.1.1 Phƣơng pháp In Situ hybridization trong chẩn đoán mầm bệnh do TSV trên P. vannamei - Sau khi thử nghiệm khả năng chẩn đoán mầm bệnh TSV trên P. vannamei bằng phƣơng pháp In Situ hybridization theo quy trình bộ kit, chúng tôi nhận thấy rằng phƣơng pháp này có thể áp dụng để chẩn đoán mầm bệnh TSV trên P. vannamei rất hiệu quả và chính xác cao. 79 - Trong quá trình thực hiện thí nghiệm chúng tôi đã tìm đƣợc quy trình In Situ hybridization tối ƣu áp dụng trong điều kiện phòng thí nghiệm tại Viện nhƣ sau: Dùng dung dịch cố định mẫu là R-F (RNA – friendly) để cố định mẫu tốt hơn là sử dụng dung dịch Davidson. Mẫu và probe trong dung dịch lai đƣợc biến tính riêng. Nhiệt độ biến tính probe là 950C trong 10 phút và nhiệt độ biến tính mẫu là 700C trong 6 phút là tốt nhất. Thời gian cắt mẫu với Proteinase K thích hợp nhất là 15 phút trên tôm postlarvae và 17 phút trên tôm thƣơng phẩm. Thể tích dung dịch lai sử dụng tốt nhất là 75 µl trên cả tôm postlarvae và tôm thƣơng phẩm. - Ứng dụng quy trình lai vừa tìm đƣợc để phát hiện mầm bệnh TSV trên P. vannamei ở các giai đoạn khác nhau (postlarvae, tôm thƣơng phẩm) cho thấy độ nhạy, độ ổn định, độ đặc hiệu và chính xác cao của phƣơng pháp này. - Thực hiện chẩn đoán so sánh phƣơng pháp ISH với phƣơng pháp mô học và PCR trong chẩn đoán mầm bệnh TSV trên P. vannamei, chúng tôi nhận thấy phƣơng pháp ISH có độ nhạy, độ ổn định và chính xác cao hơn phƣơng pháp mô học và PCR. V.1.2 Phƣơng pháp In Situ hybridization trong chẩn đoán mầm bệnh do WSSV trên P. monodon - Thử nghiệm lại quy trình In Situ hybridization trong việc chẩn đoán mầm bệnh WSSV trên tôm sú P. monodon một cách hiệu quả, từ đó cho thấy tính ổn định, độ nhạy và độ chính xác của phƣơng pháp này khi dùng trong chẩn đoán mầm bệnh đốm trắng trên tôm sú. - Trong quá trình thực hiện thí nghiệm chúng tôi đã tìm đƣợc quy trình In Situ hybridization tối ƣu để chẩn đoán WSSV áp dụng trong điều kiện phòng thí nghiệm tại Viện nhƣ sau:  Thay thế các hóa chất thông dụng nhƣ cồn, xylene và paraformaldehyde không có trong bộ kit bằng những hóa chất do Trung Quốc và Việt Nam sản xuất với giá thành tƣơng đối rẻ hơn, nên giảm đƣợc chi phí thực hiện chẩn đoán và phù hợp 80 điều kiện hiện tại của phòng thí nghiệm Mô học TTQGQTCBMT & PNDBTSKVNB của Viện.  Tìm đƣợc quy trình ISH áp dụng trong điều kiện phòng thí nghiệm nhƣ áp dụng kết hợp quy trình xử lý mẫu nhanh với việc biến tính mẫu và probe đồng thời trên lame trƣớc khi lai, đã giúp rút ngắn đƣợc thời gian chẩn đoán và thao tác đơn giản hơn quy trình của bộ kit. - Ứng dụng quy trình vừa tìm đƣợc để phát hiện mầm bệnh đốm trắng trên tôm sú ở các giai đoạn khác nhau (postlarvae, tôm thƣơng phẩm) cho thấy độ nhạy, độ ổn định, độ đặc hiệu và chính xác cao của phƣơng pháp này. - Thực hiện chẩn đoán so sánh phƣơng pháp ISH với phƣơng pháp mô học và PCR trong chẩn đoán mầm bệnh WSSV trên P. monodon, chúng tôi nhận thấy phƣơng pháp ISH có độ nhạy, độ ổn định và chính xác cao hơn phƣơng pháp mô học và PCR. Phƣơng pháp ISH khắc phục đƣợc nhƣợc điểm kém chính xác của mô học và khắc phục đƣợc nhƣợc điểm dƣơng tính giả của PCR. - Chi phí phân tích một mẫu tôm bằng ISH khoảng 100.000 đồng/mẫu, đắc hơn mô học 50.000 đồng/mẫu nhƣng rẻ hơn PCR 140.000 đồng/mẫu. Kết hợp với những kết quả nhƣ trên, chúng tôi nhận thấy rằng phƣơng pháp ISH có khả năng ứng dụng chẩn đoán mầm bệnh do WSSV trên tôm sú P. mondon. V.2 Đề nghị Trong phạm vi giới hạn của đề tài, chúng tôi thu đƣợc một số kết quả nhất định và mở ra một số nghiên cứu sâu hơn. Vì vậy, chúng tôi có một số đề nghị sau: Tiếp tục kiểm tra mầm bệnh WSSV và TSV trên số lƣợng lớn tôm postlarvae và tôm thƣơng phẩm bằng phƣơng pháp ISH, mô học và PCR để chứng minh một cách chính xác và thuyết phục hơn về hiệu quả, độ nhạy, độ đặc hiệu, độ ổn định và mức độ chính xác của phƣơng pháp ISH so với hai phƣơng pháp còn lại. Thay thế dần các hóa chất trong bộ kit bằng các hóa chất tự tổng hợp áp dụng trong chẩn đoán, linh hoạt trong chẩn đoán, giảm bớt chi phí và giảm phụ thuộc vào bộ kit chẩn đoán của nhà cung cấp. 81 Phát triển phƣơng pháp chẩn đoán bằng ISH và hệ thống phát hiện tín hiệu lai TSA (Tyramide signal amplification), phát hiện đƣợc những mẫu nhiễm mầm bệnh với mức độ rất thấp. Kết hợp ISH với các phƣơng pháp PCR để phát huy hết thế mạnh của phƣơng pháp lai này trong chẩn đoán mầm bệnh. Phát triển xu hƣớng lai đồng thời nhiều probe với cùng một mẫu mô để đồng thời phát hiện nhiều tác nhân gây bệnh trên một mẫu mô. CHƢƠNG VI TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt 1. Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 2002. Sinh học phân tử. Nhà xuất bản giáo dục, 301 trang. 82 2. Ts. Nguyễn Văn Hảo, 2004. Một số bệnh thường gặp trên tôm sú (Penaeus monodon) các phương pháp chẩn đoán và biện pháp phòng trị. Nhà xuất bản Nông Nghiệp, Thành phố Hồ Chí Minh. 3. Thái Bá Hồ, Ngô Trọng Lƣ, 2003. Kỹ thuật nuôi tôm he chân trắng. Nhà xuất bản Nông Nghiệp Hà Nội, 108 trang. 4. Ts. Bùi Quang Tề, 2003. Bệnh của tôm nuôi và biện pháp phòng trị - Nhà xuất bản Nông Nghiệp, Hà Nội. 5. Ts. Khuất Hữu Thanh, 2003. Di truyền phân tử và kỹ thuật gen. Nhà xuất bản Khoa Học Kỹ Thuật Hà Nội. 6. Lê Thị Thanh Thúy và Lý Thủy Tiên, 2003. Quy trình kỹ thuật và khả năng áp dụng các phương pháp chẩn đoán bệnh đốm trắng (White Spot Disease) trên tôm sú (Penaeus monodon). Khóa luận tốt nghiệp Kỹ sƣ Thủy Sản, Đại học Nông Lâm, TP. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 7. Mai Anh Tuấn, 2004. Tìm hiểu quy trình sản xuất giống tôm thẻ chân trắng tại công ty duyên hải Bạc Liêu. Khóa luận tốt nghiệp Kỹ sƣ Thủy Sản, Đại học Nông Lâm, TP. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 8. Trƣờng Đại Học Y Hà Nội Bộ Môn Mô Học Và Phôi Thai Học, 2002. Mô Học. Nhà xuất bản Y học Hà Nội, 739 trang. 9. Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II, 2002. Các bệnh thường gặp trên tôm nuôi thương phẩm và phương pháp chẩn đoán. Nhà xuất bản Thành phố Hồ Chí Minh. Tài liệu tiếng Anh 10. Just M. Vlak, Jean-Robert Bonami, Tim W. Flegel, Guang-Hsiung Kou, Donalt V. Lighter, Chu-Fang Lo, Philip C. Loh and Peter J. Walker. Nimaviridae A new virus family infecting aquatic invertebrates. 11. Lightner D.V., 1996. A Handbook of Shrimp Pathology and Diagnostic Procedures for Diseases od Cultured Penaeid Shrimp. World Aquaculture Society, Baton Rouge, LA, USA, 304pp. 83 12. Pornlerd Chanratchakool, James.F.Turnbull, Simon.J.Funge–Smith, Ian.H.MacRae and Chalor Limsuwan, 1998. Health Management in Shrimp Ponds. Bangkok, ThaiLand. 13. Lightner, D.V., T.A. Bell and R.M. Redman, 1989. A review of the known host geographical range and current diagnostic prosedures for the virus disease of cultured penaeid shrimp. Advances in tropical Aquaculture, Tahiti. 14. Yoichi Tani, 1999. PCR In Situ Amplification and Catalyzed Signal Amplification: Approaches of Higher Sensitive, Non-Radioactive In Situ Hybridization. 15. Thomas Ried, M.D., 1997. Cytogenis Methods. Genome Technology Branch National Human Genome Research Institute. 16. Tkachuk D.C., Pinkel D., Kuo W.L., Weier H.U., Gray J.W., 1991. Clinical applications of fluorescence in situ hybridization. Genet Anal Techn Appl 8: 67 – 74. 17. Weiming Zheng, Junichi Izaki, Shuichi Furusawa and Yukinori Yoshimura, 5- 2001. A sensitive non – radioactive in situ hybridization method for detection of chicken IgG - chain mRNA: a technique suitable for detecting of variety of mRNA in tissue sections. Biologycal Procedures Online 3: 1 – 7. Japan. 18. Baumgart E., Schad A., Grabenbauer M., 2001. In situ hybridization: general principles and application digoxigenin – labeled cRNA for detection of mRNAs. In Immunocytochemistry and in situ hybridization in Biomedical Sciences (Eds Beesley J.E.). Boston, Birkhauser, p. 108 – 137. 19. Schad A., Fahimi H.D., Volkl A., Baumgart E., 1996. Nonradioactive in situ hybridization for detection of mRNAs encoding for peroxisomal proteins: Heterogeneous hepatic lobular distribution after with a single dose of bezafibrate. J. Histochem. Cytochem 44: 825 – 834. 20. Jacques Chevalier, Jing Yi, Odile Michel and Xue-Ming Tang, 1997. Biotin and Digoxigenin as Labels for Light and Electron Microscopy in situ Hybridization Probes: Where do we stand?. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry 45: 481 – 491. 21. Bloch B., 1993. Biotinylated probes for in situ hybridization histochemistry: use for mRNA detection. J. Histochem Cytochem 41: 1751 – 1754. 22. Heitzman H., Richards F.M., 1974. Use of avidin – biotin complex for specific staining of biologycal membrances in electron microscopy. Proc Natl Acad Sci USA 71: 3537 – 3541. 84 23. Feng Yang, Jun He, Xionghui Lin, Qin Li, Deng Pan, Xiaobo Zhang and Xun Xum, 2001. Complete Genome Sequencce of the Shrimp White Spot Bacilliform Virus. People’s Republic of China. 24. Brigati D.J., Myerson D., Leary J.J., Spalholz B., Travis S.Z., Fong C.K.Y., Hsiung G.D., Ward D.C., 1983. Detection of viral genomes in cultured cells and paraffin – embedded tissue section using biotin labeled hybridization probes. Virology 126: 32 – 50. 25. Levis F.A., Griffiths S., Dunnicliffe R., Wells M., Dudding N., Bird C.C., 1987. Sensitive in situ hybridization technique using biotin – streptavidin – polyalkaline phosphatase complex. J. Clin. Pathol. 40: 163 – 166. 26. Kirsten M. Spann, Russell J. McCulloch, Jeff A. Cowley, Iain J. East, Peter J. Walker, 2003. Detection of gill – associated virus (GAV) by in situ hybridization during acute and chronic infections of Penaeus monodon and Penaeus esculentus. Diseases of Aquatic Organisms 56: 1 – 10. Queenlands Bioscience Precint, 306 Carmody Road, St Lucia, Queenland 4067, Australia. 27. Hasson K.W., Lightner D.V., Poulos B.T., Mohney L.L., Redman R.M., White B.M., 1999. Taura Syndrome Virus (TSV) lesion development and disease cycle in Pacific White Shrimp Penaeus vannamei. Dis Aquat Org 36: 81 – 93. 28. Poh – Sing Chang, Hisao – Chao Chen, Yu – Chi Wang, 1998. Detection of whitee spot syndrome associated baculovirus in experimentally infected wild shrimp, crab, lobsters by in situ hybridization. Aquaculture 164: 233 – 242. Department of Aquaculture, National Kaohsiung Insitute of Marine Technology, Kaohsiung, Taiwan. 29. Kenneth W. Hasson, Donald V. Lightner, Jocelyne Mari, Jean – Robert Bonami, Bonnie T Poulos, Leone L. Mohney, Rita M. Redman, James A. Brock, 1998. The geographic distribution of Taura Syndrome Virus (TSV) in Americas: determination by histopathology and in situ hybridization using TSV – specific cDNA probes. Aquculture 171: 13 – 26. Anuenue Fisheries Research Center, Department of Land and Natural Resources, Honolulu, HI 96819 USA. 30. Hasson K.W., Hasson J., Aubert H., Redman R.M., Lightner D.V., 1997. A new RNA – friendly fixative for the preservation of penaeid shrimp samples for virological detection using cDNA genomic probes. J. Virol. Meth. 66: 227 – 236. 31. Bonami J.R., Hasson K.W., Mari J., Poulos B.T., Lightner D.V., 1997. Taura syndrome of marine penaeid shrimp: characterization of the viral agent.Virol. 78: 313 – 319. 32. www.wjgnet.com 85 33. www.genome.gov 34. www.oie.com 35. www.jhc.org 36. 37. www.hosufl.edu 38. www.oie.com 39. www.maximbio.com 40. www.asip.org 41. www.vectorlabs.com 42. www.biologycalprocedures.com