Khóa luận Ứng dụng phương pháp mô học truyền thống khảo sát sự biến đổi cấu trúc tế bào tôm càng xanh (Macrobrachium rosenbergii De Man, 1879) bị bệnh đục thân

. Jee (1986) nghiên cứu và ứng dụng qui trình nƣớc xanh cải tiến trên cơ sở cải tiến qui trình nƣớc xanh trƣớc đó, sau đó qui trình này đƣợc áp dụng phổ biến ở Malaysia và Việt Nam (FAO, 2002). Hình 2.4: Các khu vực sản xuất TCX chính trên thế giới (FAO Fishery Statistics, 2002) Hình 2.5: Biểu đồ phân bố sản lƣợng TCX trên thế giới qua các năm (FAO Fishery Statistics, 2002) Có nhiều hình thức nuôi TCX hiện nay nhƣ nuôi tôm trên ruộng lúa, nuôi trong ao, nuôi trong mƣơng vƣờn, nuôi trong đăng và lồng, nuôi đơn hay nuôi hỗn hợp với cá, …. Năm 1984, sản lƣợng TCX thế giới đạt 5.246 tấn, năm 1989 đạt 17.608 tấn và năm 2000 đạt trên 119.000 tấn (FAO, 2002). Hầu hết sản lƣợng TCX trên thế giới đƣợc nuôi ở Châu Á, trong đó Trung Quốc có sản lƣợng lớn nhất, khoảng 128.000 tấn vào năm 2001. Năm 2002, Trung Quốc chiếm 58% tổng sản lƣợng TCX của thế giới. 9 Nghề nuôi TCX ở nƣớc ta là một nghề truyền thống, đặc biệt là vùng đồng bằng sông Cửu Long. Việc nghiên cứu sản xuất giống TCX đã đƣợc bắt đầu từ đầu thập niên 80 với qui trình nƣớc trong hở và tuần hoàn. Tuy nhiên, việc sản xuất giống nhân tạo chỉ phát triển từ 1999 khi nhu cầu con giống ngày càng cao, khi nghiên cứu và áp dụng thành công quy trình nƣớc xanh cải tiến. Trong nuôi tôm thịt, năm 2002 cả nƣớc đạt 10.000 tấn, chủ yếu tập trung sản lƣợng tại các tỉnh vùng đồng bằng sông Cửu Long nhƣ An Giang, Cần Thơ, Đồng Tháp, Bến Tre với diện tích nuôi mỗi tỉnh khoảng 200 – 800 ha. Có nhiều mô hình nuôi trồng thuỷ sản khác nhau đƣợc nông dân ứng dụng, phổ biến nhất là mô hình nuôi TCX luân canh với lúa, đạt 686 kg/ha/vụ, nuôi tôm kết hợp với lúa đạt năng suất bình quân 4,12 tấn/ha/vụ, nuôi ao đạt 1,2 tấn/ha/vụ, nuôi tôm đăng quầng trên sông (phát triển mạnh tại Đồng Tháp) với khoảng 300 quầng năm 2001 và 1.500 quầng vào năm 2002. Nhìn chung, nghề nuôi TCX trên thế giới hiện nay đang trên đà phát triển mạnh và sản lƣợng sẽ tăng 12 - 30 % mỗi năm và có thể đạt 750.000 – 1.000.000 tấn/năm vào năm 2010, trong đó Trung Quốc chiếm ƣu thế nhất về sản lƣợng, tiếp theo là Việt Nam, Ấn Độ, Bangladesh, Thái Lan. Tuy nhiên, sự phát triển nhanh chóng nhất của nghề nuôi TCX là trong những năm 1999 – 2001 với tốt độ tăng trƣởng đạt 30%/năm, đặt ra nhiều vấn đề cần xem xét để phát triển bền vững nghề nuôi tôm với bài học sâu sắc từ sự phát triển của nghề nuôi tôm biển (New, 2005). Rất nhiều vấn đề liên quan đến TCX đã và đang tiếp tục nghiên cứu và góp phần quan trọng vào ứng dụng thực tế (New, 2005). 2. 4 Các bệnh thƣờng gặp trên tôm càng xanh 2.7.1 Bệnh trên ấu trùng tôm càng xanh 2.4.1.1 Bệnh hoại tử cơ (idiopathic muscle necrosis) (IMN) Bệnh đƣợc biết bởi nhiều tên khác nhau: bệnh trắng cơ (white muscle disease), bệnh hoại tử cơ (muscle necrosis), bệnh đục cơ (muscle opacity hoặc milk prawn disease) (Tonguthai, 1997). Bệnh gây nên tỉ lệ chết cao ở ấu trùng TCX bởi các sợi cơ hoại tử. Nash và c.t.v. (1987) cho rằng IMN gây chết đến 60% ở hậu ấu trùng 28 ngày tuổi trong các trại sản xuất giống ở Thái Lan. Trên Macrobrachium rosenbergii, IMN 10 xảy ra khi tôm bị sốc môi trƣờng, do không đảm bảo vệ sinh, do thay đổi nhiệt độ, do giảm oxi hoà tan, do hoạt động quá mức hay do môi trƣờng sống chật hẹp. Bệnh cũng có thể xảy ra sau khi đem hậu ấu trùng đƣa vào ao nuôi thịt 1 hoặc 2 ngày, có thể do tôm bị sốc khi vào sống trong môi trƣờng mới. Để khống chế sự việc này, nên giữ hậu ấu trùng tôm trong ao ƣơng vài ngày trƣớc khi chính thức thả vào ao nuôi. 2.4.1.2 Bệnh giữa chu kỳ (mid-cycle disease) (MCD) Nhìn chung bệnh xảy ra từ giai đoạn ấu trùng thứ VI đến XI. Anderson và c.t.v. (1990) cho biết một tỉ lệ chết cao xảy ra trên ấu trùng ở các trại ƣơng TCX ở Malaysia trong khoảng thời gian 16 ngày sau khi nở. Triệu chứng bệnh tƣơng tự trong trƣờng hợp thối rữa do vi khuẩn xảy ra trong tự nhiên. Ấu trùng bỏ ăn hay giảm ăn và xảy ra hiện tƣợng ăn thịt lẫn nhau (các con yếu bị con khoẻ hơn ăn thịt). Ấu trùng bị bệnh thƣờng có màu nâu xanh và bơi một cách yếu ớt và không thể định phƣơng hƣớng. Hiện không xác định đƣợc tác nhân gây bệnh, có thể là do Enterobacter aerogenes (Johnson, 1978; Brock, 1988). Brock (1983) cho rằng chế độ vệ sinh tốt không thể chống lại mầm bệnh, cần nên có chế độ dinh dƣỡng đặc biệt với đầy đủ artermia cần thiết. 2.4.1.3 Bệnh hoại tử cơ do vi khuẩn (bacterial necrosis) Những con ấu trùng bị bệnh, thân tôm thƣờng có màu xanh xám, không ăn, yếu ớt và rơi xuống đáy bể, trên râu và trên các phần phụ xuất hiện những đốm nâu. Tác nhân gây bệnh này đã đƣợc xác định, bao gồm các vi khuẩn hình sợi Leucothrix spp., các cầu khuẩn và các vi khuẩn hình que hiện diện trên các sợi mang và trên các phần phụ. Bệnh thƣờng xâm hại trên các ấu trùng IV-V, gây nên sự chết hàng loạt (100%) trong 48 giờ (Aquacop, 1977). 2.4.1.4 Bệnh phát sáng (luminous disease) Vibrio harveyi đƣợc xác định là tác nhân gây nên bệnh này trên các ấu trùng giai đoạn sớm, một bệnh rất thƣờng gặp cả trên đối tƣợng tôm nƣớc ngọt và tôm nƣớc mặn. Ngoài đặc điểm phát sáng vào ban đêm, một đặc điểm rất dễ nhận thấy, còn có thể quan sát thấy trên các con tôm bệnh các vùng cơ mờ đục, bơi lội yếu dần và chết. Đây là một căn bệnh nghiêm trọng, có khả năng gây chết đến 100%, và có thể kháng lại một số thuốc sử lý. Sae-oui và c.t.v. (1978) đã làm một thí nghiệm kiểm tra tính nhạy cảm của Vibrio harveyi tìm thấy trên P. merguiensis, kết quả chứng minh rằng 11 Ca(HOCl)2 với nồng độ 20 – 30 ppm hoặc formalin nồng độ 50 ppm có khả năng giết chết hoàn toàn loài vi khuẩn này trong môi trƣờng. 2.4.1.5 Bệnh lột vỏ không hoàn toàn (exuvia entrapment disease) (EED) Bệnh ảnh hƣởng nặng nhất trên TCX ở giai đoạn ấu trùng cuối và giai đoạn PL sớm, đƣợc xem nhƣ một hội chứng. Ấu trùng bị hội chứng này không thể lột vỏ hoàn toàn ra khỏi các phần phụ khi chúng thay vỏ, nhƣ không thể trút vỏ khỏi mắt, chủy hay các phần phụ khác của cơ thể, hoặc sau khi lột vỏ chúng trở nên dị tật, kết quả tạo sự cản trở khi chúng di chuyển và có thể khiến chúng bị chết. Nguyên nhân của hội chứng này không đƣợc rõ, có thể do chất lƣợng nƣớc trong bể nuôi quá bẩn hay do khẩu phần dinh dƣỡng không hợp lý. 2.4.1.6 Bệnh do động vật nguyên sinh Zoothamnium sp., Epistylis sp., Vorticella sp., Acineta sp. là những động vật nguyên sinh đƣợc biết là có khả năng gây bệnh trên ấu trùng loài tôm Macrobrachium rosenbergii. Chúng gây nên những vệt mờ đục trên tôm ấu trùng, có thể đƣợc loại bỏ khi ấu trùng lột xác, nhƣng cũng có khả năng gây cản trở quá trình lột xác và gây chết. Ấu trùng có nhiều khả năng bị tấn công hơn tôm trƣởng thành, nguyên nhân do các ao nuôi kém vệ sinh, chất lƣợng nƣớc xấu, khi cải thiện chất lƣợng nƣớc ao nuôi bệnh sẽ hết. 2.4.1.7 Bệnh do virus Cho đến ngày nay, những loài virus đƣợc phát hiện là tác nhân gây bệnh dịch trên TCX bao gồm Macrobrachium rosenbergii nodavirus (MrNV) và Extra small virus (EXV) (Qian và c.t.v., 2003); Parvolike virus (Anderson và c.t.v., 1990; Lightner và c.t.v., 1994); Infectious hypodermal and haematopancreatic necrosis virus (IHHNV) (Hsieh và c.t.v., 2006). Đối với WSSV (White Spot Syndrome Virus), TCX hoàn toàn có khả năng kháng lại mầm bệnh xâm nhiễm bằng một cơ chế đặc biệt vẫn chƣa hiểu rõ (Hameed, 2000). 2.4.1.8 Bệnh do cấu trúc lớp vỏ không bình thƣờng Lớp vỏ đƣợc cấu tạo chủ yếu bằng canxi hay có thể nói canxi chính là bộ xƣơng của loài giáp xác này. Chính vì thế nếu thành phần canxi trong lớp vỏ thay đổi, trở nên quá ít hay quá nhiều, lớp vỏ sẽ trở nên mềm hoặc bị dị dạng, cản trở sự di chuyển và 12 sự phát triển của tôm (ảnh hƣởng đến khả năng săn mồi, trốn tránh kẻ thù, khó lột vỏ, ...), có thể gây chết tôm nhƣng thƣờng ở tỉ lệ thấp. 2.7.2 Những bệnh thƣờng gặp trên tôm trƣởng thành 2.4.2.1 Bệnh tổn thƣơng lớp vỏ Bệnh này đƣợc biết bởi nhiều tên khác nhau: bệnh đốm nâu, bệnh đốm đen. Chƣa rõ nguyên nhân gây nên bệnh này, có thể do nhiều tác nhân khác nhau gây nên, bao gồm những tổn thƣơng của lớp kitin hay những bất thƣờng do cơ học, do dinh dƣỡng, do tác nhân hoá học hoặc những nhân tố khác, tạo điều kiện cho vi khuẩn hay nấm xâm nhập gây bệnh. Những con tôm bị bệnh có triệu chứng hoại tử, sƣng viêm và sau đó để lại các vết đen trên thân và trên các phần phụ khác. Môi trƣờng nƣớc quá bẩn, nhiều chất hữu cơ với mật độ vi khuẩn cao đƣợc coi là nguyên nhân gây nên sự thƣơng tổn lớp vỏ của TCX (Macrobrachium rosenbergii), bao gồm các vi khuẩn có khả năng sinh enzyme ngoại bào (lipase và protease) nhƣ Aeromonas sp., Pseudomonas sp., Vibrio sp. 2.4.2.2 Bệnh đen mang (black gill disease) Mang tôm xuất hiện những vết đen là do sự tập trung của các sản phẩm hóa học hay do quá trình nitơ hoá dẫn đến sự đen hóa cơ quan mang của tôm (Tonguthai, 1997), tôm có thể bị chết do stress vì nồng độ amonia hay nitrite trong ao nuôi, quá cao so với ngƣỡng nồng độ nitrite thấp nhất có thể gây chết tôm khoảng 2 mg/l (Tonguthai, 1997). Những nghiên cứu mô bệnh học cho thấy có sự tập trung sắt trong tế bào mang TCX, đây có thể là kết quả của sự ô nhiễm sắt trong ao nuôi. 2.4.2.3 Bệnh trắng thân (white prawn disease) Đôi khi đƣợc gọi là hội chứng trắng, chỉ tấn công TCX (Macrobrachium rosenbergii) trƣởng thành, thƣờng trên tôm cái. Bệnh tấn công làm lớp mô bên dƣới lớp kitin chuyển trắng đục và mềm nhƣng các mô cơ vẫn bình thƣờng. 2.4.2.4 Bệnh đỏ thân (red discoloration) Bệnh chỉ gây hại trên tôm trƣởng thành, làm biến đổi màu sắc phần đuôi sang màu đỏ nhạt, có thể do sự phân tán sắc tố hay mất một số sắc tố. Hiện nay chƣa xác định đƣợc tác nhân gây nên bệnh này. 2.4.2.5 Bệnh do kí sinh trùng 13 2.4.2.6.1 Protozoa Hall (1979) cho rằng Corthunia sp., Epistylis sp., Vorticella sp. là những động vật nguyên sinh gây bệnh phổ biến nhất. Thông thƣờng chúng ký sinh trên lớp vỏ bên ngoài, trong hốc mắt, râu, chân đuôi (uropod) và trứng (trên tôm cái đang mang trứng). Một khi chúng kí sinh trên thân tôm, chúng sẽ làm cản trở quá trình lột xác của tôm và có thể gây chết do thiếu oxi huyết. 2.4.2.6.2 Metazoan Macrobrachium spp. đóng vai trò nhƣ một vật chủ trung gian mang ấu trùng của loài sán lá Carnaeophallus choanophallus (Johnson, 1978). Trên tôm Macrobrachium rosenbergii trƣởng thành nuôi ở Thái Lan cũng đã phát hiện một loài sán lá ký sinh nhƣng chƣa định danh đƣợc (Nash, 1989). 2.4.2.6.3 Isopod Nhóm động vật chân chèo gây hại trên tôm nƣớc ngọt thuộc về họ Bopyridae (Johnson, 1978). Một loài Isopod tìm thấy trong mang của những con tôm bệnh đã đƣợc nghiên cứu và phân loại, có thể là loài Probopyrus buitendijki, đƣợc cho là tác nhân ký sinh trên Macrobrachium rosenbergii ở vùng Đông Nam Á. 2. 5 Bệnh đục thân Bệnh xuất hiện ở một số quốc gia và vùng lảnh thổ: Khu vực châu Á (Trung Quốc, Đài Loan, Ấn Độ, Thái Lan, Philippin, Malaisia) và vùng Caribbean (Cộng hoà Dominican, những hòn đảo phía Tây nƣớc Pháp). Gần đây bệnh đã xuất hiện tại các trại sản xuất giống của Việt Nam. Bệnh đục thân gây một số triệu chứng lâm sàng sau: Các bó cơ mờ đục (Akiyama và c.t.v., 1982; Nash và c.t.v., 1987; Brock, 1988). Xảy ra với xác xuất cao nhất ở giai đoạn ấu trùng thứ IV - VI. Tôm bỏ ăn, rớt xuống đáy bể nuôi và bị ăn thịt bởi những ấu trùng khỏe hơn. Hình dáng ngoài của tôm có màu xám xanh, bơi yếu ớt, thƣờng bơi theo đƣờng xoắn ốc. Tỉ lệ chết cao, đột ngột, có thể lên đến 100% trong vòng 5 ngày kể từ khi phát hiện có dấu hiệu bị đục cơ. 14 Lờ đờ, giảm ăn, phần cơ bụng có màu trắng đục. Vùng đuôi (telson) bị đục trƣớc và dần dần chuyển sang phần thân tôm, và sau một thời gian thì tất cả cơ phần bụng và phần đầu ngực đều chuyển sang màu trắng đục. Triệu chứng mô học o Hao mòn khối gan tụy (Bower, 1998). o Hoại tử các sợi cơ (Vijayan, 2005; Bonami, 2005; Qian, 2003). Hình 2.6: Dấu hiệu lâm sàng bệnh đục thân trên TCX (Hameed (A, C); Vijayan, 2005 (B), Cheng và Chen, 1998 (D)). (A) và (B) Sự trắng cơ xảy ra trên PL TCX, cho thấy sự biến đổi hoàn toàn màu sắc PL. (C) và (D) Sự trắng cơ xảy ra trên tôm trƣởng thành; (D) So sánh hai mẫu tôm bệnh và không bệnh đục cơ, ở trạng thái bình thƣờng có màu hơi đục, khối gan tụy có màu gạch tƣơi (hình phía trên), khi bệnh, cơ chuyển sang đục và khối gan tụy chuyển màu vàng nhạt (hình phía dƣới). Theo Tonguthai (1977), trên TCX có nhiều bệnh gây triệu chứng đục cơ: Idiopathic muscle necrosis (IMN) (Nash và c.t.v., 1987; Brock, 1988), Larval mid- cycle disease (MCD) (Anderson và c.t.v., 1990; Johson, 1979; Brock, 1988), Bacterial A B C D 15 necrosis (Aquacop, 1977), Viral disease (Anderson và c.t.v., 1990), white muscle disease (white tail disease) (Hameed, 2005). Tác nhân gây nên căn bệnh này hiện vẫn chƣa rõ. Brower (1998) cho rằng Enterobacter aerogenes có khả năng gây hiện tƣợng đục cơ trên ấu trùng TCX ở giai đoạn IV-XI, Cheng và Chen (1998) đề nghị một loài vi khuẩn giống Enterococcus (Enterococcus-like bacterium) (Hình 2.7). Gần đây dịch bệnh trắng đuôi bùng phát tại nhiều quốc gia trên thế giới, gây triệu chứng đục các bó cơ ở phần đuôi TCX. Nhiều tác giả đã nghiên cứu và công bố tác nhân chính là MrNV (Macrobrachium rosenbergii nodavirus) và XSV (extral small virus) (Yoganandhan, 2006; Vijayan, 2005); Bonami, 2005; Qian, 2003). Hiện không có bất kỳ một bài báo khoa học nào ghi nhận những biến đổi mô học trên cơ thể TCX bị đục thân, ngoại trừ dấu hiệu hoại tử các bó cơ ở phần đuôi. Hình 2.7: Hình dạng tế bào của Enterococus KM002 dƣới kính hiển vi điện tử (Cheng & Chen, 1998) Enterococcus-like bacterium là một song cầu khuẩn Gram (+), có quan hệ gần gũi với Enterococcus seriolicida, vi khuẩn giống Enterococcus này đƣợc phát hiện trên tôm bị đục thân tại Hàn Quốc (Cheng và Chen, 1998). Thực nghiệm của tác giả này cho thấy rằng khi xâm nhiễm vi khuẩn này vào Macrobrachium rosenbergii sẽ gây tỉ lệ chết cao, gây chết 100% trong vòng một tuần. MrNV là một RNA virus hình đa diện, tròn có đƣờng kính 26-27 nm, một chủng trong họ Nodaviridae (Hình 2.8). Bộ gen gồm 2 phân tử RNA-1 và RNA-2 kích thƣớc tƣơng ứng là 2,9 và 1,3 kb. Vỏ capsid là một loại prôtein có trọng lƣợng phân tử 43 kDa (Bonami và c.t.v., 2005). Là một RNA virus, MrNV thực hiện quá trình sao chép trong nguyên sinh chất của hầu hết các tổ chức mô cơ thể TCX. XSV, một tiểu 16 thể giống virus có liên quan đến MrNV, có hình đa diện đƣờng kính 14-16 nm. Bộ gen của XSV là một phân tử RNA kích thƣớc 0,9 kb, mã hoá tạo nên vỏ capsid là hai chuỗi polipeptide trọng lƣợng phân tử 16 và 17 kDa (Bonami và Widada, 2004). Là một tiểu thể giống virus có kích thƣớc nhỏ, lại không mang các đoạn gen mã hoá enzyme cho quá trình sao chép, Widada và Bonami (2004) cho rằng cần có sự hiện diện của MrNV nhƣ là một yếu tố xúc tác không thể thiếu cho quá trình sao chép XSV trong các tổ chức mô TCX. Tuy vậy quan hệ này vẫn chƣa đƣợc hiểu rõ ràng. Hình 2.8: Hình dạng XSV (A) và MrNV (B) dƣới kính hiển vi điện tử (Bonami và c.t.v., 2005). Bar = 100 nm. Vị trí của MrNV trong họ Nodaviridae đƣợc ghi nhận trong Hình 2.9. Hình 2.9: Vị trí của Macrobrachium rosenbergii nodavirus (MrNV) trong họ nodavirus (Bonami, 2005) A B A 17 2. 6 Các phƣơng pháp nghiên cứu mô học 2.6.1 Phƣơng pháp mô học truyền thống Phƣơng pháp mô học truyền thống là phƣơng pháp dùng kính hiển vi quang học (độ phóng đại tối đa 1.200 lần) quan sát cấu trúc mô, cấu trúc tế bào, xác định các trạng thái bệnh lý của mô - tế bào. Mẫu đƣợc cố định trong dung dịch Davision (mẫu giáp xác) hoặc dung dịch Bouin (mẫu cá), sau đó đem xử lý, đúc parafin, cắt và nhuộm. Quan sát lát cắt bằng kính hiển vi quang học. 2.6.2 Phƣơng pháp phóng xạ tự chụp Phƣơng pháp này dùng để khảo sát các hiện tƣợng bên trong mẫu mô bằng cách dùng phóng xạ. Ngƣời ta đƣa các tiền chất là các phân tử phóng xạ nhƣ: acid amin phóng xạ, nucleotide phóng xạ vào tế bào. Các phân tử này đƣợc tế bào tổng hợp thành các phân tử có cấu trúc lớn hơn. Tiêu bản đƣợc phủ một lớp tráng (lớp phim) và đƣợc bảo quản trong hộp tối. Các hạt Bromide bạc khi gặp phóng xạ sẽ hình thành các hạt bạc đen. Cấu trúc có chứa phân tử phóng xạ sẽ thấy có những hạt bạc đen. Mẫu đƣợc quan sát dƣới kính hiển vi quang học hoặc kính hiển vi điện tử. Phƣơng pháp này cho biết nhiều hoạt động của nhiều cấu trúc ở cấp độ vi thể. 2.6.3 Phƣơng pháp hóa mô miễn dịch Dựa trên lý thuyết kết gắn kháng nguyên với kháng thể. Kháng thể đƣợc dùng có chất đánh dấu để phát hiện và định vị các prôtein đặc hiệu. Tùy theo chất đánh dấu (huỳnh quang, men, hạt vàng) mà tiêu bản đƣợc quan sát ở các loại kính hiển vi khác nhau. 2.6.4 Phƣơng pháp lai tại chổ Kỹ thuật này phù hợp để phát hiện các DNA bất thƣờng. Chuỗi DNA đƣợc biến tính bằng nhiệt độ hay hóa chất tạo dạng sợi đơn. Sau đó đƣợc gắn với đoạn dò (probe) chuyên biệt có đánh dấu. 18 2. 7 Cấu trúc tế bào chơ quan gan tụy và mang tôm càng xanh 2.7.1 Cấu trúc tế bào cơ quan gan tụy Hình 2.10: Cấu trúc tế bào cơ quan gan tụy TCX (Cheng và Chen, 1998). Hp - tế bào F; Hpb - tế bào B; Hbr - tế bào R; Mfn – nhân tế bào biểu mô; Mef - lớp tế bào biểu mô; Sin – xoang tạo máu; Lm – lumen. Haematoxylin và Eosin. Hình 2.10 mô tả cấu trúc tế bào cơ quan gan tụy (Cheng và Chen, 1998) trên Macrobrachium rosenbergii không mang bệnh, cho thấy khá rõ cấu trúc của các tổ chức tế bào khác nhau. Ở tôm bình thƣờng không mang bệnh, tiếp diện ngang của khối gan tụy cho thấy một cấu trúc gồm nhiều tuyến hình ống (tubule) liên kết chặt chẻ với nhau bằng một lớp biểu mô liên kết đơn. Tiếp diện ngang của thành trong của các tubule này có dạng hình hoa thị thông đến bộ máy tiêu hóa. Các tế bào trong khối gan tụy đƣợc phân thành nhiều nhóm khác nhau: nhóm tế bào E (E-cells) (embryonic cells) ở giai đoạn đầu của sự phát triển (tế bào mầm), tìm thấy ở biên của tuyến hình ống; nhóm tế bào F (F-cells) (Fibrillezellen cells) bắt màu đen và không có không bào trên tiêu bản quan sát dƣới kính hiển vi quang học; nhóm tế bào B (B-cells) (Blasenzellen cells) hình cầu trong chứa dịch chất tiêu hóa; nhóm tế bào R (R-cells) (Restzellen cells) dự trữ năng lƣợng chứa những giọt lipid và mạng lƣới nội chất nhám. Một vài tế bào trên tiêu bản đang trong giai đoạn phân chia tế bào. Những kẻ hở giữa các tuyến hình ống đƣợc xem là bình thƣờng. 19 2.7.2 Cấu trúc tế bào cơ quan mang Hình 2.11: Cấu trúc tế bào cơ quan mang (Li, Zhao và Yang, 2006), cho thấy sự sắp xếp tuần tự của các phiến mang (L - lamellae) và các khoảng trống (ILS - interlamellar space). HC - hemocyte; PC - pillar cell. Haematoxylin và Eosin, x 20. TCX có 16 sợi mang, mỗi bên 8 sợi, dài 4 – 8 mm ở tôm chƣa trƣởng thành. Bề mặt của mỗi sợi mang đƣợc bao phủ bởi một lớp kitin mỏng, phía dƣới lớp kitin là một lớp biểu mô đơn. Trên mỗi sợi mang có nhiều phiến mang (lamellae), bên trong chứa hồng cầu và biểu mô (Hình 2.11). 20 Phần III BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM VÀ PHƢƠNG PHÁP THỰC HIỆN 3.1 Bố trí thí nghiệm 3.1.1 Thời gian và địa điểm thực hiện Thời gian: từ 4/2007 đến 8/2007. Địa điểm phân tích: Trung tâm Quốc gia Quan trắc Cảnh báo môi trƣờng và Phòng ngừa dịch bệnh thủy sản khu vực Nam Bộ (trực thuộc Viện nghiên cứu nuôi trồng thuỷ sản II). Địa điểm thu mẫu: o Trại giống 1: Thị xã Long Xuyên, tỉnh An Giang. o Trại giống 2: Huyện Châu Thành, An Giang. o Trại giống 3: Xã Quới Sơn, Huyện Châu Thành, Bến Tre. o Trại giống 4: Xã An Hiệp, Huyện Châu Thành, Bến Tre. 3.1.2 Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm đƣợc chia thành hai nhóm: Thu mẫu định kỳ: tại trại giống chú Hùng và trại giống Hải Duyên. o Tại trại giống 1: Thu mỗi lần 4 mẫu x 3 lần. o Tại trại giống 2: thu 3 lần, lần 1 thu 9 mẫu (B1  B9), lần 2 thu 5 mẫu (B2, B3, B5, B6,B7), lần 3 thu 1 mẫu (B6). Thu mẫu bệnh: tại trại giống 3 và trại giống 4. 3.2 Vật liệu, trang thiết bị, dụng cụ, hóa chất 3.2.1 Trang thiết bị, dụng cụ, hoá chất cần chuẩn bị 3.2.1.1 Trang thiết bị Máy xử lý mẫu tự động Bình rót parafin Bộ phận làm lạnh mẫu Máy cắt mẫu microtome 21 Nồi nƣớc có chỉnh nhiệt độ Bàn ấm cố định mẫu trên lam kính Tủ ấm Máy nhuộm mẫu tự động Kính hiển vi quang học 3.2.1.2 Dụng cụ Khung chứa mẫu có nấp đậy Đèn cồn Kéo Panh Khung inox dùng để đúc mẫu Lam Lamel 3.2.1.3 Hoá chất Cồn 70% Cồn 80% Cồn 90% Cồn tuyệt đối 99,5% Chloroform Parafin Xylen Thuốc nhuộm Hematoxylin, Eosin Keo dán: Baum Canada Formalin Acid acetic glacial Nƣớc cất 3.2.2 Phƣơng pháp tiến hành 3.2.2.1 Lấy mẫu 22 Khối gan tụy của tôm bị tiêu hủy rất nhanh sau khi tôm chết (sự tiêu hủy mô do các enzyme tiết ra từ các tế bào gan tụy đã chết), điều này có nghĩa là cấu trúc của khối gan tụy khi tôm chết sẽ bị phân huỷ rất nhanh. Do đó mẫu phải đƣợc cố định nhanh khi tôm vẫn còn sống, để đảm bảo cấu trúc mô học của khối gan tụy không bị thay đổi. Dung dịch Davision có thành phần nhƣ sau: Acid acetic glacial : 115ml Cồn 95% : 330ml Formalin : 200ml Nƣớc cất : 335ml Hoà tan các thành phần lại với nhau và bảo quản ở nhiệt độ phòng. Theo FAO (2000), nên ngâm trực tiếp ấu trùng và hậu ấu trùng (Postlarvae) (PL) giai đoạn sớm trong dung dịch cố định với tỉ lệ tối thiểu là 10 thể tích dung dịch cố định với 1 thể tích mô tôm. Thể tích này rất quan trọng trong việc bảo quản mẫu có hiệu quả, việc cố gắng làm giảm tỉ lệ này để giảm chi phí có thể làm cho mẫu mô không đạt yêu cầu cho quá trình đọc mẫu. 3.2.2.2 Xử lý mẫu Mẫu tôm post sau khi cố định xong tiến hành xử lý mẫu. Mẫu đƣợc lấy ra khỏi dung dịch cố định và tiến hành xử lý mẫu, với sơ đồ nhƣ sau: Tổng thời gian xử lý mẫu là 12,5 giờ. Sau khi xử lý xong tiến hành đúc mẫu. 3.2.2.3 Cách đúc mẫu Mục đích của việc đúc mẫu là làm cho mẫu tôm đƣợc cố định để có thể cắt với lát mỏng (khoảng 5µm) cho việc quan sát trên kính hiển vi dễ dàng, chính xác không làm thay đổi cấu trúc của các tổ chức tế bào. Cần phải thực hiện tuần tự theo các bƣớc sau: 23 Đặt mẫu vào đáy khuôn inox sao cho mặt tiếp xúc của mẫu với đáy khuôn là lớn nhất. Thực hiện bƣớc này tốt thì hình ảnh khối gan tụy và cơ quan mang có diện tích lớn, dễ quan sát cấu trúc mô bên trong. Rót parafin vào khuôn, cố gắng giữ mẫu sao cho mẫu ở trung tâm khuôn (để khi tiến hành cắt mẫu và quan sát trên kính hiển vi đƣợc tốt hơn), đậy nắp cassette lại. Đặt khuôn inox lên trên bề măt của dụng cụ làm lạnh, đợi khoảng 15 phút sau tách khối parafin ra đặt trực tiếp lên bàn lạnh. 3.2.2.4 Cách cắt mẫu Dùng máy cắt microtome, lát cắt có độ dày 5 – 6 micromet. Lát cắt đƣợc đặt lên lam, cho vài giọt cồn 70% lên, làm căng bề mặt mẫu bằng cách cho qua bể nƣớc ấm khoảng 40oC, sau đó đính mẫu lên lam và đặt vào bàn ấm ở nhiệt độ 40oC trong vòng 4 đến 6 giờ thì tiến hành nhuộm mẫu. 3.2.2.5 Nhuộm mẫu Theo phƣơng pháp của Sheenhan và Hrapchak (1980), dùng thuốc nhuộm là Haematoxylin và Eosin. Sơ đồ nhuộm mẫu: Nhỏ một giọt keo Boume Canada ngay lên trên tiêu bản mẫu và đặt lamel lên, ép sát lame lên lam kính, cố gắng tránh sự hình thành bọt khí bên trong. 3.2.2.6 Quan sát trên kính hiển vi Đặt tiêu bản lên kính hiển vi, tiến hành quan sát hình thái cấu tạo tế bào khối gan tụy, cơ quan mang, cơ của mẫu. 24 Phần IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết quả Bằng phƣơng pháp mô học truyền thống, chúng tôi đã khảo sát cấu trúc tế bào TCX (Macrobrachium rosenbergii De Man 1879) bị bệnh đục thân và không bị bệnh đục thân nhƣng có những dấu hiệu bất thƣờng. Tổng số mẫu tôm chúng tôi thu đƣợc là 34 mẫu ấu trùng và hậu ấu trùng tại An Giang và Bến Tre, các mẫu ấu trùng tôm đƣợc thu đều có dấu hiệu giảm ăn, ít vận động, bơi lội thất thƣờng (bơi lờ đờ, bơi theo đƣờng xoắn ốc, …) trong đó có 11 mẫu tôm ấu trùng và hậu ấu trùng thu tại Bến Tre bị đục thân. 4.1.1 Kết quả khảo sát mô học mẫu tôm càng xanh thu định kỳ không có dấu hiệu đục thân Các đặc điểm chung của mẫu ấu trùng và hậu ấu trùng TCX thu tại An Giang đƣợc trình bày trong Bảng 4.1. 25 Bảng 4.1: Dấu hiệu lâm sàng mẫu tôm thu ngẫu nhiên tại An Giang Trại giống Đợt Kí hiệu Ngày thu Tuổi thu (ngày) Tình hình chung Dấu hiệu lâm sàng mẫu thu 1 I B1 16/06/2007 18 (L) - Sản xuất giống theo qui trình nƣớc xanh cải tiến. - Chất lƣợng nƣớc bể nuôi không đƣợc đảm bảo, ban đầu tốt, tảo phát triển nhiều, sau chất lƣợng suy giảm, tảo không phát triển đƣợc, màu nƣớc chuyển sang trong và nâu. - Tỉ lệ chết tăng dần theo sự phát triển của ấu trùng tôm TCX. - Không bị đục thân. - Lờ đờ, biếng ăn, biếng động. - Mất phƣơng hƣớng, bơi xoay vòng. B2 -nt- 19 (L) B3 -nt- 20 (L) B4 -nt- 21 (L) II B1 29/06/2007 31 (L) B2 -nt- 32 (L) B3 -nt- 33 (L) B4 -nt- 34 (L) 2 I B1 16/06/2007 PL 4 B2 -nt- 16 (L) B3 -nt- 16 (L) B4 -nt- PL 5 B5 -nt- 16 (L) B6 -nt- 14 (L) B7 -nt- 17 (L) B8 -nt- 17 (L) B9 -nt- 14 (L) II B2 29/06/2007 39 (PL) B3 -nt- 27 (L) B5 -nt- 40 (PL) B6 -nt- 40 (PL) B7 -nt- 37 (PL) III B6 06/07/2007 49 (PL) Bảng 4.1 cho thấy tất cả các mẫu TCX thu đƣợc ở An Giang đều không có dấu hiệu của bệnh đục thân, kết quả phân tích mô học của các mẫu TCX này sẽ làm căn cứ để xác định những khác biệt về sự thay đổi cấu trúc mô học của TCX bệnh đục thân so với bình thƣờng và so với các mẫu bệnh không gây hiện tƣợng đục thân. Kết quả phân tích mô học các mẫu TCX thu định kỳ tại An Giang đƣợc ghi nhận trong Bảng 4.2. 26 Bảng 4.2: Kết quả phân tích mô học mẫu TCX thu định kỳ tại An Giang Trại giống Đợt Số thứ tự Kí hiệu Kết quả phân tích mô học Thể ẩn trong gan tụy Thể vùi trên mang Hoại tử cơ Ký sinh trùng trên mang 1 I 1 B1 - - - - 2 B2 25% (+) - - - 3 B3 - - - - 4 B4 - - - - II 5 B1 - - - - 6 B2 - - - - 7 B3 20% (+) - - 20% (+) 8 B4 - - - - 2 I 9 B1 20% (+) - - - 10 B2 10% (+) - - - 11 B3 - - - - 12 B4 - - - - 13 B5 - - - - 14 B6 - - - - 15 B7 20% (+) - - - 16 B8 25% (+) - - - 17 B9 55% (+) - - - II 18 B2 - - - - 19 B3 - - - - 20 B5 - - - - 21 B6 10% (+) - - - 22 B7 18% (+) - - - III 23 B6 - - - - Ghi chú: (-) Không có dấu hiệu bất thƣờng. (+) Tỉ lệ bất thƣờng < 30%. (++) Tỉ lệ bất thƣờng 30% - 60%. (+++) Tỉ lệ bất thƣờng > 60%. 27 Kết quả phân tích cho thấy có 9/23 (39,13%) mẫu có thể ẩn bên trong nhân (INOs) của các tế bào trên khối gan tụy, 1/23 (4%) mẫu có ký sinh trùng trên cơ quan mang. Chỉ có một mẫu (mẫu số 7) có cả hai biểu hiện ký sinh trùng cơ quan mang và thể ẩn bên trong nhân của các tế bào trên khối gan tụy. Không có mẫu nào biểu hiện thể vùi bên trong nhân (INIs) của các tế bào trên khối gan tụy và cơ quan mang; không có bất thƣờng trên cơ quan mang và các khối cơ. Tỉ lệ bất thƣờng (thể ẩn trên khối gan tụy là thấp (+). Hình 4.1: Cấu trúc tế bào tổ chức mô cơ TCX. MI - cơ cắt ngang, MII - cơ cắt dọc, N - nhân của các tế bào cơ. Nhuộm Haematoxylin và Eosin, x 40. 28 Hình 4.1 Mô tả cấu trúc bình thƣờng của mô TCX không bệnh. Lát cắt cho thấy sự sắp xếp xen kẻ giữa các bó cơ ngang (MI) và dọc (MII), các khoảng trống giữa các sợi cơ là bình thƣờng, các hạt bắt màu đậm là hạch nhân tế bào cơ (N). Hình 4.2 mô tả cấu trúc mô học bình thƣờng của khối gan tụy TCX. Các tuyến gan tụy xếp kề nhau, giữa chúng có một lớp tế bào liên kết (Mef). Thành tuyến đƣợc cấu tạo từ nhiều loại tế bào: tế bào E, F, R, B. Nhìn chung, mô tế bào gan tụy đang ở giai đoạn phát triển, nhiều tế bào mầm (tế bào E), ít tế bào dự trử (R), ít tế bào B. Các khoảng trống bên trong khối gan tụy đƣợc xem là bình thƣờng. Hình 4.2: Các tổ chức tế bào bình thƣờng của cơ quan gan tụy. B – B-cells, E – E- cells, F – F-cells, LU – lumen, MII - cơ cắt dọc, Mef – mô liên kết, N(Mef) - nhân tế bào mô liên kết, R – R-cells. Nhuộm Haematoxylin và Eosin. x 40. 29 Sự xuất hiện các thể ẩn bên trong nhân đƣợc ghi nhận trong Hình 4.3 và Hình 4.4. Hình 4.3a: Thể ẩn bên trong nhân của các tế bào trên gan tụy TCX. B–B-cells, E– E-cells, IONs-thể ẩn bên trong nhân của các tế bào trên khối gan tụy, LU - lumen, MII - cơ cắt dọc, R – R-cells. Nhuộm Haematoxylin và Eosin, x 40 (A), x 100 (B). B A 30 Hình 4.3b: Thể ẩn bên trong nhân của các tế bào trên khối gan tụy TCX. B – B-cells, E – E-cells, F – F-cells, IONs - thể ẩn bên trong nhân của các tế bào trên khối gan tụy, LU - lumen, R – R-cells. Nhuộm Haematoxylin và Eosin. x 40. 31 Trên cơ quan mang bình thƣờng, các sợi mang (lamellae) sắp xếp đều đặng xen kẻ với những khoảng trống (interlamellar space) (ILS). Bên ngoài các sợi mang có một lớp kitin mỏng bao bọc, kế lớp kitin là lớp biểu mô mỏng bên trong chứa các tế bào hồng cầu (hemocyte) (HC). Hình 4.4 cho thấy các tổ chức tế bào khác nhau bên trong cơ quan mang. Hình 4.4: Hình thái mô học cơ quan mang TCX. ILS – interlamellar space, HC – Hồng cầu; L – phiến mang. Nhuộm Haematoxylin và Eosin, x 40. 32 4.1.2. Kết quả khảo sát mô học tôm càng xanh có dấu hiệu đục thân Trong 11 mẫu TCX thu tại Bến Tre, ngoài những dấu hiệu đục thân, ấu trùng TCX còn có những triệu chứng tƣơng tự các mẫu thu tại An Giang: lờ đờ, giảm ăn, bất động, …. Kết quả khảo sát mô học đƣợc ghi nhận trong Bảng 4.3. Bảng 4.3: Kết quả phân tích mô học 11 mẫu TCX bị bệnh đục thân Trại giống 3 STT Ngày thu Tuổi thu (ngày) INOs trong khối gan tụy INIs trong cơ quan mang Hoại cơ 1 25/07/2007 25 (L) - 5% (+) - 2 -nt- -nt- - 20% (+) 50% (++) 3 26/07/25007 -nt- 10% (+) - 25% (+) Trại giống 4 4 27/07/2007 20 (L) - - 15% (+) 5 -nt- 20 (L) - - 10% (+) 6 -nt- 17 (L) 15% (+) 10% (+) 50% (++) 7 -nt- 10 (PL) - 10% (+) 5% (+) 8 28/07/2007 21 (L) - - 30% (++) 9 -nt- 21 (L) - - 5% (+) 10 -nt- 18 (L) - - 15% (+) 11 -nt- 19 (L) - 10% (+) - Ghi chú: (-) Không có dấu hiệu bất thƣờng. (+) Tỉ lệ bất thƣờng < 30%. (++) Tỉ lệ bất thƣờng 30% - 60%. (+++) Tỉ lệ bất thƣờng > 60%. L (larvae) ấu trùng; PL (postlarvae) hậu ấu trùng; INIs (intranuclear inclusion bodies) thể vùi bên trong nhân tế bào; INOs (intranuclear oclusion bodies) thể ẩn bên trong nhân tế bào. Cũng theo quy trình nƣớc xanh cải tiến, tình hình chung tại các trại giống ở Bến Tre không khác biệt nhiều so với ở An Giang, số lƣợng ấu trùng giảm do chết đáng kể. Đặc biệt xuất hiện bệnh đục thân tại vài bể ƣơng. Kết quả phân tích mô học cho thấy trong 11 mẫu ấu trùng và hậu ấu trùng thu đƣợc, có 5/11 mẫu (45,45%) có các thể vùi xuất hiện trong nhân của các tế bào trên cơ quan mang, 9/11 mẫu (81,82%) biểu hiện 33 sự hoại tử cơ, 2/11 (18,2%) mẫu có các thể ẩn trong nhân cơ quan gan tụy. Trong đó chỉ có 3/11 mẫu (27,3%) vừa biểu hiện hoại tử khối cơ vừa có các thể vùi bên trong nhân của các tế bào trên cơ quan mang, 1/11 (9,1%) mẫu có cả ba biểu hiện hoại tử cơ, thể vùi bên trong nhân của các tế bào trên cơ quan mang và thể ẩn bên trong nhân của các tế bào gan tụy. Hình 4.5: Thể vùi bên trong nhân (INIs) của các tế bào trên cơ quan mang TCX (mủi tên). Nhuộm Haematocylin và eosin, x40 (A), x10 (B). A B 34 Hình 4.5 cho thấy các thể vùi bên trong nhân (INIs) của các tế bào trên các phiến mang. Dấu hiệu thể vùi bên trong nhân này lần đầu tiên đƣợc ghi nhận trên đối tƣợng TCX. Ngoài biểu hiện thể vùi bên trong nhân, tiêu bản quan sát còn cho thấy nhiều mẫu thu đƣợc có biểu hiện hoại tử cơ (>80%). Các bó cơ hoại tử là dấu hiệu chung phát hiện đƣợc trên đối tƣợng TCX bị đục thân (Hình 4.6). Hình 4.6: Sự hoại tử cơ xảy ra trên TCX bị đục thân. MN (Muscle necrosis) hoại cơ, M (Muscle) cơ, HP (Hepatopancreas) khối gan tụy, DT (digestive tract) hệ thống tiêu hoá, C (Cutin) lớp kitin. Nhuộm Haematoxylin và Eosin, x 10 (A), x40 (B, C, D). 4.2 Thảo luận So sánh hai bảng kết quả phân tích mô học (Bảng 4.2 và Bảng 4.3), cho thấy có sự khác biệt. Ở Bảng 4.2, kết quả phân tích mô học mẫu tôm thu tại An Giang, có sự xuất hiện các thể ẩn bên trong nhân trên các tế bào gan tụy, chiếm 39,1%; không có các dấu hiệu hoại tử cơ, không xuất hiện các thể vùi trong nhân của các tế bào cơ quan mang. Ngƣợc lại, kết quả ở Bảng 4.3 cho thấy tần số xuất hiện hoại tử cơ cao (>80%), A C D B 35 ngoài ra, sự xuất hiện các thể vùi trong nhân của các tế bào trên cơ quan mang có tần số lập lại khá cao (45,45%). Kết quả so sánh đƣợc trình bày trong Bảng 4.1. Bảng 4.4: So sánh sự bất thƣờng trên các mẫu TCX bị đục thân và không bị đục thân Mẫu không bị đục thân thu tại An Giang Mẫu bị đục thân thu tại Bến Tre - Tỉ lệ mẫu xuất hiện thể ẩn trong tế bào gan tụy là 9/23 (39,13%). - Không có sự thay đổi cấu trúc mô học trên cơ quan mang; không xuất hiện thể vùi trong tế bào mang. - Không có sự thay đổi cấu trúc mô học trên các khối cơ. - Tỉ lệ mẫu xuất hiện thể ẩn trong tế bào gan tụy là 2/11 (18,18%). - Tỉ lệ mẫu xuất hiện thể vùi trong tế bào mang là 5/11 (45,45%). - Tỉ lệ mẫu bị hoại tử cơ là 9/11 (81,81%). Nhân tế bào là nơi điều khiển quá trình hoạt động của tế bào, là trung tâm hoạt động, nơi xảy ra các phản ứng sinh hóa quan trọng. Là nơi điều hòa hoạt động của tế bào, nhân chứa các yếu tố di truyền xác định tính trạng của tế bào ấy. Màng nhân dạng kép bao gồm hai màng cơ bản, bao bọc vật liệu di truyền (DNA) bên trong. Màng nhân đóng vai trò quan trọng trong việc điều hòa vận chuyển vật chất từ tế bào chất vào nhân và ngƣợc lại. Kích thƣớc các lổ trên màng nhân rất nhỏ, một phần tử bên ngoài muốn vào trong nhân phải đƣợc chuyên chở qua các kênh vận chuyển. Virus là một cấu trúc đặc biệt siêu nhỏ có khả năng xâm nhập vào trong nhân tế bào vật chủ, điều khiển hoạt động di truyền của tế bào bởi bản chất của virus là một đoạn gen mang mật mã di truyền (DNA hay RNA). Hsieh và c.t.v. (2006) công bố một trƣờng hợp nhân tế bào gan tụy xuất hiện thể vùi bên trong nhân trên đối tƣợng TCX do virus IHHNV (infectious hypodermal and haematopoietic necrosis virus). Ngoài dấu hiện các thể vùi bên trong nhân của các tế bào trên khối gan tụy, IHHNV còn tấn công lên cấu trúc cơ gây hoại tử. Tôm bị nhiễm IHHNV tiêu thụ thức ăn kém, tôm dần trở nên yếu hơn và dễ dàng bị sốc do môi trƣờng sống thay đổi (do biến đổi nhiệt độ (mƣa gió thất thƣờng, khoảng chênh lệch nhiệt độ ngày và đêm lớn) hoặc do nguồn nƣớc bị nhiễm khuẩn và quá nghèo tảo, …) dẫn đến chết. Theo dõi qui trình chăm sóc tại các trại tôm, chúng tôi đã ghi nhận nhiều 36 yếu tố không thuận lợi cho ấu trùng tôm phát triển bình thƣờng. Thứ nhất, thời điểm chúng tôi thu mẫu nhằm vào vụ nghịch, điều kiện thời tiết không thuận lợi, thời tiết thất thƣờng, lúc mƣa nhiều, không khí ẩm ƣớt, lúc rất nắng, nhiệt độ lên đến trên 35oC (trong nhà ƣơng giống). Một số bể ƣơng tảo chết hoàn toàn, màu nƣớc trở nên trong và nâu. Khảo sát cấu trúc tế bào TCX có dấu hiệu đục thân tại Bến Tre, kết quả cho thấy có xuất hiện các thể vùi bên trong nhân cơ quan mang, tế bào cơ quan gan tụy bình thƣờng và có sự xuất hiện hoại tử cơ. Theo các tác giả Vijayan (2005); Qian và c.t.v. (2003); Bonami và c.t.v., (2005), dấu hiệu đục cơ là dấu hiệu chính của bệnh đục thân trên TCX. Cũng theo các tác giả này, có hai loại virus gây nên bệnh đục cơ trên TCX đƣợc phát hiện gần đây là Macrobrachium rosenbergii nodavirus (MrNV) và Extral small virus (XSV). Tuy nhiên, các tác giả chỉ công bố hình thái mô học bệnh đục thân trên cơ hoại tử mà không có mô tả sự thay đổi trên mang và gan tụy nhƣ thế nào. Theo Hsieh và c.t.v. (2006), có năm loại virus nhiễm trên TCX: IHHNV, HPV, WSSV, MrNV và XSV. Đồng thời các mẫu TCX bị đục thân cũng đƣợc xét nghiệm MBV với kỹ thuật PCR với mồi đặc hiệu của MBV (Monodon baculovirus), kết quả không phát hiện ra MBV trên mẫu tôm này. Cheng và Chen (1998) mô tả sự hoại tử các tế bào gan tụy và sự mêlanin hóa cùng với sự tập trung của các tế bào hồng cầu tại các mô liên kết giữa các tuyến hình ống và các khoảng trống trong khối gan tụy. Theo các tác giả này, sự biến đổi là do một loại song cầu khuẩn giống Enterococcus (Enterococcus-like bacterium) gây ra. Tôm bệnh có biểu hiện chậm lớn, giảm ăn, kém hoạt động, bị đục cơ và chết. Tiêu bản mô học mẫu tôm bệnh này cho thấy sự mêlanine hóa các mô liên kết nối các tuyến hình ống của khối gan tụy, sự hoại tử cơ kèm theo dấu hiệu mêlanine hóa các sợi cơ. 37 Phần V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Qua kết quả khảo sát các mẫu tôm ấu trùng bị đục cơ và không bị đục cơ cho phép ghi nhận nhƣ sau: Trên các mẫu ấu trùng và hậu ấu trùng TCX không bị bệnh đục thân nhƣng có những dấu hiệu bất thƣờng (ít ăn, ít vận động, …), có xuất hiện các thể ẩn bên trong nhân của các tế bào trên cơ quan gan tụy, ngoài ra cũng ghi nhận không có sự xuất hiện các thể vùi bên trong nhân tế bào mang và cũng không ghi nhận những bất thƣờng trên cơ quan cơ. Trên các mẫu ấu trùng và hậu ấu trùng TCX bị bệnh đục thân có xuất hiện sự hoại tử cơ (81,81% tổng số mẫu), có xuất hiện các thể vùi bên trong nhân của các tế bào trên cơ quan mang (45,45% tổng số mẫu), có xuất hiện các thể ẩn bên trong nhân của các tế bào gan tụy (18,18% tổng số mẫu). Đề xuất Điều kiện thời gian và kinh phí có hạn, chúng tôi chỉ dừng lại ở việc khảo sát cấu trúc mô các cơ quan trên tôm ấu trùng là chủ yếu, kết quả trên chỉ mới là bƣớc đầu. Do đó để xác định chính xác tác nhân gây bệnh đục thân, chúng tôi xin có một số đề nghị sau: Khảo sát trên số lƣợng mẫu nhiều hơn trong suốt chu kỳ ƣơng để có thể xác định chính xác giai đoạn nhiễm bệnh của ấu trùng. Tiến hành song song các phƣơng pháp RT-PCR và mô học trên các mẫu ấu trùng bệnh đục thân để có thể xác định chính xác mầm bệnh nhiễm trên ấu trùng tôm càng xanh bệnh đục thân. 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1. Nguyễn Việt Thắng, 1993. Một số đặc điểm sinh học và ứng dụng qui trình kỹ thuật sản xuất giống TCX (Macrobrachium rosenbergii De Man 1879) ở đồng bằng Nam Bộ. Luận án phó tiến sĩ khoa học nông nghiệp, trƣờng đại học thủy sản Nha Trang, Việt Nam, 214 trang. 2. Nguyễn Việt Thắng, 1997. Đặc điểm sinh học và kỹ thuật sản xuất giống tôm càng xanh ở Đồng Bằng Nam Bộ. BCKH. 3. Phạm Duy Lãm, 2005. Ứng dụng kỹ thuật RT-PCR xác định Macrobrachium rosenbergii nodavirus (MrNV) và Estra small virus (XSV) trên TCX (Macrobrachium rosenbergii). Khoá luận tốt nghiệp kỹ sƣ công nghệ sinh học, trƣờng đại học Nông Lâm, TP. Hồ Chí Minh, Việt Nam, 42 trang. 4. FAO, 2001. Hướng dẫn chuẩn đoán bệnh của động vật thuỷ sản Châu Á (Sách dịch từ tài liệu kỹ thuật thuỷ sản của FAO, số 402, phần bổ xung 2). Nhà xuất bản Nông Nghiệp, Hà Nội, Việt Nam, 240 trang. Tiếng Anh 5. Aquacop, 1977. Macrobrachium rosenbergii De Man culture in Polynesia: progress in developing a mass intensive larval rearing technique in clear water. proceedings of the World Mariculture Society 8, 311-326. 6. Arcier J. M., Herman F., Lightner D. V., Redman R., Mari J., Bonami J. R., 1999. A viral disease associated with mortalities in the hatchery – reared postlarvae of the giant freshwater prawn Macrobrachium rosenbergii. Dis Aquat Org 38: 177 – 181. 7. Bhavan P. S., Geraldine P., 2000. Histophathology of the hepatopancreas and gills of the prawn Macrobrachium malcolmsonii exposed to endosulfan. Aquatic toxicology 50, India, pages 331-339. 8. Bonami J.R., Shi Z., Qian D. and Widada J.S., 2005. White tail disease of the giant freshwater prawn, Macrobrachium rosenbergii: separation of the associated virions and characterization of MrNV as a new type of nodavirus. Journal of Fish Disease, 28, pages 23-31. 39 9. Brock J. A., D. V. Lightner and Bell T. A., 1983. A review of four virus (BP, MBV, BMN and IHHNV) diseases of penaeid shrimp with particular reference to clinical significance, diagnosis and control in shrimp aquaculture. Proc. 71 st Intl. Council for the exploration of the sea, C. M. 1983/Gen: 10/1 – 18. 10. Brower S. M., 1998. Synopsis of infectious diseases and parasites of commercially exploited shellfish: Larval Mid-cycle Disease (MCD) of freshwater shrimp. URL: 11. Cheng W. and Chen J.-C., 1998. Isolation and characterization of an Enterococcus- like bacterium causing muscle necrosis and mortality in Macrobrachium rosenbergii in Taiwan. Diseases of Aquatic Organisms, 34, pages 93-101. 12. Cheng W. and Chen J.-C., 2002. The virulence of Enterococcus to freshwater prawn Macrobrachium rosenbergii and its immune resistance under ammonia stress. Fish and Shellfish Immunology, 12, pages 97-109. 13. Cheng W., Chen S.-M., Wang F.-I., Hsu P.-I., Liu C.-H., Chen J.-C., 2003. Effects of temperature, pH, salinity and ammonia on the phagocytic activity and clearance efficiency of giant freshwater prawn Macrobrachiu rosenbergii to Lactococcus garvieae. Aquaculture 219, pages 111-121. 14. FAO, 2002. Farming freshwater prawns. A manual for the culture of the giant river prawn (Macrobrachium rosenbergii). FAO FISHERIES TECHNICAL PAPAR, 428. 15. Forster J. R. M. and J. F. Wickens 1972. Prawn culture in the United Kingdom, Laboratory Leaf let (new series), Directorate of Fisheries Research (Great Britan), 27: 32 pp. 16. Fujimura T. and Okamoto H., 1972. Notes on progress made in developing a mass culturing technique for Macrobrachium rosenbergii in Hawai. In: T. V. R. Pillay (Editor), Coastal Aquaculture in the Indo-Pacific Region. Fishing News (Books) Ltd., London. p. 313-327. 17. Hameed A. S. S., Charles M. X., Anilkumar M., 2000. Tolerance of Macrobrachium rosenbergii to white spot syndrome virus. Aquaculture 183, pages 207-213. 40 18. Hameed A. S. S., 2003. White tail disease of Macrobrachium rosenbergii. Aquaculture Division, department of Zoology, C. Abdultlakeen college, Melvisharam-632 509, Tamil Nadu, India, 3 pages. 19. Hsieh C. Y., Chuang P. C., Chen L. C., Tu C., Chien M. S., Huang K. C., Kao H. F., Tung M. C., Tsai S. S., 2006. Infectious hypodermal and haematopoietic necrosis virus (IHHNV) infections in giant freshwater prawn, Macrobrachium rosenbergii. Aquaculture 258, pages 73-79. 20. Holthuis L. B., 1950. The decapoda of the Siboga expedition pt.10. The palaemonidae, collected by the Siboga and snellins expedition with remarks on other species. Subfamily palaemoninae siboga exped. 21. Hsieh C.-Y., Wu Z.-B., Tung, Tu C., Lo S.-P., Chang T.-C., Chang C.-D., Chen S.- C., Hsieh Y.-C. and Tsai S.-S., 2006. In situ hybridization and RT-PCR detection of Macrobrachium rosenbergii nodavirus in giant freshwater prawn, Macrobrachium rosenbergii (De Man), in Taiwan. Journal of Fish Diseases, 29, pages 665-671. 22. Johnson S. K, 1978. Handbook of shrimp diseases, Sea Grant Publ. NO TAMU – SG – 90 – 601, Texas A & M Univ., 25 pages. 23. Li N., Zhao Y., Yang J., 2006. Impact of waterborne copper on the structure of gills and hepatopancreas and its impact on the content of metallothionein in juvenile giant freshwater prawn Macrobrachium rosenbergii (Crustacea: Decapoda). Archives of environmental contamination and toxicology, 10.1007/s00244-005-0214-5, China. 24. New M. B. & Valenti W. C., 2000. Freshwater prawn culture, the farming of Macrobrachium rosenbergii. Blackwell science, 446 pages. 25. New M. B., 2001. Farming freshwater prawns, a manual for the culture of the giant river prawn (Macrobrachium rosenbergii). FAO Fisheries Technical paper 428. 26. Qian D., Shi Z., Zhang S., Cao Z., Liu W., Li L., Xie Y., Cambournac and Bonami J.-R., 2003. Extra small virus-like particles (XSV) and nodavirus associated with whitish muscle disease in the giant freshwater prawn, Macrobrachium rosenbergii. Journal of Fish Disease, 26, pages 521-527. 41 27. Sheenhan D. C. and B. B. Hrapchak, 1980. Theory and practice of histotechnology. C. V. Mosby Co., St. Louis, 481 pages. 28. Sae-oui D., Tansutapanich A and Ruangpan L. 1987. Vibrio harveyi: Luminous bacteria causing disease in Penaeus merguiensis. Tech. Pap. No. 6. Brackishwater Fisheries Division. Dept. of Fisheries, Thailand, 11p. 29. Tonguthai K., 1992. Diseases of the freshwater prawn Macrobrachium rosenbergii in Thailand. In: M. Shariff, R.P. Subasinghe and J.R. Arthur (eds.). Diseases in Asian Aquaculture. I. Fish Health Section, Asian Fisheries Society. Manila, Philippines, pages 89-95. 30. Tonguthai K., 1997. Diseases of the freshwater prawn, Macrobrachium rosenbergii. The aquatic animal health research Institute. Department of Fisheries, Kasetsart University Campus, Jatujak, Bangkok 10900, Thailand, 8 pages. 31. Tung C. W., Wang C. S. and Chen S. N., 1999. Histological and electron microscopy study on Macrobrachium muscle virus (MMV) infection in the giant freshwater prawn, Macrobrachium rosenbergii (De Man), cultures in Taiwan. Journal of Fish Diseases 22: 319 – 324. 32. Vijayan K. K., Raj V. S., Alavandi S. V., Sekhar V. T. and Santiago T. C., 2005. Incidence of white muscle disease, a viral like disease associated with mortalities in hatchery-reared postlarvae of the giant freshwater prawn Macrobrachiu rosenbergii (De Man) from the southeast coast of India. Aquaculture Research, 36, pages 311-316. 33. Widada J. S., Durand S., Cambournac L., Quian D., Shi Z., Dejoughe E., Richard V. and Bonami J. R., 2003. Genome-based detection methods of Macrobrachium rosenbergii nodavirus, a pathogen of the giant freshwater prawn, Macrobrachium rosenbergii: dot-blot, in situ hybridization and RT-PCR. Journal of Fish Diseases, 26, pages 583-590. 34. Widada J. S. and Bonami J.-R., 2004. Characteristics of the monocistronic genome of extra small virus, a virus-like particle associated with Macrobrachium rosenbergii nodavirus: possible candidate for a new species of satellite virus. Journal of General virology, 85, pages 643-646. 42 35. Yoganandhan K., Learvibhas M., Sriwongpuk S., Limsuwan C., 2006. White tail disease of the giant freshwater prawn Macrobrachium rosenbergii in Thailand. Diseases of Aquatic Organisms, 69, pages 255-258. Danh sách các trang website PHỤ LỤC PHỤ LỤC A: Body segments in Macrobrachium rosenbergii and appendage function. Body section Segment Appendage names Functions of appendages and related structure CEPHALON Front portion of the cephalothorax 1 2 2 4 5 6 Embryonic segment (not visible in adults) 1 st antennae 2 nd antennae Mandibles 1 st maxillae (mxillulae) 2 nd maxillae Tactile and sensory perception (statocyst) Tactile Cutting and grinding food Food handling Food handling; water circulation through the gill chamber (scphognathite) THORAX Rear portion of the cephalothorax 7 8 9 10 11 10 13 14 1 st maxillipeds 2 nd maxillipeds 3 rd maxillipeds 1 st pereiopods (chelipeds) 2 nd pereiopods (chelipeds) 3 rd pereiopods 4 th pereiopods 5 th pereiopods Feeding/food handling Feeding/food handling Feeding/food handling Food capture Food capture; agonistic and mating behaviour Walking;female gonophores between base of legs Walking Walking; male gonophores between base of legs ABDOMEN 15 16 17 18 19 20 1 st pleopods (swimmerets) 2 nd pleopods (swimmerets) 3 rd pleopods (swimmerets) 4 th pleopods (swimmerets) 5 th pleopods (swimmerets) uropods Swimming Swimming; copulation in males Swimming Swimming Swimming Propulsion, together with the central telson. PHỤ LỤC B: Hình thái của ấu trùng tôm càng xanh qua các giai đoạn phát triển (Nguyễn Việt Thắng, 1993) Giai đoạn phát triển Hình thái Thời gian tính sau nở Ghi chú (ngày) I Dài 2 – 2,1 mm (đo từ mút chủy đến mút telson), mắt chƣa có cuống, đốt đuôi (telson) có dạng tam giác mang 7 đôi lông ở phía sau. 46 +/- 4 h 15’ 1 – 3 II Dài 2,2 mm, mắt có cuống, đốt đuôi cũng có dạng tam giác, mang 8 đôi lông ở phía sau. 94 +/- 14 h 3 – 5 III Dài 2,6 – 3,3 mm, nhánh ngoài của telson ngắn hơn telson với tia trong chƣa mang lông phía sau, gốc chủy xuất hiện một gai chủy trên đầu. 152 +/- 21 h 5 – 8 IV Dài 3,2 – 3,4 mm, đốt đuôi hẹp ở phần sau, phía trong chân đuôi có lông, sau gốc chủy có hai gai trên chủy, mỗi gai có 2 – 3 răng ở mép trƣớc, nhánh ngoài telson dài bằng telson có dạng hình chữ nhật, nhánh ngoài chân ngực 4 mới nhú. 205 +/- 34 h 7 – 10 V Dài 3,8 – 3,9 mm, đốt dƣới có lông chim, hai gai trên chủy có 4 - 5 răng telson nhọn, nhánh ngoài chân ngực 4 xuất hiện đốt. 244 +/- 36 h ? VI Dài 4 – 4,1 mm, đốt đuôi kéo dài thêm và thu hẹp lại, phần sau có mang 3 đôi gai ở phía bên và 5 đôi lông cứng ở phía sau, hai đôi cạnh đôi giữa có lông chim, nhánh ngoài telson dài quá mút telson, chân bụng đã nhú. 286 +/- 45 h 9 – 15 VII Dài 4,1 – 4,2 mm, mầm chân bụng nhú lên với các mức độ khác nhau, các mầm to thì chẻ hai, mỗi gai trên chủy đều có 5 – 6 răng, ở mép dƣới xuất hiện nhánh 3 của nhánh antene. 330 – 58 h 10 – 17 VIII Dài 4,4 – 4,7 mm (các chân bụng đều có hai nhánh chƣa mang lông hay chỉ có 1 – 2 lông ở nhánh ngoài). 262 – 56 h 11 – 18 IX Dài 5,6 – 5,8 mm, chân bụng phát triển dài thêm, nhánh ngoài có 4 – 5 lông cứng. 385 +/- 69 h 13 – 19 X Dài 6 – 6,2 mm, chân ngực 1 và 2 có kẹp, xuất hiện 3 – 4 gai chủy phía trên. 492 +/- 76 h 15 – 27 XI Dài 6,6 – 8 mm, chân ngực 1 và 2 có kẹp hoàn chỉnh, nhánh trong và nhánh ngoài chân bụng đều có mang lông, phía dƣới chủy có 2 – 3 răng. 567 +/- 93 h 17 - ? XII (PL) Dài 8,2 – 9,7 mm, chủy có 8 – 9 răng ở phía trên đốt đuôi mang 5 đốt gai ở phía sau, hai đôi giữa có dạng lông chim tôm bơi thẳng và ƣa bò trên đáy và thành của bể. 650 +/- 112 h 19 – 35