Khóa luận Xác định quy trình ly trích DNA từ lông heo

permanganate (KMnO4) là một phƣơng pháp tẩy trắng melanin có hiệu quả. 2.1.3. Cấu trúc của keratin Theo Eggling (2001, 2003), keratin thuộc nhóm protein cấu trúc, là những protein dạng sợi. Keratin hình thành màng bảo vệ cho toàn bộ động vật có xƣơng sống: da, lông, tóc, vuốt, móng, sừng, vảy, mỏ. Đơn vị cơ bản của lông là một sợi protein dài hình thành theo cấu trúc xoắn alpha bậc hai. Ba trong số những protein xoắn alpha xoắn quanh một sợi khác hình thành nên cấu trúc gọi là tiền fibrin. Một sợi 5 fibrin đƣợc tạo từ bảy tiền fibrin. Sau đó, hàng trăm sợi fibrin gắn vào một loại protein dạng keo để hình thành nên sợi fibrin lớn. Những sợi fibrin lớn này đƣợc gắn vào tế bào lông chết. Keratin là một họ protein cấu trúc sợi, dai và không hoà tan. Keratin ở dạng cấu trúc cứng nhƣng không bị khoáng hoá, đƣợc tìm thấy ở bò sát, chim, lƣỡng cƣ và động vật có vú. Keratin cạnh tranh tính bền sinh học với chitin. Có nhiều loại keratin, đôi khi chỉ trong một động vật nhƣ α-keratin, ß-keratin. Xét về cấu trúc không gian, đặc tính làm keratin trở nên rắn chắc phụ thuộc vào sự tập hợp cấu trúc siêu phân tử (thành phần và trình tự các amino acid của những mạch polypeptide thành phần). Sự phối hợp của các cấu trúc α–helix, ß-sheet và cầu nối disulfide sẽ quyết định cấu tạo của những protein chức năng, một vài trong số đó điều khiển tính không hoà tan. Xét về thành phần hóa học, keratin chứa một tỷ lệ cao glycine và một tỷ lệ tƣơng đối cao alanine. Xét về liên kết hóa học, ngoài những liên kết hydro trong phân tử và giữa các phân tử, keratin còn có một lƣợng lớn sulfur trong các amino acid cysteine, đƣợc liên kết với nhau bởi những cầu nối disulfide. Nối disulfide nhiều tạo nên tính không hòa tan của keratin, ngoại trừ các tác nhân phân hủy hay tác nhân khử nhƣ urea có thể hòa tan keratin. Keratin của lông có ít cầu nối disulfide hơn keratin ở móng hay guốc của động vật có vú. Do đó, móng, guốc cứng hơn so với lông. Trong trƣờng hợp cấu hình ß-sheet, keratin đƣợc liên kết bởi những liên kết hydrogen tự do trong không gian giữa nhóm amino và nhóm carboxyl của những chuỗi peptide, tạo ra những liên kết dày đặc và chắc chắn. Phân tử keratin dạng sợi có thể bện xung quanh nhau tạo thành dạng sợi trung gian xoắn. 2.1.4. Các liên kết trong lông 2.1.4.1. Cấu trúc cuộn xoắn A Trong cấu tạo của lông có 3 chuỗi xoắn α bện với nhau tạo thành dạng protofibril. Đây là cấu trúc sợi đầu tiên của lông. Chín protofibril đƣợc bó trong một vòng tạo thành microfibril. Những microfibril này đƣợc gắn vào một chất nền protein 6 vô tổ chức amphorous chứa nhiều lƣu huỳnh. Hàng trăm microfibril đƣợc gắn vào nhau tạo thành một bó sợi không đều nhau gọi là macrofibril. Những macrofibril này tập trung thành từng nhóm tạo nên lớp vỏ của lông. Những tế bào chết xung quanh cấu trúc này tạo nên lớp sừng của lông. Ở phần trung tâm của lông có ống tủy là hệ thống lƣu trữ và bài tiết các chất cặn bã, những kim loại nặng do cơ thể loại thải ra và chúng đƣợc bài tiết qua các ống. 2.1.4.2 Liên kết trong protein keratin Cấu hình đầu tiên của lông đƣợc thiết lập trong không gian là bởi những liên kết đƣợc tìm thấy trong lớp vỏ của lông. Nhƣ chúng ta đã thấy ở phần trƣớc, keratin bắt đầu với xoắn alpha tạo nên protofibril, microfibril, macrofibril và sau đó tạo nên lớp vỏ. Những liên kết trong lông đƣợc nằm trong phạm vi một hay nhiều xoắn alpha. 2.1.4.3. Liên kết hydrogen Liên kết này nằm giữa những cuộn tròn của xoắn alpha và có vai trò làm cho lông có khả năng duỗi ra rồi trở lại trạng thái cũ (tính đàn hồi). Liên kết hydrogen cho phép chúng ta tạm thời thay đổi hình dạng của lông với sự trợ giúp của nƣớc. Những liên kết này khi bị điện phân sẽ dễ dàng bị bẻ gãy và sữa đổi. Liên kết hydrogen đóng vai trò trong 35% tính bền và 50% tính đàn hồi của lông (có một vài tranh luận cho rằng nó đóng vai trò trong 99,9% tính đàn hồi của lông). 2.1.4.4. Liên kết muối Liên kết muối là một dạng liên kết ion (điều khiển sự điện phân) bởi electron chuyển từ nhóm amino bazơ (amino acid với nhóm –COO) sang nhóm amino axit (amino acid với nhóm –NH3 +). Điều này xảy ra ở vị trí song song với đƣờng trục của đƣờng xoắn luân phiên. Liên kết muối đóng vai trò trong 35% tính bền và 50% tính đàn hồi của lông. 2.1.4.5. Liên kết cystine Liên kết cystine đƣợc biết là liên kết disulfide, liên kết sulfur, liên kết -S đƣợc tạo ra bởi những liên kết chéo giữa các cystine của chuỗi polypeptide. Liên kết này thẳng góc với trục lông và nằm giữa những mạch polypeptide. Do vị trí của nó trong 7 lông, liên kết cystine giữ vai trò trong tính dai của lông và chống lại sự mài mòn lông. Liên kết này cho phép nếp tóc uốn giữ đƣợc lâu. 2.1.4.6. Liên kết đƣờng Liên kết đƣờng nằm giữa amino acid có nhóm –OH và nhóm amino axit. Liên kết này thẳng góc với trục lông. Do vị trí của nó, liên kết đƣờng đóng vai trò trong tính dai nhƣng không giữ vai trò trong tính bền (5%). Sự ẩm ƣớt ở lông là do một loại sản phẩm phụ của loại liên kết này. 2.1.5. Chu kỳ phát triển của lông Chu kỳ phát triển của lông chia làm 3 pha: pha anagen (pha phát triển), pha catagen (pha chuyển tiếp) và pha telogen (pha nghỉ). Stenn và Paus (2001; dẫn liệu từ McNevin và cs, 2005) thêm vào pha thứ tƣ là exogen (pha rụng), cho phép nhìn thấy việc điều khiển di truyền bên trong nang lông. Pha anagen là pha dài nhất trong chu kỳ phát triển lông ở ngƣời, từ 2-4 năm. Xấp xỉ 75-95% tất cả nang lông trên bề mặt da ngƣời là ở pha anagen. Pha catagen (2-3 tuần) đƣợc đánh dấu bởi sự kết thúc của quá trình phân bào nguyên nhiễm ở tế bào mầm nang lông. Trong pha telogen (3 tháng) chƣơng trình chết của tế bào (apotosis) dẫn đến sự keratin hóa protein và sự hoại tử. Pha telogen có thể đƣợc kích động bởi tác động của các proteinase lên hành lông còn sống. Ngay khi lông thoát ra khỏi nang lông, những tế bào bị mất nƣớc, protein bị keratin hóa và liên kết chéo qua các cầu nối cystine disulfide. Lông bị keratin hóa chứa thấp hơn 10% nƣớc. Quá trình keratin hóa gây ra sự thoái hóa tế bào và tiếp theo đó là sự mất DNA nhân ở lớp vỏ. Sử dụng nucleotide đánh dấu phóng xạ, Downes và cs (1966) chỉ ra rằng sự phân rã DNA xảy ra trong suốt quá trình keratin hóa. Chƣơng trình chết của tế bào (apotosis) đƣợc mô tả bởi sự biến mất của những bào quan trong tế bào, và sự bẻ gãy những mạch đôi của DNA nhân bởi các deoxyribonuclease đặc biệt ở vùng liên kết giữa các nucleosome. Dạng tác động này của nuclease đƣa đến kết quả là tạo ra các đoạn DNA <200 bp bao xung quanh các protein histone. Poinar (2003) xác nhận rằng nuclease tác động là nhân tố chính trong sự suy thoái của DNA của những mô khảo cổ và những mô giám định pháp y. Kanesshige và 8 cs (1992) nhận thấy rằng DNA ly trích từ móng tay - một loại mô bị keratin hóa tƣơng tự lông, gồm những đoạn nhỏ hơn DNA ly trích từ máu. Đáng chú ý hơn, họ thấy rằng lƣợng DNA từ móng để phản ứng PCR thành công thì thấp hơn lƣợng DNA từ máu, điều này đƣa ra giả thuyết rằng móng chứa ít yếu tố ức chế PCR (hemoglobin trong máu đƣợc biết là một yếu tố ức chế). 2.2. Những công trình tách chiết DNA từ lông 2.2.1. Những công trình tách chiết DNA từ lông ở nƣớc ngoài Việc sử dụng DNA từ nguồn lông không còn là mới lạ đối với các nƣớc tiên tiến có ngành công nghệ sinh học phát triển. Có rất nhiều công trình nghiên cứu về khảo cổ, về khoa học hình sự, về y học,… sử dụng nguồn DNA tách chiết từ mẫu lông hay tóc. Có thể kể một số nghiên cứu tiêu biểu nhƣ dƣới đây. Baumgartner (1979) tiến hành thí nghiệm trên mẫu lông thú và xác định đƣợc khả năng lạm dụng thuốc của thú. Mặt khác, từ phân tích mẫu lông đã xác định đƣợc hàm lƣợng heroin trong cơ thể. Kalbe và cs (1988) đã phân lập DNA dài 20.000 bp từ thân tóc và chỉ ra rằng nó tập trung hầu hết ở các tế bào lớp sừng bên ngoài thân tóc. Ông đã báo cáo năng suất ly trích DNA của 1 g lông là từ 20 ng -> 2 µg (0,02 - 2 ng/mg). Schreiber và cs (1988) nhận ra rằng việc rửa SDS lặp lại nhiều lần làm giảm năng suất DNA thu hồi từ thân lông. Ông đã thu đƣợc 1µg DNA từ 200 mg lông (5 ng/mg). Nozawa và cs (1999) ly trích DNA từ thân tóc với phƣơng pháp kết tủa bằng CTAB. Sau đó, vùng đặc biệt của gen HLA-DQA1 đƣợc khuếch đại bằng phƣơng pháp semi-nested PCR. Sản phẩm khuếch đại đƣợc tạo dòng và giải trình tự. Trình tự di truyền của HLA-DQA1 đƣợc xác định bằng cách so sánh trình tự với trình tự đã đƣợc biết trƣớc của mỗi allele. Tất cả kiểu gen của HLA-DQA1 đƣợc phân loại thành công với mẫu thân tóc lấy từ 6 ngƣời khác nhau. Heywood và cs (2003) đo đƣợc 1 ng DNA/ml thân tóc sau quá trình ly trích hữu cơ. DNA hiện diện ở cả phần gốc tóc (trung bình là 1,3 0,8 ng/ml) và phần ngọn tóc (trung bình là 0,3 0,6 ng/ml). Nhuộm huỳnh quang đã khám phá ra rằng DNA tóc 9 cũng định vị ở lớp sừng. Họ thấy rằng nhuộm màu và dùng dầu gội lâu dài làm giảm lƣợng DNA ở lông. Chất peroxide trong màu nhuộm đƣợc biết là tác động mạnh đến DNA và kích thích hoạt động của những melanin có khả năng hoà tan trong nƣớc. Đây là những melanin làm ức chế DNA polymerase. Ngƣợc lại, Huhne và cs (1999) thấy rằng màu nhuộm và dầu gội không ảnh hƣởng đến tỷ lệ thành công của việc ly trích và khuyếch đại DNA ty thể từ lông. Một số bộ kit ly trích DNA từ nguồn mẫu bị keratin hóa nhƣ lông, móng, sừng,…cũng đã đƣợc thƣơng mại hóa rộng rãi trên thị trƣờng. Các bộ kit này cung cấp một phƣơng pháp đơn giản và nhanh chóng để ly trích và phân lập DNA mẫu lông. Có thể tham khảo một số bộ kit sau: * Hãng Sigma đƣa ra sản phẩm REDExtract-N-AmpTMTissue PCR Kit dùng cho 10 phản ứng ly trích DNA từ mẫu lông hoặc mẫu nƣớc bọt, mẫu mô động vật. Giá sản phẩm là 52,88 SGD. Đặc điểm của sản phẩm là có thể ly trích DNA từ mẫu chỉ trong vòng 15 phút, có hiệu quả cao trong việc phân lập DNA của bộ gen và có thể ứng dụng cho nhiều loại mẫu. * Hãng Bionex đƣa ra sản phẩm MX-16. Đây là một thiết bị dùng ly trích và tinh sạch DNA, RNA và các vật liệu sinh học khác thông qua một quá trình tự động. Có thể xử lý 16 mẫu cùng lúc. Thời gian quy trình là 35 phút. Thiết bị có thể áp dụng đối với mẫu tóc, lông, mô động vật, mẫu cây. * Hãng Thistle đƣa ra sản phẩm Gen-IAL 50 DNA Extractions Kit với giá là 90 £ có thể ly trích DNA trọng lƣợng phân tử lớn từ nhiều cơ chất khác nhau: lông, máu, xƣơng, răng. DNA ly trích đƣợc có thể sử dụng cho PCR, Southern blot, giải trình tự và tạo dòng. * Công ty DNA Testing Centre-INC ly trích mẫu thân lông với giá 240 USD; mẫu răng hay xƣơng với giá 480 USD. DNA ly trích đƣợc có thể sử dụng theo nhiều hƣớng khác nhau tùy theo mục đích. Đối với những phòng thí nghiệm quy mô nhỏ thì việc sử dụng những bộ kit đƣợc thƣơng mại hoá trên thị trƣờng thƣờng không phù hợp vì giá thành cao. Vì vậy, 10 tùy theo mục đích thí nghiệm mà chúng ta sẽ sử dụng quy trình ly trích hay bộ kit có sẵn trên thị trƣờng. 2.2.2. Những công trình tách chiết DNA từ lông ở trong nƣớc Ở nƣớc ta, việc tách chiết DNA từ mẫu lông chƣa đƣợc phổ biến. Việc tìm ra một quy trình ly trích DNA từ mẫu lông phù hợp với điều kiện hóa chất và thiết bị ở Việt Nam đang là một vấn đề đối với các nhà khoa học trong nƣớc. Nguyễn Văn Út (2005) đã tiến hành tách chiết DNA trên mẫu lông và đƣa ra kết luận rằng DNA ly trích từ cơ khá tinh sạch và có hàm lƣợng cao hơn so với DNA ly trích từ lông; DNA ly trích từ gốc lông có độ tinh sạch cao hơn so với DNA ly trích từ ngọn lông. Bùi Thị Ngọc Bích (2006) đã sử dụng một số hoá chất để cải thiện hiệu quả quy trình ly trích DNA từ lông và đƣa ra kết quả nhƣ sau: DTT và CTAB trong dung dịch đệm ly trích đã cải thiện tỷ số OD nhƣng chỉ cho sản phẩm PCR ngắn (370 bp) của gen giới tính và không có sản phẩm PCR của gen halothane. Bổ sung BSA vào hỗn hợp PCR cũng không cải thiện đƣợc kết quả PCR. 2.3. Phản ứng PCR (polymerase chain reaction) 2.3.1 Nguyên tắc cơ bản của phản ứng PCR Phản ứng PCR là phản ứng nhân bản (khuếch đại) DNA nhờ polymerase do Karl Mullis và cộng sự phát minh năm 1985. Theo Gerard Morel và cs (1998), phƣơng pháp PCR sử dụng những trình tự DNA ngắn nhƣ đoạn mồi (oligonucleotides), một DNA polymerase chịu nhiệt (ví dụ Taq polymerase) (Sake và ctv, 1985; Haase và ctv, 1990), và tri–photphat deoxyribonucleotides (dNTPs): dATP, dGTP, dTTP, dCTP. Sau bƣớc tách hai mạch của trình tự đích (thông thƣờng do gia nhiệt ở 95oC trong 5 phút), đoạn mồi bắt cặp hay lai với trình tự đích trong bƣớc thứ hai. Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kì nối tiếp nhau, đƣợc thực hiện theo nguyên lý sau: - Bƣớc đầu tiên của PCR là biến tính (denaturation) mẫu DNA thành chuỗi đơn bằng nhiệt độ cao 94 – 950C. 11 - Sau đó nhiệt độ phản ứng đƣợc hạ thấp đến 45 – 600C. Ở nhiệt độ này, primer (mồi- oligonucleotide tổng hợp mà chuỗi của chúng đƣợc cho lai với chuỗi đối nghịch của mẫu DNA) bắt cặp với vùng bổ sung trên đoạn mẫu DNA. Đây là giai đoạn ủ bắt cặp (annealing). - Hỗn hợp đƣợc tăng nhiệt độ lên 720C. Khi đó, sự hiện diện của 4 deoxyribonucleotide triphosphate (dATP, dCTP, dTTP, dGTP) và Taq polymease, các oligonucleotide đƣợc kéo dài tạo nên chuỗi DNA. Các trình tự này tạo thành một chu kỳ gồm 3 giai đoạn: biến tính (94 – 950C), ủ bắt cặp (45 – 600C) và kéo dài (720C). Trong khuếch đại DNA, chu kỳ này sẽ đƣợc lặp lại nhiều lần. 2.3.2. Những thành phần tham gia vào phản ứng PCR - Taq polymerase: là DNA polymerase chịu nhiệt đƣợc tách chiết từ vi khuẩn suối nƣớc nóng Thermus aquaticus. Taq polymerase không bị phá huỷ ở nhiệt độ biến tính và xúc tác sự tổng hợp DNA theo chiều 5' – 3' trong suốt quá trình phản ứng dƣới sự hiện diện của Mg2+. - Primer (đoạn mồi): là những đoạn oligonucleotide mạch đơn, có trình tự bổ sung với trình tự base của hai đầu mạch khuôn để khởi đầu quá trình tổng hợp DNA. Chiều dài primer tối thiểu cho hầu hết các phản ứng PCR là 18 nucleotide (thƣờng 18 – 24 nucleotide). Đối với việc khuếch đại các chuỗi có mức độ dị hợp cao, primer đƣợc sử dụng có 28 – 35 nucleotide. - Các nucleotide (dNTPs): là hỗn hợp 4 loại dATP, dCTP, dTTP, dGTP làm nguyên liệu cho phản ứng tổng hợp DNA. Bốn loại này thƣờng đƣợc sử dung ở nồng độ 20 – 200 µM mỗi nucleotide. Sự mất cân bằng trong thành phần các nucleotide làm tăng các lỗi sao chép của polymerase (Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 1988). - Dung dịch đệm: quan trọng nhất là ion Mg2+. Mg2+ rất cần cho quá trình liên kết các dNTPs, xúc tác cho enzyme Taq polymerase, làm tăng nhiệt độ nóng chảy của DNA mạch kép. Dung dịch đệm tiêu chuẩn chứa 50 mM KCl và khuếch đại tốt những đoạn DNA > 500 bp. 12 - DNA mẫu: đƣợc tách chiết từ mẫu xét nghiệm. Việc xác định hàm lƣợng DNA để bổ sung primer là rất cần thiết. Nếu tỷ lệ primer : DNA mẫu quá cao sẽ dẫn đến hiện tƣợng primer – dimers. Nếu tỷ lệ này thấp thì sẽ có ít sản phẩm PCR (Bùi Chí Bửu, 1999). 2.4. Gen halothane 2.4.1. Khái quát về gen halothane Gen halothane (Hal) xuất hiện ngẫu nhiên trong quá trình chọn lọc heo nhiều nạc và đƣợc phát hiện vào năm 1980 bằng phƣơng pháp ngửi chất gây mê halothane. Đây là gen gồm 2 alen (N và n) nằm trên nhiễm sắc thể số 6, gây nên hội chứng nhạy cảm stress và chi phối đến các tính trạng về tăng trƣởng, phẩm chất quày thịt và phẩm chất thịt. Phƣơng pháp trắc nghiệm halothane chỉ phát hiện đƣợc kiểu gen NN và nn. Heo nhạy cảm stress (kiểu gen nn) có ƣu điểm là dày mỡ lƣng thấp, tỷ lệ nạc cao, hệ số chuyển hóa thức ăn tốt nhƣng có nhƣợc điểm là thành tích sinh sản kém, tăng tỷ lệ thịt PSE (tái, mềm, rỉ dịch) và tăng tỷ lệ chết do vận chuyển (Nguyễn Ngọc Tuân và Trần Thị Dân, 2000). Gen halothane gồm 2 alen N và n tạo nên 3 kiểu gen NN, Nn, nn. Nhóm heo mang kiểu gen NN và Nn không nhạy cảm với halothane (HAL-), trong khi nhóm heo mang kiểu gen nn thì nhạy cảm với halothane (HAL+) (Whittemore, 1993). Gen halothane mặc dù tác động có lợi đến tỷ lệ nạc một cách có ý nghĩa nhƣng cũng có ảnh hƣởng xấu nhƣ làm thú tăng trƣởng kém, tỷ lệ đột tử cao trong quá trình nuôi dƣỡng và vận chuyển đến lò mổ, tỷ lệ quầy thịt PSE nhiều, số con sơ sinh trên ổ thấp (Gahre và Juneja, 1985). Về mặt cấu trúc, sự khác biệt giữa kiểu gen đồng hợp trội NN và kiểu gen đồng hợp lặn nn là sự đột biến C (cytosine) thành T (thymine) tại vị trí base 1843. Sự đột biến này có liên quan đến hội chứng sốt kiệt phát trên nhóm heo nhạy cảm với stress (Fujii và ctv, 1991). Về mặt di truyền, gen halothane di truyền theo định luật Mendel. Để phát hiện những cá thể nhạy cảm với stress, ngƣời ta cho heo ngửi chất gây mê bay hơi halothane trong 3 - 5 phút với nồng độ từ 4 - 8%. Thú đƣợc ngửi halothane 13 đến khi phản xạ mắt biến mất trong phút đầu tiên và tình trạng mê duy trì khoảng 2 phút. Khi các chi của heo duỗi thẳng và cứng đơ thì phản ứng halothane dƣơng tính (HP) hoặc nhạy cảm với stress. Ngƣợc lại, khi thú vẫn dãn cơ bình thƣờng thì phản ứng halothane âm tính (HN) hoặc đề kháng với stress. Hầu hết các dòng Yorkshire Large White có tần số nhạy cảm rất thấp hoặc bằng không. Pietrain và Landrace Bỉ có tần số nhạy cảm cao nhất. Các dòng Landrace khác có tần số nhạy cảm stress trung gian giữa Yorkshire và Pietrain (Trích dẫn Nguyễn Ngọc Tuân, 1996). Trắc nghiệm ngửi chất gây mê halothane có lợi trong thực tế vì rẻ tiền nhƣng phát hiện trễ (heo trên 8 tuần tuổi), cồng kềnh, tốn công và không thể phát hiện kiểu gen Nn. Ngoài ra, heo có thể chết đột ngột do sốt kiệt phát lúc xét nghiệm. Do vậy, cần tìm ra một biện pháp xét nghiệm thay thế có hiệu quả hơn. 2.4.2. Ảnh hƣởng của gen halothane 2.4.2.1. Ảnh hƣởng của gen halothane đến năng suất sinh sản Ảnh hƣởng của gen halothane đến năng suất sinh sản là một vấn đề rất đƣợc quan tâm vì sinh sản là yếu tố quyết định cho sự tăng đàn, phát triển về số lƣợng. Trên nọc, stress làm giảm tính dục, số lƣợng tinh trùng thấp. Do đó, số lƣợng tinh trùng bình thƣờng có khả năng thụ tinh sẽ giảm. Những nọc nhạy cảm với stress (có kiểu gen nn) có phẩm chất tinh dịch thấp hơn so với nọc mang gen NN và Nn (Pfeiffer và ctv, 1986). Trên nái, stress làm cho nái mang thai mệt mỏi, kém ăn, ... gây ảnh hƣởng xấu đến quá trình sinh sản nhƣ giảm số trứng rụng, tăng hiện tƣợng chết phôi, ảnh hƣởng đến số con đẻ ra trên mỗi lứa. Theo Schneider và ctv (1980), nái HAL- đẻ nhiều con hơn nái HAL+ từ 0,11 đến 1 con trên ổ, thể hiện rõ qua tỷ lệ số con cai sữa so với số heo con sinh ra. Theo Willeke và ctv (1984), ảnh hƣởng của gen halothane không có ý nghĩa trên số con đẻ ra và số con còn sống/ổ nhƣng lại ảnh hƣởng có ý nghĩa đến số lứa đẻ của nái. Điều này cho thấy gen halothane đã ảnh hƣởng lên năng suất sinh sản của heo nái. 14 2.4.2.2. Ảnh hƣởng của gen halothane đến sinh trƣởng và phẩm chất thịt Đối với sinh trƣởng, stress làm heo còi cọc, sút cân và tăng trƣởng chậm. Một phần do con vật chán ăn, mặt khác do cơ thể sản xuất ra một lƣợng lớn hormone glucocorticoid. Khi có phản ứng stress mạnh, cơ thể sẽ sử dụng nguồn năng lƣợng dự trữ để thích nghi. Vì vậy, nếu quá trình này kéo dài sẽ dẫn đến giảm tăng trọng trên thú nhỏ và mất thể trọng trên thú nuôi thịt và sản xuất. Heo mang kiểu hình HP có mức tăng trọng thấp nhƣng lƣợng tiêu thụ thức ăn giảm và hệ số chuyển hoá thức ăn tốt hơn so với kiểu heo mang kiểu hình HN. Bên cạnh đó ƣu điểm nổi bật của những heo này là diện tích thịt thăn, tỷ lệ nạc và tỷ lệ thịt xẻ cao, dày mỡ lƣng thấp, chiều dài quầy thịt giảm, xƣơng nhỏ. Cùng với những lợi điểm này thì tỷ lệ thịt PSE cũng tăng cao trên cá thể HP, làm giảm chất lƣợng thịt. Qua kết quả nghiên cứu của Webb và ctv (1981) và nhiều tác giả cho thấy heo đồng hợp tử lặn nn cho tỷ lệ thịt xẻ, tỷ lệ nạc, diện tích thịt thăn lớn hơn và dày mỡ lƣng thấp hơn heo mang kiểu gen NN và Nn. Song, tỷ lệ thịt PSE cao nhất ở heo mang kiểu gen nn. Tổng hợp những tính trạng này, các tác giả cho rằng gen Nn mang tính trạng trung gian giữa kiểu gen NN và nn nên mang lại lợi ích kinh tế cao hơn so với kiểu gen NN, nn. Nhƣ vậy bên cạnh những ƣu điểm của gen halothane là những ảnh hƣởng không nhỏ lên sự sinh trƣởng, sinh sản và phẩm chất thịt. Có nhiều ý kiến cho rằng cần phải loại thải gen này trong đàn giống để giảm hội chứng stress và thịt PSE. Nhƣng ngƣợc lại cũng có nhiều đề xuất giữ lại gen này ở dạng dị hợp tử Nn để tận dụng tính ƣu việt về tỷ lệ nạc và tính kháng stress. Tuy nhiên, tùy theo mục đích khác nhau mà nhà chọn giống có nhiều lựa chọn để có hiệu quả kinh tế cao nhất. 2.5. Những công trình nghiên cứu về halothane 2.5.1 Nguyên tắc xác định gen halothane Gen halothane có hai alen N và n hình thành 3 kiểu gen NN, Nn và nn. Bằng việc so sánh trình tự nucleotide của gen này, MacLennan thấy rằng có sự đột biến C (cytosin) thành T (thymin) ở vị trí base 1843 của chuỗi nucleotide. Fujii và ctv (1991) đã đƣa ra phƣơng pháp phát hiện gen halothane bằng kỹ thuật PCR và enzyme cắt giới 15 hạn Hha I để phát hiện đột biến điểm trên bất kỳ loại tế bào nào có chứa DNA. Sau đó, kỹ thuật này đƣợc Hughes và ctv (1992) cải tiến. Phƣơng pháp này phân biệt dễ dàng các kiểu gen NN, Nn và nn (Nguyễn Thị Thu Phƣơng, 2004). 2.5.2. Những công trình nghiên cứu halothane ở trong nƣớc Theo Nguyễn Ngọc Tuân (1996), tần số nhạy cảm với halothane khác nhau giữa các quốc gia. Hầu hết các dòng Yorkshire Large White có tần số nhạy cảm rất thấp hoặc bằng không, Pietrain và Landrace Bỉ có tần số nhạy cảm cao nhất, các dòng Landrace khác có tần số nhạy cảm stress trung gian giữa Yorkshire và Pietrain. Kết quả nghiên cứu của Đinh Văn Chỉnh và ctv (1999) cho rằng heo nái Landrace và Yorkshire, kiểu gen halothane có ảnh hƣởng đến các chỉ tiêu sinh sản, nhất là các chỉ tiêu về độ lớn của lứa đẻ và qua đó ảnh hƣởng đến khối lƣợng của toàn ổ. Theo Nguyễn Ngọc Tuân và Trần Thị Dân (2000), với kiểu gen nn, nọc có sức sản xuất tinh kém nhất, nái có thời gian chờ phối dài hơn và số con sơ sinh/ổ kém hơn so với 2 kiểu gen NN và Nn. Heo Nn có tăng trọng và dày mỡ lƣng trung gian giữa NN và nn. Phan Xuân Hảo (2001) cho rằng kiểu gen halothane ảnh hƣởng rõ rệt đối với chỉ tiêu số con/ổ ở nái Landrace, có ảnh hƣởng nhƣng không rõ rệt đối với nái Yorkshire. 2.5.3 Những công trình nghiên cứu halothane ở nƣớc ngoài Kết quả nghiên cứu của Webb và ctv (1981) và nhiều tác giả (Pommier và cs, 1992; Wittmann và ctv, 1993; Berger và cs, 1994) cho thấy heo đồng hợp tử lặn nn cho tỷ lệ thịt xẻ, tỷ lệ nạc, diện tích thịt thăn lớn hơn và dày mỡ lƣng thấp hơn heo mang kiểu gen NN, Nn. Song tỷ lệ thịt PSE cao nhất ở heo mang kiểu gen nn. Tổng hợp những tính trạng này các tác giả nhận định rằng kiểu gen Nn mang tính trạng trung gian giữa kiểu gen NN và nn nên đem lại lợi ích kinh tế cao hơn kiểu gen NN, nn. Kết quả nghiên cứu của Webb và Jordan (1978); Schneider và ctv (1980); Willeke và ctv (1984) cho rằng nái không nhạy cảm với halothane (NN, Nn) đẻ nhiều hơn so với nái nhạy cảm với halothane (nn) từ 0,1 – 1,1 con/ổ, sự khác biệt thể hiện rõ số con cai sữa hơn là số con sinh ra. Trong suốt đời nái, nái có kiểu gen NN, Nn đẻ 16 nhiều hơn nái có kiểu gen nn 1,02 lứa (Willeke, 1986). Lengerken và ctv (1982) cho biết lợn có phản ứng halothane âm tính có thành tích cao hơn so với lợn có phản ứng halothane dƣơng tính về tổng số con đẻ ra/ổ (0,3 con), số con đẻ ra có khả năng chăn nuôi/ổ (0,9 con) và số lứa đẻ/năm (0,17 lứa). Bằng những công trình nghiên cứu của các tác giả trong và ngoài nƣớc cho thấy rằng gen halothane đã có ảnh hƣởng lớn đến năng suất sinh sản và chất lƣợng thịt. Vì vậy, việc nghiên cứu tính nhạy cảm stress nói chung và tính năng sản xuất của heo có các kiểu gen halothane khác nhau nói riêng đã đƣợc tiến hành từ những năm 70 cho đến nay vẫn là một vấn đề rất đƣợc quan tâm. 17 PHẦN III. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Nội dung nghiên cứu 3.1.1. Thiết lập quy trình ly trích DNA từ lông heo (1) Khảo sát nồng độ proteinase K (2) Khảo sát nồng độ DTT (3) Khảo sát nồng độ CTAB 3.1.2. Áp dụng quy trình ly trích DNA cho các vị trí khác nhau của lông (1) Áp dụng quy trình ly trích DNA cho mẫu gốc lông (2) Áp dụng quy trình ly trích DNA cho mẫu thân lông (3) Áp dụng quy trình ly trích DNA cho mẫu ngọn lông (4) Áp dụng quy trình ly trích DNA cho mẫu cả sợi lông 3.2. Địa điểm và thời gian tiến hành Thí nghiệm đƣợc tiến hành tại phòng Công Nghệ Sinh Học Động Vật – Viện Công Nghệ Sinh Học và Môi Trƣờng – Trƣờng Đại Học Nông Lâm TP.HCM, từ tháng 3 đến tháng 7 năm 2007. 3.3. Vật liệu 3.3.1. Nguồn mẫu chiết xuất DNA Mẫu lông heo đƣợc lấy từ một cơ sở giết mổ ở Dĩ An - Bình Dƣơng. 3.3.2. Đoạn mồi Đoạn mồi của gen halothane Trình tự mồi xuôi: 5' – CTT CCC ACC CTG GGT CTT – 3' Trình tự mồi ngƣợc: 5' – AGG CAG AGC CAT GGA GAC – 3' 3.3.3. Hóa chất dùng trong đề tài - Hoá chất ly trích DNA + Buffer ly trích NaCl 8 mM, Tris-HCl (pH 8,0) 8 mM, SDS 1%, EDTA (pH 8,0) 1,6 mM, DTT 50 mM, proteinase K 0,8 mg/ml + Tinh sạch DNA 18 Phenol (pH 8,0), phenol-chloroform (1:1), cloroform, CTAB 2% + Thu hồi DNA NaCl 0,2 M; NaCl 1,2 M, sodium acetate 3 M, ethanol tuyệt đối lạnh + TE buffer 1 X, Tris-HCl 100 mM, EDTA( pH 8,0) 1 mM - Hoá chất phản ứng PCR PCR buffer 1 X, MgCl2 2 mM, mỗi dNTP 200 µM, mồi xuôi 0,5 µM, mồi ngƣợc 0,5 µM, Taq DNA polymerase 1 UI - Hoá chất chạy điện di sản phẩm PCR + Agarose 2% + TBE (Tris borate EDTA) (pH = 8,3) 1 X Tris-base 89 mM, acid boric 89 mM, Na2EDTA 2,5 mM + Loading dye Bromophenol blue 0,3%, sucrose 40%, TE 1 X vừa đủ 100% + Ethidium bromide 10 mg/ml 3.3.4. Dụng cụ và thiết bị dùng trong đề tài 3.3.4.1. Dụng cụ - Micropipet loại 100 – 1000 µl; 10 – 100 µl; 0,5 – 10 µl - Đầu tip tƣơng ứng với các loại micropipet - Eppendorf loại 0,2 ml và 1,5 ml - Các chai lọ đựng hoá chất, vật mẫu - Dụng cụ kéo, kẹp, chày, cối - Ống falcon loại 14 ml; 50 ml 3.3.4.2. Thiết bị - Máy vortex - Máy ly tâm - Máy PCR - Bộ điện di - Máy chụp gel - Tủ ấm 19 - Tủ trữ mẫu - Tủ trữ hoá chất - Microwave - Cân - Tủ sấy - Máy cất H2O khử ion - Autoclave - Máy đo OD - Bình N2 lỏng - Tủ lạnh -200C và -700C 3.4. Phƣơng pháp tiến hành 3.4.1. Lấy và trữ mẫu Lấy mẫu ở lò mổ, xử lí mẫu bằng cách rửa trong nƣớc vô trùng, sau đó rửa trong cồn 70%. Đặt mẫu vào bao nylon, dán kín miệng bao và cho vào thùng đá đem về phòng thí nghiệm. Tại phòng thí nghiệm, cắt khoảng 1cm tính từ chân gốc lông trở lên để có mẫu gốc lông, phần còn lại là mẫu ngọn lông. Đối với mẫu thân lông thì lấy khoảng 1cm đoạn giữa sợi lông đã đƣợc cắt bỏ phần nang nằm dƣới da và phần ngọn lông. Đối với mẫu sợi lông thì giữ nguyên cả sợi lông. Mỗi loại mẫu đƣợc đặt trong từng bao nylon riêng biệt, dán nhãn và trữ ở tủ -700C. Cân 0,1 g mẫu cho vào cối sành vô trùng. Cho N2 lỏng vào cối, dùng chày sành vô trùng nghiền lông thành dạng bột. Chú ý nghiền nhanh tay và thƣờng xuyên châm thêm nitơ lỏng để tránh cho lông bị chảy nƣớc. Chuyển nhanh chóng bột lông từ cối vào eppendorf 1,5 ml. Đánh dấu từng loại mẫu gốc, ngọn, thân và sợi lông. Đặt eppendorf chứa bột lông trong N2 lỏng hoặc trữ ở tủ -70 oC ngay sau đó. 20 Hình 3.4. Phân chia các vị trí lấy mẫu trên sợi lông heo 3.4.2. Tách chiết DNA Quy trình tách chiết DNA từ lông đƣợc tham khảo từ Nozawa và cs (1999). Mỗi eppendorf chứa bột lông (0,1 g) đƣợc cho thêm 300 µl buffer ly trích gồm: Tris–HCl (pH 8,0) 8 mM, NaCl 8 mM, EDTA 1,6 mM, SDS 1%, DTT 50 mM và proteinase K 0,8 mg/ml. Ủ hỗn hợp ở 37oC qua đêm. Tinh sạch DNA: Thêm 300 µl phenol (pH 8,0) vào mẫu. Vortex mạnh. Ly tâm 10.000 vòng/phút, 5 phút, 250C. Hút lớp trên cho vào eppendorf sạch khác. Hút cẩn thận tránh cuốn theo protein ở lớp dƣới. Thêm vào mẫu 1 thể tích phenol–chloroform đúng bằng thể tích vừa hút ra. Vortex. Ly tâm 10.000 vòng/phút, 5 phút, 250C. Lặp lại bƣớc này 1 lần nữa. Hút lớp trên cho vào eppendorf sạch khác. Thêm vào mẫu 1 thể tích chloroform đúng bằng thể tích vừa hút ra. Vortex. Ly tâm 10.000 vòng/phút, 5 phút, 250C. Hút lớp trên cho vào eppendorf sạch khác. Thêm CTAB và NaCl để nồng độ cuối cùng của CTAB đạt 0,2% và NaCl đạt 0,02 M. Đảo nhẹ. Để 15 phút. Ly tâm 10.000 vòng/phút, 5 phút, 250C. Lấy tủa. Thu hồi DNA: Thêm 300 µl NaCl 1,2 M; 150 µl sodium acetate 2 M, 1.000 µl ethanol tuyệt đối lạnh. Ủ 2 giờ. Ly tâm 10.000 vòng/phút, 5 phút, 250C. Lấy tủa. Làm khô tủa. Thêm 100 µl TE 1 X. } gốc lông (1 cm) thân lông (1 cm) { ngọn lông (2-3 cm) 21 Quy trình trên là quy trình tham khảo. Từ đó, tiến hành các thí nghiệm nhƣ mô tả bên dƣới để tìm quy trình ly trích DNA từ lông phù hợp. 3.4.2.1. Thiết lập quy trình ly trích DNA từ lông heo Để thiết lập quy trình ly trích DNA từ lông heo ổn định và hiệu quả, một số yếu tố đã đƣợc khảo sát để tìm ra quy trình tối ƣu. * Thí nghiệm 1: Khảo sát nồng độ proteinase K Proteinase K có tác dụng phân hủy keratin (một thành phần protein chính của lông) và bảo vệ những acid nucleic bằng cách phá hủy enzyme ribonuclease (McNevin và cs, 2005). Thí nghiệm 1 đƣợc bố trí nhằm khảo sát khả năng phân cắt keratin của proteinase K ở các nồng độ khác nhau. Thí nghiệm đƣợc bố trí để so sánh 3 quy trình ly trích: quy trình 1 sử dụng proteinase K nồng độ 0,8 mg/ml; quy trình 2 sử dụng proteinase K nồng độ 1 mg/ml và quy trình 3 sử dụng proteinase K nồng độ 1,2 mg/ml (các yếu tố khác đƣợc giữ nguyên nhƣ trong quy trình tham khảo). Các bƣớc tiến hành theo quy trình tham khảo. Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên một yếu tố. Mẫu thí nghiệm là mẫu gốc lông heo. Số mẫu đƣợc khảo sát là 4 cho mỗi nghiệm thức. Chỉ tiêu khảo sát là tỷ số OD, hàm lƣợng DNA thu hồi, sản phẩm PCR của gen halothane khi sử dụng DNA ly trích từ lông theo quy trình này. * Thí nghiệm 2: Khảo sát nồng độ DTT Ngoài proteinase K có khả năng cắt phân tử keratin thì DTT cũng có khả năng phân cắt keratin tốt. Theo Manual của Biorad (2005), DTT có khả năng cắt đứt nối S–S trong phân tử cystein của keratin. Thí nghiệm 2 đƣợc bố trí nhằm mục tiêu khảo sát xem nồng độ nào của DTT thì cho DNA chất lƣợng tốt . Thí nghiệm đƣợc bố trí để so sánh 3 quy trình ly trích: quy trình ly trích 1 sử dụng DTT với nồng độ 50 mM; quy trình 2 sử dụng DTT với nồng độ 65 mM và quy trình 3 sử dụng DTT với nồng độ 80 Mm. Sử dụng proteinase K theo nồng độ đã cho kết quả tốt nhất ở thí nghiệm 1. Các yếu tố khác đƣợc giữ nguyên nhƣ trong thí nghiệm 1. Các bƣớc thực hiện giống nhƣ thí nghiệm 1. Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên một yếu tố. Chỉ tiêu khảo sát là tỷ số OD, hàm lƣợng DNA thu hồi và sản phẩm PCR xác định gen halothane. Mẫu sử dụng là mẫu gốc lông heo. Số mẫu thí nghiệm là 4 mẫu cho mỗi quy trình. 22 * Thí nghiệm 3: Khảo sát nồng độ CTAB DTT chỉ phân cắt keratin mà không có khả năng loại bỏ đƣợc melanin. Theo Giambernardi và cs (1998), melanin làm ức chế phản ứng PCR. Theo Nozawa và cs (1999), CTAB có thể loại bỏ melanin ra khỏi DNA ly trích. Do đó, thí nghiệm 3 đƣợc bố trí để so sánh chất lƣợng DNA ly trích giữa 3 quy trình: quy trình 1 không sử dụng CTAB; quy trình 2 sử dụng CTAB nồng độ 0,1% và quy trình 3 sử dụng CTAB nồng độ 0,2%. Sử dụng DTT theo nồng độ đã cho kết quả tốt nhất ở thí nghiệm 2. Các yếu tố khác đƣợc giữ nguyên nhƣ trong thí nghiệm 2. Các bƣớc đƣợc thực hiện theo trình tự của thí nghiệm 2. Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên một yếu tố. Mẫu thí nghiệm là mẫu gốc lông heo. Số mẫu đƣợc khảo sát là 4 cho mỗi nghiệm thức. Chỉ tiêu khảo sát là tỷ số OD, hàm lƣợng DNA thu hồi, sản phẩm PCR của gen halothane. 3.4.2.2. Áp dụng quy trình ly trích DNA lên các vị trí khác nhau của lông heo Để khảo sát xem quy trình ly trích tối ƣu đƣợc rút ra từ những thí nghiệm trên sẽ cho kết quả tốt nhất trên vị trí nào của lông heo, thí nghiệm đƣợc bố trí nhƣ mô tả bên dƣới. * Thí nghiệm 4: Áp dụng quy trình ly trích lên các vị trí khác nhau của lông Thí nghiệm 4 đƣợc tiến hành nhằm khảo sát hiệu quả của việc tách chiết DNA theo quy trình tối ƣu trên đối với các vị trí khác nhau của lông. Từ đó rút ra vị trí tốt nhất trên lông để ly trích DNA. Thí nghiệm 4 đƣợc thực hiện theo các trình tự của quy trình tham khảo với nồng độ proteinase K, nồng độ DTT, nồng độ CTAB đã cho kết quả ly trích DNA tốt nhất qua các thí nghiệm trên. Thí nghiệm 4 đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên một yếu tố. Có 4 lô thí nghiệm: lô 1 gồm 10 mẫu gốc lông, lô 2 gồm 10 mẫu thân lông, lô 3 gồm 10 mẫu ngọn lông và lô 4 gồm 10 mẫu cả sợi lông (vị trí lông đƣợc phân chia theo hình 3.4). Chỉ tiêu khảo sát là tỷ số OD, hàm lƣợng DNA thu hồi, sản phẩm PCR của gen halothane. 3.4.3. Định lƣợng DNA bằng quang phổ kế DNA sau khi ly trích đƣợc đo bằng máy quang phổ kế ở bƣớc sóng 260 nm và 280 nm. Độ tinh sạch của DNA đƣợc tính bằng tỷ số OD260nm/OD280nm. DNA đƣợc xem là sạch nếu tỷ số khoảng 1,8 – 2,0. 23 Hàm lƣợng DNA đƣợc tính bằng công thức: DNA (ng/µl) = (62,9*OD260nm – 36*OD280nm)* độ pha loãng. Mẫu đƣợc pha loãng 100 lần theo tỷ lệ 10 µl DNA gốc: 990 µl H2O khi đo OD. 3.4.4. Thực hiện phản ứng PCR DNA sau khi đƣợc ly trích từ lông heo theo các quy trình trên đƣợc sử dụng làm mẫu để thực hiện PCR xác định gen halothane. Kết quả PCR sẽ là một trong những chỉ tiêu để đánh giá chất lƣợng DNA ly trích. Quy trình PCR xác định gen halothane đƣợc tham khảo từ Lƣơng Quý Phƣơng (2006). Bảng 3.4. Thành phần hỗn hợp PCR xác định gen halothane Thành phần Nồng độ đầu Nồng độ cuối PCR buffer 5 X 1 X MgCl2 25 mM 2 mM F/ R primer 100 µM 0,5 µM dNTP 25 mM 200 µM/ mỗi loại Taq polymerase 5 UI/µl 1 UI DNA 150 ng H2O cất vừa đủ 30 µl (Nguồn: Lƣơng Quý Phƣơng, 2006) Bảng 3.5. Chu kỳ nhiệt trong PCR xác định gen halothane (Nguồn: Lƣơng Quý Phƣơng, 2006) Tên giai đoạn Nhiệt độ (oC) Thời gian Biến tính hoàn toàn 94 5 phút 35 chu kỳ Biến tính Bắt cặp Kéo dài 94 54 72 45 giây 90 giây 90 giây Kéo dài cuối cùng 72 5 phút Trữ 4 24 3.4.5. Điện di và quan sát kết quả 3.4.5.1. Chuẩn bị gel agarose Nồng độ agarose dùng cho điện di sản phẩm PCR xác định gen halothane là 2%. Ví dụ cần 100 ml dung dịch agarose 2%, tiến hành nhƣ sau: - Cân 2 g agarose cho vào 100 ml dung dịch TBE 0,5 X - Đun sôi hỗn hợp trên trong 3 phút - Để nguội dần ở nhiệt độ phòng, đến khi vừa ấm là đƣợc - Đổ gel vào bể điện di (đặt lƣợc tạo giếng trƣớc khi đổ), chú ý tránh bọt khí - Để cho gel cứng hoàn toàn, rút lƣợc ra khỏi gel. Cho gel vào bể điện di, bổ sung thêm TBE cho ngập bản gel là đƣợc. - Trộn 10 sản phẩm PCR với 2 loading dye và bơm hỗn hợp vào các giếng gel. Vận hành máy điện di với các thông số 100 V, 250 mA, 30 phút. - Sau khi điện di, ngâm gel trong ethidium bromide 10 mg/ml trong 30 phút. 3.4.5.2. Đọc kết quả Điện di 7,5 µl sản phẩm PCR trong 30 phút với TBE 0,5 X ; dòng điện 100 V; 250 mA. Vớt gel ra khỏi buồng diện di và cho vào thùng nhuộm ethidium bromide 10 mg/ml trong 30 phút. Đặt gel lên bàn chụp UV, quan sát kết quả với phần mềm Geldoc của Biorad. 3.5. Xử lý số liệu Xử lý số liệu với các hàm thống kê F trong Excel và phần mềm Statgraphics 7,0. Kết quả đƣợc trình bày ở dạng X ± SE (Với SE = SD/√ n ). 25 PHẦN IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát nồng độ proteinase K Sử dụng mẫu gốc lông để ly trích DNA. Kết quả đo OD và hàm lƣợng DNA đƣợc trình bày trong bảng 4.1. Bảng 4.1. Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA ứng với các nồng độ proteinase K Chỉ tiêu Nồng độ proteinase K P 0,8 mg/ml 1 mg/ml 1,2 mg/ml Tỷ số OD 1,84 0,03 1,82 0,03 1,75 0,03 1,71 Hàm lƣợng DNA (µg/µl) 0,32 0,02 0,33 0,03 0,32 0,03 0,28 Số mẫu 4 4 4 1,84 1,82 1,75 0,32 0,33 0,32 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 2 0,8 mg/ml 1 mg/ml 1,2 mg/ml nồng độ proteinase K Tỷ số OD Hàm lượng DNA (µg/µl) Biểu đồ 4.1. Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA ứng với các nồng độ proteinase K McNevin và cs (2005) đã đƣa ra khoảng nồng độ proteinase K sử dụng trong dung dịch đệm ly trích DNA của lông là từ 0,05 đến 20 mg/ml. Qua bảng 4.1 cho thấy không có sự khác biệt về tỷ số OD và hàm lƣợng DNA thu hồi ở các nồng độ 0,8 mg/ml; 1 mg/ml và 1,2 mg/ml (P > 0,05). Phản ứng PCR từ các mẫu trên đều thành 26 công. Do đó, khi tiến hành các thí nghiệm ly trích DNA từ lông, có thể dùng buffer ly trích chứa proteinase K nồng độ 0,8 mg/ml để có lợi về mặt kinh tế. 1 2 3 4 Hình 4.1. Kết quả PCR mẫu gốc lông ở 3 nồng độ proteinase K 4.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát nồng độ DTT Sau khi đo OD và tính hàm lƣợng DNA thu hồi đƣợc từ các mẫu gốc lông đem thí nghiệm, chúng tôi tính toán các giá trị thống kê (xem bảng 4.2). Bảng 4.2. Kết quả tỷ số OD và hàm lƣợng DNA ứng với các nồng độ DTT Chỉ tiêu Nồng độ DTT P 50 mM 65 mM 80 mM Tỷ số OD 1,65 0,02 1,81 0,09 1,64 0,03 1,67 Hàm lƣợng DNA (µg/µl) 0,36 0,08 0,43 0,04 0,29 0,03 0,40 Số mẫu 4 4 4 1,65 1,81 1,64 0,36 0,43 0,29 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 2 50 mM 65 mM 80 mM nồng độ DTT Tỷ số OD Hàm lượng DNA (µg/µl) Biểu đồ 4.2. Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA ứng với các nồng độ DTT 586 bp 1: Mẫu gốc lông sử dụng proteinase K 0,8 mg/ml 2: Mẫu gốc lông sử dụng proteinase K 1 mg/ml 3: Mẫu gốc lông sử dụng proteinase K 1,2 mg/ml 4: Mẫu ĐC (DNA ly trích từ cơ) 27 Không có sự khác biệt về tỷ số OD giữa việc sử dụng DTT ở các nồng độ 50 mM, 65 mM và 80 mM (P > 0,05). Phản ứng PCR gen halothane thành công ở mẫu có sử dụng nồng độ DTT 50 mM nhƣng không thành công với những mẫu ly trích từ hai nồng độ còn lại. Sự hiện diện của DTT trong dung dịch đệm ly trích làm giảm rõ rệt lƣợng DNA ly trích (Kalbe và cs, 1988) và điều này có thể làm giảm việc gắn kết giữa các deoxyribose nucleotides trong DNA, làm chúng không thể đƣợc nhận biết bởi Taq polymerase (McNevin và ctv, 2005). Đó có thể là giả định giải thích tại sao phản ứng PCR không xảy ra đối với mẫu sử dụng nồng độ DTT 65 mM và 80 mM. Do đó, trong buffer ly trích DNA từ lông nên sử dụng DTT nồng độ 50 mM để cho DNA có chất lƣợng tốt. 1 2 3 4 Hình 4.2. Kết quả PCR mẫu gốc lông ở 3 nồng độ DTT 4.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát nồng độ CTAB Thí nghiệm đƣợc tiến hành trên mẫu gốc lông. Kết quả đo OD và hàm lƣợng DNA thu hồi đƣợc trình bày trong bảng 4.3. Bảng 4.3. Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA ứng với các nồng độ CTAB Chỉ tiêu Nồng độ CTAB P 0% 0,1% 0,2% Tỷ số OD 1,39 0,02 a 1,53 0,03 b 1,80 0,02 c 0,03 Hàm lƣợng DNA (µg/µl) 0,32 0,02 0,37 0,03 0,33 0,04 0,31 Số mẫu 4 4 4 586 bp 1: Mẫu gốc lông sử dụng DTT 50 mM 2: Mẫu gốc lông sử dụng DTT 65 mM 3: Mẫu gốc lông sử dụng DTT 80 mM 4: Mẫu ĐC (DNA ly trích từ cơ) 28 1,39 1,53 1,8 0,32 0,37 0,33 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 2 0% 0,10% 0,20% nồng độ CTAB Tỷ số OD Hàm lượng DNA (µg/µl) Biểu đồ 4.3. Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA ứng với các nồng độ CTAB Có sự khác biệt giữa tỷ số OD giữa các quy trình ly trích sử dụng CTAB ở các nồng độ 0%, 0,1% và 0,2% (P < 0,05). Sử dụng CTAB ở nồng độ 0,2% cho tỷ số OD cao nhất. Phản ứng PCR thành công đối với mẫu có sử dụng CTAB ở nồng độ 0,2%. Theo Nozawa và cs (1999), CTAB có khả năng loại bỏ melanin ra khỏi hỗn hợp mẫu lông. Ở những mẫu không sử dụng CTAB và những mẫu có sử dụng CTAB 0,1%, có lẽ nồng độ CTAB sử dụng không đủ để loại hết thành phần melanin trong hỗn hợp mẫu lông. Theo Sambrook và ctv (2001), độ tinh sạch của DNA ảnh hƣởng rất lớn đến hiệu quả PCR. DNA có tỷ số OD từ 1,8 – 2,0 đƣợc xem là sạch. Ở đây, mẫu không dùng CTAB và mẫu dùng CTAB 0,1% có tỷ số OD trung bình là 1,39 và 1,53. Tỷ số này thấp, chứng tỏ lƣợng protein trong dịch DNA còn nhiều. Đó có thể là lý do giải thích cho những phản ứng PCR không thành công ở mẫu không sử dụng CTAB và mẫu sử dụng CTAB 0,1%. Do đó, trong buffer ly trích DNA từ lông nên sử dụng CTAB nồng độ 0,2%. 29 1 2 3 4 Hình 4.3. Kết quả PCR mẫu gốc lông ở 3 nồng độ CTAB 4.4. Thí nghiệm 4: Áp dụng quy trình ly trích lên các vị trí khác nhau của lông Thí nghiệm đƣợc bố trí trên các lô mẫu gốc lông, thân lông, ngọn lông và cả sợi lông heo. Kết quả đo OD và hàm lƣợng DNA đƣợc trình bày trong bảng 4.4a. Bảng 4.4a. Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA ứng với các vị trí của lông heo Chỉ tiêu Mẫu p Gốc Thân Ngọn Cả sợi Tỷ số OD 2,05±0,15 a 1,84±0,15 b 1,40±0,15 c 1,75±0,15 b 0,04 Hàm lƣợng DNA (µg/µl) 0,33±0,15 a 0,30±0,15 ab 0,24±0,15 c 0,28±0,15 b 0,03 Số mẫu 10 10 10 10 2,05 1,84 1,4 1,75 0,33 0,3 0,24 0,28 0 0,5 1 1,5 2 2,5 Gốc Thân Ngọn Sợi Tỷ số OD Hàm lượng DNA (µg/µl) Biểu đồ 4.4. Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA ứng với các vị trí lông heo 586 bp 1: Mẫu gốc lông không sử dụng CTAB 2: Mẫu gốc lông sử dụng CTAB 0,1% 3: Mẫu gốc lông sử dụng CTAB 0,2% 4: Mẫu ĐC (DNA ly trích từ cơ) 30 Qua bảng 4.4a cho thấy có sự khác biệt về tỷ số OD trên các vị trí khác nhau của lông heo (P < 0,05). Vị trí cho tỷ số OD tốt nhất là mẫu gốc lông (2,05), tiếp theo là mẫu thân lông (1,84), vị trí cho tỷ số OD thấp nhất là mẫu ngọn lông (1,40), vị trí cho tỷ số OD chấp nhận đƣợc là cả sợi lông (1,75). Nguyên nhân có thể là do mức độ keratin hóa ở gốc ít hơn ở ngọn cho nên việc tách keratin ra khỏi hỗn hợp DNA ly trích từ gốc dễ dàng hơn so với phần ngọn. Kết quả cho thấy hàm lƣợng DNA thu hồi từ mẫu gốc lông đạt cao nhất (0,33 µg/µl). Trong khi đó, mẫu thân lông đạt 0,3 µg/µl, mẫu cả sợi lông đạt 0,28 µg/µl và mẫu ngọn lông là thấp nhất (0,26 µg/µl). Sự khác biệt này rất có ý nghĩa về mặt thống kê (P < 0,05). Nguyên nhân có thể là do phần lớn tế bào ở ngọn lông là tế bào chết nên mất hết DNA, vì thế lƣợng DNA thu hồi sẽ ít hơn so với lƣợng DNA thu hồi từ gốc và thân lông (nơi có nhiều tế bào còn sống). Bảng 4.4b. Kết quả PCR từ các vị trí lông heo Mẫu Số mẫu tiến hành PCR Số mẫu có sản phẩm PCR Tỷ lệ mẫu có sản phẩm PCR (%) P Gốc lông 10 7 70 0,03 Thân lông 10 6 60 Ngọn lông 10 0 0 Sợi lông 10 5 50 Qua bảng 4.4b cho thấy DNA ly trích từ mẫu gốc lông cho tỷ lệ thành công của phản ứng PCR cao nhất (70%), tiếp theo là mẫu thân lông (60%) và mẫu cả sợi lông (50%). Mẫu ngọn lông do tỷ số OD còn quá thấp nên phản ứng PCR không xảy ra (tỷ lệ PCR thành công là 0%). Sự khác biệt này là có ý nghĩa (p < 0,05). Trong các nghiên cứu sử dụng mẫu lông của thú sống, việc nhổ cả sợi lông trên mình thú với số lƣợng lớn sẽ dễ làm cho thú bị stress, ảnh hƣởng đến khả năng sinh trƣởng, phát triển và sinh sản của thú. Để giải quyết vấn đề này, chúng ta có thể dùng dao cắt những sợi lông ngay trên bề mặt da thú rồi áp dụng quy trình ly trích DNA cho mẫu thân lông. 31 Nhƣ vậy, ly trích DNA từ gốc lông và thân lông sẽ cho DNA chất lƣợng tốt hơn so với cả sợi lông và ngọn lông. Trong trƣờng hợp thú sống, sử dụng mẫu thân lông để ly trích DNA thì thích hợp hơn cả. Do vậy, có thể xem thân lông là vị trí thích hợp để ly trích DNA. 1 2 3 4 5 6 7 8 Hình 4.4a. Kết quả PCR vị trí gốc lông 1 2 3 4 5 6 7 8 Hình 4.4b. Kết quả PCR vị trí thân lông 586 bp 586 bp 1->7: Các mẫu gốc lông 8: Mẫu ĐC (DNA đƣợc ly trích từ cơ) 1->7: Các mẫu thân lông 8: Mẫu ĐC (DNA đƣợc ly trích từ cơ) 32 1 2 3 4 5 6 7 8 Hình 4.4c. Kết quả PCR vị trí cả sợi lông 586 bp 1->7: Mẫu sợi lông 8: Mẫu ĐC (DNA đƣợc ly trích từ cơ) 33 PHẦN V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận - Sử dụng buffer ly trích chứa proteinase K ở các nồng độ 0,8 mg/ml, 1 mg/ml và 1,2 mg/ml đều cho chất lƣợng DNA tốt với tỷ số OD từ 1,75 – 1,84. - DNA đƣợc ly trích với DTT ở nồng độ 50 mM khá tinh sạch (OD = 1,65) và thành công khi đƣợc dùng làm nguồn mẫu cho phản ứng PCR. - Sử dụng CTAB 0,2% cho DNA tinh sạch (tỷ số OD trung bình là 1,80) và phản ứng PCR khuếch đại đƣợc gen halothan ở nồng độ này. - Vị trí gốc lông cho DNA ly trích tinh sạch nhất (OD = 2,05), tiếp theo là vị trí thân lông (OD = 1,84), cả sợi lông (OD = 1,75),vị trí ngọn lông (OD = 1,4). Phản ứng PCR khuếch đại gen halothane cho tỷ lệ thành công cao nhất đối với mẫu gốc lông (70%), tiếp theo là mẫu thân lông (60%) và cả sợi lông (50%). Phản ứng PCR không thành công đối với mẫu ngọn lông. 5.2. Đề nghị - Tiếp tục cải thiện quy trình ly trích DNA từ lông để cho hiệu suất PCR cao nhất. - Sử dụng thân lông (đoạn 1 cm kể từ da thú trở lên) dùng làm nguyên liệu ly trích DNA. - Áp dụng quy trình ly trích DNA từ lông này lên các loài thú khác nhau, kể cả với lông ngƣời trong những lĩnh vực có liên quan. 34 PHẦN VI. TÀI LIỆU THAM KHẢO *Tài liệu Tiếng Việt 1. Bùi Thị Ngọc Bích, 2006. Sử dụng một số hóa chất để cải thiện hiệu quả ly trích DNA từ lông. Khóa luận tốt nghiệp, ngành Công Nghệ Sinh Học, Trƣờng Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, Việt Nam. 2. Đinh Văn Chỉnh và ctv, 1999. Xác định tần số kiểu gen và tính năng sản xuất của lợn Landrrace và Yorshire có các kiểu gen khác nhau đƣợc nuôi ở một số cơ sở giống miền Bắc. Báo cáo Khoa học – NXB Nông Nghiệp. 3. Lê Thị Thu Hà, 2006. Chọn lọc đàn giống hạt nhân qua đánh giá giá trị giống kết hợp với phân tích gen estrogen (Esr), halothane (Hal). Đề tài nghiên cứu khoa học và phát triển công nghệ, Viện Khoa Học Kỹ Thuật Nông nghiệp miền Nam, Việt Nam. 4. Lê Thị Thu Phƣơng, 2004. Phát hiện gen halothane, gen thụ thể estrogen và mối liên quan giữa hai gen này đến năng suất sinh sản của heo nái. Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp, Trƣờng Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, Việt Nam. 5. Lƣơng Quý Phƣơng, 2006. Sản xuất bộ kit ly trích DNA và kit phát hiện gen halothane trên heo. Khóa luận tốt nghiệp, ngành Công Nghệ Sinh Học, Trƣờng Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, Việt Nam. 6. Nguyễn Ngọc Tuân, Trần Thị Dân, 2000. Vài kinh nghiệm ứng dụng PCR để phát hiện gen halothane và gen thụ thể estrogen , mối quan hệ giữa hai gen này với sức sản xuất của nái, nọc và heo thịt. Hội nghị KH chuyên ngành Chăn nuôi -Thú y. 7. Nguyễn Ngọc Tuân và Trần Thị Dân, 2005. Ảnh hƣởng của gen halothane, gen thụ thể estrogen đến năng suất sinh sản và phẩm chất thịt. Tạp chí KHKT Nông Lâm Nghiệp, số 2&3/2005. 8. Nguyễn Văn Út, 2005. Xác định giới tính bằng kỹ thuật multiplex PCR trên 3 giống bò. Khóa luận tốt nghiệp,ngành Công Nghệ Sinh Học, Trƣờng Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, Việt Nam. 35 *Tài liệu Tiếng Anh 9. DeSilva U., Guo X., Kupfer D.M., Fernando S.C., Pillai A.T.V., F. Z., Najar S. So, Fitcha G.Q., Roeb B.A., 2003. Allelic variants of ovine prion protein gene (PRNP) in Oklahoma sheep. Cytogenet Genome Res 102: 89 – 94. 10. Elizabeth A. G, David R. F., 2005. A simplified method for mitochondrial DNA extraction from head hair shafts. J. Forensic Sci 50: 5. 11. Galan M., Baltzinger C., Hewison A. J. M., Cosson J., 2003. Deer species identification using DNA extracted from hair samples and the polymerase chain reaction (PCR) method. Trends in Ecology and Evolution 12: 223 – 227. 12. Haase A., Retzel E. F., Stakus K. A., 1990. Amplification arid detection of lentiviral DNA inside cells. Proc. Natl Acad. SCUSA 87: 4971 – 4975. 13. Pfeiffer, I. Volkel, H. Taubert, B. Brenig, 2004. Forensic DNA-typing of dog hair: DNA-extraction and PCR amplification. Forensic Science International 141: 149 – 151. 14. James N. J., Mary V. A., 2004. Genetic variability and population differentiation in Captive Baird’s Tapirs (Tapirus bairdii). Zoo Biology 23: 521– 531. 15. Mark R. Wilson, Joseph A. DiZinno, Deborah Polanskey, Jeri Replogle, Bruce Budowle, 1995. Validation of mitochondrial DNA sequencing for forensic casework analysis. J. Legal Med 108: 68 – 74. 16. Mark R. Wilson, Joseph A. DiZinno, Deborah Polanskey, Jeri Replogle, Bruce Budowle, 1995. Validation of mitochondrial DNA sequencing for forensic casework analysis. J Legal Med 108: 68 – 74. 17. McNevin D., Wilson - Wilde L., Robertson J., Kyd J., Lennard C., 2005. Short tandem repeat (STD) genotyping of keratinised hair. Forensic Science International 153: 237 – 259. 18. Morel G., Berger M., Ronsin B., Recher S., Richard- Blum S., Mertani H.C., Lobie P. E., 1998. In situ reverse transcription - polymerase chain reaction. Applications for light and electron microscopy. Biology of the Cell 90: 137 – 154. 19. Nozawa H.D., Yanamoto T., Uchihi R., Yoshimoto T., Tamoaki K., Hayash S., Ozawa T., KatsumataY., 1999. Purification of nuclear DNA from single hair shafts for DNA analysis in forensic sciences. Legal Med 1: 61 – 67. 36 20. Rees J. L., 2003. Genetics of hair and skin colour. Annu. Rev. Genet 37: 67 – 90. 21. Riginaldo Gaspar Bastos, Joreci Federizzi, Joao Carlos Deschamps, Ricardo Cardellino and Odir Antonio Dellagostin, 2000. Characterization of swine stress gene by DNA testing using plucked hair as a source of DNA. Genetics and Molecular Biology 23: 815 – 817. 22. Sake R. K., Scharf S., Faloona F., Mullis K. B., Horn Mullis K.B., Horn G., Erlich H.A., Amheim N., 1985. Enzymatic amplification of globin genomic sequences and restriction site.analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science 230: 1350 – 1355. 23. Sauer S., Lechner D., Berlin K., Plancon C., Heuermann A., Lehrach H., and Gut G. I., 2000. Ful flexibility genotyping of single nucleotide polymorphisms by the good assay. Nucleic Acids Research 28: p. 23. 24. Vigilant L., 1999. An evaluation of techniques for the extraction and amplification of DNA from naturally shed hairs. Bio. Chem 390: 1329 – 1321. 25. Werner A. Baumgartner, 1979. Radioimmunoassay of hair for determining opiate abuse histories, J. Nucl Med 20: 749 – 752.