Khóa luận Xây dựng phương pháp nhận diện và phân tích tính đa dạng di truyền của 21 dòng cacao (Theobroma cacao L.) bằng kỹ thuật microsatellite
TÓM TẮT KHÓA LUẬN
Tên đề tài: Xây dựng phương pháp nhận diện và phân tích tính đa dạng di truyền của 21 dòng cacao (Theobroma cacao L.) bằng kỹ thuật Microsatellite.
Thời gian nghiên cứu: từ tháng 3/2005 đến tháng 8/2005.
Địa điểm nghiên cứu: Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Trường Đại Học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh.
Cơ sở nghiên cứu: Sử dụng marker phân tử Microsatellite trên cở sở phương pháp PCR và phân tích trình tự tự động để xây dựng phương pháp nhận diện hiệu quả và phân tích tính đa dạng di truyền của một số dòng cacao.
Mục đích nghiên cứu:
- Xây dựng phương pháp nhận diện 21 dòng cacao bằng kỹ thuật microsatellite với độ chính xác và ổn định cao.
- Tối ưu hoá phương pháp bằng kỹ thuật multiplex PCR.
- Nghiên cứu tính đa dạng di truyền của 21 dòng cacao, làm cơ sở để đánh giá, phân loại và chọn lọc các giống có định hướng.
Phương pháp nghiên cứu:
- Sử dụng 5 cặp primer microsatellite: mTcCIR7, mTcCIR8, mTcCIR11, mTcCIR15 và mTcCIR18 để phát hiện trình tự microsatellite đặc trưng.
- Tiến hành phân tích microsatellite trên máy giải trình tự DNA (ABI 3100), sử dụng phần mềm Gene Mapper để phân tích dữ liệu microsatellite thu được.
- Sử dụng phần mềm Genetix để phân tích tính đa dạng di truyền của 21 dòng cacao khảo sát.
Kết quả:
- Phương pháp và kỹ thuật định danh ổn định, có độ chính xác cao
- Tối ưu hóa phương pháp nhờ thực hiện thành công qui trình phản ứng multiplex PCR với 3 primer khác màu huỳnh quang, có cùng nhiệt độ bắt cặp 46oC.
- Thiết lập được mối quan hệ di truyền giữa 21 dòng cacao khảo sát.
Kết luận : 5 cặp primer microsatellite sử dụng trong đề tài đủ để định danh chính xác 21 dòng cacao khảo sát và phân tích được tính đa dạng di truyền của chúng. Đồng thời phương pháp và kỹ thuật định danh của đề tài phù hợp với phương pháp phân tích microsatellite của Ngân hàng cacao thế giới ICGD, mở ra một triển vọng cho các ứng dụng tiếp theo của microsatellite.
MỤC LỤC
CHƯƠNG
Lời cảm tạ iii
Tóm tắt iv
Mục lục v
Danh sách các chữ viết tắt viii
Danh sách các hình ix
Danh sách các bảng x
1. MỞ ĐẦU 1
1.1.Đặt vấn đề 2
1.2.Mục đích yêu cầu 3
2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
2.1. Giới thiệu tổng quan về cây cacao 3
2.1.1. Nguồn gốc cây cacao 3
2.1.2. Đặc điểm hình thái 3
2.1.3.Yêu cầu sinh thái 5
2.1.4. Các giống cacao 5
2.1.4. Đặc điểm chính của 21 dòng cacao nghiên cứu trong đề tài 6
2.2. Qui trình ly trích DNA ở tế bào thực vật 6
2.3. Giới thiệu về kỹ thuật PCR 8
2.3.1. Nguyên tắc của kỹ thuật PCR 8
2.3.2. Tối ưu hóa các điều kiện cho phản ứng PCR 10
2.3.2.1. DNA mẫu 10
2.3.2.2. Taq polymerase 10
2.3.2.3. Primer 11
2.3.2.4. Nhiệt độ bắt cặp 13
2.3.2.5. Tỉ lệ primer/DNA khuôn mẫu 14
2.3.2.6. Các thành phần khác 14
2.3.2.7. Số lượng chu kỳ phản ứng PCR 15
2.3.2.8. Thiết bị và dụng cụ trong phản ứng PCR 15
2.3.3. Các vấn đề thường gặp trong phản ứng PCR và hướng giải quyết 16
2.3.4. Ưu, nhược điểm của kỹ thuật PCR 17
2.4. Giới thiệu về phương pháp phân tích trình tự DNA 19
2.5. Giới thiệu về Microsatellite 20
2.5.1. Khái niệm về Microsatellite 20
2.5.2. Các loại Microsatellite 20
2.5.3. Cơ chế hình thành Microsatellite 21
2.5.4. Vai trò của Microsatellite 22
2.5.5. Các phương pháp phát hiện Microsatellite 24
2.5.5.1.Phương pháp lai 24
2.5.5.2.Phương pháp PCR 24
2.5.6.Nguyên tắc phát hiện microsatellite bằng primer PCR 25
2.5.6.1.Khả năng chuyển đổi primer microsatellite giữa các loài 27
2.5.6.2.Thiết kế primer microsatellite 28
2.5.7.Ưu, khuyết điểm của phương pháp microsatellite so vớ các phương pháp khác 29
2.5.8. Những ứng dụng của nghiên cứu Microsatellite 30
2.6. Các công trình nghiên cứu có liên quan 31
2.6.1. Kiểm tra tính đồng nhất di truyền của Theobroma cacao bằng Microsatellite marker 31
2.6.2. Nghiên cứu fingerprinting DNA của cacao sử dụng Microsatellite marker 32
3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35
3.1. Vật liệu 35
3.1.1. Các giống cacao thí nghiệm 35
3.1.2. Hóa chất thí nghiệm 37
3.1.2.1. Primer 37
3.1.2.2. Các hóa chất dùng trong ly trích DNA 38
3.1.2.3. Các hóa chất dùng trong phản ứng PCR 38
3.1.2.4. Các hóa chất dùng trong phân tích trình tự 38
3.1.3. Thiết bị thí nghiệm 39
3.2. Phương pháp 39
3.2.1. Đối tượng nghiên cứu 39
3.2.2. Bố trí thí nghiệm 39
3.2.3. Kỹ thuật ly trích DNA 41
3.2.4. Kiểm tra định lượng và định tính DNA 42
3.2.4.1.Định tính DNA bằng phương pháp điện di 42
3.2.4.2.Định lượng DNA bằng quang phổ kế 42
3.2.5. Qui trình phản ứng Microsatellite 42
3.2.5.1.Phản ứng PCR với 1 cặp primer 42
3.2.5.1.Phản ứng multiplex PCR với 3 cặp primer 43
3.2.6.Điện di sản phẩm PCR 45
3.2.7.Phương pháp phân tích trình tự bằng máy giải trình tự DNA 45
3.2.8.Phương pháp nhận diện bằng phần mềm Cervus 46
3.2.9.Phương pháp phân tích tính đa dạng di truyền bằng phần mềm Genetix
4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 50
4.1.Sản phẩm DNA li trích 50
4.2.Sản phẩm PCR 51
4.3.Dữ liệu Microsatellite để định danh 21 dòng cacao 52
4.4.Kết quả nhận diện các mẫu được mã hóa 55
4.5. So sánh dữ liệu microsatellite 58
4.6.Kết quả phân tích multiplex PCR 59
4.7. Kết quả phân tích tính đa dạng di truyền 61
5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 63
6. PHỤ LỤC 65
7. TÀI LIỆU THAM KHẢO 83
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
µg: microgram
µl: microlite
µM: micromol/lite
Al: Allele
bp: base pair
CT: Cần Thơ
CTAB: Cetyltrimethylammonium bromide
DNA: Deoxyribonucleic acid
dNTP: Deoxyribonucleotide triphosphate
ICGD: International Cocoa Genebank Database
mM: milimolar (milimol/lite)
mTcCIR: microsatellite Theobroma cacao CIRAD
OD: Optical density.
PCR: Polymerase chain reaction
pmol: picomol
RNA: Ribonucleic acid
Rnase: Ribonuclease
SSR: Single sequence repeat
Ta : Annealing tenperature (nhiệt độ bắt cặp)
TAE: Tris-glacial acetic acid- ethylenne diamine tetra acetic acid
TE: Tris-EDTA (ethylenne diamine tetra acetic acid)
Tm: Melting temperature (nhiệt độ nóng chảy)
U: Đơn vị hoạt tính
USDA: United States Department of Agriculture
DANH SÁCH CÁC BẢNG
BẢNG TRANG
Bảng 2.1. Kết quả phân tích fingerprinting 32
Bảng 3.1. Các giống cacao thương mại khảo sát 36
Bảng 3.2. Primer microsatellite 37
Bảng 3.3. Thành phần hóa chất cho 1 phản ứng PCR 43
Bảng 3.4. Qui trình phản ứng PCR 43
Bảng 3.5. Thành phần hóa chất cho 1 phản ứng multiplex PCR 44
Bảng 3.6: Qui trình phản ứng Multiplex PCR 44
Bảng 3.7: Dữ liệu microsatellite đưa vào phân tích trong phần mềm Cervus 47
Bảng 3.8: Dữ liệu microsatellite được đưa vào phân tích trong Genetix 48
Bảng 3.9: Kích thước các al phân tích với mỗi loại primer 49
Bảng 3.10: Số lượng các al phân tích của mỗi quần thể với từng loại primer 49
Bảng 4.1: Dữ liệu Microsatellite với 3 primer 53
Bảng 4.2: Dữ liệu Microsatellite với 2 primer 53
Bảng 4.3: Kết quả nhận diện các mẫu mã hóa 56
Bảng 4.4: Kết quả nhận diện các mẫu mã hóa 57
Bảng 4.5: Kết quả so sánh của giống NA33 58
Bảng 4.6: Kết quả so sánh của giống AMAZ15/15 58
Bảng 4.7: Kết quả so sánh của giống PA107 59
DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ
BIỂU ĐỒ TRANG
Biểu đồ 3.1: 6 quần thể với số lượng cá thể tương ứng 49
Biểu đồ 3.2: 5 primer với số lượng al tương ứng 49
Biểu đồ 4.1: Sự đa dạng di truyền của 6 quần thể cacao khảo sát 62
DANH SÁCH CÁC HÌNH
HÌNH TRANG
Hình 2.1. Theobroma cacao 3
Hình 2.2. Nguyên tắc phản ứng PCR 9
Hình 2.3. Cấu trúc của máy ABI 9
Hình 2.4. Cơ chế bắt chéo lỗi trong giảm phân 21
Hình 2.5. Cơ chế trượt lỗi trong quá trình sao mã 22
Hình 2.6 : Phát hiện microsatellite từ DNA tổng số 25
Hình 2.7 : Vùng flanking ở 2 bên trình tự microsatellite 26
Hình 2.8 :Dữ liệu microsatellite phân tích bằng điện di trên gel 26
Hình 2.9 : Dữ liệu microsatellite phân tích tự động bằng điện di trên mao quản .27
Hình 3.1: Lấy mẫu lá cacao tại vườn 36
Hình 3.2: Đánh dấu cây được chọn 36
Hình 3.3: Giai đoạn nghiền mẫu 41
Hình 3.4: DNA tiếp tục được tinh sạch 41
Hình 3.5: Đĩa bơm mẫu 46
Hình 3.6: Lắp capillary vào máy 46
Hình 4.1: Kết quả điện di sản phẩm li trích DNA 50
Hình 4.2: Kết quả điện di sản phẩm PCR với primer mTcCIR7 51
Hình 4.3: Kết quả điện di sản phẩm multiplex PCR 51
Hình 4.4: Giống PBC 159 có 1 al dropping 246 với primer mTcCIR15 54
Hình 4.5: Các chỉ tiêu để kiểm tra mức độ đồng nhất di truyền 55
Hình 4.6:So sánh kết quả của 2 mẫu multiplex PCR giống nhau ở primer mTcCIR8
Hình 4.7:Kết quả phân tích mẫu CT3 bằng phương pháp kết hợp 3 sản phẩm PCR riêng biệt với 3 primer mTcCIR7, mTcCIR15 và mTcCIR11 60
XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP NHẬN DIỆN VÀ PHÂN TÍCH TÍNH ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA 21 DÒNG CACAO (THEOBROMA CACAO L.) BẰNG KỸ THUẬT MICROSATELLITE
16 trang |
Chia sẻ: maiphuongtl | Lượt xem: 1795 | Lượt tải: 0
Bạn đang xem nội dung tài liệu Khóa luận Xây dựng phương pháp nhận diện và phân tích tính đa dạng di truyền của 21 dòng cacao (Theobroma cacao L.) bằng kỹ thuật microsatellite, để tải tài liệu về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
Phần 3
Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
v
3.1.Vật liệu
3.1.1.Các giống cacao thí nghiệm
Các dòng cacao thí nghiệm bao gồm:
13 dòng cacao thương mại (được liệt kê ở bảng 3.1) được trồng tại vườn sưu tập giống cacao, Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh.
8 dòng cacao CT bao gồm: CT1, CT3, CT4, CT5, CT6, CT7, CT8 và CT9 được trồng tại 2 vườn giống cacao ở tỉnh Cần Thơ.
Ngoài ra còn có ba giống cacao: trồng tại vườn sưu tập giống cacao, Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh, được chọn để so sánh kết quả phân tích với Ngân hàng cacao thế giới.
Cách thức lấy mẫu như sau:
Giống ở gần phòng thí nghiệm (13 dòng cacao thương mại và 3 giống AMAZ15/15, NA33 và PA107): chúng tôi lấy mẫu lá tại vườn và đem về phòng thí nghiệm để ly trích DNA ngay. Vì chúng tôi quan sát thấy lá cacao nếu lưu trữ lâu quá 24 giờ, cho dù trong tủ -20oC, sẽ xuất hiện nhiều đốm nâu trên bề mặt lá làm ảnh hưởng đến chất lượng DNA ly trích.
Giống ở xa phòng thí nghiệm (8 dòng cacao CT): mẫu lá sau khi lấy được giữ lạnh và chuyển đến phòng thí nghiệm trong vòng 24 giờ để ly trích DNA ngay.
Trên mỗi cây, chúng tôi chọn các lá tươi, có màu xanh thẫm nhưng không quá già, cũng không chọn những lá non vì chúng chứa nhiều nhựa rất khó li trích, ngoài ra lá phải không có dấu hiệu bị sâu bệnh hay côn trùng tấn công. Các mẫu lá được trữ trong tủ -20oC cho đến khi tiến hành ly trích.
Những cây chọn để lấy mẫu lá (mỗi giống chọn 2 cây) được cột dây nylon màu để đánh dấu.
Bảng 3.1: Các dòng cacao thương mại khảo sát.
Sồ thứ tự
Tên thương mại
Tên dòng
Nguồn gốc
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
TD1
TD2
TD3
TD5
TD6
TD7
TD8
TD9
TD10
TD11
TD12
TD13
TD14
BAL209
BAL244
BR25
KKM 225
PBC123
PBC154
PBC157
PBC159
PBC230
PBC236
QH1213
QH22
QH441
Malaysia
Malaysia
Malaysia
Malaysia
Malaysia
Malaysia
Malaysia
Malaysia
Malaysia
Malaysia
Malaysia
Malaysia
Malaysia
Hình 3.1: Lấy mẫu lá cacao tại vườn
Hình 3.2: Đánh dấu cây được chọn
3.1.2.Hóa chất thí nghiệm
3.1.2.1.Primer
Tổng hợp kết quả nghiên cứu về 15 cặp primer microsatellite để kiểm tra tính đồng nhất di truyền của cacao do tổ chức USDA và Đại Học Pennsylvania State, Mỹ, thực hiện (xem phần 2.6.1 và 2.6.2), chúng tôi chọn ra 5 cặp primer để phát hiện các trình tự microsatellite nằm trên 5 nhiễm sắc thể (NST) khác nhau trên genome của cacao (Ingenic Newsletter No.9, 2004).
Năm cặp primer này cho các đoạn khuếch đại có tính đa hình cao giữa các giống cacao (xem bảng 2.1) do đó có thể cho kết quả phân biệt rõ giữa các dòng cacao khảo sát.
Các primer có chiều dài từ 18-20bp, primer forward ở mỗi primer được đánh dấu bằng màu huỳnh quang ở đầu 5’, do công ty Applied-Biosystem, Mỹ, tổng hợp.
Bảng 3.2: Các primer microsatellite dùng trong thí nghiệm
Tên
Màu hùynh quang
Trình tự microsatellite
Vị trí trênNST
Ta (oC)
Trình tự khuếch đại
mTcCIR7
mTcCIR8
mTcCIR11
mTcCIR15
mTcCIR18
Xanh dương
Xanh lá cây
Vàng
Đỏ
Xanh dương
5’-6FAMATGCGAATGACAACTGGT-3’ GCTTTCAGTCCTTTGCTT
5’-VICCTAGTTTCCCATTTACCA-3’ TCCTCAGCATTTTCTTTC
5’-NEDTTTGGTGATTATTAGCAG-3’ GATTCGATTTGATGTGAG
5’-PETCAGCCGCCTCTTGTTAG-3’ TATTTGGGATTCTTGATG
5’-6FAMGATAGCTAAGGGGATTGAGGA-3’ GGTAATTCAATCATTTGAGGATA
7
9
2
1
4
51
46
46
46
51
(GA)11
(TC)5 TT(TC)17TTT(CT)4
(TC)13
(TC)19
(GA)12
3.1.2.2.Các hóa chất dùng trong ly trích DNA
Dịch trích DNA (extraction buffer EB), 100mL EB bao gồm of 2g CTAB, 28mL 5M NaCl, 20mL 0.5M Tris-HCl, 4mL 0.5M EDTA, 1mL Mercapto ethanol, nước cất 2 lần khử ion đã hấp khử trùng.
TE buffer, bao gồm 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) and 1mM EDTA (pH 8.0).
CIA, bao gồm 24V chloroform: 1V isoamylalcohol.
Isopropanol.
Sodium acetate.
Ethanol 70% and 96%.
RNase.
Low-salt TE (10 mM Tris-HCl , 1mM EDTA [pH 8.0]).
3.1.2.3.Các hóa chất dùng trong phản ứng PCR
10X PCR buffer (do công ty BioRad cung cấp).
25mM MgCl2 (do công ty BioRad cung cấp).
10mM dNTP’s (do công ty Applied-Biosystem-Mỹ cung cấp).
Taq DNA polymerase (do công ty BioRad cung cấp)
Primer (do công ty Applied-Biosystem-Mỹ cung cấp).
DNA mẫu (ly trích từ lá cacao).
H2O cất 2 lần, siêu lọc, hấp khử trùng.
3.1.2.4.Các hóa chất dùng trong phân tích trình tự
Sản phẩm PCR.
Chất làm biến tính DNA: Hidi Formamide
Chất chuẩn để xác định kích thước của các peak (size standard).
Polymer pop 6-ABI.
Buffer.
3.1.3.Trang thiết bị thí nghiệm
Chén sứ và chày giã (Đức)
Eppendorf 0,2 ml; 0,5 ml; 1,5 ml (Mỹ)
Cân phân tích 4 số (Ohaus - Mỹ)
Máy hút và tủ cấy vô trùng (Anh Quốc).
Pipet các loại (Nichiryo –Nhật).
Đầu típ các loại (Đức)
Máy ly tâm lạnh (Hettich –Đức).
Máy luân nhiệt (Biorad –Thụy Điển).
Máy điện di (Cosmo Bio Co. –Nhật).
Máy chụp ảnh DNA (Biorad –Mỹ).
Lò Viba (Electrolux –Thụy Điển).
Máy định ôn (Memmert –Đức).
Tủ lạnh các loại (Sanyo –Nhật).
Máy giải trình tự ABI 3100 (Applied Biosystem-Mỹ)
Mao quản 36cm (Applied Biosystem-Mỹ)
3.2.Phương pháp
3.2.1.Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu của đề tài là DNA được ly trích từ lá của 21 dòng cacao khảo sát. Từ DNA tổng số thu được, chúng tôi sẽ tiếp tục nghiên cứu các al có chứa các trình tự microsatellite đặc trưng cho từng dòng.
3.2.2.Bố trí thí nghiệm
Đề tài được thực hiện tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm trường Đại Học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh. Thời gian từ tháng 3/20005 đến tháng 8/2005 gồm 4 giai đoạn chính như sau:
Giai đoạn 1: Xây dựng phương pháp nhận diện 21 dòng cacao dựa trên 5 cặp primer microsatellite mTcCIR7, mTcCIR8, mTcCIR11, mTcCIR15 và mTcCIR18. Phương pháp nhận diện gồm 4 bước:
Lấy mẫu lá của 21 dòng cacao.
Tiến hành li trích DNA
Thực hiện phản ứng PCR với 5 primer.
Phân tích sản phẩm PCR thu được trên máy giải trình tự DNA. Dùng phần mềm Gene Mapper để đọc kết quả phân tích các đoạn microsatellite của mỗi dòng. Ghi nhận dữ liệu microsatellite của 21 dòng cacao với 5 primer.
Giai đoạn 2: Kiểm tra độ chính xác và tính ổn định của phương pháp nhận diện.qua 2 bước:
1. Thu nhận mẫu lá của 13 dòng cacao thương mại cũng từ vườn giống cacao tại Đại Học Nông Lâm, 13 dòng này đã được người lấy mẫu mã hoá tên giống dưới dạng: A2, A3, A4, A5, A6, A7, A8, A9, A10, A11, A12, A13, A14 (các mã số này được giữ kín cho đến khi thu được kết quả cụ thể). Tiến hành các bước phân tích như ở giai đoạn 1 để thu nhận dữ liệu Microsatellite của 13 dòng đã mã hoá. Nhận diện các giống mã hóa bằng cách dùng phần mềm Cervus để kiểm tra mức độ đồng nhất.
2. Chọn tại vườn giống cacao Đại Học Nông Lâm một số giống cacao truyền thống đã có dữ liệu Microsatellite lưu trữ trong ngân hàng cacao thế giới ICGD. Tiến hành phân tích các giống truyền thống này và so sánh dữ liệu Microsatellite của chúng với dữ liệu tương ứng trên ngân hàng dữ liệu cacao thế giới ICGD.
Giai đoạn 3: Tối ưu hóa phương pháp.
Thực hiện phản ứng multiuplex PCR với 3 cặp primer có cùng nhiệt độ bắt cặp 46oC và được đánh dấu màu huỳnh quang khác nhau: mTcCIR8, mTcCIR11, mTcCIR15. Chúng tôi chọn thử nghiệm với một số mẫu có dữ liệu microsatellite giống nhau trên 1 cặp primer.
Giai đoạn 4: Phân tích tính đa dạng di truyền của 21 dòng cacao bằng phần mềm Genetix dựa trên dữ liệu microsatellite với 5 cặp primer.
3.2.3.Kỹ thuật ly trích DNA
DNA của lá cacao được ly trích theo qui trình trong luận văn tốt nghiệp của Hoàng Thị Liễu, 2004, nhưng có thay đổi tốc độ và thời gian ly tâm cho phù hợp với điều kiện máy li tâm tại phòng thí nghiệm với tốc độ tối đa cho phép là 12000 vòng/phút.
1- Cân 0.2g lá đã rửa sạch. Cho 1.2ml dịch trích EB vào eppendorf, nghiền lá với dung dịch này. Vortex kỹ. Ủ ở 65oC trong 45 phút.
Thêm 500µl Chloroform:Isoamyl alcohol (24:1), vortex 10 phút, li tâm 7 phút 12000 vòng ở 4oC.
Chuyển lấy dịch trong, lặp lại bước 2.
Chuyển lấy dịch trong, thêm vào 0.5 µl RNase, ủ ở 370C trong 1 giờ.
Thêm vào 250µl Isopropanol lạnh. Để tủa ở -200C khoảng 30 phút (nên để qua đêm).
Li tâm 7 phút 12000 vòng ở 4oC. Đổ bỏ dịch trong.
Cho vào 300µl TE 1X, ủ 370C trong 1 giờ.
Thêm 20µl muối Sodium acetate 3M và 640µl Ethanol 96%, trộn đều và để -200C trong 30 phút.
Ly tâm 12 phút 12000 vòng ở 4oC, đổ bỏ dịch trong.
Rửa cặn với 400µl Ethanol 70% bằng cách ly tâm 3 phút 12000 vòng ở 4oC, đổ bò dịch trong.
Lặp lại bước 10, để khô cặn, hòa tan cặn trong 200µl TE 1X, ủ ở 370C trong 45 phút.
Bảo quản mẫu ở 4oC.
Hình 3.3: Giai đoạn nghiền mẫu
Hình 3.4: DNA tiếp tục được tinh sạch
3.2.4.Kiểm tra định lượng và định tính DNA
3.2.4.1. Định tính DNA bằng phương pháp điện di
Để kiểm tra kết quả li trích có thu được DNA hay không, chúng tôi tiến hành điện di các mẫu DNA đã li trích trên gel agarose 1.4%, nấu agarose trong lò viba trong 2.5 phút, 500W .
Trộn 4 µl sản phẩm li trích với 2µl loading dye (BioRad). Vận hành máy điện di ở 100V, 250A trong 20 phút. Sau đó đem nhuộm ethium bromide trong 20 phút. Gel sau khi nhuộm sẽ được chụp bằng tia tử ngoại (UV). Nếu mẫu có DNA thì băng DNA sẽ phát sáng dưới dạng vạch trên gel điện di. Độ tập trung và độ đậm nhạt của băng điện di phản ánh độ tinh sạch và nồng độ cao hay thấp của mẫu DNA.
3.2.4.2. Định lượng DNA bằng quang phổ kế
Các mẫu DNA li trích sau khi đã định tính được kiểm tra độ tinh sạch và ước lượng hàm lượng DNA bằng cách đo mật độ quang OD (optical density) với bước sóng 260nm và 280nm bằng máy quang phổ kế với độ pha loãng 100 lần. Hàm lượng DNA được tính theo công thức:
DNA (ng/µl) = [(62.9 x OD260nm) – (36 x OD280nm)] x 100
DNA được xem là sạch nếu tỉ số OD260nm/OD280nm nằm trong khoảng 1.7 đến 2.2.
3.2.5.Qui trình phản ứng Microsatellite
3.2.5.1.Phản ứng PCR với 1 cặp primer
Hiện nay có rất nhiều qui trình PCR microsatellite cho cacao, nhưng chúng tôi chỉ chọn áp dụng qui trình cũng như thành phần hóa chất của Đại Học Reading (Anh Quốc) vì nó phù hợp với trình tự primer tổng hợp.
Thứ tự pha trộn mẫu trong phản ứng PCR tuân theo thứ tự được liệt kê ở bảng bên dưới để đảm bảo hiệu quả phản ứng. Sau khi cho Taq polymerase vào phản ứng PCR sẽ bắt đầu xảy ra, do vậy phải nhanh chóng cho vào máy PCR để bắt đầu qui trình phản ứng.
Tổng thể tích cho 1 phản ứng PCR là 20µl với thành phần phản ứng như sau:
Bảng 3.3: Thành phần hóa chất cho 1 phản ứng PCR
Thành phần
Dung dịch gốc
Thể tích sử dụng
H2O cất hai lần
PCR buffer
MgCl2
dNTP
Primer mix
DNA mẫu
Taq polymerase
10X
25mM
1.5mM
1pmol/µl
50ng/µl
5U/µl
5.8µl
2.0µl
1.8µl
4.0µl
4.0µl
2.0µl
0.4µl
Do các primer sử dụng có nhiệt độ bắt cặp khác nhau, chuyên biệt cho từng loại primer, nên trong mỗi qui trình PCR cần phải điều chỉnh nhiệt độ bắt cặp thích hợp cho từng primer.
Bảng 3.4: Qui trình phản ứng PCR
Chu kỳ
Nhiệt độ (oC)
Thời gian
0
94
2 phút
1 đến 35
94
30 giây
51 hoặc 46
30 giây
72
2 phút 15 giây
36
72
5 phút
37
10
1 phút
38
4
15 phút
3.2.5.1.Phản ứng multiplex PCR với 3 cặp primer
Multiplex PCR rất cần thiết trong nghiên cứu về microsatellite vì nó có thể nghiên cứu nhiều al, nhiều locus có kích thước khác nhau cùng một lúc. Ngày nay với sự phát triển của các chất nhuộm màu huỳnh quang cho phép nghiên cứu cùng lúc những al có kích thước bằng nhau và được gắn các màu huỳnh quang khác nhau.
Để phản ứng multiplex PCR cho kết quả tốt, tất cả các locus phản ánh đúng, chính xác thì các primer phải có nhiệt độ bắt cặp gần nhau.
Dựa trên thành phần phản ứng PCR với 1 cặp primer, chúng tôi thay thành phần nước bằng thể tích của 2 cặp primer. Do đó tổng thể tích cho 1 phản ứng multiplex PCR là 22.2µl với thành phần phản ứng như sau:
Bảng 3.5: Thành phần hóa chất cho 1 phản ứng multiplex PCR
Thành phần
Dung dịch gốc
Thể tích sử dụng
PCR buffer
MgCl2
dNTP
Primer mix 1
Primer mix 2
Primer mix 4
DNA mẫu
Taq polymerase
10X
25mM
1.5mM
1pmol/µl
1pmol/µl
1pmol/µl
50ng/µl
5U/µl
2.0µl
1.8µl
4.0µl
4.0µl
4.0µl
4.0µl
2.0µl
0.4µl
Chúng tôi áp dụng qui trình PCR trên cho phản ứng multiplex PCR với 3 primer mTcCIR8, mTcCIR11 và mTcCIR15có cùng nhiệt độ Ta = 46oC. Ba primer này được đánh dấu bằng 3 màu huỳnh quang khác nhau: primer mTcCIR8 có màu xanh lá cây, mTcCIR11 có màu vàng và mTcCIR15 có màu đỏ.
Bảng 3.6: Qui trình phản ứng Multiplex PCR
Chu kỳ
Nhiệt độ (oC)
Thời gian
0
94
2 phút
1 đến 35
94
30 giây
46
30 giây
72
2 phút 15 giây
36
72
5 phút
37
10
1 phút
38
4
15 phút
3.2.6. Điện di sản phẩm PCR
Đổ gel agarose với nồng độ 1.4%, nấu agarose trong lò viba trong 2.5 phút, 500W . Trộn 2 µl sản phẩm PCR với 2µl loading dye (BioRad). Vận hành máy điện di ở 100V, 250A trong 15 phút. Sau đó đem nhuộm ethium bromide trong 15 phút
Các mẫu khác nhau nhưng được khuếch đại bởi cùng loại primer có băng điện di rất giống nhau nên không thể phân biệt được trên gel điện di agarose, cần phải tiếp tục phân tích trên máy giải trình tự DNA.
3.2.7.Phương pháp phân tích trình tự bằng máy giải trình tự DNA
Sản phẩm PCR được đưa vào phân tích trình tự qua 3 bước chính:
Bước 1: Tiến hành trộn mẫu PCR với size standard và hidi formamide.
Tổng thể tích cho 1 phản ứng trên máy giải trình tự DNA là 10µl với thành phần phản ứng như sau:
Thành phần
Thể tích dùng cho 1 phản ứng
Sản phẩm PCR
Size standard
Hidi formamide
0.5µl
0.5µl
9µl
Bước 2: Biến tính mẫu ở 95oC trong 5 phút bằng máy PCR để DNA mạch đôi tách thành 2 mạch đơn. Sau đó phải giữ lạnh mẫu trong đá ngay để 2 mạch đơn không bắt cặp lại với nhau.
Bước 3: Bơm 10µl mẫu vào từng ô trên đĩa, sau đó đưa vào máy giải trình tự DNA đã được lắp đặt sẵn mao quản thích hợp và cài đặt chương trình phù hợp trong phần mềm Gene Mapper, là phần mềm sẽ phân tích kích thước al chứa trình tự microsatellite. Máy sẽ tiến hành điện di và phân tách các sản phẩm PCR bên trong mao quản.
Kết quả được phân tích tự động dựa trên số liệu trong bin set do công ty Master Food cung cấp. Bin set là một tập tin dạng text, chứa đầy đủ thông tin về kích thước và độ tin cậy của các al tương ứng với mỗi loại primer, 5 bin set của 5 loại primer sau khi được thiết lập trong phần mềm Gene Mapper sẽ phân tích kết quả tự động để cho ra dữ liệu của 2 al có độ tin cậy cao nhất của từng mẫu với mỗi loại primer. Do đó, có những trường hợp kết quả phân tích có nhiều hơn 2 al microsatellite nhưng bin set chỉ cho ra dữ liệu của 2 al đặc trưng nhất (có độ tin cậy cao nhất).
Hình 3.5: Đĩa bơm mẫu
Hình 3.6: Lắp cappilary vào máy
Một số sản phẩm PCR được tinh sạch để so sánh hiệu quả phân tích giữa 2 nghiệm thức: tinh sạch và không tinh sạch. Qui trình tinh sạch gồm các bước sau:
- Bước 1: Hút 2.5µl EDTA 125mM và 60µl Ethanol 100%. Đảo nhẹ ống và để ở nhiệt độ phòng trong 15 phút
- Bước 2: Li tâm 12000 vòng trong 30 phút ở 4oC.
- Bước 3: Hút bỏ dịch trong.
- Bước 4: Hút 60µl Ethanol 70% cho vào mỗi ống. Li tâm 12000 vòng trong 20 phút ở 4oC.
- Bước 5: Hút bỏ dịch trong. Làm khô trong 30 phút.
- Bước 6: Hoà tan DNA đã tinh sạch trong 10µl nước cất tinh khiết.
Sau đó làm tiếp tục với ba bước phân tích trình tự như trên.
3.2.9.Phương pháp phân tính mức độ đồng nhất di truyền bằng phần mềm Cevus
Cervus là một phần mềm phân tích tần số al để kiểm tra sự đồng nhất di truyền của các cá thể và tìm ra đời bố mẹ của cá thể dựa trên các chỉ tiêu được lựa chọn. Cervus phân tích tần số al dựa trên dữ liệu về kiểu gen của các codominant- loci. Dữ liệu đưa vào phân tích ở dạng bảng trong Excel và kết quả phân tích sẽ được xuất ra dưới dạng file text.
Chúng tôi đưa vào dữ liệu di truyền microsatellite 13 dòng cacao thương mại và 13 mẫu mã hoá (từ A2 đến A14) với 3 primer mTcCIR15, mTcCIR18 và mTcCIR8 để tiến hành phân tích sự đồng nhất của các cá thể dựa trên sự trùng khớp giữa các loci của chúng (matching loci), từ đó chúng tôi sẽ định danh được các mẫu mã hoá.
Chúng tôi tiến hành phân tích kết quả dựa trên dữ liệu microsatellite của 3 loci đã loại trừ những allele dropping (xem trang 57). Mỗi loci gồm 2 al đồng hợp (VD: al 292- al 292) hoặc 2 al dị hợp (VD: al 235- al 244), đây cũng chính là đặc tính của codominant-loci.
Bảng 3.7: Dữ liệu microsatellite đưa vào phân tích trong phần mềm Cervus
CODE
15A
15B
18A
18B
8A
8B
BAL209
252
254
344
346
288
290
BAL244
244
246
337
344
292
292
BR25
235
244
331
344
302
305
KKM225
235
244
331
346
286
286
PBC123
235
244
331
342
288
290
PBC154
232
252
342
344
288
305
PBC157
235
250
331
346
288
302
]PBC159
235
244
331
346
290
302
PBC230
235
250
331
342
286
288
PBC236
235
250
342
344
290
305
QH1213
252
254
344
346
288
290
QH22
232
252
342
344
288
302
QH441
232
254
342
344
288
288
A2
244
244
337
344
292
292
A3
235
250
331
342
288
290
A4
232
252
342
344
288
302
A5
235
244
331
346
286
286
A6
235
250
342
344
290
305
A7
252
254
344
346
288
290
A8
235
244
331
346
290
302
A9
235
244
331
344
302
305
A10
252
254
344
346
288
290
A11
235
250
331
346
288
302
A12
232
252
342
344
288
305
A13
235
250
331
342
286
288
A14
232
254
342
344
288
288
Chọn các chỉ tiêu phân tích để tìm ra các cá thể có sự đồng nhất di truyền bằng công cụ “Identity Check” trong phần mềm Cervus. Dựa trên các chỉ tiêu phân tích này, Cervus sẽ tiến hành kiểm tra tất cả các cá thể và đưa ra dữ liệu của những cặp cá thể có sự đồng nhất về mặt di truyền thỏa mãn các chỉ tiêu đề ra. Có 3 chỉ tiêu chính sau:
Số lượng loci phân tích.
Số lượng loci đồng nhất tối thiểu
Số loci sai khác cho phép.
Chúng tôi dựa trên kết quả kiểm tra và nhận diện các cặp cá thể có sự đồng nhất di truyền do Cevus phân tích để định danh các mẫu mã hóa. Do đó việc định danh sẽ chính xác và khách quan.
3.2.9.Phương pháp phân tích tính đa dạng di truyền bằng phần mềm Genetix
Genetix là một phần mềm tiếng Pháp dùng cho nghiên cứu di truyền quần thể dựa trên định luật Hardy-Weinberg và xử lý bằng phép toán thống kê Fichier (Weir & Cockerham,1984) thông qua giá trị thống kê F. Giá trị này xác định mối quan hệ giữa các al của các cá thể và nó liên quan đến hệ số cận huyết. Hệ số này có thể đánh giá mối quan hệ không ngẫu nhiên giữa các al trong quần thể, nó cũng đánh giá sự giao phối thân cận giữa các đơn vị dưới quần thể và quần thể.
Từ 21 dòng cacao khảo sát, căn cứ vào tên giống, chúng tôi có 6 quần thể với dữ liệu microsatellite tương ứng với 5 primer của mỗi cá thể được đưa vào phần mềm Genetix để tiến hành phân tích mối quan hệ di truyền gần hoặc xa giữa các quần thể và giữa các cá thể trong quần thể dựa trên biểu đồ 3D (3 chiều).
Khoảng cách về chiều dài của các al microsatellite chứa thông tin về khoảng cách di truyền giữa các quần thể. Hai quần thể càng tách biệt nhau về mặt di truyền thì tần số các al khác nhau càng rõ rệt. Những tính toán về khoảng cách di truyền giữa các quần thể có sự giao phối ngẫu nhiên và có sự phân ly ít trong quá trình di truyền sẽ giúp chỉ ra cấu trúc của quần thể và dưới quần thể.
Bảng 3.8: Dữ liệu microsatellite được đưa vào phân tích trong Genetix
Biểu đồ 3.1: 6 quần thể với số lượng cá thể tương ứng
Biểu đồ 3.2:5 primer với số lượng al tương ứng
Bảng 3.9: Kích thước các al phân tích với mỗi loại primer
Bảng 3.10: Số lượng các al phân tích của mỗi quần thể với từng loại primer