Khóa luận Xây dựng qui trình PCR phát hiện nấm Ustilago scitaminea gây bệnh than trên mía

.4. Phƣơng pháp PCR Giới thiệu sơ lƣợc về PCR Kỹ thuật PCR là một phương pháp in vitro để tổng hợp DNA dựa trên khuôn là một trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng bản sao của khuôn này 13 thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme polymerase và một cặp primer đặc hiệu cho đoạn DNA này. Hiện nay, kỹ thuật này được sử dụng rộng rãi để phát hiện, tạo ra các đột biến gen, chẩn đoán bệnh, biện pháp cắt mầm bệnh trên người, vật nuôi và thực phẩm. Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lặp lại nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm ba bước như sau: Bước 1 (tách sợi đơn DNA, denaturation): ở điều kiện nhiệt độ cao phân tử DNA từ mạch đôi tách ra thành dạng mạch đơn, thường là 94 0C – 95 0C trong vòng 30 giây – 4 phút. Bước 2 (bước lai, anealation): trong bước này, ở nhiệt độ nhỏ hơn Tm (nhiệt độ nóng chảy) của các primer cho phép các mồi bắt cặp với mạch khuôn. Trong thực nghiệm nhiệt độ này dao động trong khoảng 40 0C – 70 0C tuỳ thuộc Tm của các mồi sử dụng và kéo dài từ 30 – 60 giây tuỳ thuộc vào kích thước sản phẩm khuếch đại. Bước 3 (bước kéo dài, elongation): dưới tác động của DNA polymerase, các nucleotide lần lượt gắn vào mồi theo nguyên tắc bổ sung với mạch khuôn. Mạch mới được tạo thành từ mồi được nối dài. Nhiệt độ phản ứng là 72 0C. Trong phản ứng PCR một chu kỳ bao gồm 3 bước trên sẽ được lập lại nhiều lần, làm gia tăng số lượng sản phẩm theo cấp số nhân. Theo tính toán sau 30 đến 40 chu kỳ, sự khuếch đại sẽ cho ra khoảng 106 bản sao. Sau phản ứng PCR, các DNA sản phẩm được nhuộm bởi Ethidium Bromide và có thể quan sát thấy thông qua việc điện di sản phẩm PCR trong gel agarose và quan sát dưới tia UV (bước sóng 312 nm). Các yếu tố ảnh hƣởng đến kết quả phản ứng PCR DNA khuôn DNA khuôn dùng trong phản ứng PCR phải thật tinh sạch nhưng đôi khi kỹ thuật này cũng cho phép khuếch đại DNA thu nhận trực tiếp từ dịch chiết tế bào mà vẫn cho kết quả tốt, thông thường phương pháp này được áp dụng trong chẩn đoán. Lượng DNA khuôn dùng trong phản ứng PCR là một lượng thật nhỏ khoảng 1 µg, 14 ngoài ra, nếu sử dụng các enzyme polymerase cho hiệu quả cao còn có thể giảm lượng DNA khuôn xuống còn 100 ng. Nếu lượng DNA khuôn quá cao có thể tạo ra những sản phẩm phụ không mong muốn hay còn gọi là dương tính giả. Khuôn DNA có thể được thu nhận từ các mẫu không được bảo quản tốt, đã bị phân hủy từng phần như trong tế bào máu lâu ngày, tinh dịch đã khô, hóa thạch, tóc, móng tay của người đã chết. Enzyme Thông thường DNA polymerase dùng trong phản ứng PCR phải là men chịu nhiệt cao. Enzyme thường được sử dụng hiện nay là Taq polymerase tách chiết từ vi khuẩn suối nước nóng Thermus aquaticus. Ngày nay, nhiều loại men polymerase chịu nhiệt khác đã được phát hiện và đưa ra thị trường với chức năng hoàn thiện hơn và chuyên biệt hơn. Như enzyme Tth polymerase được tách từ Thermus thermophilus, enzyme này hoạt động như một enzyme phiên mã ngược thông qua sự hình thành cDNA trong điều kiện có RNA khuôn và ion Mg2+, Tth polymerase lại xúc tác phản ứng khuếch đại DNA. Primer và nhiệt độ Việc thiết kế và chọn primer phải đáp ứng đủ các yêu cầu sau  Trình tự của primer được chọn sao cho không có sự bắt cặp bổ sung giữa primer “xuôi” và primer “ngược”, không có những cấu trúc “primer dimer” do sự bắt cặp bổ sung giữa các thành phần khác nhau của một primer.  “Nhiệt độ nóng chảy” (Tm) của primer xuôi và primer ngược không được cách biệt quá xa. Thành phần nucleotide của các primer phải cân bằng tránh lập đi lập lại nhiều lần.  Các primer phải đặc trưng cho trình tự DNA cần khuếch đại, không trùng với trình tự lặp lại trên gen.  Trình tự nằm giữa hai primer xuôi và ngược không quá lớn, phản ứng PCR tối ưu nhất cho những trình tự nhỏ hơn 1 kb. 15 Các thành phần khác trong phản ứng PCR  Bốn loại nucleotide (dNTP) thường được sử dụng ở nồng độ là 200 µM/mỗi loại nucleotide. Nếu nồng độ cao hơn dễ dẫn đến sự khuếch đại sản phẩm dương tính giả hay tạp nhiễm. Sự mất cân bằng trong thành phần các nucleotide lại làm tăng các lỗi sao chép của polymerase.  Nồng độ Mg2+ cũng là một nhân tố ảnh hưởng đến quá trình khuếch đại, nồng độ MgCl2 càng cao càng làm giảm độ đặc hiệu của Taq DNA polymerase. Nồng độ tối ưu của ion này không tuân theo một quy luật chung, thông thường nồng độ tối ưu này phải được xác định riêng cho từng phản ứng. Số lƣợng chu kỳ phản ứng Số lượng chu kỳ trong một phản ứng PCR thông thường không vượt quá 40 chu kỳ. Do phản ứng PCR diễn tiến qua hai giai đoạn, trong giai đoạn đầu số lượng bản sao tăng theo cấp số nhân tỉ lệ với lượng mẫu ban đầu, sau đó hiệu quả khuếch đại giảm hẳn vì những nguyên nhân sau: sự phân hủy và cạn kiệt các thành phần của phản ứng; sự xuất hiện những sản phẩm phụ làm ức chế phản ứng khuếch đại; các bản sao vừa được tổng hợp không bắt cặp với mồi mà chúng tự bắt cặp với nhau. Số chu kỳ cho một phản ứng còn phụ thuộc vào số lượng bản mẫu ban đầu. Thiết bị và dụng cụ cho phản ứng  Thiết bị cho phản ứng PCR như máy PCR cần đáp ứng được yêu cầu thay đổi nhiệt độ thật nhanh và chính xác, tránh tối đa sự bốc hơi nước trong quá trình phản ứng.  Eppendorf dùng cho phản ứng PCR phải là một loại có vách mỏng và có khả năng truyền nhiệt tốt. Các ứng dụng của phƣơng pháp PCR Phương pháp PCR có nhiều ứng dụng rộng lớn kể cả trong lĩnh vực nghiên cứu và đời sống. Dưới đây là một số ứng dụng tiêu biểu của phương pháp này: 16 Trong lĩnh vực công nghệ sinh học, kỹ thuật PCR được sử dụng trong việc lập bản đồ gen, dòng hoá gen, giải trình tự DNA và phát hiện gen. Trong đời sống, kỹ thuật PCR nhằm tạo ra một lượng lớn bản sao DNA mục tiêu trong ống nghiệm từ một lượng khuôn DNA rất nhỏ. Người ta có thể lấy một lượng nhỏ DNA khuôn từ một giọt máu, một sợi tóc và sử dụng kỹ thuật PCR để tạo ra hàng triệu bản sao DNA mong muốn nhằm phục vụ cho các khảo sát trong pháp y, trong điều tra hoặc tính di truyền. Trong khi đó với một lượng DNA nhỏ như vậy thì không thể sử dụng trong pháp y hoặc di truyền nếu không sử dụng PCR. Do vậy, ưu điểm của công cụ PCR là khả năng khuếch đại chính xác một trình tự DNA mong muốn với một lượng lớn. Hiện nay, phương pháp PCR còn được sử dụng trong phát hiện các virus, vi khuẩn gây bệnh cho người và động vật cũng như việc kiểm nghiệm vi sinh gây bệnh trong thực phẩm, mỹ phẩm, trong nước. Sử dụng phƣơng pháp PCR tổng hợp mẫu dò cho các thử nghiệm S1 nuclease Phương pháp S1 nuclease dựa trên sự lai của mẫu dò DNA mạch đơn với RNA, tiếp theo hỗn hợp lai được xử lý với enzyme S1 nuclease để phân cắt các RNA mạch đơn không bắt cặp với mẫu dò. Cuối cùng phương pháp lai sẽ được phát hiện bằng phương pháp phóng xạ dò tự ghi hay đo mật độ quang. Thử nghiệm S1 nuclease có ưu điểm là độ nhạy cao, cho kết quả nhanh hơn Northern blot. Các mẫu dò DNA cho phương pháp này được tổng hợp đơn giản bằng phương pháp PCR. Sử dụng PCR để sàng lọc Sàng lọc các gen trong thƣ viện gen Việc phân lập một dòng từ thư viện bộ gen hay cDNA được thực hiện bằng phương pháp lai đĩa và màng lọc (plating and filter hybridization) lặp lại nhiều lần. Tuy nhiên, phương pháp này không chỉ tốn thời gian và nhân lực mà còn không chính xác như cho dương tính giả trong lai màng lọc. Các vấn đề này có thể khắc phục khi sử dụng PCR ở những lần sàng lọc đầu tiên trước khi lai bằng màng lọc. Việc sàng lọc bằng PCR có những thuận lợi sau: 17 Các dòng dương tính được xác định dựa vào các vạch có kích thước chính xác trên gel, do đó loại bỏ được những điểm dương tính giả của lai bằng màng lọc. Tiết kiệm thời gian. Sàng lọc chuột chuyển gen Hiện nay, việc sản xuất chuột chuyển gen bằng phương pháp vi tiêm trực tiếp các DNA vào phôi chuột là một kỹ thuật chuẩn dành cho phân tích phân tử và phát triển. Phương pháp truyền thống dùng sàng lọc chuột chuyển gen là Southern blot dùng mẫu dò đánh dấu bắt đặc hiệu với các DNA đã tiêm vào chuột. Tuy nhiên phương pháp này đòi hỏi lượng mẫu lớn, tinh sạch (mẫu mô) và tốn nhiều thời gian (ít nhất 5 ngày). Trong khi đó phương pháp PCR cho kết quả nhanh (vài giờ) và chỉ cần lượng mẫu ít do đó ít làm tổn thương chuột chuyển gen nhất là với chuột non. Sử dụng PCR cho việc thiết kế nhanh các gene tổng hợp Thông thường các gen của tế bào eukaryote biểu hiện kém trong các hệ thống biểu hiện ở vi khuẩn (prokaryote). Một nguyên nhân gây ra sự biểu hiện kém này là do các codon trên bộ gen của tế bào eukaryote không được “ưa thích” ở tế bào vi khuẩn. Do đó người ta thiết kế một gen tổng hợp được dùng để biểu hiện protein của eukaryote mà nó có mang các codon “ưa thích” ở vi sinh vật. Điều này được thực hiện nhanh chóng bằng PCR hai bước (two - step PCR).Trong phương pháp này, cần biết trước trình tự gen cần tổng hợp, tổng hợp các cặp mồi có trình tự tương ứng với gen cần tổng hợp và có khả năng bắt cặp với nhau trong khoảng từ 20 nucleotide. Hai phản ứng PCR được thực hiện liên tiếp, phản ứng thứ nhất tạo ra DNA bản mẫu đúng với gen tổng hợp mà sau đó được khuếch đại trong phản ứng thứ hai. Phương pháp này là một công cụ rất hữu ích cho việc thao tác trên nucleottide acid và thiết kế các gen tổng hợp. Sử dụng PCR trong việc kiểm nghiệm Hiện nay, có nhiều ứng dụng của phản ứng PCR trong các bộ kit thương mại dùng để phát hiện đặc hiệu các chủng vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm, bệnh phẩm hoặc những loài khó nuôi cấy. 18 Trong kiểm nghiệm bệnh phẩm Bằng phản ứng PCR, có thể phát hiện virus, vi khuẩn gây bệnh cho người và vật nuôi. Gen đặc trưng của virus hoặc vi khuẩn gây bệnh được khuếch đại, sau khi khuếch đại được một lượng lớn gen đặc trưng, kiểm tra khuếch đại bằng điện di trên gel agarose, rút ra kết quả có hoặc không có nhiễm virus hoặc vi khuẩn gây bệnh trên mẫu bệnh phẩm cần kiểm tra. Trong kiểm nghiệm thực phẩm, mỹ phẩm, nƣớc Việc phát hiện vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm, mỹ phẩm, nước bằng phương pháp PCR cũng tương tự như việc phát hiện virus và vi sinh vật gây bệnh trên bệnh phẩm. Nhưng đôi khi cần phải qua bước nuôi cấy tăng sinh chọn lọc vi sinh vật cần phát hiện trước khi tách chiết DNA để thực hiện cho phản ứng PCR. Sau khi nuôi cấy tăng sinh, tiến hành thu tế bào vi sinh vật từ dịch tăng sinh để tách chiết DNA làm khuôn cho phản ứng PCR. Phương pháp này rất đơn giản, dễ thao tác, có thể thực hiện được những vi sinh vật khó nuôi cấy, ít tốn kém về mặt nhân sự, chi phí thấp, độ chính xác và độ nhạy cao và một ưu điểm lớn nhất đó là cho kết quả trong thời gian ngắn. Định lƣợng bằng phƣơng pháp PCR PCR thường được sử dụng để nghiên cứu các trình tự (DNA hay RNA) có số lượng bản sao thấp, không thể định lượng bằng các phương pháp lai phân tử cổ điển. Về nguyên tắc người ta có thể xác định số lượng bản mẫu ban đầu qua tính toán dựa vào sản phẩm cuối cùng, số chu kỳ đã thực hiện, nhưng trong thực tế người ta chỉ có thể định lượng tương đối một trình tự đích, tức so sánh hàm lượng của nó trong nhiều nguồn khác nhau, ví dụ như khi muốn so sánh mức độ biểu hiện của gen THR (Thyroid Hormone Redeptor ) vốn là một gen có biểu hiện rất yếu trong các loại mô khác nhau. Trong thực nghiệm, người ta tiến hành khuếch đại đồng thời trình tự đích và một trình tự đối chứng có nồng độ đã biết. Trình tự đích và một lượng xác định trình tự đối chứng được khuếch đại trong cùng một ống nghiệm, tốt nhất là với cùng một cặp mồi. Điều đó có nghĩa là hai trình tự phải có hai đầu nơi bắt cặp với mồi giống nhau nhưng phần trung tâm có độ dài khác nhau (do sự gắn thêm vào hay cắt bớt đi một đoạn trên trình tự đối chứng). Như vậy, sau phản ứng, người ta có thể phân biệt 19 hai trình tự này dựa vào kích thước bằng phương pháp điện di. Nếu sản phẩm khuếch đại của trình tự đối chứng không thay đổi trong các phản ứng (chứng tỏ hiệu quả khuếch đại là như nhau trong tất cả các phản ứng) thì người ta có thể so sánh hàm lượng sản phẩm của trình tự đích, từ đó so sánh được số lượng bản mẫu ban đầu. Điều quan trọng là số chu kỳ khuếch đại không được vượt quá giai đoạn đầu của phản ứng PCR khi mà số lượng bản sao còn tỷ lệ thuận với số lượng mẫu ban đầu. Một số ứng dụng khác của kỹ thuật PCR Ở các nước phát triển, PCR đã được sử dụng rộng rãi như công cụ chẩn đoán trong y học để phát hiện những bệnh di truyền, được sử dụng trong điều tra tội phạm để xác định những người bị tình nghi ở cấp độ phân tử, được sử dụng trong xác định quan hệ huyết thống và là một công cụ hữu hiệu trong việc giải trình tự các bộ gen người. Những hạn chế của phƣơng pháp PCR Do độ nhạy rất cao của PCR đồng thời với thao tác đơn giản, người ta có khuynh hướng sử dụng phương pháp này để giải quyết nhiều vấn đề. Tuy nhiên ta không thể quên rằng phương pháp này có nhiều mặt hạn chế và đòi hỏi sự thận trọng đặc biệt khi tiến hành thí nghiệm cũng như khi phân tích kết quả. Có thể kể ba vấn đề lớn khi sử dụng PCR: Trong thực nghiệm, kích thƣớc của trình tự cần khuếch đại là giới hạn đầu tiên Trừ vài trường hợp rất cá biệt, phương pháp PCR không hoạt động được với những đoạn DNA lớn hơn 3 kb. Việc sử dụng PCR đối với các độ dài dưới 1,5 kb cho kết quả tốt. Với những độ dài lớn hơn, điều kiện tối ưu cho phản ứng phải được xác định qua thực nghiệm. Sự ngoại nhiễm là vấn đề đặt ra lớn nhất đối với PCR, gắn liền với khả năng khuếch đại bản sao của phƣơng pháp này Vấn đề đặt biệt cấp thiết trong những ứng dụng về chẩn đoán, dự phòng vì hậu quả có thể rất nghiêm trọng. Nguồn ngoại nhiễm lớn nhất thường là các sản phẩm khuếch đại của những lần thao tác trước. Người ta đã chứng minh được rằng việc mở nắp các 20 ống nghiệm sau mỗi lần khuếch đại trong một khoảng không gian của phòng thí nghiệm sẽ khiến cho các phân tử đã được khuếch đại thoát ra khỏi ống nghiệm bay lơ lửng trong không khí và bám vào tường, cửa, thiết bị, dụng cụ, rồi nhiễm vào các phản ứng tiến hành sau đó. Có thể khắc phục vấn đề này bằng một số biện pháp sau:  Các công đoạn thao tác khác nhau như thiết lập phản ứng PCR và phân tích các sản phẩm khuếch đại phải được tiến hành ở các địa điểm cách xa nhau.  Dụng cụ dùng để thiết lặp phản ứng (micropipette) không sử dụng vào các thao tác khác. Đầu tip sử dụng với micropipette phải có lớp lọc tránh sự nhiễm đầu micropipette bởi các phân tử khuếch đại khi hút dung dịch phản ứng.  Dùng tia tử ngoại để loại bỏ các phân tử còn lại từ các lần khuếch đại trước.  Tất cả mọi thành phần của phản ứng đều được chia thành những lượng nhỏ, tính toán sao cho đủ 1,2 lần thao tác.  Ngoài ra, các hãng sản xuất còn tung ra thị trường nhiều hệ thống cho phép loại bỏ hoàn toàn sự ngoại nhiễm. Ví dụ hãng Perkin-Elemer-Cetus đề xuất sử dụng dUTP thay vì dTTP; việc thay thế này không ảnh hưởng đến phản ứng. Trước mỗi lần phản ứng kế tiếp, người ta cho thêm vào dung dịch phản ứng uracylglycosylase; enzyme sẽ phân hủy tất cả các DNA có mang dUTP nhiễm từ lần trước. Đồng thời enzyme sẽ bị phân hủy bởi nhiệt ngay từ lần biến tính đầu tiên. Bất lợi của hệ thống này là giá thành cao. Các sai sót gây ra do Taq polymerase Sự sao chép bởi Taq polymerase cho tỷ lệ sai khá cao (cứ 10.000 nucleotide thì enzyme gắn sai 1 nucleotide (Hồ Huỳnh Thuỳ Dương, 1998)). Đặc tính này không nghiêm trọng nếu ta chỉ cần xem xét kích thước hay sự có mặt của một sản phẩm khuếch đại, nhưng có ý nghĩa lớn nếu cần xác định chính xác trình tự nucleotide của DNA. Ta không thể loại bỏ hoàn toàn các sai sót này mà chỉ có thể giảm bớt; ví dụ như đảm bảo sự cân bằng nồng độ các nucleotide trong phản ứng, xác định trình tự của nhiều sản phẩm khuếch đại từ nhiều thao tác riêng biệt, so sánh trước khi đi đến trình tự chính thức (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998). 21 2.4. Tình hình nghiên cứu bệnh than 2.4.1. Trên thế giới:  Tạo tính kháng của mía bằng cách nhiễm với Ustilago scitaminea (Burner; Grisham và Legendre, 1993).  Biện pháp quản lý sự xâm nhập bệnh than vào Australia (Croft và Braithwaite, 2006).  Bệnh than trên mía (Comstock và Lentini, 2006).  Đánh giá tính mẫn cảm bệnh than trong ống nghiệm (Singh và ctv., 2005).  Tính đa dạng di truyền của Ustilago scitaminea ở lục địa Trung Quốc (Xu; Que và ctv., 2004).  Phương pháp chẩn đoán bệnh than (Muñiz; Martínez và ctv., 2004).  Sự biến đổi di truyền của Ustilago scitaminea (Braithwaite; Bakkeren và ctv., 2004).  Khống chế bệnh than ở Nigeria bằng thuốc diệt nấm (Wada, 2003).  Loài mới của bệnh than ở Maui (Schenck, 2003).  Giảm năng suất ở những giống có tính kháng bệnh than khác nhau (Kumar; Misra và ctv., 2003).  Bước đầu nghiên cứu tác động của chất điều hoà sinh trưởng trên mía nhiễm bệnh than (Péros, 2002).  Xác định sớm sự nhiễm bệnh than bằng kỹ thuật ELISA (Naik; Jayaraj, 2002).  Hình thái và đặc tính của các giống mía mẫn cảm và kháng với bệnh than (Da Gloria, 2000).  Đánh giá 5 thuốc diệt nấm khác nhau trong việc khống chế bệnh than ở Iran (Sharififar và Kazemi, 1999).  Nhuộm mô, một phương pháp hiệu quả để chẩn đoán bệnh than (Nallathambi; Padmanaban và ctv., 1998). 22  Tác động của bệnh than lên năng suất mía (Natarajan và Kalaimani, 1996).  Cấu trúc, hình thái của mắt mầm với mức độ kháng khác nhau đối với bệnh than (Da Gloria; Albernas, 1995).  Đánh giá một vài thuốc diệt nấm mới trong việc khống chế bệnh than (Olufolaji, 1993).  Khống chế bệnh than bằng phương pháp vật lý và hoá học (Vala; Joshi và ctv., 1992).  Tác động của nước nóng và thuốc diệt nấm trong khống chế bệnh than (Elrasoul; Mohamed và ctv., 1991).  Cơ chế kháng bệnh than ở mía (Padmanaban; Alexander, 1988).  Bệnh than, so sánh sự nhiễm tự nhiên và nhiễm nhân tạo (Comstock; Wu và ctv., 1987).  Sự phát tán bào tử của nấm Ustilago scitaminea (Sreeramulu và Vittal, 1972).  Theo Wada (2003), các thuốc sau đây có tác dụng chống lại nấm Ustilago scitaminea: Mancozeb, carbendazim + maneb, metalaxyl + carboxin + furathiocarb, pyroquilon, benomyl và chlorothalonil. Tuy nhiên kiểm soát tốt nhất lần lượt là pyroquilon, carbendazim + maneb, metalaxyl + carboxin + furathiocarb.  Theo Shingte và More (1982), Kiểm soát bệnh than với hỗn hợp thuốc diệt nấm Bavistin và Bayleton. Dùng nước nóng 50 0C + 0,1 % Bavistin [carbendazim] hoặc + 0,1 % Bayleton [triadimefon] ngâm trong 2 giờ giúp khống chế 100 % bệnh than và kết quả là năng suất mía tăng 24,627 tấn/ha. Khi chỉ dùng với nước nóng thì năng suất chỉ 11 tấn/ha.  Theo Schenck (2003), xuất hiện nòi gây bệnh than mới ở Hawaii, giống mía H78-7750 là giống kháng và chưa bao giờ nhiễm với bệnh than. Tuy nhiên, năm 2001 nhiều cánh đồng mía ở Hawaii đã xuất hiện bệnh than trên giống này, giống này nhiễm với nòi mới nhưng vẫn còn kháng với nòi nấm than cũ. 23 Ustilago scitaminea sẵn sàng lai giữa các nòi, ngay cả giữa các loài để tạo nên nòi mới. Tính mẫn cảm của các giống mía ở Hawaii đối với nòi mới (Bảng 2.2). Bảng 2.2: Tỉ lệ nhiễm bệnh than của các giống mía ở Hawaii đối với nòi mới. 2.4.2. Trong nƣớc Theo nghiên cứu của Hà Đình Tuấn (2004), thì tỉ lệ nhiễm bệnh than phát sinh và phát triển tăng theo các giai đoạn sinh trưởng của cây mía. Một số giống ngoài sản xuất biểu hiện triệu chứng với tỉ lệ bụi bị bệnh khá cao như giống ROC16 (11,38 %), F156 (2,93 %). Đặc biệt giống ROC10 không xuất hiện triệu chứng ngoài đồng nhưng qua kiểm tra xuất hiện 4,0 % mẫu có tác nhân gây bệnh tiềm ẩn bên trong mắt mầm. Năng suất trên các giống chủng bệnh than thấp hơn đối chứng từ 1,8 – 30,19 %, sự khác biệt về năng suất là do các giống chủng bệnh than có mật độ cây hữu hiệu thấp hơn đối chứng mặc dù đường kính thân và trọng lượng cây không khác biệt. So sánh hiệu quả một số biện pháp xử lý hom giống phòng trừ bệnh than hại mía (Đỗ Ngọc Diệp và ctv., 2000). Đánh giá khả năng kháng bệnh than trên một số giống mía có triển vọng (Nguyễn Văn Hoan, 1999). Giống mía % nhiễm Mía gốc Mía tơ H65-7052 15,9 7,7 H77-4643 7,7 7,7 H78-3567 0 0 H78-4153 7,1 7,1 H78-7750 9,0 27,3 H83-7061 33,3 16,7 H87-4319 0 0 H87-5794 0 0 H88-2953 27,3 27,3 H90-7492 0 0 24 Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Nội dung nghiên cứu Đề tài thực hiện gồm có 2 nội dung chính:  Nuôi cấy, phân lập, tách đơn bào tử và nhân sinh khối nấm Ustilago scitaminea.  Xây dựng qui trình PCR phát hiện trực tiếp DNA sợi nấm Ustilago scitaminea gây bệnh than trên mía. 3.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu  Đề tài được thực hiện từ tháng 05 đến tháng 08 năm 2007.  Địa điểm thực hiện: Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Hoá Sinh thuộc Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Công nghệ Môi trường, Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh. 3.3. Vật liệu nghiên cứu 11 dòng nấm Ustilago scitaminea thu thập được từ 11 giống mía khác nhau ở tỉnh Bình Dương, đó là các giống: Comus, F156, H39 – 3633, Ja60 – 5, K84 – 200, My55 – 14, VĐ86 – 368, R570, ROC10, ROC16, VN84 – 4137. 3.4. Phƣơng pháp tiến hành 3.4.1. Phƣơng pháp lấy mẫu Dùng kéo cắt các roi than từ mía bệnh cho vào bịch nhựa vô trùng, ghi tên giống mía lên bịch, rồi đặt vào thùng xốp giữ lạnh, đem về trữ ở Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Hoá Sinh thuộc Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Công nghệ Môi trường, Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh. 25 3.4.2. Phƣơng pháp phân lập Dụng cụ: Bình tam giác, đĩa petri, que cấy, đèn cồn, kẹp, cân, ống đong, giấy thấm, nồi hấp, tủ ủ, tủ sấy, bút lông, máy đo pH… Hoá chất: Môi trường PGA có bổ sung (PGA*) (Bảng 3.1). Bảng 3.1: Thành phần môi trường PGA*. Thành phần Môi trường PGA* Khoai tây 200 g Glucose 20 g CaCO3 3 g Streptomycin sulfate 0,5 g Agar 20 g Nước cất Vừa đủ 1 lít Cách pha môi trƣờng PGA*: Khoai tây đã được gọt vỏ rửa sạch, cân đủ 200 g, thái nhỏ, thêm 500 ml nước cất đun sôi trong 20 phút, lọc lấy nước trong cho vào bình tam giác, thêm 20 g agar, 3 g CaCO3, bổ sung nước cất cho đủ 1 lít, chuẩn pH 7,2, đem hấp khử trùng ở 121 0 C/ 15 phút, để nhiệt độ hạ xuống khoảng 60 0C cho vào 0,5 g Streptomycin sulfate lắc nhẹ đều, sau đó phân vào mỗi đĩa pertri vô trùng 15 ml môi trường. Phƣơng pháp phân lập: Lấy bào tử nấm từ các roi than, rửa chúng 3 lần trong nước vô trùng chứa 500 ppm streptomycin sulfate, cho bào tử vào nước vô trùng, dùng que cấy lấy bào tử, cấy ria lên đĩa môi trường PGA*, đem ủ ở nhiệt độ 28 0C trong thời gian 24 giờ, sau đó cấy khuẩn lạc sang môi trường mới và tiếp tục cấy truyền đến khi thu được giống nấm thuần chủng. 3.4.3. Phƣơng pháp tách đơn bào tử Dụng cụ: kim mũi mác, đèn cồn, pipette, lame, kính hiển vi, tủ ủ, giấy thấm, bút lông, máy đo pH... Sau khi phân lập được dòng nấm Ustilago scitaminea thuần chủng, ta tiến hành tách đơn bào tử. Quy trình tách đơn bào tử được thực hiện như sau: 26  Dùng kim mũi mác cạo nhẹ trên bề mặt khuẩn lạc của nấm.  Cho bào tử từ kim mũi mác vào cốc chứa nước cất khử trùng.  Hút 0,5 ml dung dịch bào tử nhỏ lên lame có trải một lớp mỏng agar.  Ủ ở nhiệt độ phòng 12 giờ.  Tiến hành quan sát trên kính hiển vi, tìm những bào tử nào nảy mầm riêng lẻ và mọc tách riêng lẻ. Đánh dấu, sau đó tiến hành cắt vùng đánh dấu, cấy vào đĩa petri chứa môi trường PGA*.  Đem ủ ở nhiệt độ phòng 3 ngày, để bào tử mọc thành khuẩn lạc. 3.4.4. Phƣơng pháp nhân sinh khối nấm Dụng cụ: kim mũi mác, nồi hấp, bình tam giác, máy lắc, vải lọc, đèn cồn, tủ lạnh - 20 0 C. Hóa chất: chuẩn bị môi trường PGA* lỏng, cách pha giống với môi trường PGA* nhưng không bỏ agar. Sau khi thu được khuẩn lạc ta tiến hành nhân sinh khối trong môi trường PGA* lỏng, nhân sinh khối nấm bằng cách lắc trên máy lắc (160 vòng/phút, ở 28 0C). Sau 4 ngày, tiến hành thu sinh khối sợi nấm bằng cách lọc trên vải lọc tiệt trùng. Sau đó làm khô sinh khối, giữ ở nhiệt độ -20 0C. 3.4.5. Phƣơng pháp ly trích DNA tổng số của nấm Ustilago scitaminea Các dụng cụ và thiết bị dùng để ly trích DNA  Epffendorf 1,5 ml.  Micropipette các loại.  Bồn ủ nhiệt (water bath).  Máy vortex.  Máy ly tâm lạnh.  Tủ 4 0C và -20 0C  Cối và chày để nghiền mẫu  Đầu típ các loại  Giấy bạc  Găng tay 27 Các hoá chất đƣợc sử dụng để ly trích DNA  Nitơ lỏng.  Lysis buffer: 50 mM Tris-HCl, pH 7,2, 50 mM EDTA, 3 % SDS, 1 % β_mercaptoethanol.  Hỗn hợp: phenol : chloroform : isoamyl alcohol (25 : 24 : 1).  Hỗn hợp: chloroform : isoamyl alcohol (24 : 1).  Isopropanol 100 %.  Ethanol 70 %.  TE 1X: 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0. Phƣơng pháp ly trích: DNA nấm được ly trích theo phương pháp của Lee và Taylor (1990). Quy trình cụ thể:  Lấy 1 g sợi nấm khô kiệt nghiền trong nitơ lỏng.  Chuyển bột nghiền vào eppendorf 1,5 ml.  Thêm 400 l lysis buffer, trộn đều. Nếu hỗn hợp quá đặc thì cho thêm lysis buffer. Ủ ở 65 0C trong 1giờ. Di chuyển eppendorf ra khỏi bồn ổn nhiệt.  Thêm 300 l phenol : chlorophorm : isoamyl alcohol (25 : 24 : 1) lắc nhẹ.  Ly tâm 14.000 vòng trong 1 phút ở nhiệt độ 28 0C.  Chuyển dịch nổi (khoảng 500 l) vào eppendorf mới.  Thêm vào 300 l chloroform : isoamyl alcohol (24 : 1) lắc nhẹ.  Ly tâm 14.000 vòng trong 1 phút ở nhiệt độ 28 0C.  Chuyển dịch nổi (khoảng 300 l) vào eppendorf mới.  Kết tủa DNA bằng cách thêm vào một phần hai thể tích isopropanol, trộn nhẹ.  Ly tâm 14.000 vòng trong 1 phút ở 4 0C.  Loại bỏ dịch lỏng. Dùng ethanol 70 % rửa sạch nhiều lần.  Làm khô DNA, hòa tan trong 50 l dung dịch TE 1X và tồn trữ ở -20 0C. 28 Kiểm tra chất lƣợng DNA: Yêu cầu DNA được tách chiết có chất lượng tốt (tương đối sạch và không bị gãy nhiều). Định tính DNA bằng phương pháp điện di. Phương pháp này cho phép ta đánh giá chất lượng DNA (có bị gãy nhiều hay không, có tạp không,.v.v.).Tuy nhiên không cho biết nồng độ của DNA thu được hay độ sạch của dung dịch DNA một cách chính xác. Quá trình điện di kiểm tra chất lượng được thực hiện như sau:  Chuẩn bị gel agrose 0,8 %.  Dùng 4 l mẫu DNA trộn đều với 2 l loading dye, cho vào giếng gel.  Điện di ở hiệu điện thế 100 V, cường độ dòng điện 400 mA, trong 20 phút.  Nhuộm Ethidium Bromide 15 phút. Chụp ảnh.  Dựa trên băng hình DNA đánh giá chất lượng.  Pha dung dịch DNA bằng TE. Định lượng DNA bằng quang phổ kế:  Phương pháp này cho phép ước lượng tương đối chính xác lượng DNA cũng như chất lượng DNA có trong mẫu kết quả thu được.  Hàm lượng DNA được tính theo công thức: DNA (ng/μl) = [(62,9 * OD260nm) – (36 * OD280nm)] * Độ pha loãng Gồm hai bước:  Xây dựng đường chuẩn: Dùng dung dịch TE 1X để tạo đường chuẩn.  Pha loãng dung dịch DNA đến nồng độ thích hợp để đo (thường pha loãng 100 lần) với dung dịch TE 1X: Hút 10 μl dung dịch DNA hòa tan với 990 μl TE 1X. Cho vào Curvette. Tiến hành đo OD. DNA sau khi tách chiết và kiểm tra định tính, định lượng sẽ được bảo quản ở -20 0C. 3.4.6. Tinh sạch sản phẩm ly trích Sản phẩm DNA tổng số được ly trích có nhiều tạp do nhiều nguyên nhân như protein khử không hết, RNA tạp nhiễm, DNA bị gẫy.v.v., sẽ được tinh sạch trước khi đem phản ứng PCR. Quy trình tinh sạch sản phẩm DNA tổng số được thực hiện như sau: 29 Bước 1: Pha loãng mẫu ly trích, 100 l DNA mẫu với 200 l TE 1X. Bước 2: Cho vào eppendorf chứa mẫu 200 l phenol : chloroform : isoamyl alcohol (25 : 24 : 1) lắc nhẹ. Bước 3: Đem ly tâm hỗn hợp ở 12.000 vòng, trong thời gian 1 phút. Tiến hành hút dịch nổi cho vào eppendorf khác. Bước 2 và 3 được thực hiện lại một lần nữa. Bước 4: Cho vào eppendorf chứa dịch nổi 600 l ethanol 100 % và 20 l sodium acetate ủ ở -20 0C, trong 20 phút. Bước 5: Ly tâm hỗn hợp ở 13.500 vòng, trong thời gian 1 phút. Bước 6: Loại bỏ dịch nổi. Dùng ethanol 70 % rửa sạch nhiều lần. Làm khô DNA, hòa tan trong 50 l dung dịch TE 1X và tồn trữ ở -20 0C. 3.4.7. Phƣơng pháp PCR phát hiện nấm Ustilago scitaminea Dụng cụ thí nghiệm: Eppendorf các loại. Micropippette và đầu típ các loại. Máy luân nhiệt Hóa chất thí nghiệm: PCR phát hiện dựa vào cặp mồi và quy trình của Albert và Schenck (1996), gồm các thành phần phản ứng và chu kỳ nhiệt cho ở Bảng 3.2. Cặp mồi đƣợc sử dụng là: bE4: (5’– CGC TCT GGT TCA TCA ACG – 3’) bE8: (5’– TGC TGT CGA TGG AAG GTG T – 3’)  Sản phẩm PCR sau phản ứng được điện di trên gel agarose 1 %, trong dung dịch đệm TAE 1X, hiệu điện thế là 90 V, cường độ dòng điện là 250 mA, trong 20 phút.  Chỉ tiêu đánh giá: Sự xuất hiện băng DNA khuếch đại chuyên biệt vùng gene bE của nấm Ustilago scitaminea trên gel điện di có kích thước là 442 bp. 30 Bảng 3.2: Thành phần các chất trong phản ứng PCR và chu kỳ nhiệt Điện di và đọc kết quả PCR trên gel agarose Các hóa chất được sử dụng để điện di và đọc kết quả: - Agarose - TAE 0,5X - Loading dye 6X - Ethidium bromide Các dụng cụ và thiết bị được sử dụng để điện di và đọc kết quả: - Cân kĩ thuật 4 số - Lò viba - Khay đổ gel - Bồn và máy điện di - Giấy parafin - Máy chụp hình gel - Ống đong Hóa chất Nồng độ đầu Nồng độ cuối Thể tích/ phản ứng (μl) Chu kỳ nhiệt Buffer MgCl2 dNTPs Primer F Primer R Taq DNA polymerase DNA mẫu H2O 5 X 25 mM 10 mM 10 pmol/μl 10 pmol/μl 5 U/μl 1 X 2,5 mM 0,2 mM 1 pmol/μl 1 pmol/μl 2,5 U 20ng 10 5 1 5 5 0,5 1 22,5 Khởi động: 940C – 3 phút. 94 0 C – 30 giây 52 0 C – 30 giây 30 chu kỳ 72 0 C – 30 giây Kết thúc: 720C – 3 phút. Tổng thể tích 50 μl 31 Phương pháp đổ gel agarose điện di: Bước 1: Chuẩn bị gel agarose 1 % (Cho 0,125 g agarose vào 12,5 ml dung dịch TAE 0,5X, đun sôi hỗn hợp trên khoảng hai phút trong lò viba). Bước 2: Làm nguội agarose đã được nấu chín đến 60 0C, sau đó đổ vào khuôn đã được đặt lược vào trước. Bước 3: Lấy lược ra, cho gel vào bồn điện di. Bước 4: Hút 2 µl loading dye trộn với 4 µl mẫu. Bước 5: Bơm vào các giếng một cách cẩn thận 4 µl mẫu + dung dịch đệm. Bước 6: Chạy điện di ở ở hiệu điện thế 90 V/20 phút, cho đến khi thuốc nhuộm cách đầu tận cùng của gel là 1 cm. Bước 7: Lấy gel ra và ngâm vào dung dịch ethidium bromide (0,5 µg/ml) trong 20 phút. Bước 8: Rửa nhẹ gel dưới vòi nước chuyên dụng. Bước 9: Đọc kết quả dưới tia UV. Bước 10: Chụp bản gel để lưu lại kết quả. 32 Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Phân lập, tách đơn bào tử và nhân sinh khối nấm Ustilago scitaminea 4.1.1. Kết quả phân lập Sau khi thu được các mẫu bệnh từ 11 giống mía khác nhau, chúng tôi đã tiến hành phân lập nấm trên môi trường PGA*, chọn những khuẩn lạc đặc trưng như màu nâu xám, hình dạng khuẩn lạc là tập hợp những vòng tròn đồng tâm, cấy chuyền nhiều lần. Sau 5 ngày nuôi cấy thì chúng tôi thấy xuất hiện những vết nứt từ tâm khuẩn lạc thẳng ra ngoài (Hình 4.1). Theo chúng tôi thì những vết nứt này là do môi trường bị mất nhiều nước do ủ ở nhiệt độ 30 0C làm cho môi trường bị khô. Những ngày đầu sự tăng trưởng về đường kính của khuẩn lạc rất chậm và sau 7 ngày nuôi cấy thì khuẩn lạc lan ra hết đường kính đĩa petri (Hình 4.2). Hình 4.1: Khuẩn lạc nấm Ustilago scitaminea sau 5 ngày nuôi cấy. 33 Hình 4.2: Khuẩn lạc nấm Ustilago scitaminea sau 7 ngày nuôi cấy. 4.1.2. Kết quả tách đơn bào tử Để chuẩn bị tốt nguồn nấm cho các thí nghiệm kế tiếp, tôi đã tiến hành tách đơn bào tử với mục đích tạo ra khuẩn lạc đồng nhất về mặt di truyền. Do bào tử của nấm Ustilago scitaminea có kích thước lớn nên có thể quan sát và tiến hành tách đơn bào tử rất dễ dàng trên kính hiển vi quang học (Hình 4.3 và Hình 4.4). Hình 4.3: Bào tử nấm Ustilago scitaminea (Gupta, 2006). 34 Hình 4.4: Bào tử nấm nảy mầm trên môi trường agar soi dưới kính hiển vi ở vật kính x 40. Kết quả: Chúng tôi đã tách đơn bào tử được 11 dòng nấm Ustilago scitaminea từ 11 giống mía khác nhau (Bảng 4.1). Bảng 4.1: Các dòng nấm được tách đơn bào tử. Dòng nấm được mã hóa Tên các giống mía Us1 Comus Us2 F 156 Us3 H 39 - 3633 Us4 Ja 60 - 5 Us5 K 84 – 200 Us6 My 55 – 14 Us7 VĐ 86 – 368 Us8 R 570 Us9 ROC 10 Us10 ROC 16 Us11 VN 84 – 4137 4.1.3. Kết quả nhân sinh khối Bào tử thu được sau khi tách đơn bào tử sẽ phát triển thành khuẩn lạc. Tiến hành chuyển sinh khối sợi nấm từ đĩa petri sang bình tam giác để tăng nhanh sinh khối. Các 35 bình tam giác này chứa môi trường PGA* lỏng và được lắc ở 160 vòng/phút, ở nhiệt độ 28 0C. Sau 4 ngày, khi sinh khối đã đạt được lượng cần thiết ta tiến hành thu sinh khối (Hình 4.5). Hình 4.5: Sinh khối nấm sau 4 ngày lắc. Tuy theo dõi từng ngày trong quá trình lắc nhưng do lắc liên tục nên rất khó phát hiện bị nhiễm khuẩn trong khi lắc. Để đảm bảo không bị nhiễm khuẩn, trước khi thu sinh khối ta tiến hành quan sát dịch lỏng trên kính hiểu vi quang học để kiểm tra sự có mặt của vi khuẩn (chỉ là phương pháp tương đối). Thông thường, mẫu bị nhiễm khuẩn sẽ bị đục trong khi lắc. Kết quả nhân sinh khối được thể hiện ở Bảng 4.2. Bảng 4.2: Khối lượng sợi nấm sau 4 ngày lắc trong môi trường PGA* lỏng. Dòng nấm Nguồn Khối lượng (g) Us1 Comus 3,24 Us2 F 156 2,86 Us3 H 39 – 3633 2,57 Us4 Ja 60 – 5 3,31 Us5 K 84 – 200 2,87 Us6 My 55 – 14 2,64 Us7 VĐ 86 – 368 2,14 Us8 R 570 3,02 Us9 ROC 10 2,43 Us10 ROC 16 2,53 Us11 VN 84 – 4137 2,65 36 Nhận xét: Qua Bảng 4.2 cho thấy tất cả các dòng nấm thí nghiệm đều có khả năng tạo sợi nấm trong môi trường PGA* lỏng. Dòng nấm Us4 cho sinh khối cao nhất với khối lượng là 3,31 g. Dòng nấm Us7 cho sinh khối thấp nhất với khối lượng là 2,14 g. 4.2. Kết quả ly trích và tinh sạch DNA sợi nấm 4.2.1. Kết quả ly trích Các dòng nấm Ustilago scitaminea sau khi nhân sinh khối sẽ thu nhận sợi nấm và tiến hành li trích DNA tổng số. DNA của sợi nấm được li trích theo qui trình của Lee và Taylor (1990). DNA tổng số được kiểm tra chất lượng bằng cách điện di trên gel agarose 0,8 %.Kết quả li trích DNA tổng số được thể hiện ở Hình 4.6. Hình 4.6: Kết quả li trích DNA của 11 dòng nấm. Ghi chú: L1: Us1 L4: Us4 L7: Us7 L10: Us10 L2: Us2 L5: Us5 L8: Us8 L11: Us11 L3: Us3 L6: Us6 L9: Us9 Kết quả ly trích cho thấy DNA tổng số không tinh sạch hoàn toàn. Ngoài DNA tổng số còn có thêm những đoạn DNA bị đứt gãy, RNA và protein mà quá trình ly trích không thể loại bỏ được. DNA tổng số 37 Nguyên nhân tạo ra những sản phẩm tạp là do  Quá trình nghiền chưa tốt hoặc do hóa chất như phenol, chloroform.  Thời gian cho phenol để phá hủy lớp vỏ, lớp màng nhân, loại bỏ protein. Nếu như thời gian quá dài sẽ gây nên sự đứt gãy DNA một lượng rất đáng kể.  Ly tâm (tốc độ, thời gian, thao tác): - Ly tâm với thời gian ngắn, tốc độ thấp thì sự phân lớp chưa tốt giữa phần dịch chứa DNA, lớp xác tế bào, lớp phenol. - Ly tâm với thời gian quá dài thì phenol phá huỷ nhiều DNA hơn gây ra nhiều đoạn đứt gãy - Ly tâm với tốc độ quá cao và thời gian dài thì DNA sẽ bị gãy rất nhiều. 4.2.2. Kết quả tinh sạch Để phản ứng PCR được tối ưu thì sản phẩm DNA li trích cần phải tương đối sạch các tạp chất. Khi DNA khuôn còn lẫn protein, DNA gãy, hiệu quả của phản ứng PCR giảm tỉ lệ thuận với độ tinh sạch của DNA khuôn (Khuất Hữu Thanh, 2003). Vì vậy, để có DNA khuôn tốt hơn, chúng tôi đã tiến hành tinh sạch DNA tổng số. Kết quả tinh sạch được kiểm tra bằng cách điện di trên gel agarose 0,8 % (Hình 4.7) Hình 4.7: DNA tổng số đã tinh sạch. Ghi chú: L1: Us1 L4: Us4 L7: Us7 L10: Us10 L2: Us2 L5: Us5 L8: Us8 L11: Us11 L3: Us3 L6: Us6 L9: Us9 DNA tổng số 38 Sau khi tiến hành tinh sạch, chúng tôi đã thu được DNA tổng số tương đối tốt, lượng tạp nhiễm giảm đi rất nhiều. DNA tổng số thu được từ qui trình tinh sạch này sẽ được sử dụng để làm khuôn cho phản ứng PCR. Pha loãng DNA tổng số Khi dùng để khuếch đại vùng mục tiêu từ DNA tổng số bằng phản ứng PCR, lượng DNA được sử dụng thường khoảng từ 10 – 100 ng cho một phản ứng. Nếu lượng DNA sử dụng quá ít thì sẽ không đủ số lượng khuôn DNA cho quá trình tổng hợp. Kết quả là sản phẩm PCR rất ít không đủ số lượng mong muốn. Còn nếu số lượng DNA khuôn quá nhiều thì sẽ tạo ra nhiều sản phẩm phụ không mong muốn (Khuất Hữu Thanh, 2003). Nhưng DNA tổng số li trích được có hàm lượng rất lớn. Vì vậy, trước khi thực hiện phản ứng PCR, chúng tôi tiến hành pha loãng DNA gốc trong TE 1X. Tùy vào lượng DNA tổng số mà các mẫu được pha loãng theo các nồng độ khác nhau. DNA khuôn mẫu sau khi pha loãng được điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8 % và ghi nhận hình ảnh điện di thông qua máy chụp DNA bằng phần mềm Gel doc (Hình 4.8). Hình 4.8: DNA tổng số sau khi pha loãng. Ghi chú: L1: Us1 L4: Us4 L7: Us7 L10: Us10 L2: Us2 L5: Us5 L8: Us8 L11: Us11 L3: Us3 L6: Us6 L9: Us9 DNA tổng số 39 4.3. Phát hiện DNA của Ustilago scitaminea bằng kỹ thuật PCR Sử dụng 2 primer bE4 và bE8 do Albert, H. H. và Schenck, S. (1996) thiết kế cho vùng gene bE của nấm Ustilago scitaminea, sản phẩm khuếch đại có kích thước khoảng 442 bp. Dùng quy trình nhiệt và cặp primer do Albert, H. H. và Schenck, S. (1996) thiết kế, chúng tôi đã khuếch đại được đoạn DNA có kích thước khoảng 442 bp (Hình 4.9). Hình 4.9: Sản phẩm PCR theo quy trình của Albert, H. H. và Schenck, S. Tuy nhiên, theo Hình 4.9 thì lượng sản phẩm tạp là tương đối lớn. Sản phẩm tạp này có thể do nhiều nguyên nhân: Tạp 1: Là sản phẩm PCR không đặc hiệu, sản phẩm này có kích thước lớn hơn sản phẩm PCR cần khuếch đại, nguyên nhân là do: primer, DNA mẫu, dNTPs, thời gian kéo dài chuỗi, hay Taq DNA polymerase cho một phản ứng quá nhiều. Để giảm sản phẩm tạp này ta có thể thay đổi một hoặc kết hợp một vài yếu tố sau:  Giảm thời gian bắt cặp.  Tăng nhiệt độ bắt cặp.  Giảm thời gian kéo dài.  Giảm nhiệt độ kéo dài.  Giảm primer, giảm DNA mẫu, giảm Taq DNA polymerase. Tạp 2: Có thể là do lượng primer, Taq DNA polymerase, DNA mẫu cho một phản ứng quá nhiều. DNA mẫu biến tính không tốt do thời gian biến tính ngắn hoặc nhiệt độ biến tính thấp. Chúng tôi đã tiến hành thay đổi một vài yếu tố trong phản ứng PCR để thu được sản phẩm đặc hiệu, không có tạp. Sản phẩm PCR Tạp1 Tạp2 40 Trường hợp tăng nhiệt độ bắt cặp không thể được, vì nhiệt độ nóng chảy của mồi xuôi là 53,6 0C và mồi ngược là 54,5 0C, còn nhiệt độ bắt cặp theo chu kỳ nhiệt là 52 0C. Thay đổi đầu tiên: Chúng tôi giảm lượng DNA mẫu đưa vào, kết hợp với giảm Taq DNA polymerase (1,5 U/phản ứng), giảm primer (0,5 pmol/μl), các thành phần phản ứng khác và chu kỳ nhiệt không đổi, kết quả là đã giảm bớt tạp (phần tạp 1 không còn nữa) (Hình 4.10). Hình 4.10: Sản phẩm PCR sau thay đổi đầu tiên. Những thay đổi sau: Chúng tôi giảm các yếu tố Taq DNA polymerase, primer, dNTPs, MgCl2, thay đổi chu kỳ nhiệt và cuối cùng đã thiết lập được nồng độ các hóa chất và chu kỳ nhiệt tối ưu để khuếch đại đặc hiệu sản phẩm trên vùng gene bE của nấm Ustilago scitaminea (Bảng 4.3). Bảng 4.3: Nồng độ các yếu tố trong phản ứng PCR thay đổi. Hóa chất Nồng độ đầu Nồng độ cuối Nồng độ cuối thay đổi MgCl2 dNTPs Primer F Primer R Taq DNA polymerase 25 mM 10 mM 10 pmol/μl 10 pmol/μl 5 U/μl 2,5 mM 0,2 mM 1 pmol/μl 1 pmol/μl 2,5 U 2 mM 0,15 mM 0,4 pmol/μl 0,4 pmol/μl 1 U Sản phẩm PCR 41 Chu kỳ nhiệt thay đổi: Khởi động: 94 0C – 5 phút. 94 0 C – 45 giây 52 0 C – 30 giây 30 chu kỳ. 72 0 C – 30 giây Kết thúc: 72 0C – 3 phút. Cuối cùng chúng tôi đã thu được sản phẩm PCR rất đặc hiệu và không còn tạp (Hình 4.11). Hình 4.11: Sản phẩm PCR sau khi thay đổi nồng độ hóa chất và chu kỳ nhiệt. Sau khi xây dựng được quy trình tối ưu, chúng tôi tiến hành khuếch đại DNA của 11 dòng nấm đã phân lập được. Sản phẩm được kiểm tra bằng cách điện di trên gel agarose 1,2 %. Kết quả cho thấy ở Hình 4.12. Hình 4.12: Sản phẩm PCR theo quy trình mới. 442 bp Sản phẩm PCR 400 bp 42 Ghi chú: L1: Us1 L4: Us4 L7: Us7 L10: Us10 L2: Us2 L5: Us5 L8: Us8 L11: Us11 L3: Us3 L6: Us6 L9: Us9 M: Ladder 100 bp Như vậy theo quy trình mới thì vừa tiết kiệm được hóa chất, đặc biệt là Taq DNA polymerase là hóa chất đắt tiền, từ 2,5 U cho 1 phản ứng giảm xuống còn 1 U cho 1 phản ứng, lại cho sản phẩm khuếch đại rất tốt. Chúng tôi đã BLAST được trình tự khuếch đại trên cơ sở dữ liệu GenBank (phụ lục 1). 43 Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận  Đã phân lập và tách đơn bào tử được 11 dòng nấm Ustilago scitaminea từ 11 giống mía khác nhau ở Bình Dương.  Nấm Ustilago scitaminea tăng sinh khối rất nhanh trên môi trường PGA* lỏng.  Có thể áp dụng các quy trình ly trích DNA tổng số nấm đang phổ biến trên thế giới để tiến hành ly trích DNA tổng số của nấm Ustilago scitaminea.  Áp dụng quy trình tinh sạch (mục 3.4.6) để thu được DNA tổng số của nấm sau khi ly trích được tốt hơn.  Qua nghiên cứu chúng tôi đã xây dựng được quy trình PCR tương đối tốt, phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm để khuếch đại đoạn gen bE của nấm Ustilago scitaminea. 5.2. Đề nghị  Xây dựng qui trình PCR để phát hiện trực tiếp nấm Ustilago scitaminea xâm nhiễm vào cây mía, từ đó có thể chẩn đoán sớm bệnh than.  Cần có những nghiên cứu rộng hơn về hình thái, đặc điểm sinh lý, sinh hóa của nấm Ustilago scitaminea để có thể đánh giá chính xác hơn về tình trạng nhiễm bệnh của cây mía tại Việt Nam.  Nghiên cứu sâu hơn bằng các sử dụng các phương pháp như RFLP, RAPD, AFLP… để đánh giá mức độ khác biệt di truyền của các dòng nấm Ustilago scitaminea tại Việt Nam.  Tiến hành giải trình tự vùng gene bE và so sánh để đánh giá chính xác sự khác biệt trong bộ gene của nấm. 44  Tiến hành nghiên cứu về độc tố của nấm để có thể đề ra các biện pháp ngăn ngừa và điều trị bệnh. TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 1. Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang, 1999. Di truyền phân tử. Nhà xuất bản nông nghiệp. 2. Lê Song Dự, Nguyễn Thị Quí Mùi, 1997. Cây mía. Nhà xuất bản Nông nghiệp Tp. Hồ Chí Minh. 3. Vũ Triệu Mân, 2003. Chẩn đoán bệnh hại thực vật. Nhà xuất bản Nông nghiệp. 4. Nguyễn Thị Lang, 2002. Phương pháp cơ bản trong nghiên cứu công nghệ sinh học. Nhà xuất bản Nông nghiệp TP. Hồ Chí Minh. 5. Trần Văn Sỏi, 2003. Cây mía. 6. Hà Đình Tuấn, 2004. Điều tra thành phần hại mía trên một số giống mới nhập nội và khảo sát diễn biến bệnh hại quan trọng ở vùng mía nguyên liệu vùng Đông Nam Bộ. Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp. Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. 7. Phan Gia Tân, 1990. Cây mía. Tủ sách ĐH Nông Lâm. 8. Nguyễn Văn Tuất, 2002. Kỹ thuật chẩn đoán và giám định bệnh hại cây trồng. Nhà xuất bản Nông nghiệp. TÀI LIỆU TIẾNG NƢỚC NGOÀI. 9. Albert, H, H., Schenck, S., 1996. PCR amplification from a homolog of the bE mating – type gene as a sensitve the presence of Ustilago scitaminea DNA. Plant Dis 80: 1189 – 1192 10. Braithwaite K. S., Bakkeren G., et al., 2004. Genetic variation in a worldwide collection of the sugarcane smut fungus Ustilago scitaminea. Australian Society of Sugar Cane Technologists 47: 233 – 235. 45 11. Comstock J. C., and Lentini R.S., 2006. Sugarcane Smut Disease. 12. Croft B. J., and Braithwaite K. S., 2006. Management of an incursion of sugarcane smut in Australia. Australasian Plant Pathology 35: 113 - 122. 13. Engelke J. H., Egan B. T., et al., 2001. Sugarcane smut: successful management in the Ord. Crop Protection 22: 45 – 49. 14. Grisham M. P., 2001. An international project on genetic variability within sugarcane smut. International Society of Sugar Cane Technologists 45: 459 - 461. 15. Gupta V.P., 2006. Sugarcane smut. 16. Martinez M. I., Medina, et al., 2000. Changes of some chemical parameters, involved in sucrose recovery from sugarcane juices, related to the susceptibility or resistance of sugarcane plants to smut (Ustilago scitaminea). International Sugar Journal 102: 445 - 448. 17. Muñiz Y., Martínez B., et al., 2004. Sugarcane smut (Ustilago scitaminea Sydow): diagnostic methods. Revista de Protección Vegetal 19: 16. 18. Naik G. R., Jayaraj Y. M., et al., 2002. Early detection of sugarcane smut infection by serological (ELISA) technique. Indian Sugar 51: 801 - 805. 19. Nallathambi P., Padmanaban P., et al., 2001. Standardization of an indirect ELISA technique for detection of Ustilago scitaminea Syd., causal agent of sugarcane smut disease. Journal of Mycology and Plant Pathology 31: 76 - 78. 20. Riley I. T., Jubb T. F., et al., 1999. First outbreak of sugarcane smut in Australia. Proceedings of the XXIII ISSCT Congress 2: 333 - 337. 21. Schenck S., 2003. New race of sugarcane Smut on Maui. Pathology Report 69:13. 22. Sharififar and Kazemi Q., 1999. Evaluation of five different fungicides on control of sugarcane smut (Ustilago scitaminea) in Iran. Sugar Technologists' Association of India 79: 125 – 129. 23. Singh N., Somai B.M., et al., 2005. In vitro screening of sugarcane to evaluate smut susceptibility. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 80: 259 - 266. 46 24. Singh N., Somai B.M., et al., 2004. Smut disease assessment by PCR and microscopy in inoculated tissue cultured sugarcane cultivars. Plant Science 167 : 987 - 994. 25. Sinky K. V., 2000. The smut fungi on Saccharum and related grasses. Australasian Plant Pathology 29: 3. 26. Solas M. T., Piñon D., et al., 1999. Ultrastructural aspects of sugarcane bud infection by Ustilago scitaminea teliospores. Sugar Cane 2: 14 - 18. 27. Wada A. C., 2003. Control of sugarcane smut disease in Nigeria with fungicides. Crop Protection 22: 45 - 49. 28.Wada A. C., Mian M. W., et al., 1999. Control of sugarcane smut (Ustilago scitaminea Syd) disease in Nigeria and suggestions for an integrated pest management approach. Sugar Tech 3: 48 - 53. 29. Xu L., Que Y., et al., 2004. Genetic diversity of Ustilago scitaminea in Mainland China. Sugar Tech 6: 267 - 271. 30. Yadahalli K. B., 2002. Evaluation of artificial inoculation techniques of sugarcane smut Ustilago scitamines Syd. Cooperative Sugar 34: 33 - 35. ĐỊA CHỈ TRÊN WEB 31. 47 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Trình tự đoạn khuếch đại trên gene bE của nấm Ustilago scitaminea khi dùng cặp mồi bE4 và bE8 trên cơ sở dữ liệu GenBank. LOCUS USU61291 442 bp DNA linear PLN 23-JUL- 1996 DEFINITION Ustilago scitaminea b East mating-type gene, partial cds. ACCESSION U61291 VERSION U61291.1 GI:1438940 KEYWORDS . SOURCE Sporisorium scitamineum ORGANISM Sporisorium scitamineum Eukaryota; Fungi; Basidiomycota; Ustilaginomycetes; Ustilaginomycetidae; Ustilaginales; Ustilaginaceae; Sporisorium. REFERENCE 1 (bases 1 to 442) AUTHORS Albert,H.H. and Schenck,S. TITLE PCR amplification from a homolog of the bE mating-type gene as a sensitive assay for the presence of Ustilago scitaminea DNA JOURNAL Unpublished REFERENCE 2 (bases 1 to 442) AUTHORS Albert,H.H. and Schenck,S. TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted (19-JUN-1996) USDA ARS, Hawaii Agriculture Research Center, 99-193 Aiea Heights Dr., Aiea, HI 96701, USA FEATURES Location/Qualifiers source 1..442 /organism="Sporisorium scitamineum" /mol_type="genomic DNA" /db_xref="taxon:49012" /note="plus mating-type" gene 1..442 /gene="b East mating-type gene" CDS 442 /gene="b East mating-type gene" /codon_start=2 /protein_id="AAB04128.1" /db_xref="GI:1438941" /translation="FINARRRSGWSNILREFARGDRSRMKVLMQAKMSSCGLSVPLHP GCSTPIRSVDDILCDNLNRPLTAADKKGFEEEWSSMISWIRYGVKEKIGDWVYDLVAA SKKPRKTGQARPVTTPVKRTPARKAATTQQAKPGRAKQRXSATPS" ORIGIN 1 gttcatcaac gcgcgccgcc gttccggctg gtccaacatt ctccgcgaat ttgcacgggg 61 cgatcgttca cgaatgaaag ttctcatgca agccaagatg agctcttgcg gcttgtccgt 121 tcctttgcac ccgggctgct cgacgccaat tcggagcgtg gacgatatcc tttgcgacaa 181 cctcaatcga cctctcacag cagcagacaa gaaagggttc gaagaagaat ggagcagcat 241 gatcagctgg atcagatatg gcgtcaagga aaagatcgga gactgggtct acgatctcgt 301 tgcggcaagc aagaagccgc ggaaaactgg tcaagcgcgc ccagtcacca ctcctgtgaa 361 gcgcacacca gcacgcaaag cagccacgac tcagcaggcc aagcctggga gggctaagca 421 gagarcaagc gcgacacctt cc 48 Phụ lục 2: Cách pha một số hóa chất 1. Pha lysis buffer Lysis buffer có các thành phần cụ thể như sau: Tris HCl 50 mM, EDTA 50 mM, SDS 3 %, - mercaptoethanol 1 %.  Cho vào becher một thể tích nước khử ion gần bằng với thể tích dung dịch buffer mong muốn.  Lần lượt cho các thành phần khác: Tris HCl, EDTA và SDS vào dung dịch với một lượng sao cho đảm bảo nồng độ cuối cùng như mong muốn.  Khuấy đều cho hỗn hợp hòa tan, sau đó cho - mercaptoethanol vào.  Khuấy đều và chuẩn độ cho dung dịch lysis buffer đạt pH = 8. Nếu sau khi chuẩn độ thể tích cuối cùng chưa đạt như mong muốn cần thêm nước khử ion vào cho đạt thể tích mong muốn. 2. Pha Phenol  Làm tan 100 g phenol (tinh thể) bằng cách đặt trong bồn ủ nhiệt ở 65 0C (phải bịt kín dụng cụ đựng phenol khi hòa tan).  Sau khi phenol đã tan hoàn toàn, thêm vào 100 ml dung dịch Tris bazơ 0,5 M, pH = 8.  Khuấy từ 10 phút, để yên ở nhiệt độ phòng cho đến khi hỗn hợp tách thành hai pha, hút bỏ phần dung dịch bên trên một cách cẩn thận. Lưu ý các thao tác này nên thực hiện ở trong tủ hood và phải luôn giữ phenol trong tối để tránh oxy hóa và nguy hiểm đến sức khỏe.  Tiếp tục cho vào 100 ml dung dịch Tris HCl 0,5 M, pH 8.  Khuấy từ 10 phút, để yên ở nhiệt độ phòng cho đến khi dung dịch tách làm hai pha, hút bỏ phần dung dịch bên trên.  Lập lại chu kỳ này một lần nữa. Sau đó phủ lên trên dung dịch phenol thu được một lớp TE 1X (50 ml). 49  Lưu ý là phải bảo quản dung dịch phenol trong tối (dùng bình đựng có màu tối hoặc bịt kín bình bằng giấy bạc). 3. Pha dung dịch TE 1X  Thành phần gồm: 10 mM Tris HCl, 1 mM EDTA, pH 8.  Trước hết pha dung dịch Tris HCl stock, pH 8.  Cho dung dịch Tris HCl và EDTA vào nước khử ion.  Khuấy đều và chuẩn độ pH đến 8.