Khóa luận Xây dựng qui trình phát hiện virus PMWaV-1 gây bệnh héo đỏ đầu lá (Mealybug wilt) trên cây dứa Cayenne bằng phương pháp RT-PCR

er với chính nó (trình tự của chúng không được bổ sung nhau). - Tm của 2 primer không cách xa nhau. - Trình tự của primer phải đặc trưng cho trình tự của DNA được khuyếch đại, không trùng với các trình tự lặp lại trên gen. Trình tự giữa 2 primer không nên quá lớn, phản ứng PCR thường tối ưu với những đoạn trình tự nhỏ hơn 1kb (Phan Cự Nhân, 2001). 2.8.2.5 Taq – polymerase Là một DNA polymerase chịu nhiệt, được tách chiết từ một vi khuẩn suối nước nóng có tên là Thermus aquaticus. Taq - polymerase không bị phá hủy ở nhiệt độ biến tính của phản ứng PCR và hoạt động tối ưu ở 68 – 72oC . Nồng độ enzyme Taq polymerase được sử dụng thông thường là 0.5 – 5 đơn vị trên 100µl dung dịch phản ứng. Nếu nồng độ Taq quá cao có thể tạo ra những sản phẩm không chuyên biệt làm sai lệch kết quả. Nếu nồng độ Taq quá thấp, phản ứng sẽ không có đủ lượng enzyme cần thiết để tạo ra sản phẩm PCR theo mong muốn (Bùi Chí Bửu, 1999). 30 2.8.2.6 Số lượng chu kỳ trong phản ứng PCR Số chu kỳ cho 1 phản ứng tùy thuộc vào số lượng bản sao ban đầu của mẫu. Ví dụ nếu lượng bản mẫu ban đầu là 105 thì cần 25 – 30 chu kỳ, nếu lượng bản mẫu là 102 – 103 thì số lượng chu kỳ là 35 – 40 . Trong thực tế không nên thiết lập số chu kỳ quá lớn cho 1 phản ứng PCR. Sở dĩ như vậy là vì phản ứng PCR diễn tiến qua 2 giai đoạn, ở giai đoạn đầu số lượng bản sao tăng theo cấp số nhân của lượng mẫu, sau đó hiệu quả khuyếch đại giảm hẳn vì những nguyên nhân sau: - Sự phân hủy và cạn kiệt các thành phần của phản ứng - Sự xuất hiện các sản phẩm phụ ức chế phản ứng - Các bản sao vừa được tổng hợp không kết hợp với mồi mà bắt cặp với nhau (Phan Cự Nhân, 2001). 2.9 Phương pháp RT-PCR (Reverse Transcription PCR) RT-PCR là một kỹ thuật cho phép ta khuếch đại các đoạn mRNA (RNA thông tin) để làm cơ sở cho việc nghiên cứu về sự biểu hiện gene (sự sao mã tạo ra các mRNA của các gen) hay nghiên cứu các retrovirus (các loại virus mang thông tin di truyền là mRNA). RT-PCR hoạt động dựa trên cơ sở của kỹ thuật PCR nhưng trước khi thực hiện phản ứng khuếch đại, có thêm giai đoạn tổng hợp cDNA (complementary DNA) từ sợi mRNA khuôn. Giai đoạn này được thực hiện nhờ enzyme reverse transcriptase, enzyme phiên mã ngược được phân lập từ retrovirus. Nếu cung cấp một primer bắt cặp với mRNA, enzyme reverse transcriptase sẽ thực hiện phản ứng phiên mã ngược, tổng hợp nên một sợi DNA bổ sung với sợi mRNA khuôn, gọi là sợi cDNA. Sau khi được tạo ra, sợi cDNA sẽ được dùng làm khuôn mẫu cho phản ứng khuếch đại DNA thông thường. (Bùi Trang Việt, 2002) 31 Hình 2.8: Phản ứng RT-PCR Có 3 loại primer chính thường dùng trong giai đoạn tổng hợp cDNA * Primer là các oligo T Tất cả các loại mRNA đều có đuôi poly A ở đầu 3' nên với primer là một đoạn oligo T (ví dụ: TTTTTT) thì nó sẽ bắt cặp với sợi mRNA ở đoạn poly A và phản ứng tổng hợp sẽ tạo ra sợi cDNA có độ dài ứng với toàn bộ sợi mRNA khuôn. Phương pháp này rất thuận lợi cho những nghiên cứu tổng quát về mRNA. * Primer random hexamer Là những đoạn oligo nucleotide gồm 6 nucleotide với trình tự ngẫu nhiên. Chúng bám lên nhiều điểm khác nhau dọc theo suốt sợi mRNA và tổng hợp nên những đoạn cDNA ngắn phủ khắp sợi mRNA khuôn mẫu. Random hexamer thích hợp cho những sợi mRNA đích quá dài hoặc có nhiều cấu trúc thứ cấp gây cản trở cho oligo T hoạt động hiệu quả. 32 * Primer chuyên biệt Primer được thiết kế với một trình tự chuyên biệt cho một đoạn trình tự nhất định trên sợi mRNA. Primer sẽ bắt cặp ở trước đầu 3' của đoạn gene mong muốn và phản ứng tổng hợp sẽ tạo ra sợi cDNA có độ dài từ điểm bắt cặp kéo dài đến hết sợi mRNA khuôn. Do primer chỉ bắt cặp tại một điểm chuyên biệt nên cDNA tạo ra sẽ chứa đoạn trình tự mong muốn với xác suất rất cao, vì vậy, loại primer này đặc biệt hữu hiệu trong việc khuếch đại các mRNA có số lượng bản sao thấp. (O'Connell J., 2002). Phản ứng RT-PCR có thể được thực hiện theo 2 bước (two steps) hay diễn ra liên tục (one step). * Phản ứng qua 2 bước Trước tiên, thực hiện phản ứng tổng hợp cDNA với mRNA khuôn, primer và enzyme reverse transcriptase trong khoảng 45 phút ở 42 - 45oC (là nhiệt độ thích hợp cho hoạt động của enzyme reverse transcriptase). Sau đó, bổ sung primer cho PCR, Taq - polymerase để thực hiện tiếp phản ứng khuếch đại. Phương pháp này thường được sử dụng với các primer tổng hợp cDNA là oligo T hay hexamer, giúp người thực hiện có thể khống chế được từng qui trình. Tuy nhiên dễ xảy ra nhiễm các DNA lạ khi bổ sung hóa chất giữa 2 giai đoạn. * Phản ứng liên tục Cho tất cả các yếu tố cần thiết cho cả phản ứng tổng hợp cDNA và phản ứng khuếch đại vào một lần rồi thực hiện cả 2 qui trình liên tục. Phương pháp này thường được thực hiện với các primer được thiết kế chuyên biệt chung cho cả phản ứng tạo cDNA lẫn phản ứng khuếch đại và ít gây nhiễm DNA lạ trong quá trình thao tác. 33 2.10 Kỹ thuật giải trình tự DNA (Sequencing) Để xác định trình tự của một đoạn DNA mong muốn, phương pháp Sanger là phương pháp thường được sử dụng nhất hiện nay. Phương pháp này dựa trên nguyên tắc: thực hiện sự tổng hợp sợi DNA bổ sung với sợi cần xác định trình tự (thực hiện phản ứng PCR), nhưng ngoài 4 loại dNTP thông thường còn bổ sung thêm các dideoxynucleotide triphosphate (ddNTP). Các ddNTP này không có nhóm -OH ở đầu 3' nên khi chúng gia nhập vào chuỗi sẽ làm cho sự kéo dài chuỗi bị dừng lại (do không thể tạo được liên kết giữa nhóm -OH 3' của nucleotide trước với nhóm phosphate 5' của nucleotide sau). Sự gia nhập của các ddNTP vào chuỗi là hoàn toàn ngẫu nhiên nên phản ứng kéo dài sẽ ngừng lại ở một vị trí bất kỳ. Do đó, nếu cung cấp một lượng DNA mẫu đủ lớn thì các phản ứng tổng hợp sẽ cho hàng loạt các sản phẩm có độ dài tăng dần: 1, 2, 3, 4… nucleotide. Như vậy, chỉ cần biết được ở mỗi đoạn kết thúc bằng loại ddNTP nào thì sẽ có thể tìm ra được trình tự của đoạn DNA mong muốn. Để làm được điều đó, người ta thực hiện 4 phản ứng PCR cho mẫu DNA muốn giải trình tự cùng lúc, ở mỗi phản ứng chỉ cho thêm một loại ddNTP (A, T, G hoặc C). Sau phản ứng, kết quả điện di sản phẩm của cả 4 trên cùng một gel acrylamide sẽ giúp xác định được trình tự của đoạn DNA (Bùi Trang Việt, 2002). Hiện nay, với các thế hệ máy đọc trình tự mới, các ddNTP được gắn thêm các chất phát màu huỳnh quang, mỗi loại ddNTP gắn với 1 màu khác nhau thay vì gắn với đồng vị phóng xạ như phương pháp kinh điển. Kết thúc phản ứng, các đoạn DNA sẽ được phân tích bằng phương pháp điện di mao quản (capillary electrophoresis). Cuối cùng, từ kết quả điện di, máy sẽ đọc các màu huỳnh quang phát ra trên capillary và phân tích với các phần mềm chuyên dụng để cho ra trình tự các nucleotide của đoạn DNA quan tâm. 34 Phần 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Vật liệu nghiên cứu 3.1.1 Mẫu Mẫu nghiên cứu gồm chồi giống thương phẩm và các mẫu lá bệnh được lấy ngẫu nhiên từ 3 giống dứa Cayenne: - Giống Thái Lan và giống Lâm Đồng do nông trường Phạm Văn Hai cung cấp. - Giống Trung Quốc do nông trường Thọ Vực cung cấp. Hình 3.1: Mẫu chồi giống dứa Cayenne thương phẩm 3.1.2 Dụng cụ và thiết bị - Máy ly tâm Mikro 22R - Máy vortex - Máy luân nhiệt iCycle (BioRad) - Bộ nguồn và bồn điện di (BioRad) - Bình đựng Nitơ lỏng - Pipetman, đầu tube và eppendorf các loại. 35 3.1.3 Hóa chất 3.1.3.1 Hóa chất dùng cho tách chiết RNA Sử dụng kit ly trích AurumTM Total RNA Mini Kit (Catalog #732-6820) do Bio Rad cung cấp: - Lysis solution. - Low stringency wash solution (X5). - High stringency wash solution. - DNase I (ở dạng bột rắn, cần pha buffer trước khi sử dụng). - DNase dilution solution. - Elution solution. Ngoài ra, còn có các hóa chất khác cần cung cấp riêng: - β- mercaptoethanol, 14.2 M. - Polyvinylpyrolidone - 40 (PVP), 2%. - Ethanol 100% và 70%. - Tris-base (pH 7.5, 10 mM). - Nitơ lỏng. - NaOH 0.1M. - EDTA 1mM. - DEPC (Diethyl pyrocarbonate). 3.1.3.2 Hóa chất dùng cho phản ứng RT-PCR - Primer cho phản ứng RT-PCR: Primer 225: 5'-ACAGGAAGGACAACACTCAC-3' Primer 226: 5'-CGCACAAACTTCAAGCAATC-3' (Theo thiết kế của Sether D.M và ctv, 2001) Cặp primer này sẽ khuếch đại từ vị trí nucleotide thứ 118 đến nucleotide 707 trên gene mã hóa cho HSP 70 của PMWaV-1 cho ra sản phẩm có kích thước 589bp. 36 118 707 Đoạn khuếch đại 589bp Gene mã hóa HSP70 Primer 226 Primer 225 5’3’ Hình 3.2: Sơ đồ phản ứng RT-PCR khuếch đại đoạn gene HSP 70 của PMWaV-1 bằng cặp primer 225, 226. Các hóa chất khác thuộc bộ kit Access RT-PCR System (Promega) gồm: - AMV / Tfl Buffer (5X) - dNTP (10mM) - MgSO4 (25 mM) - Enzyme reverse transcriptase AMV (5 Unit/µl) - Enzyme Taq polymerase Tfl (5 Unit/µl) 3.1.3.3 Hóa chất dùng cho điện di DNA - Agarose (BioRad). - Ethidium bromide. - Loading dye 6X (Promega). - Nước cất 2 lần. - Dung dịch TAE 1X (Tris acetat 40mM, EDTA 0,1mM, pH 8). - Thang DNA (100bp DNA ladder – Promega). 37 Hình 3.3: Thang DNA 3.1.3.4 Hóa chất dùng cho điện di RNA - MOPS buffer 5X (MOPS 10 mM, sodium acetat 2,5 mM, EDTA 0,5 mM, pH 7,0). - Formaldehyde 37%. - Formamide. - Nước cất khử ion, khử RNase. - Dung dịch đặt mẫu biến tính (loading dye biến tính). 3.2 Phương pháp nghiên cứu 3.2.1 Tách chiết RNA Mẫu chồi dứa được lột hết các lá ngoài, lấy phần lõi trắng bên trong cắt thành từng mảnh nhỏ (<5mm), nghiền thành bột mịn trong Nitơ lỏng rồi đem ly trích RNA với bộ kit Aurum Total RNA Mini Kit theo các bước: 1. Cho 60 mg mẫu vào tube ly tâm 2 ml có nắp đậy. Hòa tan mẫu bằngvới 700 µl dung dịch ly giải (lysis solution). 2. Ly tâm dịch ly giải ở 14 000 vòng trong 3 phút, chuyển dịch nổi vào tube ly tâm 2 ml mới. 1500 bp 1000 bp 500 bp 100 bp 38 3. Thêm 700 µl ethanol 70% vào mỗi tube, hòa tan bằng pipet cho đến khi dung dịch không còn phân lớp. 4. Ủ ấm dịch hòa tan trong water bath 700C (chuẩn bị cho bước 12). Đặt RNA binding column vào tube ly tâm 2 ml không nắp. 5. Cho 700 µl dung dịch ở bước 3 vào RNA binding column, ly tâm 60 giây, loại bỏ dịch lọc. Thực hiện tương tự cho hết phần dịch còn lại. 6. Cho 700 µl dịch rửa low stringency vào RNA binding column, ly tâm 30 giây, loại bỏ dịch lọc. 7. Trộn 5 µl DNase với 75 µl dung dịch DNase delution (trong tube 1.5 ml), cho vào RNA binding column. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 15 phút, ly tâm 30 giây, loại bỏ dịch lọc. 8. Cho 700 µl dung dịch high stringency vào RNA binding column, ly tâm 30 giây, loại bỏ dịch lọc 9. Thực hiện tương tự bước 12 với dung dịch low stringency 10. Ly tâm thêm 1 phút để loại bỏ hoàn toàn dịch rửa. 11. Chuyển RNA binding column vào tube 1.5 ml có nắp đậy, cho 80 µl dịch hòa tan (elution solution) đã ủ ở 70oC ở bước 5 vào, ủ 1 phút, ly tâm 2 phút để thu RNA tổng số. Dung dịch RNA được bảo quản ở 40C. 3.2.2 Điện di sản phẩm ly trích RNA Nấu 16 ml gel 1,8%, chờ nguội đến khoảng 65oC, cho thêm 4 ml MOPS 5X và 400 µl formaldehyde. Khi gel nguội, ngâm trong dung dịch MOPS 1X khoảng 30 phút trước khi điện di. Mẫu sản phẩm RNA trước khi điện di được làm biến tính ở 65oC trong 30 phút rồi làm lạnh nhanh trong nước đá khoảng 1 phút. Sau đó, trộn với dung dịch nạp mẫu biến tính rồi đem điện di ở 30V trong 150 phút. Sản phẩm điện di được quan sát dưới đèn cực tím. 39 3.2.3 Xây dựng quy trình RT-PCR 3.2.3.1 Kiểm tra độ đặc hiệu của primer Trước khi được dùng làm mồi đặc hiệu cho phản ứng RT-PCR phát hiện PMWaV-1, cặp primer 225, 226 được kiểm tra các cấu trúc thứ cấp bằng phần mềm trực tuyến Oligo Analyzer của hãng IDT ( và được kiểm tra độ đặc hiệu cho PMWaV-1 bằng công cụ BLAST của NCBI ( 3.2.3.2 Xác định chu trình nhiệt tối ưu Quy trình RT-PCR được thực hiện theo theo kiểu one step. Primer 226 sẽ thực hiện phản ứng reverse với tác động của enzyme reverse transcriptase, tổng hợp sợi cDNA từ RNA của PMWaV-1. Sau đó dưới tác động của Taq – polymerase, cả hai primer 225 và 226 sẽ hoạt động, khuếch đại các cDNA vừa tạo. Với nguyên tắc trên, phản ứng RT-PCR tối ưu sẽ được khảo sát dựa trên 5 chu trình sau Bảng 3.1: Các chu trình nhiệt của phản ứng RT-PCR được khảo sát Chu trình nhiệt Giai đoạn 1 2 3 4 5 Tạo cDNA 45oC/45’ 94oC/2’ 45oC/45’ 94oC/2’ 45oC/45’ 94oC/2’ 45oC/45’ 94oC/2’ 45oC/45’ 94oC/2’ Khuếch đại cDNA 92oC/30’’ 52oC/1’ 68oC/1’30’’ (45 chu kỳ) 92oC/30’’ 54oC/1’ 68oC/1’30’’ (45 chu kỳ) 92oC/30’’ 56oC/1’ 68oC/1’30’’ (45 chu kỳ) 92oC/30’’ 58oC/1’ 68oC/1’30’’ (45 chu kỳ) 92oC/30’’ 58oC/1’ 68oC/1’30’’ (10 chu kỳ) 92oC/30’’ 54oC/1’ 68oC/1’30’’ (35 chu kỳ) Kéo dài 68oC/8’ 68oC/8’ 68oC/8’ 68oC/8’ 68oC/8’ Trong đó chu trình 2 được thực hiện theo Sether (2001), các chu trình 1, 3, 4 chỉ thay đổi nhiệt độ bắt cặp ở giai đoạn khuếch đại cDNA của chu trình 2. 40 3.2.3.3 Xác định nồng độ primer thích hợp Hỗn hợp hóa chất cần thiết cho một sản phẩm PCR (50 µl) được pha như sau: Hóa chất Thể tích Nồng độ cuối AMV / Tfl Buffer (5X) 10 µl 1X dNTP (10mM) 1 µl 0.2 mM MgSO4 (25 mM) 2 µl 1 mM Enzyme reverse AMV (5 Unit/µl) 1 µl 0.1 Unit/µl Enzyme Taq polymerase Tfl (5 Unit/µl) 1 µl 0.1 Unit/µl Primer 225 (25 mM) --- --- Primer 226 (25 mM) --- --- RNA khuôn mẫu 2 µl Nước cất 2 lần 29 µl Trong đó, nồng độ primer cho phản ứng được khảo sát ở 3 mức nồng độ cuối là 1 mM, 0,8 mM và 0,6 mM. 3.2.3.4 Xác định số chu kỳ phản ứng tối ưu. Phản ứng RT-PCR được thực hiện ở 5 mức 41, 42, 43, 44, 45 chu kỳ để xác định số chu kỳ cho hiệu quả khuếch đại tối ưu. 3.3.4 Điện di sản phẩm RT-PCR Sản phẩm PCR được đem điện di trên gel agarose 1.5% với hiệu điện thế 50V trong 90 phút. Quan sát kết quả điện di dưới đèn cực tím. Kích thước các sản phẩm PCR được ghi nhận thông qua sự so sánh với thang chuẩn 100 bp DNA ladder (Promega). Những mẫu khuếch đại có chứa band với kích thước 600 bp, tương đương với đoạn 589 bp trên lý thuyết, sẽ là những mẫu dương tính - bị nhiễm PMWaV-1. 41 3.3.5 Giải trình tự sản phẩm RT-PCR Để kiểm tra độ đặc hiệu của sản phẩm RT-PCR, có 2 mẫu sản phẩm RT-PCR dương tính trên điện di, 1 của cây bệnh, 1 của chồi dứa thương phẩm (không có triệu chứng bệnh) được đem giải trình tự. Do hạn hẹp về thời gian thực hiện đề tài, chúng tôi không thể trực tiếp tiến hành giải trình tự nên gửi mẫu sản phẩm RT-PCR sang công ty Macrogene – Hàn Quốc để thực hiện. Sau đó, trình tự sẽ được so sánh với dữ liệu của đoạn gene mã hóa cho HSP 70 của PMWaV-1 trên GenBank bằng các phần mềm Clustal X 1.83 và BLAST. 3.3.6 Giám định chồi giống dứa Áp dụng quy trình đã xây dựng được, tiến hành giám định trên 3 giống dứa Thái Lan, Trung Quốc, Lâm Đồng, mỗi giống gồm 30 mẫu chồi giống dứa thương phẩm được lấy ngẫu nhiên từ các nông trường. Tất cả được thực hiện phản ứng RT-PCR và điện di. 42 Phần 4 KẾT QUẢ – THẢO LUẬN 4.1 Kết quả ly trích RNA Sau khi tiến hành ly trích RNA tổng số của mẫu dứa, sản phẩm ly trích được điện di trong MOPS buffer 1X để kiểm chứng xem có thu được RNA hay không. Kết quả kiểm tra sản phẩm RNA sau ly trích được thể hiện qua hình sau: Hình 4.1: Kết quả điện di sản phẩm ly trích RNA Chú thích: Giếng 1: Mẫu RNA không biến tính Giếng 2: Mẫu RNA biến tính Khi ly trích RNA thực vật, sản phẩm chiếm đại đa số là 2 tiểu phần ribosome 18S và 28S. Các loại RNA khác như mRNA, RNA virus có rất ít nên khi điện di, hầu như không thể thấy được các sản phẩm này, chỉ có thể thấy được 2 vạch 28S và 18S. Vì vậy, 2 vạch sản phẩm 28S, 18S được xem như là dấu hiệu nhận biết của RNA thực vật. Hình 4.1 cho thấy sản phẩm RNA ly trích được có chứa 2 vạch tương ứng với các ribosome 28S và 18S. Trong đó, ở giếng 2, mẫu RNA được làm biến tính với nhiệt trước khi điện di nên các sợi RNA duỗi ra và di chuyển trong gel chậm hơn giếng 1. Như vậy, kết quả trên cho thấy đã ly trích được RNA tổng số từ mẫu dứa. 28 S 18 S 1 2 43 4.2 Kết quả xây dựng quy trình RT-PCR 4.2.1 Kết quả khảo sát độ đặc hiệu của primer Cặp primer 225, 226 được chúng tôi khảo sát các đặc tính cơ bản và các cấu trúc thứ cấp bằng phần mềm trực tuyến Oligo Analyzer ( Việc khảo sát các đặc tính cơ bản của cặp primer cho kết quả như sau Bảng 4.1: Các đặc tính cơ bản của cặp primer 225, 226 Primer 225 Primer 226 Trình tự Số Nu % GC Tm 5'-ACAGGAAGGACAACACTCAC-3' 20 50 % 57,3oC 5'-CGCACAAACTTCAAGCAATC-3' 20 45 % 55,7oC Các thông số này của cặp primer 225, 226 hoàn toàn phù hợp với các yêu cầu cơ bản để một cặp primer hoạt động hiệu quả trong phản ứng RT-PCR như: nhiệt độ bắt cặp của 2 primer không cách xa nhau, số Nu tối ưu trong khoảng 10 - 25 Nu, và % GC mỗi primer ở 20 - 80 %. Tiếp theo là việc khảo sát khả năng hình thành các cấu trúc thứ cấp của primer, một yếu tố có ảnh hưởng lớn đến kết quả của phản ứng RT-PCR. Các cấu trúc này bao gồm cấu trúc kẹp tóc (hairpin loop – hình thành từ sự bắt cặp giữa các base trong cùng một primer), homo dimer (hai primer giống nhau tự bắt cặp), hetero dimer (primer xuôi bắt cặp với primer ngược). Nếu primer có các cấu trúc thứ cấp này bền vững thì primer sẽ kém hoạt động, hiệu quả của phản ứng PCR sẽ giảm đáng kể. Để xác định độ bền vững của các cấu trúc thứ cấp, người ta sử dụng chỉ số năng lượng tự do (Delta G, kcal/mole). Theo hãng IDT, các cấu trúc thứ cấp có năng lượng tự do lớn hơn -9 kcal/mole sẽ hầu như không ảnh hưởng đến hoạt động của phản ứng PCR, còn các cấu trúc có năng lượng tự do nhỏ hơn -9 kcal/mole đòi hỏi phải cung cấp một nhiệt độ khá cao mới có thể phá vỡ chúng. 44 Kết quả khảo sát các cấu trúc thứ cấp của cặp primer 225, 226 cho thấy: - Primer 225 có 1 cấu trúc kẹp tóc, 4 cấu trúc homo dimer. - Primer 226 có 1 cấu trúc kẹp tóc, 8 cấu trúc homo dimer. - Hai primer có 7 cấu trúc hetero dimer (Phụ lục 1) Trong đó, các cấu trúc có năng lượng tự do Delta G thấp nhất là: Bảng 4.2: Các cấu trúc thứ cấp mang năng lượng tự do thấp nhất Cấu trúc thứ cấp Delta G (kcal/mol) Kẹp tóc Homo dimer (Primer 225) Homo dimer (Primer 226) Hetero dimer 5' CGCACAAA || ::C 3' CTAACGAACTT 5' ACAGGAAGGACAACACTCAC || : : :: 3' CACTCACAACAGGAAGGACA 5' CGCACAAACTTCAAGCAATC ||| ::: 3' CTAACGAACTTCAAACACGC 5' ACAGGAAGGACAACACTCAC : |||| 3' CTAACGAACTTCAAACACGC - 0,21 - 1,6 - 3,54 - 5,12 Tất cả các cấu trúc thứ cấp kể trên đều có năng lượng tự do lớn hơn -9 kcal/mole nên sẽ không gây ảnh hưởng gì đáng kể đến hoạt động của cặp primer 225, 226 trong phản ứng RT-PCR. Sau đó, cặp primer 225, 226 được kiểm tra độ đặc hiệu cho PMWaV-1 bằng công cụ BLAST của NCBI ( Chương trình này dò tìm trên cơ sở dữ liệu của các ngân hàng gene để tìm ra tất cả các gene có trình tự tương đồng với cặp primer này. Kết quả BLAST cho thấy có 3 đoạn gene có vị trí tương đồng với cặp primer 225, 226 45 Bảng 4.3: Kết quả phân tích BLAST của 2 primer 225, 226 Số Nu tương đồng STT Tên trình tự Primer 225 Primer 226 1 gi|18253957|gb|AF414119.1|AF414119 Pineapple mealybug wilt associated virus-1, complete cds 20/20 20/20 2 gi|22227|emb|X63205.1|ZMCAB48 Zea mays cab48 gene for chlorophyll a/b binding protein precurso 18/20 --- 3 gi|62630081|gb|AC122311.6| Mus musculus BAC clone RP23-298B23 from chromosome 6, complete sequence --- 18/20 Chú thích: --- : không có vị trí tương đồng. Trong đó, hai trình tự 2 và 3 chỉ có vị trí tương đồng với 1 trong 2 primer, chỉ duy nhất trình tự 1, PMWaV-1, là có 2 vị trí tương đồng hoàn toàn với cặp primer 225, 226 nằm trên đoạn gene mã hóa cho HSP 70 (Phụ lục 2). Như vậy, về mặt lý thuyết, cặp primer 225, 226 hoàn toàn đặc hiệu và phù hợp cho phản ứng RT-PCR phát hiện PMWaV-1. 4.2.2 Kết quả xác định chu trình nhiệt tối ưu Ở bước đầu thực hiện phản ứng RT-PCR, chúng tôi đã thực hiện quy trình RT-PCR theo Sether và cộng sự, (2001) (chu trình 2). Tuy nhiên, trong quá trình thí nghiệm, có lẽ do không phù hợp với hóa chất của bộ kit Access RT-PCR System (Promega) mà chúng tôi sử dụng nên quy trình này cho hiệu quả khuếch đại không như mong đợi. Vì vậy, chúng tôi khảo sát lại trên 5 quy trình RT-PCR như đã trình bày ở phần phương pháp thực hiện. 5 chu trình trên được khảo sát với cùng 1 mẫu RNA ly trích từ cây bệnh và cho kết quả sau: 46 Hình 4.2: Sản phẩm RT-PCR của 5 chu trình nhiệt Chú thích: L: ladder Giếng 1, 2, 3, 4, 5: lần lượt là sản phẩm RT-PCR của các chu trình nhiệt 1, 2, 3, 4, 5. Kết quả trên cho thấy chu trình nhiệt của Sether (chu trình 2) đã khuếch đại được đoạn gene mong muốn 589 bp. Tuy nhiên, hiệu quả khuếch đại của chu trình này không cao, phản ứng chủ yếu xảy ra sự bắt cặp không chuyên biệt nên kết quả điện di cho thấy cường độ sáng của vạch sản phẩm phụ rất lớn, trong khi vạch sản phẩm chính lại khá mờ. Sự thay đổi nhiệt độ bắt cặp của chu trình 2 cũng không cho kết quả tốt hơn. Ở chu trình 1, nhiệt độ bắt cặp quá thấp nên không xảy ra sự bắt cặp chuyên biệt, phản ứng chỉ tạo sản phẩm phụ. Ở chu trình 3, nhiệt độ bắt cặp cao hơn giúp ít xảy ra sự bắt cặp không chuyên biệt nên lượng sản phẩm phụ ít đi. Tuy nhiên, với nhiệt độ này, phản ứng RT-PCR xảy ra khó khăn hơn và tạo ra lượng sản phẩm chính ít hơn chu trình 2. Với chu trình 4, nhiệt độ bắt cặp 58oC là quá cao cho cặp primer 225, 226 nên sự khuếch đại chuyên biệt hầu như không xảy ra. 589 bp L 1 2 5 3 4 500 bp 1.500 bp 47 Trong 5 chu trình, chu trình 5 cho sự khuếch đại đặc hiệu cao nhất, vạch sản phẩm phụ mờ, còn vạch sản phẩm chính rất sáng và rõ nét. Chu trình này được xây dựng dựa trên phương pháp Touchdow PCR của Don và ctv (1991) (trích dẫn bởi McPherson M.J. và Moller S.G., 2000). Phương pháp này rất hữu hiệu cho các phản ứng PCR có lượng bản sao ban đầu của mẫu thấp. Trong đó, 10 chu kỳ đầu được thiết lập với nhiệt độ bắt cặp cao (58oC), giúp tăng sự chuyên biệt của phản ứng, nhân bản chính xác đoạn DNA mong muốn. Khi lượng bản sao mục tiêu đã tăng lên đến mức cần thiết, các chu kỳ sau được thiết lập với một điều kiện thuận lợi hơn (bắt cặp ở 54oC), giúp phản ứng khuếch đại xảy ra dễ dàng hơn. Như vậy, kết quả trên cho thấy chu trình 5 là chu trình thích hợp nhất cho phản ứng RT-PCR phát hiện PMWaV-1 với các hóa chất mà chúng tôi sử dụng. 4.2.3 Kết quả khảo sát nồng độ primer thích hợp Sau khi đã xác định được yếu tố chính của phản ứng RT-PCR là quy trình nhiệt, chúng tôi tiến hành xác định các yếu tố khác để tối ưu hóa phản ứng RT-PCR. Tỷ lệ primer – RNA mẫu ảnh hưởng rất lớn đối với phản ứng RT-PCR, vì vậy, cần phải xác định tỷ lệ primer – RNA thích hợp để thu được kết quả tối ưu. Đối với quy trình đang thiết lập, việc xác định nồng độ RNA sau khi ly trích rất khó thu được kết quả chính xác nên chúng tôi chỉ thay đổi nồng độ primer để làm thay đổi tỷ lệ primer – RNA. Có 3 nồng độ primer được chọn khảo sát là 1 mM, 0,8 mM và 0,6 mM. Các sản phẩm đều được thực hiện với RNA trên cùng một mẫu bệnh và cho kết quả điện di sản phẩm RT-PCR như sau: 48 Hình 4.3: Kết quả khảo sát nồng độ primer thích hợp Chú thích: L: Ladder (-) : Đối chứng âm Giếng 1: sản phẩm RT-PCR với nồng độ primer 1 mM Giếng 2: sản phẩm RT-PCR với nồng độ primer 0,8 mM Giếng 3: sản phẩm RT-PCR với nồng độ primer 0,6 mM Kết quả điện di trên cho thấy, với 2 nồng độ primer 1 mM và 0,8 mM phản ứng RT-PCR đều cho vạch sản phẩm chính sáng và rõ nét, nhưng nồng độ 0,8 mM cho lượng sản phẩm phụ ít hơn. Còn ở nồng độ 0,6 mM, lượng primer quá ít nên phản ứng cho hiệu quả khuếch đại thấp. Như vậy, nồng độ primer 0,8 mM chính là nồng độ thích hợp nhất. 4.2.4 Kết quả khảo sát số chu kỳ tối ưu cho phản ứng RT-PCR. Vì số lượng bản sao RNA của virus trong RNA thực vật rất thấp nên số chu kỳ cho một phản ứng RT-PCR thông thường là 40 – 45 chu kỳ. Do đó, chúng tôi đã tiến hành khảo sát trên 5 mức 41, 42, 43, 44 và 45 chu kỳ để tìm số chu kỳ thích hợp nhất. Kết quả của thí nghiệm này cho thấy như sau: 500 bp L (-) 1 2 3 589 bp 49 Hình 4.4: Kết quả khảo sát số chu kỳ RT-PCR thích hợp Chú thích: L: Ladder Giếng 1: sản phẩm RT-PCR với 41 chu kỳ Giếng 2: sản phẩm RT-PCR với 42 chu kỳ Giếng 3: sản phẩm RT-PCR với 43 chu kỳ Giếng 4: sản phẩm RT-PCR với 44 chu kỳ Giếng 5: sản phẩm RT-PCR với 45 chu kỳ Kết quả điện di ở hình 4.4 cho thấy tất cả 5 chu kỳ được khảo sát đều cho kết quả đặc hiệu, thu được vạch sản phẩm mong muốn 589 bp. Các phản ứng có số chu kỳ ít cho sản phẩm chính hơi mờ. Còn ở các phản ứng có số chu kỳ cao, tuy vạch sản phẩm chính rõ hơn nhưng lượng sản phẩm phụ cũng được khuếch đại lên theo. Như vậy, tính đặc hiệu của các phản ứng khuếch đại không tăng lên. Tuy nhiên, quy trình RT-PCR trên được xây dựng với mục đích phát hiện PMWaV-1 trên những mẫu chồi với lượng bản sao RNA virus ban đầu rất thấp nên chúng tôi quyết định chấp nhận lượng sản phẩm phụ cao để tăng độ nhạy cho phản ứng. Vì vậy, mức 45 chu kỳ được chọn là mức thích hợp nhất cho phản ứng RT-PCR. L 1 2 3 4 5 589 bp 500 bp 50 Trong suốt quá trình xây dựng quy trình RT-PCR trên, ngoài vạch sản phẩm chính 589 bp, còn xuất hiện thêm 1 vệt sản phẩm phụ kích thước khoảng 100 bp. Bên cạnh đó, ở các phản ứng đối chứng âm (giếng (-), hình 4.3) không thấy có sản phẩm khuếch đại, chứng tỏ trong quá trình thao tác không xảy ra sự ngoại nhiễm. Như vậy, chúng tôi tạm lý giải điều này là do các nguyên nhân sau: - Primer dư tạo thành các dimer. - Hỗn hợp phản ứng RT-PCR thừa các sản phẩm Mg2+, dNTP, RNA mẫu. - Trên RNA của cây dứa (thu được chung với của PMWaV-1 trong quá trình ly trích RNA tổng số) có những đoạn trình tự cũng gần như bổ sung với cặp primer 225, 226 nên trong phản ứng, ngoài đoạn HSP 70 của PMWaV-1 thì đoạn trình tự này cũng được nhân bản. Tuy nhiên, trên GenBank không có dữ liệu về trình tự các đoạn RNA của cây dứa nên chúng tôi không thể kiểm tra lại giả thuyết này. Việc khử các vạch sản phẩm không chuyên biệt trên đòi hỏi phải mất khá nhiều thời gian và hóa chất nên trong khuôn khổ hạn hẹp của đề tài, chúng tôi chưa thực hiện được việc này. Tuy nhiên, lượng sản phẩm phụ đã được làm giảm đi nhiều, còn sản phẩm chính đã đạt được mức khuếch đại cần thiết để có thể đánh giá chính xác sự hiện diện của PMWaV-1. Như vậy, có thể kết luận quy trình RT-PCR được xây dựng hoàn toàn đủ độ tin cậy trong việc phát hiện PMWaV-1. Hình 4.5: Sơ đồ phản ứng RT-PCR phát hiện PMWaV-1 51 4.3 Kết quả kiểm tra sản phẩm RT-PCR bằng phương pháp giải trình tự Các sản phẩm RT-PCR khi điện di trên gel agarose 1,5% đã thu được vạch DNA với kích thước 589 bp như mong đợi. Tuy nhiên, chưa thể đưa ra kết luận rằng đây chính là đoạn DNA đã nhân bản từ đoạn gene HSP 70 của PMWaV-1. Do đó, phương pháp giải trình tự được áp dụng để kiểm chứng lại các sản phẩm này. Có 2 mẫu sản phẩm RT-PCR dương tính trên điện di, một từ cây bệnh và một từ chồi giống thương phẩm bình thường (không có triệu chứng bệnh) đã được chọn để đem giải trình tự. Do trong các quá trình giải trình tự trực tiếp trên sản phẩm PCR, máy thường không đọc được một số nucleotide đầu tiên nên trình tự của các sản phẩm PCR giải ra bị mất một đoạn khoảng 20 nucleotide về phía đầu 5’, nơi primer xuôi bắt cặp vào. Vì vậy, kết quả giải trình tự 2 sản phẩm RT-PCR thu được 2 đoạn 566 bp và 568 bp. Bảng 4.4: Trình tự của sản phẩm RT-PCR Mẫu Trình tự (5’ – 3’) D1 (566 bp) NNNNNGATTTATGCTGTGGAAAGATTCAGGTTATCGTGATATAAAAAGGT ATTTCGGACTCAACAAGTTCAACAAAGATGTGTATCTCGATAAATTGAAA CCCACAATCGAGGTAGTGGTTGACGACTGGGGTTGTTCTATAGGACCAGT AGACGGTGCGAGAGGGAAAGCCAAATCAGTTCTCACTTTAGCCTCTGATT TTATAACGGGATTGGTACAACTAGCGATCAAGATGACGAATCAACAAGTA TCTGTGTCTGTTTGTTCAGTACCAGCAGCTTACAATTCTTATCAAAGGGG TTTTATTTTTGAAAGTTGTAAGTTGAGCTCTATAAATGTGCAGGCGGTAG TAAACGAACCGACCGCAGCTGGATTGAGTGCTTTCATAACTACCCCGAAA GCTTCTGTGAATTATTTGTTAGTCTACGATTTCGGAGGAGGCACTTTTGA TAGTTCCTTACTCGTGGTTGGGCCTGCGTACGTGGGAGTACTGGATTCGA TGGGAGATAACTATCTGGGAGGCAGGGACGTAGATAACAGATTGCTTAGT TTTTGGTGCGANNNNN 52 D2 (568 bp) NNNNNCGCATTCTGCTGNTTGGAAGACTTGAGGTTATCGTGATATAAAAA GGTATTTCGGACTCAACAAGTTCAACAAAGATGTGTATCTCGATAAATTG AAACCCACAATCGAGGTAGTGGTTGACGACTGGGGTTGTTCTATAGGACC AGTAGACGGTGCGAGAGGGAAAGCCAAATCAGTTCTCACTTTAGCCTCTG ATTTTATAACGGGATTGGTACAACTAGCGATCAAGATGACGAATCAACAA GTATCTGTGTCTGTTTGTTCAGTACCAGCAGCTTACAATTCTTATCAAAG GGGTTTTATTTTTGAAAGTTGTAAGTTGAGCTCTATAAATGTGCAGGCGG TAGTAAACGAACCGACCGCAGCTGGATTGAGTGCTTTCATAACTACCCCG AAAGCTTCTGTGAATTATTTGTTAGTCTACGATTTCGGAGGAGGCACTTT TGATAGTTCCTTACTCGTGGTTGGGCCTGCGTACGTGGGAGTACTGGATT CGATGGGAGATAACTATCTGGGAGGCAGGGACGTAGATAACAGATTGCTG AATTTTGTGTCCGAANNT Chú thích: D1: mẫu từ cây bệnh D2: mẫu từ chồi dứa thương phẩm N: các nucleotide không xác định được Thường ở đầu và cuối đoạn DNA được giải trình tự, các tín hiệu huỳnh quang mà máy thu được thường bị nhiễu nên đoạn này máy thường đọc trình tự không chính xác hoặc không xác định được trình tự tạo ra các N. Thống kê từ 2 trình tự trên cho thấy D1 có 10 N (chiếm 1,77 % tỷ lệ nucleotide), D2 có 7 N (chiếm 1,23 % tỷ lệ nucleotide). Tỷ lệ N thu được ở trên là rất thấp nên kết quả giải trình tự 2 mẫu D1, D2 là hoàn toàn chấp nhận được. Bước tiếp theo, 2 đoạn trình tự vừa giải được đem so sánh với các trình tự chuẩn đã được công bố trên GenBank để có thể khẳng định đó chính là trình tự HSP 70 của PMWaV-1. Ở đây phần mềm Clustal X 1.83 được sử dụng để xác định độ tương đồng của 2 trình tự được giải với trình tự HSP 70 tiêu chuẩn tải về từ NCBI. Như đã nói ở trên, các tín hiệu thu được ở 2 đầu của các trình tự D1, D2 rất xấu, không rõ ràng nên chúng tôi lấy 1 đoạn trình tự đáng tin cậy nhất của 2 mẫu (dài 532 bp) để tiến hành so sánh. 53 Bảng 4.5: Kết quả so sánh trình tự của sản phẩm RT-PCR Mẫu Trình tự D1 AAAAGACTTAGAGGTTTATCGTGATATAAAAAGGTATTTCGGACTCAACAAGTTCAACAA D2 AAAAGACTTAGAGGTTTATCGTGATATAAAAAGGTATTTCGGACTCAACAAGTTCAACAA AF414119 AAAAGACTTAGAGGTTTATCGTGATATAAAAAGGTATTTCGGACTCAACAAGTTCAACAA ************************************************************ D1 AGATGTGTATCTCGATAAATTGAAACCCACAATCGAGGTAGTGGTTGACGACTGGGGTTG D2 AGATGTGTATCTCGATAAATTGAAACCCACAATCGAGGTAGTGGTTGACGACTGGGGTTG AF414119 AGATGTGTATCTCGATAAATTGAAACCCACAATCGAGGTAGTGATTGACGACTGGGGTTG ******************************************* **************** D1 TTCTATAGGACCAGTAGACGGTGCGAGAGGGAAAGCCAAATCAGTTCTCACTTTAGCCTC D2 TTCTATAGGACCAGTAGACGGTGCGAGAGGGAAAGCCAAATCAGTTCTCACTTTAGCCTC AF414119 TCCTATAGGACCAGTAGACGGTGCGCGCGGGAAAGCCAAATCAGTTCTCACTTTAGCCTC * *********************** * ******************************** D1 TGATTTTATAACGGGATTGGTACAACTAGCGATCAAGATGACGAATCAACAAGTATCTGT D2 TGATTTTATAACGGGATTGGTACAACTAGCGATCAAGATGACGAATCAACAAGTATCTGT AF414119 TGATTTTATAACGGGATTGGTACAACTAGCGATCAAGATGACGAATCAACAAGTATCTGT ************************************************************ D1 GTCTGTTTGTTCAGTACCAGCAGCTTACAATTCTTATCAAAGGGGTTTTATTTTTGAAAG D2 GTCTGTTTGTTCAGTACCAGCAGCTTACAATTCTTATCAAAGGGGTTTTATTTTTGAAAG AF414119 GTCTGTTTGTTCAGTACCAGCAGCTTACAATTCTTATCAAAGGGGTTTTATTTTTGAAAG ************************************************************ D1 TTGTAAGTTGAGCTCTATAAATGTGCAGGCGGTAGTAAACGAACCGACCGCAGCTGGATT D2 TTGTAAGTTGAGCTCTATAAATGTGCAGGCGGTAGTAAACGAACCGACCGCAGCTGGATT AF414119 TTGTAAGTTGAGCTCTATAGATGTGCAGGCGGTAGTAAACGAACCGACCGCAGCTGGATT ******************* **************************************** D1 GAGTGCTTTCATAACTACCCCGAAAGCTTCTGTGAATTATTTGTTAGTCTACGATTTCGG D2 GAGTGCTTTCATAACTACCCCGAAAGCTTCTGTGAATTATTTGTTAGTCTACGATTTCGG AF414119 GAGTGCTTTCATAACTACCCCGAAAGCTTCTGTGAATTATTTGTTAGTCTACGATTTCGG ************************************************************ 54 D1 AGGAGGCACTTTTGATAGTTCCTTACTCGTGGTTGGGCCTGCGTACGTGGGAGTACTGGA D2 AGGAGGCACTTTTGATAGTTCCTTACTCGTGGTTGGGCCTGCGTACGTGGGAGTACTGGA AF414119 AGGAGGCACTTTTGATAGTTCCTTACTCGTGGTTGGGGGTGCGTACGTGGGAGTACTGGA ************************************* ********************* D1 TTCGATGGGAGATAACTATCTGGGAGGCAGGGACGTAGATAACAGATTGCTT D2 TTCGATGGGAGATAACTATCTGGGAGGCAGGGACGTAGATAACAGATTGCTT AF414119 TTCGATGGGAGATAACTATCTGGGAGGCAGGGACGTAGATAACAGATTGCTT **************************************************** Chú thích: AF 414119: trình tự HSP 70 tiêu chuẩn từ GenBank *: thể hiện sự tương đồng giữa các trình tự Kết quả so sánh trên cho thấy 2 trình tự D1, D2 hoàn toàn giống nhau (100%) và có sự tương đồng cao (98,68 %) giữa 2 mẫu sản phẩm D1, D2 với trình tự tiêu chuẩn. Vì vậy, có thể kết luận rằng phản ứng RT-PCR được thiết lập đã nhân bản được đúng vùng gene HSP 70 của PMWaV-1. Trình tự D1, D2 cũng tiếp tục được tiến hành so sánh mở rộng với toàn bộ các genome của các loài khác bằng công cụ BLAST ( Chương trình này cho phép tìm kiếm trên toàn bộ cơ sở dữ liệu của tất cả các ngân hàng gene trên thế giới như GenBank, EMBL, DDBL… để tìm ra tất cả những đoạn gene tương đồng với 2 trình tự này nếu có. Phân tích này cho biết có loài nào khác cũng chứa đoạn gene tương tự như đoạn gene thu được từ phản ứng RT-PCR hay không. Hay nói các khác, phân tích cho biết đoạn gene khuếch đại được có đặc hiệu cho PMWaV-1 hay không. Kết quả của BLAST được trình bày theo độ tương đồng giảm dần. Ở đây, chúng tôi xin trình bày kết quả với 5 trình tự có độ tương đồng cao nhất đối với đoạn gene đang xét (trên tổng số 15 trình tự thu được – Phụ lục 3). 55 Bảng 4.6: Kết quả phân tích BLAST của 2 trình tự D1, D2 STT Tên trình tự Số Nu tương đồng 1 gi|18253957|gb|AF414119.1|AF414119 Pineapple mealybug wilt associated virus-1, complete cds 510/517 2 gi|8977608|emb|AL137017.9| Human DNA sequence from clone RP11-120J1 on chromosome 9 Contains the 3' end of a novel gene and a CpG island, complete sequence 28/517 3 gi|34495171|gb|AC140307.3| Mus musculus BAC clone RP23- 389D15 from chromosome 19, complete sequence 20/517 4 gi|62659432|ref|XM_579802.1| PREDICTED: Rattus norvegicus LOC498243 (LOC498243), mRNA 20/517 5 gi|15487179|emb|AL589706.13| Human DNA sequence from clone RP11-522P6 on chromosome X, complete sequence 20/517 Kết quả trên cho thấy chỉ có duy nhất một loài mang gene tương đồng với 2 trình tự D1, D2 của chúng tôi (với độ tương đồng 98,64%), đó là PMWaV-1. Vị trí tương đồng nằm trên vùng gene mã hóa HSP 70 của PMWaV-1. Như vậy chúng tôi có thể kết luận rằng trình tự mà chúng tôi nhân bản được chính là trình tự HSP 70 và hoàn toàn đặc hiệu với PMWaV-1. 4.5 Kết quả giám định chồi giống dứa Áp dụng quy trình RT-PCR đã xây dựng được, chúng tôi tiến hành giám định PMWaV-1 trên 90 mẫu chồi giống dứa Cayenne thương phẩm thuộc 3 giống Thái Lan, Trung Quốc, Lâm Đồng, mỗi giống gồm 30 chồi được thực hiện phản ứng RT-PCR và đọc kết quả bằng điện di. Sau đây là kết quả của một số mẫu giám định tiêu biểu. 56 Hình 4.6: Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR của 10 mẫu chồi dứa Thái Lan Chú thích: L: Ladder (-): Mẫu đối chứng âm Giếng 2, 3, 4, 5, 8, 9: mẫu dương tính với PMWaV-1. Giếng 1, 6, 7, 10: mẫu âm tính với PMWaV-1. Các kết quả giám định trên 90 mẫu chồi dứa Cayenne ở cả 3 giống được thống kê lại như sau: Bảng 4.7 Tổng kết giám định PMWaV-1 trên chồi dứa Giống Tỷ lệ nhiễm PMWaV-1 Thái Lan 16 / 30 (53,3%) Trung Quốc 14 / 30 (46,7%) Lâm Đồng 14 /30 (46,7%) Tổng số 44 / 90 (48,9%) Kết quả thống kê trên cho thấy có sự hiện diện rất cao của PMWaV-1 trong chồi giống dứa thương phẩm, 48,9 % các mẫu thử nghiệm phát hiện được PMWaV-1. Tỷ lệ nhiễm PMWaV-1 cao và khá đồng đều đối với các giống dứa cũng như trên các địa điểm lấy mẫu cho thấy tình hình nhiễm PMWaV-1 đang diễn ra hết sức nghiêm trọng trên diện rộng ở cả 2 nông trường được khảo sát. L 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 (-) 589 bp500 bp 57 Đối với nước ta, Thái Lan và Trung Quốc là hai nguồn cung cấp giống chủ yếu cho chiến lược phát triển cây dứa Cayenne những năm gần đây. Tỷ lệ nhiễm PMWaV-1 cao trên cả hai nguồn giống này cho thấy một nguy cơ lớn của bệnh héo đỏ đầu lá đang tiềm ẩn trên các vùng dứa vừa được phát triển. Nguy cơ này đang tạo ra một áp lực rất lớn cho người trồng dứa và đòi hỏi cấp bách một nguồn giống Cayenne sạch bệnh để bảo đảm cho sự phát triển bền vững của ngành dứa Việt Nam. 58 Phần4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1 Kết luận Với những kết quả ghi nhận được sau khi thực hiện đề tài, chúng tôi đi đến những kết luận sau: ¾ Đã ly trích được RNA tổng số từ mẫu dứa. ¾ Quy trình RT-PCR tối ưu cho phát hiện PMWaV-1: 1 chu kỳ 10 chu kỳ 35 chu kỳ 1 chu kỳ 45oC/45’ 94oC/2’ 92oC/30’’ 58oC/1’ 68oC/1’30’’ 92oC/30’’ 54oC/1’ 68oC/1’30’’ 68oC/8’ ¾ Sản phẩm RT-PCR được giải trình tự nằm đúng vùng gene HSP 70 cần nhân bản và hoàn toàn đặc hiệu cho PMWaV-1. Điều này khẳng định độ tin cậy của quy trình RT-PCR vừa được xây dựng. ¾ Tỷ lệ nhiễm PMWaV-1 trên cả 3 giống dứa Cayenne được giám định đều rất cao, giống Thái Lan: 53,3%, giống Trung Quốc: 46,7% và giống Lâm Đồng: 46,7%. Kết quả này cho thấy một nguy cơ lớn của bệnh héo đỏ đầu lá đang đe dọa người trồng dứa và đòi hỏi cấp thiết một phương pháp phòng trừ bệnh hiệu quả. 4.2 Đề nghị Với những kết luận đã được rút ra trên, để tiếp tục phát triển hiệu quả của đề tài, chúng tôi đưa ra một số đề nghị sau: ¾ Tiếp tục mở rộng khảo sát trên nhiều vùng dứa khác để đánh giá chính xác tình hình bệnh héo đỏ đầu lá và nhiễm PMWaV-1 trong nước. ¾ Kết hợp với quy trình phát hiện PMWaV-2 và xử lý nhiệt – nuôi cấy mô cây dứa để có thể xây dựng mô hình cung cấp nguồn giống dứa sạch virus cho nông dân. Nếu xây dựng thành công mô hình này, sẽ mang lại hiệu quả kinh tế - xã hội rất lớn cho người trồng dứa nói riêng và cho ngành dứa Việt Nam nói chung. 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 1. Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999. Di truyền phân tử - Những nguyên tắc cơ bản trong chọn giống cây trồng. Nhà xuất bản Nông Nghiệp, trang 195 – 209. 2. Đường Hồng Dật, 2003. Cây dứa và kỹ thuật trồng. Nhà xuất bản Lao Động - Xã Hội. 68 trang. 3. Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998. Sinh học phân tử. Nhà xuất bản Giáo Dục. 300 trang. 4. Võ Thị Mỹ Hân, 2004. Điều tra tình hình bệnh hại trên cây dứa (Ananas comosus) ở huyện Tân Phước - Tiền Giang. Luận văn tốt nghiệp kỹ sư Nông Nghiệp. Đại học Nông Lâm – Tp. Hồ Chí Minh. 5. Võ Thị Thúy Huệ, 2003. Điều tra tình hình bệnh hại trên cây dứa (Ananas comosus) ở huyện Bến Lức – Long An và huyện Bình Chánh – Tp. Hồ Chí Minh. Luận văn tốt nghiệp kỹ sư trồng trọt. Đại học Nông Lâm – Tp. Hồ Chí Minh. 6. Nguyễn Văn Kế, 2002. Cây ăn quả nhiệt đới (tập 1 và 2). Nhà xuất bản Nông Nghiệp. 7. Phạm Văn Khánh, 2003. Điều tra bệnh trên dứa ở Đức Trọng – Lâm Đồng và nông trường Thọ Vực – Xuân Lộc – Đồng Nai. Luận văn tốt nghiệp kỹ sư trồng trọt. Đại học Nông Lâm – Tp. Hồ Chí Minh. 8. Phan Cự Nhân, 2001. Di truyền học động vật. Nhà xuất bản Khoa Học và Kỹ Thuật Hà Nội, trang 157 – 164. 9. Phan Gia Tân, 1984. Cây dứa và kỹ thuật trồng dứa ở miền Nam. Nhà xuất bản Tp. Hồ Chí Minh. 98 trang 10. Trần Thế Tục và Vũ Mạnh Hải, 2001. Kỹ thuật trồng dứa. Nhà xuất bản Nông Nghiệp. 158 trang. 11. Bùi Trang Việt, 2002. Tài liệu giảng dạy sinh học phân tử (chương trình cao học). Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. (Chưa xuất bản). 141 trang. 12. Tài liệu thống kê ngành Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn, 1996. Nhà xuất bản Nông Nghiệp. 60 TÀI LIỆU NƯỚC NGOÀI 13. Borroto E.G., Cintra M., González J., Borroto C., and Oramas P., 1998. First Report of a Closterovirus-Like Particle Associated with Pineapple Plants (Ananas comosus cv. Smooth Cayenne) Affected with Pineapple Mealybug Wilt in Cuba. Plant disease 82: p 263. 14. Hu J.S., Sether D., and Ullman D.E.,1996. Detection of pineapple closterovirus in pineapple plants and mealybug using monoclonal antibodies. Plant pathology. 42: 829 – 836. 15. Hu J.S., Sether D.M., Liu X.P., and Wang M., 1997. Use of a Tissue blotting immunoassay to examine the distribution of pineapple closterovirus in Hawaii. Plant disease 81 (10): 1150 – 1154. 16. Hu J.S., Sether D.M., and Ullman D.E., 1998. Transmission of pineapple mealybug wilt – associated virus by two species of mealybug (Dysmicoccus spp.). Phytopathology 88: 1224 – 1230. 17. German T.L., Ullman D.E., and Gunasinghe U.B., 1992. Mealybug wilt of pineapple. Adv. Dis. Vector Res. 9: 241 – 259. 18. Gunasinghe U.B., German T.L., 1989. Purification and partial charaterization of a virus from pineapple. Phytopathology 79:1337-1341. 19. Mc. Pherson M.J. and Moller S.G., 2000. PCR. BIOS scientific publisher. USA. p. 67 – 83. 20. O’Connell J., 2002. Method in molecular biology. Vol 193. RT-PCR protocols. Humana press. USA. p. 20 – 25. 21. Peremyslov V.V., Hajiwara Y., and Dolja V.V., 1999. HSP 70 homolog functions in cell-to-cell movement of a plant virus. PNAS 96: 14771 - 14776. 22. Rorhbach K.G., Beardsley J.W., German T.L., Reimer N.J., ans Sanford W.G, 1988. Mealybug wilt, mealybug, and ants on pineapple. Plant disease 72: 558 – 565. 23. Sether D.M., Karasev A.V., Okumura C., Arakawa C., Zee F., Kislan M.M., Busto J.L., and Hu J.S., 2001. Differentiation, distribution, and elimination of two different pineapple mealybug wilt – associated viruses found in pineapple. Plant disease 85: 856 – 864. 61 24. Sether D.M., Hu J.S., 2002. Closterovirus infection and mealybug exposure are necessary for the development of mealybug wilt of pineapple disease. Phytopathology 92: 928 – 935. 25. Ullman D.E., German T.L., Gunashinge U.B., and Ebesu R.H., 1989. Serology of a closteroviruslike particle associated with mealybug wilt of pineapple. Phytopathology 79: 1341 - 1345. 26. Wakman W., Teakle D., Thomas J.E., and Dietzgen R.G., 1995. Presence of closterolike – virus and a bacilliform virus in pineapple plants in Queensland. Aust. J. Agric. Sci. 46: 947 – 958. CÁC TRANG WEB t-star/mealybug.htm 62 PHỤ LỤC 1 Các cấu trúc thứ cấp của cặp primer 225, 226 kiểm tra bằng phần mềm Oligo Analyzer 1. Các cấu trúc kẹp tóc (hairpin) Primer Delta G (kcal/mole) Base pair Cấu trúc hairpin 225 -0,14 2 ACAGGAAGG || :A CACTCACAAC 226 -0,21 2 CGCACAAA || ::C CTAACGAACTT 2. Các cấu trúc hetero dimer Delta G (kcal/mole) Base pair Cấu trúc hetero dimer -5.12 -1,94 -1,6 -1,6 -1,57 -1,57 -1,57 4 2 2 2 2 2 2 5' ACAGGAAGGACAACACTCAC : |||| 3' CTAACGAACTTCAAACACGC 5' ACAGGAAGGACAACACTCAC || : 3' CTAACGAACTTCAAACACGC 5' ACAGGAAGGACAACACTCAC || : : 3' CTAACGAACTTCAAACACGC 5' ACAGGAAGGACAACACTCAC : || 3' CTAACGAACTTCAAACACGC 5' ACAGGAAGGACAACACTCAC : || : 3' CTAACGAACTTCAAACACGC 5' ACAGGAAGGACAACACTCAC || : : : 3' CTAACGAACTTCAAACACGC 5' ACAGGAAGGACAACACTCAC || : : 3' CTAACGAACTTCAAACACGC 63 3. Các cấu trúc homo dimer Primer Delta G (kcal/mole) Base pair Cấu trúc homo dimer 225 -1.6 -1.6 -1,57 -1,57 2 2 2 2 5' ACAGGAAGGACAACACTCAC || : : :: 3' CACTCACAACAGGAAGGACA 5' ACAGGAAGGACAACACTCAC : || :: : 3' CACTCACAACAGGAAGGACA 5' ACAGGAAGGACAACACTCAC || : : :: 3' CACTCACAACAGGAAGGACA 5' ACAGGAAGGACAACACTCAC || :: 3' CACTCACAACAGGAAGGACA 226 -3.54 -3.54 -3.14 -3.14 -3,14 -1,94 2 2 2 2 2 2 5' CGCACAAACTTCAAGCAATC || 3' CTAACGAACTTCAAACACGC 5' CGCACAAACTTCAAGCAATC ||| ::: 3' CTAACGAACTTCAAACACGC 5' CGCACAAACTTCAAGCAATC || 3' CTAACGAACTTCAAACACGC 5' CGCACAAACTTCAAGCAATC || :: :: :: 3' CTAACGAACTTCAAACACGC 5' CGCACAAACTTCAAGCAATC || 3' CTAACGAACTTCAAACACGC 5' CGCACAAACTTCAAGCAATC || :: 3' CTAACGAACTTCAAACACGC 64 -1,94 -1,47 2 2 5' CGCACAAACTTCAAGCAATC || :: 3' CTAACGAACTTCAAACACGC 5' CGCACAAACTTCAAGCAATC || 3' CTAACGAACTTCAAACACGC PHỤ LỤC 2 Kết quả BLAST của cặp primer 225, 226 Score E Sequences producing significant alignments: (Bits) Value gi|18253957|gb|AF414119.1|AF414119 Pineapple mealybug wilt-as... 40.1 0.48 gi|22227|emb|X63205.1|ZMCAB48 Zea mays cab48 gene for chlorop... 36.2 7.5 gi|62630081|gb|AC122311.6| Mus musculus BAC clone RP23-298B23... 36.2 7.5 > gi|18253957|gb|AF414119.1|AF414119 Pineapple mealybug wilt-associated virus- 1 methyltransferase/helicase protein gene, partial sequence; RNA-dependent RNA polymerase (RdRp), small hydrophobic protein, heat shock protein 70 (hsp70), p46, and putative coat protein genes, complete cds. Length=10038 Score = 40.1 bits (20), Expect = 0.48 Identities = 20/20 (100%), Gaps = 0/20 (0%) Strand=Plus/Plus Primer 225 ACAGGAAGGACAACACTCAC 20 |||||||||||||||||||| Sbjct 5958 ACAGGAAGGACAACACTCAC 5977 Score = 40.1 bits (20), Expect = 0.48 Identities = 20/20 (100%), Gaps = 0/20 (0%) Strand=Plus/Minus Primer 226 CGCACAAACTTCAAGCAATC 59 |||||||||||||||||||| Sbjct 6547 CGCACAAACTTCAAGCAATC 6528 > gi|22227|emb|X63205.1|ZMCAB48 Zea mays cab48 gene for chlorophyll a/b binding protein precursor. Length=2780 Score = 36.2 bits (18), Expect = 7.5 Identities = 18/18 (100%), Gaps = 0/18 (0%) Strand=Plus/Plus Primer 225 ACAGGAAGGACAACACTC 18 |||||||||||||||||| Sbjct 781 ACAGGAAGGACAACACTC 798 65 > gi|62630081|gb|AC122311.6| Mus musculus BAC clone RP23-298B23 from chromosome 6, complete sequence. Length=209435 Score = 36.2 bits (18), Expect = 7.5 Identities = 18/18 (100%), Gaps = 0/18 (0%) Strand=Plus/Minus Primer 226 CACAAACTTCAAGCAATC 59 |||||||||||||||||| Sbjct 49897 CACAAACTTCAAGCAATC 49880 PHỤ LỤC 3 Kết quả BLAST của trình tự D1, D2. Score E Sequences producing significant alignments: (Bits) Value gi|18253957|gb|AF414119.1|AF414119 Pineapple mealybug wilt-as... 969 0.0 gi|8977608|emb|AL137017.9| Human DNA sequence from clone RP11... 44.1 0.41 gi|34495171|gb|AC140307.3| Mus musculus BAC clone RP23-389D15... 40.1 6.4 gi|62659432|ref|XM_579802.1| PREDICTED: Rattus norvegicus LOC498 40.1 6.4 gi|15487179|emb|AL589706.13| Human DNA sequence from clone RP... 40.1 6.4 gi|19068404|emb|AL391737.2|CNS06C8G chromosome I of strain GB... 40.1 6.4 gi|61656697|emb|BX088713.8| Zebrafish DNA sequence from clone... 40.1 6.4 gi|52627220|gb|AC097087.13| Rattus norvegicus BAC CH230-140P... 40.1 6.4 gi|20334517|gb|AC106726.3| Homo sapiens 3 BAC RP11-450I19 (Ro... 40.1 6.4 gi|26108544|gb|AE016762.1| Escherichia coli CFT073 section 8 of 40.1 6.4 gi|146881|gb|J01652.1|ECOMOTAB E. coli mocha promoter, motA a... 40.1 6.4 gi|48994873|gb|U00096.2| Escherichia coli K-12 MG1655 complete g 40.1 6.4 gi|47118301|dbj|BA000007.2| Escherichia coli O157:H7 DNA, comple 40.1 6.4 gi|1736542|dbj|D90831.1| E.coli genomic DNA, Kohara clone #339(4 40.1 6.4 > gi|18253957|gb|AF414119.1|AF414119 Pineapple mealybug wilt-associated virus-1 methyltransferase/helicase protein gene, partial sequence; RNA- dependent RNA polymerase (RdRp), small hydrophobic protein, heat shock protein 70 (hsp70), p46, and putative coat protein genes, omplete cds. Length=10038 Score = 969 bits (489), Expect = 0.0 Identities = 510/517 (98%), Gaps = 0/517 (0%) Strand=Plus/Plus Query 31 TTATCGTGATATAAAAAGGTATTTCGGACTCAACAAGTTCAACAAAGATGTGTATCTCGA 90 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 6019 TTATCGTGATATAAAAAGGTATTTCGGACTCAACAAGTTCAACAAAGATGTGTATCTCGA 6078 Query 91 TAAATTGAAACCCACAATCGAGGTAGTGGTTGACGACTGGGGTTGTTCTATAGGACCAGT 150 |||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||| ||||||||||||| Sbjct 6079 TAAATTGAAACCCACAATCGAGGTAGTGATTGACGACTGGGGTTGTCCTATAGGACCAGT 6138 Query 151 AGACGGTGCGAGAGGGAAAGCCAAATCAGTTCTCACTTTAGCCTCTGATTTTATAACGGG 210 |||||||||| | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 6139 AGACGGTGCGCGCGGGAAAGCCAAATCAGTTCTCACTTTAGCCTCTGATTTTATAACGGG 6198 Query 211 ATTGGTACAACTAGCGATCAAGATGACGAATCAACAAGTATCTGTGTCTGTTTGTTCAGT 270 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 6199 ATTGGTACAACTAGCGATCAAGATGACGAATCAACAAGTATCTGTGTCTGTTTGTTCAGT 6258 Query 271 ACCAGCAGCTTACAATTCTTATCAAAGGGGTTTTATTTTTGAAAGTTGTAAGTTGAGCTC 330 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 6259 ACCAGCAGCTTACAATTCTTATCAAAGGGGTTTTATTTTTGAAAGTTGTAAGTTGAGCTC 6318 66 Query 331 TATAAATGTGCAGGCGGTAGTAAACGAACCGACCGCAGCTGGATTGAGTGCTTTCATAAC 390 |||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 6319 TATAGATGTGCAGGCGGTAGTAAACGAACCGACCGCAGCTGGATTGAGTGCTTTCATAAC 6378 Query 391 TACCCCGAAAGCTTCTGTGAATTATTTGTTAGTCTACGATTTCGGAGGAGGCACTTTTGA 450 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 6379 TACCCCGAAAGCTTCTGTGAATTATTTGTTAGTCTACGATTTCGGAGGAGGCACTTTTGA 6438 Query 451 TAGTTCCTTACTCGTGGTTGGGCCTGCGTACGTGGGAGTACTGGATTCGATGGGAGATAA 510 |||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 6439 TAGTTCCTTACTCGTGGTTGGGGGTGCGTACGTGGGAGTACTGGATTCGATGGGAGATAA 6498 Query 511 CTATCTGGGAGGCAGGGACGTAGATAACAGATTGCTT 547 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 6499 CTATCTGGGAGGCAGGGACGTAGATAACAGATTGCTT 6535 > gi|8977608|emb|AL137017.9| Human DNA sequence from clone RP11-120J1 on chromosome 9 Contains the 3' end of a novel gene and a CpG island, complete sequence. Length=167585 Score = 44.1 bits (22), Expect = 0.41 Identities = 28/30 (93%), Gaps = 0/30 (0%) Strand=Plus/Plus Query 250 ATCTGTGTCTGTTTGTTCAGTACCAGCAGC 279 ||||||||||||| ||||||||||||||| Sbjct 31275 ATCTGTGTCTGTTACTTCAGTACCAGCAGC 31304 > gi|34495171|gb|AC140307.3| Mus musculus BAC clone RP23-389D15 from chromosome 19, complete sequence. Length=187731 Score = 40.1 bits (20), Expect = 6.4 Identities = 20/20 (100%), Gaps = 0/20 (0%) Strand=Plus/Plus Query 511 CTATCTGGGAGGCAGGGACG 530 |||||||||||||||||||| Sbjct 120588 CTATCTGGGAGGCAGGGACG 120607 …………… …………… ……………