Xây dựng quy trình kỹ thuật tách chiết, khảo sát tính kháng khuẩn và khả năng chống oxy hóa của một số hợp ch ất thứ cấp từ lá Xuân Hoa (Pseudranthemum palatiferum)
MỤC LỤC
NỘI DUNG TRANG
Lời cảm ơn iii
Tóm Tắt .iv
Mục lục vii
Danh sách các chữ viết tắt .xi
Danh sách các hình và biểu đồ xii
Danh sách các bảng và sơ đồ .xiii
1. MỞ ĐẦU .1
1.1. Đặt vấn đề .2
1.2. Mục đích - Yêu cầu 2
1.2.1. Mục đích 2
1.2.2. Yêu cầu 2
2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3
2.1. Giới thiệu về cây Xuân Hoa .3
2.1.1. Đặc điêm thực vật học .3
2.1.2. Đặc điểm hình thái 3
2.1.3. Phân bố 4
2.1.4. Nhân giống 4
2.2. Công dụng của cây Xuân Hoa 4
2.2.1. Theo kinh nghiệm dân gian .4
2.2.2. Tác dụng sinh học .5
2.3.1.1. Bảo vệ tế bào gan .5
2.3.1.2. Ảnh hưởng lên bệnh tiêu chảy ở heo .10
2.3. Thành phần hóa học .13
2.4. Đại cương về một số hợp chất hữu cơ tự nhiên .15
2.4.1. Alcaloid .15
2.4.2. Flavonoid .16
2.4.3. Tinh dầu 16
2.4.4. Saponin 17
2.5. Đại cương về vi khuẩn đường ruột 17
2.5.1. Định nghĩa .17
2.5.2. Hình thể .17
2.5.3. Tính chất nuôi cấy .18
2.5.4. Đặc tính sinh hóa .18
2.5.5. Sức đề kháng .19
2.5.6. Độc tố 19
2.5.7. Cấu trúc kháng nguyên 19
2.5.8. Khả năng gây bệnh 21
2.6. Một số đặc tính của vi khuẩn thử nghiệm 21
2.6.1. Staphyl ococcus aureus .21
2.6.2. Pseudomonas aeruginosa 21
2.6.3. Escherichia coli .21
2.6.4. Salmonella .22
2.7. Hoạt tính chống oxy hóa DPPH .23
3. VẬT LIỆU VÀ PHưƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 24
3.1. Vật liệu .24
3.2. Địa điểm và thời gian thực hiện .24
3.2.1. Địa điểm 25
3.2.2. Thời gian .25
3.3. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất .25
3.3.1. Thiết bị và dụng cụ 25
3.3.2. Hóa chất 27
3.4. Phương pháp tiến hành .28
3.4.1. Xử lý nguyên liệu 28
3.4.2. Điều chế các loại cao .28
3.4.2.1. Điều chế cao ete dầu hỏa 28
3.4.2.2. Điều chế cao chloroform 29
3.4.2.3. Điều chế cao n-butanol .29
3.4.2.4. Điều chế cao nước 29
3.4.3. Khảo sát tính kháng khuẩn của các loại cao .31
3.4.4. Chiết xuất một số hợp chất cao chloroform 32
3.4.4.1. Sắc ký cột 32
3.4.4.2. Sắc ký lớp mỏng 35
3.4.4.3. Sắc ký điều chế 37
3.4.4.4. Kỹ thuật kết tinh phân đoạn .38
3.4.5. Khảo sát tính kháng khuẩn của các phân đoạn được tách chiết từ cao chloroform
.38
3.4.6. Thử nghiệm hoạt tính chống oxy hóa DPPH 40
3.4.6.1. Các tính chất của gốc tự do DPPH .40
3.4.6.2. Quy trình thử hoạt tính chống oxy hóa DPPH .40
4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 44
4.1. Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của các loại cao chiết 44
4.2. Kết quả tách chiết của cao chloroform và các phân đoạn của chúng 45
4.2.1. Kết quả tách chiết của cao chloroform 45
4.2.2. Khảo sát phân đoạn XH9, XH10, XH11, XH13. 47
4.2.2.1. Phân đoạn XH11 47
4.2.2.2. Phân đoạn XH9 và XH10 .47
4.2.2.3. Phân đoạn XH13 48
4.3. Cấu trúc hóa học của các chất tinh khiết 49
4.3.1. Chất XH-K13 49
4.3.2. Chất XH-K11 50
4.4. Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của các phân đoạn được chiết từ cao
chloroform. 52
4.5. Kết quả của thử nghiệm chống oxy hóa .55
4.5.1. Kết quả đo OD đối với vitamin C .55
4.5.2. Kết quả đo OD đối với dịch chiết lá Xuân Hoa 56
5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .58
5.1. Kết luận 58
5.2. Đề nghị .59
TÀI LIỆU THAM KHẢO .60
PHỤ LỤC 62
DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ
Hình 1.1: Cây Xuân Hoa . 3
Hình 3.1: Các pha trong bình lắc quả lê 29
Hình 3.2: Chất phân tích đã được đưa vào cột sắc ký .33
Hình 3.3: Bình triển khai sắc ký lớp mỏng .36
Hình 3.4: Sắc ký điều chế .37
Hình 3.5: Các nồng độ pha loãng của vitamin C và mẫu Xuân Hoa sau khi cho DPPH
vào .43
Hình 4.1: Thử nghiệm các phân đoạn kháng E.coli v à Salmonella .44
Hình 4.2: Chất XH-K11 trên bản mỏng 47
Hình 4.3: Chất XH-K13 trên bản mỏng 48
Hình 4.4: Kết quả thử nghiệm các phân đoạn kháng E. Coli .52
Hình4.5 : Các nồng độ kháng E. coli của phân đoạn XH9 .53
Hình 4.6: Các nồng độ kháng Staphylococcus của phân đoạn XH9 54
Hình 4.7: Các nồng độ kháng Pseudomonas aeruginosa của XH9 54
Đồ thị 4.1: Vitamin C 55
Đồ thị 4.2: Mẫu Xuân Hoa 56
DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ SƠ ĐỒ
Bảng 2.1: Kết quả quan sát vi thể ở chuột 7
Bảng 2.2: Kết quả đo hàm lượng MDA trong gan chuột ở liều gây là 1ml CCl /kg thể
4
trọng 9
Bảng 2.3: Hàm lượng MDA ở liều gây là 0,5ml CCl /kg thể trọng chuột . 9
4
Bảng 2.4: Kết quả hàm lượng men gan .10
Bảng 2.5: Ảnh hưởng của lá tươi hay bột lá Xuân Hoa lên sự biểu hiện tăng trưởng,
bệnh tiêu chảy và sinh lý máu của heo 11
Bảng 2.6: So sánh hiệu quả chữa trị tiêu chảy 12
Bảng 3.1 : Thể tích và nồng độ các ống nghiệm .39
Bảng 3.2: Độ pha loãng và nồng độ mẫu Xuân Hoa .42
Bảng 3.3: Độ pha loãng và nồng độ mẫu vitamin C .43
Bảng 4.1: Kết quả thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của 4 loại cao 44
Bảng 4.2: Kết quả sắc ký cột trên Cao Chloroform 45
Bảng 4.3: Nồng độ ức chế vi khuẩn tối thiểu của các phân đoạn .53
Bảng 4.4: Nồng độ và kết quả đo OD của vitamin C 55
Bảng 4.5: Nồng độ và kết quả đo OD của mẫu Xuân Hoa .56
Bảng 4.6: Ảnh hưởng của mẫu Xuân Hoa đối với độ hấp thụ của DPPH 57
Sơ đồ 3.1: Quy trình xử lý nguyên liệu 28
Sơ đồ 3.2: Quy trình điều chế các loại cao .30
Sơ đồ 3.3: Quy trình ly trích mẫu cho thử nghiệm DPPH 41
Xây dựng quy trình kỹ thuật tách chiết, khảo sát tính kháng khuẩn và khả năng chống oxy hóa của một số hợp ch ất thứ cấp từ lá Xuân Hoa (Pseudranthemum palatiferum)
120 trang |
Chia sẻ: maiphuongtl | Lượt xem: 3300 | Lượt tải: 1
Bạn đang xem trước 20 trang tài liệu Khóa luận Xây dựng quy trình kỹ thuật tách chiết, khảo sát tính kháng khuẩn và khả năng chống oxy hóa của một số hợp ch ất thứ cấp từ lá Xuân Hoa (Pseudranthemum palatiferum), để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
ờng đƣợc xác
định nhất là glucose và lactose.
- Sinh hơi hay không sinh hơi khi lên men đƣờng.
- Có hay không có một số enzym. Hai enzym thƣờng đƣợc xác định nhất là urease và
tryptophanase.
- Khả năng sinh ra sunfua hydro (H2S) khi dị hóa protein, acid amin hoặc các dẫn
chất có lƣu huỳnh.
- Phát triển đƣợc hay không phát triển đƣợc trên một số môi trƣờng tổng hợp. Ví dụ:
khả năng sử dụng citrat là nguồn cung cấp cacbon duy nhất có trong môi trƣờng
Simmons.
2.5.5. Sức đề kháng
Vì không có khả năng hình thành nha bào nên các thành viên của họ vi khuẩn đƣờng ruột
không có sức đề kháng cao với những điều kiện hóa lý đặc biệt của môi trƣờng. Chúng dễ
dàng bị tiêu diệt ở nhiệt độ sôi 100oC và bởi các hoá chất sát khuẩn thông thƣờng. Tuy
nhiên nhiều loài vi khuẩn đƣờng ruột có khả năng sống nhiều ngày đến nhiều tuần, thậm
chí một vài tháng ngoài môi trƣờng. Đây là điều kiện thuận lợi để các vi khuẩn gây bệnh
lan truyền.
2.5.6. Độc tố
Hầu hết các vi khuẩn đƣờng ruột đều có nội độc tố. Bản chất hóa học của nội độc tố là
lipoposaccharid (LPS) của vách tế bào. Nội độc tố chỉ đƣợc giải phóng khi tế bào bị li giải.
Nội độc tố có khối lƣợng phân tử từ 100000 đến 500000 dalton. Nội độc tố tuy tính độc
không cao bằng ngoại độc tố nhƣng cũng rất độc (chỉ cần 0,05 mg nội độc tố đủ giết chết
chuột nhắt sau 24 giờ). Nội độc tố có thể gây ra tình trạng sốc, nếu không đƣợc điều trị
tích cực kịp thời, để chuyển thành sốc không hồi phục dẫn đến tử vong. Nội độc tố không
bị mất tính độc ở 100oC trong 30 phút. Nội độc tố là chất có khả năng gây sốc.
19
Một số thành viên của họ vi khuẩn đƣờng ruột có khả năng sinh ngoại độc tố nhƣ S.Shiga,
E.Coli loại Enterotoxigenic E.Coli (ECET). Ngoại độc tố của S.Shiga làm cho bệnh lỵ
nặng hơn rất nhiều, ngoại độc tố LT (Labile Toxin) của ETEC là yếu tố quyết định độc lực
của vi khuẩn này.
2.5.7. Cấu trúc kháng nguyên
Họ vi khuẩn đƣờng ruột có 3 nhóm kháng nguyên cơ bản: kháng nguyên O, kháng nguyên
H và kháng nguyên K.
- Kháng nguyên O: Là kháng nguyên thân của vi khuẩn. đây là thành phần kháng
nguyên của vách tế bào. Là một phức hợp protein, poliozid và lipid, trong đó
protein làm cho phức hợp có tính kháng nguyên, poliozid quyết định tính đặc hiệu
kháng nguyên còn lipid quyết địng tính độc. Không bị phá huỷ ở 100oC trong hai
giờ hoặc trong cồn 50% nhƣng bị mất tính kháng nguyên khi xử lý bằng formol
0,5%. Ở những vi khuẩn không có vỏ hoặc màng bọc (không có kháng nguyên K)
thì kháng nguyên O nằm ở lớp ngoài cùng. Khi kháng nguyên O gặp kháng thể
tƣơng ứng sẽ xảy ra phản ứng ngƣng kết, gọi là “hiện tƣợng ngƣng kết O” với các
hạt ngƣng kết nhỏ, lắc khó tan. Ở những vi khuẩn có kháng nguyên K, hiện tƣợng
ngƣng kết O có thể bị che lấp bới kháng nguyên này. Kháng nguyên O có tính đặc
hiệu cao, nó thƣờng đƣợc dùng để phân loại vi khuẩn. Dựa vào kháng nguyên O
ngƣời ta có thể chia một vài loài vi khuẩn thành nhiều typ huyết thanh.
- Kháng nguyên H: Là kháng nguyên lông của tế bào vi khuẩn, chỉ có ở những vi
khuẩn có lông. Có bản chất là protein, để phá huỷ ở 100oC hoặc trong cồn 50%
nhƣng không bị phân huỷ trong formol 0,5%. Kháng nguyên H khi gặp kháng thể
tƣơng ứng sẽ xảy ra “hiện tƣợng ngƣng kết H” với các hạt to hơn trong hiện tƣợng
ngƣng kết O và rất dễ tan khi lắc. Những vi khuẩn có khả năng di động khi tiếp xúc
với kháng thể H tƣơng ứng sẽ trở thành không di động. Kháng nguyên O và kháng
nguyên H có thể đƣợc sản xuất riêng để phát hiện riêng biệt các kháng thể tƣơng
ứng. Để có kháng nguyên O, ngƣời ta cho vi khuẩn này vào cồn 50%, kháng
nguyên H sẽ bị phá huỷ, kháng nguyên O vẫn tồn tại. Để có kháng nguyên H ngƣời
20
ta cho vi khuẩn vào formol 0,5% thì kháng nguyên O bị phá huỷ, kháng nguyên H
vẫn còn nguyên vẹn.
- Kháng nguyên K: Là kháng nguyên vỏ hoặc bề mặt, kháng nguyên K nằm bên
ngoài kháng nguyên thân. Nó có thể dƣới dạng một lớp vỏ dày, quan sát đƣợc bằng
kính hiển vi quang học thông thƣờng (nhƣ ở Klebsiella) hoặc dƣới dạng một lớp rất
mỏng chỉ có thể quan sát bằng kính hiển vi điện tử (nhƣ ở S.Typhy). Kháng nguyên
K nếu che phủ hoàn toàn kháng nguyên O sẽ ngăn cách không cho kháng thể O gắn
với kháng nguyên O làm cho phản ứng ngƣng kết không xảy ra. Trong trƣờng hợp
này cần phải phá huỷ kháng nguyên K hoặc vi khuẩn phải đƣợc nuôi cấy trong điều
kiện không sinh ra đƣợc kháng nguyên này.
2.5.8. Khả năng gây bệnh
Nói về khả năng gây bệnh của họ vi khuẩn đƣờng ruột, trƣớc hết phải đề cập đến các
nhiễm khuẩn đƣờng tiêu hóa. Họ vi khuẩn đƣờng ruột đứng đầu trong các căn nguyên vi
khuẩn gây tiêu chảy. Cơ chế gây bệnh, vị trí gây tổn thƣơng ở bộ máy tiêu hóa rất khác
nhau tuỳ theo từng giống, từng loài.
Ngoài đƣờng tiêu hóa, các vi khuẩn đƣờng ruột còn có khả năng gây bệnh ở nhiều cơ quan
khác nhƣ tiết niệu, thần kinh, hô hấp…Các thành viên của họ này đứng đầu trong các vi
khuẩn gây viêm đƣờng tiết niệu, bỏ xa các vi khuẩn khác. Chúng cũng đứng đầu trong các
vi khuẩn gây nhiễm khuẩn huyết. Có thể nói khái quát ở bất kỳ bệnh phẩm nào cũng có thể
gặp thành viên của họ vi khuẩn đƣờng ruột.
2.6. Một số đặc tính của vi khuẩn thử nghiệm
2.6.1. Staphyllococcus aureus
- Là vi khuẩn gram dƣơng, không giáp mô, không tạo bào tử.
- Sức đề kháng: nhạy cảm với Penicillin, Authromycin và Ampicilin.
- Khả năng gây bệnh:
o Sƣng mủ trên da, niêm mạc.
o Gây ung nhọt, áp xe.
21
o Viêm vú ở bò cừu.
o Gây nhiễm trùng máu dẫn đến viêm phổi, viêm thận cấp, viêm tuyến sữa
và viêm tủy xƣơng.
2.6.2. Pseudomonas aeruginosa
- Là vi khuẩn gram âm, có tiêm mao, vi khuẩn sinh sắc tố màu xanh.
- Khả năng gây bệnh:
o Gây bệnh mủ xanh ở động vật và ngƣời.
o Viêm bàng quang, viêm tai có mủ ở ngƣời.
2.6.3. Escherichia coli (E.coli)
- Là vi khuẩn gram âm, không bào tử
- Sức đề kháng: Nhạy cảm với chloraphenicol, Streptomycin, Sunfamid,
Trimethroprim.
- Khả năng gây bệnh: E.coli có sẵn trong ruột, khi cơ thể bị suy yếu, sức đề kháng
giảm thì E.coli mới gây bệnh:
o Gây tiêu chảy
o Bệnh phù thủng ở heo con
o Viêm ruột
2.6.4. Salmonella
- Salmonella là trực khuẩn dài 0,6 – 0,8 µm, có nhiều lông xung quanh thân, rất di
động, không có vỏ, không sinh nha bào, nhuộm Gram bắt Gram âm.
- Vi khuẩn hiếu khí hay kị khí tùy tiện, mọc dễ dàng trên các môi trƣờng nuôi cấy
thông thƣờng, nhiệt độ thích hợp 37oC nhƣng có thể phát triển đƣợc từ 6 – 42oC,
pH thích hợp là 7,6; phát triển đƣợc ở pH 6,9.
o Trên môi trƣờng lỏng: Sau 5 – 6 giờ nuôi cấy, vi khuẩn đã làm đục môi
trƣờng, sau 18 giờ môi trƣờng đục đều.
o Trên môi trƣờng thạch thƣờng: Khuẩn lạc tròn lồi, bóng, thƣờng không
màu hoặc màu trắng xám.
22
o Trên môi trƣờng phân lập SS: Khuẩn lạc có màu hồng; Trên môi trƣờng
Istrati khuẩn lạc có màu xanh.
- Độc tố:
o Nội độc tố: Nội độc tố của Salmonella rất mạnh, tiêm cho chuột nhắt
hoặc chuột lang liều thích hợp thì sau vài ngày chuột chết, mổ chuột thấy
ruột non xung huyết, mảng Payer bị phù nễ, đôi khi hoại tử. Nội độc tố
có vai trò quyết định trong tính chất gây bệnh của Salmonella.
o Ngoại độc tố: Ngoại độc tố chỉ hình thành trong điều kiện invivo và nuôi
cấy kỵ khí. Ngoại độc tố có thể điều chỉnh thành giải giải độc tố.
- Khả năng gây bệnh:
o Sốt thƣơng hàn – phó thƣơng hàn.
o Ngộ độc thức ăn.
2.7. Hoạt tính chống oxy hóa DPPH [3]
Hiện nay ngày càng có nhiều mối quan tâm về các chất chống oxy hóa thứ cấp từ thực
vật nhƣ là nguồn bổ sung cho các hệ thống bảo vệ chống lại sự oxy hóa có hại tồn tại
sẵn có trong cơ thể. Trong đời sống các sinh vật kỵ khí và hiếu khí đều thiết lập một sự
cân bằng tinh tế giữa ích lợi và nguy cơ trong việc sử dụng oxy để đạt năng lƣợng.
Trong quá trình hô hấp chúng đã tạo ra các hợp chất trung gian là các gốc tự do: anion
superoxide (O2), hydroxyl (OH), chất oxy hóa nhƣ H2O2 có hoạt tính phản ứng rất lớn,
mà từ các chất này cũng nhƣ các sản phẩm phản ứng của chúng là nguyên nhân phá
hủy các phân tử sinh học nhƣ DNA, lipid, protein…
Mặc dù bản thân của sinh vật đã tự phát triển các hệ thống enzyme nhằm điều hòa các
loại phân tử oxy hoạt tính cao này nhƣ superoxide dismutase, catalae, glutathione
peroxidase là các enzyme điều hòa nhằm duy trì sự an toàn trong giới hạn cho phép của
anion superoxide, H2O2 và các hydroperoxide hữu cơ tƣơng ứng, chúng đƣợc xem là
các enzyme khử độc chính trong cơ thể. Đôi khi hệ thống bảo vệ trên bị quá tải, không
khí bị ô nhiễm, khói thuốc lá, bức xạ tử ngoại…các loại oxy hoạt tính cao này vƣợt quá
23
giới hạn cho phép sẽ là nguồn gây bệnh, thúc đẩy nhanh quá trình lão hóa cho sinh vật.
Các chất chống oxy hóa từ thực vật đã góp phần hỗ trợ cho hệ thống bảo vệ của cơ thể,
ngăn chặn oxy hóa không mong muốn nhƣ các carotenoid, flavonoid, vitamin C, E…và
các hợp chất trao đổi chất thứ cấp từ thực vật đã và đang đƣợc quan tâm nghiên cứu.
24
Chƣơng 3
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH
3.1. Vật liệu
Vật liệu:
Lá cây Xuân Hoa (Pseuderanthemum palatiferum).
Nguồn gốc lấy mẫu:
Lá Xuân Hoa đƣợc lấy từ 2 nguồn:
- Tại doanh nghiệp tƣ nhân trà 7 Nga (Tây Ninh).
- Vƣờn thực nghiệm trƣờng đại học Cần Thơ.
3.2. Địa điểm và thời gian thực hiện
Địa điểm
Tại phòng thí nghiệm hóa lý, Trung Tâm Phân Tích và Thí Nghiệm Hóa Sinh, Trƣờng
đại học Nông Lâm.
Thời gian
Đề tài đƣợc thực hiện qua 2 phần:
Phần 1: Tiến hành tách chiết một số hợp chất thứ cấp từ lá Xuân Hoa và khảo sát tính
kháng khuẩn.
- Giai đoạn 1: Tiến hành chiết Soxhlet lá Xuân Hoa để thu các loại cao. Thời gian
tiến hành từ ngày 1/4/2007 đến 27/4/2007.
- Giai đoạn 2: Tiến hành khảo sát khả năng kháng khuẩn của các loại cao để xác
định cao có hoạt tính mạnh nhất. Từ ngày 29/4/2007 đến ngày 6/5/2007.
- Giai đoạn 3: Thực hiện sắc ký cột và sắc ký lớp mỏng trên cao chloroform để
tách các phân đoạn. Thời gian thực hiện từ ngày 8/5/2007 đến ngày 23/6/2007.
25
- Giai đoạn 4: Tiến hành khảo sát khả năng kháng khuẩn của các phân đoạn để
xác định phân đoạn kháng khuẩn. Thời gian thực hiện từ ngày 25/6/2007 đến
ngày 2/7/2007.
- Giai đoạn 5: Thực hiện sắc ký cột và sắc ký lớp mỏng trên phân đoạn kháng
khuẩn để tách chất sạch. Thời gian thực hiện từ ngày 5/7/2007 đến ngày
19/7/2007.
- Giai đoạn 6: Gửi mẫu chạy phổ cộng hƣởng từ hạt nhân để xác định cấu trúc
của các hợp chất đƣợc tách chiết ở phòng phân tích cấu trúc, Viện Hoá Học,
Trung tâm khoa học Tự Nhiên, Công Nghệ Quốc Gia Hà Nội.
Phần 2: Khảo sát khả năng chống oxy hóa của dịch chiết lá Xuân Hoa. Thời gian thực
hiện từ 23/7/2007 đến ngày 30/7/2007.
3.3. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất
3.3.1. Thiết bị và dụng cụ
Dùng cho các thử nghiệm sinh hóa:
Tủ sấy.
Máy xay mẫu.
Bộ soxhlet.
Máy cô quay.
Bình lắc.
Bình lắc quả lê.
Phễu.
Giấy lọc.
Ống chạy sắc cột.
Bình tam giác 50ml.
Bình triển khai.
Máy lắc.
Bồn đánh siêu âm.
26
Micropipette loại 100 – 1000 µl.
Đầu tipe loại 1000µl.
Cân phân tích.
Máy làm đá.
Máy đo nhiệt độ nóng chảy.
Máy đo OD.
Ống nghiệm.
Giấy bạc.
Parafirm.
Pipette Pasteur.
Đèn cồn.
Cây kẹp.
Dùng cho thử nghiệm vi sinh:
Ống nghiệm.
Đĩa petri.
Đèn cồn.
Tủ ấm.
Tủ sấy.
Tủ hấp autoclave.
Bông không thấm.
Micropipette loại 100-1000 µl.
Micropipette loại
Đầu tipe loại
Que cấy vòng.
Tâm bông vô trùng.
3.3.2. Hóa chất
Dùng cho thử nghiệm sinh hóa:
27
Methanol (Trung Quốc, Merck).
Ethanol (Trung Quốc).
Chloroform (Trung Quốc).
Ete dầu hỏa.
Acetone.
H2S04 98%.
Hạt silicagel kích thƣớc 0,063 – 0,2 mm.
Bản mỏng silicagel (TLC) loại 25DC – alufolien 20 x 20 cm, kieselgel 60 F254,
Merck.
Vitamin C.
DPPH (1, 1- diphenyl- 2-picrylhydrazyl).
Dùng cho thử nghiệm vi sinh:
Cồn.
Nƣớc cất.
Muối.
Môi trƣờng BHI.
Môi trƣờng TSA.
Môi trƣờng thạch máu.
DMSO (dimethylsulfoxid).
3.4. Phƣơng pháp tiến hành
3.4.1. Xử lý nguyên liệu
Sơ đồ 3.1: Quy trình xử lý nguyên liệu.
28
3.4.2. Điều chế các loại cao
Tiến hành chiết soxhlet với 670 g bột mẫu khô trong 120 giờ với EtOH 70%, thu lấy
dịch lọc, cô quay để loại bỏ dung môi.
3.4.2.1. Điều chế cao ete dầu hỏa
- Cho dịch lọc trên vào bình lắc quả lê, thêm 200 ml nƣớc cất vào, sau đó cho ete
dầu hỏa vào.
- Dịch lắc chia làm 2 pha: Pha ete dầu hỏa và pha nƣớc, hứng lấy dịch trích ete
dầu hỏa, sau đó cô cạn bằng máy cô quay với áp suất thấp thu đƣợc cao ete dầu
hỏa: 23 g
- Tổng thể tích ete dầu hỏa dùng: 1,5 lít.
Pha ete dầu
hỏa
Pha nƣớc
Rửa sạch lá tƣơi Xuân Hoa
Để khô tự nhiên
Sấy khô đến trọng lƣợng
không đổi ở nhiệt độ 40ºC
Xay mẫu thành bột mịn
29
3.4.2.2. Điều chế cao chloroform
- Lấy pha nƣớc ở trên cô quay để loại bỏ dung môi.
- Cho chloroform vào lắc, dịch lắc chia làm 2 pha, thu lấy dịch chloroform, sau
đó cô cạn bằng máy cô quay để loại dung môi chloroform thu đƣợc cao
chloroform: 42 g
- Tổng thể tích chloroform sử dụng: 2,5 lít.
3.4.2.3. Điều chế cao n-butanol
- Phần còn lại sau khi đã trích với chloroform đƣợc tiếp tục tận trích với n –
butanol.
- Dịch trích thu đƣợc đem cô quay thu đƣợc cao n-butanol:16 g
- Tổng thể tích n-butanol sử dụng: 1,3 lít.
3.4.2.4. Điều chế cao nƣớc
Phần còn lại đem cô quay thu đƣợc cao thô nƣớc.
Sơ đồ 3.2: Quy trình điều chế các loại cao.
Dịch trích Ete
dầu hỏa
Bột khô 670 g
chiết soxhlet với EtOH 70%
Dịch trích EtOH Bã
Pha nƣớc
cô quay, chiết với ete dầu hỏa
30
3.4.3. Khảo sát tính kháng khuẩn của các loại cao.
- Chủng vi khuẩn: E.coli, Salmonella đƣợc lấy từ bệnh xá thú y, Trƣờng Đại Học
Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh.
- Pha loãng liên tiếp để xác nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của các loại cao có
khả năng ức chế sự tăng trƣởng của vi khuẩn.
- Môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật để tiến hành thử nghiệm vi sinh vật là môi
trƣờng BHI và TSA.
31
- Pha môi trƣờng BHI: cho 15 g bột BHI và 300 ml nƣớc cất vào bình tam giác,
đun nhẹ bằng microwave trong 2 phút, sau đó lọc bằng giấy lọc để loại bỏ cặn.
Hấp khử trùng autoclave ở 121ºC/15 phút.
- Cách pha môi trƣờng TSA:
Cao thịt 2,5 g
Pepton 5 g
NaCl 2,5 g
Nƣớc Cất 500 ml
Cho tất cả vào bình tam giác, đun nhẹ bằng microwave trong 2 phút, sau đó cho
2 g agar vào. Hấp khử trùng autoclave ở 121ºC/15 phút, lấy ra đổ vào đĩa petri.
- Dung môi hòa tan 4 loại cao: DMSO.
- Pha ống chuẩn độ đục Mc Farland nhƣ sau: Thêm 0,5 ml BaCl2 0,048M vào
99,5 ml H2SO4 0,18 M đồng thời khuấy liên tục để tạo huyền dịch.
- Phƣơng pháp:
o Cân 0,2 g cao cho vào 10 ml DMSO để hòa tan, nồng độ cao lúc này là 0,02
g/ml.
o Pha loãng tiếp tục cao này xuống nồng độ 0,002 g/ml (2000 µg/ml) bằng môi
trƣờng BHI.
o Tiếp tục pha loãng cao xuống còn một nửa nồng độ: 1000 µg/ml, 500 µg/ml,
250 µg/ml, 125 µg/ml.
o Xác định nồng độ vi khuẩn dựa vào ống chuẩn độ đục Mc Farland 0,5: Điều
chỉnh độ đục của huyền dịch vi khuẩn sao cho ngang với độ đục của ống Mc
Farland 0,5 bằng cách cho thêm nƣớc muối sinh lý 0,9%, lúc này nồng độ vi
khuẩn sẽ là 108 cfu/ml.
o Tiếp tục pha loãng nồng độ vi khuẩn xuống còn 107, 106 bằng môi trƣờng BHI.
o Bố trí thử nghiệm vi sinh vật trên môi trƣờng thạch TSA để xác định khả năng
kháng khuẩn của 4 loại cao này. Cao ở các nồng độ 1000 µg/ml, 500 µg/ml, 250
32
µg/ml, 125 µg/ml đƣợc hòa tan vào môi trƣờng TSA. Nguyên tắc xác định dựa
vào sự ức chế của các nồng độ cao đã pha loãng trên. Cấy vi khuẩn E.coli và
Salmonella ở nồng độ 106 lên trên cùng một đĩa môi trƣờng TSA, mỗi vi khuẩn
chiếm nửa đĩa.
- Đọc kết quả dựa trên việc quan sát khuẩn lạc có mọc hay không trên bề mặt môi
trƣờng thạch sau 24 giờ, từ đó sẽ xác định đƣợc cao nào có khả năng ức chế vi
khuẩn mạnh nhất và tiếp tục đƣợc sử dụng để cô lập một số hợp chất kháng
khuẩn bằng phƣơng pháp sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng và sắc ký điều chế.
3.4.4. Chiết xuất một số hợp chất từ cao chloroform
3.4.4.1. Sắc ký cột [1, 7]
Nguyên tắc:
- Sắc ký cột loại hấp phụ đƣợc tiến hành trên một cột thủy tinh thẳng đứng với
chất hấp phụ đóng vai trò tƣớng tĩnh, dung môi rửa cột đóng vai trò tƣớng động
chảy qua chất hấp phụ dƣới ảnh hƣởng của trọng lực.
- Đối với mỗi chất riêng biệt trong hỗn hợp cần tách tùy theo khả năng hấp phụ và
khả năng hòa tan của nó đối với dung môi rửa cột để lấy ra đƣợc lần lƣợt trƣớc
hoặc sau.
- Chất hấp phụ đƣợc sử dụng phổ biến là Silicagel 60 cỡ hạt 0,063 – 0,2 mm.
- Dung môi: Để triển khai sắc ký cột, ngƣời ta có thể dùng tuần tự từng dung môi
riêng biệt có độ phân cực tăng dần hoặc dùng một hỗn hợp dung môi thích hợp
để rửa cột.
- Việc lựa chọn kích thƣớc cột rất quan trọng, thông thƣờng cột có đƣờng kính
nhỏ và chiều dài càng dài thì sự tách càng tốt.
Tiến hành:
Bƣớc 1: Chuẩn bị cột.
- Rửa cột thật sạch, tráng lại với nƣớc cất, sau đó sấy khô.
33
- Cho bông gòn vào đáy cột (phải thật khéo nếu chặt quá chất nghiên cứu sẽ bị
mắc kẹt lại không chảy xuống đƣợc, nếu không chặt thì khi đổ dung môi vào nút
bong sẽ bị trôi).
- Kẹp cột thẳng đứng trên giá sắt.
Bƣớc 2: Nhồi cột.
- Cân 200 g Silicagel cho vào becher, cho ete dầu hỏa vào sao cho lƣợng thể tích
đủ làm cho silicagel trƣơng phình tối đa, tốt nhất là để qua đêm.
- Cho silicagel từ từ vào cột sao cho nút bông dƣới đáy cột không bị trôi lên, kiểm
tra tốc độ chảy dung môi ra khỏi cột (thông thƣờng khoảng 30-50 giọt/phút là
đạt yêu cầu).
- Hứng ete dầu hỏa và cho lại vào cột vài lần đến khi cột thật sự ổn định, bề mặt
silicagel phải nằm ngang.
Bƣớc 3: Đƣa chất phân tích vào cột.
Hình 3.2: Cột sắc ký
34
- Cao chloroform phải đƣợc sấy thật khô ở nhiệt độ 40ºC để đuổi hết dung môi,
khối lƣợng cao: 42 g.
- Cho 8 g silicagel vào trộn đều lƣợng cao khô này, nghiền, sau đó tiếp tục sấy
khô hoàn toàn, mẫu lúc này phải ở dạng bột mịn.
- Sau đó cho ete dầu hỏa vào cao này sao cho hỗn hợp trở thành dạng sệt, không
loãng quá cũng không đặc quá để khi đổ mẫu vào tạo thành một lớp trên bề mặt
silicagel.
Bƣớc 4: Triển khai cột.
- Để triển khai cột ta có thể dung tuần tự các dung môi có độ phân cực tăng dần.
Sự thay đổi từ dung môi này sang dung môi khác phải chuyển từ từ bằng cách
pha tỷ lệ tăng dần hoặc giảm dần.
- Sử dụng dung môi: ete dầu hỏa, chloroform , methanol và hỗn hợp của nó đƣợc
pha theo tỷ lệ tăng dần: 1%, 2%, 5%, 10%, 25%, 50%, 100%.
Bƣớc 5: Hứng và kiểm tra các phân đoạn.
- Sử dụng các bình tam giác 50 ml để hứng từng phân đoạn, đánh dấu số thứ tự
của bình.
- Kiểm tra các phân đoạn thu đƣợc bằng sắc ký lớp mỏng với thuốc thử đặc trƣng.
3.4.4.2. Sắc ký lớp mỏng [1, 7]
Nguyên tắc:
- Sắc ký lớp mỏng (SKLM) là kỹ thuật phân bố rắn - lỏng; trong đó pha động là
chất lỏng đƣợc cho đi ngang qua một lớp chất hấp trơ (ví dụ nhƣ: silicagel hoặc
oxid nhôm) chất hấp thụ này đƣợc tráng thành một lớp mỏng, đều, phủ lên một
nền phẳng nhƣ tấm kiếng hoặc tấm nhôm.
- Dung môi triển khai trong SKLM thƣờng là một hỗn hợp có từ 2, 3 hoặc 4 loại
dung môi khác nhau với tỷ lệ thích hợp. Ứng với mỗi loại hợp chất phân tích
khác nhau sẽ có một số hệ dung môi thích hợp.
35
- Sử dụng SKLM để gộp các bình hứng chất chảy ra thành chung một phân đoạn
nếu chúng cho kết quả Rf giống nhau.
Phƣơng pháp:
Chuẩn bị:
- Ống mao quản: Sử dụng pipette Pasteur, dùng kẹp kéo dài đầu pipette do sức
nóng của ngọn lửa đèn cồn.
- Ống nghiệm nhỏ: Chứa acetone để rửa mao quản sau mỗi lần sử dụng.
- Bình khai triển: Cho dung môi ete dầu hỏa, chloroform, methanol theo tỉ lệ thích
hợp vào bình, sau đó cho một tấm giấy thấm vào bình để dung môi đƣợc hoàn
toàn bão hòa (khoảng 30 phút). Một hậu quả dễ thấy là nếu bình không đƣợc
bão hòa thì khi dung môi là một hệ hỗn hợp, mức tiền tuyến dung môi sẽ có
hình lõm (hình lòng chão) do dung môi đi hai bên cạnh nhanh hơn đi ở giữa
bảng.
- Thuốc thử H2SO4 10%/EtOH: Pha 21ml H2SO4 95% với 179 ml ethanol.
- Bản mỏng: Dùng bút chì kẻ một đƣờng thẳng cách đáy 1,5 cm và một đƣờng
thẳng cách đầu trên 0,5 cm.
Tiến hành:
- Sử dụng mao quản chấm chất cần kiểm tra vào bản mỏng, mỗi vết chấm phải
nhỏ, gọn 2 – 3 mm và không làm rách bản mỏng. Vết chấm ở vị trí cách cạnh
đáy 1 – 1,5 cm, vết này cách vết kia 0,5 cm và cách bờ cạnh của bảng 0,5 cm.
- Nhúng bản mỏng vào bình khai triển thật nhẹ nhàng, đặt bản mỏng hơi nghiêng,
đậy nắp kín. Lƣu ý trong thời gian này không di chuyển bình. Mao quản trong
bình sẽ dẫn chất đi lên.Theo dõi vạch dung môi chạy đến đầu trên bản mỏng
cách khoảng 0,5 cm thì lấy ra, dùng mấy sấy tóc làm khô dung môi. Sau đó
nhúng bản mỏng vào bình thuốc thử H2SO4 10%/EtOH, hiện vết ở 100ºC.
Bản mỏng
36
Phát hiện vết:
- Qua màu sắc tự nhiên.
- Phát quang dƣới tia UV.
- Phun thuốc thử cho màu đặc trƣng.
Tính trị số Rf:
Rf = ( Khoảng đƣờng di chuyển của hợp chất) / (Khoảng đƣờng di chuyển của dung
môi).
Một hệ dung môi giải ly phù hợp là hệ sau khi giải ly sẽ cho các vết chính có Rf
khoảng từ 0,3 – 0,7.
3.4.4.3. Sắc ký điều chế [7]
- Nguyên tắc cơ bản cũng giống nhƣ SKLM, chỉ khác là sử dụng bảng có kích cỡ
lớn hơn (10 x 20 cm).
- Dùng bút chì vạch sẵn mức xuất phát cách đáy 1,5 cm. Sử dụng vi quản để kéo
dung dịch mẫu thành một dãy, có bề ngang 2-4 mm, dài suốt chiều ngang của
bảng nhƣng cần chừa 1cm khoảng cách 2 đầu bảng để tránh bị hiệu ứng bờ. Sấy
37
cho dung môi bay đi, đặt bảng vào bình khai triển sắc ký, có chứa 50 ml hỗn
hợp dung môi giải ly. Sau khi giải ly, hiện hình vết trên bảng sẽ có nhiều dãy ;
dùng lƣỡi lam hay dao có đầu nhọn cạo những dãy lớp hấp thu có chứa chất,
chứa riêng biệt trong các becher có đánh số.
- Thu lấy hợp chất : Chất hấp thu Silicagel có chứa chất đƣợc chứa trong một
becher, rót dung môi chloroform vào để hợp chất tan vào dung môi. Hỗn hợp
đƣợc để yên 15 phút để hợp chất hòa tan hết vào dung môi. Lọc qua giấy lọc
hứng vào một becher khác. Thực hiện sự trích 3-5 lần nữa để bảo đảm trích hết
mẫu chất ra khỏi chất hấp thu.
3.4.4.4. Kỹ thuật kết tinh phân đoạn
- Giả sử chất A có lẫn một ít chất B và C. Hòa tan mẫu vào dung môi nóng, lọc
dung dịch còn nóng qua giấy lọc, để yên cho dung môi nguội từ từ, hợp chất A
sẽ kết tinh rắn và lẫn trong tinh thể của nó một ít B và C. Lƣợng B và C vẫn còn
lẫn trong nƣớc cái.
- Lọc lấy riêng tinh thể A. Lập lại kết tinh nhƣ thế thêm vài lần nữa bằng dung
môi tinh khiết sẽ cho chất A tinh khiết.
3.4.5. Khảo sát tính kháng khuẩn của các phân đoạn đƣợc chiết từ cao chloroform
Hình 3.4: Sắc ký điều chế
38
- Các phân đoạn thu đƣợc ở sắc ký cột đƣợc tiến hành thử nghiệm kháng khuẩn
với vi khuẩn E.coli, staphylococcus aureus, pseudomonas aeruginosa.
- Môi trƣờng đƣợc sử dụng ở đây là TSA, BHI.
- Dung môi hòa tan mẫu là DMSO.
- Dùng phƣơng pháp vòng kháng khuẩn để kiểm tra phân đoạn nào có khả năng
kháng khuẩn.
Tiến hành :
- Môi trƣờng TSA dùng để đổ đĩa petri với độ dày 2/3 đĩa, để 72 giờ cho đĩa khô
hoàn toàn.
- Hòa tan 0,4 g mẫu mỗi phân đoạn bằng 5 ml dung môi DMSO (lúc này nồng độ
mẫu là 0,02 g/ml) đun nhẹ trên ngọn đèn cồn.
- Cắt 1/3 đầu ống tipe, sấy khử trùng.
- Dùng đầu tipe đã đƣợc khử trùng đục lỗ đĩa, mỗi đĩa đục 5 lỗ với khoảng cách
đều nhau.
- Cấy vi khuẩn vào môi trƣờng BHI, chuẩn độ đục của huyền dịch vi khuẩn tƣơng
đƣơng với độ đục của ống Mc Farland 0,5 bằng cách thêm nƣớc muối sinh lý
0,9%. Lúc này nồng độ vi khuẩn sẽ tƣơng đƣơng 108. Pha loãng nồng độ vi
khuẩn xuống còn 107, 106 bằng môi trƣờng BHI.
- Dùng tâm bông vô trùng chấm nhẹ vào huyền dịch vi khuẩn, sau đó ray đều tâm
bông này lên đĩa petri có sẵn các lỗ sao cho vi khuẩn có thể đƣợc trãi đều mặt
đĩa.
- Dùng micropipette hút 100 µl mỗi phân đoạn mẫu lần lƣợt cho vào mỗi lỗ.
Quan sát : Sau 24 giờ, nếu lỗ nào có vòng kháng khuẩn xung quanh chứng tỏ
phân đoạn đó có kháng khuẩn. Ta sử dụng phân đoạn này tiếp tục thử nghiệm
xác định nồng độ tối thiểu ức chế vi khuẩn (MIC).
Thử nghiệm xác định nồng độ tối thiểu ức chế vi khuẩn:
39
Pha loãng phân đoạn kháng khuẩn ở nồng độ 0,02 g/ml xuống 0,002 g/ml (2000µg/ml).
Chuẩn bị 3 nhóm ống nghiệm tƣơng ứng với 3 loại vi khuẩn, mỗi nhóm 6 ống.
Bảng 3.1 : Thể tích và nồng độ các ống nghiệm.
Tên các
ống nghiệm
Nồng độ
mẫu lúc
đầu
(µg/ml)
Thể tích
mẫu cho
vào (µl)
Thể tích
BHI cho
vào (µl)
Nồng độ
mẫu
(µg/ml)
Thể tích vi
khuẩn cho
vào 1ml
mẫu (ml)
Nồng độ
mẫu cuối
cùng
(µg/ml)
E1, P1, S1 2000 100 900 200 1 100
E2, P2, S2 2000 200 800 400 1 200
E3, P3, S3 2000 300 700 600 1 300
E4, P4, S4 2000 400 600 800 1 400
E5, P5, S5 2000 500 500 1000 1 500
E6, P6, S6 2000 600 400 1200 1 600
- Chuẩn bị 3 ống nghiệm để làm đối chứng, mỗi ống chứa 1 ml môi trƣờng BHI.
Cho E.coli, Staphyloccoccus aureus, Pseudomonas aeruginosa lần lƣợt vào
từng ống.
- Ủ tất cả các ống nghiệm trong tủ ấm 37ºC/24 giờ.
- Quan sát sự thay đổi độ đục của môi trƣờng, sự tạo thành cặn ở đáy và sự tạo
váng ở bề mặt ống nghiệm.
3.4.6. Thử nghiệm hoạt tính chống oxy hóa DPPH
3.4.6.1. Các tính chất của gốc tự do DPPH
- Là gốc tự do bền do có hiệu ứng liên hợp trong phân tử.
- Độ hấp thụ cực đại tại 517 nm do gốc tự do trên Nitơ và cho màu tím trong
Methanol [3].
- Có công thức cấu tạo nhƣ sau :
NO2
NO2
N˙ N O2N
40
- Cơ chế phản ứng của gốc tự do DPPH và chất chống oxy hóa :
DPPH ˉ + AH DPPH-H + A˙
- Kết quả đƣợc đánh giá thông qua giá trị IC50 (inhibitory concentration) là
nồng độ chất oxy hóa cần để ức chế (trung hòa) 50% gốc tự do DPPH trong
khoảng thời gian xác định.
- Mẫu Vitamin C đƣợc dùng để so sánh thông giá trị IC50.
3.4.6.2. Quy trình thử hoạt tính chống oxy hóa DPPH [3]
Ly trích mẫu:
Sơ đồ 3.3: Quy trình ly trích mẫu cho thử nghiệm DPPH.
Cân 10 g lá tƣơi Xuân Hoa
Nghiền
Cho vào 25 ml Methanol
Lắc ở nhiệt độ phòng 30 phút
Lọc
Lập lại quy trình 5 lần
41
Pha mẫu:
- Cân 2 mg Cao + 5 ml Methanol, lắc cho mẫu tan hoàn toàn. Nồng độ
mẫu Xuân Hoa lúc này là 400 µg/ml.
- Pha loãng mẫu: Pha loãng nồng độ mẫu xuống 2, 4, 8, 16 lần.
Bảng 3.2: Độ pha loãng và nồng độ mẫu Xuân Hoa
Độ pha loãng (lần) Nồng độ mẫu Xuân Hoa (µg/ml)
2 100
4 50
8 25
16 12,5
Pha thuốc thử :
- Cân 2,7 mg DPPH cho vào bình định mức 25 ml.
42
- Thêm 25 ml MeOH, lắc mạnh cho tan hết, sau đó thêm MeOH vào cho
đủ 25 ml.
- Để ổn định trong tối 30 phút, 4ºC.
Pha dung dịch chuẩn:
- Cân 2 mg vitamin C vào bình định mức 5ml.
- Thêm 3 ml MeOH vào, lắc mạnh cho tan hết, sau đó thêm MeOH vào
cho đủ 5 ml. Nồng độ vitamin C lúc này là 400 µg/ml.
- Pha loãng dung dịch chuẩn xuống 2, 4, 8, 16 lần bằng MeOH.
Bảng 3.3: Độ pha loãng và nồng độ vitamin C.
Độ pha loãng (lần) Nồng độ vitamin C (µg/ml)
2 100
4 50
8 25
16 12,5
Đo dung dịch chuẩn
- Cho 1ml DPPH vào 1ml dung dịch chuẩn ở từng độ pha loãng.
- Để ổn định trong bóng tối 30 phút.
- Đo độ hấp thụ quang (OD) ở bƣớc sóng 517nm
Đo mẫu
- Cho 1ml DPPH vào 1ml mẫu Xuân Hoa ở từng độ pha loãng.
- Để tất cả vào trong bóng tối, 30 phút.
- Đo độ hấp thụ quang (OD) ở bƣớc sóng 517 nm.
43
Hình 3.5: Các nồng độ pha loãng của vitamin C (bên trái) và mẫu Xuân
Hoa (bên phải) sau khi cho DPPH vào.
44
Chƣơng 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của các loại cao chiết
Bảng 4.1: Kết quả thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của 4 loại cao.
Các loại cao
Nồng độ thử
nghiệm cao nhất
(µg/ml)
Nồng độ ức chế (µg/ml)
E.coli Salmonella
Ete dầu hỏa 1000 Chƣa ức chế Chƣa ức chế
n-butanol 1000 Chƣa ức chế Chƣa ức chế
Nƣớc 1000 Chƣa ức chế Chƣa ức chế
Chloroform 500 Ức chế Ức chế
cao chloroform cao ete dầu hỏa
cao n-Butanol cao nƣớc
Hình 4.1: Thử nghiệm các phân đoạn kháng E.coli và
Salmonella
45
Cao chloroform có hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất. Ở nồng độ 500 µg/ml, cao
chloroform không cho phép khuẩn lạc vi khuẩn mọc trên bề mặt môi trƣờng thạch
TSA, trong khi đó ở nồng độ 1000 µg/ml vẫn tìm thấy khuẩn lạc mọc ở các cao còn lại.
4.2. Kết quả tách chiết của cao chloroform và các phân đoạn của chúng
4.2.1. Kết quả tách chiết của cao chloroform
Thực hiện sắc ký cột trên cao chloroform với hệ dung môi: Ete dầu hỏa, chloroform,
methanol và hỗn hợp của chúng. Kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng với thuốc thử
H2SO410%/EtOH cho hiện vết ở 100
o
C (Bảng 4.2).
Bảng 4.2: Kết quả sắc ký cột trên cao chloroform.
Số thứ
tự bình
Tên
phân
đoạn
Dung
môi
giải ly
cột
Cao (g)
Sắc ký lớp mỏng Hoạt
tính
kháng
khuẩn
Ghi
chú
Hệ
dung
môi
Thuốc
thử
Rf
1-26 XH1 E 4,83
E:C
(9:1)
H2SO4
nhiều
vết
Âm
tính
27-49 XH2
E:C
(95:5)
2,47
E:C
(85:15)
nt nt
Âm
tính
50-64 XH3
E:C
(9:1)
1,74
E:C
(8:2)
nt nt
Âm
tính
65-83 XH4
E:C
(8:2)
1,61
E:C
(7:3)
nt nt
Âm
tính
84-96 XH5
E:C
(7:3)
1,34
C:E
(8:2)
nt nt
Âm
tính
97-108 XH6
E:C
(6:4)
1,98
C:E
(9:1)
nt 4vết
Âm
tính
XH7 E:C 1,35 C:E nt 3vết Âm
46
109-116
(6:4) (98:2) tính
117-126 XH8
E:C
(6:4)
1,63 C nt 3vết
Âm
tính
127-132 XH9
E:C
(5:5)
0,87 C nt 2 vết
Dƣơng
tính
khảo
sát
133-136 XH10
E:C
(5:5)
0,56
C:M
(99:1)
nt 2 vết
Dƣơng
tính
khảo
sát
137-145 XH11
E:C
(5:5)
0,78
C:M
(99:1)
nt 3vết
Dƣơng
tính
khảo
sát
146-155 XH12 C 2,56
C:M
(95:5)
nt
nhiều
vết
Dƣơng
tính
156-168 XH13 C 1,23
C:M
(95:5)
nt 4 vết
Dƣơng
tính
khảo
sát
169-172 XH14 C 0,96
C:M
(95:5)
nt 5 vết
Âm
tính
173-192 XH15
C:Me
(99:1)
1,67
C:M
(8:2)
nt
nhiều
vết
Âm
tính
193-204 XH16
C:Me
(98:2)
0,48
C:M
(7:3)
nt nt
Âm
tính
205-216 XH17
C:Me
(95:5)
0,74
C:M
(7:3)
nt nt
Âm
tính
217-223 XH18 Me Xả cột
(Chú thích: Phần hoạt tính kháng khuẩn tham khảo mục 4.4).
Sắc ký cột và sắc ký bản mỏng trên Cao chloroform thu đƣợc 18 phân đoạn. Dựa
vào tính kháng khuẩn của các phân đoạn chúng tôi chỉ chọn phân đoạn XH9, XH10,
XH11, XH13 để tiếp tục khảo sát.
47
4.2.2. Khảo sát phân đoạn XH9, XH10, XH11, XH13.
4.2.2.1. Phân đoạn XH11
Thực hiện sắc ký điều chế trên phân đoạn 11 với hệ dung môi triển khai C: Me
(98:2) thu đƣợc hợp chất màu vàng, xung quanh có lẫn một ít tạp. Kết tinh nhiều lần
hợp chất này và thực hiện việc gạn lọc sau mỗi lần kết tinh, kiểm tra bằng sắc ký lớp
mỏng với thuốc thử hiện vết là H2SO4 10%/EtOH đến khi thu đƣợc một vết tròn màu
vàng có Rf=0,36. Ký hiệu chất này là XH-K11. Nhiệt độ nóng chảy: 237ºC, trọng
lƣợng 4,8 mg.
4.2.2.2. Phân đoạn XH9 và XH10
Hai phân đoạn này lúc đầu trên bản mỏng có vết khác nhau, sau nhiều lần kết tinh
trong chloroform ta đã loại đƣợc tạp chất, chấm bản mỏng thấy Rf giống nhau nên gộp
hai phân đoạn này lại. Tiếp tục kết tinh nhiều lần trong Ethylacetat, chloroform và thực
hiện việc gạn lọc sau mỗi lần kết tinh. Kết quả cho dạng tinh thể màu vàng. Kiểm tra
lại bằng sắc ký lớp mỏng với thuốc thử hiện vết là H2SO4 10%/EtOH trong hệ dung
môi triển khai CHCl3:M (98:2) cho một vết tròn màu vàng có Rf=0,36; nhiệt độ nóng
Hình 4.2: Chất XH-K11 trên bản mỏng
48
chảy 237ºC trùng với chất XH-K11. Gộp chung lại với chất XH-K11 ở phân đoạn
XH11 cân đƣợc 12,6 mg.
4.2.2.3. Phân đoạn XH13:
Thực hiện sắc ký điều chế trên phân đoạn 13 với hệ dung môi triển khai là C:Me
(9:1) thu đƣợc một hợp chất màu tím. Kết tinh nhiều lần hợp chất này và thực hiện việc
gạn lọc sau mỗi lần kết tinh, kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng với thuốc thử hiện vết là
H2SO4 10%/EtOH đến khi thu đƣợc một chất tròn màu tím, có Rf=0,27. Ký hiệu chất
này là XH-K13. Nhiệt độ nóng chảy: 218ºC, trọng lƣợng 16,6 mg.
Các chất tinh khiết thu đƣợc tiếp tục đƣợc tiến hành chạy phổ một chiều, phổ hai
chiều NMR để xác định cấu trúc của chúng.
4.3. Cấu trúc hóa học của các chất tinh khiết.
4.3.1. Chất XH-K13
Sắc ký lớp mỏng cho hiện vết màu tím, có Rf = 0,27, nhiệt độ nóng chảy 218oC.
Hình 4.3: Chất XH-K13 trên bản mỏng
49
Phổ hồng ngoại IR (ν, cm-1) cho vạch hấp thu mạnh, rộng của nhóm OH tại 3400,20
cm
-1
; vạch 2937,99 cm-1 thể hiện sự dao động của CH2, vạch 1624,65 thuộc dao động
C=C, các vạch 1457,71 và 1372,95 thuộc dao động của CH, các vạch 1064,91 và
1024,40 đặc trƣng cho liên kết của nhóm C-O (Phụ lục 1).
Phổ khối lƣợng MS (Phụ lục 8) cho pick ion mẹ là 577 [M + H]+ cho thấy trọng
lƣợng phân tử của XH-K13 là 576.
Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 13C-NRM kết hợp kỹ thuật Dept cho ta thấy (phụ lục
3, 4):
- Trong phân tử có 35 cacbon, trong đó có 3 cacbon tứ cấp, 14 nhóm CH, 12
nhóm CH2, 6 nhóm CH3
- Các mũi ở 140,437 và 121,129 ppm là dấu hiệu của nối đôi và ở 140,437 là C=
(Cacbon tứ cấp có nối đôi), ở 121,129 là của CH=.)
- Một mũi đặc trƣng ở 100,795 ppm là mũi của acetal C1' của đƣờng gắn vào C ở
vị trí số 3; đƣợc chứng minh nhờ phổ HMBC (phụ lục 6) cho thấy sự tƣơng tác
giữa H1' và C3.
Đồng thời hằng số tƣơng tác spin-spin giữa H1' và H2' là J=8 Hz, chứng tỏ liên kết
kiểu trans-diaxial, kết hợp với các số liệu phổ 13C-NRM của phần đƣờng và phổ proton
hai chiều COSY (phụ lục 7 ) cho thấy phù hợp với D-Glucose và nối với khung
aglycon bằng liên kết beta.
Mặt khác, với kỹ thuật Dept 90 cho ta 5 mũi ở các vị trí 70,09; 73,44; 76,94; 76,75;
76,69 kết hợp phổ HSQC (phụ lục 5), HMBC cho biết đó là 5 nhóm CH-OH của gốc
đƣờng. Vậy trong phân tử có 1 đơn vị đƣờng có 6 cacbon.
Sau đó dựa vào phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1H-NRM (phụ lục 2) xác nhận có một
vạch nhọn tại độ dịch chuyển hóa học là 5,321 ppm, có cƣờng độ tích phân là 1,000
đơn vị là của H6, cùng với tín hiệu phổ 13C-NRM ở 121,129 ( CH=); cũng phù hợp trên
phổ HSQC. Mặt khác dựa vào phổ HMBC cho thấy sự tƣơng tác giữa H6 với C7, C8,
C10, C4 và sự tƣơng tác giữa H1 với C3, C5, C10 nên CH2 ở vị trí số 1 phải có độ dịch
50
chuyển là 36,80 ppm và C= ở vị trí số 5; chứng tỏ khung sterol có một nối đôi tại ví trí
5-6.
Mặt khác kết hợp dấu hiệu định tính trên bảng mỏng khi sắc ký lớp mỏng có màu tím
khi phun H2SO4 10%, sau đó hơ nóng, cho phép giả thiết khung aglycon của XH-K13
là một Sterol có 29 cacbon chứa nối đôi ở vị trí 5-6 kết hợp với đƣờngGlucose, phù
hợp với công thức của β- sitosterol-3-O- β-glucoside, công thức phân tử là: C35H60O6.
Công thức cấu tạo của C35H60O6:
4.3.2. Chất XH-K11
Sắc ký lớp mỏng cho hiện vết màu vàng, có Rf = 0,36, nhiệt độ nóng chảy 237oC.
Phổ 1H-NMR (DMSO, ppm, 500MHz) (phụ lục 9) cho:
- 2 mũi đôi của proton nhân thơm tại = 6,45 ppm và 6,83 ppm (d, J = 2 Hz),
chứng tỏ chúng ở vị trí meta.
- 2 mũi đôi của proton nhân thơm tại = 6,94 ppm (d, J=8,5) và 7,95 ppp (d,
J= 9 Hz), chứng tỏ chúng ở vị trí ortho.
Phổ 13C-NMR (DMSO, ppm, 125 MHz) (phụ lục 11) kết hợp phổ DEPT (phụ lục
10) cho thấy XH-K11 có 21 cacbon trong đó có 1 nhóm >C=O, 1 nhóm CH2 14 nhóm
– CH, 5 nhóm cacbon tứ cấp.
51
Đồng thời kết hợp phổ công hƣởng từ hạt nhân 2 chiều HSQC (phụ lục 12) và HMBC
(phụ lục 13) cho thấy XH-K11 thuộc nhóm flavon và là dẫn xuất của apigenin.
Phổ 13C-NMR cho một mũi đặc trƣng ở 99,90 ppm là mũi của acetal C1’ của đƣờng.
Dựa vào phổ HSQC (phụ lục 12) có đƣợc giá trị H1’ = 5,06 ppm. Kết hợp phổ 1H-
NMR (phụ lục 9), ta có đƣợc H1’ (1H, d, J=7,5 Hz), chứng tỏ đƣờng nối với khung
aglycon bằng liên kết . Mặt khác, phổ DEPT 90 (phụ lục 10) cho ta 5 mũi ở các vị trí
73,09; 77,16; 69,56; 76,42 và 60,60 ppm. Đồng thời kết hợp với phổ HSQC, HMBC
(phụ lục 13) và COSY (phụ lục 14) cho biết đó là 5 nhóm CH-OH của gốc đƣờng
glucose. Vậy trong phân tử có 1 đơn vị đƣờng glucose có 6 cacbon.
Từ các dữ liệu về phổ và so sánh với các tài liệu tham khảo của Phan Minh Giang
(2002) và Nguyễn Văn Hùng (2004) [16], chúng tôi nhận danh chất XH-K11 là:
apigenin 7-O-β- glucoside, có công thức phân tử là: C21H20O10.
Công thức cấu tạo của C 21H20O10 nhƣ sau:
4.4. Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của các phân đoạn đƣợc chiết từ cao
chloroform.
Tiến hành phƣơng pháp đo vòng kháng khuẩn đối với 18 phân đoạn đƣợc chiết từ
cao chloroform. Kết quả phân đoạn XH9, XH10, XH11, XH12, XH13 có vòng kháng
khuẩn xung quanh lỗ, điều này chứng tỏ rằng các phân đoạn này có khả năng ức chế sự
phát triển của vi khuẩn.
52
(1): Phân đoạn XH9.
(2): phân đoạn XH10.
(3): Phân đoạn XH11.
(4): Phân đoạn XH12.
(5): Phân đoạn XH13.
Sau đó tiếp tục thử nghiệm trên các phân đoạn kháng khuẩn này để khảo sát nồng độ
tối thiểu ức chế vi khuẩn (MIC).
Bảng 4.3: Nồng độ ức chế vi khuẩn tối thiểu của các phân đoạn.
Phân đoạn
Nồng độ ức chế tối thiểu vi khuẩn thử nghiệm (µg/ml)- MIC
E.coli S. aureus Pseudomonas
XH9 400 500 500
XH10 400 500 400
XH11 300 400 300
XH12 300 400 300
XH13 300 400 400
Hình 4.4: Kết quả thử nghiệm các phân đoạn kháng E. coli.
(1)
(2)
(3)
(4)
(5)
53
Nhận xét:
Sử dụng kết quả trên làm cơ sở cho việc lựa chọn phân đoạn nào đƣợc tiếp tục khảo
sát để tách chiết các hợp chất bằng phƣơng pháp sắc ký cột và sắc ký lớp mỏng.
Hình 4.5: Các nồng độ kháng E.coli của phân đoạn XH9.
Hình 4.6: Các nồng độ kháng Staphylococcus aureus của phân đoạn XH9.
E1 E2 E3 E4 E5 E6 Eđc
S1
S2 S3 S4 S5 S6 Sđc
54
Hình 4.7: Các nồng độ kháng Pseudomonas aeruginosa của XH9.
Chú thích:
E1, E2, E3, E4, E5, E6: E. coli từ nồng độ từ 100 – 600 µg/ml.
P1, P2, P3, P4, P5, P6: Pseudomonas aeruginosa từ 100 – 600 µg/ml.
S1, S2, S3, S4, S5, S6: Staphylococcus aureus từ 100 – 600 µg/ml.
Đc: đối chứng
4.5. Kết quả của thử nghiệm chống oxy hóa
% Ức chế DPPH = (Ao- A)/Ao x 100
Đo độ hấp thu của DPPH : A0 = 1,67458.
A: Độ hấp thu của dung dịch phản ứng.
IC50: Nồng độ ức chế 50% gốc DPPH.
Khả năng ức chế gốc tự do đƣợc đánh giá bằng phƣơng pháp gốc tự do bền DPPH.
4.5.1. Kết quả đo OD đối với vitamin C
Vitamin C đƣợc đo 3 lần và lấy giá trị trung bình.
Bảng 4.4: Nồng độ và kết quả đo OD của vitamin C
Nồng độ vitamin C (µg/ml) A (OD đo ở 517 nm)
100 1,361421
50 0,766121
P1 P2
2
P3 P4 P5 P6
Pđc
55
25 0,43277
12,5 0,28491
Kết quả đo OD và nồng độ vitamin C đƣợc thể hiện dƣới dạng biểu đồ:
Đồ thị 4.1: Khả năng ức chế DPPH ở các nồng độ khác nhau của vitamin C.
Các nồng độ vitamin C và phần trăm ức chế đƣợc biểu thị dƣới dạng đƣờng thẳng
với phƣơng trình y = -1,355x + 124,8, với hệ số tƣơng quan R=0,999.
Từ đồ thị ngoại suy giá trị IC50 của vitamin C là 57,05 (µg/ml).
Vitamin C đƣợc dùng làm chất chuẩn để so sánh với mẫu cần đối chiếu là Xuân
Hoa.
4.5.2. Kết quả đo OD đối với dịch chiết lá Xuân Hoa
Dịch chiết mẫu Xuân Hoa đƣợc đo 3 lần và lấy giá trị trung bình.
Bảng 4.5: Nồng độ và kết quả đo OD của dịch chiết lá Xuân Hoa
Nồng độ dịch chiết lá Xuân Hoa (µg/ml) A (OD đo ở 517nm)
100 1,12256
50 0,70756
25 0,48307
12,5 0,34129
56
Kết quả đo OD và nồng độ mẫu đƣợc thể hiện dƣới dạng biểu đồ:
Đồ thị 4.2: Khả năng ức chế DPPH ở các nồng độ khác của dịch chiết lá Xuân
Hoa.
Các nồng độ mẫu Xuân Hoa và phần trăm ức chế đƣợc biểu thị dƣới dạng đƣờng
thẳng y = -1,897x + 161,4, với hệ số tƣơng quan R=0.998.
Từ đồ thị ngoại suy giá trị IC50 của mẫu Xuân Hoa là 66,55 (µg/ml).
Bảng 4.6: So sánh khả năng kháng oxy hóa của vitamin C và dịch chiết lá Xuân Hoa:
Độ hấp thụ của DPPH
Độ hấp thụ của (DPPH +
vitamin C)
Độ hấp thụ của (DPPH +
mẫu Xuân Hoa)
1,67458 1,361421 1,12256
Nhận xét:
- Độ hấp thụ quang của DPPH giảm từ 1,67458 xuống 1,361421 đối với trƣờng
hợp có vitamin C và giảm xuống 1,12256 đối với trƣờng hợp có dịch chiết lá
Xuân Hoa. Điều này có nghĩa là trong lá Xuân Hoa có một số hợp chất chống
oxy hóa đã tác dụng với phân tử DPPH làm cho độ hấp thụ giảm xuống :
57
Cơ chế phản ứng của gốc tự do DPPH và chất chống oxy hóa :
DPPH ˉ + AH DPPH-H + A˙
- So sánh IC50 của mẫu Xuân Hoa (66,55 µg/ml) với IC50 của vitamin C (57,05
µg/ml): Nồng độ để ức chế 50% DPPH của mẫu Xuân Hoa là 66,55µg/ml, trong
khi nồng độ để ức chế 50% DPPH của vitamin C là 57,05 µg/ml, kết luận rằng
hàm lƣợng các phân tử chống oxy hóa của mẫu Xuân Hoa là khá cao (bằng
85,7% vitamin C).
58
Chƣơng 5
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
5.1. Kết luận
- Lá Xuân Hoa đƣợc chiết soxhlet với dung môi ethanol, sau đó lần lƣợt chiết với
ete dầu hỏa, chloroform, n-butanol lần lƣợt cho 4 loại cao: Cao ete dầu hỏa, cao
chloroform, cao n-butanol và cao nƣớc. Thử nghiệm kháng khuẩn 4 loại cao này
đối với E.coli và Salmonella, kết quả xác định đƣợc cao chloroform có hoạt tính
kháng khuẩn nhất, với nồng độ ức chế tối thiểu là 500 µg/ml.
- Chạy sắc ký cột và sắc ký lớp mỏng trên cao chloroform, kết quả thu đƣợc 18
phân đoạn.
- Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của 18 phân đoạn, kết quả xác định đƣợc
phân đoạn có hoạt tính kháng khuẩn là: XH9, XH10, XH11, XH12, XH13.
- Kết hợp kết quả chạy sắc ký cột và thử kháng khuẩn các phân đoạn, cuối cùng
chọn ra 4 phân đoạn tiếp tục khảo sát là: XH9, XH10, XH11, XH13. Tiếp tục
kết tinh xác định đƣợc 2 chất: XH-K11 với nhiệt độ nóng chảy 237ºC và XH-
K13 với nhiệt độ nóng chảy 218ºC.
- Chạy phổ cộng hƣởng từ hạt nhân một chiều và hai chiều xác định đƣợc chất
XH-K11 là apigenin 7-O-β-glucoside, có công thức phân tử: C21H20O10 và chất
XH-K13 là β-sitosterol-3-O-β-glucoside, có công thức phân tử: C35H60O5.
- Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của lá Xuân Hoa dựa vào phƣơng pháp DPPH
đã xác định đƣợc trong lá Xuân Hoa có chất chống oxy hóa với hàm lƣợng là
khá cao (85,7% vitamin C).
5.2. Đề nghị
59
Với sự hiểu biết và kinh nghiệm có giới hạn của một sinh viên nên kết quả sẽ có
những thiếu xót. Vì thời gian và kinh phí làm đề tài còn hạn hẹp nên không thể tiếp tục
chiết tách thêm một số hợp chất thứ cấp trong lá Xuân Hoa có hoạt tính sinh học cao.
Nếu có thời gian, tôi xin đƣợc phép đề nghị tiếp tục phân tích các thành phần và tách
chiết các hợp chất thứ cấp nhằm sử dụng chúng thay thế cho kháng sinh trong tƣơng
lai. Thêm vào đó, nghiên cứu sâu hơn nữa để có thể sử dụng cây Xuân Hoa nhƣ một
thực phẩm chức năng là một trong những hƣớng vô cùng quan trọng.
60
TÀI LIỆU THAM KHẢO
TIẾNG VIỆT
1. Nguyễn Thạc Cát, 1985. Phương pháp sắc ký. Nhà Xuất Bản Khoa Học và Kỹ
Thuật.
2. Võ Văn Chi, 1997. Từ điển cây thuốc Việt Nam. Nhà Xuất Bản Hà Nội.
3. Bùi Trọng Đạt, Phùng Văn Trung, Phan Nhật Minh, Hoàng Thị Ngọc Dung và
Phạm Cao Thanh Tùng, 2003. Xây dựng quy trình thử hoạt tính kháng oxy hóa
DPPH và sàng lọc một số cao chiết từ cây cỏ Việt Nam.Tuyển Tập Công Trình
Nghiên Cứu Khoa Học và Công Nghệ năm 2003; tr.150-155.
4. Nguyễn Văn Hùng, Lê Anh Tuấn và Nguyễn Quyết Chiến, 2004. Nghiên cứu
thành phần hóa học cây Xuân Hoa (Pseuderanthemum Palatiferum Nees Radlk).
Tạp Chí Khoa Học và Công Nghệ, tập 42, số 2; tr.75-79.
5. Trần Công Khánh, Nguyễn Văn Hùng, Nguyễn Thị Thanh Nhài, Lê Mai Hƣơng
và Bùi Kim Liên, 1997. Góp phần nghiên cứu về thực vật, thành phần hóa học
và tác dụng sinh học của cây Xuân Hoa. Tạp chí dược liệu, tập 3; tr. 37-41.
6. Trần Công Khánh, 1997. Sự thật về cây thuốc kỳ diệu-cây Xuân Hoa. Tạp Chí
Thuốc và Sức Khỏe, số 101; tr.10-11.
61
7. Nguyễn Kim Phi Phụng, 2000-2001. Các phương pháp nhận danh; trích ly cô
lập các hợp chất hữu cơ. Trƣờng Đại Học Khoa Học Tự Nhiên.
8. Nguyễn Văn Thanh. Vi sinh học. Nhà Xuất Bản Y học.
9. Nguyễn Thị Minh Thu, Trần Công Khánh, Trần Vân Hiền, Tạ Thị Phòng, Trần
Lê Du, 1999. Thử độc tính cấp diễn và tác dụng bảo vệ tế bào gan của cây Xuân
Hoa. Tạp Chí Dƣợc Học, số 9; tr.15-17.
10. Bài giảng chiết xuất dƣợc liệu. Trƣờng Đại Học Y Dƣợc TpHCM.
11. Bài giảng dƣợc liệu, 2002. Trƣờng Đại Học Dƣợc Hà Nội, Bộ Môn Dƣợc Liệu.
Nhà Xuất Bản Y Học.
12. Vi sinh vật y học. Bộ Y Tế, Vụ Khoa Học- Đào Tạo.
TIẾNG NƢỚC NGOÀI
13. Dejian Huang, Boxin Ou and Ronald L. Prior, 2005. The chemistry behind
antioxidant capacity assays. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 53;
p.41-56.
14. Huỳnh Kim Diệu, Châu Bá Lộc, Seishi Yamasaki and Yutaka Hirata, 2006. The
effects of Pseuderanthemum palatiferum a new medicinal, on growth
performances and diarrhea of piglets.JARQ, No.40; P.85-91.
15. Irina I. Koleva, Teris A. van Beek, jozef P. H. Linssen, Aede de Grôt and Lyuba
N. Evstatieva, 2002. Screening of plant extract for antioxidant activity: a
62
comparative study on three testing methods. Phytichemical analysid, No.13;
p.8-17.
16. Phan Minh Giang, Ha Viet Bao, Phan Tong Son. 2000. Phytochemical study on
Pseuderanthemum palatiferum (Nees) Raldk, Acanthaceae. Joural of chemistry,
Vol.41, No.2, trang 115-118.
TÀI LIỆU TRÊN MẠNG
17. http:// www.jireas. Affre.go.jp.
18. http:// www.cancerweb.ncl.ac.uk/cgi-bin/omd=antioxidants.
19. http:// www.unabridged.merriam-webster.com.
Phụ lục 1 : Phổ IR của chất XH-K13.
Phụ lục 2 : Phổ 1H- NMR của chất XH-K13
Phụ lục 2a: Phổ 1H- NMR của chất XH-K13.
Phụ lục 2b : Phổ 1H- NMR của chất XH-K13.
Phụ lục 3: Phổ 13C- NMR của chất XH-K13.
Phụ lục 3a: Phổ 13C- NMR của chất XH-K13.
Phụ lục 3b: Phổ 13C- NMR của chất XH-K13.
Phụ lục4: Phổ Dept của chất XH-K13
Phụ lục 5: Phổ HSQC của chất XH-K13
Phụ lục 5a: Phổ HSQC của chất XH-K13.
Phụ lục 5b: Phổ HSQC của chất XH-K13.
Phụ lục 6: Phổ HMBC của chất XH-K13.
Phụ lục 6a: Phổ HMBC của chất XH-K13.
Phụ lục 6b: Phổ HMBC của chất XH-K13.
Phụ lục 6c: Phổ HMBC của chất XH-K13.
Phụ lục 7: Phổ COSY của chất XH-K13.
Phụ lục 7a: Phổ COSY của chất XH-K13.
Phụ lục 7b: Phổ COSY của chất XH-K13.
Phụ lục 8: Phổ MS của chất XH-K13.
Phụ lục 9: Phổ 1H của chất XH-K11.
Phụ lục 10: Phổ 13CNRM và DEPT của chất XH-K11.
Phụ lục11: Phổ 13CNMR của chất XH-K11
Phụ lục 12: Phổ HSQC của chất XH-K11
Phụ lục 12a: Phổ HSQC chất XH-K11.
Phụ lục 12b: Phổ HSQC của chất XH-K11
Phụ lục 13: Phổ HMBC của chất XH-K11
Phụ lục 13a: Phổ HMBC của chất XH-K11
Phụ lục 13b: Phổ HMBC của chất XH-K11
Phụ lục 14: Phổ COSY của chất XH-K11
Phụ lục 14a: Phổ COSY của chất XH-K11
Phụ lục 14b: Phổ COSY của chất XH-K11.
Phụ Lục14c: Phổ COSY của chất XH-K11
Phụ lục 15: Dữ liệu phổ 13C – NMR và DEPT của chất XH-K13.
Vị trí C 13C – NMR Dept 135 Tín hiệu mũi
(δppm)
1 36,80 CH2 Mũi âm, mất trong Dept 90
2 29,24 CH2 Mũi âm, mất trong Dept 90
3 76,94 CH=O Mũi dƣơng
4 38,29 CH2 Mũi âm, mất trong Dept 90
5 140,43 C= Biến mất
6 121,29 CH= Mũi dƣơng
7 31,34 CH2 Mũi âm, mất trong Dept 90
8 31,39 CH Mũi dƣơng
9 49,59 CH Mũi dƣơng
10 36,18 C Biến mất
11 20,56 CH2 Mũi âm, mất trong Dept 90
12 39,30 CH2 Mũi âm, mất trong Dept 90
13 41,82 C Biến mất
14 56,15 CH Mũi dƣơng
15 23,82 CH2 Mũi âm, mất trong Dept 90
16 27,74 CH2 Mũi âm, mất trong Dept 90
17 55,42 CH Mũi dƣơng
18 11,62 CH3 Mũi dƣơng, mất trong Dept 90
19 18,91 CH3 Mũi dƣơng, mất trong Dept 90
20 35,44 CH Mũi dƣơng
21 18,58 CH3 Mũi dƣơng, mất trong Dept 90
22 33,34 CH2 Mũi âm, mất trong Dept 90
23 25,47 CH2 Mũi âm, mất trong Dept 90
24 45,14 CH Mũi dƣơng
25 28,71 CH Mũi dƣơng
26 19,65 CH3 Mũi dƣơng, mất trong Dept 90
27 19,05 CH3 Mũi dƣơng, mất trong Dept 90
28 22,59 CH2 Mũi âm, mất trong Dept 90
29 11,74 CH3 Mũi dƣơng, mất trong Dept 90
1
'
100,79 CHOH Mũi dƣơng
2' 73,44 CHOH Mũi dƣơng
3' 76,69 CHOH Mũi dƣơng
4' 70,09 CHOH Mũi dƣơng
5' 76,75 CHOH Mũi dƣơng
6' 61,08 CH2OH Mũi âm, mất trong Dept 90
Phụ lục 16: Dữ liệu các phổ của chất XH-K13
Vị trí 1H – NMR 13C – NMR COSY HMBC
C (δ ppm, J = Hz) (δ ppm ) 1H - 1H H C
1 1,77; 0,987; m 36,80 C3, C5, C10
2 1,804; 1,508; m 29,24
3 3,43, m 76,94 H3/H4a;H3/H4b
4 4a:2,12 / 4b:2,37 38,29 H4a/H4b C2,C10,C3 /C6,C5
5 140,43
6 5,32; s; 1H 121,29 H6/H7 C7,C8,C10, C4
7 1,946; 1,97; t 31,34 H7/H8
8 1,512; m; 1H 31,39
9 0,9075; d; 1H 49,59
10 36,18
11 11a:1,4; 11b:1,5; m 20,56
12 12a:1,17; 12b:1,97; m 39,30
13 41,82
14 0,86; m; 1H 56,15
15 15a:1,13; 15b:1,52; m 23,82
16 16a:1,23; 16b:1,78; m 27,74
17 1,157; m; 1H 55,42
18 0,67; s; 3H 11,62 C13, C17,C14
19 0,96, s; 3H 18,91 C9, C10, C5
20 1,3; m; 1H 35,44 H20/H21
21 0,91, d; 3H 18,58 H21/H20 C17,C20,C22
22 22a:1,4; 22b:1,24 33,34
23 1,18; m; 2H 25,47
24 0,93; m; 2H 45,41
25 1,609; m; 1H 28,71
26 0,78; s; 3H 19,65
27 0,80; s; 3H 19,05
28 28a:1,20; 28b:1,22 22,59
29 0,82; t; 3H 11,74
1' 4,22; d, J=8 100,79 H1'/ H2' C3'
2,90; m; 1H
2' OH-2'=4,84 73,44 OH-2'/ H2'
3,12; m; 1H
3' OH-3' = 4,85 76,69 OH-3'/ H3'
3,02; m; 1H
Phụ lục 17: Dữ liệu phổ 13C-NMR và DEPT của XH-K11
Vị trí C 13C-NMR DEPT 90 DEPT 135 Kết luận
(δ ppm )
2 164,30 Biến mất Biến mất >C=O
3 102,98 Mũi dƣơng Mũi dƣơng –CH=
4 181.96 Biến mất Biến mất >C=O
5 161,09 Biến mất Biến mất =C-OH
6 99,50 Mũi dƣơng Mũi dƣơng –CH=
7 162,93 Biến mất Biến mất =C-O
8 94,83 Mũi dƣơng Mũi dƣơng –CH=
9 156,92 Biến mất Biến mất =C–O
10 105,31 Biến mất Biến mất =C<
1’ 120,77 Biến mất Biến mất >C=
2’ 128,60 Mũi dƣơng Mũi dƣơng –CH=
3’ 116,06 Mũi dƣơng Mũi dƣơng –CH=
4’ 162,31 Biến mất Biến mất =C–OH
5’ 116,06 Mũi dƣơng Mũi dƣơng –CH=
6’ 127,60 Mũi dƣơng Mũi dƣơng –CH=
Glucose
1 99,90 Mũi dƣơng Mũi dƣơng >CH kề O
2 73,09 Mũi dƣơng Mũi dƣơng –CH – OH
3 77,16 Mũi dƣơng Mũi dƣơng –CH – OH
4 69,56 Mũi dƣơng Mũi dƣơng –CH – OH
5 76,42 Mũi dƣơng Mũi dƣơng –CH – OH
6 60,60 Biến mất Mũi âm –CH2–OH
4' OH-4'= 4,82 70,09 OH-4'/ H4'
5' 3,07; m; 1H 76,75
Phụ lục 18: Dữ liệu phổ 13C-NMR, 1H-NMR, COSY, HMBC của chất XH-
K11.
Vị tríC 13C-NMR 1H-NMR COSY HMBC
(δ ppm ) 1H 1H 1H 13H
2 164,30
3 102,98 6,86 (1H,s) H3 C4, C2
4 181.96
5 161,09
6 99,5 6,45 (1H, d, J = 2,0 Hz) H6 H8 H6 C8, C10
7 162,93
8 94,83 6,83 (1H, d, J = 2,0 Hz) H8 H6 H8 C6, C7, C9, C10
9 156,92
10 105,31
1’ 120,77
2’ 128,60 7,95 (1H, d, J = 9,0 Hz) H2’ H3’
3’ 116,06 6,94 (1H, d, J = 8,5 Hz) H3’ H2’
4’ 162,31
5’ 116,06 6,94 (1H, d, J = 8,5 Hz)
6’ 127,60 7,95 (1H, d, J = 9,0 Hz)
Glucose
1 99,9 5,06 (1H,d, J=7,5Hz) H1 C7
2 73,09
3 77,16
4 69,56
5 76,42
6 60,60
Các file đính kèm theo tài liệu này:
- DO THI TUY PHUONG.pdf