Kỷ thuật thực hành nuôi cấy mô

LỜI MỞ ĐẦU Từ rất lâu, con người đã biêt nhân giống cây trồng bằng rất nhiều biện pháp. Từ cách gieo hạt đến cách mà người ta lấy trực tiếp một nhánh cây để trồng ,gọi là giâm cành ,chiết cành…Hay chắp nối những thân cây này với thân cây kia bằng cách ghép cành. Những ưu điểm vượt trội của nó rất được ứng dụng rộng rãi. Cùng một lúc chúng ta có thể nhân giống cây lên hang lọt mà không mất nhiều thời gian để gieo hạt ,chờ cho cây con lớn. Bên cạnh đó người ta lại có một công nghệ hiện đại hơn, gọi là công nghệ nuôi cấy mô tế bào. Cùng với sự phát triển của khoa hoc kỹ thuật, nền công nghệ này đã và đang ứng dụng rộng rãi trong cây trồng…Cùng một lúc nó cũng tạo ra hang vạn cây trồng mới, nhanh chống mà không nhất thiết phải là từ các hạt của cây mà có thể lấy bất kỳ mô bào nào , trừ những mô tế bào đã hoá gỗ. Tuy nhiên nền công nghệ này đòi hỏi khá tốn kém, sự kiên nhẫn và khéo léo . CƠ SỞ LÝ THUYẾT CỦA NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT I.CƠ SỞ CỦA VIỆC NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật là quá trình điều khiển sự phát sinh hình thái của tế bào thực vật (khi nuôi cấy tách rời trong điều kiện nhân tạo vô trùng)một cách có định hướng vào sự phân hoá và sự phản phân hoá của tế bào trên cơ sở tính toàn năng của tế bào thực vật. 1.1 Tính toàn năng của tế bào: Tế bào bất kỳ nào của cơ thể sinh vật đa bào nào cũng đều có khả năng phát triển thành cơ thể hoàn chỉnh khi gặp điều kiện thuận lợi.Đó là tính toàn năng của tế bào. (Theo Gottlied Haberlandt trong cuốn “Thực nghiệm về nuôi cấy mô tế bào tách rời” ) 1.2 Sự phân hoá và phản phân hoá của tế bào: Cơ thể sinh vật trưởng thành bao gồm nhiều cơ quan có chức năng khác nhau được hình thành từ nhiều loại tế bào. Tất cr các tế bào đó đều bắt nguồn từ một tế bào ban đầu (tế bào hợp tử).Ở giai đoạn đầu tế bào hợp tử phân chia thành nhiều tế bào phôi sinh chưa mang chức năng riêng biệt(chuyên hoá).Sau đó ,các tế bào phôi sinh này tiếp tục được biến đổi thành các tế bào chuyên hoá đặc hiệu cho các mô ,cơ quan khác nhau.Đó là sự phân hoá. Tuy nhiên ,khi tế bào đã phân hoá thành các tế bào có chức năng chuyên biệt, chúng không hoàn toàn mất khả năng biến đổi của mình.Trong điều kiện thích hợp chúng có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ .Qúa trình đó gọi là quá trình phản phân hoá tế bào. 1.3 Môi trường dinh dưỡng : Là nhân tố quan trọng quyết định sự thành công của quá trình nuôi cấy .Hầu hết các môi trường dinh dưỡng nhân tạo được sử dụng để nuôi cấy mô và tế bào thực vật đều bao gồm các thành phần sau: Các nguyên tố muối khoáng +Nguyên tố đa lượng +Nguyên tố vi lượng Nguồn cac bon Vitamin Bảng Thành Phần Một Số Môi Trường Thông Dụng Thành phần Môi trường (Mg/l) Murashige và Skoog (MS) Gamborg (B5) Woody plant medium (WPM) Nitsch và Nitsch Khoáng đa lượng NH4NO3 1650 - 400 - NH4SO4 - 134 - - CaCl2.2H2O 332,2 150 96 166 Ca(NO3)2.4H2O - - 556 - MgSO4.7H2O 370 250 370 185 KNO3 1900 2500 - 950 K2SO4 - - 990 - KH2PO4 170 - 170 68 NaH2PO4 - 130,5 - - Khoáng vi lượng H3PO3 6,2 3,0 6,2 10 CoCl2.6H2O 0,025 0,025 - - CuSO4.5H2O 0,025 0,025 0,25 0,025 Na2EDTA 37,3 37,3 37,3 37,3 FeSO4.7H2O 27,8 27,8 27,8 27,8 MnSO4.H2O 16,9 10,0 22,3 18,9 KI 0,83 0,75 - - Na2MoO4.2H2O 0,25 0,25 0,25 0,25 ZnSO4.7H2O 8,6 2,0 8,6 10 Chất hữư cơ Myo-inositol 100 100 100 100 Glycine 2,0 - 2,0 2,0 Acid nicotinic 0,5 1,0 0,5 5 B1 0,5 0,1 0,5 0,5 B6 0,1 10,0 1,0 0,5 Các chất điều hoà sinh trưởng Ví dụ auxin,cytokinin… 1.4 pH của môi trường 1.5 Vô trùng mẫu cấy II NHÂN GIỐNG INVITRO 2.1 Ý nghĩa của nhân giống in vitro +Sử dụng mô nuôi cấy có kích thước nhỏ +Duy trì và nhân nhanh các kiểu gen hiếm ,làm vật liệu cho chọn giống +nhân nhanh với hiệu qủa kinh tế cao …. 2.2 Các phương thức nhân giống in vitro - Tái sinh cây mới từ cấu trúc sinh dưỡng - Nhân giống thong qua mô sẹo (callus) Nuôi cấy mô không tái sinh cây ngay mà phát triển thành khối mô sẹo - Nhân giống thông qua phát sinh phôi vô tính-Công nghệ hạt nhân tạo - Nhân giống trong các nồi phản ứng sinh học SƠ ĐỒ CÁC PHƯƠNG THIỨC TẠO CÂY HOÀN CHỈNH TRONG NHÂN GIỐNG IN VITRO: cây chồi Nuôi cấy tế bào Nuôi cấy phôi Nuôi cấy callus Nuôi cấy cơ quan Cây trưởng thành chồi ,cụm chồi,phôi củ nhỏ cây callus tế bào đơn cây phôi cây callus chồi III.CÁC GIAI ĐOẠN TRONG QUÁ TRÌNH NHÂN GIỐNG VÔ TÍNH IN VITRO 3.1 Giai đoạn 1- Cấy khởi đầu: - lựa chọn mẫu Hầu hết là các cơ quan hay bộ phận của cây như:chồi ngọn ,phiến lá… Mẫu phải ít mầm bệnh,cây mẹ khoẻ mạnh,không bị bệnh Tuỳ vào trạng thái sinh lý và tuổi của mẫu . -Nuôi cấy khởi động Đưa mẫu từ ngoài môi trường vào phải đảm bảo yêu cầu sau: + Tỷ lệ nhiễm thấp + Tỷ lệ sống cao + Tốc độ sinh trưởng nhanh 3.2 Giai đoạn 2- Nhân nhanh: Ở giai đoạn này bao gồm nhiều lần cấy chuyền mô lên các môi trường nhân nhanh nhằm kích thích tạo cơ quan phụ hoặc cấu trúc khác mà từ đó cây hoàn chỉnh có thể phát sinh.Những khả năng tạo cây đó là: + Phát triển chồi nách + Tạo phôi vô tính + Tạo đỉnh sinh trưởng mới - Bổ sung tổ họp hormone sinh trưởng mới:tăng cytokinin giảm auxin. Tỷ lệ auxin/cytokinin<1 tăng cường quá trình tạo chồi. Tỷ lệ auxin/cytokinin =1cân bằng hai quá trình tạo rễ và chồi Tỷ lệ auxin/cytokinin > tăng cường quá trình tạo rễ - Bảo đảm ở chế độ nhiệt 20-270c Tuy nhiên cần xác định số lần cấy chuyển hợp lý ,bởi vì nếu số lần cấy chuyền quá lớn thì sẽ dẫn tới hiện tượng cây bị thoái hoá và sinh trưởng kém ,có thể mất đi những đặc tính ban đầu của cây bố mẹ. 3.3 Giai đoạn 3- Tạo rễ: Giai đoạn này bao gồm quá trình kéo dài chồi để tạo kích thước thích hợp và tạo rễ,tức là quá trình tạo cây hoàn chỉnh.Môi trường lúc này không cần bổ sung cytokinin mà có thể chỉ bổ sung auxin.Nồng độ auxin tối ưu được xác định dựa trên tỷ lệ tạo rễ ,số lượng rễ và chiều dài rễ. 3.4 Giai đoạn 4- Đưa ra ngoài đất: Đây là giai đoạn quan trọng bao gồm công việc huấn luyện cây in vitro thích nghi với điều kiện khí hậu thay đổi :nhiệt độ ,ánh sang, độ ẩm…và chuyển từ trạng thái dị dưỡng sang trạng thái tự dưỡng hoàn toàn. Qúa trình thích nghi ở đây phải được hiểu như là quá trình thay đổi những đặc diểm sinh lý, giải phẫu, của bản than cây con đó .Thời gian tối thiểu cho sự thích nghi là 2-3 tuần .Trong thời gian này cây phải được bảo vệ trước những yếu tố bất lợi như: +Mất nước nhanh làm cho cây bị héo khô +Nhiễm vi khuẩn và nấm làm cho cây bị héo khô +Cháy lá do nắng IV.CÁC NHÂN TỐ ĐẢM BẢO THÀNH CÔNG TRONG NUÔI CẤY - Đảm bảo điều kiện vô trùng - Chọn đúng môi trường và chuẩn bị môi trường đúng cách - Chọn mô cấy, xử lý mô cấy thích hợp trước và sau khi cấy 4.1 Đảm bảo điều kiện vô trùng: Ý nghĩa: Môi trường nuôi cấy có chứa đường, muối, khoáng…rất thích hợp cho các loại nấm và vi khuẩn phát triển.Với tốc độ phát triển nhanh hơn rất nhiều lần so với tế bào thực vật nên nếu môi trường bị nhiễm thì sau vài ngày đến một tuần ,toàn bộ bề mặt nuôi cấy sẽ phủ đầy vi khuẩn và nấm, mô nuôi cấy sẽ không phát triển và chết dần. Vô trùng các nguồn tạp chất: - dụng cụ thuỷ tinh :rửa sạch và sấy ở 1600c/1 giờ (trừ các loại dung để đo thể tích) - Nút đậy: bong không thấm nước .Nút phải tương đối chặt để bụi không đi qua được và nước không bay đựơc trong quá trình nuôi cấy. - Mô nuôi cấy :dung các chất hoá học có hoạt tính diệt nấm khuẩn,.. - Vô trùng nơi thao tác và tủ cấy 4.2 Môi trường dinh dưỡng (phần 1.3) 4.3 Chọn mô cấy và xử lý mô cấy: Tuỳ từng loại mà chọn mô thích hợp. Thong thường các mô trong cơ thể thực vật đều có thể dung làm mô cấy,trừ những mô đã hoá gỗ. Tuy vậy, khi để bắt đầu nghiên cứu nhân giống vô tính một cây nhất định thì trước tiên người ta chú ý đến các chồi nách và mô phân sinh ngọn. KỸ THUẬT THỰC HÀNH NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT NUÔI CẤY HOA CÚC VÀ HOA LAN I.CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY 1. Pha dung dịch mẹ: Ký hiệu Thành phần nồng độ (mg/l) Dung dịch stock(mg/l) số ml dung dịch cần thiết để pha 500 ml môi trường nuôi cấy KNO3 1900 38.000 KH2PO4 170 3.400 25ml MS1( 20X) NH4NO3 1650 3.300 MgSO4.7H2O 370 7.400 MS2( 20X) CaCl2.2H2O 440 8.800 25ml H3PO3 6.2 1240 MnSO4.4H2O 22.3 4460 MS3(200X) CoCl2.6H2O 0.025 5 CuSO4 0.025 5 2.5ml ZnSO4 8.6 1720 Na2MoO4.2H2O 0.025 5 KI 0.83 166 MS4(40X) FeSO4.7H2O 27.8 1112 12.5ml Na2-EDTA 37.3 1492 (100X) Myo-inositol 100 10.000 5ml B1 0.1 10.000 MS5 B6 0.5 20 2.5ml Acide nicotinic 0.5 100 Glycine 2 400 Sau khi cân hoá chất xong cho vào lọ thuỷ tinh và cho 500 ml nước cất vào ,đặt lên máy khuấy tan rồi đổ vào bình có ghi tên từng loại dung dịch. 2.Pha môi trường: Đối với 1lit môi trường: MS1 50ml MS2 50ml MS3 5ml MS4 25ml Myo-inositol 10ml MS5 5ml Đường saccarozo 30g/lít nước dừa 100ml BAP 2ml NAA 0,5ml Agar 6,5-7g/lít Sau đó cho nước cất vào đầy 1 lít dung dịch, đo độ pH cho thích hợp rồi cho vào nồi khuấy trên máy khuấy, đem đun sôi, rót vào chai thuỷ tinh, dung nút bong đậy lại và trên mặt có giấy bảo vệ đã khử trùng , sau đó đem hấp. II.CHUẨN BỊ MẪU CẤY 1.Mẫu hoa cúc : Cúc được nuôi cấy từ tràng hoa. - lựa chọn những cúc to khẻo ,không bị bệnh. - Tách từng tràng hoa ra ,có thể để lại lớp ngoài cùng. - rửa bằng nước xà phòng loãng, sau đó rửa lại bằng nước sạch - lần cuối lấy nước cất tráng lại. - khử trùng bằng cồn 700 trong 30 giây. - khử trùng bằng nước Javen NaOCl với tỷ lệ 1 NaOCl : 9 H2O trong 15 phút. - rửa lại bằng nước vô trùng. 2. Mẫu phong lan: Các đỉnh sinh trưởng của phong lan. - lựa chọn những loại còn khả năng sinh trưởng, không quá già. - Dung tay để cọ rửa kỹ càng những ngọn được chọn. - cắt ngắn từng đoạn để lại khoảng giao nhau giữa hai đốt, nơi mà chồi non phát triển. - các thao tác sau giống như trên. Nhưng tỷ lệ NaOCl : H2O là: 1: 5 III.QUY TRÌNH CẤY MẪU: 1. Các thao tác trong phòng thí nghiệm trước khi cấy mẫu: - Khử trùng tủ cấy bằng tia cực tím trong 20-30 phút. Lau chùi bằng cồn 700. Bật đèn và máy khử trùng lên. - Khử trùng dụng cụ cấy bằng cách đốt dưới cồn 900 - Khử trùng tay bằng cồn 700 khi vào buồng cấy. - Khử trùng các dụng cụ chứa môi trưòng nuôi cấy bằng cách xịt cồn vào ,lau sạch khi đưa vào cấy mẫu hoặc có thể hơ trên ngọn lửa đèn cồn. 2. Cấy mẫu : Chú ý : • Khi cấy không được chạm tay vào mặt bàn cấy. • Tay phải hơi nghiêng . • Thao tác cấy xong phải lau chùi giao và que gắp rồi găm vào máy khử trùng. • Sau khi cấy xong phải đậy môi trường có mẫu cấy lại như ban đầu. a) Mẫu cúc: Gắp mẫu ra bằng que gắp ,đặt lên giấy (đã khử trùng). Dùng dao cắt bỏ hai đầu chỉ lấy phần cuống của tràng hoa (phần có màu xanh). Dùng que gắp cấy vào môi trường .Mỗi lọ môi trường cấy khoảng 5 mẫu.(giàn trải đều mẫu trong môi trường). b) Mẫu phong lan: Gắp mẫu ra đặt lên giấy cấy. Dùng dao cắt bỏ hai bên của mô sinh trưởng ,kích trước khoảng<=1cm.Dung dao bốc lớp vỏ bao trên đỉnh ra . Cấy vào môi trường ,sao cho mẫu hơi nghiêng ,gốc chỉa xuống môi trường và đỉnh sinh trưởng ở phía trên không gian trống. IV. CẤY CHUYỂN Thao tác khử trùng và cấy giống như trên.Nhưng cấy chuyển,nguyên liệu ở đây là : mẫu đã phát triển thành dạng cây non.Vì vậy cần đòi hỏi thao tác nhẹ nhàng và khéo léo. - Dùng que lấy mẫu ra khỏi lọ môi trường cũ .Đặt lên giấy cấy. - Dùng dao cắt, chia từng cây ra, vẫn giữ nguyên cây. -Đưa vào môi trường nuôi cấy mới. Chú ý mật độ không quá dày ,khoảng 4-5 cây trong một lọ môi trường là được. V.CHUYỂN RA NGOÀI MÔI TRƯỜNG ĐẤT Như chúng ta cũng đã biết ,cây con từ trong môi trường nuôi cấy ban đầu mà chuyển ra môi trường đất thì rất là khó khăn. Thứ nhất do sự thay đổi môi trường sống , môi trường dinh dưỡng ,... Thứ hai cây phải chuyển từ trạng thái dị dưỡng sang tự dưỡng. Khi cây đuợc khoảng 2 – 3 lá mầm thì đưa ra môi trường. 1.Chuẩn bị cây và môi trường đất: Cây được cấy ra ngoài môi trường ở đây là cây hoa chuông. - cây được lấy từ trong các lọ đã đủ tiêu chuẩn cấy . - Rửa bằng nước sạch ,sao cho hết phần thạch ,không cho dính lại ở cây dù là rất nhỏ. - Phân loại ra thành các dạng đã ghi rõ trong lọ cấy. - Nhúng trong dung dịch chống nấm ,rồi vớt ra ngoài. + Đất được lấy ở đây là đất cát nhỏ, không lẫn các hạt sạn lớn. + Được trải trong sọt một lớp khoảng 4-5cm. + Phun nước vừa ướt đất. 2. Cấy cây: Tất cả các thao tác đều dùng găng tay . Dùng que chọc lỗ dưới lớp đất vừa chuẩn bị, đặt cât xuống và lắp lớp đất lại. 3. Đưa vào môi trường chăm sóc: Sau khi cấy xong ,sọt chứa phải được đặt trong môi trường ổn định.Luôn giữ ẩm cho đất, bề mặt luôn ướt và tránh ánh sáng mặt trời mạnh cũng như nhiệt độ cao . KẾT LUẬN Công nghệ nuôi cấy mô tế bào hiện nay đang rất phổ biến và là nghành có tiềm năng phát triển. Không chỉ riêng lĩnh vực cây trồng, công nghệ nuôi cấy này còn có ở động vật và cả con người. Thời gian nhanh và số lượng nuôi cấy tăng, dễ dàng lấy mẫu, đó là một trong những ưu điểm của công nghệ này. Theo tình hình hiện nay thì vấn đề này rất thích hợp với việc đưa vào trồng cây, cải tạo đất ,bảo vệ môi trường.