Luận án Đặc điểm về phage T4 và ứng dụng

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM 09 CAO ĐẲNG SINH HỌC LUẬN ÁN VI SINH Thành viên Võ Mạnh Thanh TUấn TRần Quốc BÌnh Huỳnh Quốc Việt Trần Thị Mỹ DIệu Lê Trọng NHàn HUỳnh Diệp BẢo LÂm Mục lục HÌnh thái- cấu trúc 5 Sự sắp xếp của các gene trong nhiễm sắc thể phage 14 Lập bản đồ cấu trúc tinh vi vùng rII của phage T4 15 Chu trình tiềm tan ở Phage T4 18 Quá trình hoạt động của virus T4 –Sinh trưởng và phát triển ( chu trình sinh tan) 20 Ứng dụng 24 Tài liệu Tham Khảo 26 VÀI NÉT LỊCH SỬ Thực khuẩn thể (phage) là một thể “ăn” vi khuẩn, hay nói cho đúng: là virus của vi khuẩn, nó có thể gây bệnh và tiêu diệt vi khuẩn. Thực khuẩn thể không phải là phát hiện mới. Nó đã được biết đến từ lâu do Twort phát hiện đầu tiên và 2 năm sau (1917) được d’He’relle nghiên cứu kỹ. Từ nhiều công trình nghiên cứu và thực nghiệm d’He’relle nhận xét: nguyên nhân của hiện tượng thực khuẩn thể là một loại vi sinh vật rất nhỏ, có khả năng gây bệnh cho vi khuẩn với triệu chứng chính là dung giải. Sau đó, càng ngày càng tìm ra nhiều loại thực khuẩn thể khác nhau tương ứng với từng loại vi khuẩn như: phẩy khuẩn tả, thực khuẩn thương hàn, dịch hạch, các tụ cầu khuẩn, liên cầu, Brucella, Mycobacteria. Về bản chất đó là sự tan vỡ của tế bào vi khuẩn, do tác dụng của một loại thực khuẩn thể tương ứng. Thí dụ trong môi trường lỏng đã có vi khuẩn phát triển, nếu người ta cho vào đấy thực khuẩn thể tương ứng, thì môi trường trước kia đục ngầu vì có vi khuẩn sẽ trở thành trong suốt sau vài giờ. Trên bề mặt môi trường thạch đặc vừa mới cấy vi khuẩn, người ta rỏ một giọt thực khuẩn thể tương ứng vào một điểm, thì sau một thời gian để ở tủ ấm 370C, chỗ đã rỏ giọt thực khuẩn thể sẽ trơ thạch ra, còn ở bề mặt còn lại vi khuẩn mọc kín hết. Nhà văn Sinclair Lewis là người đầu tiên đã nói về liệu pháp thực khuẩn thể chữa bệnh nhiễm trùng, trong cuốn tiểu thuyết mang tên Arrowsmith xuất bản vào năm 1925 của ông. Các nước Đông Âu và Liên Xô cũ, trong nhiều thập kỷ đã ứng dụng liệu pháp thực khuẩn thể vào điều trị có hiệu quả cao, nhưng chỉ được ít người biết đến. Đặc biệt là sự xuất hiện của nhiều loại thuốc kháng sinh với những thắng lợi rực rỡ của nó, được coi là sử dụng đơn giản và hiệu quả, thực khuẩn thể hầu như đã bị mọi người lãng quên. HÌNH THÁI- CẤU TRÚC Cấu trúc đối xứng phức hợp Thể thực khuẩn T4 cấu tạo bởi 3 bộ phận: đầu , cổ, và đuôi. Đầu có cấu trúc đối xứng 20 mặt còn đuôi lại có đối xứng xoắn. Chính vì vậy mà người ta gọi là đối xứng phức hợp. Đầu dài 95nm, rộng 65nm, dưới kính hiển vi điện tử có thể thấy rõ 20 mặt. Capsid cấu tạo bởi 8 loại protein, lựơng chứa protein chiếm 76-81% trong thể thực khuẩn. Mỗi capsome có đường kính là 8nm. Có cả thẩy 212 capsome. Bên trong đầu có sợi ds DNA. Đầu nối với đuôi qua cổ. Đó là một đĩa hình lục giác , đường kính 37.5nm, có 6 tua cổ (cảnh tu) mọc ra từ cổ. Đuôi gồm bao đuôi, ống đuôi, đĩa gốc. 6 mấu ghim và 6 sợi đuôi. Bao đuôi dài 95nm, có 24 vòng xoắn cấu tạo bởi 144 capsome (mỗi capsome có khối lượng phân tử là 55000) cấu tạo nên.Ống đuôi dài 95nm, đường kính 8nm, ở giữa có lỗ thủng đường kính 2.5-3.5nm. Đây là con đường để dẫn DNA trong đầu của thể thực khuẩn xâm nhiễm vào tế bào vật chủ. Ống đuôi cũng cấu tạo bởi 24 vòng xoắn, tương ứng 24 vòng xoắn trên bao đuôi. Đĩa gốc cũng tương tự như đĩa cổ, đó là một đĩa hình lục giác, rỗng ở giữa. đường kính đĩa gốc là 30.5nm, trên đó mọc ra 6 sợi đuôi và 6 mấu ghim. Mấu ghim dài 20nm có chức năng hấp phụ. Sợi đuôi dài 140nm có thể gấp lại ở chính giữa, đường kính 2nm. Sợi đuôi cấu tạo bởi 2 laoị phân tử protein khá lớn và 4 loại phân tử protein khá nhỏ. Nó có tác dụng hấp phụ chuyên hoá và vùng mẫn cảm của bê mặt tế bào vật chủ. Sau khi sợi đuôi hấp phụ đĩa gốc sẽ bị kích thích, dẫn đến việc co rút bao đuôi và làm cho ống đuôi đâm vào tế bào vật chủ. Khi đó 144 capsome của bao đuôi sẽ phát sinh những phản ứng thay đổi vị trí khá phức tạp làm cho chiều dài đuôi co lại chỉ còn 50%, rất giống với sự co của các protein sợi cơ *Vỏ capsid: Capsid là vỏ protein bao bọc phần đầu chưua DNA của virus,được cấu tạo bởi các đơn vị hình thái gọi là capsome. Capsome lại được cấu tạo từ 5 hoặc 6 đơn vị cấu trúc gọi là protome. Protome có thể là monome (chỉ có một phân tử protein) hoặc polyme (có nhiều phân tử protein)- Pentame (penton) có 5 protome nằm trên các đỉnh của khối đa diện, còn hexame (hexon) tạo thành các cạnh và bề mặt hình tam giác. - Capsid có khả năng chịu nhiệt, pH và các yếu tố ngoại cảnh nên có chức năng bảo vệ lõi acid nucleic - Trên mặt capsid chứa các thụ thể đặc hiệu, hay là các gai glicoprotein, giúp cho virus bám vào các thụ thể trên bề mặt tế bào. Đây cũng chính là các kháng nguyên (KN) kích thích cơ thể tạo đáp ứng miễn dịch (ĐƯMD). - Vỏ capsid có kích thước và cách sắp xếp khác nhau khiến cho virus có hình dạng khác nhau. Có thể chia ra ba loại cấu trúc: đối xứng xoắn, đối xứng hình khối và cấu trúc phức tạp (Hình 1). Hình 1. Kích thước và hình thái của một số virus điển hình .Theo Presscott L. M. et al. , Microbiology. 6th ed. Intern. Ed. 2005. 2.2.1 Cấu trúc đối xứng xoắn: Sở dĩ các virus có cấu trúc này là do capsome sắp xếp theo chiều xoắn của acid nucleic. Tuỳ loại mà có chiều dài, đường kính và chu kỳ lặp lại của các nucleocapsid khác nhau. Cấu trúc xoắn thường làm cho virus có dạng hình que hay hình sợi ví dụ virus đốm thuốc lá (MTV), dại (rhabdo), quai bị, sởi (paramyxo), cúm (orthomyxo). ở virus cúm các nucleocapsid được bao bởi vỏ ngoài nên khi quan sát dưới kính hiển virus điện tử thấy chúng có dạng cầu. 2.2.2 Cấu trúc đối xứng dạng khối đa diện 20 mặt Hình của phòng thí nghiệm  Robert M Bock Đại học University of Wisconsin-Madison. Ở các virus loại này, capsome sắp xếp tạo vỏ capsid hình khối đa diện với 20 mặt tam giác đều, có 30 cạnh và 12 đỉnh. Đỉnh là nơi gặp nhau của 5 cạnh thuộc loại này gồm các virus adeno, reo, herpes và picorna. Gọi là đối xứng vì khi so sánh sự sắp xếp của capsome theo trục. Ví dụ đối xứng bậc 2, bậc 3, bậc 5, vì khi ta xoay với 1 góc 1800 (bậc 2), 1200 (bậc 3) và 720 (bậc 5) thì thấy vẫn như cũ. Các virus khác nhau có số lượng capsome khác nhau. Virus càng lớn, số lượng capsome càng nhiều. Dựa vào số lượng capsome trên mỗi cạnh có thể tính được tổng số capsome của vỏ capsid theo công thức sau:N= 10(n-1)2+2Trong đó N- tổng số capsome của vỏ capsid, n-số capsome trên mỗi cạnh. Hình 2. A Sơ đồ virus hình que với cấu trúc đối xứng xoắn (virus khảm thuốc lá). Capsome sắp xếp theo chiều xoắn của acid nucleic.B- Sơ đồ virus đa diện đơn giản nhất. Mỗi mặt là một tam giác đều. Đỉnh do 5 cạnh hợp lại. Mỗi cạnh chứa 3 capsome.C- Sự đối xứng của hình đa diện thể hiện khi quay theo trục bậc 2 (1800), bậc 3 (1200) và bậc 5 (720). Theo J. Nicklin et al., Instant Notes in Microbiology, Bios Scientific Publisher, 1999.   Trong một nguồn tài liệu khác chi tiết hơn thì: Có 2 phần chính cấu trúc nên Phage T4: phần đầu , phần thân cùng với các sợi đuôi Phần đầu: Phần đầu của bacteriophage T4 có trọng lượng khoảng 194 Mda, chiều dài khoảng 1150 Ǻ  và chiều rộng khoảng 850 Ǻ . Phần đầu là một khối đa diện 20 mặt bao gồm 160 phân tử có chứa 6 tiểu đơn vị của Gp23( protein capsid chính), 11 phân tử có chứa 5 tiểu đơn vị trong Gp24 (các protein ở góc) và 1 phân tử có 20 tiểu đơn vị trong Gp20 Trong suốt quá trình định hình phần đầu , các protein nâng đỡ trải qua sự phân giải của Gp21 amin của protein gp23 , gp24, IPI, IPII, IPIII, và gpalt được phân cắt, trong khi protein gp22, gp21, gp67, và gp68 được tiêu hóa. Khoảng cách giữa các trung tâm gp23 là ~ 140Ǻ . protein tạo thành một vỏ khoảng 30-Ǻ bảo vệ acid nucleic. Góc được chiếm bởi Gp24 và chúng tương tác với phần viền ngoài của Gp23 Một yếu tố cấu trúc của các capsid của T4 là một loại protein nhỏ tên Soc. Nó tạo một lưới gần như liên tục trên bề mặt của gp23. Nó liên kết 2 tiểu đơn vị Gp23, nhưng nó không thể liên kết quanh Gp24 hoặc khoảng giữa Gp23 và Gp24. Kết quả là mạng lưới tạo bởi Gp Soc chỉ bao quanh gp23, bỏ qua Gp24. Hầu như các phân tử Gp23 kết nối với 2 protein Soc, ngoại trừ những phân tử nằm gần nhất với Gp24. Mặc dù chức năng của Soc chưa được xác định đầy đủ, nó được coi là ổn định các thể thực khuẩn của capsid chống lại biến tính nhiệt và tiếp xúc với kiềm ,chất tẩy rửa, do đó, nó có trách nhiệm bảo toàn sự sinh tồn của thể thực khuẩn trong điều kiện không thuận lợi. Gene (kDa) Kích thước (số lượng amino-acid) Số lượng trong đầu trưởng thành Địa điểm 21 18.5 ♦ ♦ Lõi 22 2.5 ♦ ♦ Lõi, protein chính 23 48.7 422 930 vỏ,capsid 24 46.0 407 55 vỏ, đỉnh 67 3.9 ♦ ♦ lõi 68 15,7 ♦ ♦ lõi Alt 75.9 682 40 lõi Học 39.1 376 155 vỏ, bên ngoài bề mặt IPI 8.5 ♦ ♦ lõi IPII 9.9 ♦ ♦ lõi IPIII 20.4 ♦ ♦ lõi Soc 9.7 80 810 vỏ, ngoài Phần Thân VÀ Các Sợi của PHAGE T4 Thân và các sợi: Phần này rất quan trọng với Phage T4 vì nó là công cụ đắc lực để giúp Phage bám vào vật chủ. Phần này của lớp vỏ xác định đặc tính cũng như khả năng lây nhiễm vào vi khuẩn của Phage. Phần thân bao gồm 2 protein hình trụ đồng tâm nhau. Ống ở ngoài sẽ co lại và ống ở trong sẽ tạo thành 1 đường rãnh nhỏ dành riêng cho acid nucleic đang được lưu giữ trong phần đầu của Phage. Giống như 1 ống tiêm, cấu trúc của phần thân có khả năng đẩy DNA của Phage vào trong tế bào của vi khuẩn. Phần ống bên trong được cấu tạo bởi 144 mẫu Gp19, phần ống bên ngoài được gọi là lớp vỏ của thân, nó được cấu tạo bởi 144 mẫu Gp18 ( tương ứng số lượng của Gp19).Chiều dài của phần thân được xác định bởi “thước đo protein” : Gp29 (Leiman và cộng sự năm 2003), khi đó chiều dài nếu không co lại của phần thân là 1000 Ǻ và 210 Ǻ đường kính (Mesyanshinov và cộng sự năm 2004). Khi co lại, lớp vỏ của thân chỉ khoảng 360 Ǻ chiều dài và 270 Ǻ đường kính. Chiều dài của ống trong không thay đổi trong suốt quá trình co lại của của bao đuôi (Leiman và cộng sự năm 2003). Ở hai đầu của ống là một tấm nền (vòng cổ) và các sợi đuôi. Vòng cổ là một cấu trúc đa protein,những protein cấu tạo thành 6 tấm nêm( WHISKER) bao quanh trục trung tâm nhờ sự giúp đỡ của protein (gp9)3 và (gp12)3. Gp11, gp10, gp7, gp8, gp6, gp53, và gp25 kết hợp liên tiếp nhau để tao nên các vòng nêm. Gp5, gp27, gp29, gp26 ,gp28 tạo nên trục của nêm. Gp5 có 1 lysozyme  cần cho sự tiêu hoá lớp peptidoglycan của vi khuẩn trong suốt quá trình xâm nhập. Một trong những bộ phận hữu dụng nhất của bacteriophage T4 là những sợi đuôi. Sợi đuôi dài và những râu ngắn hơn (mọc ra từ vùng cổ áo-còn gọi là các tua cổ) được gắn vào 2 đầu ống thân (Coley và Wood năm 1975). Những sợi đuôi dài sẽ đảm nhận trách nhiệm của việc liên kết với các thụ thể đặc biệt trên bề mặt vi khuẩn. Mỗi sợi đuôi bao gồm 2 phần: 1 nửa ở gần được mã hoá bởi gen 34 và phần ở xa được mã hoá bởi gen 36 và 37. Cả hai phần này sẽ được kết nối bởi Gp35, đồng thời tương tác với Gp34 và Gp36. Protein sẽ liên kết sợi đuôi với mặt tiếp xúc của Gp9. Sự kết hợp của phần đuôi ở gần với Gp9 được giúp đỡ bởi Gp63. Gp9 có vai trò cực kì quan trọng trong quá trình lây nhiễm. Sau khi liên kết 1 sợi đuôi tới 1 LPS (lipopolysaccharide) ở thành tế bào vi khuẩn, nó sẽ khởi động quá trình biến đổi cấu trúc ở nơi tiếp xúc , sau đó bao đuôi sẽ co lại cho phép thể thực khuẩn tiêm DNA của nó vào tế bào. Bên cạnh đó , Gp9 còn đảm bảo chức năng chuyển động tổng hợp của tất cả sợi đuôi và ngăn cản sự chống đỡ của thành tế bào. Các đuôi ngắn (tua cổ) là Gp12 được gắn vào mặt tiếp xúc bằng Gp11,chúng có cấu trúc thu hẹp ở giữa-nơi cho phép các sợi uốn cong lên. Các tua cổ đảm nhiệm chức năng liên kết phần đầu của Phage với bề mặt vi khuẩn. Trong suốt quá trình xâm nhập phân tử gp12 liên kết với các khu vực cốt lõi của các receptor trên bề mặt tế bào LPS (Mesyanzhinov và cộng sự 2004). Cấu trúc PRPTEIN của phần thân và sợi đuôi của phage t4 (xác định bởi Mesyanzhinov và cộng sự 2004 , Leimann và cộng sự 2003). Gene (kDa) Kích thước (số lượng amino-acid ) Số mẫu tồn tại Vị trí 3 19.7 176 6 ống thân 5 63.7 575 3 Trục trung tâm 6 74.4 660 12 Phần nêm bao ống thân 7 119.2 1032 6 Phần nêm bao ống thân 8 38.0 334 12 Phần nêm bao ống thân 9 31.0 288 18 phần đầu 10 66.2 602 18 Mấu ghim 11 23.7 219 18 Mấu ghim 12 55.3 527 3* Mặt tiếp xúc (Tấm nền) 15 31.4 272 6 Thân 18 71.2 659 144 Bao đuôi(thân) 19 18.5 163 144 Ống trong (thân) 25 15.1 132 6 Lớp nêm mặt tiếp xúc 26 23.4 208 n.d. Chaperone 27 44.4 208 3 Trục trung tâm 28 24.0 177 n.d. Trục trung tâm 29 64.4 391 6 Ống trong 34 140.0 1289 3* Phần đuôi gần 35 30.0 372 1* Phần cổ 36 23.0 221 3* Phần đuôi xa 37 109.0 1026 3* Phần đuôi xa 48 39.7 177 6 Lớp nêm mặt tiếp xúc 53 23.0 196 6 Lớp nêm mặt tiếp xúc 54 35.0 590 6 Lớp nêm mặt tiếp xúc Frd 21.7 320 6 Lớp nêm mặt tiếp xúc Td 33.1 364 3 Trục trung tâm wac 51.9 89 3* Phần liên kết giữa đầu và thân n.d : Không xác định *: số mẫu của các protein cho mỗi sợi đuôi. Có sáu sợi ở mỗi virion T4 bám vào ,bao đuôi xoắn lại 2. Sự sắp xếp của các gene trong nhiễm sắc thể phage Tần số tái tổ hợp có thể được sử dụng để xác định khoảng cách của bản đồ ở Eukaryote. Các thí nghiệm lập bản đồ cho thấy đột biến ở T4 được lập bản đồ thành 3 cụm riêng biệt. Cả ba cụm này có liên kết với một cụm khác. George Streisinger và cộng sự (1964) đã chứng minh bản đồ di truyền của phage T4 có dạng vòng tròn. Trong mỗi phép lai, lập ba đến bốn điểm đánh dấu ( MARKER) di truyền lần lượt với mỗi nhóm và tiến hành qua toàn bộ genome của T4. Nhiều gene khác đã được xác định và lập bản  đồ  đầy đủ  trên  phân tử vòng  tròn .  Những vùng ở vòng tròn bên trong là 3 cụm của điểm đánh dấu T4 đã được xác định và lập bản đồ di truyền. Vòng ngoài có mặt của nhiều bộ đánh dấu lớn tạo thành toàn bộ vòng tròn của bản đồ di truyền. Bản đồ di truyền phage T4 cho thấy gene của phage T4 tạo cụm mở rộng theo chức năng của chúng. Chẳng hạn có cụm lớn các gene dùng  cho sao chép DNA  ở vị trí phần tư bên trên phía phải và có cụm gene tổng hợp các cấu phần tạo nên đầu của phage ở phía dưới của vòng tròn. Phân tử DNA của phage T4 là phân tử sợi đơn dạng thẳng, mỗi đầu tận  cùng  của  DNA  phage  T4  được  nhân  lên  hoặc  lặp  đoạn  ở  đầu  cuối (terminal redundant). Do vậy,  mỗi phân tử DNA có kích thước tăng thêm 2%. Khi DNA được sao chép trong tế bào, sự tái tổ hợp giữa các phần ở đầu tận cùng của bộ gen T4 với những trình tự tương đồng của bộ gen T4 khác, kết  quả  tạo  ra  sản  phẩm  DNA  có  kích  thước  lớn  hơn  khả  năng  chứa  của phần  đầu.  Những  phân  tử  chứa  lặp  đoạn  được  tạo  thành  vì  sự  tái  tổ  hợp trong bộ gen của phage T4 xảy ra thường xuyên, trung bình có khoảng 20%sự kiện tái tổ hợp xảy ra trên một nhiễm sắc thể. Khi phân tử DNA được gói vào  phần  đầu,  nó  được  cắt  bằng  enzyme  chỉ  còn  chứa  khoảng  102%  của  chiều dài bộ gen phage T4, vì có chứa đoạn lặp lại của phần đầu.Bản đồ di truyền của T4 với các marker 3. Lập bản đồ cấu trúc tinh vi vùng rII của phage T4 Các nghiên cứu chi tiết về các đột biến rII của phage T4 làm sáng tỏ hơn về cấu trúc gene. Phage T4 ở dạng hoang dại r+ có khả năng nhiễm đồng thời hai nòi   E.coliB và K. Các đột biến rII chỉ nhiễm nòi B nhưng không nhiễm  nòi  K.  Seymour  Benzer  (1955)  đã  nhận  được  2400  đột  biến  rII  có nguồn gốc độc lập với nhau. Ông đã cho lai các đột biến với nhau và căn cứ vào sự xuất hiện các dạng tái tổ hợp hoang dại r+ mà lập bản đồ các điểm đột biến. Mỗi  đột  biến  có  thể  tái  tổ  hợp  với  các  đột  biến  khác.  Đột  biến  mất đoạn ngăn cản sự tái tổ hợp với hai hoặc nhiều đột biến điểm ở các vị trí khác nhau của gene. Mỗi mất đoạn làm mất một phần bộ gene của phage bao gồm cả vùng rII. Sử dụng đột biến mất đoạn là phương pháp đơn giản để lập bản đồ của hàng ngàn đột biến. Bản đồ mất đoạn (Deletion mapping) dựa trên sự có hoặc không có dạng tái tổ hợp. Trong bất kỳ phép lai nào giữa một đột biến điểm chưa biết và một đột biến mất đoạn, sự xuất hiện của dạng hoang dại cho thấy đột biến điểm nằm ngoài vùng mất đoạn. Ngược lại, nếu đột biến điểm xuất hiện trong vùng mất đoạn, không xuất hiện dạng tái tổ hợp kiểu hoang dại ở thế hệ sau.Đột biến mất đoạn được sử dụng để chia locus rII của bacteriophage T4 thành 7 vùng và 47 tiểu vùng nhỏ Nhiều phép lai đã được thực hiện để lập bản đồ đột biến chi tiết gene rII. Khoảng cách từ A1 đến A6 và B được trình bày ở hình 8.4. Một đột biến đặc biệt đã được kiểm tra định vị ở vùng A4. Đột biến này không tái tổ hợp tạo dạng kiểu dại trong phép lai với các đột biến mất đoạn lớn như r1272, r1241, rJ3 và rPT1 nhưng nó có thể tái tổ hợp tạo dạng kiểu dại trong phép lai  với  rPB242,  rA105  và  r638.  Các  đột  biến  được  tạo  ra  bởi  cùng  một khuôn, kết quả lai với các đột biến mất đoạn lớn sẽ được xếp vào vùng A4. Bản đồ di truyền trong vùng A4 có thể được tạo ra bởi một bộ các đột biến mất đoạn được trình bày ở phần dưới của hình. Xác định 7 tiểu vùng ở trong A4 (từ a qua g).Xác định vùng rII liên quan với các marker di truyền dạng thẳng của bản đồ di truyền phage T4 Ví dụ, một đột biến trong vùng A4 kết quả tái tổ hợp tạo dạng kiểu dại với đột biến mất đoạn r1368, nhưng lại không thể thực hiện được với đột biến r221 sẽ được sắp vào tiểu vùng c. Ở mức độ chi tiết hơn, các đột biến trong một tiểu vùng được sắp xếp nhờ lai giữa chúng với nhau. Ở phage T4, các điểm đột biến ở rất gần nhau, được tách nhau nhờ tái tổ hợp. 1% tái tổ hợp tương ứng với khoảng cách khoảng 100 bp. Vì vậy, bất kỳ hai đột biến không thể tái tổ hợp được với nhau có thể được xếp vào cùng vị trí trong gene.  Bản  đồ  di  truyền  cho  số  lớn  các  đột  biến  rII  có  nguồn  gốc  độc  lập được mô tả ở hình. Nghiên cứu đột biến ở vùng rII và lập bản đồ di truyền có vai trò quan trọng, qua đó có thể rút ra các kết luận sau: + Sự  trao  đổi di truyền  có thể  xảy ra trong  gene và có  thể giữa  các nucleotide ở gần nhau.+ Các đột biến không được tạo ra ở cùng tần số với tất cả các điểm trong gene, chúng phân bố không đều nhau. Chẳng hạn, 2400 đột biến rII đã được xác định chỉ ở 304 điểm. Một trong những điểm này có thể có đến 474 đột biến . Nhũng điểm có tần số đột biến cao như thế được gọi là các điểm nóng (hotspot mutation). Ở những điểm khác, đột biến được phục hồi một lần hoặc vài lần.Bản đồ di truyền locus rII của phage T4 Kết quả phân tích vùng rII rất quan trọng, giúp cho chúng ta phân biết được 3  khái  niệm  về gene.  Phổ  biến  nhất,  gene liên  quan với  một  đơn vị chức năng. Điều này tương ứng với một đoạn DNA mã hóa cho một phân tử protein.  Benzer  đưa  ra  thuật  ngữ  cistron  để  chỉ  chức  năng  này,  thuật  ngữ cistron thỉnh thoảng vẫn được sử dụng. Đơn vị chức năng được xác định qua thử  nghiệm  bổ  sung  (complementation  test),  xác  định  được  2  đột  biến  có allele với nhau không. Trước thí nghiệm của ông rII được coi là một locus. Thí nghiệm cho thấy các đột biến xếp thành hai nhóm rIIA và rIIB. Lai các đột biến rIIA x rIIB sẽ có r+, nhưng lai rIIA ´ rIIA và rIIB ´ rIIB thì thu được kiểu hình đột biến r. Ngoài nghĩa là đơn vị chức năng, gene còn là đơn vị tái tổ hợp (recon) và đơn vị đột biến (muton). Cả hai đơn vị này,  đều tương ứng với những nucleotide riêng lẽ trong gene. 4. CHU TRÌNH TIỀM TAN Ở PHAGE T4 Chu  trình  tiềm  tan  bắt  đầu  khi  phân  tử  DNA  của  phage  gắn  vào nhiễm sắc thể của vi khuẩn  và tiến hành sao chép như một phần nhiễm sắc thể vi khuẩn. Các hạt phage không được tạo thành. Phân tử DNA của phage được gắn vào bộ gen của vi khuẩn được gọi là prophage, tế bào vi khuẩn sống  sót  được  gọi  là  tế  bào  tiềm  tan  (lysogen).   Phân  tử  DNA  của  phage   có  đầu  các  đầu  cuối  chứa  12  nucleotide không kết cặp, mà ở dạng sợi đơn tạo đầu dính  (cohesive end) bổ sung. Khi vào tế bào, đầu cuối bổ sung gắn lại tạo phân tử vòng tròn. Sự tạo vòng tròn xảy ra sớm ở cả chu trình tan và chu trình tiềm tan . Có khoảng 75% tế bào vi khuẩn bị nhiễm phage, phân tử DNA vòng tròn sao chép và chu trình tan xảy ra tiếp  theo. Còn khoảng 25%  tế bào bị nhiễm, phân tử DNA vòng tròn của phage l và phân tử DNA vòng tròn của E. colitương tác và xảy ra tái  tổ hợp điểm chuyên  biệt (site-specific recombination)  và DNA của phage gắn vào nhiễm sắc thể của vi khuẩn. Vị trí của tái tổ hợp điểm chuyên biệt ở DNA của vi khuẩn và phage được  gọi  là  điểm  gắn  vào  của  vi  khuẩn  và  phage  (bacterial  and  phage attachment sites). Mỗi điểm gắn có chứa 3 đoạn: ở đoạn trung tâm có cùng trình tự nucleotide ở cả 2 vị trí gắn và là vùng mà sự tái tổ hợp thực sự xảy ra. Điểm gắn vào của phage được ký hiệu bởi POP’ (P: phage) và điểm gắn vào ở vi khuẩn được biểu diễn bằng BOB’ (B: bacteria). So sánh bản đồ di truyền của phage và prophage POP’ nằm gần vùng trung tâm của phân tử DNA dạng thẳng. Một protein của phage, integrase, xúc tác cho tái tổ hợp điểm chuyên biệt. Enzyme integrase nhận ra điểm gắn vào của phage và vi khuẩn, gây ra sự trao đổi vật lý, kết quả là phân tử DNA của phage gắn vào phân tử DNA của vi khuẩn. Kết quả của sự tái tổ hợp làm bản đồ di truyền của  prophage  khác  với  bản  đồ  di  truyền  của  phage.  Bản  đồ  di  truyền prophage là sự chuyển đổi vòng tròn bản đồ di truyền phage tự do. Prophage được chèn vào nhiễm sắc thể của E. coli giữa gene gal và gene bio. Sự chèn vào của phage làm tăng khoảng cách giữa gene gal và gene bio. Khi tế bào tiềm tan, các gene của phage trở thành một phần nhiễm sắc thể  của  vi  khuẩn  vì  vậy  có  thể  làm  kiểu  hình  của  vi  khuẩn  bị  thay  đổi. Nhưng hầu hết các gene của phage ở prophage đều được giữ ở trạng thái bất hoạt nhờ protein repressor – sản phẩm của gene ở phage. Protein repressor được bắt đầu tổng hợp nhờ sự nhiễm vào của phage và nó được tiếp tục tổng hợp  nhờ  prophage.  Gene  mã  hóa  cho  repressor  thường  chỉ  là  gene  của prophage được biểu hiện ở chu trình tiềm tan. Nếu tế bào tiềm tan bị nhiễm bởi phage giống với prophage, sự có mặt của repressor trong prophage ngăn cản  sự  biểu  hiện  các  gene  của  phage  nhiễm  vào.  Tính  kháng  với  những phage giống với prophage được gọi là tính miễn nhiễm (immunity). Đây là tiêu  chuẩn  để  xác  định  tế  bào  vi  khuẩn  chứa  phage  đặc  biệt.  Chẳng  hạn phage l không tạo đốm trên vi khuẩn chứa prophage lamda. Trong tế bào tiềm tan, sự sao chép không giải phóng các phage mới. Tuy nhiên, các prophage đôi khi trở nên có hoạt tính, trải qua chu trình tan, tạo ra số lượng lớn phage ở thế hệ sau. Hiện tượng này được gọi là sự cảm ứng prophage (prophage induction),  nó  được  bắt  đầu  bằng  sự  hư  hại  DNA  của  vi  khuẩn.  Đôi  khi prophage có thể tách ra khỏi DNA của vi khuẩn một cách ngẫu nhiên nhưng thường nó được gây ra do các tác nhân của môi trường như hóa chất hoặc chiếu xạ. Khả năng bị cảm ứng là một thuận lợi cho phage bởi vì DNA của phage có thể thoát khỏi tế bào bị hư hại. Cơ chế sinh hóa của sự cảm ứng là phức tạp nhưng sự thoát ra của phage xảy ra dễ dàng. Sự cắt ra của phage là sự tái tổ hợp điểm chuyên biệt khác, ngược với quá  trình  gắn vào.  Sự  cắt  này  yêu  cầu  enzyme  của  phage,  integrase thêm protein của phage là excisionase. Nghiên cứu di truyền của sự gắn vật lý cho thấy  escisionase  gắn  với  integrase  và  sau  đó  nhận  ra  điểm  gắn  vào  của prophage BOP’ và POB’, gắn với các điểm này. Integrase cắt ở trình tự O và tạo ra lại BOB’ và POP’. Quá trình tách diễn ra ngược lại với sự gắn vào. 5.Quá trình hoạt động của virus T4 –Sinh trưởng và phát triển * ký sinh trên E.coli ( chu trình sinh tan) Bao gồm 5 giai đoạn:hấp phụ, xâm nhập, sao chép,thành thục, phóng thích SỰ hấp thụ:trong dung dịch khi thể thực khuẩn ngẫu nhiên gặp tế bào vật chủ tương ứng có thể có sự tiếp xúc giữa mút của sợi đuôi với thụ thể đặc dị trên bề mặt tế bào. CÓ tác giả cho rằng đó là một quá trình hoá học hình thành giữa gốc-NH2 trên sợi đuôi và gốc –COOH trên thụ thể.Có thể do chạm vào các tua cổ mà búi sợi đuôi được gỡ tung ra.Sau khi sợi đuôi đã bám trên thụ thể, , các mấu ghim và đĩa gốc sẽ áp sát bề mặt tế bào. Người ta nhận thấy trên bề mặt mỗi vi khuẩn có khoảng 300 điểm hấp phụ. Các thể thực khuẩn khác nhau có các vị trí khác nhau về điểm hấp phụ. Ví dụ thể thực khuẩn t4 của E.coli có điểm hấp phụ là lipopolysaccharide, t2 lại có điểm hấp phụ là lipoprotein. Việc hấp phụ chịu nhiều tác động của nhân tố nội ngoại cảnh, ví dụ: -Số lượng thể thực khuẩn: Vì số điểm hấp phụ trên bề mặt tế bào vật chủ có hạn do đó số thể thực khuẩn có thể hấp phụ cũng chỉ có hạn. Số lượng thể thưucj khuẩn tương ứng có thể hấp phụ trên mỗi tế bào mẫn cảm được gọi là phức số cảm nhiễm M.O.I Phức số cảm nhiễm thường rất lớn, tới 250-360. Nếu một lượng lớn thể thực khuẩn đồng thời hấp phụ 1 tế bào mẫn cảm, vì đầu ống đuôi của từng thể thực khuẩn đều có 1 ít lizozyme làm cho bề mặt tế bào vật chủ như có nghìn nhọt trăm lỗ và khiến tế bào bị phá vỡ. Đó là do M.O.I quá cao gây nên. Trường hợp này sự phá vỡ tế bào không làm sản sinh ra các thế hệ thể thực khuẩn mới, ngườ ta gọi là sự phá vỡ tự hoại. -Các ion dương: Các ion Ca2+ , Mg2+ và Ba2+… đều có tác dụng xúc tiến sự hấp phụ, ngược lại, ion Al3+ ,Fe3+ ,Cr3+… lại có tác dụng làm bất hoạt. -Các nhân tố bổ trợ: Tritophan có thể xúc tiến sự hấp phụ của thể thực khuẩn T4, Biotin có thể xúc tiến sự hấp phụ của thể thực khuẩn ở vi khuẩn sinh acid glutamid(sản xuất bột ngọt, mì chính) -pH: môi trường trung tính có lợi cho sự hấp phụ. Khi pH10 thể thực khuẩn rất khó hấp phụ -Nhiệt độ: Nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển cũng là thích hợp cho sự hấp phụ. SỰ xâm nhập Sau khi hấp phụ, đĩa gốc và sợi đuôi sẽ nhận được sự kích thích, làm cho 144 capsome của bao đuôi sẽ có những vận động phức tạp. CHúng co lại chỉ còn 1 nửa chiều dài và đâm ống đuôi và qua thành tế bào và màng tế bào chất. Trong quá trình này các men lizozyme ở đầu ống đuôi có tác dụng làm hoà tan peptidoglican ở 1 bộ phận của thành tế bào. Thời gian hấp phụ đến xâm nhập là rất ngắn, ở nhiệt độ thích hợp với thể thực khuẩn T4 chỉ cần có 15 giây. Nếu có từ 2 thể thực khuẩn khác nhau trở lên xâm nhập vào cùng 1 tế bào vậtc hủ thì cuối cùng cũng chỉ có 1 thể thực khuẩn sinh sản mà thôi. Sự sao chép Quá trình sinh sản xảy ra cùng với sự sao chép acid nucleic và sự sinh tổng hợp protein. Đầu tiên thể thực khuẩn cung cấp thông tin di truyền cho tế bào vật chủ và bắt tế bào này tổng hợp ra các “Nguyên liệu” dựa trên hệ thống trao đổi chất của tế bào vật chủ. Các nguyên liệu sẽ được tiếp tục tạo thành các bộ phận của thể thực khuẩn (vỏ protein và lõi acid nucleic). Sau cùng lắp ráp thành các thể thưucj khuẩn hoàn chỉnh, đó là các thể thực khuẩn thế hệ “con” có kích thước như nhau Trong tế bào vật chủ DNA chuỗi thẳng của Phage được khép vòng nhờ một trong 2 cơ chế tuỳ thuộc phân tử chuỗi thảng có các đầu dính hay có đầu dư thừa Đầu dính là vùng ngắn, có sợi đơn, bổ sung nhau. Bên trong tế bào vật chủ chúng khép lại tạo thành một phân tử vòng, để lại 1 chỗ hở trên mỗi sợi. Những chỗ hở ấy sẽ được hàn gắn lại nhờ tác dụng của ligaza Các phân tử DNA chuỗi thẳng có đầu dư thừa được khép vòng nhờ có sự tái tổ hợp bên trong các vùng tận cùng đồng dạng Nhiễm sắc thể vòng của virus mở đầu sao chép ở một vị trí đặc biệt và diễn ra theo hai hướng quanh phân tử theo một quá trình tương tự như ở nhiễm sắc thể của vi khuẩn. Những lần sao chép tiếp theo trong nhiều trường hợp diễn ra theo một quá trình gọi là vòng xoáy. Một endonucleaza đặc biệt cắt 1 trong 2 sợi và đầu 3’-OH cùa sợi bị cắt sẽ được dùng làm ngòi để gắn thêm các nucleotit khác. Sợi nguyên vẹn bổ sung được dùng làm khuôn. Như vậy đầu 5’ bị thay thế và sau đó được sao chép. Theo cách này phân tử sợi kép được tổng hợp có thể dài gấp nhiều lần nhiễm sắc thể của virus. Các phân tử như vậy được gọi là thể đa liên, sau đó sẽ bị cắt thành các nhiễm sắc thể của virus thường Trong một số trường hợp sự khép vòng không diễn ra trước sao chép. Phân tử dạng chuỗi được sao chép nhiều lần thành một số phân tử giống nhau, sau đó tái tổ hợp để tạo ra các thể đa liên. Cuối cùng các thể đa liên sẽ được một endonucleaza cắt thành các nhiễm sắc thể có đầu dư thừa Sự thành thục Sự thành thục còn được gọi là sự lắp ráp là giai đoạn thứ 4 của quá trình sinh sản virus. Sau khi các protein capsid và acid nucleic của virus đã được tích luỹ phong phú trong tế bào vật chủ thì bắt đầu xảy ra quá trình lắp ráp (hay tập hợp-assembly). Ở virus thực vật và ở các virus có cấu trúc đối xứng xoắn ốc sự lắp ráp tương đối đơn giản. Các protein capsid sẽ liên kết với nhiễm sắc thể của virus và cuộn lại thành dạng xoắn ốc. Sự lắp ráp ở thể thực khuẩn có đối xứng phức tạp hơn. Khi đó quá trình lắp ráp và giải phóng các virion thành thục liên quan với nhau. Việc tập hợp diễn ra ở mặt trong của màng tế bào chất và khi các protein capsid gắn vào AND thì sợi virion đang sinh trưởng bị đẩy qua thành tế bào Việc lắp ráp của các virus có đối xứng 20 mặt và các thể thực khuẩn hoặc virus có đối xứng phức hợp (ví dụ có đầu và đuôi) sẽ khác 1 chút. Trong đa số trường hợp các protein capsid tập hợp tạo thành 1 cấu trúc rỗng gọi là procapsid hay tiền capsid có hình dạng và kích thước của capsid (hoặc của đầu trong trường hợp các thể thực khuẩn không có đuôi). Sau đó acid nucleic của virus đi vào cấu trúc này và kết hợp thành một trạng thái chặt chẽ. Với các virus đối xứng 20 mặt procapsid sẽ được hàn lại và trở nên không thấm các phân tử lớn. Ở các thể thực khuẩn gồm 2 thành phần thì đuôi được tập hợp riêng biệt sau đó mới gắn với đầu có chứa DNA Trong hầu hết trường hợp bước cuối cùng trong giai đoạn lắp ráp cuả một virus với vỏ là việc tiếp nhận một màng của tế bào vật chủ bao bọc lấy lõi nucleocapsid khi virus đi qua màng tế bào chất vật chủ. Trước khi diễn ra bước này các protein do virus do virus đọc mã sẽ tích tụ ở màng tế bào chất hoặc ở màng trong của nhân. Ở các virus động vật có vỏ các protein của virus được tổng hợp trên riboxom gắn vào mạng lưới nội chất thô và được màng bên cạnh bao lấy khi chúng được tổng hợp. Thương các protein này được glycozyl hoá bởi các enzyme có mặt trong mạng lưới nội chất. Các virus có vỏ chứa DNA (T4) thì protein màng di chuyển đến màng trong của nhân. Ở đây nucleocapsid tập hợp trong nhân sẽ liên kết với các vùng của màng trong nhân đã gắn với các protein màng của virus. Màng này bao quanh lõi nucleoprotein và virion tách khỏi nhân. Virion thành thục sẽ chuyển tới lưới nội chất. Sự phóng thích Virus DNA có vỏ có thể di chuyển từ mạng lưới nội chất đến các bào nang. Từ đây chúng được phóng thích nhờ quá trình đào thải khỏi tế bào qua quá trình xuất bào. Ở một số virus động vật không có vỏ (như adenovirus) virus trực tiếp phóng thích qua màng tế bào chất mà không mà không làm tổn hại đến tế bào vật chủ. Tuy nhiên, nhiều virus động vật và virus thực vật sẽ làm giết chết tế bào vật chủ và thoát ra ngoài sau khi tế bào chủ đã bị tự phân. Trong phần lớn trường hợp thể thực khuẩn được giải phóng thông qua việc làm phân giải vi khuẩn. Trong một số trường hợp một gen của thể thực khuẩn được biểu hiện trong pha muộn sẽ đọc mã cho lyzozyme phân giải các liên kết glycozit của peptidoglican. Trong một số trường hợp khác một gen của thể thực khuẩn đọc mã cho một enzyme phân giải liên kết chéo peptid trong peptidoglycan. Tuy vậy cho đến nay vẫn còn chưa rõ nguyên nhân làm dung giải tế bào trong không ít trường hợp. 6.Ứng dụng: Sử dụng trong công nghệ DNA tái tổ hợp Mục đích Phân lập các gen từ hỗn hợp nhiều gen trong tế bào, để có thể phân tích và nghiên cứu từng gen riêng lẽ Nhân một dòng gen đã được phân lập lên 1 số lượng lớn, để đáp ứng đủ cho nhu cầu nghiên cứu Khả năng tạo ra những gen/tổ hợp gen mới *Cụ thể phage T4 sẽ được ứng dụng trong ezyme của công nghệ DNA tái tổ hợp, enzyme nối khung phân tử DNA ( nối các đoạn DNA) : T4 DNA ligase +Các enzyme bổ sung hoặc loại nhóm phosphate ở đầu tận cùng của acid nucleic: T4 polynucleotide kinase +Các enzyme tổng hợp các mối liên kết phosphodieste mới trong phân tử acid nucleic :T4 DNA polymerase -T4 DNA ligase: Mã hoá bởi hệ gen phage T4, nối các đoạn DNA sợi kép với nhau, không nối được giữa các đoạn DNA mạch đơn và giữa DNA và RNA. Hoạt tính nối mạnh hơn E. coli DNA ligase, vì không cần trình tự đối diện , tạo vector tái tổ hợp và nhân dòng ứng dụng: nối các đoạn DNA sợi kép đầu dính hoặc tù -T4 ARN ligase: có khả năng nối giữa DNA-DNA , DNA-RNA, RNA-RNA. Có thể gắn mchj đơn hoặc sợi kép ứng dụng: dùng để nối dài phân tử DNA hoặc RNA, gắn các trình tự nucleic đánh dấu (vd:GFP) 7. TÀI LIỆU THAM KHẢO www.google.com Leiman P.G., Kanamaru S., Mesyanzhinov V.V., Arisaka F., Rossmann M.G.: Structure and morphogenesis of bacteriophage T4. Cellular and Molecular Life Science 60 2356 � 2370 (2003) - Fokine A., Chipman P.R., Leiman P.G., Mesyanzhinow V.V., Rao V.B. Molecular architecture of the prolate head of bacteriophage T4. PNAS Vol. 101 No. 16 6003-6008 (2004) - Mesyanzhinov V.V., Leiman P.G., Kostyuchenko V.A., Kurochkina L.P., Miroshnikov K.A., Sykilinda N.N., Shneider M.M.: Molecular Architecture of Bacteriophage T4. Biochemistry (Moscow) Vol. 69 No. 11 (2004)