Luận văn Ảnh hưởng của loại enzyme, nồng độ enzyme, nhiệt độ, ph đến quá trình thủy phân nếp than ứng dụng cho quá trình lên men

hiệu suất thu hồi cho từng giai đoạn. Do đó việc sử dụng enzyme amylase trong sản xuất bia có hiệu suất cao sẽ: - Giảm tổn thất tinh bột và các chất hòa tan khi cho hạt nẩy mầm, làm tăng hiệu suất chất hòa tan lên 0,6 % (tức là tiết kiệm được 0,9% đại mạch ). - Giảm giá thành nguyên liệu hạt vì sử dụng nguyên liệu thay thế như gạo, bắp ... những nguyên liệu không nẩy mầm. - Giảm chi phí lao động cho sản xuất malt do đó tăng hiệu suất lao động. 2.7.3 Trong công nghệ sản xuất bánh mì Trong bánh mì, enzyme dược xem như một chất phụ gia cho vào quá trình làm bánh để tăng chất lượng bánh mì. Enzyme được đưa vào nhằm giải quyết các vấn đề sau: - Làm tăng nhanh thể tích bánh - Làm màu sắc của bánh đẹp hơn - Làm tăng mùi thơm cho bánh Các enzyme này tham gia thủy phân tinh bột để tạo thành đường. Nhờ đó nấm men Saccharomyces cerevisase sẽ dễ dàng chuyển hóa chúng thành cồn, CO2 làm tăng thể tích bánh tạo màu sắc và hương vị tốt cho bánh . Việc sử dụng amylase cho phép sử dụng bột mì kém phẩm chất để làm bánh hoặc có thể giảm bớt tới 50% đường cho thêm vào bánh trong thực đơn sản xuất bánh mì ngọt. 2.7.4 Trong sản xuất bánh kẹo Nếu chỉ tận dụng lượng enzyme có sẵn trong bột thì các phản ứng chuyển hóa từ tinh bột sẽ xảy ra không mạnh, nhất là khi ta sử dụng loại bột xấu để sản xuất bánh. Do đó người ta phải cho thêm enzyme amylase và protease vào chế biến bột trong quá trình sản xuất bánh quy. Các enzyme này hoạt động làm tăng lượng đường khử và acid amin. Đường khử và acid amin có trong khối bột đó sẽ cùng tham gia vào các phản ứng oxy hóa-khử, phản ứng Maillard và kết quả là tạo cho bánh có mùi, vị và màu hấp dẫn. Luận văn Tốt nghiệp khóa 28-2007 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm-Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 17 2.7.5 Trong sản xuất siro và các sản phẩm chứa đường Hiện nay, các nước Châu Âu và Châu Mỹ sản xuất siro đường fructose từ bột bắp bằng phương pháp enzyme phát triển rất mạnh. Theo phương pháp này phôi bắp được xử lý bằng SO2 và vi khuẩn lactic để hạt tinh bột mềm ra và enzyme sẽ được sử dụng sau khi bột đã được hòa tan vào nước. Ở giai đoạn gia nhiệt người ta cũng cho một lượng nhỏ α-amylase vào để dịch tinh bột có độ nhớt thấp tránh hiện tượng cháy khét. Sau đó cho lượng còn lại vào giai đoạn đường hóa, các enzyme này giúp cho quá trình đường hóa rất dễ dàng. Tăng hiệu suất thu hồi sản phẩm. Luận văn Tốt nghiệp khóa 28-2007 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm-Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 18 CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 3.1 Phương tiện thí nghiệm 3.1.1 Địa điểm Thí nghiệm được tiến hành tại Bộ môn Công nghệ thực phẩm-Khoa Nông nghiệp & SHƯD- Trường Đại học Cần Thơ. 3.1.2 Thời gian Thời gian thực hiện đề tài được tiến hành từ ngày 26/02/07 đến ngày 18/05/07. 3.1.3 Nguyên liệu - Nếp than - Chế phẩm enzyme amylase thương mại (α-amylase từ Bacillus, glucoamylase từ vi khuẩn Bacillus và nấm mốc Aspergillus, glucoamylase từ nấm mốc Aspergillus niger) - Các nguyên liệu khác 3.1.4 Hoá chất - Iod - NaOH - HCl - Fehling A và B - Một số hoá chất khác - Acid citric - Pb(CH3COO)2 - Na2SO4 3.1.5 Trang thiết bị - Chiết quang kế - Tủ lạnh - Máy đo độ màu - Nhiệt kế - Ống nghiệm - Máy xay nhỏ - Máy điều nhiệt - Ống đong - Erlen, Becker - Pipet các loại - Phểu thủy tinh - Cân phân tích Luận văn Tốt nghiệp khóa 28-2007 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm-Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 1 3.2 Phương pháp thí nghiệm 3.2.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát hoạt lực của chế phẩm enzyme amylase thương mại đến quá trình thuỷ phân tinh bột. i. Mục đích Nhằm rút ngắn thời gian sản xuất và nâng cao hiệu suất sản xuất. ii. Chuẩn bị mẫu - Mẫu tinh bột 5%. - Mẫu enzyme mỗi loại. - Mẫu dung dịch đệm (pH = 5) iii. Bố trí thí nghiệm - Sơ đồ thí nghiệm Chế phẩm enzyme A1 A2 A3 Tinh bột Đường hóa Dịch đường - Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm được tiến hành với ba loại enzyme: A1: α-amylase từ Bacillus A2 : glucoamylase từ vi khuẩn Bacillus và nấm mốc Aspergillus A3 : glucoamylase từ nấm mốc Aspergillus niger Số lần lặp lại: 2 iv. Tiến hành - Hút 0,1ml enzyme mỗi loại pha với 200ml nước cất, và lấy: + 2ml tinh bột 5% + 2ml dung dịch đệm (pH 5) + 0,5ml dịch enzyme mỗi loại + 1,5ml nước cất Ta có tổng số ml cho mỗi ống nghiệm là 6ml. Ủ 2 ống nghiệm ở nhiệt độ 500C trong thời gian 5 phút. Lấy 0,5ml dung dịch trong mỗi ống nghiệm thêm vào 5ml HCl 0,1N để phản Luận văn Tốt nghiệp khóa 28-2007 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm-Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 2 ứng dừng lại. Tiếp tục lấy 0,5ml trong mỗi ống nghiệm và 5ml dung dịch iod cho vào 2 ống nghiệm, lắc kỹ. Đo độ hấp thụ ở bước sống 620nm. - Tính vận tốc phản ứng: gọi Ao – độ hấp thụ đọc trên máy của mẫu ban đầu (mẫu đối chứng); A1 – độ hấp thụ đọc trên máy của mẫu thủy phân trong 5 phút. Ao a mg tinh bột Ao – A1 o o A AA 1− * a (số mg tinh bột bị thủy phân trong khoảng thời gian t) Định nghĩa vận tốc phản ứng là số mg tinh bột bị thủy phân trong thời gian 1 phút. Công thức tính: t a A AA o o ∗ − 1 - Hoạt tính của enzyme Định nghĩa: Hoạt tính của enzyme là số ml dịch enzyme có thể thủy phân 1 mg tinh bột trong 1 phút ở 500C. Công thức tính: X = aAA Atb o o ∗− ∗∗ )( 1 v. Chỉ tiêu theo dõi - Lượng tinh bột còn lại. Kết quả theo dõi sẽ được xử lý bằng chương trình Statgraphics Plus 4.0. 3.2.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của loại enzyme amylase, nồng độ enzyme, pH và nhiệt độ đến quá trình thuỷ phân nếp than. i. Mục đích Nhằm xác định loại enzyme, nồng độ và nhiệt độ thuỷ phân thích hợp để quá trình thuỷ phân đạt hiệu quả cao. ii. Chuẩn bị mẫu - Nếp than được làm sạch, nghiền nhỏ. - Chế phẩm enzyme thương mại được chuẩn bị với 3 nồng độ khác nhau cho mỗi loại. Luận văn Tốt nghiệp khóa 28-2007 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm-Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 3 Hình 7: Nếp sau khi nghiền nhỏ iii. Bố trí thí nghiệm - Sơ đồ thí nghiệm Nếp than Xử lý Trộn Chế phẩm enzyme 1 Chế phẩm enzyme 2 Chế phẩm enzyme 3 (B1,B2,B3) (B1,B2,B3) (B1,B2,B3) A2 A3 A4 A1 A2 A3 A1 A2 A3 C4,C5,C6 C4,C5,C5 C4,C5,C6 C1,C2,C3 C1,C2,C3 C1,C2,C3 C2,C3,C4 C2,C3,C4 C2,C3,C4 Đường hóa Dịch đường - Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm được tiến hành với ba nhân tố Nhân tố A: giá trị nhiệt độ thay đổi theo các mức độ A1: 600C A2: 650C A3: 700C A4: 750C Luận văn Tốt nghiệp khóa 28-2007 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm-Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 22 Nhân tố B: nồng độ enzyme sử dụng thay đổi theo các mức độ B1: 0,5 ml/50 g B2: 1,5ml/50 g B3: 2,5 ml/50 g Nhân tố C: giá trị pH thay đổi ở các mức độ C1: pH 3,5 C2: pH 4 C3: pH 4,5 C4: pH 5 C5: pH 5,5 C6: pH 6 Số lần lặp lại: 2 Tổng số nghiệm thức là: 102 iv. Tiến hành thí nghiệm Với mỗi loại enzyme ta tiến hành như sau: Cho 0,2ml enzyme vào 50g nếp than đã được nghiền sẵn với 200ml nước, sau đó chỉnh về pH C1 rồi đem đun ở nhiệt độ 70 0C trong 10 phút. Sau đó tiến hành nâng nhiệt độ lên nhiệt độ hồ hóa khoảng 10 phút rồi cho lượng enzyme còn lại ứng với nồng độ B1 (kể cả lượng enzyme lúc đầu), sau đó giữ ổn định ở nhiệt độ A1 khoảng 40 phút. Trong suốt quá trình làm cứ 5 phút ta lấy mẫu ra làm lạnh để xác định Bx. Tổng thời gian nấu là 60 phút. Lặp lại với các nhiệt độ, pH và nồng độ còn lại cho cả ba nguồn chế phẩm enzyme khác nhau. v. Chỉ tiêu theo dõi - Độ Brix. - Hàm lượng đường tổng số của bã. Xử lý kết quả thống kê bằng chương trình Statgraphics Plus 4.0 Luận văn Tốt nghiệp khóa 28-2007 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm-Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 23 A B A B B A CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Xác định hoạt tính của enzyme thương mại Bảng 4: Hoạt độ của enzyme amylase Loại enzyme Hoạt độ (số ml enzyme/1mg tinh bột/1phút) α-amylase từ Bacillus 0,051 Glucoamylase từ Aspergillus và Bacillus 0,052 Glucoamylase từ Aspergillus niger 0,054 Chú thích: Số liệu trong bảng là giá trị trung bình của 3 lần lặp lại. Giá trị trong bảng càng nhỏ thì hoạt độ của enzyme càng mạnh. Từ bảng trên cho thấy enzyme có nguồn gốc từ vi khuẩn có hoạt tính mạnh hơn enzyme có nguồn gốc từ nấm mốc. (a) α-amylase từ Bacillus (b) Glucoamylase từ Aspergillus niger Chú thích: A: mẫu có chứa enzyme B: mẫu đối chứng (c) Glucoamylase từ Aspergillus và Bacillus Hình 8: Mẫu xác định hoạt lực của 3 loại enzyme 4.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ, pH, nồng độ enzyme đến khả năng thủy phân của enzyme 4.2.1 Kết quả ảnh hưởng của nhiệt độ, pH, nồng độ enzyme đến khả năng thủy phân của enzyme α-amylase có nguồn gốc từ vi khuẩn Bacillus Tiến hành khảo sát ở 3 mức độ của enzyme, pH, nhiệt độ khác nhau kết quả thể hiện ở các đồ thị và bảng thống kê sau. Luận văn Tốt nghiệp khóa 28-2007 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm-Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 24 Hình 9: Đồ thị biểu diễn sự thay đổi độ brix theo thời gian thủy phân, ở nồng độ 0,5ml/50g Ở các nồng độ 1,5ml/50g và 2,5ml/50g cũng tuân theo qui luật như ở nồng độ 0,5m/50g. Giai đoạn đầu tốc độ tăng độ brix cao do nồng độ cơ chất cao, khi nồng độ cơ chất cao cơ hội enzyme tiếp xúc được với cơ chất lớn vì vậy enzyme thủy phân mạnh. Sau đó nồng độ cơ chất giảm, enzyme không còn đủ cơ chất để thủy phân như lúc đầu nên tốc độ tăng độ brix cũng chậm dần. Điều này cũng phù hợp với qui luật ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hoạt động của enzyme (Giáo trình sinh hóa - Bùi Hữu Thuận). Qua đồ thị cũng thấy rõ khi nhiệt độ tăng thì khả năng thuỷ phân của enzyme cũng tăng vì nhiệt độ tăng thì tốc độ phản ứng sẽ tăng. Kết quả cho thấy ở bảng 5 Bảng 5: Kết quả thống kê ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ Brix đạt được cuối quá trình thủy phân của enzyme α-amylase có nguồn gốc từ vi khuẩn Bacillus Nhiệt độ Độ Brix 650C 17,87b 700C 18,06a 750C 18,19a Chú thích: Số liệu trong bảng là giá trị trung bình của 2 lần lặp lại Các giá trị trung bình có cùng chữ thì khác biệt không ý nghĩa, mức độ ý nghĩa 5% Kết quả thống kê cho thấy nhiệt độ 700C và 750C khả năng thủy phân của enzyme là tốt nhất và không có sự khác biệt ở hai nhiệt độ. Đây là nhiệt độ tối thích cho hoạt động của enzyme vì enzyme được trích ly từ vi khuẩn nên khả năng chịu nhiệt của enzyme này cũng cao hơn so với những nguồn khác như nấm mốc, hay trích ly từ thực vật. Điều này 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 0 10 20 30 40 50 60 Thời gian (phút) Đ ộ Br ix 65oC 70oC 75oC 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 2 0 0 10 20 30 40 50 60 Thời gian (phút) Đ ộ Br ix 65o C 70o C 75o C 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 0 10 20 30 40 50 60 Thời gian (phút) Đ ộ Br ix 65o C 70o C 75o C pH 5,5 pH 6 pH 5 Luận văn Tốt nghiệp khóa 28-2007 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm-Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 25 đã được chứng minh rằng nhiệt độ tối thích cho enzyme trích ly từ vi khuẩn từ 700C - 750C (Công Nghệ Enzyme – Nguyễn Đức Lượng). Hình 10: Đồ thị biểu diễn sự thay đổi độ brix theo thời gian thủy phân ở nhiệt độ 650C Ở các nhiệt độ 700C và 750C cũng tuân theo qui luật như ở nhiệt độ 650C Từ đồ thị thấy rõ sự khác biệt của nồng độ ảnh hưởng đến khả năng thủy phân của enzyme. Khi nồng độ tăng thì độ brix đạt được cũng tăng vì nồng độ enzyme tăng thì cơ hội tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất sẽ tăng nên tốc độ thủy phân cũng tăng. Bảng 6: Kết quả thống kê ảnh hưởng của nồng độ đến độ Brix đạt được cuối quá trình thủy phân của enzyme α-amylase có nguồn gốc từ vi khuẩn Bacillus Nồng độ Độ Brix 0,5ml/50g 17,78c 1,5ml/50g 18,09b 2,5ml/50g 18,24a Chú thích: Số liệu trong bảng là giá trị trung bình của 2 lần lặp lại. Các giá trị trung bình có cùng chữ thì khác biệt không ý nghĩa, mức độ ý nghĩa 5%. Theo kết quả bảng 6, 2,5ml/50g cho độ brix cao nhất và khác biệt có ý nghĩa. 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 2 0 0 10 20 30 40 50 60 Thời gian (phút) Đ ộ Br ix 0,5m l 1,5ml 2,5m l 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 0 10 20 30 40 50 60 Thời gian (phút) Đ ộ Br ix 0,5ml 1,5ml 2,5ml pH 5 pH 5,5 pH 6 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 0 10 20 30 40 50 60 Thời gian (phút) Đ ộ Br ix 0,5ml 1,5ml 2,5ml Luận văn Tốt nghiệp khóa 28-2007 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm-Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 26 Hình 11: Đồ thị biểu diễn sự thay đổi độ brix theo thời gian thủy phân ở nồng độ 2,5ml/50g Ở các nồng độ 0,5ml/50g và 1,5ml/50g cũng tuân theo qui luật như ở nồng độ 0,5m/50g. Từ đồ thị cho thấy pH ảnh hưởng rõ rệt đến khả năng thủy phân của enzyme. Ở thời gian đầu, pH ảnh hưởng rõ do nồng độ cơ chất nhiều enzyme có điều kiện hoạt động tốt nên chúng thể hiện hoạt tính rõ hơn, càng về sau nồng độ cơ chất càng ít nên hoạt động của enzyme bị hạn chế vì khả năng tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất giảm. Bảng 7: Kết quả thống kê ảnh hưởng của pH đến độ Brix đạt được cuối quá trình thủy phân của enzyme α-amylase có nguồn gốc từ vi khuẩn Bacillus pH Độ Brix 5 18,03ab 5,5 18,16a 6 17,92b Chú thích: Số liệu trong bảng là giá trị trung bình của 2 lần lặp lại. Các giá trị trung bình có cùng chữ thì khác biệt không ý nghĩa, mức độ ý nghĩa 5%. Kết quả trên cho thấy pH tốt nhất cho enzyme hoạt động là 5,5. Giữa pH 5,5 và pH 5 thì không có sự khác biệt nhưng giữa 5,5 và 6 thì có sự khác biệt ý nghĩa. Ở pH 6 khả năng thủy phân của enzyme thấp hơn ở pH 5,5. Khoảng pH này phù hợp với điều kiện pH tối ưu của enzyme amylase từ Bacillus (pH tối ưu: 5,5 – 6) (Công Nghệ Enzyme – Nguyễn Đức Lượng). Kêt quả bảng 7 cho thấy lượng đường sinh ra ở giai đoạn cuối không có sự khác biệt ở các pH. 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 0 10 20 30 40 50 60 Thời gian (phút) Đ ộ Br ix pH 5 pH 5,5 pH 6 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 2 0 0 10 20 30 40 50 60 Thời gian (phút) Đ ộ Br ix pH 5 pH 5,5 pH 6 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 2 0 0 10 20 30 40 50 60 Thời gian (phút) Đ ộ Br ix pH 5 pH 5,5 pH 6 Nhiệt độ 650C Nhiệt độ 750C Nhiệt độ 700C Luận văn Tốt nghiệp khóa 28-2007 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm-Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 27 17 17.2 17.4 17.6 17.8 18 18.2 5 5.5 6 pH Đ ộ B ri x 65oC 70oC 75oC 17.5 17.6 17.7 17.8 17.9 18 18.1 18.2 18.3 18.4 18.5 5 5.5 6 pH Đ ộ Br ix 65oC 70oC 75oC 17.4 17.6 17.8 18 18.2 18.4 18.6 18.8 5 5.5 6 pH Đ ộ B ri x 65oC 70oC 75oC Hình 12: Độ brix của dịch thủy phân khi sử dụng enzyme nồng độ 0,5ml/50g Hình 13: Độ brix của dịch thủy phân khi sử dụng enzyme nồng độ 1,5ml/50g Hình 14: Độ brix của dịch thủy phân khi sử dụng enzyme nồng độ 2,5ml/50g Luận văn Tốt nghiệp khóa 28-2007 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm-Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 28 Phương trình : -25.3778 + 0.336667*x + 11.4*y - 0.00133333*x*x -0.933333*y*y - 0.02*y*x R2 = 80% Hình 15: Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến độ Brix đạt được sau quá trình thủy phân tinh bột ở nồng độ 2,5ml/50g trong không gian Qua các hình 12, 13, 14, 15 cho thấy mối quan hệ giữa nhiệt độ và pH ảnh hưởng đến khả năng thủy phân của enzyme. Mỗi pH sẽ có một nhiệt độ thích hợp riêng cho enzyme hoạt động. Điều này cũng phù hợp với lý thuyết nói rằng ứng với mỗi nhiệt độ và nồng độ thì có một giá trị pH tối thích cho enzyme hoạt động (Công Nghệ Enzyme - Nguyễn Đức Lượng). Từ hình 7, có thể xác định được mối quan hệ giữa độ brix sau cùng của quá trình thủy phân tinh bột theo nhiệt độ, pH, và nồng độ. Nhiet do pH D o B rix 65 67 69 71 73 75 5 5,2 5,4 5,6 5,8 6 17,8 18 18,2 18,4 18,6 18,8 19 Nhiet do pH Do Brix 17,8 17,9 18,0 18,1 18,2 18,3 18,4 18,5 18,6 18,7 65 67 69 71 73 75 5 5,2 5,4 5,6 5,8 6 Luận văn Tốt nghiệp khóa 28-2007 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm-Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 29 4.2.2 Kết quả ảnh hưởng của nhiệt độ, pH, nồng độ enzyme đến khả năng thủy phân của enzyme glucoamylase có nguồn gốc từ nấm mốc Aspergillus và vi khuẩn Bacillus. Hình 16: Đồ thị biểu diễn sự thay đổi độ brix theo thời gian thủy phân ở nồng độ 0,5ml/50g Ở các nồng độ còn lại cũng tuân theo qui luật như ở nồng độ 0,5m/50g. Giống như đồ thị hình 4.1, nhiệt độ cũng ảnh hưởng đến khả năng thủy phân của enzyme. Khi nhiệt độ tăng thì khả năng thủy phân của enzyme sẽ tăng. Thời gian đầu tăng nhanh là do nồng độ cơ chất còn nhiều sau đó nồng độ cơ chất giảm nên độ brix cũng tăng chậm lại. Giữa 3 mốc nhiệt độ có sự khác biệt rõ hơn so với enzyme α-amylase. Bảng 8: Kết quả thống kê ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ Brix đạt được cuối quá trình thủy phân của enzyme glucoamylase từ Aspergillus và Bacillus Nhiệt độ Độ Brix 600C 17,34c 650C 17,69b 700C 18,02a Chú thích: Số liệu trong bảng là giá trị trung bình của 2 lần lặp lại. Các giá trị trung bình có cùng chữ thì khác biệt không ý nghĩa, mức độ ý nghĩa 5%. Kết quả thống kê cho thấy được nhiệt độ thích hợp cho enzyme thủy phân là 700C vì tại nhiệt độ này độ brix sau khi thủy phân cao hơn so với 600C, 650C. So với enzyme α- amylase thì nhiệt độ thích hợp cho enzyme glucoamylase thủy phân thấp hơn vì nguồn gốc của enzyme glucoamylase từ nấm mốc Aspergillus nên khả năng chịu nhiệt của 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 0 10 20 30 40 50 60 Thời gian (phút) Đ ộ Br ix 60o C 65o C 70o C 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 0 10 20 30 40 50 60 Thời gian (phút) Đ ộ Br ix 60o C 65o C 70o C 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 0 10 20 30 40 50 60 Thời gian (phút) Đ ộ Br ix 60o C 65o C 70o C pH 3,5 pH 4 pH 4,5 Luận văn Tốt nghiệp khóa 28-2007 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm-Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 30 enzyme cũng thấp hơn so với enzyme α-amylase được từ vi khuẩn Bacillus (Công Nghệ Enzyme - Nguyễn Đức Lượng). Hình 17: Đồ thị biểu diễn sự thay đổi độ brix theo thời gian thủy phân ở nhiệt độ 600C Ở các mốc nhiệt độ còn lại cũng tương tự như ở nhiệt độ 600C. Nhìn vào đồ thị thấy rõ sự khác biệt về nồng độ ảnh hưởng đến tốc độ thủy phân của enzyme cũng như độ brix đạt được sau quá trình thủy phân. Nồng độ càng cao thì tốc độ thủy phân càng tăng, tuy nhiên không phải tăng nồng độ càng cao thì tốc độ thủy phân càng cao mà tốc độ thủy phân tăng có giới hạn khi nồng độ enzyme tăng. Khi tăng nồng độ enzyme tốc độ thủy phân tăng vì lúc đầu nồng độ cơ chất nhiều nên nồng độ enzyme quyết định tốc độ thủy phân, nồng độ enzyme càng cao thì tốc độ thủy phân càng cao. Tuy nhiên khi nồng độ cơ chất giảm thì lúc này tốc độ thủy phân phụ thuộc vào nồng độ cơ chất vì vậy nếu có tăng nồng độ enzyme thì tốc độ thủy phân cũng không thay đổi đáng kể (Giáo trình sinh hóa - Bùi Hữu Thuận). Bảng 9: Kết quả thống kê ảnh hưởng của nồng độ đến độ Brix đạt được cuối quá trình thủy phân của enzyme glucoamylase từ Aspergillus và Bacillus Nồng độ Độ Brix 0,5ml 17,14b 1,5ml 17,89a 2,5ml 18,02a Chú thích: Số liệu trong bảng là giá trị trung bình của 2 lần lặp lại Các giá trị trung bình có cùng chữ thì khác biệt không ý nghĩa, mức độ ý nghĩa 5% 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 0 10 20 30 40 50 60 Thời gian Đ ộ Br ix 0,5ml 1,5ml 2,5ml 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 0 10 20 30 40 50 60 Thởi gian (phút) Đ ộ Br ix 0,5ml 1,5ml 2,5ml 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 0 10 20 30 40 50 60 Thời gian (phút) Đ ộ B rix 0,5ml 1,5ml 2,5ml pH 3,5 pH 4 pH 4,5 Luận văn Tốt nghiệp khóa 28-2007 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm-Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 31 Kết quả thống kê cho thấy không có sự khác biệt ở nồng độ 1,5ml/50g và 2,5ml/50g điều này chứng tỏ khi tăng nồng độ thì khả năng thủy phân của enzyme có tăng nhưng cũng dừng ở một mức giới hạn chứ không tăng mãi. Nồng độ thích hợp nhất để quá trình thủy phân đạt hiệu quả là 1,5ml/50g. Hình 18: Đồ thị biểu diễn sự thay đổi độ brix theo thời gian thủy phân ở nồng độ 1,5ml/50g Nồng độ 0,5ml/50g và 2,5ml/50g thì qui luật biến đổi cũng tương tự ở 1,5ml/50g. Từ đồ thị cho thấy sự khác biệt về pH ảnh hưởng rõ đến tốc độ thủy phân ngay thời gian đầu không giống như ảnh hưởng của nhiệt độ và nồng độ. pH càng thấp thì khả năng thủy phân của enzyme càng mạnh. So với enzyme α-amylase được trích từ vi khuẩn Bacillus thì enzyme glucoamylase được trích ly từ nấm mốc Aspergillus có khoảng pH hoạt động thấp hơn. Điều này cũng đã được nhiều tác giả chứng minh rằng những enzyme glucoamylase được trích ly từ nấm mốc đều có tính acid và thích hợp hoạt động tốt ở vùng pH thấp (Công Nghệ Enzyme- Nguyễn Đức Lượng). Bảng 10: Kết quả thống kê ảnh hưởng của pH đến độ Brix đạt được cuối quá trình thủy phân của enzyme glucoamylase từ Aspergillus và Bacillus pH Độ Brix 3,5 17,93a 4 17,64b 4,5 17,48b Chú thích: Số liệu trong bảng là giá trị trung bình của 2 lần lặp lại Các giá trị trung bình có cùng chữ thì khác biệt không ý nghĩa, mức độ ý nghĩa 5% 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 2 0 0 10 20 30 40 50 60 Thời gian (phút) Đ ộ br ix pH 3,5 pH 4 pH 4,5 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 2 0 0 10 20 30 40 50 60 Thời gian (phút) Đ ộ Br ix pH 3,5 pH 4 pH 4,5 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 0 10 20 30 40 50 60 Thời gian (phút) Đ ộ Br ix pH 3,5 pH 4 pH 4,5 Nhiệt độ 600C Nhiệt độ 700C Nhiệt độ 650C Luận văn Tốt nghiệp khóa 28-2007 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm-Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 32 15.5 16 16.5 17 17.5 18 18.5 3.5 4 4.5 pH Đ ộ Br ix 60oC 65oC 70oC 17 17.2 17.4 17.6 17.8 18 18.2 18.4 18.6 3.5 4 4.5 pH Đ ộ B rix 60oC 65oC 70oC 16.8 17 17.2 17.4 17.6 17.8 18 18.2 18.4 18.6 18.8 3.5 4 4.5 pH Đ ộ B ri x 60oC 65oC 70oC Từ kết quả thống kê, pH thích hợp nhất cho enzyme hoạt động là 3,5. pH 4 và pH 4,5 thì khả năng thủy phân của enzyme không có sự khác biệt và thấp hơn ở pH 3,5. Hình 19: Độ brix của dịch thủy phân khi sử dụng enzyme nồng độ 0,5ml/50g Hình 20: Độ brix của dịch thủy phân khi sử dụng enzyme nồng độ 1,5ml/50g Hình 21: Độ brix của dịch thủy phân khi sử dụng enzyme nồng độ 2,5ml/50g Luận văn Tốt nghiệp khóa 28-2007 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm-Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 33 Phương trình: 40.1889 + 0.116667*y - 0.763333*x - 0.07*y*x + 0.00866667*x*x + 0.466667*y*y R2 = 75%. Hình 22: Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến độ Brix đạt được sau quá trình thủy phân tinh bột ở nồng độ 0,5ml/50g trong không gian Qua hình 19, 20, 21, 22 cho thấy được quan hệ giữa nhiệt độ, pH, và nồng độ ảnh hưởng đến khả năng thủy phân của enzyme. Ở nồng độ nhất định thì giữa nhiệt độ và pH có ảnh hưởng lẫn nhau. Chẳng hạn ở nồng độ 2,5ml thì tại pH 4 nhiệt độ thích hợp để enzyme hoạt động tốt nhất là 650C, nhưng tại pH 4,5 thì nhiệt độ thích hợp nhất là 700C. Điều đó chứng tỏ ứng với mỗi pH khác nhau thì có nhiệt độ tối thích khác nhau. Đồ thị không gian cho thấy mối tương quan giữa nhiệt độ và pH ảnh hưởng thế nào đến khả năng thủy phân của enzyme. Nhiet do pH D o B rix 60 62 64 66 68 70 3,5 3,7 3,9 4,1 4,3 4,5 16 16,4 16,8 17,2 17,6 18 18,4 18,8 Nhiet do pH Do Brix 16,48 16,72 16,96 17,2 17,44 17,68 17,92 18,16 18,4 60 62 64 66 68 70 3,5 3,7 3,9 4,1 4,3 4,5 Luận văn Tốt nghiệp khóa 28-2007 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm-Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 34 4.2.3 Kết quả ảnh hưởng của nhiệt độ, pH, nồng độ enzyme đến khả năng thủy phân của enzyme glucoamylase có nguồn gốc từ nấm mốc Aspergillus niger Hình 23: Đồ thị biểu diễn sự thay đổi độ brix theo thời gian thủy phân ở nồng độ 0,5ml/50g Với nồng độ 1,5ml/50g và 2,5ml/50g thì qui luật biến đổi cũng tương tự ở 0,5ml/50g. Qua đồ thị thấy rõ nhiệt độ ảnh hưởng đến quá trình thủy phân của enzyme. Khi tăng nhiệt độ thì tốc độ thủy phân có tăng nhưng không tăng mãi. Sở dĩ như vậy là do đối với những enzyme có nguồn gốc từ nấm mốc khi nhiệt độ tăng thì hoạt độ của enzyme sẽ bị giảm vì nhiệt độ tối thích của enzyme từ nấm mốc không cao (Công Nghệ Enzyme – Nguyễn Đức Lượng). Vì vậy, mặc dù nhiệt độ tăng thì khả năng thủy phân của enzyme tăng nhưng tăng có giới hạn và khi tăng nhiệt độ mãi thì enzyme sẽ bị vô hoạt. Bảng 11: Kết quả thống kê ảnh hưởng của nhiệt độ đễn đô Brix đạt được cuối quá trình thủy phân của enzyme glucoamylase có nguồn gốc từ Aspergillus niger Nhiệt độ Độ Brix 600C 16,56b 650C 16,68ab 700C 16,83a Chú thích: Số liệu trong bảng là giá trị trung bình của 2 lần lặp lại Các giá trị trung bình có cùng chữ thì khác biệt không ý nghĩa, mức độ ý nghĩa 5% 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 0 10 20 30 40 50 60 Thời gian (phút) Đ ộ Br ix 60o C 65o C 70o C 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 0 10 20 30 40 50 60 Thời gian (phút) Đ ộ Br ix 60o C 65o C 70o C 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 0 10 20 30 40 50 60 70 Thời gian (phút) Đ ộ Br ix 60o C 65o C 70o C pH 4 pH 4,5 pH 5 Luận văn Tốt nghiệp khóa 28-2007 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm-Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 35 Kết quả thống kê thấy rằng nhiệt độ thích hợp nhất cho enzyme glucoamylase có nguồn gốc từ nấm mốc Aspergillus niger hoạt động là 650C và 700C. Ở nhiệt độ này khả năng thủy phân của enzyme tốt hơn so với nhiệt độ khác. Hình 24: Đồ thị biểu diễn sự thay đổi độ brix theo thời gian thủy phân ở nhiệt độ 600C Ở mốc nhiệt độ 650C và 700C thì ảnh hưởng của nồng độ cũng tuân theo qui luật giống như ở nhiệt độ 600C. Từ đồ thị thấy nồng độ enzyme ảnh hưởng khá rõ đến quá trình thủy phân của enzyme. Nồng độ enzyme càng tăng thì tốc độ thủy phân sẽ tăng vì nồng độ tăng thì cơ hội tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất sẽ tăng. Sự khác biệt giữa nồng độ 1,5ml/50g và 2,5ml/50g không rõ bằng sự khác biệt giữa 0,5ml/50g và 1,5ml/50g. Điều này là do khi nồng độ tăng thì tốc độ thủy phân sẽ tăng nhưng sẽ tăng đến một mức nào đó rồi không tăng nữa cho dù có thêm nồng độ enzyme (Hóa Sinh Công Nghiệp). Bảng 12: Kết quả thống kê ảnh hưởng của nồng độ đến độ Brix đạt được cuối quá trình thủy phân của enzyme glucoamylase từ Aspergillus niger Nồng độ Độ Brix 0,5ml 16,0c 1,5ml 16,8b 2,5ml 17,29a Chú thích: Số liệu trong bảng là giá trị trung bình của 2 lần lặp lại Các giá trị trung bình có cùng chữ thì khác biệt không ý nghĩa, mức độ ý nghĩa 5% 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 0 10 20 30 40 50 60 Thời gian (phút) N hi ệt đ ộ 0,5ml 1,5ml 2,5ml 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 0 10 20 30 40 50 60 Thời gian (phút) Đ ộ Br ix 0,5ml 1,5ml 2,5ml 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 0 10 20 30 40 50 60 Thời gian (phút) Đ ộ Br ix 0,5ml 1,5ml 2,5ml pH 5 pH 4 pH 4,5 Luận văn Tốt nghiệp khóa 28-2007 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm-Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 36 Bảng thống kê cho thấy sự khác biệt về nồng độ ảnh hưởng đến khả năng thủy phân của enzyme và nồng độ thích hợp nhất cho enzyme hoạt động là 2,5ml. Hình 25: Đồ thị biểu diễn sự thay đổi độ brix theo thời gian thủy phân ở nồng độ 0,5ml/50g Ở các nồng độ 1,5ml/50g và 2,5ml/50g ảnh hưởng của pH đến khả năng thủy phân của enzyme cũng tương tự như ở nồng độ 0,5ml/50g. Từ đồ thị nhận thấy pH có ảnh hưởng đến khả năng thủy phân của enzyme vì nó ảnh hưởng đến mức độ ion hóa cơ chất, enzyme và ảnh hưởng đến độ bền của protein. Ở pH thấp thì enzyme hoạt động tốt. Khi pH tăng thì hoạt động của enzyme sẽ giảm vì enzyme glucoamylase được trích ly từ nấm mốc là những enzyme có tính acid nên chỉ thích hợp hoạt động ở vùng pH thấp: 3,5 – 5,5 và ở pH cao thì hoạt tính của enzyme giảm (Công Nghệ Enzyme – Nguyễn Đức Lượng). Bảng 13: Kết quả thống kê ảnh hưởng của pH đến độ Brix đạt được cuối quá trình thủy phân của enzyme glucoamylase từ Aspergillus niger pH Độ Brix 4 16,86a 4,5 16,93a 5 16,30b Chú thích: Số liệu trong bảng là giá trị trung bình của 2 lần lặp lại Các giá trị trung bình có cùng chữ thì khác biệt không ý nghĩa, mức độ ý nghĩa 5% 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 0 10 20 30 40 50 60 Thời gian Đ ộ Br ix pH 4 pH 4,5 pH 5 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 0 10 20 30 40 50 60 Thời gian (phút) Đ ộ Br ix pH 4 pH 4,5 pH 5 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 0 10 20 30 40 50 60 Thời gian (phút) Đ ộ Br ix pH 4 pH 4,5 pH 5 Nhiệt độ 600C Nhiệt độ 650C Nhiệt độ 700C Luận văn Tốt nghiệp khóa 28-2007 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm-Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 37 14.6 14.8 15 15.2 15.4 15.6 15.8 16 16.2 16.4 16.6 4 4.5 5 pH Đ ộ B ri x 60oC 65oC 70oC 15.6 15.8 16 16.2 16.4 16.6 16.8 17 17.2 17.4 17.6 4 4.5 5 pH Đ ộ B ri x 60oC 65oC 70oC 16 16.2 16.4 16.6 16.8 17 17.2 17.4 17.6 17.8 18 4 4.5 5 pH Đ ộ B ri x 60oC 65oC 70oC Qua kết quả thống kê thì pH 4 và pH 4,5 thì enzyme hoạt động tốt nhất và không có sự khác biệt. Khi pH tăng thì khả năng thủy phân của enzyme giảm. Vì lý thuyết đã chứng minh ở pH tối thích thì enzyme hoạt động tốt, khi tăng hoặc giảm so với pH tối thích thì khả năng thủy phân của enzyme sẽ giảm. Hình 26: Độ brix của dịch thủy phân khi sử dụng enzyme nồng độ 0,5ml/50g Hình 27: Độ brix của dịch thủy phân khi sử dụng enzyme nồng độ 1,5ml/50g Hình 28: Độ brix của dịch thủy phân khi sử dụng enzyme nồng độ 2,5ml/50g Luận văn Tốt nghiệp khóa 28-2007 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm-Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 38 Phương trình: -33.4583 + 18.05*y + 0.31*x - 2.0*y*y -0.002*x*x - 0.01*y*x. R2 = 66% Hình 29: Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến độ Brix đạt được sau quá trình thủy phân tinh bột ở nồng độ 0,5ml/50g trong không gian Qua 3 hình 26, 27, 28 ta thấy được mối quan hệ giữa nhiệt độ, pH, nồng độ enzyme ảnh hưởng đến khả năng thủy phân của enzyme. Từ đồ thị không gian cho thấy mối quan hệ giữa nhiệt độ và pH ảnh hưởng đến khả năng thủy phân của enzyme và cũng từ đây có thể xác định được quan hệ giữa độ brix đạt được sau quá trình thủy phân và nhiệt độ , pH, nồng độ. 4.3 So sánh khả năng thủy phân của loại enzyme để ứng dụng cho quá trình lên men Sử dụng enzyme để thủy phân nếp than trong điều kiện tối thích, tiến hành đo khối lượng dịch sau khi lọc và xác định lượng đường còn lại trong bã được kết quả ở bảng sau. Nhiet do pH D o B rix 60 62 64 66 68 70 4 4,2 4,4 4,6 4,816 16,3 16,6 16,9 17,2 17,5 Nhiet do pH Do Brix 16,0 16,15 16,3 16,45 16,6 16,75 16,9 17,05 17,2 17,35 17,560 62 64 66 68 70 4 4,2 4,4 4,6 4,8 5 Luận văn Tốt nghiệp khóa 28-2007 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm-Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 39 0 5 10 15 20 25 1 2 3 Loại enzyme Đ ơn v ị g a m Hàm lượng chất tan Hàm lượng đường trong bã Bảng 14: So sánh khả năng thủy phân của enzyme Loại enzyme Brix (%) Khối lượng dung dịch (g) Hàm lượng chất tan (g) Hàm lượng đường trong bã (%) Khối lượng bã (g) Khối lượng đường trong bã (g) α-amylase từ Bacillus 18 107,6 19,36 51,7 13,4 6,92 Glucoamylase từ Aspergillus và Bacillus 18 94,7 17,05 48,1 16,1 7,74 Glucoamylase từ Aspergillus niger 17 97,8 16,63 53,4 18,2 9,71 Từ kết quả cho thấy enzyme α-amylase trích ly từ vi khuẩn Bacillus thủy phân nếp thu được hàm lượng chất tan nhiều nhất, kế đến là enzyme glucoamylase từ Aspergillus và Bacillus và sau cùng là enzyme glucoamylase từ Aspergillus niger. Như vậy, khả năng thủy phân nếp than của enzyme trích ly từ vi khuẩn mạnh hơn so với trích ly từ nấm mốc. Kiểm tra khối lượng đường còn lại trong bã thấy rằng khi sử dụng enzyme trích ly từ vi khuẩn bacillus thì lượng đường còn lại trong bã thấp hơn so với sử dụng enzyme từ nấm mốc Aspergillus niger và enzyme từ hỗn hợp Aspergillus và Bacillus. Điều này cũng phù hợp vì trong dịch thủy phân lọc được chứa lượng chất tan nhiều hơn thì trong bã phải chứa hàm lượng đường. Hình 30: Đồ thị hàm lượng chất tan thu được trong dịch lọc và hàm lượng đường trong bã của enzyme từ nguồn khác nhau Qua đồ thị ta thấy rõ sự khác nhau về khả năng thủy phân nếp than của enzyme có nguồn gốc khác nhau và từ kết quả đó ta tính được hiệu suất của quá trình thủy phân ứng với mỗi loại enzyme ở bảng sau. Aspergillus và Bacillus Aspergillus niger Bacillus Luận văn Tốt nghiệp khóa 28-2007 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm-Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 40 Bảng 15: Hiệu suất thủy phân của các loại enzyme Loại enzyme Hiệu suất thủy phân (%) α-amylase từ Bacillus 73,67 Glucoamylase từ Aspergillus và Bacillus 67,55 Glucoamylase từ Aspergillus niger 63,14 Kết quả trên cho thấy được khi sử dụng enzyme α-amylase trích ly từ Bacillus thì hiệu suất của quá trình thủy phân sẽ cao hơn so với enzyme còn lại. Tóm lại, khi sử dụng enzyme α-amylase trích ly từ Bacillus thì hàm lượng chất tan thu được và hiệu suất thủy phân cao. Tuy nhiên về mặt ứng dụng dịch lọc thu được cho quá trình lên men để sản xuất rượu thì gặp vấn đề khó khăn do enzyme này không thủy phân cho ra được nhiều đường glucose để nấm men sử dụng, mà sản phẩm thủy phân chủ yếu của nó là dextrin. Còn đối với hai loại enzyme còn lại trên mặt dù hiệu suất thủy phân không bằng nhưng nó lại được ứng dụng nhiều trong quá trình lên men rượu vì sản phẩm thủy phân của nó chủ yếu là glucose thích hợp cho quá trình lên men. Vì vậy, việc kết hợp các loại enzyme này với nhau để ứng dụng cho quá trình lên men là vấn đề cần nghiên cứu. Luận văn Tốt nghiệp khóa 28-2007 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm-Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 41 CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Qua thời gian tiến hành thí nghiệm, tổng hợp kết quả thu nhận được chúng tôi có một số kết luận như sau: - Nồng độ tối ưu đối với enzyme amylase từ Bacillus, từ Aspergillus niger là 2,5ml/50g còn đối với nguồn từ hỗn hợp vi khuẩn Bacillus và nấm mốc Aspergillus là 1,5ml/50g. - Nhiệt độ thủy phân tối ưu đối với enzyme từ Aspergillus niger, từ Bacillus và Aspergillus là 700C còn đối với enzyme có nguồn gốc từ vi khuẩn Bacillus thì nhiệt độ tối ưu là 700C và 750C. - pH thích hợp cho phản ứng thủy phân tinh bột của enzyme từ Bacillus pH 5,5; từ Bacillus và Aspergillus là pH 3,5 còn đối với enzyme có nguồn gốc từ Aspergillus niger là pH 5,5. - Từ các thông số tối ưu đã khảo sát trên enzyme từ 3 nguồn khác nhau, tiến hành thí nghiệm ở các điều kiện tối thích của enzyme, nhận thấy khả năng thủy phân nếp than của enzyme có nguồn gốc từ vi khuẩn Bacillus đạt được hiệu suất cao hơn. 5.2 Đề nghị Qua thời gian nghiên cứu và tiến hành thí nghiệm, do thời gian có hạn nên chúng tôi chưa phân tích được hàm lượng glucose có trong chất tan thu được. Do vậy, chúng tôi có một số ý kiến sau: - Tiến hành xác định hàm lượng đường glucose có trong chất tan để xem với lượng đường có trong dịch thủy phân như thế có đủ để cho nấm men phát triển và tạo ra rượu không. - Khảo sát khả năng thủy phân nếp than khi kết hợp giữa hai enzyme α-amylase từ Bacillus và glucoamylase từ Aspergillus niger. Luận văn Tốt nghiệp khóa 28-2007 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm-Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO Bùi thị Huỳnh Hoa (2004), Bài giảng Công nghệ sản xuất rượu bia và nước giải khát, ĐHCT. Nguyễn Đức Lượng (2003), Công nghệ vi sinh (tập 3), NXB Đại Học Quốc Gia TP. HCM. Lê Ngọc Tú (2003), Hóa học thực phẩm, NXB Khoa học và kỹ thuật Hà Nội. Nguyễn Đức Lượng (2003), Công nghệ enzyme, NXB Đại Học Quốc Gia TP. HCM. Nguyễn Thanh Hằng và Nguyễn Đình Thưởng (2002), Công nghệ sản xuất và kiểm tra cồn etylic, NXB khoa học kỹ thuật. Phạm Thu Cúc (2002), Giáo trình sinh hóa tập 1, Tủ sách Đại Học Cần Thơ. Bùi Hữu Thuận (2002), Giáo trình sinh hóa, Tủ sách Đại Học Cần Thơ. Trịnh Thị An Giang (2006), Khảo sát hoạt tính enzyme amylase trích ly từ mầm lúa và so sánh với enzyme thương mại, Luận văn tốt nghiệp, Thư viện Đại Học Cần Thơ. Luận văn Tốt nghiệp khóa 28-2007 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm-Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng ix PHỤ LỤC PHỤ LỤC A: CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 1. Phân tích độ ẩm Phương pháp phân tích: Dùng phương pháp sấy ở 105 0C đến khối lượng không đổi. Đầu tiên cốc nhôm rửa sạch, sấy ở tủ sấy đến khi khối lượng không đổi, cân và xác định cốc. Cho phần thịt quả bưởi đã làm nhỏ thật đều vào cốc đem sấy và xác định khối lượng của nguyên liệu ban đầu (W1), khối lượng bưởi sau khi sấy đến khối lượng không đổi (W2). Tính độ ẩm của nguyên liệu theo công thức: (%)100 1 21 x W WWW −= 2. Xác định tổng chất khô hòa tan Xác định chất khô hòa tan ta dùng chiết quang kế. Sau khi đã tách bỏ vỏ, hạt thì ta đem phần thịt quả đi ép lấy nước. Ta lấy dịch quả nhỏ một giọt lên chiết quang kế rồi đọc kết quả. 3. Xác định độ pH: Bưởi được ép lấy dịch quả và đem xác định pH bằng pH kế. 4. Xác định hàm lượng đường trong thực phẩm theo phương pháp Bertrand *Nguyên tắc Trong môi trường kiềm các đường khử (glucose, fructose, maltose,) dễ dàng khử đồng II thành đồng I theo phản ứng Fehling. Kết tủa đồng I oxit có màu đỏ gạch, lượng Cu2O tương ứng với lượng glucid khử oxy. Phương trình phản ứng: R-CHO + Cu(OH)2 = R-COOH + Cu2O + H2O Căn cứ vào lượng đường khử đủ để tác dụng 10ml hổn hợp Fehling A và B, cho màu đỏ gạch bền vững, tra bảng tính hàm lượng đường cần phân tích. *Hóa chất xác định 1. NaOH 30%, 10%, 1N 2. Pb(CH3COO)2 30% 3. Na2SO4 bão hòa (30%) Luận văn Tốt nghiệp khóa 28-2007 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm-Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng x 4. Metyl xanh 1% trong nước 5. Fehling A: CuSO4 tinh thể 69.28g Nước cất đến 1000 ml 6. Fehling B: Kalinatritartrate 346g NaOH 100g Nước cất đến 1000 ml 7. Phenolphtalein 1% trong cồn *Tiến hành + Cân m gram mẫu cho vào cốc (tùy theo nồng độ đường trong mẫu, đường nhiều cân khối lượng mẫu ít, đường ít cân khối lượng mẫu nhiều). + Thêm vào trong đó 50 ml nước cất và 5 ml HCl đậm đặc, thủy phân dung dịch trong thời gian 7 phút ở 68 – 700 C. + Sau khi thủy phân làm lạnh ngay, trung hòa bằng NaOH với nồng độ giảm dần 30%, 10%, 1N. + Khử tạp chất bằng 7 ml Pb(CH3COO)2 30%. Để yên 5 phút đến khi thấy xuất hiện một lớp chất lỏng trong suốt bên trên lớp cặn thì coi như dã khử tạp chất xong. + Kết tủa muối chì dư (loại bỏ) bằng 18 – 20 ml Na2SO4. + Lọc pha loãng khi sử dụng. Tùy hàm lượng đường trong thực phẩm mà ta có hệ số pha loãng (HSPL) khác nhau. Ví dụ: hàm lượng đường 60%, cân 1g pha loãng 2 – 3 lần. + Cho vào becher 5ml Fehling A + 5ml Fehling B + 15ml dịch lọc pha loãng. Đem đốt trên bếp và chuẩn độ. Mỗi lần chuẩn nhỏ 1ml dung dịch chuẩn đến màu đỏ gạch không còn ánh xanh. Thử lại bằng cách nhỏ một giọt metyl xanh vào dung dịch đang sôi, thấy mất màu xanh trở về màu đỏ gạch. Đọc kết quả và tra bảng tính ra hàm lượng đường. Luận văn Tốt nghiệp khóa 28-2007 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm-Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng xi Bảng: Bảng tra tỉ lệ đường nghịch chuyển ml dd đường yêu cầu mg đường nghịch chuyển ml dd đường yêu cầu mg đường nghịch chuyển ml dd đường yêu cầu mg đường nghịch chuyển ml dd đường yêu cầu mg đường nghịch chuyển 15 16 17 18 19 20 21 22 23 336 316 298 282 267 254.5 242.9 231.8 222.2 24 25 26 27 28 29 30 31 32 213.3 204.8 197.4 190.4 183.7 177.6 171.7 166.3 161.2 33 34 35 36 37 38 39 40 41 156.06 152.2 147.09 143.9 140.2 136.6 133.3 130.1 127.1 42 43 44 45 46 47 48 49 50 124.2 121.4 118.7 116.1 113.7 111.4 109.2 107.1 105.1 Công thức tính toán: Hàm lượng đường = (%) Số tra bảng*HSPL*100 Khối lượng mẫu*1000 Luận văn Tốt nghiệp khóa 28-2007 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm-Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng xii PHỤ LỤC B: KẾT QUẢ XỬ LÝ THEO PHẦN MỀM STATGRAPHICS 4.0 1. Kết quả ANOVA về ảnh hưởng của nhiệt độ, pH, nồng độ đến khả năng thủy phân của enzyme α-amylase có nguồn gốc từ Bacillus Analysis of Variance for Brix - Type III Sums of Squares ------------------------------------------------------------------- Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value ------------------------------------------------------------------- MAIN EFFECTS A:NHIET DO 0,943704 2 0,471852 10,37 0,0002 B:NONG DO 2,03259 2 1,0163 22,33 0,0000 C:PH 0,49037 2 0,245185 5,39 0,0078 RESIDUAL 2,13926 47 0,0455162 ------------------------------------------------------------------- TOTAL(CORRECTED) 5,60593 53 ------------------------------------------------------------------- All F-ratios are based on the residual mean square error. Multiple Range Tests for Brix by NHIET DO ------------------------------------------------------------------- Method: 95,0 percent LSD NHIET DO Count LS Mean Homogeneous Groups ------------------------------------------------------------------- 65 18 17,8667 X 70 18 18,0556 X 75 18 18,1889 X ------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits ------------------------------------------------------------------- 65 - 70 *-0,188889 0,143065 65 - 75 *-0,322222 0,143065 70 - 75 -0,133333 0,143065 ------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. Multiple Range Tests for Brix by NONG DO ------------------------------------------------------------------- Method: 95,0 percent LSD NONG DO Count LS Mean Homogeneous Groups ------------------------------------------------------------------- 0,5 18 17,7778 X 1,5 18 18,0889 X 2,5 18 18,2444 X ------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits ------------------------------------------------------------------- 0,5 - 1,5 *-0,311111 0,143065 0,5 - 2,5 *-0,466667 0,143065 1,5 - 2,5 *-0,155556 0,143065 ------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. Luận văn Tốt nghiệp khóa 28-2007 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm-Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng xiii Multiple Range Tests for Brix by PH ------------------------------------------------------------------- Method: 95,0 percent LSD PH Count LS Mean Homogeneous Groups ------------------------------------------------------------------- 6 18 17,9222 X 5 18 18,0333 XX 5,5 18 18,1556 X ------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits ------------------------------------------------------------------- 5 - 5,5 -0,122222 0,143065 5 - 6 0,111111 0,143065 5,5 - 6 *0,233333 0,143065 ------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. 2. Kết quả ANOVA về ảnh hưởng của nhiệt độ, pH, nồng độ đến khả năng thủy phân của enzyme glucoamylase có nguồn gốc từ Aspergillus và Bacillus Analysis of Variance for Brix - Type III Sums of Squares ------------------------------------------------------------------- Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value ------------------------------------------------------------------- MAIN EFFECTS A:NHIET DO 4,13481 2 2,06741 19,18 0,0000 B:NONG DO 8,05481 2 4,02741 37,36 0,0000 C:PH 1,91259 2 0,956296 8,87 0,0005 RESIDUAL 5,06593 47 0,107786 ------------------------------------------------------------------- TOTAL(CORRECTED)19,1681 53 ------------------------------------------------------------------- All F-ratios are based on the residual mean square error. Multiple Range Tests for Brix by NHIET DO ------------------------------------------------------------------- Method: 95,0 percent LSD NHIET DO Count LS Mean Homogeneous Groups ------------------------------------------------------------------- 60 18 17,3444 X 65 18 17,6889 X 70 18 18,0222 X ------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits ------------------------------------------------------------------- 60 - 65 *-0,344444 0,220157 60 - 70 *-0,677778 0,220157 65 - 70 *-0,333333 0,220157 ------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. Luận văn Tốt nghiệp khóa 28-2007 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm-Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng xiv Multiple Range Tests for Brix by NONG DO ------------------------------------------------------------------- Method: 95,0 percent LSD NONG DO Count LS Mean Homogeneous Groups ------------------------------------------------------------------- 0,5 18 17,1444 X 1,5 18 17,8889 X 2,5 18 18,0222 X ------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits ------------------------------------------------------------------- 0,5 - 1,5 *-0,744444 0,220157 0,5 - 2,5 *-0,877778 0,220157 1,5 - 2,5 -0,133333 0,220157 ------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. Multiple Range Tests for Brix by PH ------------------------------------------------------------------- Method: 95,0 percent LSD PH Count LS Mean Homogeneous Groups ------------------------------------------------------------------- 4,5 18 17,4778 X 4 18 17,6444 X 3,5 18 17,9333 X ------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits ------------------------------------------------------------------- 3,5 - 4 *0,288889 0,220157 3,5 - 4,5 *0,455556 0,220157 4 - 4,5 0,166667 0,220157 ------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. 3. Kết quả ANOVA về ảnh hưởng của nhiệt độ, pH, nồng độ đến khả năng thủy phân của enzyme glucoamylase có nguồn gốc từ Aspergillus niger Analysis of Variance for Brix - Type III Sums of Squares ------------------------------------------------------------------- Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value ------------------------------------------------------------------- MAIN EFFECTS A:NHIET DO 0,597037 2 0,298519 3,57 0,0359 B:NONG DO 15,2415 2 7,62074 91,23 0,0000 C:PH 4,29481 2 2,14741 25,71 0,0000 RESIDUAL 3,92593 47 0,0835303 ------------------------------------------------------------------- TOTAL(CORRECTED)24,0593 53 ------------------------------------------------------------------- All F-ratios are based on the residual mean square error. Luận văn Tốt nghiệp khóa 28-2007 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm-Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng xv Multiple Range Tests for Brix by NHIET DO ------------------------------------------------------------------- Method: 95,0 percent LSD NHIET DO Count LS Mean Homogeneous Groups ------------------------------------------------------------------- 60 18 16,5778 X 65 18 16,6778 XX 70 18 16,8333 X ------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits ------------------------------------------------------------------- 60 - 65 -0,1 0,193809 60 - 70 *-0,255556 0,193809 65 - 70 -0,155556 0,193809 ------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. Multiple Range Tests for Brix by NONG DO ------------------------------------------------------------------- Method: 95,0 percent LSD NONG DO Count LS Mean Homogeneous Groups ------------------------------------------------------------------- 0,5 18 16,0 X 1,5 18 16,8 X 2,5 18 17,2889 X ------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits ------------------------------------------------------------------- 0,5 - 1,5 *-0,8 0,193809 0,5 - 2,5 *-1,28889 0,193809 1,5 - 2,5 *-0,488889 0,193809 ------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. Multiple Range Tests for Brix by PH ------------------------------------------------------------------- Method: 95,0 percent LSD PH Count LS Mean Homogeneous Groups ------------------------------------------------------------------- 5 18 16,3 X 4 18 16,8556 X 4,5 18 16,9333 X ------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits ------------------------------------------------------------------- 4 - 4,5 -0,0777778 0,193809 4 - 5 *0,555556 0,193809 4,5 - 5 *0,633333 0,193809 ------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. Luận văn Tốt nghiệp khóa 28-2007 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm-Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng xvi