MỤC LỤC
CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ . 1
1.1 TỔNG QUAN 1
1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU . 1
CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2
2.1 GIỚI THIỆU VỀ CÂY DỨA . 2
2.2 GIỚI THIỆU VỀ ENZYME TRONG DỨA . 3
2.2.1 Sơ lược về hệ enzyme trong cây dứa . 3
2.2.2 Sơ lược về enzyme bromelain . 4
2.2.3 Cấu tạo và hoạt tính chung của enzyme bromelain 5
i. Cấu tạo . 5
ii. Hoạt tính enzyme bromelain . 6
2.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme bromelain 7
i. Ảnh hưởng của nhân tố nhiệt độ . 7
ii. Ảnh hưởng của nhân tố pH . 8
2.3 GIỚI THIỆU VỀ PHẢN ỨNG ENZYME . 9
2.3.1 Động hóa học của phản ứng cơ bản . 9
2.3.2 Động học phản ứng enzyme 10
2.4 GIỚI THIỆU SƠ LƯỢC VỀ CASEIN . 11
2.5 SƠ LƯỢC CÁC NGHIÊN CỨU VỀ ENZYME BROMELAIN . 12
2.6 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 13
CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15
3.1 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU . 15
3.1.1 Nguyên liệu 15
3.1.2 Hóa chất thí nghiệm 15
3.1.3 Thiết bị thí nghiệm 15
3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16
3.2.1 Phương pháp chuẩn bị mẫu và hóa chất nghiên cứu 16
3.2.2 Bố trí thí nghiệm . 17
CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ THẢO LUẬN . 20
4.1 Ảnh hưởng của thời gian bảo quản dịch chiết từ dứa chứa bromelain quả đến đặc
tính enzyme 20
4.2 Khảo sát ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên hoạt tính xúc tác phản ứng thủy phân
của enzyme bromelain quả trên cơ chất là casein 22
CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ . 26
5.1 Kết luận . 26
5.2 Đề nghị 26
TÀI LIỆU THAM KHẢO 27
PHỤ LỤC v
49 trang |
Chia sẻ: maiphuongtl | Lượt xem: 2052 | Lượt tải: 0
Bạn đang xem trước 20 trang tài liệu Luận văn Ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên hoạt tính xúc tác của enzyme bromelain trong quả dứa, để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
được chuyển hóa tiếp tục để tạo thành sản phẩm (P) và giải phóng enzyme.
Enzyme được giải phóng sẽ thực hiện phản ứng mới.
Theo Michealis – Menten, cơ chế xúc tác tổng quát của phản ứng có enzyme được trình
bày theo sơ đồ:
Trong đó: K1, K-1, K2, K-2 là những hằng số vận tốc của các phản ứng tương ứng.
K
-1 có giá trị nhỏ nhất.
Phản ứng chuyển hóa cơ chất thành sản phẩm là quan trọng nhất
K2 tỉ lệ với nồng độ ES: v = K2.[ES] (v: vận tốc phản ứng)
Khi nồng độ ES càng lớn, vận tốc phản ứng càng lớn (Nguyễn Đức Lượng, 2004)
Theo thuyết Mischaelis và Menten, cơ chế phản ứng có xúc tác của enzyme xảy ra qua
ba giai đoạn:
Giai đoạn một: enzyme (E) sẽ kết hợp với cơ chất (S) tại vị trí trung tâm hoạt
động của enzyme bằng các liên kết hóa học, tạo thành phức hệ enzyme cơ chất
(E-S). Ở giai đoạn này, các liên kết được hình thành thường là những liên kết
yếu nên phức hệ E – S thường không bền. Phản ứng tạo phức hệ này thường xảy
ra rất nhanh và cần có một ít năng lượng. Giữa E và S có năm loại liên kết tham
gia, mỗi loại có đặc tính riêng và năng lượng liên kết khác nhau, gồm liên kết
phối trí, liên kết hydro, liên kết ion, liên kết kỵ nước lực Vander-Waals và liên
kết do dịch chuyển điện tử.
Giai đoạn hai: khi tạo thành phức hệ E – S, dưới tác dụng của enzyme, cơ chất
sẽ bị thay đổi về cấu trúc không gian và mức độ bền vững của các liên kết bên
trong phân tử, dẫn tới sự kéo căng và phá vỡ các liên kết đồng hóa trị tham gia
ES E + P
K2
E + S ES E + P
K1
K
-1
K2
K
-2
Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ
Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 11
phản ứng. Sau đó xảy ra sự thay đổi mật độ điện tích của phức hợp E – S làm
biến dạng các liên kết giữa chúng, kết quả là cơ chất được hoạt hóa, dẽ dàng
tham gia phản ứng.
Giai đoạn ba: đây là giai đoạn cuối cùng, sản phẩm của quá trình phản ứng được
tạo thành, enzyme tách ra và trở về trạng tháng ban đầu, chuẩn bị kết hợp với
phân tử cơ chất khác. Quá trình phản ứng hoàn thành.
(citied by P. R. Mathewson, 1998)
2.4 GIỚI THIỆU SƠ LƯỢC VỀ CASEIN
Để xác định hoạt tính xúc tác của một loại enzyme, điều quan trọng nhất là lựa chọn cơ
chất và phương pháp đo hoạt tính phù hợp. Khả năng xúc tác của enzyme phụ thuộc rất
nhiều vào loại cơ chất. Đối tượng nghiên cứu ở đây là bromelain quả, cơ chất được
chọn là casein sữa (hoặc có thể là dạng muối caseinate).
Casein là protein chủ yếu có trong sữa, chiếm khoảng 80% protein của sữa. Casein là
một trong những protein có tính acid vì trong phân tử của chúng có chứa nhiều gốc acid
glutamic và acid aspartic. Các casein đều có điểm đẳng điện pI= 4,6. Casein không có
cấu trúc bậc ba và bốn nên không bị biến tính theo định nghĩa mà bị biến đổi phần lớn
do bị thủy phân bằng enzyme hoặc do xử lý nhiệt, khi đó các liên kết peptide bị cắt đứt
và hình thành những nitro phi protein (các mạch peptide ngắn, acid amine tự do, muối
amonium..). Các muối caseinate thì bền với nhiệt và tan trong nước tốt hơn. Casein
trong sữa gồm bốn dạng chính: α (s1) và α (s2)-casein, β-casein, κ-casein.
(Lê Văn Việt Mẫn, 2004)
α (s1)-casein: phân tử lượng khoảng 23000 Da, có 199 gốc acid amine. Do sự
phân bố các phần tích điện và các phần ưa béo không đồng đều nên các phân tử
loại này có tính chất lưỡng cực, 1 đầu ưa nước, 1 đầu kỵ nước.
α (s2)-casein: phân tử lượng khoảng 25000 Da, có 207 gốc acid amine, có tính
ưa nước cao nhất trong các loại casein do phân tử của nó chứa nhiều nhóm
phosphoryl và gốc cation nhất.
β-casein: phân tử lượng khoảng 24000 Da, có 209 gốc acid amine, có tính ưa
béo cao nhất. Dưới 40C, β-casein hoàn toàn bị khử trùng hợp do có nhiều tương
tác ưa béo bị phá hủy.
κ-casein: phân tử lượng khoảng 19000 Da, có 169 gốc acid amine. Loại này chỉ
chứa một gốc phosphoryl và cũng có tính lưỡng cực. Đầu amino của phân tử
protein thì ưa béo còn đầu carboxyl thì ưa nước.
Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ
Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 12
Casein trong sữa có nguồn gốc từ những chủng bò khác nhau thì có thể có cấu trúc bậc
một khác nhau. Tuy nhiên cấu trúc bậc một của cùng một loại casein chỉ khác nhau bởi
vài gốc acid amine trong phân tử protein của chúng (Lê Ngọc Tú, 2003).
Bảng 1: Thành phần các acid amine trong casein
Acid amine Tỉ lệ (%)
Glutamic Acid
Proline
Leucine
Lysine
Valine
Aspartic Acid
Serine
Tyrosine
Isoleucine
Phenylalanine
Threonine
Arginine
Histidine
Alanine
Methionine
Glycine
Tryptophan
Cystine
20,2 %
10,2 %
8,3 %
7,4 %
6,5 %
6,4 %
5,7 %
5,7 %
5,5 %
4,5 %
4,4 %
3,7 %
2,8 %
2,7 %
2,5 %
2,4 %
1,1 %
0,3 %
Nguồn: truy cập ngày: 16/12/2006
2.5 SƠ LƯỢC CÁC NGHIÊN CỨU VỀ ENZYME BROMELAIN
Shoshi et al. (1975) đã nghiên cứu về sự biến đổi về thành phần hóa học của bromelain
thân I-1 và bromelain quả A dưới sự tác động của 2-hydroxy-5-5-nitrobenzyl Bromide,
tetra nitromethane và H2O2. Kết quả nghiên cứu cho thấy, dưới tác động của các hợp
chất trên, enzyme bromelain bị biến đổi mạnh về cấu trúc, thành phần các acid amine
trong phân tử, trong khoảng pH và nhiệt độ nhất định.
(Nguồn: truy cập
ngày: 15/03/2007)
Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ
Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 13
Yamada, Takahashi và Murachi (1976), đã tinh chế và định tính được một loại protease
từ quả dứa, tên là bromelain quả FA2. Kết quả nghiên cứu cho thấy, sự biến đổi của
enzyme này sẽ sinh ra chuỗi amino acid cuối cùng là
Ala – Val – Pro – Gln – Ser – Ile – Asp – Trp – Arg – Asp – Tyr – Gly – Ala
Thành phần amino acid của FA2 không khác biệt nhiều so với bromelain thân, tuy
nhiên về cấu tạo FA2 có ít hơn về tổng lượng lysine và alanine so với glycine như
bromelain thân nên có thể kết luận FA2 không phải là một glucoprotein.
(Nguồn:
opt=Abstract, truy cập ngày: 12/03/2007)
Waliszewski và Corzo (2004) cũng đã nghiên cứu về ái lực xúc tác của enzyme
bromelain quả dạng thô trên những cơ chất protein khác nhau. Nghiên cứu đã thực hiện
với dịch quả dứa ở bốn mức độ chín khác nhau trên năm loai cơ chất gồm azocasein,
azoalbumine, hemoglobin, natricaseinate và casein. Sản phẩm tạo thành được xác định
bằng phương pháp quang phổ. Nghiên cứu đã đưa ra kết luận về khoảng pH và nhiệt độ
tối thích đối với hoạt tính xúc tác của bromelain quả trên từng loại cơ chất trên.
(Nguồn: truy cập ngày: 15/03/2007)
Bên cạnh đó, Andrew et al. (1990) cũng đã tiến hành nghiên cứu về nhóm các enzyme
cysteine proteinase của cây dứa và các nghiên cứu về ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên
hoạt tính xúc tác của bromelain quả, comosain và pinguinain trên các loại cơ chất tổng
hợp, sử dụng phương pháp quang phổ để xác định sản phẩm tạo thành. Một phần kết
quả nghiên cứu cho thấy trong thân dứa có tối thiểu bốn loại cysteine protease trong khi
trong quả dứa chỉ chứa 2 loại là bromelain thân và bromelain quả với bromelain quả là
chủ yếu. Với cơ chất tổng hợp, hoạt tính của các cysteine proteinase này là thể hiện
mạnh nhất.
Ở trong nước, Phạm Thị Trân Châu và cộng sự cũng nghiên cứu một số tính chất của
bromelain tách từ chồi dứa tây cho thấy trong chồi dứa, bromelain có hoạt tính cực đại
ở pH = 6,5 nhiệt độ tối thích là 600C.
Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ
Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 14
2.6 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
Nội dung nghiên cứu: khảo sát ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên hoạt tính xúc tác phản
ứng thủy phân của enzyme bromelain quả (thô) trên cơ chất là casein.
Phần thí nghiệm bao gồm các nội dung:
Trích ly dung dịch enzyme bromelain quả (thô) từ nguồn nguyên liệu dứa tươi,
giống dứa Queen (Ananas comosus), đạt độ chín 2 (chín 2-3 hàng mắt, thường
sử dụng trong chế biến các sản phẩm dứa_thực phẩm)
Khảo sát sự thay đổi các đặc tính của enzyme bromelain trong dịch chiết (tính
chất vật lý, hoạt tính thủy phân) theo thời gian bảo quản ở các điều kiện nhiệt độ
khác nhau.
Khảo sát ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên hoạt tính xúc tác phản ứng thủy
phân của enzyme bromelain quả (thô) trên cơ chất là casein và sau đó xác định
hoạt tính của enzyme bằng cách xác định nồng độ sản phẩm sinh ra từ phản ứng
thủy phân bằng phương pháp quang phổ. (áp dụng phương pháp Kunitz)
Từ cơ sở là quá trình nghiên cứu trên, xây dựng biểu đồ biểu diễn mối tương quan giữa
pH và nhiệt độ ảnh hưởng lên hoạt tính xúc tác phản ứng thủy phân của enzyme
bromelain quả trên cơ chất là casein.
Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ
Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 15
CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU
3.1.1 Địa điểm, thời gian nghiên cứu
Địa điểm thực hiện: phòng thí nghiệm Bộ môn Công Nghệ Thực Phẩm, khoa Nông
Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, Trường Đại Học Cần Thơ.
Thời gian thực hiện: Từ 12/3/2007 đến 28/5/2007.
3.1.2 Nguyên liệu
Dứa giống Queen, đạt độ chín 2 (chín 2-3 hàng mắt)
3.1.3 Hóa chất thí nghiệm
Casein – sodium caseinate, từ sữa bò (Sigma)
L - Cysteine hydrochlorid – monohydrate (Merck)
Trichloroacetic acid (TCA) (Trung Quốc)
Ethylene diamine tetraacetic acid disodium salt (EDTA) (Trung Quốc)
L - Tyrosine (C9H11NO3) (Merck)
Disodium hydro phosphate (Na2HPO4.12H2O), sodium dihydro phosphate
(NaH2PO4.2H2O) (Trung Quốc)
Acid hydrochlorid 0,1N
3.1.4 Thiết bị thí nghiệm
Máy ly tâm lạnh (Hattich centrifugen D-78532 Tuttlingen, 1999, Germany)
Thiết bị ủ nhiệt (Water Bath)
Máy đo quang phổ (Hitachi U-1500 Spectrophotometer)
Cuvette thạch anh
Máy đo pH (Thermo electron corporation)
Cân phân tích độ chính xác 0,0001; 0,01
Micropipette, pipette, nhiệt kế
Máy ép trái cây (Philip)
Tủ lạnh, tủ đông và một số dụng cụ khác
Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ
Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 16
3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.2.1 Phương pháp chuẩn bị mẫu và hóa chất nghiên cứu
i. Phương pháp trích ly enzyme bromelain quả (thô)
Dứa ở độ chín đã được lựa chọn, sau khi thu hái, tiến hành trích ly enzyme bromelain
theo phương pháp trích ly tổng quát cho các enzyme theo sơ đồ ở hình 6.
Hình 6: Sơ đồ quy trình trích ly enzyme bromelain quả (thô)
Nguồn: Nguyễn Đức Lượng, 2004
ii. Phương pháp xác định hoạt tính của enzyme bromelain
Sự thay đổi hoạt tính của enzyme bromelain trong quả khóm theo các điều kiện xử lý
khác nhau được tiến hành theo phản ứng thủy phân của enzyme bromelain trong dịch
quả trên cơ chất là casein (phương pháp Kunitz, xem phụ lục).
iii. Phương pháp chuẩn bị dung dịch casein 1%
Cơ chất casein sử dụng trong quá trình xác định hoạt tính của enzyme bromelain được
chuẩn bị theo sơ đồ ở hình 7.
Hình 7: Sơ đồ chuẩn bị dung dịch casein 1%
Casein (1 g)
100 ml dd đệm phosphate 0,05 M,
pH = 7,5
Đun cách thủy (85-900C, 1h)
Bảo quản (40C)
Dứa chín
Gọt vỏ, bỏ
mắt, cắt nhỏ
Ép lấy dịch quả
Lọc
(giấy lọc)
Ly tâm lạnh
(7000 vòng/phút,
40C)
Dịch chiết
chứa enzyme
bromelain quả
Bảo quản
Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ
Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 17
3.2.2 Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm 1: Khảo sát sự thay đổi các đặc tính của enzyme bromelain trong dịch
chiết (tính chất vật lý, hoạt tính thủy phân) theo thời gian bảo quản ở các điều kiện
nhiệt độ khác nhau.
Mục đích
Xác định điều kiện bảo quản thích hợp mà enzyme vẫn duy trì và ổn định hoạt tính.
Tiến hành thí nghiệm
Dung dịch enzyme sau khi trích ly sẽ được đưa vào bảo quản với 2 nhân tố
Nhân tố A: Nhiệt độ bảo quản
A1: Nhiệt độ lạnh 40C
A2: Nhiệt độ lạnh đông -30 0C
Nhân tố B: Thời gian bảo quản, thay đổi ở 10 mức độ:
B1: 1 ngày B2: 2 ngày B3: 3 ngày
B4: 4 ngày B5: 5 ngày B6: 6 ngày
B7: 8 ngày B8:10 ngày B9:12 ngày
B10:14 ngày
Mẫu chuẩn đối chứng là mẫu không bảo quản (mẫu vừa mới trích ly): B0
Ứng với mỗi nghiệm thức thời gian là một mẫu thử, lặp lại 2 lần.
Số mẫu thí nghiệm: (10 nghiệm thức + 1 mẫu đối chứng)* 2 lần lặp lại * 2 (điều kiện
bảo quản) = 44 mẫu
Thu nhận kết quả
Sau thời gian bảo quản, mẫu thí nghiệm được kiểm tra để xác định đặc tính vật lý (màu
sắc, độ kết lắng) và hoạt tính enzyme theo phương pháp Kunitz với cơ chất là casein,
điều kiện thí nghiệm: pH = 7,5; nhiệt độ = 370C.
Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên hoạt tính xúc tác phản
ứng thủy phân của enzyme bromelain quả(trong dịch quả dứa) trên cơ chất là casein
Mục đích
Tìm hiểu quy luật biến đổi hoạt tính của enzyme bromelain trong dịch quả dứa ở những
điều kiện tiền xử lý khác nhau.
Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ
Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 18
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 2 nhân tố:
Nhân tố C: pH môi trường
Với khoảng pH khảo sát từ 4,6 ÷ 9,5; chia làm 11 mức độ
C1: pH = 4,6 C2: pH = 5,6 C3: pH = 6,2
C4: pH = 6,5 C5: pH =6,8 C6: pH = 7,1
C7: pH = 7,5 C8: pH = 7,8 C9: pH = 8,4
C10: pH = 9,0 C11: pH = 9,5
Nhân tố D: Nhiệt độ môi trường
Với khoảng nhiệt độ khảo sát thay đổi từ 100C ÷ 700C; chia làm 13 mức độ
D1: 100C D2: 150C D3: 200C D4: 250C
D5: 300C D6: 350C D7: 400C D8: 450C
D9: 500C D10: 550C D11: 600C D12: 650C
D13: 700C
Ứng với mỗi nghiệm thức, thí nghiệm được lặp lại 2 lần.
Tổng số mẫu thí nghiệm: n x m = 11 x 13 x 2 (lần lặp lại) = 286 mẫu
Thí nghiệm được bố trí theo sơ đồ sau:
D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D8 D9 D10 D11 D12 D13
C1 C1 D1 C1 D2
C2 C2 D3
C3 C3 D4
C4 C4 D5
C5
C6
C7
C8
C9
C10
C11
Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ
Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 19
Tiến hành thí nghiệm
Khảo sát ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên hoạt tính xúc tác phản ứng thủy phân của
enzyme bromelain quả trên cơ chất là casein.
Các bước thực hiện dựa vào phương pháp Kunitz (phụ lục).
Ứng với mỗi giá trị khảo sát có thực hiện thêm 1 mẫu đối chứng kèm theo (hình 8).
Kết quả thí nghiệm
- Hoạt tính của enzyme bromelain còn lại trong mẫu ở các chế độ xử lý khác nhau,
được xác định theo mức độ thủy phân casein.
- Xác định sự tương tác của điều kiện pH môi trường và nhiệt độ xử lý đến sự thay
đổi hoạt tính của enzyme bromelain quả dứa.
Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ
Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 20
CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ THẢO LUẬN
4.1 ẢNH HƯỞNG CỦA THỜI GIAN BẢO QUẢN DỊCH CHIẾT DỨA CHỨA
ENZYME BROMELAIN QUẢ ĐẾN ĐẶC TÍNH ENZYME
Trong quá trình nghiên cứu về enzyme bromelain ở dạng còn tồn tại trong dung dịch
dứa tươi, bước đầu tiên là trích ly dung dịch dứa, loại bỏ các hợp chất màu và tạp chất.
Để đồng nhất mẫu, cần tiến hành trích ly một lượng lớn enzyme, sau đó đưa vào bảo
quản ở điều kiện tối ưu nhất mà không làm thay đổi lớn đến đặc tính enzyme trong
dung dịch. Vì vậy, vấn đề đặt ra là cần tiến hành khảo sát khả năng bảo quản enzyme
trong điều kiện nào là tốt nhất để hạn chế tối thiểu sự biến đổi của dung dịch enzyme.
Thí nghiệm tiến hành khảo sát ở hai điều kiện bảo quản là tồn trữ lạnh ở nhiệt độ 4oC
và bảo quản lạnh đông ở nhiệt độ -30oC.
Dung dịch dứa tươi chứa enzyme bromelain quả được tiến hành trích ly, ly tâm và cho
vào bao PA (5ml dd / mẫu), tiến hành bảo quản ở 2 chế độ nhiệt độ: bảo quản lạnh 4oC
và lạnh đông ở -30oC, sau các khoảng thời gian dự kiến, mẫu được đem phân tích hoạt
tính enzyme theo phương pháp Kunitz, đồng thời được đánh giá cảm quan về các đặc
tính vật lý, có sự so sánh giữa các mẫu. Sự thay đổi hoạt tính của enzyme bromelain
theo thời gian bảo quản được thể hiện ở bảng 2.
Bảng 2: Kết quả theo dõi hoạt tính enzyme bromelain trong dd dứa tươi theo thời gian
bảo quản
Thời gian (ngày) Bảo quản lạnh (4 0C) Bảo quản lạnh đông (-30 0C)
0 10,355 b 10,270 c
1 10,375 b 9,320 a
2 10,775 c 9,580 b
3 11,385 d 11,795 c
4 11,415 d 11,925 d
5 12,050 e 11,925 d
6 12,040 e 11,910 d
8 12,045 e 11,895 d
10 12,015 e 11,890 d
12 10,775 c 11,985 d
14 7,825a 11,990 d
Kết quả thể hiện là hoạt tính của enzyme theo đơn vị TU/ml dd, trên cơ chất là casein
Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê ở độ tin cậy 95%
Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ
Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 21
Từ kết quả ở bảng 2 và đồ thị ở hình 8 cho thấy các mẫu dung dịch chứa enzyme được
bảo quản trong điều kiện lạnh và lạnh đông có hoạt tính enzyme không ổn định trong
khoảng 3 ngày bảo quản đầu. Tuy nhiên, ở ngày bảo quản thứ 4 có sự thay đổi rõ rệt,
hoạt tính enzyme bắt đầu ổn định hơn so với những ngày bảo quản tiếp sau, thể hiện
qua giá trị hoạt tính TU/ml dung dịch tăng khác biệt đáng kể. Điều này có thể lý giải là
do dung dịch ban đầu là một hệ tương đối phức tạp, trong thời gian đầu có thể có các
phần tử trong hệ tương tác với nhau làm hoạt tính enzyme proteases trong hệ không
được ổn định. Bên cạnh đó, do trong dung dịch ban đầu còn tồn tại một số phần tử “tiền
enzyme” protease, sau một thời gian, gặp điều kiện thích hợp, các phần tử này sẽ biến
đổi thành các protease, làm tăng nồng độ enzyme trong hệ nên hoạt tính thủy phân của
enzyme tổng tăng lên. Ngoài ra, trong quá trình trích ly, các tác động của những thiết bị
ép tách, ly tâm và sự chênh lệch nhiệt độ giữa các công đoạn có thể làm enzyme trong
dung dịch bị ảnh hưởng.
6
7
8
9
10
11
12
13
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Thời gian (ngày)
H
o
ạt
tín
h(
TU
/m
l)
BQ lạnh
BQ lạnh đông
Hình 8: Đồ thị biểu diễn kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian bảo quản đến hoạt
tính của enzyme bromelain trong dd dứa tươi
So sánh giữa hai điều kiện bảo quản cho thấy, mẫu được bảo quản ở các điều kiện lạnh
và lạnh đông nhìn chung hoạt tính enzyme thể hiện tốt vào ngày bảo quản thứ 4 trở đi.
Tuy nhiên đến ngày bảo quản thứ 10, một số mẫu bảo quản ở điều kiện nhiệt độ lạnh có
hiện tượng hư hỏng, enzyme bromelain trong dung dịch lúc này bắt đầu giảm hoạt tính.
Hoạt tính enzyme ở ngày thứ 12 và 14 giảm thấp hẳn, khác biệt có ý nghĩa khi so sánh
với giá trị thu được từ ngày thứ 4 đến ngày thứ 10. Do enzyme tồn tại trong dung dịch
dứa là một hệ phức tạp, các biến đổi khác của các phần tử bên trong hệ đều gây ảnh
hưởng đến đặc tính của enzyme. Xét về mặt khoa học thực phẩm, mẫu lúc này sẽ
không còn khả năng sử dụng được nên ngừng quá trình khảo sát.
Đối với mẫu bảo quản ở điều kiện lạnh đông, tính chất của enzyme trong dung dịch ổn
định hơn, thể hiện qua giá trị hoạt tính thu được không thay đổi trong suốt thời gian tồn
Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ
Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 22
trữ từ ngày thứ 4 đến sau 2 tuần bảo quản. Enzyme ở điều kiện bảo quản này có thể sử
dụng tốt cho nghiên cứu trong thời gian dài. Điều này có thể giải thích dựa trên khả
năng kìm hãm các hoạt động sinh hóa, vi sinh của hợp chất nhờ lạnh đông. Ở điều kiện
lạnh đông -30oC, 86% nước trong dung dịch chứa enzyme bị đóng băng. Không có
nước tự do, phần lớn các phản ứng sinh hóa có thể xảy ra trong dung dịch mẫu sẽ bị
kìm hãm, một số có thể bị vô hoạt. Vì thế, sau rã đông, mẫu dung dịch có thể duy trì
được trạng thái gần như ban đầu và không ảnh hưởng lớn đến đặc tính của các phần tử
trong dung dịch. Các nghiên cứu về sự ổn định của enzyme cũng cho thấy, lạnh đông
nhanh ở nhiệt độ nhỏ hơn -20oC (tốt nhất là -70oC hay lạnh đông bằng Nitơ lỏng) là chế
độ tối ưu nhằm duy trì hoạt tính của enzyme (Copeland, 2000).
Về đặc tính cảm quan, mẫu dung dịch dứa tươi chứa enzyme bromelain quả sau ly tâm
ban đầu có trạng thái trong, màu vàng sáng đặc trưng của dung dịch dứa, không vẩn
đục, không có mùi lạ.
Sau những khoảng thời gian bảo quản mẫu ở hai điều kiện trên, nhận thấy các mẫu
dung dịch có sự khác biệt ở nhiều mặt:
- Mẫu được bảo quản ở điều kiện lạnh đông, sau các khoảng thời gian bảo quản từ 1
ngày, 2 ngày..đến 20 ngày, dung dịch sau rã đông vẫn giữ được trạng thái và màu
sắc như ban đầu, không mùi lạ, không vẩn đục.
- Mẫu được bảo quản ở điều kiện lạnh 4oC, sau 6 ngày bảo quản vẫn còn màu vàng
sáng, không mùi lạ, không vẩn đục. Sau 10 ngày bảo quản, mẫu có màu vàng sậm,
hơi vẩn đục, có mùi lạ. Sau 12 đến 14 ngày bảo quản, mẫu có mùi lạ mạnh, một số
mẫu có hiện tượng sinh bọt khí, dung dịch bị đục, có hiện tượng lên men, bao bì bị
căng phồng. Ở các mẫu này, sự khảo sát được dừng lại.
Bảo quản lạnh Bảo quản lạnh đông
Hình 9: Mẫu dung dịch dứa chứa enzyme bromelain sau 12 ngày bảo quản
Từ các kết quả đã thu thập và phân tích, có thể cho phép kết luận: nên sử dụng dung
dịch dứa chứa enzyme bromelain quả sau 3 ngày bảo quản, lúc đó enzyme trong dịch
quả có tính chất ổn định và hoạt tính tốt. Sử dụng phương pháp lạnh đông để bảo quản
Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ
Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 23
mẫu chứa enzyme có thể giúp duy trì chất lượng mẫu và hoạt tính enzyme trong thời
gian dài tốt hơn so với phương pháp bảo quản lạnh.
4.2 KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA PH VÀ NHIỆT ĐỘ LÊN HOẠT TÍNH
XÚC TÁC PHẢN ỨNG THỦY PHÂN CỦA ENZYME BROMELAIN
QUẢ (TRONG DỊCH QUẢ DỨA) TRÊN CƠ CHẤT LÀ CASEIN
Dung dịch dứa chứa enzyme bromelain quả được tiến hành xử lý ở các pH và nhiệt độ
khác nhau, bố trí ngẫu nhiên 2 nhân tố. Sau đó, các mẫu được tiến hành phân tích hoạt
tính enzyme trong dịch quả theo phương pháp Kunitz trên cơ chất là casein. Giá trị xác
định được là nồng độ tyrosine sinh ra µmol/ml dd sản phẩm. Sau đó, dựa vào các giá trị
này, xác định được hoạt tính enzyme bromelain quả theo đơn vị TU/ml dd dứa tươi.
Thực hiện tiến trình thí nghiệm như đã trình bày ở phần bố trí thí nghiệm, các mẫu thí
nghiệm được sử dụng là các mẫu có thời gian bảo quản từ ngày thứ tư đến ngày thứ 10.
Kết quả thu nhận được thể hiện qua các bảng số liệu ở phần phụ lục và ở các đồ thị
hình 10, 11, 12.
Hình 10: Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng tương tác của pH và nhiệt độ xử lý lên hoạt tính
của enzyme bromelain trong dịch quả dứa
Từ đồ thị hình 10, nhận thấy có sự tương tác qua lại giữa pH và nhiệt độ lên hoạt tính
xúc tác của enzyme bromelain quả. Ứng với mỗi khoảng nhiệt độ enzyme này sẽ có
khoảng pH hoạt động và giá trị pH tối thích khác nhau và ngược lại.
Về mặt tổng quát, hệ enzyme bromelain quả tồn tại trong dung dịch dứa tươi thể hiện
hoạt tính cao nhất trong khoảng nhiệt độ từ 35 – 55oC với pH dung dịch đệm là 6,8 –
7,8. Kết quả này khá phù hợp với nghiên cứu của Waliszewski và Corzo (2004) về
enzyme bromelain quả cũng trên cơ chất là casein.
Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ
Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 24
0
2
4
6
8
10
12
14
16
4 5 6 7 8 9 10pH
ho
ạ
t t
ín
h
(TU
/m
l)
15 oC
40 oC
0
2
4
6
8
10
12
14
16
4 5 6 7 8 9 10
pH
ho
ạ
t t
ín
h
(TU
/m
l) 70 oC
65 oC
40 oC
0
2
4
6
8
10
12
14
16
0 10 20 30 40 50 60 70 80
nhiệt độ (oC)
ho
ạt
tín
h
(TU
/m
l) pH = 9,0
pH = 4,6
pH = 6,8
pH = 7,1
Hình 11: Đồ thị biểu diễn sự thay đổi hoạt tính của bromelain quả khi xử lý ở các nhiệt
độ khác nhau
Xét về nhiệt độ xử lý, từ đồ thị hình 11 thấy rằng, ở nhiệt độ thấp từ dưới 15oC,
bromelain quả thể hiện hoạt tính thủy phân trên casein vẫn khá tốt. Ở 15oC, trên cơ
chất casein, bromelain quả có hoạt tính khoảng 7,286 TU/ml tại pH = 6,8; giảm khoảng
50% hoạt tính so với ở 40oC, cùng pH. Điều này còn thể hiện: khi tiến hành thí nghiệm
ở nhiệt độ 5oC, nhận thấy bromelain quả vẫn còn hoạt tính, tuy nhiên do một số điều
kiện nghiên cứu không đáp ứng được nên sự khảo sát đã được dừng lại.
Như đa số các enzyme khác, bromelain ở dạng tinh khiết rất nhạy cảm với nhiệt độ,
phần lớn các enzyme này bị giảm hoạt tính từ 55oC và bị vô hoạt ở nhiệt độ trên 70oC,
(Nguyễn Đức Lượng, 2004). Tuy nhiên, từ đồ thị hình 11 cho thấy, ở dịch chiết quả
(pH = 3,5 – 3,8), khi tăng nhiệt độ lên đến 70oC thì nhận thấy enzyme bromelain vẫn
còn hoạt tính khá cao, khoảng 80% hoạt tính so với ở điều kiện 40oC, giá trị pH dao
động từ 6,8 – 7,1. Điều này có thể là do trong dịch chiết còn chứa một số thành phần
khác như protein, glucose,..có tác dụng giúp bromelain trở nên bền nhiệt hơn. Ở nhiệt
độ từ 75oC đến 80oC, enzyme bị mất hoạt tính hoàn toàn. Điều này xảy ra có thể là do
cấu trúc của enzyme đã bị phá hủy do nhiệt.
Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ
Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 25
Sự tương tác giữa pH và nhiệt độ môi trường xử lý enzyme được thể hiện: bromelain
quả hoạt động tốt trong môi trường tính acid ở điều kiện nhiệt độ càng thấp (hình 12)
và ngược lại khi nhiệt độ xử lý càng cao, enzyme bromelain quả có khuynh hướng hoạt
động tốt ở môi trường có pH trung tính đến kiềm yếu.
0
1
2
3
4
5
0 10 20 30 40 50 60 70
nhiệt độ (oC)
ho
ạ
t t
ín
h
(TU
/m
l) pH 4,6
pH 5,6
Hình 12: Đồ thị biểu diễn hoạt tính bromelain quả dưới các điều kiện xử lý nhiệt độ khác
nhau ở pH thấp
Với môi trường xử lý có pH trung tính (pH = 6,8 – 7,1), bromelain quả có khuynh
hướng hoạt động tốt ở nhiệt độ 40 – 60oC. Môi trường xử lý có pH từ kiềm yếu đến
kiềm (pH = 7,5 – 9,5), bromelain quả hoạt động tối thích ở nhiệt độ 25 – 40oC; pH càng
thấp (pH = 4,6 – 5,2), bromelain lại có khuynh hướng hoạt động tốt ở điều kiện nhiệt
độ lạnh từ 10 – 25oC.
Từ vấn đề này có thể đi đến hai khuyến cáo, vì đa phần các sản phẩm từ dứa đều có pH
acid đến dưới trung tính nên trong quá trình xử lý kết hợp với điều kiện nhiệt độ thấp,
cần quan tâm đến hệ enzyme protease trong dịch quả vì chúng vẫn hoạt động khá tốt.
Mặt khác, đối với các sản phẩm dứa tươi, dùng trong thực phẩm, ở trạng thái lạnh
(nhiệt độ xử lý thấp) thì hoạt tính protease hay dược tính tiêu hóa thể hiện càng tốt. Ở
nhiệt độ cao, đặc tính này càng giảm.
Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ
Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 26
CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
5.1 KẾT LUẬN
Ở mức độ của đề tài nghiên cứu này, các kết quả khảo sát hệ enzyme bromelain quả
(trong dịch chiết) trên chỉ phù hợp với loại dứa giống Queen, độ chín 3, là loại và độ
tuổi thường sử dụng nhất trong công nghiệp chế biến các sản phẩm từ dứa hiện nay.
Từ các kết quả nghiên cứu trên nhận thấy:
- So với bảo quản lạnh, bảo quản dịch chiết chứa enzyme ở điều kiện lạnh đông có
thể giúp enzyme trong dung dịch ít bị biến đổi và hoạt tính của hệ enzmye
bromelain quả thể hiện ổn định hơn (duy trì không đổi sau 2 tuần tồn trữ ở nhiệt
độ -30oC). Mặt khác, sau khi trích ly, hoạt tính của hệ enzyme trong dịch chiết thể
hiện sự ổn định từ ngày bảo quản thứ tư trở đi. Vì thế, để phục vụ cho nghiên cứu,
các mẫu dịch chiết chứa enzyme được sử dụng từ sau thời gian này là tốt nhất.
- Có sự tương tác qua lại giữa pH và nhiệt độ của môi trường xử lý lên hoạt tính
của hệ enzyme bromelain quả trong dịch chiết từ quả dứa. Hệ enzyme bromelain
quả tồn tại trong dung dịch dứa tươi thể hiện hoạt tính cao nhất trong khoảng
nhiệt độ 35 – 55oC với pH dung dịch đệm là 6,8 – 7,8. Đối với những sản phẩm từ
dứa, trong quá trình tiền xử lý, hệ enzyme protease trong quả, điển hình là
bromelain quả vẫn có khả năng hoạt động tốt trong khoảng nhiệt độ khá rộng từ
nhiệt độ lạnh đến 70oC.
5.2 ĐỀ NGHỊ
- Khảo sát hệ enzyme pectinase trong dịch quả dứa ở độ chín 3.
- Khảo sát hoạt tính của hệ bromelain quả dưới những điều kiện xử lý khác nhau về
pH và nhiệt độ ở độ chín 4 và chín hoàn toàn.
Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ
Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 27
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
Lê Ngọc Tú, (2004), Hóa sinh công nghiệp, Nhà xuất bản Khoa Học Kỹ Thuật Hà Nội.
Lê Ngọc Tú, (2003), Hóa học thực phẩm, Nhà xuất bản Khoa Học Kỹ Thuật
Nguyễn Đức Lượng, (2004), Công nghệ enzyme, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí
Minh.
Phạm Thu Cúc, (1999). Giáo trình sinh hóa I, Tủ sách Đại Học Cần Thơ, 1999
Vũ Công Hậu, (1999), Trồng cây ăn quả ở Việt Nam, Nhà xuất bản Nông Nghiệp.
Lê Văn Việt Mẫn, (2003), Công nghệ sản xuất các sản phẩm từ sữa và thức uống (tập 1), Nhà xuất bản
Đại Học Quốc Gia TP Hồ Chí Minh
Tiếng Anh
Arnord F. H., G.Goergiou, (2003). Directed enzyme evolution, Methods in molecular biology, volume
23, Humana Press Inc.
Bartholomew D. P., R. E. Paull and K. G. Rohrbach (2003), The Pineapple: Botany, Cultivation and
Ultilization.Interscience Publishers, New York.
Bruno M.A.; Pardo M.F; Caffini N.O.; López L.M.I, Hieronymain I, a New Cysteine Peptidase Isolated
from Unripe Fruits of Bromelia hieronymi Mez (Bromeliaceae), Journal of Protein Chemistry,
Volume 22, Number 2, February 2003, pp. 127-134(8), Springer
Buchholz K., V. Kasche, U.T. Bornscheuer, 2005. Biocatalysts and enzyme technology, Wiley-VCH
Verlag GmbH and Co. KGaA, Weinheim.
Copeland Robert A. (2000). Enzymes: A Practical Introduction to Structure, Mechanism, and Data
Analysis. Wiley-VCH, Inc, 258 pp.
Fernander G., Pomilio A. B. ,(2003), Optimized Growth Conditions and Determination of The
Catalytic Type of The Peptidase Complex From A Novel Callus Culture of Pineapple (Ananas
Comosus), Molecular Medicinal Chemistry, Vol 1, 39-49 p8
Gerald Reed, (1966), Enzymes in food processing; Academic Press, Inc
Harvey. M and M.D. Ross (1985), Understanding the wonder of bromelain, Reprint from: BETTER
NUTRITION The Consumers’ Guide To A Better, Healthier Life March 1985
Mathewson P. R. , (1998), Enzymes, in Eagan Press Handbook Series, the American Association of
Cereal Chemists, Inc
Ota S., H. Umi, E. Muta and Y. Okamoto (1975), Chemical Modification of Stem Bromelain I-1 and
Fruit Bromelain A with 2-Hydroxy-5-nitrobenzyl Bromide, Tetranitromethane, and Hydrogen
Peroxide, Journal of Biochem, Vol. 78, No. 3 627-635_© 1975 Japanese Biochemical Society
Rowan A.D., D.J. Buttle and A.J. Barrett (1990), The cysteine proteinases of pineapple plant , Journal
of Biochem. 266, 869 – 875 pp.
Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ
Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 28
Svendsen A., (2004), Enzyme functionality: design, engineering and screening novozymes A/S, Marcel
Dekker, Inc. All rights reserved
Voet D. and J.G. Voet , (2003), Biochemistry-3rd edition; volume 1, Springer-Verlag Berlin Heidelberg
Waliszewski K.and C. Corzo (2004), Crude fruit-bromelain affinity to different protein substrates, 2004
IFT Annual Meeting, July 12-16 - Las Vegas, NV
Whitaker J.R.; A. G. J. Voragen; D. W. S. Wong, (2003), Handbook of food enzymology, Marcel
Dekker, Inc. All rights reserved
Một số địa chỉ website
www.brenda.uni-koeln.de/information/all_enzymes.php4?ecno=3.4.22.33
Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ
Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang v
PHỤ LỤC 1: PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH
Xác định hoạt tính của enzyme bằng phương pháp Kunitz
(Nguồn: Kunitz, (1947), citied by Fernandez et al., 2003)
Nguyên tắc
Phương pháp đo hoạt tính dựa vào phản ứng thủy phân cơ chất protein (casein hoặc
hemoglobin) bởi enzyme.
Đối tượng thí nghiệm: enzyme bromelain quả và cơ chất là casein
Phản ứng này sẽ được kết thúc tại 1 thời điểm nhất định bằng trichloroacetic acid
(TCA). Sản phẩm tạo thành được xác định dựa vào độ hấp thụ ánh sáng của sản phẩm
acid amine sinh ra (chủ yếu là tyrosine) đo ở bước sóng 280 nm.
Đơn vị đo hoạt tính của bromelain (hay papain): được thể hiện qua đơn vị tyrosine (TU:
tyrosine unit). 1TU: là lượng sản phẩm sinh ra tương đương với số µmol tyrosine do sự
thủy phân casein của enzyme có trong 1ml dung dịch trong thời gian 1 phút ở điều kiện
nhiệt độ và pH môi trường nhất định.
Hoạt tính đặc hiệu của enzyme: là số đơn vị hoạt tính enzyme có trong 1 mg protein
(TU/mg).
Tiến hành thí nghiệm
Chuẩn bị hóa chất
Dung dịch đệm Natriphosphate 0,05M, bổ sung 0,005M EDTA ở các khoảng pH
khác nhau.
Chất hoạt hóa cysteine 0.02M
Dung dịch acid trichloroacetic (TCA) 15% (w/v): cân 15g TCA hòa tan với nước cất,
sau đó thếm nước cất vào vừa đủ đến 100ml
Casein 1%: hòa tan 1g casein với 100ml dung dịch đệm phosphate 0,05M, pH = 7,5 có
bổ sung 0,005M EDTA. Dd này được hòa tan bằng cách đun cách thủy ở nhiệt độ 95oC
khoảng 1 giờ cho đến khi hòa tan hoàn toàn. Bảo quản ở 4oC. Trước khi sử dụng,
dung dịch phải được ủ ấm ở 37oC khoảng 30 phút.
Các bước thực hiện
Làm 2 mẫu thí nghiệm song song, trong đó có một mẫu đối chứng. Các bước thực hiện
theo sơ đồ
Mẫu đối chứng tiến hành tương tự nhưng cho dd TCA vào trước, casein vào sau.
Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ
Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang vi
Mẫu 1 (đối chứng) Mẫu 2
Tính toán kết quả
Đơn vị hoạt tính enzyme trong 1 ml dung dịch enzyme được tính theo công thức sau
k
VT
VxTu
E
hh *)
*
1000**(=
Trong đó
Tu: hoạt tính enzyme (Tu/ml)
X : nồng độ tyrosine (µmol/ml) *
Vhh : thể tích tổng của dd phản ứng (4,8 ml)
T : thời gian phản ứng (10 phút)
VE: thể tích enzyme (120 µl)
k: hệ số pha loãng (1)
* Nồng độ tyrosine (x) trong công thức trên được xác định dựa vào đường chuẩn
tyrosine
lắc ủ 10 phút, toC
120 µl enzyme bromelain
240 µl dd cysteine
840 µl dd đệm phosphate pH = Cn
Bổ sung 3600 µl dd TCA 15%
Bổ sung 3600 µl dd casein 1%
ổn định 10 phút
Lọc
Đo độ hấp thụ ở 280 nm
ủ 20 phút, toC
120 µl enzyme bromelain
240 µl dd cysteine
840 µl dd đệm phosphate pH = Cn
ủ 20 phút, toC
Bổ sung 3600 µl dd casein 1%
lắc ủ 10 phút, toC
Bổ sung 3600 µl dd TCA 15%
ổn định 10 phút
Lọc
Đo độ hấp thụ ở 280 nm
Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ
Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang vii
Xây dựng đường chuẩn Tyrosine
Tyrosine được pha trong dung dịch HCl 0,2N
Chuẩn bị dãy ống nghiệm chứa dd tyrosine chuẩn với nồng độ tăng dần từ 0,1; 0,125;
0,25; 0,3; 0,5; 0,7; 0,9; 1,0; 1,5; 2 µmol/ml. Thí nghiệm lặp lại 3 lần.
[tyrosine]
(µmol/ml)
0 0,1 0,125 0,2 0,3 0,5 0,7 0,9 1,0 1,5 2,0
OD
(280nm)
0 0,132 0,191 0,316 0,401 0,646 0,8625 1,13 1,1245 1,873 2,518
Lắc đều các ống nghiệm trên máy Vortex. Sau đó tiến hành đo OD của các dung dịch ở
bước sóng 280 nm.
Từ kết quả đo OD, đường chuẩn tyrosine theo nồng độ tyrosine trong dung dịch và
độ hấp thụ của các dung dịch đo được, được thiết lập như hình 13.
y = 1.2406x
R2 = 0.9978
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 2
Nồng độ tyrosine(mmol/l)
M
ật
đ
ộ
qu
an
g
A
Hình 13. Đường chuẩn tyrosine
Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ
Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang
viii
PHỤ LỤC 2
Thí nghiệm 1: Sự thay đổi hoạt tính của enzyme bromelain (TU/ml) theo điều kiện bảo
quản khác nhau
i. Bảo quản lạnh
Analysis Summary
Dependent variable: lanh
Factor: thoi gian
Number of observations: 22
Number of levels: 11
ANOVA Table for lanh by thoi gian
Analysis of Variance
-----------------------------------------------------------------------------
Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value
-----------------------------------------------------------------------------
Between groups 31.2293 10 3.12293 16757.19 0.0000
Within groups 0.00205 11 0.000186364
-----------------------------------------------------------------------------
Total (Corr.) 31.2313 21
Table of Means for lanh by thoi gian
with 95.0 percent LSD intervals
--------------------------------------------------------------------------------
Stnd. error
thoi gian Count Mean (pooled s) Lower limit Upper limit
--------------------------------------------------------------------------------
0 2 10.355 0.00965307 10.34 10.37
1 2 10.375 0.00965307 10.36 10.39
2 2 10.775 0.00965307 10.76 10.79
3 2 11.385 0.00965307 11.37 11.4
4 2 11.415 0.00965307 11.4 11.43
5 2 12.05 0.00965307 12.035 12.065
6 2 12.04 0.00965307 12.025 12.055
8 2 12.035 0.00965307 12.02 12.05
10 2 12.025 0.00965307 12.01 12.04
12 2 10.775 0.00965307 10.76 10.79
14 2 7.825 0.00965307 7.80998 7.84002
--------------------------------------------------------------------------------
Total 22 11.005
Multiple Range Tests for lanh by thoi gian
--------------------------------------------------------------------------------
Method: 95.0 percent LSD
thoi gian Count Mean Homogeneous Groups
--------------------------------------------------------------------------------
14 2 7.825 X
0 2 10.355 X
1 2 10.375 X
2 2 10.775 X
12 2 10.775 X
3 2 11.385 X
4 2 11.415 X
10 2 12.025 X
8 2 12.035 X
6 2 12.04 X
5 2 12.05 X
Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ
Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang ix
--------------------------------------------------------------------------------
Contrast Difference +/- Limits
--------------------------------------------------------------------------------
0 - 1 -0.02 0.0300468
0 - 2 *-0.42 0.0300468
0 - 3 *-1.03 0.0300468
0 - 4 *-1.06 0.0300468
0 - 5 *-1.695 0.0300468
0 - 6 *-1.685 0.0300468
0 - 8 *-1.68 0.0300468
0 - 10 *-1.67 0.0300468
0 - 12 *-0.42 0.0300468
0 - 14 *2.53 0.0300468
1 - 2 *-0.4 0.0300468
1 - 3 *-1.01 0.0300468
1 - 4 *-1.04 0.0300468
1 - 5 *-1.675 0.0300468
1 - 6 *-1.665 0.0300468
1 - 8 *-1.66 0.0300468
1 - 10 *-1.65 0.0300468
1 - 12 *-0.4 0.0300468
1 - 14 *2.55 0.0300468
2 - 3 *-0.61 0.0300468
2 - 4 *-0.64 0.0300468
2 - 5 *-1.275 0.0300468
2 - 6 *-1.265 0.0300468
2 - 8 *-1.26 0.0300468
2 - 10 *-1.25 0.0300468
2 - 12 0.0 0.0300468
2 - 14 *2.95 0.0300468
3 - 4 -0.03 0.0300468
3 - 5 *-0.665 0.0300468
3 - 6 *-0.655 0.0300468
3 - 8 *-0.65 0.0300468
3 - 10 *-0.64 0.0300468
3 - 12 *0.61 0.0300468
3 - 14 *3.56 0.0300468
4 - 5 *-0.635 0.0300468
4 - 6 *-0.625 0.0300468
4 - 8 *-0.62 0.0300468
4 - 10 *-0.61 0.0300468
4 - 12 *0.64 0.0300468
4 - 14 *3.59 0.0300468
5 - 6 0.01 0.0300468
5 - 8 0.015 0.0300468
5 - 10 0.025 0.0300468
5 - 12 *1.275 0.0300468
5 - 14 *4.225 0.0300468
6 - 8 0.005 0.0300468
6 - 10 0.015 0.0300468
6 - 12 *1.265 0.0300468
6 - 14 *4.215 0.0300468
8 - 10 0.01 0.0300468
8 - 12 *1.26 0.0300468
8 - 14 *4.21 0.0300468
10 - 12 *1.25 0.0300468
10 - 14 *4.2 0.0300468
12 - 14 *2.95 0.0300468
--------------------------------------------------------------------------------
* denotes a statistically significant difference.
Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ
Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang x
ii. Bảo quản lạnh đông
Analysis Summary
Dependent variable: lanh dong
Factor: thoi gian
Number of observations: 22
Number of levels: 11
ANOVA Table for lanh dong by thoi gian
Analysis of Variance
-----------------------------------------------------------------------------
Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value
-----------------------------------------------------------------------------
Between groups 21.9879 10 2.19879 9127.07 0.0000
Within groups 0.00265 11 0.000240909
-----------------------------------------------------------------------------
Total (Corr.) 21.9906 21
able of Means for lanh dong by thoi gian
with 95.0 percent LSD intervals
--------------------------------------------------------------------------------
Stnd. error
thoi gian Count Mean (pooled s) Lower limit Upper limit
--------------------------------------------------------------------------------
0 2 10.27 0.0109752 10.2529 10.2871
1 2 9.32 0.0109752 9.30292 9.33708
2 2 9.58 0.0109752 9.56292 9.59708
3 2 11.795 0.0109752 11.7779 11.8121
4 2 11.925 0.0109752 11.9079 11.9421
5 2 11.925 0.0109752 11.9079 11.9421
6 2 11.91 0.0109752 11.8929 11.9271
8 2 11.895 0.0109752 11.8779 11.9121
10 2 11.9 0.0109752 11.8829 11.9171
12 2 11.985 0.0109752 11.9679 12.0021
14 2 11.99 0.0109752 11.9729 12.0071
--------------------------------------------------------------------------------
Total 22 11.3177
Multiple Range Tests for lanh dong by thoi gian
--------------------------------------------------------------------------------
Method: 95.0 percent LSD
thoi gian Count Mean Homogeneous Groups
--------------------------------------------------------------------------------
1 2 9.32 X
2 2 9.58 X
0 2 10.27 X
3 2 11.795 X
8 2 11.895 X
10 2 11.900 X
6 2 11.910 X
5 2 11.925 X
4 2 11.925 X
12 2 11.985 X
14 2 11.990 X
--------------------------------------------------------------------------------
Contrast Difference +/- Limits
--------------------------------------------------------------------------------
0 - 1 *0.95 0.0341621
0 - 2 *0.69 0.0341621
0 - 3 *-1.525 0.0341621
0 - 4 *-1.655 0.0341621
Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ
Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang xi
0 - 5 *-1.655 0.0341621
0 - 6 *-1.64 0.0341621
0 - 8 *-1.625 0.0341621
0 - 10 *-1.63 0.0341621
0 - 12 *-1.715 0.0341621
0 - 14 *-1.72 0.0341621
1 - 2 *-0.26 0.0341621
1 - 3 *-2.475 0.0341621
1 - 4 *-2.605 0.0341621
1 - 5 *-2.605 0.0341621
1 - 6 *-2.59 0.0341621
1 - 8 *-2.575 0.0341621
1 - 10 *-2.58 0.0341621
1 - 12 *-2.665 0.0341621
1 - 14 *-2.67 0.0341621
2 - 3 *-2.215 0.0341621
2 - 4 *-2.345 0.0341621
2 - 5 *-2.345 0.0341621
2 - 6 *-2.33 0.0341621
2 - 8 *-2.315 0.0341621
2 - 10 *-2.32 0.0341621
2 - 12 *-2.405 0.0341621
2 - 14 *-2.41 0.0341621
3 - 4 *-0.13 0.0341621
3 - 5 *-0.13 0.0341621
3 - 6 *-0.115 0.0341621
3 - 8 *-0.1 0.0341621
3 - 10 *-0.105 0.0341621
3 - 12 *-0.19 0.0341621
3 - 14 *-0.195 0.0341621
4 - 5 0.0 0.0341621
4 - 6 0.015 0.0341621
4 - 8 0.03 0.0341621
4 - 10 0.025 0.0341621
4 - 12 *-0.06 0.0341621
4 - 14 *-0.065 0.0341621
5 - 6 0.015 0.0341621
5 - 8 0.03 0.0341621
5 - 10 0.025 0.0341621
5 - 12 *-0.06 0.0341621
5 - 14 *-0.065 0.0341621
6 - 8 0.015 0.0341621
6 - 10 0.01 0.0341621
6 - 12 *-0.075 0.0341621
6 - 14 *-0.08 0.0341621
8 - 10 -0.005 0.0341621
8 - 12 *-0.09 0.0341621
8 - 14 *-0.095 0.0341621
10 - 12 *-0.085 0.0341621
10 - 14 -0.04 0.0341621
12 - 14 -0.005 0.0341621
--------------------------------------------------------------------------------
* denotes a statistically significant difference.
Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ
Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang xii
Thí nghiệm 2
Bảng 3: Kết quả thí nghiệm khảo sát sự ảnh hưởng của pH và nhiệt độ môi trường xử lý
lên hoạt tính của enzyme bromelain quả
oC
pH
10 15 20 25 30 35 40
4,6 2,7529 3,621 3,122 2,714 0,7555 0,1476 0,2931
5,6 2,8137 3,76 3,8124 4,06 2,0799 0,1997 0,4386
6,2 2,818 4,737 5,2279 6,926 4,5853 4,4116 4,8458
6,5 0,0347 6,366 7,1037 7,872 7,8809 11,602 6,9734
6,8 0,0217 7,286 8,0372 9,149 10,525 12,01 14,016
7,1 0,013 6,934 7,7941 8,285 10,217 12,088 12,232
7,5 3,5432 6,774 7,4467 8,15 10,304 12,084 8,745
7,8 3,8428 6,557 7,0516 7,833 9,8131 12,566 7,9113
8,4 4,1814 6,522 7,8679 8,68 10,417 11,455 8,4975
9,0 4,7285 6,435 7,755 8,697 9,6655 11,411 9,3268
9,5 4,6157 6,283 7,0993 8,176 8,9013 10,252 7,3468
oC
pH
45 50 55 60 65 70
4,6 0,4776 0,452 0,9466 0,773 0,1997 0,1824
5,6 0,508 0,578 0,7555 0,799 1,003 0,825
6,2 6,9734 5,228 3,7385 2,614 1,7629 0,9987
6,5 12,28 6,661 5,1975 3,647 2,6313 1,5545
6,8 13,1 12,67 12,349 12,31 11,819 11,281
7,1 14,377 14,55 14,933 13,88 11,324 9,7697
7,5 11,476 10,55 8,9143 11,06 9,7784 7,7289
7,8 10,586 7,577 7,8939 6,131 4,0642 3,8905
8,4 11,35 8,228 6,8041 5,02 1,4589 0,7642
9,0 8,6017 7,086 6,7303 3,769 0,7034 0,2345
9,5 8,8839 7,008 6,1571 3,196 0,6774 0,2953
(kết quả thể hiện là hoạt tính của enzyme theo đơn vị TU/ml dd, trên cơ chất là casein.
Các giá trị trên là kết quả trung bình của 2 lần lặp lại.)
Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ
Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang
xiii
Chương trình SAS cho đồ thị 3D và contour xác định ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến
hoạt tính của enzyme bromelain (TU/ml)
input NhD pH Act;
cards;
10 4,6 2,7529
10 5,6 2,8137
10 6,2 2,818
10 6,5 0,0347
10 6,8 0,0217
10 7,1 0,013
10 7,5 3,5432
10 7,8 3,8428
10 8,4 4,1814
10 9 4,7285
10 9,5 4,6157
15 4,6 3,6213
15 5,6 3,7603
15 6,2 4,7372
15 6,5 6,3655
15 6,8 7,286
15 7,1 6,9343
15 7,5 6,7737
15 7,8 6,5566
15 8,4 6,5218
15 9 6,435
15 9,5 6,283
20 4,6 3,122
20 5,6 3,8124
20 6,2 5,2279
20 6,5 7,1037
20 6,8 8,0372
20 7,1 7,7941
20 7,5 7,4467
20 7,8 7,0516
20 8,4 7,8679
20 9 7,755
20 9,5 7,0993
25 4,6 2,7138
25 5,6 4,0599
25 6,2 6,9256
25 6,5 7,8722
25 6,8 9,1488
25 7,1 8,2847
25 7,5 8,1501
25 7,8 7,8331
25 8,4 8,6799
25 9 8,6972
Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ
Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang
xiv
25 9,5 8,1762
30 4,6 0,7555
30 5,6 2,0799
30 6,2 4,5853
30 6,5 7,8809
30 6,8 10,525
30 7,1 10,217
30 7,5 10,304
30 7,8 9,8131
30 8,4 10,417
30 9 9,6655
30 9,5 8,9013
35 4,6 0,1476
35 5,6 0,1997
35 6,2 4,4116
35 6,5 11,602
35 6,8 12,01
35 7,1 12,088
35 7,5 12,084
35 7,8 12,566
35 8,4 11,455
35 9 11,411
35 9,5 10,252
40 4,6 0,2931
40 5,6 0,4386
40 6,2 4,8458
40 6,5 6,9734
40 6,8 14,016
40 7,1 12,232
40 7,5 8,745
40 7,8 7,9113
40 8,4 8,4975
40 9 9,3268
40 9,5 7,3468
45 4,6 0,4776
45 5,6 0,508
45 6,2 6,9734
45 6,5 12,28
45 6,8 13,1
45 7,1 14,377
45 7,5 11,476
45 7,8 10,586
45 8,4 11,35
45 9 8,6017
45 9,5 8,8839
50 4,6 0,4516
50 5,6 0,5775
50 6,2 5,2279
50 6,5 6,6608
Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ
Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang xv
50 6,8 12,666
50 7,1 14,555
50 7,5 10,551
50 7,8 7,577
50 8,4 8,2283
50 9 7,0863
50 9,5 7,0081
55 4,6 0,9466
55 5,6 0,7555
55 6,2 3,7385
55 6,5 5,1975
55 6,8 12,349
55 7,1 14,933
55 7,5 8,9143
55 7,8 7,8939
55 8,4 6,8041
55 9 6,7303
55 9,5 6,1571
60 4,6 0,7729
60 5,6 0,7989
60 6,2 2,6139
60 6,5 3,6474
60 6,8 12,31
60 7,1 13,882
60 7,5 11,055
60 7,8 6,131
60 8,4 5,0195
60 9 3,7689
60 9,5 3,1958
65 4,6 0,1997
65 5,6 1,003
65 6,2 1,7629
65 6,5 2,6313
65 6,8 11,819
65 7,1 11,324
65 7,5 9,7784
65 7,8 4,0642
65 8,4 1,4589
65 9 0,7034
65 9,5 0,6774
70 4,6 0,1824
70 5,6 0,825
70 6,2 0,9987
70 6,5 1,5545
70 6,8 11,281
70 7,1 9,7697
70 7,5 7,7289
70 7,8 3,8905
70 8,4 0,7642
Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ
Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang
xvi
70 9 0,2345
70 9,5 0,2953
;
/*VI. Su thay doi hoat tinh cua bromealine*/
proc g3grid data=bromealine out=bromealine;
grid NhD*pH=Act/
spline
smooth=6
axis1=10 to 70 by 1
axis2=4.6 to 9.5 by 0.1;
run;
goptions reset=all
nocell nocharacters
ctext=black
ftext=simulate
htext=0.35
gunit=cm
horigin=6 cm
vorigin=2 cm
hsize=10 cm
vsize=9 cm
colors=(black);
axis1 order=10 to 70 by 10
label=(f=simulate h=0.35 cm a=0 j=c 'Nhiet do (C)')
value=(f=simulate h=0.35 cm);
axis2 order=4.6 to 9.5 by 1
label=(a=0 f=simulate a=90 h=0.35 cm j=c 'pH')
value=(f=simulate h=0.35 cm);
symbol1 height=0.3 cm
font=simulate
value=
color=;
symbol2 height=0.3 cm
step=
color=;
symbol3 height=0.3 cm
color=;
symbol4 height=0.3 cm
color=;
symbol5 height=0.3 cm
color=;
symbol6 height=0.3 cm
color=;
symbol7 height=0.3 cm
color=;
symbol8 height=0.3 cm
color=;
Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ
Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang
xvii
symbol9 height=0.3 cm
color=;
symbol10 height=0.3 cm
color=;
symbol11 height=0.3 cm
color=;
symbol12 height=0.3 cm
color=;
symbol13 height=0.3 cm
color=;
symbol14 height=0.3 cm
color=;
symbol15 height=0.3 cm
color=;
symbol16 height=0.3 cm
color=;
symbol17 height=0.3 cm
color=;
symbol18 height=0.3 cm
color=;
symbol19 height=0.3 cm
color=
font=
value=;
legend1 LABEL = (F=simulate H=0.35 cm)
VALUE = (F=simulate H=0.35 cm);
proc gcontour data=bromealine;
plot pH*NhD=Act/
autolabel=(check=none)
levels= 0 to 18 by 1
clevels=black
caxis=black
haxis=axis1
vaxis=axis2
nolegend;
run;
goptions reset=all
nocell nocharacters
ctext=black
ftext=simulate
htext=0.35
gunit=cm
horigin=5 cm
vorigin=2 cm
hsize=10 cm
vsize=9 cm
colors=(brown black brown);
proc g3d data=bromealine;
plot pH*NhD=Act/grid
Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ
Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang
xviii
caxis=black
tilt=80
rotate=45
yticknum=5
xticknum=6
zticknum=5;
run;
Các file đính kèm theo tài liệu này:
- 1 43.pdf