Luận văn Bước đầu nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử để phân biệt một số loài sâm thuộc chi panax
BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ ĐỂ PHÂN BIỆT MỘT SỐ LOÀI SÂM THUỘC CHI PANAX
NGUYỄN THANH THUẬN
Trang nhan đề
Lời cảm ơn
Mục lục
Danh mục từ viết tắt
Danh mục bảng
Danh mục hình
Mở đầu
Chương_1: Tổng quan tài liệu
Chương_2: Vật liệu và phương pháp
Chương_3: Kết quả nghiên cứu
Chương_4: Bàn luận
Kết luận và đề nghị
Tài liệu tham khảo
Phụ lục
MỤC LỤC
MỤC LỤC i
CHỮ VIẾT TẮT iv
DANH MỤC BẢNG .v
DANH MỤC HÌNH .vi
DANH MỤC HÌNH .vi
MỞ ĐẦU .1
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3
1.1 Tổng quan về chi Panax .3
1.1.1 Đặc điểm . 3
1.1.2 Phân loại 4
1.1.3 Thành phần hóa học 6
1.1.3.1 Hợp chất saponin 6
1.1.3.2 Hợp chất polyacetylen 8
1.1.4 Tác dụng dược lý 10
1.2 Hệ thống học mức phân tử của Panax .13
1.3 Các phương pháp phân biệt loài dựa trên DNA 13
1.3.1 Các phương pháp dựa trên PCR . 14
1.3.1.1 PCR-Đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn (PCR-RFLP) . 14
1.3.1.2 Đa hình chiều dài đoạn DNA nhân bản (AFLP) . 14
1.3.1.3 PCR mồi ngẫu nhiên (RP-PCR) 15
1.3.1.4 Vi vệ tinh khuếch đại ngẫu nhiên (RAMS) . 16
1.3.2 Các phương pháp dựa trên sự lai 17
1.3.3 Các phương pháp dựa trên giải trình tự 18
1.4 Chiết tách, phân tích sơ bộ DNA .18
1.4.1 Chiết tách DNA 18
1.4.2 Các phương pháp phân tích sơ bộ axit nucleic 19
1.4.2.1 Đo quang phổ 19
ii
1.4.2.2 Điện di 20
Chương 2. VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .23
2.1 Vật liệu .23
2.1.1 Đối tượng . 23
2.1.2 Dụng cụ, vật liệu - hóa chất . 24
2.1.3 Mồi . 25
2.1.4 Trang thiết bị- dụng cụ . 25
2.2 Phương pháp nghiên cứu 26
2.2.1 Phương pháp sắc kí lớp mỏng . 26
2.2.2 Chiết tách DNA 26
2.2.3 Phát hiện DNA: Phương pháp điện di gel agarose 28
2.2.4 Thực hiện các phản ứng PCR 28
2.2.4.1 Thiết lập RAMS . 29
2.2.4.2 Thiết lập ITS . 29
2.2.4.3 Thiết lập 18S . 30
2.2.5 Tinh sạch sản phẩm PCR . 30
2.2.6 Thực hiện RFLP . 30
2.2.7 Giải trình tự 31
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .32
3.1 Các mẫu Panax .32
3.2 Phương pháp sắc kí lớp mỏng 33
3.3 Chiết tách DNA 34
3.4 Kết quả PCR .35
3.4.1 Vùng ITS 35
3.4.2 Vùng 18S . 35
3.5 Kết quả giải trình tự 36
3.5.1 Vùng ITS 36
3.5.2 Vùng 18S . 37
iii
3.6 Phân tích RFLP 40
3.6.1 Vùng ITS 40
3.6.2 Vùng 18S . 41
3.7 Phân tích RAMS .43
3.7.1 Xác lập điều kiện tiến hành 43
3.7.1.1 Lựa chọn mồi và nhiệt độ gắn mồi thích hợp . 43
3.7.1.2 Dò tìm nồng độ Mg2+ thích hợp . 44
3.7.2 Tiến hành RAMS . 44
3.7.3 Phân tích bằng Bionumeric 45
Chương 4. BÀN LUẬN 46
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .48
TÀI LIỆU THAM KHẢO .49
14 trang |
Chia sẻ: maiphuongtl | Lượt xem: 1751 | Lượt tải: 0
Bạn đang xem nội dung tài liệu Luận văn Bước đầu nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử để phân biệt một số loài sâm thuộc chi panax, để tải tài liệu về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
Kết quả nghiên cứu 32
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1 Các mẫu Panax
STQ SM SH1 SH2
TTTQ TTVN SVN SH3
Hình 3.1 Các mẫu Panax thu thập được
Kết quả nghiên cứu 33
3.2 Phương pháp sắc kí lớp mỏng
STQ SM SH1 SH2 TTTQ TTVN SH3 SVN
Hình 3.2 Sắc kí đồ lớp mỏng dịch chiết các mẫu
Bảng 3.1 Sự hiện diện của các vệt trên SKLM theo giá trị Rf
Rf 0,26 0,34 0,38 0,47 0,54 0,59
STQ + + +
SM + +
SH1 + + + + + +
SH2 + + + + + +
TTTQ + + + + +
TTVN + + +
SVN + + + + +
SH3 + + + + +
Kết quả nghiên cứu 34
Nhận xét:
Sắc kí đồ của SH1, SH2, TTTQ, SVN, SH3 có nhiều vết tương đương nhau
nhưng độ đậm của các vết khác nhau.
Sắc kí đồ của STQ, SM, TTVN cũng có những vết tương đương nhưng cho ít
vết hơn.
Kết quả sắc kí đồ cho thấy các mẫu có các vết sắc kí phù hợp với tiêu chí của
Dược điển.
3.3 Chiết tách DNA
Chiết tách DNA theo qui trình trên, dịch chiết DNA được kiểm tra bằng cách định
lượng trên máy quang phổ UV.
Bảng 3.2 Kết quả đo quang DNA
Mẫu A260 A280 Tỷ lệ A260/ A280
STQ 0,490 0,270 1,81
SM 0,484 0,252 1,92
SH1 0,485 0,278 1,74
SH2 0,457 0,254 1,8
TTTQ 0,545 0,287 1,9
TTVN 0,483 0,274 1,76
SVN 0,552 0,283 1,95
SH3 0,428 0,238 1,8
Nhận xét: Phương pháp chiết trên phù hợp cho Panax, tuy nhiên dùng nitơ lỏng
nghiền mẫu thành bột mịn để phá vỡ tế bào là quan trọng.
Kết quả nghiên cứu 35
3.4 Kết quả PCR
3.4.1 Vùng ITS
Tiến hành PCR với cặp mồi ITS_AF và ITS_BR trên các mẫu DNA chiết được.
Thu được kết quả:
M 1 2 3 4 5 6 7 8
Hình 3.3 Sản phẩm PCR vùng ITS
(M: Thang 1000bp)
Nhận xét: Các mẫu Panax cho sản phẩm PCR ở vùng ITS có kích thước phù hợp
với dự đoán trong khoảng 700 đến 750bp, ngoại trừ mẫu STQ, SH1 (giếng 1, 3)
không cho sản phẩm PCR.
3.4.2 Vùng 18S
Tiến hành PCR với cặp mồi 18SCOM_F và 18SCOM_R trên các mẫu DNA chiết
được. Kết quả thu được
500bp
1000bp
Kết quả nghiên cứu 36
M 1 2 3 4 5 6 7 8
Hình 3.4 Sản phẩm PCR vùng 18S
Nhận xét: Các mẫu Panax cho sản phẩm PCR ở vùng 18S có kích thước phù hợp
với dự đoán trong khoảng 500 đến 550bp, ngoại trừ mẫu TTVN (giếng 6) không có
sản phẩm PCR.
3.5 Kết quả giải trình tự
Các sản phẩm PCR được tinh sạch, sau đó được giải trình tự tại công ty Macrogen
(Hàn Quốc). Kết quả giải trình tự được Blast trên NCBI. Một trình tự đem so sánh
càng tương đồng cao với các trình tự trên NCBI nếu có giá trị E-value thấp (càng về
0) và giá trị Max ident, Query coverage cao (càng gần 100%)
3.5.1 Vùng ITS
Kết quả Blast trên NCBI cho thấy các mẫu đều thuộc chi Panax và có kết quả loài
gần nhất phù hợp (chi tiết xem ở Phụ lục 1). Tuy nhiên, kết quả giải trình tự không
thể phân biệt được nguồn gốc của dược liệu do sự khác biệt không cao giữa các mẫu
(mức tương đồng trên 95%). Việc xác định cây phân loài được thực hiện bằng cách
dùng phần mềm Bionumeric để so sánh sự liên quan của các mẫu này với các trình
tự trong Gen Bank (Hình 3.5).
Hình 3.5 Kết quả phân tích các trình tự ITS bằng Bionumerics
500bp
1000bp
Kết quả nghiên cứu 37
Bảng 3.3 Kết quả Blast các trình tự vùng ITS trên NCBI
3.5.2 Vùng 18S
Kết quả Blast trên NCBI cho thấy các mẫu đều thuộc chi Panax. Tuy nhiên không
thể xác định được loài gần nhất vì không có sự khác biệt giữa mẫu được Blast với
các trình tự trên NCBI (mẫu đem so sánh có giá trị Max ident và Query coverage
giống với nhiều loài thuộc chi Panax trên Genbank) (chi tiết xem ở Phụ lục 2). Điều
này có thể là do mức độ bảo thủ cao của trình tự 18S.
Nhận xét: Kết quả Blast các trình tự vùng ITS và 18S cho thấy các mẫu dược liệu
đều thuộc chi Panax. Tuy nhiên, kết quả trên vùng 18S không thể phân biệt các loài
do mức độ bảo tồn cao của vùng này giữa các loài có quan hệ gần. Dựa vào kết quả
trên vùng ITS, chúng tôi có thể xác định loài có quan hệ gần nhất với các mẫu
(Bảng 3.3), tuy nhiên không thể phân biệt được nguồn gốc của dược liệu do ít có sự
khác biệt giữa các mẫu.
Hình 3.6 Kết quả phân tích các trình tự 18S bằng Bionumerics
Mẫu Loài gần nhất Query coverage (%) Max ident (%)
SM Panax quinquefolius 98 98
SH2 Panax ginseng 98 99
TTTQ Panax notoginseng 97 98
TTVN Panax notoginseng 98 97
SVN
Panax quinquefolius
Panax vietnamensis
96 98
SH3 Panax ginseng 96 99
Pairwise (OG:100%,UG:0%) (FAST:2,10) Gapcost:0%
ITS
1
0
0
9
9
9
8
9
7
9
6
P. pseudoginseng var. bipinnatif.
P. zingiberensis
P. japonicus var. bipinnatifidus
P. pseudoginseng var. eleganti.
P. vietnamensis specimen-vou.
P. ginseng
P. ginseng cultivar Chunggyung
P. ginseng cultivar Chunpoong
P. ginseng cultivar Hwang-Sook
P. ginseng cultivar Yunpoong
SH3
P. ginseng isolate KGD4
P. ginseng isolate KGD5
P. ginseng isolate KW1
P. ginseng isolate ac22
P. quinquefolius
TTVN
P. pseudoginseng var. angustifo.
SH2
SVN
P. notoginseng
P. notoginseng specimen-vouc.
TTTQ
SM
P. stipuleanatus
100
99.5 100
99.4 99.2 100
99.3 99.0 99.0 100
99.1 99.2 98.8 98.7 100
99.1 98.9 98.9 98.7 98.8 100
99.0 98.9 98.7 98.5 98.7 100 100
99.0 98.9 98.7 98.5 98.7 100 100 100
99.0 98.9 98.7 98.5 98.7 100 100 100 100
99.0 98.9 98.7 98.5 98.7 100 100 100 100 100
98.8 98.9 98.5 98.4 98.5 99.7 100 100 100 100 100
99.2 99.0 98.9 98.7 98.9 99.8 99.8 99.8 99.8 99.8 99.8 100
99.2 99.0 98.9 98.7 98.9 99.8 99.8 99.8 99.8 99.8 99.8 100 100
99.2 99.0 98.9 98.7 98.9 99.8 99.8 99.8 99.8 99.8 99.8 100 100 100
99.0 98.7 98.6 98.5 98.7 99.7 99.8 99.8 99.8 99.8 99.6 99.7 99.7 99.7 100
99.4 99.2 99.1 99.0 99.1 99.4 99.4 99.4 99.4 99.4 99.0 99.5 99.5 99.5 99.1 100
98.4 98.1 98.1 98.2 97.9 99.2 99.1 99.1 99.1 99.1 99.2 98.9 98.9 98.9 99.0 99.0 100
98.7 98.4 98.4 98.5 98.2 98.4 98.2 98.2 98.2 98.2 98.1 98.4 98.4 98.4 98.2 98.4 98.4 100
97.5 97.9 97.1 97.3 97.0 98.3 98.5 98.5 98.5 98.5 98.0 98.3 98.3 98.3 98.1 97.6 98.9 97.0 100
97.9 98.4 97.6 97.8 97.9 97.6 98.2 98.2 98.2 98.2 97.4 98.4 98.4 98.4 97.5 97.8 96.6 97.2 96.3 100
97.4 97.3 97.1 96.9 97.4 97.1 97.1 97.1 97.1 97.1 97.1 97.3 97.3 97.3 96.9 97.4 96.8 96.3 95.8 97.4 100
97.6 97.3 97.3 97.2 97.6 97.3 97.1 97.1 97.1 97.1 97.1 97.3 97.3 97.3 97.2 97.6 97.1 96.6 95.8 96.9 100 100
96.3 96.6 96.0 95.9 96.3 96.0 96.4 96.4 96.4 96.4 96.2 96.6 96.6 96.6 95.9 96.3 96.0 95.3 95.1 96.3 99.0 98.4 100
96.9 96.7 96.6 96.9 96.5 96.8 96.7 96.7 96.7 96.7 96.5 96.8 96.8 96.8 96.6 97.1 97.0 96.1 96.7 95.5 95.4 95.6 94.6 100
96.3 95.8 96.0 95.9 96.3 96.2 95.8 95.8 95.8 95.8 95.9 96.0 96.0 96.0 96.0 96.3 95.3 95.3 95.0 95.4 95.0 95.4 94.1 93.4 100
Pairwise (OG:100%,UG:0%) (FAST:2,10) Gapcost:0%
18S
1
0
0
9
5
9
0
8
5
P. japonicus var. major
P. pseudoginseng subsp. himalaic.
P. ginseng
P. notoginseng isolate:R2
P. vietnamensis
P. vietnamensis var. fuscidiscus
P. pseudoginseng var. bipinnatifid.
P. quinquefolius
P. stipuleanatus
P. zingiberensis
P. notoginseng
SVN
SM
SH3
TTTQ
P. notoginseng isolate:R3
SH2
STQ
SH1
100
100 100
100 100 100
100 100 100 100
100 100 100 100 100
100 100 100 100 100 100
100 100 100 100 100 100 100
100 100 100 100 100 100 100 100
100 100 100 100 100 100 100 100 100
100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
99.8 99.8 99.8 99.8 99.8 99.8 99.8 99.8 99.8 99.8 100
98.4 98.4 98.4 98.4 98.4 98.4 98.4 98.4 98.4 98.4 98.2 100
98.8 98.8 98.8 98.8 98.8 98.8 98.8 98.8 98.8 98.8 98.6 98.8 100
96.8 96.8 96.8 96.8 96.8 96.8 96.8 96.8 96.8 96.8 96.6 97.1 99.5 100
96.7 96.7 96.7 96.7 96.7 96.7 96.7 96.7 96.7 96.7 97.0 96.7 99.3 98.0 100
96.6 96.6 96.6 96.6 96.6 96.6 96.6 96.6 96.6 96.6 96.6 95.0 96.4 94.7 95.1 100
96.0 96.0 96.0 96.0 96.0 96.0 96.0 96.0 96.0 96.0 95.8 95.8 98.0 96.5 96.6 93.5 100
88.3 88.3 88.3 88.3 88.3 88.3 88.3 88.3 88.3 88.3 88.0 88.5 88.4 86.9 86.3 87.8 87.0 100
82.5 82.5 82.5 82.5 82.5 82.5 82.5 82.5 82.5 82.5 82.8 82.5 81.8 81.4 81.8 72.6 79.9 70.9 100
Kết quả nghiên cứu 40
3.6 Phân tích RFLP
3.6.1 Vùng ITS
Đoạn ITS sau khi được PCR và tinh chế được cắt bằng 2 enzym HaeIII và HindIII
để nghiên cứu sự đa hình các đoạn cắt. Kết quả như sau:
M SM SH2 TT TQ TTVN SVN SH3
Hình 3.7 Kết quả cắt giới hạn đoạn ITS
(M: Thang 100bp)
Kết quả được phân tích bằng phần mềm Bionumerics 3.0
Kết quả nghiên cứu 41
Hình 3.8 Kết quả phân tích sự đa hình sản phẩm RFLP đoạn ITS
Nhận xét:
Các mẫu SM, SH2, SH3 có mức tương đồng cao cho thấy chúng có quan hệ
gần với nhau.
Các mẫu TTTQ (Trung Quốc), TTVN (Việt Nam) được cho là Panax
notoginseng nhưng có độ tương đồng thấp (dưới 50%). Nguyên nhân có thể
là do nguồn gốc, điều kiện sinh trưởng, thổ nhưỡng khác nhau.
Mẫu SVN (Sâm Việt nam) có mức độ tương đồng thấp so với các mẫu còn
lại.
3.6.2 Vùng 18S
Đoạn 18S sau khi được PCR và tinh chế được cắt bằng 2 enzym HaeIII và HindIII
để nghiên cứu sự đa hình các đoạn cắt. Kết quả như sau:
Kết quả nghiên cứu 42
M STQ SM SH1 SH2 SH3 SVN TTTQ
Hình 3.9 Kết quả cắt giới hạn đoạn 18S
(M: Thang 100bp)
Kết quả được phân tích bằng phần mềm Bionumerics 3.0
Hình 3.10 Kết quả phân tích sự đa hình sản phẩm RFLP đoạn 18S
Nhận xét:
Nhìn chung, phân tích trên vùng 18S cho kết quả tương đồng cao hơn trên
vùng ITS vì vùng 18S có mức bảo tồn cao hơn.
Các mẫu STQ, SH1 có mức tương đồng khá cao (khoảng 73%) cho thấy
chúng có nguồn gốc gần nhau (các mẫu này được thu mua từ các cửa hàng sỉ
Kết quả nghiên cứu 43
và lẻ ở quận 5 có nguồn gốc Trung Quốc). Các mẫu SH2, SH3 (nguồn gốc
Hàn Quốc) có mức tương đồng cao (khoảng 94%). Như vậy có sự khác biệt
giữa các mẫu Nhân sâm có nguồn gốc từ Trung Quốc và Hàn Quốc (khoảng
20%) giữa hai nhóm.
3.7 Phân tích RAMS
3.7.1 Xác lập điều kiện tiến hành
3.7.1.1 Lựa chọn mồi và nhiệt độ gắn mồi thích hợp
Tiến hành PCR với nhiệt độ gắn mồi thích hợp cho từng mồi RAMS1, RAMS2,
RAMS3 và RAMS4. Thu được kết quả như sau:
R1 R2 R3 R4
Hình 3.11 Kết quả PCR RAMS với các mồi khác nhau
R1: mồi RAMS1, nhiệt độ gắn mồi: 37,5oC
R2: mồi RAMS2, nhiệt độ gắn mồi: 53oC
R3: mồi RAMS3, nhiệt độ gắn mồi: 53oC
R4: mồi RAMS4, nhiệt độ gắn mồi: 33,5oC
Nhận xét: Mồi R2, R3, R4 không cho sản phẩm. Mồi R1 cho sản phẩm khi phân
tích trên gel nên được chọn cho các thử nghiệm tiếp theo.
Kết quả nghiên cứu 44
3.7.1.2 Dò tìm nồng độ Mg2+ thích hợp
Tiến hành PCR với mồi R1, nồng độ Mg2+ khảo sát 1,5; 2; 2,5; 3mM. Thu được kết
quả:
1,5 2 2,5 3
Hình 3.12 Kết quả khảo sát nồng độ Mg2+
Nhận xét:
Nồng độ ion Mg2+ ảnh hưởng rõ rệt đến quá trình PCR.
Kết quả trên cho thấy ứng với nồng độ độ ion Mg2+ 2mM thì sản phẩm PCR
cho vết băng rõ và đa hình nhất.
Từ các kết quả thực nghiệm trên, các thông số cho kỹ thuật RAMS được xác định
như sau: mồi R1, nhiệt độ gắn mồi 37,5oC, nồng độ Mg2+ 2mM.
3.7.2 Tiến hành RAMS
Trên cơ sở các thông số đã thiết lập (mồi, nhiệt độ gắn mồi, nồng độ Mg2+ ), tiến
hành RAMS trên các mẫu DNA thu được kết quả như sau:
Kết quả nghiên cứu 45
M SM SH1 SH2 TTTQ SH3 SVN
Hình 3.13 Kết quả tiến hành RAMS
(M: Thang 1000bp)
3.7.3 Phân tích bằng Bionumeric
Hình 3.14 Kết quả phân tích đa hình thử nghiệm RAMS
Nhận xét: Kết quả phân tích sự đa hình sản phẩm PCR RAMS trên phần mềm
Bionumeric cho thấy mức độ đa hình giữa các mẫu không cao (dưới 15%). Điều
này có thể do số lượng mẫu phân tích ít và chỉ có một mồi được áp dụng. Như vây,
đối với phương pháp RAMS cần dùng số mẫu lớn và kiểm tra nhiều mồi để làm
tăng các dấu ấn đa hình.