Luận văn Bước đầu phân tích proteomics tế bào bệnh leukemia

ng lớn nghiên cứu protein sản phẩm của gen, không chỉ là tất cả các protein của một tế bào nào đó, mà còn là tập hợp của tất cả các dạng, những protein đã được cải biến, những tương tác giữa chúng, cấu trúc không gian và cả những phức hệ cao hơn của protein. Nghiên cứu proteomics thường được coi như là bước tiếp theo trong quá trình nghiên cứu hệ thống sinh học. Vì sao phải nghiên cứu hệ protein? Việc giải mã hoàn chỉnh hệ gen người là một bước tiến lớn của nền khoa học nhưng đồng thời cũng đặt ra một thực tế là thông tin di truyền của bộ gen người cho biết không đầy đủ chức năng của nó. Ở mức độ phiên mã, mặc dù đã đạt được những thành tựu đáng kể trong nghiên cứu mức độ biểu hiện, nhưng vẫn còn nhiều hạn chế, nhiều vấn đề không thể giải quyết được như: sau dịch mã, đa số các protein bị biến đổi hóa học bởi các quá trình cải biến, các tương tác protein-protein, các phản ứng với gốc cacbonhydrat, gốc photphat. Những biến đổi này đóng vai trò chủ yếu trong việc kích hoạt chức năng của protein. Kết quả là từ một gen ban đầu có thể tìm thấy sự đa dạng về biểu hiện, cấu trúc, và chức năng dưới nhiều loại protein khác nhau. Có nhiều nghiên cứu cho thấy, ở người có 25.000 gen đã được nhận diện nhưng có khoảng lớn hơn 500.000 protein được tạo ra từ các gen đó [17]. Điều này là tăng thêm phần khó khăn với những thay đổi do sự tác động cơ học, sự cải biến của các protein (các quá trình glycosyl hóa, phosphory hóa) và sự biến tính của protein. Như vậy, mức độ biểu hiện gen không phản ánh đúng về số lượng protein có hoạt tính trong tế bào. Ngoài ra, theo các kết quả nghiên cứu thì chỉ có khoảng 2% số bệnh tật đã biết được xác định là do các sai lệch về gen: ví dụ như ở bệnh bạch cầu cấp dòng tủy, thể M2 là do chuyển đoạn nhiễm sắc thể số 8 và nhiễm sắc thể số 21 hoặc thể M3 là sự chuyển đoạn nhiễm sắc thể số 15 và nhiễm sắc thể số 17, 98% số bệnh còn lại cần được làm sáng tỏ ở mức tương tác protein hay còn gọi là mạng lưới protein. Do đó cần xác định cấu trúc không gian ba chiều của những protein này, từ đó cho thấy việc nghiên cứu hệ protein người là cần thiết. Các nhà khoa học trên thế giới rất quan tâm đến proteomics bởi vì nó mang lại những hiểu biết về thế giới sinh học nhiều hơn so với những hiểu biết về cấu trúc cơ thể cũng như là hệ gen. Từ khi protein đóng vai trò trung tâm trong cơ thể sống thì proteomics chính là công cụ hữu hiệu trong việc khám phá ra các chỉ thị sinh học (biomarkers), nhằm nhận diện các loại bệnh khác nhau. Cơ thể con người thậm chí có thể có đến trên 2 triệu loại protein, mỗi loại đóng một vai trò khác nhau. Tính chất không đồng nhất giữa các loại protein đã cho thấy sự đa dạng của protein không thể giải thích và mô tả hoàn toàn thông qua quá trình phân tích hệ gen. Do đó proteomics được sử dụng hữu hiệu hơn trong việc nghiên cứu tế bào và các loại mô. 1.2.2. Proteomics và chỉ thị sinh học Một trong những ứng dụng quan trọng của proteomics là sử dụng các protein đặc hiệu làm các chỉ thị sinh học trong chẩn đoán bệnh. Một số kỹ thuật cho phép kiểm tra quá trình sinh ra của các protein trong suốt quá trình hình thành của từng loại bệnh, từ đó có thể chẩn đoán các loại bệnh rất nhanh chóng. Các kỹ thuật này bao gồm Western blot, nhuộm mô hóa miễn dịch, hấp phụ miễn dịch liên kết enzyme (enzyme linked immunosorbent assay-ELISA) hoặc khối phổ. Theo đó có một vài loại bệnh mà những chỉ thị sinh học có thể nhận ra một cách dễ dàng để chẩn đoán bệnh. Ở người bị bệnh Alzheimer, sự tăng lên của β-Secretase tạo nên amyloid/beta-protein, chúng tập hợp tạo thành mảng trong não bệnh nhân, gây ra chứng mất trí. Tấn công vào enzyme này làm giảm amyloid/beta-protein và làm chậm tiến trình của bệnh. Để xác định sự tăng của amyloid/beta-protein, người ta đã áp dụng kỹ thuật nhuộm hóa mô miễn dịch (immunohistochemical staining), trong đó kháng thể được gắn vào amyloid/beta-protein có mặt trong các mô[15]. Đau tim là căn bệnh thường được đánh giá bằng một vài loại protein chỉ thị sinh học. Các protein chuẩn làm chỉ thị cho các bệnh tim mạch bao gồm interleukin-6, interleukin-8, serum amyloid A protein, fibrinogen, và troponins. cTnI cardiac troponin I sẽ tăng lên và tập trung trong vòng từ 3 đến 12 giờ trước khi những triệu chứng ban đầu khi bị đau tim xuất hiện và có thể dự đoán trước nhiều ngày sau khi có cơn nhồi máu cơ tim cấp tính. Có rất nhiều thương phẩm đã được sản xuất và được dùng trong bệnh viện như là những phương thức chính để kiểm tra chứng nhồi máu cơ tim cấp. Phân tích proteomics của tế bào thận và tế bào ung thư thận đã được tiến hành hứa hẹn tạo ra chỉ thị sinh học cho các tế bào ung thư biểu mô ở thận và phát triển thành bộ kit thử để kiểm tra bệnh. Ở các bệnh liên quan đến thận, nước tiểu là một nguồn chỉ thị sinh học đầy tiềm năng. Gần đây, người ta đã nghiên cứu được các polypeptides trong nước tiểu có thể là những chỉ thị sinh học của các bệnh liên quan đến thận, cho phép người ta có thể phân tích, chẩn đoán bệnh một vài tháng trước khi xuất hiện các triệu chứng của bệnh [22]. Việc nắm được thông tin của hệ proteome, cấu trúc và chức năng của từng protein và phức hệ tương tác protein-protein sẽ quyết định đến việc phát triển các kỹ thuật chẩn đoán hữu hiệu cũng như những phương pháp chữa trị bệnh trong tương lai. 1.2.3. Một số kỹ thuật quan trọng sử dụng trong Proteomics Proteomics phát triển dựa trên sự tiến bộ của rất nhiều công nghệ. - Kỹ thuật điện di một chiều và hai chiều : Điện di là hiện tượng dịch chuyển của các vật thể mang điện tích dưới tác động của điện trường. Điện di hay điện di trên gel áp dụng trong sinh học phân tử là một kĩ thuật để phân tích các phân tử ADN, ARN hay protein dựa trên các đặc điểm vật lý của chúng như kích thước, hình dạng hay điểm đẳng điện (isoelectric point). Kĩ thuật này hoạt động nhờ vào lực kéo của điện trường tác động vào các phân tử tích điện và kích thước lỗ của thể nền (gel). Các phân tử được phân tách khi di chuyển trong gel với vận tốc khác nhau phụ thuộc vào sự khác nhau của lực điện trường tác động lên chúng (nếu các phân tử tích điện khác nhau), kích thước của phân tử so với kích thước lỗ của gel và hình dạng, độ cồng kềnh của phân tử. Điện di protein thường sử dụng là điện di trên gel acrylamide có SDS (SDS-PAGE), hoặc điện di 2 chiều (2-DE). Phương pháp nền tảng trong nghiên cứu proteomics là điện di hai chiều (2-DE), cho đến nay vẫn được coi là phương pháp không thể thay thế trong việc mô tả thành phần protein (hệ proteome) của một cơ thể. 2-DE được giới thiệu lần đầu tiên vào năm 1975 bởi Klose và O'Farrell [19]. Kỹ thuật này cho phép phân tích và nhận rõ ràng đến hàng nghìn protein trong một bản gel điện di, trong đó các protein được phân tách dựa trên hai đặc tính là điểm đẳng điện và khối lượng phân tử. Ứng dụng của điện di hai chiều là phân tách phức hệ protein hỗn hợp và phân tích sự cải biến protein sau khi phiên mã. Điện di hai chiều còn cho ta biết những thông tin có giá trị về đặc tính phân tử protein, mối quan hệ giữa điểm đẳng điện (pI) của protein và khối lượng phân tử. - Các phần mềm phân tích ảnh Các phần mềm phân tích ảnh điện di có khả năng định lượng và tự động nhận ra các điểm của protein trong gel mẫu. Mặc dù các phần mềm này chưa thật hoàn hảo nhưng kết hợp với năng lực xử lý và kinh nghiệm người sử dụng, các phần mềm này đều cho những kết quả rất tốt. - Sắc ký lỏng đa chiều (Multidimentional Liquid Chromatography-MDLC) Mặc dù điện di hai chiều có nhiều ưu điểm như đã trình bày ở trên nhưng phương pháp này còn có hạn chế là: khó phát hiện các protein có hàm lượng thấp, có điểm đẳng điện quá thấp hoặc quá cao cũng như các protein không hòa tan là thành phần cấu trúc của màng. Một phương pháp khác cho phép khắc phục những nhược điểm ấy là kỹ thuật sắc ký đa chiều (MDLC). MDLC cho phép phân tích hiệu quả các thành phần protein phức tạp, trong đó mỗi hỗn hợp protein có thể giảm độ phức tạp qua một loạt cột sắc ký lỏng khác nhau. Dựa vào số lần mẫu được tiến hành phân tích qua sắc ký mà người ta chia thành sắc ký lỏng một chiều, hai chiều (2DLC) (kết hợp sắc ký trao đổi ion hoặc sắc ký ái lực và sắc ký pha đảo), hoặc ba chiều - Khối phổ Phương pháp khối phổ xuất hiện từ những năm đầu của thế kỉ XX do Thomson và các nhà khoa học khác tìm ra từ năm 1912 [17]. Nó đóng vai trò quan trọng trong việc xác định cấu trúc của những phân tử nhỏ. Sau đó, phương pháp này cũng được cải tiến để ứng dụng trong nghiên cứu sinh học đặc biệt là xác định cấu trúc của các đại phân tử như protein. Proteomics dựa trên nguyên lý khối phổ đã trở thành một môn khoa học thật sự nhờ các dữ liệu về trình tự gen và genome cùng với nhiều thành tựu kỹ thuật vượt bậc trong nhiều lĩnh vực khác, trong đó đặc biệt phải kể đến sự phát triển của những phương pháp ion hóa protein. Các kỹ thuật này là những kỹ thuật không thể thiếu được để diễn giải những thông tin được mã hóa trong hệ genome. Cho đến nay những phân tích về protein (trình tự bậc 1, những biến đổi sau phiên mã, dịch mã hoặc tương tác giữa protein-protein v.v.) bằng khối phổ không chỉ thành công với những nhóm protein có chức năng riêng biệt, mà cả với phức hệ protein được biểu hiện trong tế bào. Trong những năm gần đây, khối phổ (MS) đã trở thành công cụ được lựa chọn để hoàn thiện phân tích những mẫu protein. Khối phổ là một phương pháp kỹ thuật ở đó đo được 2 đặc tính: tỷ lệ khối lượng/điện tích của phân tử ở dạng ion hóa (m/z); và số lượng những ion biểu hiện cho mỗi giá trị m/z. Một cách đơn giản, kỹ thuật phân tích này làm cho từng phân tử protein tách khỏi nhau thành các peptid nhỏ và phát tán rộng như một đám mây gồm các ion mang điện tích và di chuyển tự do. Phương pháp phổ biến để xác định khối lượng của các ion này - là gia tốc chúng trong buồng chân không, để đo được thời gian bay (Time of Flight - TOF) của chúng. Chúng "đạt tới mục tiêu" trong một trật tự được xác lập, một phần bởi điện tích và một phần bởi khối lượng của chúng. Những ion nhanh nhất là những ion nhẹ nhất và có điện tích lớn nhất. Sản phẩm cuối cùng là một phổ khối lượng hay đồ thị với một loạt những đỉnh nhọn, mỗi một đỉnh tiêu biểu cho ion hoặc chất mang những mảnh protein có mặt trong mẫu thử đã cho. Chiều cao của đỉnh và khoảng cách giữa chúng là dấu hiệu của mẫu và cung cấp đầu mối để nhận dạng chúng 1.3. Proteomics trong nghiên cứu bệnh leukemia Với những tiến bộ trong chẩn đoán và điều trị bệnh leumkemia, tỷ lệ bệnh nhân tử vong đã giảm và tỷ lệ bệnh nhân sống sót cũng tăng ở cả người trưởng thành và trẻ em trong tất cả các thể bệnh. Tuy nhiên vẫn có tới 21790 người chết ở Mỹ vào năm 2007 vì loại bệnh máu ác tính này. Với các thể bệnh leukemia, tỷ lệ sống sót chỉ chỉ hơn 50%. Mặc dù tỷ lệ tử vong ở trẻ em từ 0-14 tuổi mắc leukemia đã giảm đến 70% qua ba thập kỷ nhưng bệnh này vẫn gây ra nhiều cái chết hơn bất cứ bệnh ung thư nào khác đối với trẻ em Mỹ. Ước tính đã có 515 trẻ em chết vì leukemia tại Mỹ năm 2007[18]. Do đó, việc điều trị bệnh leukemia vẫn luôn là một trong những thách thức to lớn của nền y học hiện đại. Mục tiêu của việc điều trị là làm giảm hoàn toàn các triệu chứng, bệnh lý của bệnh và bệnh nhân trở lại sức khỏe bình thường với các tế bào máu và tủy bình thường. Đối với bệnh leukemia cấp, sự lui bệnh hoàn toàn (không có các biểu hiện về bệnh trong máu và tế bào) trong 5 năm liên tục là dấu hiệu chứng tỏ bệnh đã được chữa trị. Các báo cáo gần đây cho thấy càng ngày càng có nhiều bệnh nhân leukemia đã lui bệnh hoàn toàn ít nhất sau 5 năm khi họ chẩn đoán phát hiện bệnh. Để nâng cao khả năng chẩn đoán và đẩy lui bệnh, ngày càng có nhiều phương pháp mới được áp dụng trong nghiên cứu leukemia. Phương pháp quan sát kiểu nhân đã cung cấp các thông tin quan trọng nhất trong chẩn đoán ở AML trưởng thành. Ngoài ra, bằng việc sử dụng các phân tích trên nhiễm sắc thể thấy rằng xấp xỉ 50% số bệnh nhân AML không có các bất thường nhiễm sắc thể [13]. Đối với các bệnh nhân AML này, các phương pháp di truyền phân tử trở thành yếu tố quan trọng chính. Liệu pháp miễn dịch cung cấp cơ hội loại bỏ các tế bào miễn dịch còn sót lại trong quá trình lui bệnh và có thể giảm đáng kể hay thậm chí loại trừ rủi ro của sự tái phát. Trong suốt 20 năm qua, y học đã có sự cải tiến đáng kể trong khả năng đánh giá xác định các kháng nguyên ung thư. Phân tích huyết thanh qua các ngân hàng biểu hiện cADN tái tổ hợp cho phép việc nhận dạng các kháng nguyên liên kết với leukemia dựa vào việc nhận ra chúng bằng các phản ứng dịch thể nhưng cũng đưa ra một chứng minh rằng những kháng nguyên này được nhận biết bằng các tế bào T CD4+ và CD8+ cũng tốt như tế bào B. Gần đây, kỹ thuật vi chuỗi phản ứng (microarray), phân tích đa hình nucleotide đơn (SNPs) và điện di hai chiều cho phép chúng ta phân tích sâu rộng về sự khác biệt về gen, ARN và protein giữa bệnh nhân và các mẫu đối chứng bình thường. Hiện nay, với việc áp dụng các kỹ thuật proteomics trong phân tích leukemia người ta đã đi sâu vào nghiên cứu leukemia theo nhiều con đường và mục đích khác nhau. Tất cả các nghiên cứu này hướng tới mục đích cuối cùng là làm tăng hiệu quả điều trị bệnh leukemia. Các nghiên cứu proteomics bệnh leukemia thường dựa trên một trong hai nguồn nguyên liệu chính là huyết tương và tế bào bệnh nhân 1.3.1. Phân tích proteomics trong huyết tương bệnh nhân leukemia Huyết tương (plasma) là phần dịch lỏng màu vàng nhạt còn lại sau khi máu đã loại bỏ các tế bào máu. Một người trưởng thành chứa khoảng 2,5 lít huyết tương với gần 250gram protein. Hàm lượng protein trong huyết tương thay đổi từ 60-80mg/ml. Dịch huyết tương có tính lỏng, keo nhớt, có tỷ trọng 1,051±0,005, pH=7,3-7,4, ở 370C, áp suất thẩm thấu trong khoảng 7,2-8,1. Người ta ước lượng có khoảng từ 1000 đến 2000 protein khác nhau có mặt trong huyết tương tại một thời điểm nhất định, phần lớn trong số chúng là các protein có nồng độ rất thấp (<1ng/ml). Các protein trong huyết tương thay đổi khác nhau về số lượng và nồng độ, nó được coi là hệ protein phức tạp nhất ở người. Huyết tương cũng được coi là hệ protein hoàn thiện nhất, chứa một loạt các protein khác nhau, là mẫu proteome hàng đầu được dùng cho chẩn đoán y học. Những hiểu biết hệ protein huyết tương rất quan trọng về mặt lâm sàng, cung cấp những thông tin chắc chắn thúc đẩy nhanh quá trình phát hiện bệnh. Một số protein có hàm lượng cao (>mg/ml) như albumin thông thường thay đổi từ 35-50 mg/ml (chiếm từ 50-70%), do sự tổng hợp hàng ngày của gan (12g) và có chu kỳ sống là 21 ngày nên nó được coi là chỉ thị của bệnh sơ gan hay bệnh suy dinh dưỡng . Các protein có hàm lượng thấp (<ng/ml) chỉ chiếm 1% hàm lượng protein tổng số, như interleukin 6 thông thường thay đổi trong khoảng 0-5 pg/ml được coi là chất chỉ thị có độ nhạy cao trong quá trình viêm, nhiễm vi sinh vật. Hiện nay hơn 22 triệu lít huyết tương của người đã được xử dụng trên toàn thế giới thông qua quá trình phân đoạn trong mỗi một năm nhằm tạo ra các protein điều trị bệnh cho hơn một triệu người. Những hiểu biết về hệ protein trong huyết tương mang lại những thông tin quan trọng về nhiều quá trình sinh học diễn ra trong cơ thể. Bất cứ một thay đổi nào của các protein huyết tương cũng sẽ là dấu hiệu của tình trạng bệnh lý như: ung thư, tiểu đường, tim mạch v.v. Do đó việc nhận dạng các protein, peptid trong huyết tương có thể cung cấp nhiều thông tin mà cơ thể phản ứng với những thay đổi này. Phân tích và so sánh các thành phần protein trong huyết tương của người ở trạng thái bình thường và bị bệnh có thể giúp cho các nhà nghiên cứu hiểu rõ hơn các sự cố trong tế bào dẫn đến bệnh lý, đồng thời đưa ra phương pháp chẩn đoán mới, nhanh và có hiệu quả. Một trong những động lực khi nghiên cứu hệ protein là khám phá ra những chỉ thị sinh học, những protein này có thể là đích tác động của thuốc chữa bệnh và chúng sẽ có một vai trò quan trọng đối với sự phát triển những liệu pháp chữa trị mới. Đã có nhiều nghiên cứu chứng minh rằng protein huyết tương có thể là các chỉ thị sinh học đủ tin cậy trong chẩn đoán một số bệnh như: ung thư buồng trứng (CA 13-5), ung thư tuyến tiền liệt (PAP), ung thư gan (a-fetoprotein), và các bệnh về tim mạch (C-ractive protein) [11]. Mặc dù qua nhiều thập kỉ nghiên cứu nhưng mới chỉ có một lượng nhỏ các loại protein được sử dụng cho mục đích chẩn đoán. Bệnh leukemia là một bệnh liên quan trực tiếp đến hệ thống máu trong cơ thể, do đó, rõ ràng việc lựa chọn hệ protein huyết tương làm đối tượng nghiên cứu bệnh leukemia là một việc tất yếu, hứa hẹn đem lại nhiều thành quả quan trọng trong việc nghiên cứu leukemia nói chung. Trên đối tượng là huyết tương của các bệnh nhân leukemia kinh dòng lympho (CLL), năm 2003, Cochran và cộng sự đã phân tích proteomics các phân nhóm CLL với các gen Ig VH đột biến và không đột biến [8]. Phân tích hệ protein của 12 bệnh nhân CLL với 6 trường hợp có đột biến và 6 trường hợp không đột biến trên chuỗi nặng Ig bằng cách sử dụng điện di hai chiều và khối phổ. Kết quả là họ đã tìm ra một số protein biểu hiện khác biệt giữa mẫu có đột biến và không có đột biến. Nồng độ của protein F-actin-capping tiểu đơn vị b, protein 14-3-3 b và tiền chất protein gắn laminin tăng lên ở CLL đột biến so với thể không đột biến. Ngoài ra, nucleophosmin chỉ xuất hiện dưới dạng một vài spot protein ở CLL thể đột biến mà không phát hiện thấy trên mẫu không đột biến. Điều này có thể được giải thích rằng một số dạng cải biến sau dịch mã của nucleophosmin biến đổi giữa hai nhóm này. Kết quả này cho thấy phân tích proteomics huyết tương có thể bổ sung các phương pháp trong việc nhận dạng protein, các protein này có thể có vai trò quan trọng trong việc xác định sự khác biệt về sinh học và trong chẩn đoán giữa các phân nhóm CLL. 1.3.2. Phân tích proteomics tế bào bệnh nhân leukemia Wang và các cộng sự (2004) đã tiến hành nghiên cứu proteomics dòng tế bào leukemia (K562/CR3) bằng việc sử dụng điện di không dòng kết hợp với sắc ký lỏng và khối phổ LC/MS [28]. Các tế bào được dung giải đã được phân tách thành 96 phân đoạn bằng điện di không dòng, sau đó được chạy qua SDS- PAGE và những phân đoạn hiện băng được chạy tiếp qua LC/MS. Trong 96 phân đoạn đó có 35 phân đoạn pH từ 4,75 đến 9,6 được lựa chọn để xác định và đã nhận dạng được 736 protein khác nhau. Cũng vào năm 2004, Cui và cộng sự đã tiến hành phân tích proteomics tế bào bệnh nhân leukemia cấp nhằm tìm hiểu sâu hơn về hệ thống phân loại chúng [10]. Hệ thống phân loại của Pháp-Mỹ-Anh (FAB) về leukemia cấp với các khác biệt di truyền đóng vai trò quan trọng trong điều trị và chẩn đoán bệnh. Tuy nhiên, việc mô tả và xác định các phân tử protein khác nhau phân biệt giữa các phân nhóm của hệ thống phân loại leukemia cấp vẫn chưa rõ ràng. Nghiên cứu được thực hiện trên 61 bệnh nhân leukemia cấp đã được phân loại theo hệ thống FAB. Các protein của những tế bào leukemia lấy từ các bệnh nhân này được phân tách bằng điện di hai chiều và các spot protein có biểu hiện khác nhau được nhận dạng bằng khối phổ. Nhóm nghiên cứu này đã thành công trong việc mô tả các protein khác biệt giữa các nhóm và các phân nhóm theo phân loại FAB, bao gồm leukemia cấp dòng tủy, các phân nhóm của nó (M2, M3 và M5) và leukemia cấp dòng lympho. Họ đã nhận được kết quả đồng nhất giữa các mẫu thuộc cùng một phân nhóm và sự khác biệt rõ rệt với tất cả các phân nhóm khác. Một nhóm protein biểu hiện với hàm lượng cao hơn ở M2 và M3 so với các phân nhóm khác cũng được xác định. Cũng trong nghiên cứu này, các protein liên quan dòng tủy Mrp 8 và Mrp 14 lần đầu tiên được đưa ra để đánh dấu sự khác biệt của AML và phân biệt AML với ALL. Protein sốc nhiệt 1 (HSP 1) và một số protein khác biểu hiện tăng ở ALL được tìm thấy đóng vai trò quan trọng trong việc phân biệt ALL với AML. Protein NM23-H1 có biểu hiện mạnh ở tất cả các phân nhóm trừ dạng M3a có thể có ích trong chẩn đoán. Những kết quả nghiên cứu này liên quan đến việc mô tả các con đường biểu hiện gen bất thường trong phát sinh bệnh leukemia có thể làm cho việc xác định ở mức độ phân tử hệ thống phân loại FAB được dễ dàng. Năm 2005, Rezaul và nhóm nghiên cứu đã phân tích hệ protein ty thể từ các tế bào T bệnh nhân leukemia [21]. Với 40 mg protein tinh sạch từ ty thể, nhóm nghiên cứu đã xác định được 227 protein ty thể đã được biết đến và thêm 453 protein được coi là protein liên kết với ty thể. Phân tích 60 mg protein ty thể xác định được 466 protein được biết đến là có chức năng tham gia vào các quá trình khác nhau như hô hấp, chu trình tricarboxylic acid (chu trình TCA), chuyển hóa amino acid và nucleotide, đường phân, stress bảo vệ chống oxy hóa, tập trung ty thể, vận chuyển các phân tử, sinh tổng hợp protein, điều khiển chu trình tế bào và rất nhiều các quá trình khác trong tế bào. Với một nghiên cứu tương tự, năm 2006, López-Pedrera và nhóm nghiên cứu của mình đã tiến hành phân tích những thay đổi trong biểu hiện protein ở các tế bào leukemia cấp dòng tủy bằng các kỹ thuật proteomics nhằm đi sâu vào chẩn đoán sớm chính xác hơn bệnh ung thư này. Bẩy protein được xác định có thay đổi đáng kể trong hầu hết các tế bào nguồn AML phân tích trong mối tương quan với các tế bào máu đơn nhân bình thường: alpha-enolase, RhoGD12, annexin A10, catalase, peroxiredoxin 2, tromomyosin 3 và lipocortin (annexin 1). Các protein khác biệt này đóng vai trò quan trọng trong việc thực hiện các chức năng tế bào như thủy phân glycogen, ngăn chặn khối u, apoptosis, hình thành mạch, di căn và chúng có thể tạo ra tiến triển bất lợi cho bệnh. Trong nghiên cứu này, áp dụng phân tích proteomics lần đầu tiên xác định các protein mới không những giúp ích cho chẩn đoán mà còn được sử dụng như là các dấu chuẩn sinh học của bệnh, vì thế cung cấp các đích mới quan trọng cho các liệu pháp dựa trên cơ chế sinh bệnh của AML. 1.3.3. Nghiên cứu proteomics bệnh leukemia ở Việt Nam Trong những năm gần đây, phương pháp proteomics đã bắt đầu được áp dụng trong việc nghiên cứu bệnh leukemia ở Việt Nam. Năm 2005, Trịnh Hồng Thái và cộng sự đã áp dụng kỹ thuật điện di hai chiều kết hợp với khối phổ để phân tích proteomics huyết tương người bị bệnh leukemia cấp dòng tủy [25]. Bằng việc so sánh các bản gel điện di hai chiều, nhóm nghiên cứu đã nhận ra 12 protein biểu hiện khác nhau trong đó có các protein là chất phản ứng pha cấp và một số là chất chỉ thị ung thư. Trong số các protein này có enzyme ADN topoisomerase được biểu hiện tăng lên ở người bị leukemia cấp dòng tủy, enzyme này đã được chứng minh có liên quan tới sự chuyển vị nhiễm sắc thể 8;21 trong bệnh này. Tiếp theo nghiên cứu này, nhóm nghiên cứu đã phân tách được trung bình 600 spot protein trên các bản gel điện di huyết tương các thể bệnh leukemia cấp dòng tủy. Phân tích so sánh đã chỉ ra được 2 protein chỉ xuất hiện ở người bình thường mà không có ở các bản gel bệnh, 4 spot protein chỉ có mặt trên các bản gel bệnh mà không tìm thấy trên mẫu đối chứng. Để mở rộng đối tượng nghiên cứu trên các thể bệnh leukemia, năm 2007 Trịnh Thị Thanh Hương và Trịnh Hồng Thái đã công bố kết quả phân tích proteomics huyết tương người bệnh leukemia cấp dòng lympho [3]. Trong kết quả này, sự khác biệt trong biểu hiện protein giữa mẫu đối chứng và các thể bệnh cũng được phát hiện. Tất cả các kết quả trên của nhóm nghiên cứu này nhằm chỉ ra sự khác biệt trong biểu hiện protein ở huyết tương bệnh nhân, tìm ra các marker sử dụng trong chẩn đoán bệnh. Các công trình nghiên cứu trên đang tiếp tục và mở rộng đối tượng, hứa hẹn nhiều kết quả khả quan, ứng dụng thiết thực trong sinh, y, dược học. CHƯƠNG 2- NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên liệu 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu là 46 bệnh nhân được chẩn đoán mắc leukemia từ tháng 11/2007 đến tháng 2/2008 tại Viện huyết học và Truyền máu Trung ương. Dựa trên các kết quả xét nghiệm, những bệnh nhân này được xác định thuộc các thể bệnh: - ALL thể L2: 20 người, thể L3: 1 người - AML thể M1: 1 người, M2: 5 người, M3: 2 người, M4: 3 người , M5: 3 người, M6: 4 người. - CLL: 1 người - CML: 6 người Để nghiên cứu proteomics tế bào, mẫu tủy của 31 bệnh nhân được chọn ra một cách ngẫu nhiên để tiến hành các bước phân tích. Ngoài ra nghiên cứu cũng được tiến hành trên mẫu huyết tương của các bệnh nhân này. Huyết tương thu được từ máu đã chống đông và đã được xác định là không bị nhiễm các loại bệnh truyền nhiễm. 2.1.2. Hoá chất - Chất tạo tỉ trọng tách bạch cầu Ficoll™ 400 F4375 (Sigma-Mỹ) - ReadyPrep™ 2D Cleanup Kit (BioRAD-Mỹ) - IPG strip pH 4-7 chiều dài 7cm (Biorad- Mỹ). - Bio-Lyte 3/10 ampholyte (Biorad- Mỹ) - Enzyme trypsin đạt độ sạch phân tích (Promega- Mỹ). - Tất cả các hoá chất khác: 3-[(3-cholamidopropyl) dimethylammonio]-1-propanesulfonic acid (CHAPS), Urea, Thiourea (Invitrogen), dithiothreitol (DTT), Iodoacetamide (Biorad), SDS, Acylamide (USB- Pharmacia), … đạt độ tinh sạch dùng cho phân tích proteomics 2.1.3. Thiết bị - Ly tâm lạnh sử dụng roto văng Sigma - Thiết bị điện di biến tính SDS-PAGE: Mini-Protean 3 (BioRad-Mỹ). - Nguồn chạy điện di Bio-Rad Power/PAC 1000 (BioRad-Mỹ) - Thiết bị điện di Criterion™ Cell (BioRad-Mỹ) - Thiết bị điện di đẳng điện Protean IEF cell (BioRad - Mỹ). - Hệ thống cắt và xử lý gel tự động XCISE (Shimadzu Biotech - Nhật Bản). - Ngoài ra còn các dụng cụ và máy khác của Phòng Proteomics và Sinh học cấu trúc thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm về Công nghệ Enzyme- Protein. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Đánh giá một số đặc điểm tế bào học của bệnh leukemia Các bệnh nhân nhập viện có chẩn đoán xác định mắc bệnh được chọn làm mẫu nghiên cứu. Các số liệu xét nghiệm huyết tủy đồ của bệnh nhân khi vào viện được thu thập nhằm tìm hiểu các đặc điểm tế bào của máu ngoại vi và tủy xương. Các số liệu thống kê về các đặc điểm tế bào được xử lý bằng phần mềm SPSS version 13.0 giúp đánh giá một số đặc điểm tế bào học đặc trưng cho bệnh trong phạm vi các mẫu nghiên cứu. 2.2.2. Tách tế bào bạch cầu từ tủy xương - Mẫu tế bào bệnh nhân leukemia: Dịch tủy sau khi lấy ra từ người bệnh được chống đông bởi EDTA và được sử dụng trong vòng 4 tiếng. Dịch tủy được ly tâm 1500 vòng/phút ở nhiệt độ 20oC trong 10 phút để lắng hồng cầu. Sau đó, mẫu được hòa với đệm PBS theo tỷ lệ 1:1 và rải đều lên bề mặt Ficoll® 400 F4375 có tỉ trọng 1,077 g/ml, tiếp tục ly tâm trong thời gian 30 phút ở nhiệt độ 4oC, tốc độ 4000 vòng/phút. Sau khi ly tâm, lớp tế bào được tách khỏi mẫu dung dịch đệm-Ficoll và rửa bằng đệm PBS. - Mẫu huyết tương bệnh nhân leukemia Mẫu huyết tương của người bệnh được trộn lại thành một ống để phân tích. Huyết tương được ly tâm 4000 vòng/phút trong 5 phút để loại bỏ hết các tế bào máu và sau đó ly tâm 10000 vòng/phút trong 5 phút trước khi bảo quản ở -20oC để chuẩn bị cho các nghiên cứu tiếp theo. 2.2.3. Tách chiết protein từ tế bào bạch cầu - Các tế bào bạch cầu được phá vỡ bằng sóng siêu âm trong đệm chạy điện di hai chiều (đệm A) có chứa 7M urea, 2M thiourea, 4% CHAPS, 65 mM DTT. Dịch phá tế bào được xử lý theo 2 phương pháp: + Tủa dịch phá tế bào bằng acetone lạnh trong -20oC theo tỷ lệ 1:2, 1:3 thể tích. Sau đó hòa tủa bằng đệm A có 0,2% ampholyte 3/10 để chuẩn bị cho bước điện di tiếp theo. + Dịch phá tế bào được làm sạch một phần bằng cách sử dụng ReadyPrep™ 2D Cleanup Kit. Protein tủa được hòa lại bằng đệm A có 0,2% ampholyte 3/10 để chuẩn bị cho bước điện di tiếp theo. - Mẫu huyêt tương bệnh được xử lý bằng ReadyPrep™ 2D Cleanup Kit. Protein lắng tủa được hòa tan bằng, 0,2% ampholyte 3/10 để chuẩn bị cho bước điện di hai chiều tiếp theo. 2.2.4. Điện di hai chiều Hàm lượng protein trong các mẫu huyết tương được xác định bằng phương pháp Bradford trước khi chạy điện di hai chiều để đảm bảo tính đồng nhất về lượng protein lên mẫu điện di hai chiều giữa các mẫu nghiên cứu. Điện di hai chiều bắt đầu bằng việc làm trương strip: dịch protein được ngâm cùng với thanh gel gradient pH cố định (IPG strip) 4-7, chiều dài 11 cm trong thời gian 14h. Trong quá trình này, protein sẽ thấm vào IPG strip. Điện di đẳng điện được thực hiện trên hệ thống Protean IEF cell (Biorad - Mỹ) để tập trung các phân tử protein vào vị trí trên IPG strip nơi có pH trùng với pI của phân tử đó. Quá trình chạy điện di đẳng điện diễn ra theo 3 bước nối tiếp nhau dưới điều kiện về nguồn điện như sau: Bảng 3. Chương trình chạy điện di đẳng điện 11 cm Hiệu điện thế (V) Thời gian (t) V.t (V-giờ) Chế độ tăng U Bước 1 250 20 phút Tuyến tính Bước 2 8.000 2,5 giờ Tuyến tính Bước 3 8.000 20.000 V-giờ Nhanh Tổng 5,5 giờ ~30.000V-giờ Kết thúc điện di đẳng điện, các IPG strip được cân bằng trong 10 ml dung dịch đệm cân bằng I với thành phần 50 mM Tris HCl, pH 8,8; 6 M urea, 30% glycerol 2% SDS có chứa 100 mg DTT. Sau đó tiếp tục cân bằng trong 10ml đệm cân bằng II với thành phần tương tự như đệm cân bằng I chỉ thay DTT bằng 250 mg iodoacetamide. Chiều thứ hai của điện di hai chiều được tiến hành trên gel polyacrylamide có SDS (SDS-PAGE) với gel gradient 7-15% polyacrylamide. Sau khi điện di chiều thứ hai, các gel được cố định trong 1 giờ bởi dung dịch chứa 1,3% axit phosphoric, 20% methanol và nhuộm màu qua đêm bằng Coomassie G-250 theo phương pháp nhuộm Colloidal Coomassie Brilliant Blue của Neuhoff (1988) [26]. Phương pháp nhuộm này đạt độ nhạy cao, có thể hiện lên các spot chỉ chứa 30ng protein. 2.2.5. Phân tích hình ảnh các bản gel điện di hai chiều Các bản gel điện di hai chiều được quét vào máy tính trên hệ thống cắt và xử lý gel tự động Xcise (Shimazdu, Nhật Bản). Hình ảnh thu được phân tích bằng phần mềm chuyên dụng cho phân tích gel điện dai hai chiều Phoretix (Shimazdu, Nhật Bản). Trước tiên phần mềm sẽ xác định tất cả các spot protein có trên mỗi bản gel. Mỗi bản gel được chỉ ra số lượng spot, mỗi spot đều được xác định số thứ tự, vị trí, thể tích (tính theo độ lớn và độ đậm nhạt của spot) của nó trên bản gel. Thể tích hay cường độ khối của từng spot được tính bằng độ lớn của spot đó chia cho tổng số các spot trên toàn bản gel nhân với 100. CHƯƠNG 3- KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 3.1. Đánh giá các đặc điểm tế bào học của bệnh leukemia Trước khi phân tích proteomics tế bào, chúng tôi tiến hành thống kê kết quả xét nghiệm huyết tủy đồ của bệnh nhân nhằm đánh giá các đặc điểm tế bào học của bệnh leukemia. 3.1.1. Đặc điểm tế bào học của bệnh nhân leukemia kinh Nghiên cứu trên 7 trường hợp bệnh nhân leukemia kinh, chúng tôi thu được kết quả sau: Bảng 4. Chỉ số tế bào máu trong leukemia kinh Các chỉ số Trị số TB Độ lệch chuẩn (SD) Số lượng hồng cầu (T/l) 2,84 0,55 Lượng huyết tố - Hb (g/l) 89,14 17,24 Hematocrit (l/l) 0,29 0,05 MCV (lf) 100,57 8,14 MCH (pg) 30,47 2,22 MCHC (g/l) 311,14 13,73 Hồng cầu lưới máu (%) 3,03 2,08 Hồng cầu lưới tủy (%) 3,76 2,21 Số lượng tiểu cầu (G/l) 269,00 119,99 Số lượng bạch cầu (G/l) 177,79 152,16 Số lượng tế bào tủy xương (G/l) 258,95 189,17 Kết quả cho thấy đa số bệnh nhân leukemia kinh có biểu hiện thiếu máu bình sắc mức độ vừa (số lượng hồng cầu 2,84T/l với SD = ± 0,55, Hb: 89,14g/l với SD = ±17,24). Kết quả nghiên cứu của chúng tôi tương đối phù hợp với các nghiên cứu tương tự của Canellos và Rowe [23]. Đa số bệnh nhân có số lượng bạch cầu tǎng rất cao (trị số trung bình là 177,79G/l, SD = ±152,16 so với người bình thường là từ 4-11G/l) trong đó có 57,14% bệnh nhân có SLBC trên 100G/l. Phần lớn bệnh nhân có số lượng tiểu cầu ở mức bình thường (trung bình là 269,00G/l với SD = ±119,99), chỉ có 1/7 bệnh nhân có số lượng tiểu cầu ở trạng thái bệnh lý (tăng trên 400G/l). Thống kê công thức bạch cầu của bệnh nhân leukemia kinh, chúng tôi có bảng sau: Bảng 5. Công thức bạch cầu của bệnh leukemia kinh Các chỉ số Tủy Máu TB(%) SD TB(%) SD Tế bào bất thường 2,29 5,22 1,29 3,40 Nguyên tuỷ bào (NTB) (%) 0,29 0,49 0,00 0,00 Tiền tuỷ bào (TTB) (%) 1,29 0.95 1.00 1.15 Tuỷ bào (TB) (%) 8,86 5.76 7.43 6.68 Hậu tuỷ bào (HTB) (%) 10,00 5,48 8,00 6,35 Bạch cầu đũa (BCĐ) (%) 10,57 8.00 8.71 7.65 Bạch cầu đoạn trung tính (BCĐTT) (%) 36,43 22,31 46,00 23,09 Bạch cầu đoạn ưa axit (BCĐƯAX) (%) 3,40 3,36 3,43 3,36 Bạch cầu đoạn ưa bazơ (BCĐƯBZ) (%) 1,00 0,82 1,50 1,00 Monocyte (M) (%) 0,00 0,00 4,50 2,08 Lymphocyte (L) (%) CML 3,17 1,83 4,50 4,14 CLL 92 0,00 91 0,00 Công thức bạch cầu cho thấy có đủ các tuổi của dòng bạch cầu hạt ở máu ngoại vi, tỷ lệ tế bào blast hoặc nguyên tủy bào và tiền tủy bào rất thấp. Tỷ lệ tế bào blast<15%. Đây chính là một trong những biểu hiện đặc trưng của bệnh leukemia kinh. Tuy nhiên không có sự khác biệt rõ rệt các giữa các trị số trung bình của từng loại bạch cầu trong tủy so với các trạng thái bình thường. Lượng lymphocyte ở bệnh nhân mắc CML tương đối thấp trong khi lượng lymphocyte ở bệnh nhân măc CLL tăng rất cao. Đây là biểu hiện khác nhau đặc trưng giữa hai nhóm CML và CLL 3.1.2. Đặc điểm tế bào học của bệnh nhân leukemia cấp Khác với bệnh leukemia kinh, đặc điểm tế bào học nổi bật của bệnh nhân leukemia cấp là sự xuất hiện tỷ lệ lớn tế bào non ác tính. Bên cạnh đó, nghiên cứu cũng cho thấy sự trưởng thành không bình thường của các dòng tế bào còn lại. Từ kết quả thống kê 39 trường hợp bệnh nhân leukemia cấp được điều trị tại Viện Huyết học Truyền máu Trung ương, chúng tôi thu được kết quả như sau: Bảng 6. Chỉ số tế bào máu trong leukemia cấp Các chỉ số Trị số TB Độ lệch chuẩn (SD) Số lượng hồng cầu (T/1) 2,87 0,68 Lượng huyết tố(g/1) 84,10 16,58 Hematocrit(1/1) 0,27 0,07 MCV(lf) 93,42 8,69 MCH(pg) 29,77 2,72 MCHC(g/l) 320,54 16,91 Hồng cầu lưới máu(%) 1,48 1,74 Hồng cầu lưới tủy(%) 2,42 2,58 Số lượng tiểu cầu(G/l) 67,76 65,52 Số lượng bạch cầu(G/l) 22,31 22,13 Số lượng tế bào tủy xương(G/l) 172,53 167,57 Từ kết quả trên cho thấy đa số bệnh nhân leukemia cấp có biểu hiện thiếu máu bình sắc mức độ vừa (số lượng hồng cầu 2,87T/l với SD = ± 0,68, Hb: 84,10g/l với SD = ± 16,58). Đa số bệnh nhân có số lượng bạch cầu tǎng, trị số trung bình là 22,31G/l, SD = ±22,13. Số lượng tiểu cầu của bệnh nhân giảm, trung bình ở mức 67,76 G/l SD = ±65,52. Các mẫu tủy của bệnh nhân leukemia cấp cũng rất giàu tế bào. Thống kê công thức bạch cầu trong máu và tủy của bệnh nhân leukemia cấp, chúng tôi thu được kết quả sau: Bảng 7. Công thức bạch cầu của bệnh leukemia cấp Các chỉ số Tủy Máu TB(%) SD TB(%) SD Tế bào bất thường 69,15 25,71 53,48 32,23 Nguyên tuỷ bào (NTB) (%) - - - - Tiền tuỷ bào (TTB) (%) - - - - Tuỷ bào (TB) (%) 1,24 2,10 0,32 1,57 Hậu tuỷ bào (HTB) (%) 1,85 2,57 0,44 1,80 Bạch cầu đũa (BCĐ) (%) 2,32 3,25 1,30 4,21 Bạch cầu đoạn trung tính (BCĐTT) (%) 6,54 4,37 20,13 18,79 Bạch cầu đoạn ưa axit (BCĐƯAX) (%) 0,44 0,94 0,46 1,48 Bạch cầu đoạn ưa bazơ (BCĐƯBZ) (%) 0,08 0,35 0,13 0,57 Monocyte (M) (%) 1,15 4,98 3,21 6,18 Lymphocyte (L) (%) 4,95 4,25 22,95 21,38 Qua kết quả trên bảng trên, chúng tôi nhận thấy ở bệnh nhân bị leukemia cấp có tỷ lệ tế bào bất thường rất cao (69,15% ± 25,71%). Một số bệnh nhân bệnh nhân có gặp các tuổi trung gian của dòng hạt nhưng ở tỷ lệ thấp. 3.2. Tách tế bào bạch cầu từ tủy xương bệnh nhân leukemia Mẫu tế bào lấy từ tủy xương người là một mẫu phức tạp, chứa nhiều loại tế bào khác nhau. Đặc biệt số lượng hồng cầu quá lớn từ 4-6T/l, lượng huyết sắc tố nhiều (117,5-153,5g/l) gây ảnh hưởng trực tiếp đến việc phân tích các protein. Mặt khác, các protein có hàm lượng cao trong huyết tương, đường, muối và mỡ trong tủy cũng ảnh hưởng đến kết quả phân tích protein tế bào bệnh leukemia. Để có thể nghiên cứu protein trong tế bào bạch cầu bệnh leukemia thì cần phải tách các tế bào bạch cầu. Do đó chhúng tôi đã sử dụng Ficoll™ 400 để tách các tế bào bạch cầu. Ficoll™ 400 F4375 là một hợp chất cao phân tử dưới dạng bột, trơ, có cấu tạo là polysucrose. Ficoll được pha với đệm PBS hoặc SBSS cho đến khi có tỉ trọng thích hợp cho việc phân tách các loại tế bào theo tỉ trọng. Trong nghiên cứu này, Ficoll đã được pha với PBS để đạt tới tỉ trọng là 1,077g/ml. Để hiệu quả tách tế bào cao đòi hỏi mẫu tủy xương phải được chống đông bằng EDTA hoặc heparin và việc tách tế bào không muộn hơn 4h sau khi tủy đã được lấy từ bệnh nhân. Mẫu tủy được giữ ở nhiệt độ khoảng 20oC, được trộn đều với PBS theo tỷ lệ 1:1 và rải đều lên bề mặt Ficoll có tỉ trọng 1,077g/ml đựng trong ống Eppendoff. Tiến hành ly tâm tách tế bào ở nhiệt độ 4oC. Sau khi tiến hành ly tâm, ta thu được ống mẫu với các lớp tách biệt. Lớp trên cùng là lớp dịch nổi có tỷ trọng nhỏ nhất; dưới lớp này là lớp tế bào màu trắng đục chính là lớp bạch cầu. Tiếp theo là lớp Ficoll có tỉ trọng lớn hơn lớp bạch cầu và cuối cùng là lớp hồng cầu màu đỏ đậm có tỉ trọng lớn nhất. Như vậy với tỉ trọng là 1,077g/ml, Ficoll đã tách riêng hai lớp tế bào có tỉ trọng khác nhau. Kết quả phân tách tế bào được thể hiện ở hình 2. Ficoll 400 Dịch nổi Tế bào bạch cầu Hồng cầu Hình 2. Phân tách tế bào bạch cầu bằng Ficoll™ 400 Lớp tế bào bạch cầu được hút ra và rửa sạch nhiều lần bằng đệm PBS. Để kiểm tra khả năng tách tế bào, chúng tôi đã tiến hành nhuộm tế bào bạch cầu bằng Giêmsa và soi tế bào trên kính hiển vi quang học. Kết quả được trình bày như ở hình 3 B A Hình 3. Ảnh chụp tế bào bạch cầu sau khi phân tách dưới kính hiển vi A: Độ phóng đại 40x; B: Độ phóng đại 100x Trên ảnh chụp mẫu tế bào bạch cầu, ta có thể thấy toàn bộ các tế bào đều bắt màu đặc trưng với thuốc nhuộm Giemsa, chứng tỏ qui trình lọc tách tế bào đã thành công. 3.3. Tách chiết protein từ tế bào bạch cầu 1 2 3 4 Chúng tôi đã tiến hành nhiều phương pháp khác nhau để phá tế bào bạch cầu và tách chiết protein. Dưới đây là kết quả điện di một chiều SDS-PAGE 10% (hình 3) Hình 4. Điện di dịch chiết tế bào bạch cầu trên gel polyacrylamide 10% có SDS Giếng 1: Mẫu được ngâm trong đệm A, giếng 2: mẫu tủa trong TCA/Acetone 10% tỉ lệ 1:3, giếng 3: mẫu được xử lý bằng sốc nhiệt -80oC và tủa trong TCA/Acetone 10% tỉ lệ 1:2, giếng 4: mẫu được xử lý bằng xốc nhiệt -80oC và xử lý bằng ReadyPrep Cleanup Kit Kết quả giếng 1 cho thấy ở điều kiện bình thường mẫu tế bào có thể bị hòa tan trong đệm A, có thể tách chiết được các protein. Tuy nhiên, số lượng các băng rất ít, các băng rất dày và đặc biệt có một băng rất đậm chứng tỏ có một loại protein có hàm lượng lớn trong mẫu. Điều này cho thấy mẫu vẫn còn chưa sạch, mẫu vấn có nhiều tạp chất. Để làm sạch mẫu, chúng tôi tiến hành rửa thêm tế bào và ngâm mẫu trong đệm A rồi tủa mẫu trong TCA/Acetone 10% tỷ lệ 1:3 (1 thể tích mẫu: 3 thể tích TCA/Acetone). Kết quả điện di ở giếng 2 cho thấy lượng protein sau khi tủa mẫu là rất thấp. Nguyên nhân là do khi tủa ở tỷ lệ 1:3, protein đã không còn khả năng hòa tan trở trong đệm mẫu điện di. Chúng tôi tiếp tục đưa mẫu tế bào sau khi tách vào tủ lạnh sâu (-80oC) để phá vỡ tế bào bằng cách gây sốc nhiệt khi đưa ra nhiệt độ bình thường. Sau khi ngâm đệm A và tủa theo tỷ lệ thấp hơn (1 thể tích mẫu: 2 thể tích TCA/Acetone), chúng tôi thu được hình ảnh điện di ở giếng 3. Kết quả điện di đã cho thấy hiệu quả tách chiết theo phương pháp này đã tốt hơn. Áp dụng qui trình trên nhưng sử dụng ReadyPrep™ Cleanup Kit thay cho việc tủa bằng TCA/Acetone, chúng tôi đã thu được kết quả như hình 3 giếng 4. Theo phương pháp này, hiệu quả tách chiết protein cao hơn cả. Trên hình ảnh điện di có nhiều băng protein nhất, thể hiện được sự đa dạng của protein trong mẫu. Do đó dịch chiết theo phương pháp này đã được sử dụng cho điện di 2 chiều. 3.4. Điện di hai chiều protein bệnh leukemia Điện di 2 chiều là kỹ thuật nền tảng trong phân tích proteomics. Kỹ thuật này đã được sử dụng để phân tách protein thu được trong dịch chiết tế bào bạch cầu và cả trong huyết tương của bệnh nhân leukemia. Mẫu đem phân tích là mẫu hỗn hợp, bao gồm tế bào bạch cầu của các bệnh nhân leukemia và hỗn hợp huyết tương của chính các bệnh nhân trên. Kết quả điện di 2 chiều được trình bày như ở hình 5 và phụ lục 3. A S5 S4 S3 S2 S1 T1 S6 S5 S4 S3 S2 S1 S7 S6 B Hình 5. Phân tách protein bệnh leukemia bằng điện di hai chiều, sử dụng IPG strip pH 3-10 dài 11 cm ở chiều I và gel gradient 7,5-15% polyacrylamide có SDS ở chiều II. A: Tế bào bạch cầu bệnh leukemia , B: Huyết tương bệnh leukemia Trên bản gel điện di, các protein được phân thành từng spot, hình thành những dãy (chuỗi) spot của một loại protein. Đây là kết quả của việc cải biến protein, có thể do biến đổi sau dịch mã, tạo ra các đồng phân có khối lượng phân tử tương tự nhau và điểm đẳng điện gần nhau. Các spot trên bản gel tế bào bệnh nhân leukemia có khuynh hướng phân bố rời rạc trên toàn bản gel trong khi đó các spot trên bản gel huyết tương lại tập trung thành những vùng chính. Điều này phản ánh sự đa dạng về các loại protein trong cả tế bào và protein trong huyết tương. Sử dụng phần mềm phân tích hình ảnh gel điện di 2 chiều, chúng tôi đã xác định được 93 spot protein trên bản gel điện di từ dịch chiết tế bào và 84 spot protein trên bản gel điện di huyết tương. So sánh giữa huyết tương và tế bào, chúng tôi nhận thấy một số điểm tương đồng và khác biệt (hình 5 và 6). Vùng Tế bào Huyết tương S1 S2+S3 S4 S5 S6 Hình 6. Các vùng spot giống nhau trên 2 bản gel bệnh leukemia Để xác định chính xác hơn các spot điện di, kỹ thuật phân tích 3D đã được áp dụng. Kỹ thuật này cho phép phân biệt các spot điện di, nhất là những spot rất gần nhau mà bình thường không thể phân biệt được (hình 7). Hình 7: Hình ảnh ba chiều (3D) vùng S6 của 2 bản gel A: Tế bào bệnh leukemia , B: Huyết tương bệnh leukemia Dựa vào hình ảnh ba chiều của các spot chúng ta có thể thấy sự khác biệt một cách rõ nét về độ lớn cũng như độ đậm của các spot như được chỉ ra trong hình 6. Độ lớn của spot được thể hiện bằng bề rộng của đáy spot trên hình 3-D, độ đậm của spot được thể hiện bằng chiều cao của spot tính từ đáy lên đỉnh và độ sắc nét của spot nhuộm màu coomasie được thể hiện bằng độ nhọn của spot ấy trên hình ảnh 3-D. Dựa trên cơ sở kết quả nghiên cứu của Anderson năm 1977 (hình 8), ta có thể thấy những cụm protein trên bản gel điện di 2 chiều huyết tương như sau: Chuỗi nhẹ IgG (S2) IgG chuỗi gamma (S5), Antithrombin III, Apo A-II Lipoprotein (HDL), Apo A-II Lipoprotein (HDL), α1 acid Glycoprotein (S7), Haptoglobin chuỗi beta (S6), Platelet actin (S6). Dựa trên những vùng giống nhau giữa 2 bản gel và dựa trên các cụm protein đã xác định được trên bản gel huyết tương, ta có thể dự đoán các cụm protein tương ứng trên bản gel tế bào bệnh leukemia như sau: - Vùng S4: có chuỗi IgG chuỗi gamma - Vùng S6: có 2 cụm protein là Haptoglobin chuỗi beta và Platlet actin - Vùng T1: có cụm Apo A-II Lipoprotein Tuy nhiên, để khẳng định chính xác các protein này, cần phải tiếp tục phân tích protein bằng các kỹ thuật khác trong đó có kỹ thuật khối phổ. Hình 8. Vị trí những protein trên bản gel điện di hai chiều protein huyết tương người. (Anderson L., Anderson N. G. (1977)) Các kết quả trên mới chỉ là dữ liệu bước đầu, phản ánh sơ bộ thành phần protein trong tế bào bạch cầu và huyết tương bệnh nhân leukemia. Thành phần protein trong huyết tương của bệnh leukemia đã được công bố trong một số công trình nghiên cứu ở trên thế giới cũng như ở Việt Nam như của Cochran và cộng sự (2003) [8], của Trịnh Hồng Thái và Trịnh Thị Thanh Hương năm 2005 và 2007 [3][25]. Thành phần protein trong tế bào bạch cầu của bệnh này cũng đã được nghiên cứu bởi Wang và cộng sự (2004)[28], Cui và cộng sự (2004)[10], thậm chí còn được phân tách trong ty thể (Rezaul và cộng sự năm 2005)[21]. Các kết quả nghiên cứ này đã cho biết sự đa dạng, phong phú của các protein trong tế bào bạch cầu và trong huyết tương. Tuy nhiên nhiều điểm vẫn chưa được sang tỏ, liệu các protein được tổng hợp trong bạch cầu có được tiết vào huyết tương hay không và khả năng nhận dạng các protein này, nhất là các protein có ý nghĩa như là chỉ thị của bệnh. Vì vậy, các nghiên cứu tiếp theo cần phải đi sâu phân tách đầy đủ và rõ ràng các protein trong tế bào bạch cầu và huyết tương của bệnh nhân leukemia, làm cơ sở cho phân tích nhận dạng protein, phục vụ cho chẩn đoán và điều trị bệnh. CHƯƠNG 4- KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Từ những kết quả nghiên cứu thu được chúng tôi rút ra các kết luận sau: 1. Đa số các bệnh nhân leukemia kinh lúc được chẩn đoán xác định có thiếu máu vừa, số lượng tế bào bạch cầu tǎng cao. Công thức bạch cầu trong máu ngoại vi gặp đủ các tuổi của dòng bạch cầu hạt. Tỷ lệ tế bào blast<15%. Đa số các bệnh nhân leukemia cấp lúc được chẩn đoán xác định có thiếu máu vừa, số lượng bạch cầu tăng nhẹ, tỷ lệ tế bào blast trong tủy tăng rất cao. Số lượng tiểu cầu giảm. 2. Có thể phân tách được tế bào bạch cầu trong mẫu tủy xương của bệnh nhân leukemia bằng Ficoll 400 F4375 tỉ trọng 1,077 g/ml. 3. Chiết protein từ tế bào bạch cầu bằng phương pháp sốc nhiệt từ -80oC, đệm A và làm sạch bằng ReadyPrep Cleanup Kit. 4. Bằng kỹ thuật điện di 2 chiều đã phân tách được 93 spot protein từ tế bào bạch cầu bệnh leukemia. Các spot này phân bố rải rác trên toàn bộ bản gel điện di. KIẾN NGHỊ Qua quá trình nghiên cứu, chúng tôi đưa ra một số kiến nghị như sau: 1. Tiếp tục thu thập tế bào bệnh nhân leukemia ở tất cả các thể nhằm phân tích proteomics tế bào bạch cầu của tất cả các đối tượng, tìm ra hệ protein đặc trưng cho tế bào bệnh leukemia. 2. So sánh các kết quả phân tích proteomics tế bào với kết quả phân tích proteomics huyết tương của bệnh leukemia, từ đó tìm ra các chỉ thị sinh học đặc trưng cho bệnh leukemia. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1 Trần Văn Bé: “Lâm Sàng Huyết Học”, NXB  Y Học Tp. HCM 1999 2 Trần Thị Minh Hương, Đỗ Trung Phấn: “Tình hình bệnh máu tại Viện Huyết học - Truyền máu, Bệnh viện Bạch mai”, Kỷ yếu công trình nghiên cứu khoa học Huyết học - Truyền máu 1999-2000, Nhà xuất bản Y học, 2002: 15-24. 3 Trịnh Thị Thanh Hương, Trịnh Hồng Thái (2007), “Phân tích proteomics huyết tương bệnh lơxêmi cấp dòng lympho”, Hội nghị khoa học những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống 2007, Quy Nhơn, tr. 169-170. 4 Đỗ Trung Phấn, “Bài giảng huyết học và truyền máu”, Nhà xuất bản Y học, 2004 5 Đỗ Trung Phấn, Bệnh lý tế bào nguồn tạo máu, NXB Y học Hà Nội, 2003 6 Đỗ Trung Phấn, Thái Quý, Nguyễn Chí Tuyển và cs (1998), “Kết quả bước đầu thực hiện chương trình nghiên cứu nâng cao chất lượng chẩn đoán và điều trị các bệnh máu và tạo máu”, Y học Việt Nam, 12, tr. 1-5. 7 Vũ Minh Thiết, Nguyễn Nam Long, Đặng Thành Nam, Phan Văn Chi (2004), "Nghiên cứu hệ protein huyết thanh người bằng kết nối sắc ký lỏng Nano đa chiều và hệ khối phổ liên tục", Báo cáo khoa học hội nghị toàn quốc 2004, NCCB định hướng Y-Dược học, Học Viện Quân Y, Hà Nội, tr. 470-474. Tiếng Anh 8 Cochran D. A. E., Evan C. A., Blinco D., Burthem J., Stevenson F. K., Gaskell S. J., Whetton A. D. (2003), “Proteoomic Analysis of Chronic Lymphocytic Leukemia Subtypes with Mutated or Unmutated Ig VH Genens”, Molecular & Cellular Proteomics, 2(12), pp. 1331-1341. 9 Colvin GA, Elfenbein GJ (2003). "The latest treatment advances for acute myelogenous leukemia". Med Health R I 86 (8): 243–6 10 Cui J., Wang J., He K., Jin B., Wang H., Li W., Kang L., Hu M., Li H., Yu M., Shen B., Wang G., and Zhang X. (2004), “Proteomic Analysis of Human Acute Leukemia cell: Insight into Their Classidication”, Clinical Cancer Research, 10, pp. 6887-6896. 11 Crystal Ronald G. (1990), “a1-Antitrypsin Deficiency, Emphysema, and liver disease”, Journa of Clinical Investigation, 85, pp. 1343-1352. 12 Else M, Ruchlemer R, Osuji N, et al (2005). "Long remissions in hairy cell leukemia with purine analogs: a report of 219 patients with a median follow-up of 12.5 years". Cancer 104 (11): 2442–8 13 Guinn B., Mohamedali A., Mills K. I., Czepulkowski B., Schmitt M., Greiner J. (2007), “Leukemia Associated Antigens: Their Dual Role as Biomarkers and Immunotherapeutic Targets for Acute Myeloid Leumemia”, Biomarker Insights, 2, pp. 1-11. 14 Harrison's Principles of Internal Medicine, 16th Edition, Chapter 97. Malignancies of Lymphoid Cells. Clinical Features, Treatment, and Prognosis of Specific Lymphoid Malignancies. 15 Hye A, Lynham S, Thambisetty M, et al. " Proteome-based plasma biomarkers for Alzheimer's disease." Brain 129: 3042-3050, (2006). 16 Jemal A, Thomas A, Murray T, Thun M (2002). "Cancer statistics, 2002". CA Cancer J Clin 52 (1): 23–47 17 Liebler D. C. (2002), Introduction to Proteomics, Humana Press, Totowa, New Jersey. 18 National Cancer Insitute: Finding Cancer Statistics » Cancer Stat Fact Sheets »Leukemia, 19 O'Farrel, P., 1975. High resolution two-dimensional electrophoresis. of proteins . J. Biol . Chem . 250: 4007-21 20 Patients with Chronic Myelogenous Leukemia Continue to Do Well on Imatinib at 5-Year Follow-Up Medscape Medical News 2006 21 Rezaul K., Wu L., Mayya V., Hwang S., Han D. (2005), “A Systematic Characterization of Mitochondrial Proteome from Human T Leukemia Cells”, Molecular & Cellular Proteomics, 4(2), pp. 169-181 22 Rogers MA, Clarke P, Noble J, et al. "Proteomics Profiling of Urinary Proteins in Renal Cancer by Surface Enhanced Laser Desorption Ionization và Neural-Network Analysis: Identification of Key Issues Affecting Clinical Potential Utility." Cancer Research 63: 6971-6983 23 Rowe JM: Clinical and laboratory features of the myeloid and lymphocytic leukemias. Am J Med Technol 49:103, 1983. Canellos GP: Chronic granulocytic leukemia. Med Clin North Am 60:1001, 1976. 24 Tischkowitz M, Dokal I: Fanconi anaemia and leukaemia - clinical and molecular aspects. Br.J.Haematol. 2004;126:176-191. 25 Huong T. T. T., Thai T. H. (2006), “Plasma proteomic analysis of acute myeloid leukemia”, Program&Abstracts Joint Third AOHUPO and Fourth Strctural Biology and Functional Genmics Conference, pp. 250. 26 Westermeier R., Naven T. (2002), Proteomics in Practice, Wiley-VCH Verlag-GmbH, Freiburg. 27 Xie Y, Davies SM, Xiang Y, Robison LL, Ross JA: “Trends in leukemia incidence and survival in the United States (1973-1998)”, Cancer. 2993 Aug 1;98(3):659. 28 Wang Y., Palmer-Toy D., Weber G., Eckerskorn C., Hancock W. S. (2004), “Proteomic study of leukemia cell line (K562/CR3) using free flow electrophoresis (FFE) coupled with LC/MS”, Proceedings of the 52nd ASMS conferrence on mass spectrometry and allied topics, Nashville, Tennessee, 2004. MỤC LỤC