Luận văn Bước đầu ứng dụng kỹ thuật southern blot phân tích đa dạng di truyên nấm magnaporthe grisea gây bệnh đạo ôn trên cây lúa

t này sẽ tạo ra ánh sáng đối với enzyme có trong hệ thống [2]. Đánh dấu probe được thực hiện bằng một số phương pháp sau: phương pháp nick – translation, phương pháp random priming (thiết lập mồi ngẫu nhiên), phương pháp đánh dấu End labelling (đánh dấu ở đuôi), phương pháp photobiotin. 10 2.7. Cơ sở của sự đa hình trong quần thể nấm M. grisea Transposon là yếu tố thường gặp trong cả prokaryote và eukaryote, đây là những vùng có khả năng chuyển vị trong genome. Trong những năm gần đây, những yếu tố này được phát hiện tăng số lượng trong các loài nấm sợi. Transposon của nấm cũng giống như transposon của của các loài eukaryote khác, chúng được phân thành 2 nhóm chính. Các yếu tố nhóm I chuyển vị qua trung gian RNA, các yếu tố nhóm II chuyển vị trực tiếp từ DNA sang DNA. Yếu tố nhóm I phân thành 3 loại: retrotransposon LTR mã hóa enzyme RT (reverse transcription) và có chứa LTR (long terminal repeat) ở cả hai đầu, retrotransposon LINE cũng mã hóa RT và có đuôi polyA nhưng không có LTR và yếu tố SINE thể hiện đặc tính cần phải phiên mã bằng polymerase RNA III và không có gen RT. Sự biểu hiện của các transposon trong vi sinh vật luôn được quy định hoàn toàn bởi genome kí chủ. Nhưng hoạt tính của chúng lại rất khác nhau tùy theo điều kiện xử lý: shock nhiệt, chiếu tia UV, nuôi cấy mô, lai và chủng với vi khuẩn hoặc xử lý với những yếu tố gây bệnh của vi khuẩn [17]. M. grisea là một loại nấm có phổ kí chủ rất rộng, chúng có thể kí sinh trên hơn 50 loại thực vật thân cỏ và một số loài cây 1 lá mầm khác [11]. Loại nấm này phân hóa và gồm một số loại tác nhân gây bệnh chuyên biệt cho kí chủ. Tác nhân Oryza gây bệnh cho cây lúa (Oriza sativa), Setaria gây bệnh trên loài kê đuôi cáo (Setaria italica), Panicum gây bệnh trên loài kê thường (Panicum miliaceum), Triticum là tác nhân gây bệnh trên lúa mì (Triticum aesticum), Eleusine là tác nhân gây bệnh trên kê hình ngón tay (Eleusine coracana) và digitaria tác nhân gây bệnh trên loài cỏ crabgrass (Digitaria sanguinalis) [17]. Hình 2.4. Những vị trí cắt giới hạn của MAGGY . Các phân đoạn của nó pMGY18, pMGY23 (dòng kẻ đậm) và probe SB (bằng dòng kẻ trắng) để đánh giá số lượng bản sao của MAGGY trong genome. Tên viết tắt của các enzym cắt: BamHI (B), EcoRV (E), HindIII (H), PstI (P), SalI (S).(Yukio Tosa và ctv, 1995). 11 Genome M. grisea có 6 nhiễm sắc thể, có trọng lượng phân tử là 38 megabase và kích thước mỗi nhiễm sắc thể là khác nhau. Có nhiều transposon được tìm thấy trong genome của M. grisea tạo nên những trình tự DNA lập lại được gọi là MGR (M. grisea repeat), các MGR này giúp phân biệt các cá thể trong một quần thể nấm M. grisea đa hình. Một số MGR được tìm thấy trong quần thể nấm M. grisea: MGR583, MGR586, MGSR1, Grasshopper, MAGGY, Fosburi và Pot2 [9, 16]. Nhóm I gồm các retrotransposon LTR Grasshopper, MAGGY và fosbury, retrotransposon MGR583- LINE, yếu tố MGSR1-SINE và Mg-SINE, nhóm II gồm MGR586 hoặc Pot3 và Pot2. MGR583 được cho là những yếu tố cũ, đã xuất hiện rất sớm trong quần thể M. grisea trong quá trình tiến hóa của nó, LTR-retrotransposon MAGGY và Grasshopper thì bị giới hạn, và được cho là những yếu tố mới cái mà gần đây mới xuất hiện trong quần thể nấm Pyricularia bằng sự di chuyển ngang. Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng MAGGY là yếu tố hoạt động mạnh nhất trong các yếu tố được kiểm tra về sự chuyển vị trong quần thể M. grisea [17]. MAGGY là một retrotransposon kích thước 5,6 kb, được phân tách từ nấm Magnaporthe grisea và có 2 ORF và các LTR có kích thước 253-bp ( Farman và ctv 1996). ORF1 mã hóa chuỗi polypeptide gồm 457 amino acid, ORF2 có đặc tính của gen pol mã hóa một polypeptide có chức năng protease. Hầu hết các retrotransposon được tìm thấy trong các loại nấm sợi ngày nay được phân vào nhóm Ty3-gypsy với một vài ngoại lệ. MAGGY có nhiều coppy trong bộ gen M. grisea phân lập được từ cây lúa, cây kê đuôi cáo, và một số loại cỏ khác, nhưng chúng không tìm thấy trong nấm M. grisea phân lập từ lúa mì [8]. 2.8. Một số nghiên cứu ứng dụng Southern blot trong phân tích đa dạng di truyền của quần thể nấm Magnaporthe grisea Hamer và ctv (1989) là những người đầu tiên tìm ra một họ những trình tự DNA lập lại trong genome của M. grisea được gọi là MGR586. Ứng dụng phương pháp DNA-fingerprinting sử dụng probe MGR586 đã mở ra một hướng mới trong nghiên cứu cấu trúc của quần thể nấm M. grisea. Sau đó, những nghiên cứu này được phát triển xa hơn trong nghiên cứu cấu trúc di truyền của quần thể nấm gây bệnh cháy lá trong các vùng trồng lúa trên thế giới. Một vài trình tự DNA lập lại trong quần thể nấm này cũng được tìm thấy sau đó như: Pot2, Fosbury, MGSR1, MAGGY và được sử 12 dụng thay thế cho probe MGR586. Trong đó, MAGGY được xem là probe tốt nhất vì trong một số trường hợp nó có thể cho thấy sự khác biệt giữa các nòi nấm M. grisea trong cùng một kí chủ. Hamer và ctv (1992) đã sử dụng probe MGR586, lai chéo với các dòng là tác nhân gây bệnh cho lúa và những dòng không gây bệnh trong phòng thí nghiệm. Kết quả ông đã tìm được 57 đoạn DNA cắt giới hạn được lai với probe MGR586 của dòng gây bệnh trên lúa và phát hiện ra 8 nhóm liên kết. Những kết quả đó cho phép Hamer xây dựng bản đồ 3 gen sắc tố (Alb1, Rsy1 và Buf1), vị trí lai (Mat1), tổ chức tạo nhân con (Rdn1), gen Smo1 và hai đa hình RFLP liên kết với Smo1. Kết quả của Hamer đã chỉ ra rằng vị trí của các MGR586 được phân bố một cách ngẫu nhiên trong genome của nấm M. grisea. Yukio Tosa và ctv (1995) đã sử dụng hai probe pMGY23 và pMGY18 được tách dòng từ MAGGY, để phân tích sự phân bố của retrootransposon MAGGY trong các dòng Pyricularia được phân lập từ các loài thực vật một lá mầm ở nhiều nước khác nhau. Kết quả ông đã tìm thấy được nhiều bản sao của MAGGY trong các nòi phân lập từ lúa và kê đuôi cáo (Setaria italica). Điều này chứng tỏ các nòi là tác nhân gây bệnh trên lúa có quan hệ di truyền gần với nòi từ loài Setaria. Pradeep Kachroo và ctv (1995) sử dụng phương pháp Southern blot với probe Mg-SINE, phân tích genome của các nòi M. grisea. Qua nghiên cứu Kachroo đã phát hiện ra khoảng 100 bản sao của Mg-SINE trên một thể đơn bội trong cả các nòi gây bệnh cho lúa và các nòi không gây bệnh cho lúa. Verel Shull và John E. Hamer (1996) sử dụng probe pCB586 để phát hiện đoạn MGR586 trong quần thể nấm M. grisea. Phân tích sự giảm phân của MGR586 Shull và Hamer đã tìm ra được một đa hình mới là MGR586-P2. P2 được tạo ra do một đoạn chèn gần, đó là một retrotransposon chứa đoạn LTR. Kết quả các ông đưa ra rằng những vị trí DNA đánh dấu có thể siêu biến tái sắp xếp chính xác. Le Dinh Don và ctv (1998) phân tích cấu trúc quần thể nấm M. grisea ở Nhật Bản bằng phương pháp DNA fingerprinting. Don đã sử dụng Probe SB lai với MAGGY và MGR586. Kết quả đã cho thấy rằng có hai dòng liên kết trong quần thể nấm, hai dòng này chỉ ra khả năng gây độc tương tự nhau. MAGGY thể hiện trong các nhóm cũng tương tự như MGR586, mặc dù hai yếu tố nay khác nhau về tính chất và 13 cấu trúc. Điều này cho thấy rằng MAGGY có thể thay thế cho MGR586 trong những nghiên cứu khác trong quần thể các nòi M. grisea gây bệnh cho lúa. Le Dinh Don và ctv (1999) đã tiến hành phân tích cấu trúc di truyền của quần thể nấm M. grisea gây bệnh đạo ôn trên vùng Đồng bằng Sông Hồng (1998) và Đồng bằng Sông Cửu Long (1996). Ứng dụng phương pháp Southern blot sử dụng probe chứa một đoạn phân lập từ MAGGY và đã phát hiện được 5 dòng chứa đoạn gen MAGGY. Kết quả cho thấy có sự khác biệt giữa các nòi ở hai vùng trồng lúa này. Đầu tiên, khả năng gây độc rất khác nhau đặc biệt là trên những dòng có gen kháng Pi-ks và Pi-ta. Thứ hai, các nòi ở khu vực phía Bắc thì đa dạng về cấu trúc dòng hơn các nòi ở khu vực phía Nam. Motoaki Kusaba và ctv (1999) đã nghiên cứu sự đa dạng di truyền của quần thể nấm M. grisea được phân lập từ nhiều loại kí chủ khác nhau bằng sự đa hình các đoạn MAGGY trong DNA genome. Kusaba nhận ra sự hiện diện với số lượng bản sao nhiều của MAGGY trong genome, thực hiện đọc trình tự vùng ITS2 để xây dựng sơ đồ mối quan hệ giữa các dòng. Những kết quả cho thấy rằng MAGGY di chuyển ngang trong di truyền quần thể nấm M. grisea. Những kết quả nghiên cứu đó đã xây dựng một cơ sở dữ liệu về bản đồ di truyền của quần thể nấm M. grisea kí sinh trên nhiều loại cây trồng đặc biệt là trên cây lúa. Cơ sở dữ liệu đó có thể được sử dụng cho những nghiên cứu sau này. 14 PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Thời gian và địa điểm tiến hành 3.1.1. Thời gian Đề tài được tiến hành từ 06-02-2006 đến ngày 15-08-2006. 3.1.2. Địa điểm Phòng thí nghiệm Bộ môn Bảo vệ thực vật, khoa Nông Học, Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Phòng công nghệ sinh học, trung tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh, Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. 3.2. Đối Tƣợng khảo sát Các dòng nấm Magnaporthe grisea được cung cấp từ Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long. 3.3. Nội dung thực hiện - Ly trích DNA từ sinh khối sợi nấm Magnaporthe grisea. - Thiết lập phản ứng cắt DNA genome bằng enzyme cắt giới hạn. - Biến nạp plasmid pMGY-SB, pMGR-T1, pEBA18 vào tế bào vi khuẩn E.coli DH5 . - Ly trích DNA plasmid từ sinh khối vi khuẩn. - Thực hiện phản ứng đánh dấu plasmid. - Tạo mẫu lai trên DNA genome của nấm M. grisea. - Thực hiện lai Southern với probe palsmid pMGY-SB được đánh dấu bằng biotin 3.4. Vật liệu và hóa chất 3.4.1. Dụng cụ và thiết bị 3.4.1.1. Dụng cụ - Micropipette (0.5-10 µl; 10 - 100 µl; 100 - 1000 µl), đầu tip các loại - Eppendorf 1,5 ml, 200 µl, ống ly tâm 15 ml 15 - Màng Hybond-N - Bình đựng nitơ lỏng - Kính hiển vi quang học - Bình tam giác (250, 500, 1000ml), ống nghiệm, đĩa petri, becher - Phim Konica 30 x 40 cm (100 tấm / hộp) - Cassette 30 x 40 Konica 3.4.1.2. Máy móc và thiết bị - Buồng lai: HB – 1000 Hybridizer - Máy cross-linker: GS GENE LINKER TM UV CHAMBER (Bio-Rad) - Máy điện di (Bio - Rad) - Máy chụp gel (Bio - Rad) - Máy lắc định ôn - Máy vortex - Bồn nước ổn nhiệt - Tủ sấy dụng cụ - Nồi hấp (Autoclave - Tomy) - Máy đo pH - Cân kỹ thuật - Máy khuấy từ - Máy lọc nước khử ion - Tủ cấy vô trùng (micro flow) - Tủ lạnh -4oC, - 20oC, - 70oC 3.4.2. Hóa chất Các hoá chất được sử dụng trong đề tài này được sản xuất bởi Công ty Sigma, Meark, Amersham Biosence và Bio Rad. 3.4.2.1. Môi trƣờng - Môi trường lỏng CZA : yeast extract, K2HPO4, KH2PO4, MgSO4, Glucose. - Môi trường lỏng LB chứa Ampiciline: yeast extract, bactose trypton, NaCl. 3.4.2.2. Hóa chất dùng trong ly trích DNA - Nitơ lỏng - Phenol /Chloroform/Isoamyl (25:24:1) - Isopropanol - Dung dịch TE 1X vô trùng: 10mM tris HCl, 1mM EDTA pH 8.0 - Ethanol 70%, 100% - RNAse 16 - Dung dịch ly trích (lyssis buffer): 50mM tris HCl, 50mM EDTA, 3% SDS, 1% - mercaptoethanol. 3.4.2.3. Hóa chất dùng trong Southern blot Hóa chất chuyển DNA lên màng - Đệm biến tính: NaOH 0,5 M; NaCl 0,15 M - Đệm trung tính: Tris – HCl 0,5 M; NaCl 0,15 M; pH 7,0 - Đệm chuyển (transfer buffer): SSC 20X, SSC 6X, SSC 2X. Hóa chất để tạo probe - Reaction buffer - Labelling reagent - Cross – linker working Hóa chất dùng trong phản ứng lai - Dung dịch đệm lai: Alkphos Direct hybridization buffer (Amersham) - Dung dịch rửa 1 (Primary wash buffer): Urea 2 M; SDS 0,1%; natri phosphate. - Dung dịch rửa 2 (Secondary wash buffer ): Tris-base 1M, NaCl 2M, pH 10.0. Hóa chất để phát hiện phản ứng lai - Chất phát hiện: detection reagent with CDP – star (Amersham) - Bộ thuốc rửa phim Konica (developer + fixer) Enzyme cắt giới hạn Bảng 3.1. Enzym giới hạn dùng phân cắt genomic DNA tạo mẫu lai Tên enzyme Trình tự nhận biết Mã hàng Nhà sản xuất BamHI EcoRV HindIII G /GATCC GAT/ATG A/AGCTT Cat. No. 220 612 Cat. No. 667 145 Cat. No. 656 313 Roche Roche Roche 17 3.5. Phƣơng pháp nghiên cứu 3.5.1. Triết tách DNA tổng số từ các mẫu nấm (isolate) 3.5.1.1. Chuẩn bị môi trƣờng lỏng nhân sinh khối sợi nấm Các mẫu phân lập được nuôi cấy trên môi trường lỏng CZA (Czapek- Dox) (Tuite, 1969): 20g Glucose, 3g yeast extract, 0,5g KH2PO4, 0,5g K2HPO4, 0,5g MgSO4-7H2O (hoặc 0.005g/500 ml FeSO4-H2O), một ít NaCL trên tổng thể tích 1000ml, pH 6.0-6.5. Chuẩn bị một cốc dung tích 1000ml, cho vào cốc 800ml nước cất vô trùng, cân đủ lượng tất cả các loại hóa chất này và cho vào cốc khuấy tan bằng máy khuấy từ. Sau đó, môi trường được san đều vào 10 bình tam giác, mỗi bình 100ml, hấp khử trùng trong nồi hấp 20 phút ở 1210C. Sợi nấm được lấy ra trên một đĩa petri vô trùng, dùng dao vô trùng băm nhỏ ra và cho vào bình chứa môi trường lỏng. Sinh khối nấm được nhân trong điều kiện lắc với tốc độ 5000 vòng, trong khoảng 72 giờ. Sau đó, tôi thu được khối sợi nấm là những hạt tròn nhỏ li ti, lọc lấy khối sợi nấm này qua vải lọc (đã được khử trùng) và làm khô bằng giấy thấm, đặt khối sợi nấm vào giấy bạc và giữ ở -80oC. 3.5.1.2. Ly trích DNA theo phƣơng pháp lysis buffer - Đặt 10 g sợi nấm đã được làm khô kiệt vào cối và nghiền nát trong dung dịch nitơ lòng. Sau đó, sinh khối nấm đã nghiền nát được chuyển vào ống ly tâm 15 ml. Chú ý, trong giai đoạn này tránh để bột nấm bị ướt. - Thêm 400 l Lysis buffer, trộn đều hỗn hợp và đem ủ khoảng 1 giờ ở 65oC. - Lấy ống nghiệm ra khỏi dung dịch nước ấm. Thêm vào khoảng 300 l Phenol: Chloroform: Isoamyl alcohol (25:24:1) lắc nhẹ, dung dịch lúc này có màu trắng đục như sữa (không nên lắc mạnh tránh DNA bị đứt gãy). - Ly tâm 20 phút 10000 vòng ở nhiệt độ phòng. - Dùng pipet hút dịch nổi và chuyển vào một ống nghiệm mới. - Thêm 0,5 vol Isopropanol, vào dịch nổi mới thu được, trộn nhẹ nhàng, ủ ở - 20 0C khoảng 1 giờ, để làm kết tủa DNA, lúc này DNA kết tủa tạo thành những sợi màu trắng đục. 18 - Dùng ống thủy tinh (hiệu Ikarea) được tạo thành một đầu cong dưới đèn cồn và móc lấy DNA chuyển qua eppendorf sạch, dùng ethanol 70% rửa DNA nhiều lần mỗi lầm khoảng 300 l. - Làm khô DNA, hòa tan trong dung dịch TE 1X và tồn trữ ở tủ mát 40C hoặc tủ -200C cho đến khi sử dụng. 3.5.1.3. Phƣơng pháp tinh sạch DNA Các bước tinh sạch DNA bằng RNAse như sau: - Cho hỗn hợp DNA pha loãng với nước cất vô trùng (hoặc TE 1X) vào eppendorf (theo tỷ lệ 1:3) - Thêm 2 l RNAse vào hỗn hợp trên và trộn đều - Ủ ở 370C trong khoảng 2 giờ - Thêm vào 20 l phenol/ chloroform/ isoamyl alcohol (25:24:1) - Ly tâm 13500 vòng trong 10 phút, thu phần dịch nổi cho vào eppendorf mới - Cho vào 800 l ethanol 100% và ủ ở -800C khoảng 30 phút - Ly tâm 13500 vòng 1 phút bỏ phần dịch nổi bên trên - Làm khô DNA và hòa tan DNA với TE 1X - Điện di trên gel agarose 0,8%, với dung dịch đệm TAE 0,5X, vận hành máy điện di trong 30 phút ở 100V và 250mA. Sau khi điện di ngâm gel trong hỗn hợp ethidium bromide 1 l/ml và TAE 0,5X trong 15 phút. - Kết quả được đọc bằng máy chụp gel hiệu Bio-Rad (phần mềm quantity one 2000). 3.5.2. Quy trình biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn 3.5.2.1. Chuẩn bị tế bào khả nạp - Cấy 30 l dịch vi khuẩn E.coli DH5 vào 3 ống nghiệm chứa 3 ml môi trường LB lỏng. - Nuôi cấy lắc ở 370C trong 4 giờ đến khi đạt được mật độ khoảng 108 tế bào/ml. - Chuyển ống nghiệm chứa dịch nuôi cấy vào thùng nước đá giữ lạnh trong 10 phút. 19 - Hút 1,5 ml dịch nuôi cấy cho vào eppendorf 1,5 ml, ly tâm 4000 vòng/phút trong 10 phút ở 40C, đổ bỏ phần dịch bên trên thu phần sinh khối ở bên dưới, lập lại bước này 3 lần. - Thêm 1 ml CaCl2 100mM lạnh vào eppendorf chứa phần sinh khối vừa thu được, votex nhẹ để làm tan hết phần kết tủa. - Ly tâm 4000 vòng/phút trong 10 phút ở 40C, đổ bỏ phần dịch bên trên, lật ngược eppendorf để làm khô kết tủa. - Thêm 150 l CaCl2 100mM lạnh vào eppendorf hòa tan phần kết tủa trên, thêm 20 l glycerol 98% trộn đều và trữ ở -700C. 3.5.2.2. Biến nạp plasmid pMGY-SB, pMGR-T1, pEBA18 vào tế bào vi khuẩn E.coli DH5 bằng phƣơng pháp sốc nhiệt (theo quy trình của Sambrook và cộng sự, 1989) - Hút 30 l dịch tế bào vi khuẩn E.coli DH5 đã được chuẩn bị cho vào eppendorf 1,5 ml, thêm một thể tích phù hợp tương ứng với 100ng của DNA plasmid, đảo nhẹ, giữ lạnh trong đá 20 phút - Chuyển nhanh eppendorf trên vào bồn nhiệt 420C, giữ trong 90 giây. - Chuyển nhanh eppendorf vào nước đá, giữ lạnh trong 2 phút. - Thêm 800 l môi trường LB lỏng vào eppendorf và ủ ở 370C trong 1 giờ. - Hút 200 l huyền phù tế bào đã biến nạp ở trên cho vào 3 ml môi trường LB chứa kháng sinh Ampiciline với nồng độ 70 g/ml, nuôi cấy lắc ở 37 0C qua đêm. Tôi tiến hành cùng một quy trình trên với tế bào khả nạp nhưng không cho DNA plasmid vào để làm đối chứng. 3.5.2.3. Kiểm tra kết quả biến nạp Kết quả biến nạp có thể được kiểm tra trực tiếp bằng cách nuôi trong môi trường LB chứa kháng sinh với nồng độ 70 g/ml. Những tế bào vi khuẩn nào có chứa plasmid thì có thể sống và tăng sinh trong môi trường kháng sinh, cón những tế bào nào không chứa plasmid thì không kháng lại được kháng sinh và chết. Từ đó, tôi có thể chọn lọc được dòng vi khuẩn chứa plasmid, và ly trích được plasmid mà tôi cần sử dụng với số lượng lớn. 20 Phƣơng pháp chiết tách plasmid sử dụng SDS-kiềm (theo quy trình của Sambrook và cộng sự, 1989) Nguyên tắc của phương pháp này là màng tế bào vi khuẩn bị phá vỡ bởi các tác nhân phá màng, Sau khi màng tế bào bị phá vỡ, dưới tác dụng của SDS protein của tế bào sẽ bị biến tính. Nhờ vậy mà DNA sẽ tránh được sự phân hủy của enzyme DNAse. Mặt khác, sự bổ sung dung dịch II với nồng độ kiềm cao ở giai đoạn đầu của quá trình tách triết, làm cho DNA genome và DNA plasmid bị biến tính. Sau đó, trung hòa nhanh bằng dung dịch III, cấu trúc của DNA plasmid sẽ được phục hồi nhanh chóng, DNA của bộ gen có kích thước lớn nên khó phục hồi cấu trúc hơn so với DNA plasmid. Vì vậy, DNA của plasmid sẽ nằm ở phần dịch nổi sau khi ly tâm, protein và DNA genome của tế bào sẽ bị tủa suống. Như vậy, ta có thể tách DNA plasmid ra khỏi tế bào của bộ gen mà it bị lẫn DNA genome. Chọn những ống vi khuẩn tăng sinh được trong môi trường kháng sinh ở trên để ly trích DNA plasmid theo quy trình sau: - Hút địch vi khuẩn từ mỗi ống cho vào mỗi eppendorf 1,5 ml, ly tâm 13000vòng/phút trong 1 phút ở 200C để thu sinh khối. - Hút bỏ dịch bên, tiếp tục hút dịch vi khuẩn từ những ống nghiệm tương ứng cho vào, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút ở 200C, lặp lại cho đến khi hết dịch nuôi cấy trong ống nghiệm. - Cho 150 l dung dịch I vào mỗi eppendorf chứa sinh khối, votex đến khi sinh khối vi khuẩn tan ra hết. - Thêm 200 l dung dịch II, đảo nhẹ khoảng 8 lần (dịch trong eppendorf trở nên nhớt), sau đó thêm tiếp 150 l dung dịch III, đảo nhẹ eppendorf (chú ý trong bước này không nên votex). - Ly tâm 1200 vòng/phút trong 10 phút ở 200C, thu hết dịch nổi cho vào eppendorf mới tương ứng. - Thêm 1 l RNAse vào mỗi eppendorf chứa dịch nổi mới thu được, ủ 370C trong 1 giờ để khử hết RNA. 21 - Cho vào mỗi eppendorf 300 l phenol/chloroform/isoamylalcohol (25:24:1), trộn đều ly tâm 10000 vòng/ phút trong 5 phút ở 200C, thu dịch nổi cho vào các eppendorf mới tương ứng. - Cho vào mỗi eppendorf 300 l chloroform/isoamylalcohol (24:1), trộn đều ly tâm 10000 vòng/ phút trong 5 phút ở 200C, thu dịch nổi cho vào các eppendorf mới tương ứng. - Thêm vào mỗi eppendorf trên 300 l isopropanol, ủ -200C 30 phút, ly tâm 13000 vòng/phút trong 20 phút ở 40C. hút bỏ dịch nổi thu kết tủa. - Rửa tủa trên bằng ethanol 70% 3 lần, úp ngược eppendorf trên giấy thấm để làm khô DNA. - Thêm 20 l TE 1X vào eppendorf để hòa tan kết tủa. - Hút 4 l chạy điện di trên gel agarose 0,8% để kiểm tra kết quả ly trích 3.5.2.4. Tăng sinh vi khuẩn và ly trích plasmid bằng kit DNA plasmid để sử dụng làm probe phải có độ tinh sạch cao nên tôi tiến hành ly trích DNA plasmid bằng AurumTM Plasmid mini kit của Bio-Rad. Quy trình ly trích như sau: - Chuyển 1ml dịch vi khuẩn vào eppendorf 1,5 ml, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ dịch nổi thu sinh khối, lập lại bước này 3 lần. - Thêm 250 l dung dịch đệm hòa tan (resuspension solution), votex hoặc dùng pipet làm tan kết tủa trong dung dịch. - Thêm 250 l dung dịch ly trích (lysis solution), đảo ngược eppendorf 6-8 lần. - Thêm 350 l dung dịch trung hòa (neutralization solution) trong vòng 5 phút sau khi cho dung dịch ly trích, đảo ngược từ 6-8 lần (không votex). - Ly tâm 13000 vòng/phút trong vòng 5 phút, thu dịch nổi. - Trong khi ly tâm, tiến hành chèn cột vào ống do bộ kit cung cấp (capless wash). - Hút dịch nổi cho vào cột, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút để DNA plasmid gắn vào màng, bỏ phần dịch bên dưới ống, lập lại bước này một lần nữa. 22 - Thêm 750 l dung dịch rửa vào cột, ly tâm 1 phút, sau đó ly tâm tiếp một phút. - Loại bỏ dịch rửa chuyển cột chứa plasmid sang eppendorf 1,5 ml, thêm 50 l dung dịch elution vào màng, để 1 phút, ly tâm 1phút để tách plasmid ra khỏi màng, thu phần dung dịch chứa DNA plasmis. 3.5.3. Thực hiện đánh dấu plasmid pMGY-SB bằng biotin Chúng tôi sử dụng plasmid pMGY-SB đã được ly trích ở trên, có chứa đoạn MAGGY có kích thước 0,56 kp để tạo probe. Trước khi thực hiện phản ứng đánh dấu cần phải pha loãng dung dịch cross - linker thành dung dịch có nồng độ sử dụng, dung dịch này có thể bảo quản lạnh 2–80C trong một tuần. Bên cạnh đó, DNA plasmid cũng cần phải được pha loãng với nước tới nồng độ 10 ng / µl dùng để đánh dấu (nồng độ muối trong mẫu DNA nên được giữ ở mức thấp nhất, không quá 50 mM). Thực hiện phản ứng đánh dấu theo kit của Amersham gồm các bước như sau: - Cho 10 µl DNA đã pha loãng vào eppendorf 200 µl, biến tính hoàn toàn bởi nhiệt độ bằng cách đun 5 – 7 phút trong nước đang sôi mạnh. - Làm lạnh nhanh trên đá trong 5 phút, đem ly tâm nhanh ở tốc độ 4000 vòng/30 giây để dồn dung dịch xuống đáy ống. - Thêm 10 µl dung dịch đệm phản ứng reaction buffer vào DNA đã được làm lạnh, đảo trộn nhẹ cho đều, phản ứng nên giữ trên đá. - Thêm 2 µl chất đánh dấu labelling reagent, trộn nhẹ, đều. - Thêm 10 µl dung dịch phản ứng cross - linker. Trộn đều, ly tâm nhanh 4000 vòng / 30 giây để dồn hỗn hợp xuống đáy. - Ủ 30 phút ở 370C cho phản ứng xảy ra. - Probe có thể được dùng ngay, trong trường hợp muốn bảo quản lâu hơn, probe đã đánh dấu được giữ trong 50 %V glycerol ở - 150C đến – 300C trong 6 tháng (không cần xử lý gì thêm dung dịch probe này sau khi bảo quản). 3.5.4. Tạo mẫu lai 3.5.4.1. Thực hiện phản ứng cắt genomic DNA bằng enzyme cắt giới hạn 23 Sử dụng genomic DNA của các nòi đã được ly trích ở trên, tôi đã thực hiện phản ứng cắt với enzyme cắt giới hạn BamHI, EcoRV và HindIII để ở thể tích 25 µl và 50 µl như sau: Bảng 3.2. Thành phần phẩn ứng cắt với tổng thể tích là 25 µl BamHI HindIII EcoRV Thể tích DNA 10X đệm BamHI Enzyme BamHI Nước DNA 10X đệm HindIII Enzyme EcoRV Nước DNA 10X đệm EcoRV Enzyme HindIII Nước 8 µl (1µg) 2,5 µl 05 µl 14 µl Tổng cộng 25 µl Bảng 3.3. Thành phần phản ứng cắt với tổng thể tích phản ứng là 50 µl BamHI Hind III Eco RV Thể tích DNA 10X đệm BamHI Enzyme BamHI Nước DNA 10X đệm HindIII Enzyme EcoRV Nước DNA 10X đệm EcoRV Enzyme HindIII Nước 16 µl (2-3 g) 5 l 1µl 28 µl Tổng cộng 50 l Tôi tiến hành trộn đều thành phần của các phản ứng cắt theo tổng thể tích đã tính toán. Sau đó, hỗn hợp đó được phân chia đều thành các phản ứng riêng lẻ ra các eppendorf để thực hiện phản ứng cắt. DNA được thêm vào eppendorf chứa hỗn hợp trên, đậy nắp kỹ và đem đi ủ ở 370C trong khoảng 2 giờ (có thể qua đêm nếu cần thiết). Sản phẩm của phản ứng cắt được kiểm tra trên gel agarose 0,8%, các mẫu được bố trí theo kiểu xen kẽ, liên tiếp nhau mẫu DNA chưa cắt, đến mẫu sản phẩm cắt. 3.5.4.2. Điện di sản phẩm cắt DNA genome của nấm M. grisea trên gel agarose 24 Tôi thực hiện điện di trên gel agarose 0,8 % trong đệm TAE 0,5X, với kích thước gel 20 cm x 15 cm x 0,5 cm, gel được gắn lược 20 giếng, thực hiện bố trí như sau: Giếng 1: Hút 10 µl DNA plasmid dùng để tạo probe như một đối chứng dương + 2 µl loading buffer, trộn đều trước khi bơm vào giếng. Giếng 2-9: Hút 25µl mẫu (2µg DNA đã được cắt bằng enzym cắt giới hạn) + 2 µl loading buffer, trộn đều trước khi bơm vào giếng. Giếng 10: Hút 10 µl DNA plasmid dùng để tạo probe như một đối chứng dương + 2 µl loading buffer, trộn đều trước khi bơm vào giếng. Giếng 11-20: Hút 25µl mẫu (2µg DNA đã được cắt bằng enzym cắt giới hạn) + 2 µl loading buffer, trộn đều trước khi bơm vào giếng. Tiến hành điện di ở hiệu điện thế là 50 V, trong 3 giờ. Sau đó, gel được cắt bỏ giếng, nhuộm ngắn trong ethidium bromide trong 1 - 2 phút, rửa sạch và chụp gel lấy lại hình ảnh để biện luận kết quả. Miếng gel đó sẽ được làm biến tính trước khi chuyển lên màng (chú ý miếng gel trước khi chuyển lên màng không nên để lâu trong không khí vì như thế sẽ làm cho bề mặt miếng gel bị khô và ảnh hưởng không tốt đến quá trình chuyển lên màng. Thời gian giữ gel là 15 - 30 phút khi nó được ngâm trong dung dịch đệm) 3.5.4.3. Chuyển DNA từ gel lên màng bằng phƣơng pháp mao dẫn hƣớng lên  Biến tính DNA trên gel trƣớc khi chuyển lên màng nitrocellulose Sau khi hoàn thành giai đoạn điện di, gel được giữ trong dung dịch đệm TAE 0,5X. Chúng tôi thực hiện biến tính DNA như sau: - Đổ bỏ đệm TAE 0,5X, rửa lại miếng gel bằng nước cất và đổ bỏ phần nước rửa. - Đổ vào khoảng 300 ml dung dịch đệm biến tính (NaOH 0,5 M; NaCl 0,15 M), phải xem kỹ đảm bảo rằng miếng gel đã được phủ hoàn toàn bởi dung dịch, đem lắc nhẹ 30 phút ở nhiệt độ phòng, đổ bỏ phần dung dịch đó đi. - Lặp lại bước trên, rửa lại gel bằng nước cất vô trùng, đổ bỏ phần nước rửa. - Đổ vào khoảng 300 ml dung dịch đệm trung tính (Tris – HCl 0,5 M; NaCl 0,15 M; pH 7,0), miếng gel cũng phải được ngấm hoàn toàn 25 trong dung dịch, đem lắc nhẹ 15 phút ở nhiệt độ phòng, đổ bỏ phần dung dịch đó đi. - Lặp lại bước trên, trong thời gian này chuẩn bị màng, dung dịch chuyển, giấy thấm, hệ thống mao dẫn và các dụng cụ cần thiết khác.  Chuyển DNA lên màng bằng phƣơng pháp mao dẫn hƣớng lên (thiết bị chuyển lên màng nitrocellulose đã đƣợc cải tiến) Khi đã hoàn thành giai đoạn biến tính DNA trên gel agarose bằng dung dịch biến tính, tiến hành chuyển lên màng theo các bước sau: - Dùng hộp nhựa hình chủ nhật (30 cm x 20 cm) có chứa 500 ml đệm SSC 6X, phía trên có đặt một tấm mica (24 cm x 20 cm) làm bệ của hệ thống mao dẫn. - Cắt một tấm giấy lọc có kích thước phù hợp (30cm x 15 cm) được làm ướt bằng dung dịch SSC 2X, phủ đều trên tấm mica (tránh có bọt khí, nếu có bọt khí dùng que thủy tinh gạt theo một chiều) và hai đầu giấy ngấm vào trong dung dịch đệm để làm cầu mao dẫn. - Úp ngược miếng gel và đặt lên trên giấy lọc, giữa miếng gel và giấy lọc tránh có bọt khí. - Đặt màng Hybond N có kích thước (20 cm x 12 cm) được làm ướt bằng SSC 2X lên trên miếng gel tránh để bọt khí. - Đặt hai tấm giấy lọc có kích thước 20 cm x 12 cm được làm ướt bằng dung dịch SSC 2X lên trên màng. - Đặt một chồng giấy thấm có kích thước 20 cm x 12 cm với độ cao vừa phải lên trên giấy lọc, màng và gel. - Trên cùng được đặt vài miếng mica để giữ hệ thống và tạo lực mao dẫn. - Khoảng trống xung quanh hộp nhựa được phủ bằng saran wrap, giảm sự tác động của môi trường xung quanh. Hệ thống được giữ qua đêm (16 giờ). 3.5.4.4. Làm khô màng nitrocellulose Sau 16 giờ , chúng ta tiến hành làm khô màng theo cách sau: - Loại bỏ các thành phần ở trên cho đến khi tới màng thì dừng lại. - Dùng kẹp giữ một góc màng và làm dấu bề mặt chứa DNA của màng 26 - Đặt màng vào trong tủ sấy ở 65-800C trong khoảng 1 giờ cho đến khi các góc màng co lại là được. 3.5.4.5. Cố định DNA lên màng nitrocellulose Màng sau khi được làm khô, được đem xử lý dưới UV trong tủ GS GENE LINKER TM UV CHAMBER (Bio - Rad) trong 50 giây (chú ý bề mặt DNA của màng hướng lên). Sau đó, màng được đem ra để chuẩn bị lai (hoặc cũng có thể giữ lại trong hộp kín cho đến khi tiến hành lai). 3.5.5. Thực hiện lai Southern sử dụng probe pMGY-SB 3.5.5.1. Thực hiện phản ứng lai Trước khi thực hiện phản ứng lai, xác lập nhiệt độ của buồng lai là 550C, đồng thời làm nóng dung dịch đệm lai ở 550C. Song song đó, chúng tôi tính toán các thông số sau: Diện tích màng: 20 x 12 = 240 (cm2 ) Thể tích đệm lai: 0.2 x 240 = 48 (ml) Nồng độ probe cần: 10 x 48 = 480 (ng) Thể tích probe: 480 / 10 =48 (µl)  Qui trình thực hiện phản ứng lai Bước 1: Tiền lai Khi nhiệt độ của buồng lai đạt ổn định ở 550C và dung dịch đệm lai cũng đã được làm nóng đến 550C, tiến hành rửa ống lai bằng nước cất vô trùng, sau đó bơm vào ống lai 40 ml dung dịch đệm lai. Dùng kẹp đặt màng vào ống lai sao cho bề không có DNA tiếp xúc với thành ống lai. Thời gian cho bước này là 15 phút. Bước 2: Lai Trộn 8 ml dung dịch đệm lai với 48 µl probe, bơm hỗn hợp vào giữa ống lai (tránh nhỏ trực tiếp lên màng), phản ứng được thực hiện trong một thời gian dài, có thể để phản ứng qua đêm là phù hợp nhất (12 giờ). 3.5.5.2. Rửa màng nitrocellulose sau khi lai Trước khi rửa màng cần làm nóng dung dịch rửa 1 (primary wash buffer) đến 55 0 C. Thực hiện rửa màng theo các bước sau: 27 - Loại bỏ dung dịch đệm lai, thêm vào ống lai khoảng 20 ml dung dịch rửa 1. Nhiệt độ và số vòng quay của buồng lai giống như khi lai, thời gian rửa là 10 phút. - Lặp lại bước trên cũng trong 10 phút. - Loại bỏ dung dịch rửa 1, dùng kẹp gấp màng ra và cho vào hộp nhựa sạch với bề có DNA nằm trên. Cho vào đó dung dịch rửa 2 (secondary wash buffer) khoảng 50 ml, lắc nhẹ ở nhiệt độ phòng trong 10 phút. - Lặp lại bước trên trong 10 phút. Lúc này màng có thể được giữ trong dung dịch rửa 2 trong 30 phút để chuẩn bị cho bước phát hiện. 3.5.5.3. Phát hiện kết quả bắt cặp giữa probe và đoạn DNA đích bằng huỳnh quang và thể hiện trên X-ray phim  Chuẩn bị màng với chất phát hiện CDP - Star Màng sau khi được rửa lần 2, sẽ được phủ lên trên một lớp dịch của chất phát hiện, chất này làm cho các phân tử probe phát sáng. Các bước thực hiện như sau: - Dùng saran wrap trải trên một mặt phẳng nằm ngang, phẳng, có phủ một lớp khăn giấy. - Lấy màng từ trong dung dịch rửa 2 ra, phải ráo và đặt lên trên miếng saran wrap với bề có DNA hướng lên trên. - Hút 1000 µl chất phát hiện CDP- Star nhỏ lên trên màng. - Dùng một tấm saran wrap khác phủ bề mặt màng, trải đều chất phát hiện bằng que thủy tinh, tránh để lại bọt khí. - Sau đó, màng lai được lấy ra, và đặt ở giữa hai miếng saran wrap mới với kích thước phù hợp (chú ý trong quá trình thao tác với màng không để màng bị khô).  Ủ màng nitrocellulose với X-ray phim trong cassette Màng được đặt giữa Cassette 30 x 40 Konica, sau đó đặt một tấm phim Konica 30 x 40 cm lên trên màng tránh sự dịch chuyển của màng. Đậy cassette lại và tính thời gian ủ 30 phút hoặc 1 giờ (thường phản ứng sẽ có tín hiệu sáng tốt nhất sau 1 giờ từ khi cho chất phát hiện vào). Tùy theo tính chất probe mà thời gian ủ phản ứng phát hiện khác nhau. Các thao tác trên được thực hiện trong buồng tối. 28 Khi đã hoàn thành giai đoạn ủ phim với màng, phim sẽ được đem ra khỏi cassette và ngâm trong dung dịch developer trong 5 phút. Sau đó, lấy phim ra và ngâm trong dung dịch fixer khoảng 3 phút. Cuối cùng đem phim ra rửa dưới vòi nước sạch và dùng kẹp treo lên giá làm khô ở nhiệt độ phòng. PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Ly trích DNA tổng số của nấm M. grisea. Giai đoạn tách chiết DNA là một giai đoạn tuy dễ thực hiện nhưng không đơn giản. Để có thể triết tách được một lượng DNA tốt và có thể sử dụng cho những nghiên cứu sau này, thì ngoài phương pháp cần phải có một kinh nghiệm trong thao tác. Giai đoạn này đóng vai trò quan trọng đầu tiên cho phép phản ứng lai thành công hay không.Việc tách chiết phải đảm bảo có lượng DNA có trong mẫu và lượng DNA phải đủ lớn để có thể phát hiện được qua lai với probe. Các thao tác phải nhẹ nhàng để tránh DNA bị gãy. Kết quả tách chiết có ý nghĩa cao là phải đảm bảo độ tinh khiết cao không còn hóa chất ly trích sót lại. Sau khi tiến hành tách chiết DNA theo đúng qui trình, chúng tôi thu được lượng DNA của các mẫu như sau: 29 Hình 4.1. DNA tổng số của nấm M. grisea. Nấm sau khi nuôi cấy trong máy lắc định ôn 370C, qua 72 giờ được ly trích DNA, DNA sau ly trích được điện di trên gel agarose 0,8%, trong dung dịch đệm TAE 0,5X, hiệu điện thế 100V, trong thời gian 30 phút. Kết quả điện di trong hình 4.1 cho thấy, tất cả các mẫu đều thu được DNA tổng số có nồng độ cao và ít bị đứt gãy. Tuy nhiên, các mẫu còn lẫn tạp chất nhiều. Các vệt sáng kéo dài phía dưới có thể là RNA hoặc DNA bị đứt gãy. Lỗi này có thể la do lắc mạnh trong quá trình sau khi cho phenol/chloroform/isoamyl (25:24:1), khiến DNA bị đứt gãy nhiều. Mặt khác do quá trình ly trích tôi không sử dụng enzym RNAse nên lượng RNA lẫn tạp trong mẫu còn nhiều. Riêng mẫu CT72 và CT64 có hai băng, điều này có thể lý giải là trong quá trình nuôi cấy mẫu bị nhiễm khuẩn và do DNA genomic vi khuẩn có trọng lượng phân tử nhỏ hơn nên di chuyển trước và tạo thành 2 băng. Từ thực nghiệm, chúng tôi rút ra được những điểm cần lưu ý trong quá trình ly trích: - Cần đảm bảo vô trùng tuyệt đối trong quá trình cấy và tăng sinh khối sợi nấm. Nếu môi trường tăng sinh không bị nhiễm khuẩn thì sau khi ta thu sinh khối là phần sợi nấm thì phần dịch còn lại trong và có màu vàng óng. - Bước thu sinh khối không nên để sợi nấm quá khô, tốt nhất nên nghiễn sinh khối nấm trong nitow lỏng ngay sau khi thu thí chất lượng DNA sẽ tốt hơn. CT64 CT375 LA415 CT104 LA18 VL265 VL37 VL52 VL45 KG109 CT72 KG390 CT72 KG216 KG531 CT80 LA9 CT178 AG518 TG24 CT72 CT375 KG535 KG483 CT72 KG398 CT74 CT64 KG398 KG531 CT63 LA2 30 - Thao tác phải nhẹ nhàng trong khi ly trích, dặc biệt là sau khi thêm hỗn hợp phenol/chloroform/isoamyl (25:24:1), chỉ nên nghiêng ống nghiệm (hoặc eppendorf) một cách cẩn thận không nên lắc mạnh. - Thu phần dịch nổi không nên hút phần cặn phía dưới, đặc biệt là không được hút vào phenol phía dưới. Phenol có thể phá hủy DNA sau khi ly trích. - Khi thêm isopropanol (ethanol 100%) thì ta nên ủ trong tủ -200C trong 30- 60 phút, để DNA có thể tủa hoàn toàn. - DNA phải được rửa nhiều lần với ethanol 70% để loại bỏ bớt tạp chất và nên làm khô DNA hoàn toàn (có thể để trong tủ cấy qua đêm). - Khi điện di DNA tổng số thì nồng độ gel từ 0,6-0,8% là phù hợp. Tuy nhiên, để đảm bảo cho phản ứng cắt và phản ứng lai xảy ra tốt hoặc biết được nguyên nhân nếu phản ứng không cho kết quả tốt, tôi cố gắng hoàn thiện tốt từng giai đoạn. Sản phẩm ly trích còn nhiều tạp nhiễm, do đó tôi tiến hành loại bỏ tạp nhiễm bằng RNAse. Hình 4.2. DNA của các nguồn nấm M. grisea sau khi đƣợc xử lý với RNAse. DNA sau khi tinh sạch được điện di trên gel agarose 0,8%, trong dung dịch đệm TAE 0,5X, hiệu điện thế 100V, trong thời gian 30 phút. Nhìn chung, kết quả tinh sạch tương đối tốt nhưng DNA còn bị đứt gãy nhiều. Một số mẫu không có DNA mà chỉ là những vệt sáng mờ như mẫu CT375, KG535, LA415 LA18 KG531 VL265 VL37 VL52 VL45 KG109 CT72 KG390 CT72 CT178 AG518 TG24 CT104 CT375 KG535 KG483 CT72 KG398 CT80 KG216 31 CT72, KG531. Nguyên nhân có thể do trong thao tác không cẩn thận làm DNA bị đứt gãy hoặc do DNA không tủa hoàn toàn và do đó không thu được DNA. Để khắc phục hiện tượng này tôi đề nghị nên sử dụng NaOAc kết hợp với ethanol để DNA có thể kết tủa tốt hơn. Tuy nhiên với dộ tinh sạch đó ta có thể sử dụng để thực hiện làm mẫu cho phản ứng lai. 4.2. Biến nạp plasmid pMGY-SB, pEBA18, pMGR-T1 vào vi khuẩn E.coli DH5α Sau khi biến nạp, tôi chọn phương pháp chọn lọc trực tiếp trong môi trường LB lỏng có chứa kháng sinh ampicilin với nồng độ 70µg/ml, để chọn lọc những dòng vi khuẩn E.coli DH5α có chứa plasmid. Kết quả ly trích vi khuẩn E.coli DH5α được nuôi cấy lắc qua đêm ở nhiệt độ 370C: Hình 4.3. Kết quả ly trích plasmid điện di trên gel agarose 0,8%. DNA plasmid ly trích từ vi khuẩn E.coli DH5α tăng sinh trong môi trường LB chứa 70µg/ml Ampicilin. Plasmid được điện di trên gel agarose 1%, trong dung dịch đệm TAE 0,5X, hiệu điện thế 50V, thời gian 45 phút. Mẫu pMGY-SB (1,2), pEBA 18 (3,4), pMGR-T1 (5,6). Kết quả cho thấy quá trình biến nạp thành công và vi khuẩn chứa plasmid có thể sống trong môi trường kháng sinh (70 g/ml). Các mẫu 2,4,6 là mẫu plasmid chuẩn được cung cấp để thực hiện biến nạp, mẫu 1, 3 là mẫu plasmid được ly trích trong đó có sử dụng RNAse, mẫu 5 không sử dụng enzyme RNAse trong quá trình ly trích nên còn lẫn tạp chất nhiều. Kết quả ly trích không có lẫn DNA genomic của vi khuẩn. 1 2 3 4 5 6 32 Riêng mẫu 4 và 5 có hai băng, nguyên nhân là do plasmid tồn tại ở hai dạng: dạng vòng và dạng xoắn. 4.3. Thiết lập phản ứng cắt DNA genome của M. grisea bằng enzym cắt giới hạn Trong 30 dòng nấm Magnaporthe grisea ly trích được, tôi chọn ra 10 dòng để thực hiện phản ứng cắt với hai enzym BamHI và EcoRV, nhằm chuẩn bị mẫu cho phản ứng lai. Tôi thực hiện phản ứng cắt với thể tích là 40µl, nồng độ mẫu DNA được cắt là 2 µg, ủ ở 370C qua đêm. Sau đó, hút 4 µl sản phẩm cắt và điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8%, kết quả điện di như sau: a) b) Hình 4.4. Kết quả thực hiện phản ứng cắt DNA tổng số bằng enzyme giới hạn. Sản phẩm cắt được điện di trên gel agarose 0,8%, trong đệm TAE 0,5X, hiệu điện thế 50V, thời gian 1 giờ. Hình a) các mẫu DNA được cắt bằng enzyme BamHI, hình b) các mẫu DNA được cắt bằng EcoRV. Mẫu LA415(1), LA18(2), VL265(3), VL37 (4), VL52(5), VL45(6), AG518(7), TG24(8), KG535(9). 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 33 Kết quả cho thấy sản phản ứng cắt không hoàn toàn đối với các mẫu số 1 và 2 trên cả hai enzym EcoRV và BamHI. Phản ứng cắt không tốt có thể là do mẫu DNA ly trích không được tốt nên không thực hiện được phản ứng cắt. Những mẫu cắt không hoàn toàn và những mẫu cắt quá vụn như vậy sẽ không có ý nghĩa trong quá trình tạo mẫu lai. Phản ứng cắt không hoàn toàn nguyên nhân là do nồng độ DNA quá nhiều so với nồng độ mà một đơn vị enzym có thể cắt được. 4.4. Phản ứng lai DNA M. grisea sau khi đƣợc cắt bằng EcoRV và BamHI với probe SB Thí nghiệm 1: Lai ở 550C, thời gian lai là 16 giờ, thời gian ủ phát hiện là 30 phút. Sản phẩm cắt DNA genome của M. grisea với hai enzyme EcoRV và BamHI được dùng làm mẫu lai, 15 µl mẫu được load trên miếng gel agarose 0,8% kích thước 20 x 15 x 0,7 cm. Plasmid pMGY-SB được bố trí là mẫu đối chứng dương cho phản ứng lai. Probe đánh dấu sử dụng cho phản ứng lai là plasmid pMGY-SB có kích thước 3,54 kp. Điện di được thực hiện trong đệm TAE 0,5X, hiệu điện thế 50 V, thời gian 4 giờ. DNA sau khi điện di được chuyển lên màng trong thời gian 16 giờ. Sau đó, tiến hành phản ứng lai ở 550C, thời gian là 16 tiếng. Tôi thực hiện bước phát hiện, tác nhân phát hiện được cho trực tiếp lên màng lai, để 2 – 5 phút ở nhiệt độ phòng, sau đó loại bỏ tác nhân phát hiện thừa rồi ủ màng lai với phim trong thời gian 30 phút. Rửa phim với dung dịch rửa phim. Sản phẩm lai xuất hiện trên nền phim sau khi rửa. Đây là kết quả của sự bắt cặp giữa probe đánh dấu với DNA plasmid và DNA genomic của nấm M.grisea sau khi ly trích. Các mẫu DNA được cắt bằng 2 enzyme BamHI và EcoRV thì sự bắt cặp với probe không xảy ra. Kết quả này chứng minh được DNA được biến tính hoàn toàn trên gel và có thể bắt cặp được với probe đánh dấu, nhiệt độ lai là 550C, thời gian lai là 16 giờ thì probe đã bắt cặp với trình tự DNA mục tiêu, nhưng không đặc hiệu. Điều này có thể chứng tỏ rằng nhiệt độ lai thấp. Tuy nhiên, các mẫu sử dụng làm thí nghiệm thì không có hiện tượng bắt cặp. Điều này có thể được lý giải từ những nguyên nhân sau: - Phản ứng cắt genomic DNA bằng enzyme giới hạn chưa hoàn chỉnh. 34 - Quá trình chuyển DNA lên màng chưa hoàn toàn do nồng độ gel cao và kích thước gel dày (0,7cm), cũng có thể do kích thước DNA lớn nên khó chuyển lên màng. - Trình tự DNA mục tiêu hiện diện trên màng ít, probe không thể phát hiện được. - Sự liên kết giữa trình tự DNA mục tiêu với probe đánh dấu lỏng lẻo, nên trong quá trình rửa màng, probe đã bị cuốn trôi theo dung dịch rửa. Thí nghiệm 2: Lai ở 600C, thời gian lai 20 giờ, thời gian ủ 30 phút Tôi thực hiện phản ứng lai với các mẫu LA415 (1), LA18 (2), VL265 (3), VL 37 (4), VL 52 (5), VL45 (6), AG 518 (7), TG24 (8), KG535 (9) được cắt bằng hai enzyme BamH I và Eco RV. Khắc phục những nguyên nhân nêu ở thí nghiệm 1 tôi thực hiện các bước có cải tiến. 30 µl mẫu được load vào giếng trên miếng gel kích thước 20 x 15 x 0,5 cm, điện di được thực hiện trong đệm TAE 0,5X, hiệu điện thế 50 V, thời gian 6 giờ. Thời gian chuyển DNA lên màng là 20 giờ. Tôi thực hiện phản ứng lai ở 600C, thời gian 20 tiếng. Kết quả thực hiện như sau: Hình 4.5. kết quả điện di tạo mẫu DNA cho phản ứng lai. ĐC(+) 1 2 3 4 5 6 7 8 9ĐC (+)1 2 3 4 5 6 7 8 9 BamHI EcoRI 35 Sản phẩm cắt được điện di trên gel agarose 0,7% (20x15x0,5cm), hiệu điện thế 50V, thời gian 5 giờ, trong đệm TAE 0,5X. Mẫu LA415(1), LA18(2), VL265(3), VL37 (4), VL52(5), VL45(6), AG518(7), TG24(8), KG535(9), pMGY-SB (ĐC(+)). Kết quả tạo mẫu lai cho thấy sản phẩm cắt chưa tốt để thực hiện một phản ứng lai. Các mẫu 2 và 7 bị cắt quá vụn nên các mẫu điện di có thể bị chạy ra ngoài sau một thời gian điện di quá dài. Mẫu 1 và 9 được đánh giá là tốt nhất. So sánh về kích thước của sản phẩm cắt với plasmid pMGY-SB có kích thước 3,52 kb, thì ta thấy các đoạn DNA cắt ra từ genome đều có kích thước nhỏ hơn 3,5 kb, từ đó có thể nhận xét rằng kích thước các đoạn phân cắt có thể quá nhỏ và điều này cũng ảnh hưởng tới khả năng bắt cặp của DNA mục tiêu với probe. Các băng điện di không thẳng do điện cực ở máy điện di không ổn định trong quá trình điện di hoặc do bồn điện di bị rung trong quá trình điện di. Trong điều kiện này, kết quả điện di tạo mẫu lai không phản ánh thực được sự di chuyển theo kích thước của các đoạn DNA từ đó kết quả phản ứng lai không có ý nghĩa khi phân tích sự đa dạng. Những kết luận rút ra được là : - Sản phẩm cắt phải có nồng độ đều nhau. - Sản phẩm cắt phải tạo thành một vết sáng đêu trên gel sau khi điện di (smear) thì mới có thể dùng làm mẫu cho phản ứng lai. - Hiệu điện thế không nên quá cao có thể chạy ở 30V trong thời gian khoảng 32 h (Le Dinh Don, 2000). - Nồng độ gel từ 0,7-0,8% là phù hợp để DNA có thể được chuyển lên màng sau khi điện di. - Dung dịch đệm điện di phải sạch thì mới đảm bảo quá trình chuyển lên màng thành công. 36 Hình 4.6. Kết quả phát hiện trên X-ray film. Kết quả lai với probe pMGY-SB, Lai ở 55oC, thời gian lai 20 giờ, thời gian ủ 30 phút. Sản phẩm cắt được điện di trên gel agarose 0,7% (20x15x0,5cm), hiệu điện thế 50V, thời gian 5 giờ, trong đệm TAE 0,5X. Mẫu LA415(1), LA18(2), VL265(3), VL37 (4), VL52(5), VL45(6), AG518(7), TG24(8), KG535(9), pMGY-SB (ĐC(+)). Quy trình thực hiện tuy có cải tiến nhưng kết quả không thay đổi nhiều. Tất cả những mẫu lai được cắt bằng hai enzym cắt BamHI và EcoRV sau khi chuyển lên màng, lai với probe và đều cho kết quả âm tính khi phát hiện trên X-ray film. Mẫu đối chứng dương là những sản phẩm có kích thước nhỏ và đều chứa trình tự bổ sung với probe, nên khả năng bắt cặp với probe là rất cao. Bảng 4.1. Những khó khăn và những giải pháp khắc phục trong thực hiện phản ứng lai Southern Phương pháp Khó khăn Cách giải quyết 1. thực hiện phản ứng cắt với thể tích lớn để có thể tạo được một lượng mẫu có nồng độ cao. 2. Điện di tạo mẫu lai 1. Thể tích phản ứng lớn khó có thể bơm vào giêng điện di. 2. thực hiện quá trình điện di khó đạt được. 1. cô đọng sản phẩm cắt bằng phương pháp sau: - thêm NaOAc (1/10V). - thêm ethanol 100% (2V). 2. Điện di ở hiệu điện thế 30V, thời gian >4 giờ, ĐC(+) 1 2 3 4 5 6 7 9ĐC (+)1 2 3 4 5 6 7 8 9 BamHI EcoRI 37 3. Chuyển lên màng. 4. thực hiện phản ứng lai. 3. DNA chuyển lên màng không hoàn toàn, và khó gắn kết lên màng. 4. Lai không chuyên biệt, bắt cặp không hoàn toàn. điện di trong đệm TBE 1X để sự phân tách DNA được tốt hơn. 3. Thực hiện điện di trong gel nồng độ thấp và độ dày nhỏ hơn 0,5 cm. Có thể thực hiện chuyển bằng điện. Quá trình phơi khô màng nên phơi khô ở 80 0 C trong vaif giờ. 4. Nhiệt độ lai có thể tăng lên 680C, để sự bắt cặp chuyên biệt hơn. So sánh với kết quả của Nguyễn Văn Lẫm và Lê Minh Kha (2005), sản phẩm PCR có kích thước 6,26 bp được sử dụng để đánh dấu probe đồng thời được sử dụng làm đối chứng dương. Kết quả phản ứng lai vẫn chỉ có mẫu đối chứng dương (sản phẩm PCR) cho tín hiệu bắt cặp sau khi lai. Nguyên nhân mà Nguyễn Văn Lẫm và Lê Minh Kha (2005) đưa ra là do nồng độ DNA thấp không đủ tín hiệu để phát hiện sự bắt cặp giữa trình tự đích và probe, nguyên nhân thứ hai là do DNA không được chuyển hoàn toàn lên màng bắng phương pháp mao dẫn hướng lên. Khắc phục nguyên nhân thứ nhất tôi đã tiến hành tạo mẫu DNA với nồng độ cao hơn (2µg), nhưng để tạo ra được một phản ứng cắt có thể cắt được một lượng DNA có nồng độ cao thì phải thực hiện ở thể tích lớ, điều đó lại gây khó khăn trong việc load mẫu điện di. DNA được load đầy giếng làm đo lượng mẫu sau khi điện di không cô đọng lại dưới đáy miếng gel từ đó tạo một khoảng cách lớn giữa DNA cần chuyển với màng nitrocellulose dẫn đến hiệu quả chuyển không tốt. Qua thực nghiệm tôi đã rút ra được những kinh nghiệm sau: (Bảng 4.1) 38 PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận Những nội dung thực hiện đưa ra tôi đã hoàn thành được những nội dung sau: - Ly trích DNA từ sinh khối sợi nấm Magnaporthe grisea, DNA ly trích có thể được sử dụng cho phản ứng lai. - Thiết lập phản ứng cắt genomic DNA bằng enzyme cắt giới hạn tốt. - Biến nạp plasmid pMGY-SB, pMGR-T1, pEBA18 vào tế bào vi khuẩn E.coli DH5 . - Ly trích DNA plasmid từ sinh khối vi khuẩn. - Thực hiện phản ứng đánh dấu plasmid pMGY-SB thành công cho phản ứng lai. - Tạo mẫu cho quá trình lai tuy hoàn thành nhưng chưa thực hiện tốt và cần phải có nhiều cải tiến. 5.2 Đề nghị 39 Với những thuận lợi sẵn có về trang thiết bị, điều kiện làm việc và tầm quan trọng của việc nghiên cứu sự đa dạng di truyền của nấm Magnaporthe grisea gây bệnh đạo ôn ở nước ta, chúng tôi có một vài đề nghị như sau: - Tiếp tục hoàn thiện quy trình Southern blot. - Tiếp tục hoàn thiện việc phân tích đa dạng di truyền của nấm M. grisea bằng phương pháp RFLP. TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 1. Huỳnh Văn Thái, Phạm Duy, 2005. Xây dựng quy trình biến nạp đoạn DNA vào tế bào vi khuẩn E.coli DH5 . Khóa luận tốt nghiệp kỹ sư Công Nghệ Sinh Học. Đại học Nông Lâm TP. HCM. 2. Lê Minh Kha, Nguyễn Văn Lẫm, 2005. Thiết lập quy trình Southern blot. Khóa luận tốt nghiệp kỹ sư Công NGhệ Sinh Học. Đại học Nông Lâm TP. HCM. 3. Lê Minh Triết, 2003. Bài Giảng Môn Học Cây Lúa. Khoa Nông Học- Đại Học Nông Lâm TP. HCM. 4. Nguyễn Thị Lang, Bùi Chí Bửu, 2005. Sinh Học Phân Tử-Giới Thiệu Phương Pháp và Ứng Dụng. Nhà xuất bản Nông Nghiệp TP. HCM, trang 63-74. 40 5. Nguyễn Thị Thư Hương, 2004. Xác định gen gây độc của nấm Metarrhizium ký sinh trên sâu hại cây trồng bằng kỹ thuật PCR. Luận án thạc sĩ. Trường Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh. 6. Võ Thị Thu Oanh, 2000. Bệnh Cây Chuyên Khoa. Khoa Nông Học- Đại Học Nông Lâm TP. HCM. TÀI LIỆU TIẾNG ANH 7. Derek Robinson, Paul R.Walsh, and Joseph A. Bonventre, 2001. Molecular Biology Problem Solver: A Laboratory Guide. Wiley-Liss, Inc, p 224-244. 8. Hitoshi Nakayashiki, Kanako Kiyotomi, Yukio Tosa, and Shigeyuki Mayama, 1999. Transposition of the Retrotransposon MAGGY in Heterologous Species of Filamentous Fungi. Laboratory of Plant Pathology, Faculty of Agriculture, Kobe University, Kobe 657-8501, Japan. 9. Hamer JE, Farral L, Orbach MJ, Valent B, Chumley FG, 1989. Host specie- specific conservation of a family of repeat DNA sequences in the genome of a fungal plant pathogen. Proc Nat Acad Sci USA 86: 9981-9985) 10. Jose Romao and John E. Hamer, 1992. Genetic organization of repeated DNA sequence family in the rice.department ò Biological Sciences, Purdue University, West Lafayette. 11. Le Dinh Don, 2000.DNA-fingerprinting Analysis and PCR-based Diagnosis of the Population of Magnaporther grisea. The Graduate School of Science and Technology Kobe University, pp 31-37. 12. Le Dinh Don,Yukio Tosa, Hitoshi Nakayashiki and Shigeyuki Mayama, 1999. Annals of the Phytopathological Scociety of Japan. 13. Motoaki Kusaba, Yukio Eto, Le Dinh Don, Natsuka Nishimoto, Yukio Tosa, Hitoshi Nakayashiki and Shigeyuki Mayama, 1999. Genetic diversity in Pyricularia isolates from varios Hosts Revealed by Polymorphisms of Nuclear Ribosomal DNA and the Distribution of the MAGGY Retrostranposon. Annals of the Phytopathological Society of Japan. 41 14. Sambrook Joseph and Rusell W.David, 2001. Molecular Cloning A Laboratory Manual. Volume 1. 3 rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York. 15. Verel Shull John E. Hamer, 1996. Springer- Verlag. 16. Yukio Tosa, Hitoshi Nakayashiki, Hideyuki Hyodo, Shigeyuki Mayama, Hạime Kato and Sally A. Leong, 1995. Ann. Phytopathol. Soc. Jpn. Support. 17. Y. Eto, K. Ikeda, I. Chuma, T. Kataoka, S. Kuroda, N. Kikuchi, L. D. Don, M. Kusaba, H. Nakayashiki, Y. Tosa, S. Mayama, 2000. Comparative analyses of the distribution of various transposable element in Pyricularia and their activity during and after the sexual cycle. Springer-Verlag. CÁC TRANG WEB http//:www.knowledgebank.irri.orgricedoctor_mxFact_Sheets/Diseases/Rice_Blast.htm orthe.html