Luận văn Bước đầu xây dựng quy trình nhuộm nhiễm sắc thể trên tế bào máu thỏ

hể tồn tại trong nhân tế bào soma thành từng cặp đồng dạng, trong đó một NST có nguồn gốc từ bố và một có nguồn gốc từ mẹ. Trong các tế bào bình thƣờng mỗi NST gồm 2 nhiễm sắc tử (chromatid), còn trong các giao tử NST đơn bội ở dạng một nhiễm sắc tử. Mỗi loài bình thƣờng có bộ NST lƣỡng bội (2n) đặc trƣng về số lƣợng, hình thái, cấu trúc và ổn định tƣơng đối qua các thế hệ. Kiểu nhân (karyotype) là thuật ngữ dùng chỉ số lƣợng và hình dạng của các NST chuyên biệt cho mỗi loài. Hình 2.1 Nhiễm sắc thể (Nguồn 2.2.2 Hình thái và kích thƣớc Nhiễm sắc thể quan sát ở trung kỳ thƣờng có hình dạng chấm hoặc hình que, thƣờng có kích thƣớc đƣờng kính khoảng 0,2 µm đến 3 µm và chiều dài chiều dài khoảng 0,2 µm đến 50 µm. Về kích thƣớc ở các tế bào khác nhau thì không giống nhau, nhƣng chúng đặc trƣng cho các tế bào và cá thể của cùng một loài. 5 Tuy nhiên, các mô khác nhau của cùng một cơ thể có sự biến đổi hình dạng và kích thƣớc NST để thích nghi với chức năng của một giai đoạn phát triển (Nguyễn Nhƣ Hiền, 2005). 2.2.3 Số lƣợng nhiễm sắc thể Số lƣợng nhiễm sắc thể là một chỉ tiêu đặc trƣng cho loài. Theo quy luật chung, mỗi một cá thể cùng một loài có số lƣợng NST đặc trƣng cho loài đó. Không thể dựa vào số lƣợng NST để đánh giá mức độ tiến hóa của các loài. Cũng giống nhƣ hàm lƣợng DNA, tuy có tính ổn định loài nhƣng chƣa thể hiện tính logic của bậc thang tiến hóa. Vấn đề là cần phải xem xét mức độ tổ chức và hoạt động của hệ gen trong DNA và trong NST. Bảng 1.1 Số lƣợng nhiễm sắc thể của một số loài (Eldridge, 1985) Ngƣời (Homo sapiens) 2n = 46 Thỏ (Oryctolagus cuniculus) 2n = 44 Cừu (Ovis aries) 2n = 54 Chó (Canis familiaris) 2n = 78 Mèo (Felis catus) 2n = 38 Ngựa (Equus asinus) 2n = 62 Vịt (Anas platyrhyncha) 2n = 80 Heo (Sus scrola) 2n = 38 Số lƣợng nhiễm sắc thể còn đặc trƣng cho bộ NST. Gồm các bộ: Bộ nguyên bội (monoploid) đƣợc ký hiệu là x, từ đó khởi nguyên hình thành các bộ đơn bội, lƣỡng bội, đa bội. Bộ đơn bội (haploid) ký hiệu là n, đặc trƣng cho các tế bào, cơ thể đơn bội và các tế bào sinh dục trƣởng thành ở loài sinh sản hữu tính. Bộ lƣỡng bội (diploid) ký hiệu 2n, đặc trƣng cho các tế bào và cơ thể lƣỡng bội. Bộ lƣỡng bội đƣợc hình thành do sự kết hợp hai bộ đơn bội. Bộ đa bội (polyploid) đặc trƣng cho tế bào và cơ thể đa bội. Số NST đƣợc tăng lên theo bội số của n khởi nguyên. 6 2.2.4 Cấu trúc nhiễm sắc thể 2.2.4.1 Cấu trúc hiển vi của nhiễm sắc thể a) Nhiễm sắc thể thƣờng và nhiễm sắc thể giới tính Trong bộ lƣỡng bội (2n) thƣờng tồn tại nhiều cặp tƣơng đồng giống nhau về hình dạng, kích thƣớc đƣợc gọi là NST thƣờng (autosome). Ngoài ra còn có 1 cặp NST trong đó 2 thành viên khác nhau về hình dạng, kích thƣớc hoặc trạng thái hoạt động đƣợc gọi là NST giới tính (sex chromosome). Hình 2.2 Cấu trúc nhiễm sắc thể (Nguồn b) Centromere Centromere là cấu trúc định khu trên chiều dọc NST ở vùng đƣợc gọi là eo thƣa cấp một. Centromere là vùng phân hóa của NST có vai trò đính kết hai nhiễm sắc tử với nhau, đồng thời giúp cho nhiễm sắc tử phân ly khỏi nhau và di chuyển về hai cực của tế bào nhờ các sợi của thoi vô sắc. Centromere chia NST thành 2 vế, chiều của 2 vế phụ thuộc vào vị trí centromere. Ngƣời ta thành lập chỉ số centromere (centromere index – Ic) để xác định vị trí của centromere và các kiểu hình NST. P: chiều dài vế ngắn. Q: chiều dài vế dài. 7 Theo Eldridge (1985), nhiễm sắc thể có các kiểu hình sau: ־ Acrocentric có centromere ở rất gần điểm tận cùng nhiễm sắc. ־ Telocentric có centromere ở ngay điểm tận cùng nhiễm sắc thể. ־ Subtelocentric có centromere nằm gần điểm tận cùng nhiễm sắc thể. ־ Submetacentric có centromere ở gần chính giữa (Q > P). ־ Metacentric có centromere ở chính giữa chia 2 vế bằng nhau (P = Q). Có một số tranh luận khoa học về kiểu hình nhiễm sắc thể. Ngƣời ta tự hỏi telocentric có thật hay không. Một số nghiên cứu chứng minh rằng telocentric thật sự tồn tại, centromere của telocentric có dính một lƣợng rất nhỏ chất nhiễm sắc mà chúng ta khó xác định đƣợc. Hình 2.3 Các kiểu hình nhiễm sắc thể (Nguồn c) Telomere Mỗi nhiễm sắc thể chứa một phân tử ADN liên kết với protein tạo thành các sợi NST xoắn, gấp khúc chạy suốt NST. Đầu tận cùng của phân tử ADN ở đầu tận cùng của NST gọi là telomere. Những dẫn liệu về cấu trúc phân tử đã chứng minh rằng telomere có ba chức năng quan trọng: ־ Ngăn cản không cho enzyme deoxiribonuclease phân giải đầu tận cùng của phân tử ADN ־ Ngăn cản không cho NST trong bộ kết dính nhau ־ Tạo thuận lợi cho tái bản ADN ở phần đầu cuối của phân tử Telomere có cấu trúc và thành phần đặc thù gồm những đoạn lặp nucleotid, tuy khác nhau ở các loài nhƣng thƣờng thể hiện theo phƣơng thức 5’ – T1-4 A0-1 G1-8 – 3’. Ví dụ ở ngƣời cũng nhƣ động vật có xƣơng sống có đoạn lặp lại là TTAGGG, ở thực vật arabidopsis thaliana có đoạn lặp lại là TTTAGGG. 8 2.2.4.2 Cấu trúc siêu vi của nhiễm sắc thể a) Sợi nucleosome Trong nhiễm sắc thể, ADN liên kết với protein tạo nên cấu trúc sợi xoắn nhiều cấp, đƣợc gọi là sợi nhiễm sắc. Sợi nhiễm sắc cơ bản có đƣờng kính 11 nm, là chuỗi hạt cƣờm, đƣợc gọi là sợi nucleosome. Mỗi hạt cƣờm là một nucleosome có kích thƣớc 11 nm dạng khúc giò gồm lõi đƣợc cấu tạo bởi 8 phân tử histon (2 H2A, 2 H2B, 2 H3, và 2 H4), sợi xoắn kép ADN cuốn xung quanh lõi histon với 1,75 vòng (chứa khoảng 146 cặp nucleotid). Các nucleosome nối nhau qua sợi xoắn kép ADN dài khoảng 60 nucleotid. Các sợi nucleosome gấp khúc, cuộn lại nhờ các histon H1, mỗi cuộn gồm sáu nucleosome, để tạo thành các sợi nhiễm sắc lớn hơn có đƣờng kính 30nm, đƣợc gọi là sợi solenoid. b) Các cấp độ cấu trúc nhiễm sắc thể Sợi solenoid sẽ gấp khúc tạo nên các vòng bên (looped domains) chứa khoảng 20.000 – 80.000 cặp nucleotid và có kích thƣớc khoảng 300nm. Các sợi 300 nm sẽ cuộn lại tạo nên các sợi nhiễm sắc ở cấp độ lớn hơn từ 700nm đến 1400nm tức là các nhiễm sắc tử. Ngoài protein histon, trong NST còn có nhiều protein axit có vai trò điều hòa hoạt động của gen. Hình 2.4 Cấu trúc siêu vi và phân tử của nhiễm sắc thể (Nguồn 9 2.3 Chu kỳ sống của tế bào Chu kỳ sống của tế bào là thời gian diễn ra kể từ thời điểm tế bào đƣợc hình thành nhờ phân bào của tế bào mẹ và kết thức sự phân bào hình thành tế bào mới. Ngƣời ta chia chu kỳ tế bào ra hai thời kỳ chính: gian kỳ (interphase), kỳ phân bào (mitosis). Thời gian của một chu kỳ sống của tế bào động vật rất dài, từ 20 đến 40 giờ. Hình 2.5 Chu kỳ phân chia tế bào (Nguồn 2.3.1 Gian kỳ Trong gian kỳ tế bào thực hiện các chức năng trao đổi chất, các hoạt động sống khác nhau nhƣ tổng hợp các ARN (acid ribonucleotide) và ADN, protein và các enzyme chuẩn bị cho sự phân bào. Tùy theo đặc điểm chức năng ngƣời ta chia tế bào gian kỳ ra làm ba giai đoạn hay pha liên tiếp nhau: giai đoạn G1 (gap 1), giai đoạn S (synthesis) và giai đoạn G2 (gap 2). Thời gian tế bào ở giai đoạn gian kỳ rất dài, chiếm hơn 90% thời gian chu kỳ sống của tế bào. Thời gian này tùy thuộc vào thời gian của 3 pha G1 + S + G2, đặc biệt tùy thuộc vào G1. Vì ở các tế bào khác nhau thì thời gian G1 là rất khác nhau, còn giai đoạn S và G2 tƣơng đối ổn định (Eldridge, 1985). Ví dụ ở tế bào chuột, thời gian ở G1 là 9,5 giờ, S 7,5 giờ, G2 là 1 giờ và thời gian ở kỳ phân bào 45,5 phút. Vậy thời gian tế bào chuột ở giai đoạn gian kỳ chiếm hơn 95% thời gian của một chu kỳ sống ở tế bào chuột. 10 2.3.1.1 Pha G1 Pha G1 tiếp ngay sau phân bào, là pha đầu tiên của tế bào con. Thời gian của G1 kéo dài từ ngay sau khi tế bào tạo thành do phân bào, cho đến khi bắt đầu pha S là pha tổng hợp ADN. Vào cuối pha G1 có một thời điểm đƣợc gọi là điểm hạn định (restriction point), điểm R. Nếu tế bào vƣợt qua điểm R, chúng tiếp tục đi vào pha S. Trong nuôi cấy tế bào, tế bào có vƣợt qua điểm hạn định hay không phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện một trƣờng. Nhân tố điều chỉnh thời điểm R là hệ protein phức tạp trong đó có các cyclin và kinase. Đối với các tế bào biệt hóa thì tế bào không vƣợt qua R mà đi vào quá trình biệt hóa tế bào. 2.3.1.2 Pha S Pha S là pha tiếp theo pha G1, đƣợc gọi là pha tổng hợp ADN vì chính trong pha này xảy ra sự tái bản ADN và nhân đôi số lƣợng NST của tế bào. Vào cuối pha G1, tế bào tổng hợp một loại protein đặc trƣng là cylin A và nhanh chóng tích lũy trong nhân tế bào. Protein cyclin A cùng với enzyme kinase sẽ xúc tiến sự tái bản ADN. Protein cyclin A tác động cho tới cuối pha S thì biến mất. Thời gian kéo dài của pha S ở đa số tế bào nhân thực tƣơng đối ổn định từ 6 – 8 giờ. 2.3.1.2 Pha G2 Tiếp theo S là pha G2, thời gian của G2 ngắn từ 1 – 4 giờ. Trong pha G2, các ARN và protein đƣợc tổng hợp chuẩn bị cho sự phân bào. Cuối pha G2 một protein đƣợc tổng hợp là cyclin b đƣợc tích lũy trong nhân cho đến tiền kỳ phân bào. Cyclin b hoạt hóa enzyme kinase tạo thành các vi ống tubulin hình thành các thoi phân bào. 2.3.1.2 Phân bào Tiếp theo pha G2 là pha M (mitosis) thời kỳ tế bào mẹ phân chia thành hai tế bào con. Sự phân bào là phƣơng thức sinh sản của tế bào, và là phƣơng thức tế bào mẹ truyền thông tin di truyền chứa DNA cho hai tế bào con. Ngƣời ta phân biệt bốn dạng phân bào sau: nguyên phân, giảm phân, trực phân, nội phân. 11 2.3.2 Nguyên phân 2.3.2.1 Đặc điểm của nguyên phân Nguyên phân hay còn đƣợc gọi là phân bào nguyên nhiễm, xảy ra trong pha M của chu trình tế bào, tiếp ngay sau pha G2. Qua M, tế bào mẹ sau khi đã đi qua pha S sẽ tạo hai tế bào con, mỗi tế bào con mang bộ máy di truyền giống hệt tế bào mẹ. Hiện tƣợng này đƣợc phát hiện đầu tiên bởi Strasburger và Flemming từ những năm 1882, khi quan sát thấy các cấu trúc sợi nên đặt tên là phân bào có tơ (Nguyễn nhƣ hiền, 2005). 2.3.2.2 Các kỳ của phân bào a) Tiền kỳ (prophase) Tiền kỳ đƣợc tiếp theo sau pha G2 của gian kỳ. Rất khó phân biệt một cách chính xác điểm chuyển tiếp này, các hiện tƣợng đặc trƣng cho tiền kỳ là: Hình thành nhiễm sắc thể: chất nhiễm sắc ở gian kỳ bao gồm các sợi nhiễm sắc đã đƣợc nhân đôi qua pha S, trở nên xoắn và cô đặc lại, hình thành các NST thấy rõ dƣới kính hiển vi thƣờng, mà số lƣợng, hình thái đặc trƣng cho loài. Màng hạch nhân có nhiều thay đổi: hạch nhân giảm thể tích, phân rã và biến mất. Màng nhân đứt thành nhiều đoạn và biến thành các bóng không bào bé phân tán trong tế bào chất. Hình thành bộ máy phân bào: qua pha S, trung tử nhân đôi tạo thành 2 đôi trung tử con, do sự hoạt hóa của các chất quanh trung tử, các đơn hợp tubulin trong tế bào hợp tạo thành các vi ống tubulin. Các vi ống phóng xạ quanh trung tử tạo thành sao phân bào, hai sao di chuyển về hai cực của tế bào. Giữa hai sao, các vi ống phát triển sắp xếp thành hệ thống ống có dạng hình thoi, đƣợc gọi là thoi phân bào hay thoi vô sắc. Cấu tạo nên thoi có hai dạng vi ống: vi ống cực và vi ống tâm động. Đến cuối tiền kỳ, khi màng nhân biến mất thì bộ máy thoi với hai sao đƣợc hình thành. Tiền kỳ chiếm thời gian nhiều nhất trong kỳ nguyên phân. Ở tế bào động vật, tiền kỳ chiếm hơn 50 % thời gian trong giai đoạn tế bào phân chia (Eldridge, 1985). 12 b) Trung kỳ sớm (prometaphase) Bắt đầu khi màng nhân tiêu biến thành các bong bóng nhỏ phân tán trong tế bào chất quanh thoi phân bào. Khi vùng nhân biến mất thì thoi vô sắc di chuyển chiếm ngay vị trí trung tâm. Lúc này centromere đƣợc phân hóa thành 2 cấu trúc đƣợc gọi là tâm động có kích thƣớc khoảng 1 µm. Thông qua tâm động, NST đƣợc đính với các sợi tâm động của thoi. c) Trung kỳ (metaphase) Đối với tế bào động vật, thời gian tế bào ở giai đoạn trung kỳ rất ngắn, chỉ kéo dài từ năm đến bảy phút (Eldridge, 1985). Trong giai đoạn này, nhiễm sắc thể xoắn, cô đặc, co ngắn tối đa và sắp xếp trên mặt phẳng xích đạo của thoi vô sắc, tạo nên tấm trung kỳ. Tấm trung kỳ nằm thẳng góc với trục dọc của thoi. Đây cũng là thời điểm có thể quan sát hình dạng, số lƣợng NST rõ nhất. Vì thế ngƣời ta thƣờng tập trung vào giai đoạn này để nghiên cứu kiểu nhân hay đặc điểm NST của mỗi loài. d) Hậu kỳ (anaphase) Nhiễm sắc thể tách đôi và rời khỏi nhau tạo thành hai NST con độc lập. Nhiễm sắc thể con di chuyển về 2 cực nhờ sự co ngắn của sợi tâm động, phối hợp với sự kéo dài của các sợi cực và hẹp lại của thoi. e) Mạt kỳ (telophase) Trong kỳ này, các NST con đã di chuyển đến hai cực, giãn xoắn, dài ra và biến dạng thành chất nhiễm sắc. Hạch nhân đƣợc tái tạo, hình thành 2 nhân con trong khối tế bào chất chung. Quá trình phân chia tế bào chất của tế bào bắt đầu từ cuối hậu kỳ hoặc đầu mạt kỳ và diễn ra suốt mạt kỳ. Sự phân chia này bắt đầu bởi sự hình thành một eo thắt, đƣợc cấu tạo bởi các vòng vi sợi actin nằm giữa hai nhân con. Khi vòng vi sợi actin co rút kéo theo phần màng sinh chất lõm thắt vào trung tâm, và khi màng nối với nhau sẽ phân tách tế bào chất thành 2 nửa, mỗi nửa chứa một nhân con. Mặt phẳng phân cắt tế bào chất thẳng góc với trục của thoi phân bào. 13 Hình 2.6 Quá trình nguyên phân giảm nhiễm (Nguồn 14 2.4 Sơ lƣợc các kỹ thuật nghiên cứu nhiễm sắc thể Cơ chế chung của việc nghiên cứu kiểu nhân là giải phóng NST ở các tế bào, mô ở giai đoạn trung kỳ. Sau đó tiến hành nhuộm để quan sát hình thái, cấu trúc, số lƣợng cũng nhƣ những băng vạch trên nhiễm sắc thể. Có hai kỹ thuật dựa trên cơ chế này để nghiên cứu NST là kỹ thuật splash và kỹ thuật squash. 2.4.1 Kỹ thuật splash Kỹ thuật này đã đƣợc ứng dụng nghiên cứu nhiễm sắc thể từ rất lâu. Cơ chế của kỹ thuật này theo đúng theo tên gọi của nó là “splash” có nghĩa là “bắn” hay “văng”. Với kỹ thuật này, màng tế bào sẽ bị phá hủy, những giọt dịch chứa nhân của tế bào sẽ đƣợc cho rơi từ một độ cao thích hợp lên một mặt phẳng, nhờ điều này mà nhiễm sắc thể bị bắn ra khỏi nhân và trải đều trên phiến kính. Ta có thể tiến hành nhuộm và quan sát nhiễm sắc thể. Kỹ thuật này đơn giản, đáng tin cậy và đƣợc ứng dụng trên các nguồn tế bào nhƣ: a) Tế bào in vivo Kỹ thuật splash đƣợc ứng dụng kỹ thuật đƣợc thực hiện đầu tiên ở các mô, tế bào phân chia nhanh trong in vivo để nghiên cứu về NST. Những mô, tế bào có thể sử dụng nghiên cứu nhiễm sắc thể ngay nhƣ: rễ ở thực vật, hay tủy xƣơng, tế bào lách, biểu mô ruột ở động vật hữu nhũ, lƣỡng cƣ và chim (Herbert, 1993). Những mẫu mô này đƣợc ngâm trong những hỗn hợp dung môi nhƣ metanol – acid acetic để cố định mẫu, sau đó mẫu đƣợc nhuộm và bảo quản bởi một lớp papain. Tuy nhiên phƣơng pháp này chỉ thực hiện đƣợc trên những loài có số lƣợng NST thấp, đối với những loài nhƣ gia cầm có số lƣợng nhiều thì không có kết quả chính xác. b) Tế bào nuôi cấy in vitro Khắc phục nhƣợc điểm của những tế bào in vivo, kỹ thuật trên sử dùng nguồn tế bào đã đƣợc nuôi cấy in vitro để thay thế. Năm 1885, Roux là ngƣời báo cáo đầu tiên về nuôi cấy tế bào in vitro, hơn 100 năm qua thuật ngữ “nuôi cấy tế bào” vẫn đƣợc dùng, mặc dù lĩnh vực này đã đƣợc mở rộng từ thập niên 1950 khi các nhà khoa học đã sử dụng những tế bào nuôi cấy rời (Eldridge, 1985). 15 Những mẫu mô nhƣ tim, da, gan, thận, phổi thƣờng đƣợc sử dụng nuôi cấy để nghiên cứu kiểu nhân, vì tế bào của những mẫu mô này có thể phát triển và phân chia mà không cần các tác nhân kích thích đặc biệt (Herbert, 1993). Bên cạnh đó, ngƣời ta còn nuôi cấy nang noãn hay phôi nang (blastocyst) để nghiên cứu kiểu nhân (Eldridge, 1985). Tuy nhiên phƣơng pháp này vẫn có một số nhƣợc điểm là: sự phân chia của tế bào rất chậm và thời gian nuôi cấy tế bào thƣờng theo quy trình dài ngày từ một đến ba tuần. Bên cạnh đó các mô trên cơ thể rất khó trong việc bảo quản cũng nhƣ nuôi cấy tế bào, do các tế bào của mô này đòi hỏi phải có môi trƣờng sinh khiết nhƣ trong cơ thể và tế bào phải bám dính trên một gián thể mới tồn tại và phát triển đƣợc. c) Tế bào bạch cầu Cho tới năm 1960, tế bào bạch cầu chƣa đƣợc dùng để nghiên cứu NST. Vì ngƣời ta cho rằng tế bào bạch cầu, đặc biệt là tế bào lympho không thể phân chia khi đã đi vào dòng máu trong cơ thể. Năm 1960, Novell vô tình phát hiện ra Phytohemagllutinin (PHA) là tác nhân kích thích tế bào bạch cầu phân bào. Nó đƣợc chiết xuất từ cây đậu đỏ phaseolus vulgaris. Ông đặt tên phytohemaglutinin là do “phyto” nghĩa là thực vật, “hem” thuộc về máu và “agllutinin” có nghĩa là kết dính (Eldridge, 1985). Đặc tính của nó là có khả năng làm lắng tụ hồng cầu, nhờ đó mà tế bào bạch cầu đƣợc tách ra. Chính vì điều này mà làm tế bào bạch cầu, và chủ yếu là tế bào lympho có khả năng phân chia (Herbert, 1993). Ngày nay, ngƣời ta có thể sử dụng Pokeweed có thể thay thế cho PHA trong nuôi cấy tế bào bạch cầu. Tuy nhiên khả năng tác dụng của nó yếu hơn PHA. Pokeweed chỉ áp dụng cho những loại máu đòi hỏi nồng độ PHA thấp. Việc phát hiện ra PHA là một bƣớc tiến lớn trong việc nghiên cứu NST, vì tế bào bạch cầu có những ƣu điểm vƣợt trội so những dòng tế bào trƣớc đây. Thời gian phát triển của tế bào rất ngắn từ 48 đến 72 giờ, bạch cầu dể tồn tại trong môi trƣờng nuôi cấy và có khả phát triển tốt trong môi trƣờng huyền phù. Do đó tế bào bạch cầu đƣợc sử dụng phổ biến trong nghiên cứu NST của các loài vật nuôi nhƣ: heo, bò, dê, cừu, gà… 16 Khi nuôi cấy in vitro, tế bào bạch cầu đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng dinh dƣỡng thích hợp có bổ sung chất kích thích phân bào là PHA hoặc Pokeweed. Sau thời gian nuôi cấy thích hợp, tế bào đƣợc xử lý và cố định trên một mặt phẳng nhất định và đƣợc nhuộm màu. Bằng kỹ thuật nhuộm băng nhƣ: nhuộm giemsa, nhuộm huỳnh quang, nhuộm màu kết hợp với xử lý bằng enzyme, hoặc bằng nhiệt sẽ làm xuất hiện các băng vạch trên NST, kỹ thuật này đƣợc gọi là “banding”. Các kỹ thuật banding thƣờng dùng là G-banding, R-banding, C-banding, Q-banding, T-banding… Sự hiện diện và phân bố các băng trên NST ở trung kỳ có thể phản ánh kiểu tổ chức thành đơn vị nhóm của sự hoạt hóa gen. Ví dụ: băng C tƣơng ứng với vùng chứa chứa đoạn ADN lặp lại và liên kết rất chặt với các protein acid. 2.4.2 Kỹ thuật squash Một phƣơng pháp khác trong nghiên cứu NST mà nó thƣờng dùng trong nghiên cứu hệ gen là kỹ thuật squash. Cơ chế của kỹ thuật này rất đơn giản. Các tế bào hay các mẫu mô nhỏ trên một mặt phẳng cố định, đặt một miếng kính phủ lên và tác động một lực mạnh lên kính phủ làm màng tế bào và màng nhân vỡ ra, giải phóng NST. Ƣu điểm của kỹ thuật này là có thể khống chế đƣợc lực tác dụng theo từng loại các tế bào do đó có thể thu nhận đƣợc nhiều tế bào ở trung kỳ. Kỹ thuật này đƣợc báo cáo đầu những năm 1930, nó đƣợc nghiên cứu đầu tiên trên NST ngƣời năm 1944. 2.5 Nghiên cứu về kiểu nhân nhiễm sắc thể thỏ Năm 1926, Painter là ngƣời đầu tiên báo cáo số lƣợng nhiễm sắc thể thỏ là 2n = 44, sau đó rất nhiều báo cáo về kiểu nhân của thỏ trên nhiều loại tế bào khác nhau (Kannan và ctv, 2006). Năm 1962, Sarkar và ctv đã nuôi cấy lớp tế bào giác mạc và mô của phổi, Nicolai và Shaver (1977) sử dụng phôi nang sáu ngày tuổi của thỏ để nghiên cứu NST. Năm 2002, Hayes đã nguyên cứu kiểu nhân thỏ trên nguyên sợi bào. Và trong thời gian gần đây đã có những báo cáo về kiểu nhân NST thỏ trên tế bào bạch cầu nhƣ Parkányi và ctv (2004), Kannan và ctv (2006). 17 Dựa theo vị trí của centromere chia NST thỏ thành bốn dạng metacentric, submetacentric, subtelocentric và telocentric. Mỗi nhóm đƣợc xếp theo kiểu hình và chiều dài giảm dần. Theo Ford và ctv (1980), nhiễm sắc thể của thỏ đƣợc nhuộm theo kỹ thuật G – bading và đã đƣợc Hội nghị Quốc tế giới giới thiệu jiểu nhân nhƣ sau: Bảng 1.2 Đặc điểm các băng trên nhiễm sắc thể thỏ Nhiễm sắc thể thứ Đặc điểm 1 p: ba băng tối khoảng cách bằng nhau. Băng trung tâm nổi bật q: băng tối hẹp kề sát centromere. Hai băng tối gần tâm. Băng trung tâm rộng, sáng và hai băng tối xa tâm. 2 p: ba băng tối khoảng cách bằng nhau. q: băng tối hẹp kề centromere. Hai băng tối gần tâm. Hai băng tối xa tâm. 3 p: băng tối gần tâm. Băng tối xa tâm q: ba băng tối khoảng cách bằng nhau. 4 p: băng trung tâm tối q: hai băng trung tâm tối 5 p: băng tối kề sát centromere q: băng tối gần tâm. 6 p: băng tối gần centromere q: băng trung tâm tối 7 p: băng trung tâm tối. q: hai băng tối gần tâm. Băng trung tâm sáng và hai băng tối xa tâm. 8 p: băng tối xa tâm. Băng hẹp gần tâm thỉnh thoảng hiển nhiên q: ba băng tối có khoảng cách bằng nhau. Băng gần tâm phân hai. 9 p: băng gần tâm tối. q: băng gần tâm tối có thể phân thành hai. Băng tối xa tâm. 18 10 p: băng rộng, tối kề sát centromere. Băng trung tâm tối. q: băng tối hẹp gần tâm. Băng tối xa tâm có thể phân thành hai. 11 p: băng trung tâm tối. q: băng trung tâm tối. Băng xa tâm tối 12 p: băng gần tâm tối. q: băng sáng kề sát centromere. Hai băng gần tâm tối. Băng trung tâm tối. Hai băng xa tâm tối. 13 p: băng trung tâm tối. q: băng tối kề sát centromere. Hai băng trung tâm tối. Xa tâm sáng. 14 p: băng trung tâm tối. q: hai băng gần tâm tối. Hai băng xa tâm tối. 15 p: băng trung tâm tối. q: bốn hoặc năm băng tối khoảng cách bằng nhau. 16 p: băng xa tâm tối, hẹp. q: băng gần tâm tối. Băng xa tâm tối. 17 p: băng trung tâm hẹp, tối. q: ba băng tối khoảng cách bằng nhau 18 q: băng tối hẹp nằm gần centromere. Băng tối trung tâm có thể tách làm hai. Băng tối hẹp xa tâm 19 q: băng tối nằm gần centromere. Băng trung tâm tối. Băng tối hẹp xa tâm 20 q: băng tối nằm gần centromere. Băng tối trung tâm 21 q: băng tối nằm gần centromere. Xa tâm sáng X p: băng nằm gần tâm sáng. Băng nằm xa tâm tối q: băng nằm gần tâm tối. Hai băng tối nằm xa tâm Y p: băng tối kéo dài từ gần tâm đến xa tâm q: có thể không bắt màu nhuộm 19 Parkányi và ctv (2004) sau khi nhuộm bằng kỹ thuật G – banding và xây dựng kiểu nhân trên NST thỏ cũng đã đƣa ra năm dạng NST thỏ là: metacentric, submetacentric, subtelocentric, telocentric và acrocentric. Kiểu nhân đƣợc trình bày bởi Parkányi không có sự khác biệt với kiểu nhân đƣợc Hội đồng Quốc tế đƣa ra. Vì từ năm 1975, John và Freeman sau rất nhiều nghiên cứu trên kiểu hình nhiễm sắc thể đã cho rằng kiểu hình acrocentric cũng có thể bao gồm telocentric (Eldridge, 1985). Vì kiểu hình của arcocentric và telocentric đều không nhìn thấy đƣợc nhiễm sắc chất ở vế ngắn trong giai đoạn trung kỳ của tế bào, còn kiểu hình subtelocentric có thể thấy đƣợc trong giai đoạn trung kỳ. (Ford và ctv, 1980) (Parkányi và ctv, 2004) Hình 2.7 Kiểu nhân của nhiễm sắc thể thỏ đực 20 Chƣơng 3 NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 3.1 Thời gian và địa điểm ־ Đề tài đƣợc thực hiện từ tháng 4 đến tháng 8 năm 2007. ־ Thỏ đƣợc nuôi tại trại bò Sarec, Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. ־ Máu thỏ đƣợc nuôi cấy Phòng Nuôi Cấy Tế Bào và phân tích tại Phòng Sinh Lý Động Vật, Khoa Chăn Nuôi Thú Y, Trƣờng Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. 3.2 Đối tƣợng Đề tài thực hiện chủ yếu trên máu của thỏ có trọng lƣợng từ 2 – 3 kg. 3.3 Nội dung nghiên cứu ־ Máu thỏ đƣợc lấy và nuôi cấy để thu nhận đƣợc các tế bào lympho ở trung kỳ, sau đó tiến hành nhuộm với giemsa. ־ Xem mẫu dƣới kính hiển vi để xác định hình dạng NST thỏ. 3.4 Vật liệu và hóa chất 3.4.1 Thiết bị ־ Tủ ấm ־ Tủ ấm CO2 ־ Tủ cấy vô trùng ־ Máy ly tâm ־ Kính hiển vi độ có máy chụp ảnh ־ Máy ảnh kỹ thuật số ־ Tủ lạnh -200C ־ Tủ lạnh 40C ־ Cân điện tử ־ Bồn ủ nhiệt ־ Máy vi tính 21 3.4.2 Dụng cụ ־ Micro pipette loại 100 - 1000 μl, 10 - 100 μl ־ Đầu típ tƣơng ứng với các loại micro pipette ־ Ống nghiệm 15ml, chai Rough, eppendorf ־ Ống kháng đông có tráng heparin ־ Chai nắp xanh 250ml và 1000ml ־ Kim tiêm, ống chích, găng tay, khẩu trang và phiến kính 3.4.3 Hóa chất a) Các chất trong môi trƣờng nuôi cấy tế bào bạch cầu: 1) Môi trƣờng RPMI 1640 (1X) của hãng Gibco BRL - Thành phần: L glutamine và 25mM HEPES trong 500ml môi trƣờng. - Chức năng: Là môi trƣờng chính nuôi cấy tế bào bạch cầu, cung cấp dinh dƣỡng, ổn định nồng độ CO2 5% và pH cho sự phát triển tế bào. 2) Pokeweed - Thành phần: 10 mg lectin trong 10 ml PBS - Chức năng: là tác nhân chính kích thích bạch cầu phân bào. 3) Huyết thanh thai bò (FBS) đã đƣợc bất hoạt bằng nhiệt - Chức năng: cung cấp đạm, hấp thu các ion kim loại độc. Nếu thiếu, tế bào không phân bào mà chuyển sang giai đoạn G0. 4) Antibiotic – Antimycotic (100X) - Thành phần: 10000 IU/ml penicilin G sodium, 10000 µg/ml streptomicin sulfate, 25 µg/ml amphotericin trong dung dịch muối 0.85%. - Chức năng: ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây hại cho tế bào. 5) Colcemid (10 µg/ml) - Chức năng: phá hủy thoi vô sắc của tế bào ức chế sự nhân đôi của centromere của NST làm tế bào dừng lại ở giai đoạn trung kỳ. 22 Bảng 3.1 Môi trƣờng nuôi cấy 0,4 và 1 ml máu Tên hóa chất Dung tích RPMI 1640 (1X) 8 ml FBS 1 ml Pokeweed 80 µl Antibiotic – Antimycotic (100X) 100 µl Colcemid 40 µl b) Các dung dịch trong quá trình nhuộm nhiễm sắc thể 1) Dung dịch nhƣợc trƣơng KCl 0,075 M - Thành phần: 0,56 g KCl trong 100 ml nƣớc khử ion. - Tác dụng làm tăng thể tích tế bào lên. 2) Dung định cố định - Thành phần: 3 methanol : 1 acid axetic - Chức năng: giữ tế bào tình trạng trƣơng phòng, loại bỏ lipid, biến tính protein nên làm màng tế bào và màng nhân rất mỏng dể giải phóng NST. 3) Dung dịch nhuộm - Thành phần: 8 ml giemsa trong 100 ml dung dịch sorensen buffer. - Chức năng: nhuộm nhiễm sắc thể. c) Một số dung dịch khác 1) Nồng độ các chất trong giemsa Tên hóa chất Liều lƣợng Giemsa 1 g Methanol 50 ml Glycerin 50 ml 23 2) Nồng độ các chất trong dung dịch PBS (phosphate buffer saline) Tên mg/50 ml mg/100 ml NaCl 400 800 KCl 10 20 Na2HPO4.12H2O 145 290 H2PO4 10 20 3) Nồng độ các chất trong dung dịch đệm (Sorensen buffer) Tên hóa chất g/500 ml nƣớc cất g/1000 ml nƣớc cất KH2PO4 4,54 9,078 Na2HPO4 5,94 11,876 3.5 Bố trí thí nghiệm 3.5.1 Thí nghiệm 1: khảo sát thời gian ủ mẫu với colcemid - Mục tiêu thí nghiệm: khảo sát tác động của colcemid theo thời gian đối với tế bào nuôi cấy để thu nhận đƣợc tế bào trung kỳ nhiều nhất. - Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm đƣợc chia làm 3 nghiệm thức theo thời gian ủ với colcemid là 20 phút, 40 phút, 60 phút trƣớc khi nhuộm. Tƣơng ứng với mỗi nghiệm thức là một lô thí nghiệm gồm có 10 mẫu, bố trí theo kiểu một hoàn toàn ngẫu nhiên. Mỗi mẫu chúng tôi tiến hành nhuộm trên sáu phiến kính. 3.5.2 Thí nghiệm 2: khảo sát lƣợng máu nuôi cấy - Mục tiêu thí nghiệm: khảo sát lƣợng máu nuôi cấy thích hợp để thu nhận đƣợc tế bào ở giai đoạn trung kỳ nhiều nhất. - Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm đƣợc chia làm hai nghiệm thức là nuôi cấy máu với thể tích 0,4 ml và 1ml. Tƣơng ứng với mỗi nghiệm thức là một lô thí nghiệm gồm 15 mẫu, bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên. 24 3.5.3 Thí nghiệm 3: tiến hành nuôi cấy trên ống nghiệm 15 ml. - Mục đích thí nghiệm: khảo sát khả năng dùng ống nghiệm 15 ml nuôi cấy tế bào bạch cầu để thay thể cho chai Rough - Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm chia làm 2 nghiệm thức là nuôi cấy trên chai Rough và ống nghiệm 15 ml với lƣợng máu là 1 ml và theo thời gian ủ với colcemid là 60 phút. Tƣơng ứng với mỗi nghiệm thức là một lô thí nghiệm có 3 mẫu. Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên một yếu tố. Mỗi mẫu chúng tôi tiến hành nhuộm trên sáu phiến kính. 3.5.4 Chỉ tiêu quan sát Số mẫu nhuộm thành công: là số mẫu có phiến kính nhuộm thành công. Số phiến kính nhuộm thành công: là những phiến kính có bạch cầu ở giai đoạn trung kỳ. Số lƣợng tế bào bạch cầu ở trung kỳ thu đƣợc theo từng thí nghiệm. 3.6 Phƣơng pháp tiến hành 3.6.1 Phƣơng pháp lấy máu thỏ: 3.6.1.1 Phƣơng pháp lấy máu tim Đầu tiên thỏ đƣợc cố định và xác định vị trí tim. Tim nằm ở giữa sụn mấu kiếm và xƣơng sƣờn đầu tiên, hơi lệch về phía trái đƣờng trắng khoảng 1cm. Sau khi cạo sạch lông và sát trùng nơi cần lấy máu với cồn, dùng xylanh 5ml đâm thẳng một cách nhẹ nhàng và từ từ hút 4ml máu. Sau khi hút, máu đƣợc chuyển nhanh qua ống kháng đông chứa heparin, chú ý lắc nhẹ và đều ống. Trƣớc khi lấy máu, không đƣợc cho thỏ ăn no, vì khi no thỏ rất dễ bị sốc và gây tử vong. 3.6.1.2 Phƣơng pháp lấy máu động mạch tai Đầu tiên thỏ đƣợc cố định, xác định động mạch ở giữa tai, cạo sạch lông và sát trùng với cồn nơi cần lấy. Đâm kinh nhẹ vào động mạch sau đó dùng ngón cái và ngón giữa để giữ kim cố định, đồng thời rút từ từ khoảng 4ml máu, rồi chuyển nhanh qua ống kháng đông chứa heparin. Chú ý lắc nhẹ và đều ống để máu trộn đều với heparin. 25 Hình 3.1 Phƣơng pháp lấy máu động mạch tai 3.6.2 Phƣơng pháp nuôi cấy tế bào máu Máu sau khi đƣợc lấy chuyển nhanh tới phòng thí nghiệm để nuôi cấy. Dùng micro pipette hút môi trƣờng nuôi cấy theo bảng 3.1 vào chai Rough hay ống nghiệm 15 ml tùy theo bố trí thí nghiệm. Sau đó dựng đứng bình, trộn thật nhẹ để môi trƣờng đều. Trƣớc khi hút máu vào môi trƣờng, phải dựng đứng ống kháng đông từ một đến hai giờ. Vì sau thời gian này, máu sẽ phân tách thành hai lớp. Lớp dƣới là hồng cầu và lớp trên rất nhiều bạch cầu. Sau đó hút lƣợng máu theo kiểu bố trí thí nghiệm vào môi trƣờng nuôi cấy. Chú ý phải lắc nhẹ và đều để máu hòa đều vào môi trƣờng. Thao tác này rất quan trọng vì nó quyết định đến sản phẩm nuôi cấy. Bình nuôi cấy đƣợc chuyển vào tủ ấm CO2 và nuôi cấy ở 37 0C trong 72 giờ. Đối với chai Rough thì đậy chặt nắp còn đối với ống nghiệm 15 ml thì không đƣợc đậy nắp chặt. Ống 15ml phải đƣợc đặt cố định, nghiêng 300 so với mặt phẳng. Trong thời gian nuôi cấy phải lắc nhẹ chai Rough và ống nghiệm 15 ml từ một đến hai trong một ngày. Điều này sẽ làm cho hồng cầu lắng xuống đáy và tế bào bạch cầu phân chia nhiều hơn (Kannan và ctv, 2006). 26 Chai Rough Ống nghiệm 15 ml Hình 3.2 Nuôi cấy tế bào bạch cầu 3.6.3 Kỹ thuật nhuộm nhiễm sắc thể 3.6.3.1 Kỹ thuật trải đều nhiễm sắc thể Quy trình nhuộm đƣợc tham khảo theo quy trình của Seabright (1971) Bƣớc 1: Sau khi ủ 72 giờ, cho colcemid vào môi trƣờng nuôi cấy tế bào và đặt vào tủ ấm 20 phút, 40 phút, 60 phút trƣớc khi đem cố định để nhuộm. Bƣớc 2: Sau khi ủ, chuyển môi trƣờng nuôi cấy vào ống nghiệm 15 ml và ly tâm ở tốc độ 1200 vòng/phút trong 10 phút. Sau đó loại bỏ hầu hết phần nổi, chỉ lấy khoảng 0,5 ml dịch tế bào còn lại. Bƣớc 3: Trộn đều dịch tế bào trong phần môi trƣờng còn giữ lại và cẩn thận cho thêm 2 ml KCl 0,075 M đã làm ấm trƣớc ở 370C, cho từng giọt một, nếu cho quá nhanh tế bào rất dễ vỡ trƣớc khi đƣợc cố dịnh. Sau đó khi khuấy nhẹ và tiếp tục cho thêm dung dịch KCl cho đến khi thể tích đạt 12ml. Bƣớc 4: Ủ ống nghiệm 15 phút ở 370C trong water bath. Bƣớc 5: Cho 1ml dung dịch cố định vào (hỗn hợp 3 methanol : 1 acid axetic) vào và đậy ống ly tâm lại và trộn đều bằng cách đảo ống. Bƣớc 6: Ly tâm, bỏ nổi nhƣ bƣớc 2. Bƣớc 7: Tiếp tục thêm 3 ml dung dịch cố định vào và dùng micro pipette để trộn thật đều và mạnh một đến hai phút để các tế bào bạch cầu tách rời ra và dịch tế bào đồng nhất. Chú ý: bƣớc này rất quan trọng cho chất lƣợng của mẫu. Sau đó thêm dung dịch cố định cho đạt thể tích 10 ml và trộn đều. 27 Bƣớc 8: Sau đó đem ủ 15 phút ở 40C, ly tâm bỏ nổi nhƣ bƣớc 2. Bƣớc 9: Lặp lại quá trình cố định ở bƣớc 7 - 8 ba lần nữa. Chỉ trộn nhẹ và không cần ủ lạnh giữa các lần ly tâm. Cuối cùng ta thu đƣợc lƣợng bạch cầu trong 0,5 ml dung dịch cố định. Bƣớc 10: Sau lần ly tâm cuối cùng, ta thu đƣợc lƣợng bạch cầu trong 0,5 ml dung dịch cố định. Dùng pipette Pasteur hút 50 µl dịch tế bào, đặt pipette vuông góc với phiến kính khoảng cách 60 cm, sau đó nhỏ từng giọt xuống phiến kính. Thao tác này sẽ giúp cho NST sẽ trải đều trên mặt phiến kính. Chú ý: phiến kính phải sạch và phải đặt ở -200C trong 30 phút trƣớc khi sử dụng. 3.6.3.2 Nhuộm nhiễm sắc thể với giemsa Sau khi trải tế bào trên phiến kính, để phiến kính khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng. Ngâm phiến kính vào dung dịch nhuộm 15 phút, rữa nhẹ bằng nƣớc sau đó để khô rồi xem dƣới kính hiện vi ở độ phóng đại 1000 lần. Hình ảnh nhiễm sắc thể đƣợc chụp lại và xử lý trên phần mềm photoshop. 3.7 Xử lý số liệu Mặc dù bố trí thí nghiệm ngẫu nhiên một yếu tố, chúng tôi không xử lý thống kê mà nhận định do tỷ lệ thành công còn rất thấp. 28 Chƣơng 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết quả nhuộm theo thời gian ủ với colcemid Sau khi nuôi cấy 72 giờ để các tế bào lympho trong máu thỏ đạt giai đoạn trung kỳ, mỗi bình nuôi cấy đƣợc cho thêm 40 µl colcemid (10 µl/ml) và đem ủ ba mức thời gian là 20, 40, 60 phút để chọn ra thời gian ủ tối ƣu nhất. Kết quả nhuộm theo thời gian ủ với colcemid đƣợc trình bày ở bảng 4.1 Bảng 4.1: Số lƣợng tế bào đạt trung kỳ theo thời gian ủ colcemid Thời gian 20 phút 40 phút 60 phút Số mẫu 10 10 10 Số mẫu thành công 0 2 4 Số phiến kính quan sát 60 60 60 Số phiến kính thành công 0 4 8 Tỷ lệ phiến kính thành công (%) 0 6,66 13,33 Số tế bào thành công 0 6 17 Từ kết quả trên, chúng tôi nhận thấy quá trình ủ mẫu máu nuôi cấy với 40 µl colcemid trong thời gian 20 phút không có mẫu nào thành công, nhƣng khi kéo dài thời gian ủ đến 40 phút có hai mẫu thành công và 60 phút có tới bốn mẫu thành công. Nhƣ vậy, khi ngâm tế bào với colcemid trong thời gian dài hơn thì tỷ lệ mẫu nhuộm sẽ thành công nhiều hơn. Mỗi mẫu nuôi cấy đƣợc trải đều trên sáu phiến kính. Các phiến kính đƣợc nhuộm với giemsa 8 % và đọc dƣới kính hiển vi có độ phóng đại 1000 lần để quan sát NST ở giai đoạn trung kỳ. 29 Kết quả cho thấy số lƣợng phiến kính thành công và số tế bào ở giai đoạn trung kỳ khi ủ với colcemid ở thời gian 60 phút là nhiều nhất (8 phiến kính và 17 tế bào thành công). Trong khi đó, khi ủ với colcemid ở thời gian 40 phút số phiến kính thành công chỉ có 4 và số tế bào thành công cũng chỉ có 6. Nhƣ vậy, khi kéo thời gian ủ colcemid trên tế bào bạch cầu thỏ, thì tác động phá hủy thoi vô sắc của colcemid mạnh hơn, nên số lƣợng tế bào bị phá hủy thoi vô sắc nhiều. Dẫn đến số lƣợng tế bào thu đƣợc ở trung kỳ nhiều hơn. Trong ba mức ủ thời gian với colcemid 20 phút, 40 phút và 60 phút thì ở 60 phút đều cho kết quả tốt nhất. Nhƣng theo chúng tôi, thời gian nhƣ trên vẫn chƣa tối ƣu cho tế bào máu thỏ, cần khảo sát thêm nồng độ và thời gian ủ colcemid đối với tế bào máu thỏ. Theo Kannan và ctv (2006) khi nuôi cấy bạch cầu máu thỏ, đã ủ colcemid với nồng độ 10 µg/ml trong thời gian 90 phút thu đƣợc rất nhiều tế bào ở trung kỳ. Parkányi và ctv (2004) cũng ủ tế bào với colcemid trong 90 phút nhƣng nồng độ colcemid giảm rất nhiều chỉ có 0,6 µg/ml và tỷ lệ thành công cũng rất cao. Nồng độ và thời gian colcemid thay đổi theo từng loại tế bào, theo kinh nghiệm và hóa chất tại phòng thí nghiệm đó. Nhƣ Sarkar và ctv (1962) khi tiến hành nuôi cấy lớp tế bào giác mạc và tế bào phổi thỏ đã ủ tế bào với colcemid nồng độ 10 µg/ml trong 10 đến 16 giờ, Korstanje và ctv (2003) cũng nuôi cấy tế bào phổi thỏ chỉ với nồng độ colcemid 0,1 µg/ml và thời gian ủ chỉ cũng chỉ 6 giờ cũng đạt đƣợc kết quả rất cao. 4.2 Kết quả nhuộm theo lƣợng máu Trong quá trình nuôi cấy, thành phần dinh dƣỡng là yếu tố tối quan trọng cho kết quả nuôi cấy. Vì trong nuôi cấy in vtro, tế bào có thể sinh trƣởng và phát triển hay không phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện môi trƣờng. Do đó chúng tôi tiến hành nuôi cấy thử nghiệm lƣợng máu với hai mức độ là 0,4 ml và 1 ml để khảo sát nồng độ dinh dƣỡng cần thiết. Kết quả thu đƣợc trong quá trình nhuộm thể hiện qua bảng 4.2 30 Bảng 4.2 Kết quả nhuộm theo lƣợng máu nuôi cấy Lƣợng máu 0,4 ml 1 ml Số mẫu 15 15 Số mẫu thành công 3 3 Số phiến kính quan sát 90 90 Số phiến kính thành công 3 9 Tỷ lệ phiến kính thành công (%) 3,33 10 Số tế bào thành công 5 18 Chúng tôi tiến hành nuôi cấy theo hai nồng độ máu khác nhau, kết quả khi nuôi cấy với lƣợng máu 0,4 ml và 1 ml đều có số lƣợng mẫu thành công là ba. Mỗi mẫu nuôi cấy cũng đƣợc trải đều trên sáu phiến kính, nhuộm màu với giemsa 8 % và xem dƣới kính hiển vi độ phóng đại 1000 lần. Kết quả cho thấy khi nuôi cấy mẫu máu 0,4 ml số phiến kính thành công chỉ có ba, và số tế bào ở trung kỳ cũng rất ít (5 tế bào). Nhƣng tăng lƣợng máu số phiến kính thành công lại tăng lên 9 phiến kính và số lƣợng tế bào thu đƣợc ở trung kỳ là 18. Trên lý thuyết, khi lƣợng máu ít hơn, các tế bào có thể nhận đƣợc nhiều dinh dƣỡng hơn, giúp cho quá trình phân bào đƣợc tốt hơn. Đặc biệt là mẫu máu đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng RPMI 1640 là môi trƣờng nuôi cấy tốt nhất cho tế bào máu (Kannan và ctv, 2006). Bên cạnh đó, Parkányi và ctv (2004); Kannan và ctv (2006) đã tiến hành nuôi cấy với lƣợng máu chỉ 0,25 ml và 0,3 ml trong 8 ml RPMI 1640 và thu đƣợc rất nhiều tế bào ở trung kỳ. Kết quả của chúng tôi có khác biệt, mẫu máu 1 ml khi nuôi cấy lại cho kết quả tốt hơn mẫu máu 0,4 ml. Kết quả trên có thể do trong quá trình lấy máu, chúng tôi sử dụng ống có tráng sẵn heparin. Do đó chúng tôi không xác định đƣợc nồng độ heparin thích hợp, nên trong quá trình nuôi cấy máu rất dễ bị đông trở lại. Vì vậy số lƣợng bạch cầu thu lại trong quá trình nuôi cấy bị mất đi rất nhiều. dẫn đến tỷ lệ thành công khi nuôi cấy 0,4 ml máu thấp hơn nuôi cấy 1ml máu do số lƣợng bạch cầu ít hơn. 31 Do đó, chúng tôi đã bổ sung thêm heparin vào các ống kháng đông có tráng sẵn heparin và kết quả nuôi cấy máu không bị đông. Chúng tôi thu rất nhiều tế bào bạch cầu trên phiến kính, nhƣng số lƣợng bạch cầu thu đƣợc ở trung kỳ rất thấp. Điều này do chúng tôi không xác định lƣợng heparin thích hợp khi bổ sung vào ống đã tráng sẵn heparin. Vì vậy heparin có thể ảnh hƣởng không tốt đến kết quả nuôi cấy. Theo Eldridge (1985) thì lƣợng kháng đông heparin thích hợp là 14,3 IU/ml máu, trong khi đó Margre và ctv (1992) cho là 10 – 20 IU/ml máu là thích hợp. Một yếu tố ảnh hƣởng đến kết quả nuôi cấy là do chúng tôi chỉ bổ sung 10% FBS trong môi trƣờng nuôi cấy. Với hàm lƣợng FBS này có lẽ chƣa đủ thích hợp đối với tế bào máu thỏ, điều này làm ảnh hƣởng đến sự phát triển của bạch cầu. Theo George (1994), Parkányi và ctv (2004); Kannan và ctv (2006), đều nuôi tế bào trong môi trƣờng RPMI 1640 và bổ sung FBS 20 %, và kết quả thu nhiều tế bào ở trung kỳ. Mặt khác, các tác giả khác khi nuôi cấy tế bào để nghiên cứu NST đều dùng chất kích thích phân bào là PHA còn chúng tôi sử dụng Pokeweed. Trên thực tế PHA đƣợc sử dụng phổ biến hơn Pokeweed. So PHA thì khả năng làm lắng tụ hồng cầu cũng nhƣ kích thích tế bào bạch cầu phân chia của Pokeweed yếu hơn (Margre và ctv, 1993). Vì vậy có thể ảnh hƣởng không tốt đến kết quả nuôi cấy. 4.3 Kết quả nuôi cấy thử nghiệm trên ống ly tâm 15ml Hầu hết tế bào động vật khi phát triển trong in vivo đều bám vào một cấu trúc trong mô liên kết, màng cơ bản hay chất nền khoáng nhƣ xƣơng. Vì vậy khi nuôi cấy tế bào động vật trong in vitro phải sử dụng các bình thủy tinh hay chai Rough có tráng lớp bám dính giúp tế bào phát triển. Nhƣng theo Phan Kim Ngọc và Phạm Văn Phúc (2006), quá trình nuôi cấy in vitro của tế bào máu không cần lớp bám dính nhƣ những dòng tế bào khác và nó có thể phát triển tốt trong môi trƣờng huyền phù. Vì thế chúng tôi tiến hành nuôi cấy thử nghiệm trên ống nghiệm 15ml theo quy trình nuôi cấy 1 ml máu trong 72 giờ giống chai Rough. Kết quả thu đƣợc theo bảng 4.3 32 Bảng 4.3 Kết quả nuôi cấy trên chai Rough và ống nghiệm 15 ml Thiết bị Chai Rough Ống nghiệm 15 ml Số lần lập lại 3 3 Thành công 2 2 Số phiến kính quan sát 18 18 Số phiến kính thành công 6 4 Tỷ lệ phiến kính thành công (%) 33,33 22,22 Số tế bào thành công 14 5 Kết quả sau thời gian nuôi cấy và nhuộm, chúng tôi khả năng nuôi cấy thành công ở ống nghiệm 15 ml và chai Rough là nhƣ nhau (số mẫu thành công đều là hai). Khi quan sát thì số phiến kính thành công khi nuôi trên ống nghiệm là 4, còn trên chai Rough là 6. Nhƣng số tế bào thành công ở ống nghiệm 15 ml là rất thấp (5 tế bào ở trung kỳ) so với chai Rough (14 tế bào thành công). Có thể do khi nuôi cấy ở ống 15 ml, thể tích môi trƣờng và máu chiếm 2/3 thể tích bình. Mặc dù trong môi trƣờng đã có Hepes giúp cung cấp lƣợng CO2 và trong quá trình nuôi cấy chúng tôi không đóng chặt nắp và có lắc đều hai lần trong ngày. Nhƣng vì không khí chiếm thể tích là rất thấp (1/3 thể tích) và diện tích mặt phẳng tiếp xúc của tế bào với không khí nhỏ khi nuôi cấy ở ống nghiệm 15 ml so với chai Rough. Điều này có thể làm không ổn định lƣợng khí và pH cần thiết cho tế bào, nên kết quả số lƣợng tế bào thu đƣợc ở ống nghiệm là không nhiều. Tuy nhiên, kết quả trên là một bƣớc đầu cho việc dùng ống nghiệm 15 ml thay thế cho chai Rough trong nuôi cấy tế bào. Việc ứng dụng ống nghiệm 15 ml trong nuôi cấy tế bào máu sẽ tiết kiệm đƣợc giá thành. Vì ống nghiệm 15 ml có giá thành rẻ hơn, có thể xử lý dễ dàng cũng nhƣ tái sử dụng lại nhiều lần để nuôi cấy tế bào máu. Ngoài ra, khi nuôi cấy với hàm lƣợng kháng đông nhƣ nhau,máu ở ống 15 ml ít bị đông hơn nuôi cấy trong chai Rough, nên có thể thu đƣợc nhiều bạch cầu hơn. Có thể do lớp bám dính tráng trong lòng của chai Rough làm các hồng cầu khi lắng xuống bám dính lại, dễ gây đông máu. 33 NST nuôi cấy trên chai Rough NST nuôi cấy trên ống nghiệm 15 ml Hình 4.1 Nhiễm sắc thể nhuộm với giemsa (X 1000) Sau khi nhuộm và chụp ảnh lại, dựa trên tỷ lệ chiều dài cánh p và q của NST chúng tôi xác định nhuộm sắc thể thỏ gồm kiểu hình: Metacentric, acrocentric, submetacentric, subtelocentric và telocentric. Kết quả này giống với các công trình nghiên cứu trƣớc đây nhƣ Robson và Shaver (1979), Parkányi và ctv (2004). Hình 4.2 Hình dạng nhiễm sắc thể thỏ (X 1000) Chúng tôi cũng ghi nhận lại đƣợc đặc điểm của chu kỳ phân bào của các tế bào bạch cầu khi quan sát dƣới kính hiển vi. Chúng tôi nhận thấy hầu nhƣ các tế bào đều ở giai đoạn gian kỳ, đặc biệt là khi ủ colcemid ở thời gian 20 phút. C B D E A A – Metacentric B – Submetacentric C – Subtelocentric D –Telocentric E – Acrocentric 34 Gian kỳ Tiền kỳ Trung kỳ sớm Trung kỳ Hậu kỳ Mạt kỳ Hình 4.3 Chu kỳ phân chia của tế bào bạch cầu (X 1000) 4.4 Một số nguyên nhân ảnh hƣởng tới kết nuôi cấy và nhuộm Chúng tôi chƣa thể xác định đƣợc số lƣợng cũng nhƣ xây dựng kiểu nhân nhiễm sắc thể thỏ vì số tế bào ở giai đoạn trung kỳ rất thấp, và NST chƣa rải đều trên phiến kính. Kết quả nhuộm không tốt có thể do một số yếu tố sau: 35 a) Thao tác lấy máu Việc lấy máu ảnh hƣởng khá lớn đến kết quả nuôi cấy. Khi lấy máu ở tim, lƣợng máu lấy đƣợc nhiều và nhanh hơn lấy máu ở động mạch giữa tai. Vì vậy máu nhanh chóng đƣợc hòa tan với chất kháng đông hơn, do đó trong quá trình nuôi cấy mẫu máu ít bị đông hơn so với lấy máu ở động mạch giữa tai. Tuy nhiên việc lấy máu ở tim đòi hỏi ngƣời lấy phải có kinh nghiệm nếu không rất dễ gây chết thỏ. Ngoài ra vấn đề vô trùng trong lúc lấy máu cũng ảnh hƣởng đến kết quả nuôi cấy. Máu ở môi trƣờng ngoài rất khó bảo đảm điều kiện vô trùng, mặt khác máu sau khi lấy xong không thể xử lý vô trùng nhƣ lọc hay hấp. Vì thế mẫu máu rất dễ bị nhiễm khuẩn trong khi lấy. Khi bị nhiễm các tế bào nuôi cấy bị cạnh tranh nguồn dinh dƣỡng bởi vi khuẩn. Vì thời gian để tế bào động vật nhân đôi rất chậm (khoảng 20 – 40 giờ), trong khi đó thời gian để vi khuẩn nhân đôi là một giờ. Mặt khác tế bào động vật không thể tồn tại ở dạng cô lập, do đó chúng sẽ không sống đƣợc nếu không đƣợc cung cấp môi trƣờng phức hợp. Nếu bị nhiễm, môi trƣờng sẽ thay đổi, tế bào sẽ chết hoặc bị phá hủy. b) Chất kháng đông Hàm lƣợng kháng đông cũng ảnh hƣởng rất nhiều đến quá trình nuôi cấy. Chúng tôi sử dụng ống có tráng lớp kháng đông sẵn, nhƣng sau những lần nuôi chúng tôi nhận thấy máu rất dễ bị đông. Khi hàm lƣợng kháng đông không đủ sẽ máu cấy sẽ bị đông lại và số lƣợng bạch cầu sẽ bị mất rất nhiều và không tìm thấy các tế bào ở giai đoạn metaphase. Ngoài ra khi mẫu nuôi cấy bị đông sẽ ảnh hƣởng rất nhiều đến quá trình đồng nhất mẫu, làm các tế bào kết dính không tách nhau ra, do đó khi đồng nhất mẫu không đủ lực cơ học làm vỡ màng nhân, giải phóng NST. c) Thao tác nuôi cấy trong phòng thí nghiệm Tủ cấy và dụng cụ thao tác phải đƣợc chiếu tia UV trƣớc mỗi lần thực hiện, tất cả dụng cụ phải đƣợc sát trùng cẩn thận trƣớc khi mang vào phòng cấy và tủ cấy vô trùng.Chú ý lắc đều môi trƣờng và mẫu máu khi đƣa vào môi trƣờng. 36 Giai đoạn đầu chúng tôi nuôi cấy không thành công có thể do thao tác đƣa máu vào môi trƣờng chúng tôi lắc không đƣợc đều, và kết quả các tế bào không tan đều trong môi trƣờng làm chúng đông lại tạo một lớp tế bào máu nổi trên bề mặt môi trƣờng. Do đó chúng tôi bị mất rất nhiều tế bào, nên kết quả không tốt. Khi lắc đều, các tế bào máu sẽ trải đều và nằm dƣới đáy chai Rough. e) Thời gian ngâm dung dịch nhƣợc trƣơng Chúng tôi tiến hành ngân dung dịch nhƣợc trƣơng 15 phút trong bồn ủ nhiệt và tiến hành ly tâm 10 phút, tổng thời gian chỉ 25 phút. Với thời gian này, chúng tôi nhận thấy một số tế bào màng nhân vẫn còn, và NST không thể phóng thích và đƣợc trải đều ra. Nhƣ Hayes (2002) và Kannan (2006) và nhiều protocol khác đều có tổng thời gian ngâm với dung dịch nhƣợc trƣơng là 30 phút. Hình 4.4 Nhân tế bào bạch cầu thỏ chƣa vỡ (X 1000) f) Thao tác trải đều nhiễm sắc thể Các nhiễm sắc thể ở trung kỳ khi cố định đều trên phiến kính không trải đều nhƣ mong nuốn. Có thể do mẫu nuôi cấy bị đông, làm các tế bào kết dính lại, khi nhỏ xuống phiến kính rất khó phân tách ra. Một nguyên nhân nữa là do khi nhỏ giọt dung dịch chƣa nhân tế bào bạch cầu, chúng tôi chỉ tiến hành với độ cao là 40 – 60 cm. Có thể trong môi trƣờng thí nghiệm đối với tế bào máu thỏ thì độ cao này chƣa thích hợp nhất. Màng nhân chƣa bị vỡ 37 Hình 4.5 Nhiễm sắc thể không trải đêu trên phiến kính (X 1000) d) Thiết bị thí nghiệm Độ phóng đại của kính hiển vi và độ phân giải của máy ảnh là một yếu tố ảnh hƣởng lớn đến kết quả. Ban đầu chúng tôi chụp hình bằng máy kỹ thuật số, các hình thu đƣợc rất mờ và khó nhận dạng nhiễm sắc thể. Khi chuyển sang chụp trên máy ảnh có gắn trực tiếp lên kính hiển vi thì tấm ảnh đẹp hơn và có thể quan sát nhiễm sắc thể rõ hơn. 38 Chƣơng 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận ־ Quy trình nuôi cấy 1ml máu thỏ trong thời gian 72 giờ ở 37 0C để nhuộm nhiễm sắc thể cho kết quả tốt nhất ־ Ủ tế bào sau khi nuôi cấy với colcemid 60 phút trƣớc khi đem nhuộm thu đƣợc nhiều tế bào ở giai đoạn trung kỳ nhất. ־ Ống nghiệm 15 ml có thể sử dụng nuôi cấy tế bào máu trong nghiên cứu nhiễm sắc thể. 5.2 Đề nghị ־ Thử nghiệm nồng độ kháng đông heparin thích hợp. ־ Khảo sát thêm thời gian ngâm colcemid đối với tới bào thỏ. ־ Khảo sát thêm nồng độ FBS trong môi trƣờng nuôi cấy. ־ Tiếp tục xây dựng kiểu nhân (karyotype) của thỏ và xác định số lƣợng NST thỏ. 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 1. Dƣơng Nguyên Khang, 2006. Sinh lý thể dịch. Sinh lý vật nuôi (PGS.TS Trần Thị Dân, TS Dƣơng Nguyên Khang). Nhà xuất bản nông nghiệp. Trang 89 - 109. 2. Nguyễn Nhƣ Hiền, 2005. Sinh học phân tử và tế bào cơ sở khoa học của công nghệ sinh học. Nhà xuất bản giáo dục, Hà Tây. Trang 133 - 192. 3. Phan Kim Ngọc và Phạm Văn Phƣớc, 2006. Nuôi cấy tế bào động vật. Công nghệ sinh học người và động vật. Nhà xuất bản giáo dục. Trang 92 - 149. 4. Trịnh Văn Thịnh, 1978. Cơ thể và sinh lý gia súc. Sổ tay thực hành chăn nuôi thú y. Nhà xuất bản nông nghiệp. Trang 3 - 36. TÀI LIỆU TIẾNG NƢỚC NGOÀI 5. Eldridge F. E., 1985. Laboratory Procedures for chromosome studies. Cytogenetic of liverstock. The avi publishing company, United States of America. 93 – 112. 7. Ford C. E., Pollock D.L., and Gustavsson I., 1980. Proceedings of the first international conference for the standardisation of banded karyotypes of domestic animals. Hereditas 92: 158 - 160. 8. Hayes H., Rogel-Gaillard C., Zijlstra C., Haan de A. N., C. U., Bourgeaux N., Bertaud M., and Bosma A. A., 2002. Establishment of R-banded rabbit karyotype nomenclature by FISH lacalization of 23 chromosome-speccific genes on both G-and R-band chromosome. Cytogenet Genome Res 98: 199 - 205. 9. Kannan T. P., Quah B. B., Azlina A., and Samsudin A. R.,2006. Mitotic index and chromosomal analyses for hydroxyapatide. Archives of Orofacial Sciences 1: 15 - 20. 40 10. Korstanje R., Gillissen G. F., Versteeg S. A., Van OOST B. A., Bosma A. A., Gaillard C. R., Van Zutphen L. F. M., and Van Lith H. A., 2003. Mapping of rabbit microsatellite markers using chromosome specific libraries. Journal of heredity 94: 161 – 169. 11. Nicolai Pand Shaver. E. L, 1977. The Chromosome complement of rabbit blastocysts resulting from spermatozoa stored at 5 0 C. Biology of reproduction 17: 640 -646. 12. Parkányi V., Chrenek P., Rafay J., Suvegová K., Jurcík R., Makarevich A. V., Pivko J., Hetényi L., and Paleyanda R. K., 2004. Aneuploid in the transgenic rabbit. Folia Biologica (Praha) 50: 194 - 199. 13. Robson K. E., and Shaver E. L., 1979. The chromosome complement of rabbit blastocyst resulting from spermatozoa stored in vitro at -196 0 C. Biology of reproduction 20: 516 - 522. 14. Sarkar P., Basu P. K., and Miller I., 1962. Karyologic studies on cells from rabbit cornea and other tissues growm in vitro. Investigative Ophthalmology 1: 33 – 40. 15. Seabright M., 1971. A rapid banding technique for human chromosomes. Lancet 2: 971 – 972. TÀI LIỆU THAM KHẢO TRÊN MẠNG 1. George S., 1994. Mitotic metaphase chromosome preparation from peripheral blood for high resolution. k=chapterdetails&category=biomedprotocols&chapter_code=0-89603-289-2:1 2. Herbert C. M., 1993. Working with animal chromosome. working+with+animal+chromosome&psp=1&hl=en#PPP1,M1 3. 41 4. 5. 6. 7. 8.